JP2022003094A - 細胞療法を改善するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
員の媒介において、HSC E−セレクチンリガンドに結合するセレクチン、主にE−セレクチンが果たす役割を指し示した。
283巻、845頁(1999年);D. A. Sipkinsら、Nature 435巻、969頁
(2005年))。しかしながら、SDF−1の発現は髄に限定されるものではなく、このケモカインは、組織傷害/炎症のある全ての部位で代表的には発現される(R. Sackstein、Immunol. Rev. 230巻:140〜163頁(2009年))。
069頁(2004年))。重要なことに、霊長類(齧歯動物を除く)では炎症部位および組織傷害/損傷部位の全てにおいて、炎症性サイトカインTNFおよびIL−1に応答性のプロモーターエレメントがP−セレクチン遺伝子から欠失しているので、E−セレクチンが、細胞動員を媒介する主要な血管セレクチンである。したがって、ヒトの炎症部位の全てにおいて、血管E−セレクチンの発現は、P−セレクチンより顕著である(R. Sackstein、Immunol. Rev. 230巻:140〜163頁(2009年))。
53巻、1277頁(2001年);C. J. Dimitroff、J. Y. Lee、R. C. Fuhlbrigge、R. Sackstein、Proc Natl Acad Sci US A 97巻、13841頁(200
0年))が識別されている。CD44は、どちらかといえば遍在する細胞膜タンパク質であるが、HCELL表現型は、ヒトHSPC上に主に見られる。HCELLの制限されている分布とは対照的に、CLA/PSGL−1は、髄内の造血前駆細胞ならびにより成熟した骨髄系およびリンパ系細胞の間で広く発現される(Z. Laszikら、Blood 88巻、
3010頁(1996年)、R. Sackstein、Immunol. Rev. 230巻:140〜16
3頁(2009年))。HCELLは、剪断(shear)条件下でE−セレクチンおよびL−セレクチンに結合するCD44として操作上定義され、E−セレクチン−Igキメラ(E−Ig)およびmAb HECA452と反応するCD44グリコフォームとして細胞溶解物のウェスタンブロット分析により識別され、HECA452は、シアリルルイスXを認識する(そして、HECA452は、sLexに加えて、フコースが、1型ラクトサミン骨格内のN−アセチルグルコサミンにα(1,4)連結で付加されている「シアル化ルイスa」[sLea]として公知のsLexの四糖異性体を認識する)。CLAおよびHCELLに加えて、ヒト白血球およびHSPCは、E−セレクチンリガンドとして働き得る「CD43−E」として公知のCD43グリコフォームを発現することもでき(Fuhlbriggeら、Blood 107巻:1421〜1426頁(2006年)、Merzabanら、Blood 118巻:1774〜1783頁(2011年))、マウス白血球においては、E−セレクチンリガンド−1(ESL−1)として公知の別のE−セレクチンリガンドが記述されている(Merzabanら、Blood 118巻:1774〜1783頁(2011年))
。全ての糖タンパク質において、E−セレクチン(ならびにまた、L−セレクチンおよびP−セレクチン)に結合するセレクチンリガンド(例えば、CD43−E、CLAおよびHCELL)は、α(2,3)−シアル酸およびα(1,3)−フコース修飾に極めて依存的である(C. J. Dimitroff、J. Y. Lee、S. Rafii、R. C. Fuhlbrigge、R. Sackstein、J Cell Biol 153巻、1277頁(2001年);C. J. Dimitroff、J. Y. Lee、R. C. Fuhlbrigge、R. Sackstein、Proc Natl Acad Sci USA 97巻、13841頁(2000年);R. Sackstein、C. J. Dimitroff、Blood 96巻
、2765頁(2000年);C. J. Dimitroff、J. Y. Lee、K. S. Schor、B. M. Sandmaier、R. Sackstein、J Biol Chem 276巻、47623頁(2001年))。ヒトHSPC上で、HCELLは、N−グリカン上に適切なシアロフコシル化セレクチン結合決定因子を呈示する(C. J. Dimitroff、J. Y. Lee、S. Rafii、R. C. Fuhlbrigge、R. Sackstein、J Cell Biol 153巻、1277頁(2001年);R.
Sackstein、C. J. Dimitroff、Blood 96巻、2765頁(2000年))。血行
力学剪断応力下でのE−およびL−セレクチン結合のin vitroアッセイは、HCELLが、任意のヒト細胞上で発現されるこれらの分子に対する最も強力なリガンドであることが示されている(C. J. Dimitroff、J. Y. Lee、S. Rafii、R. C. Fuhlbrigge、R. Sackstein、J Cell Biol 153巻、1277頁(2001年);C. J. Dimitroff、J. Y. Lee、K. S. Schor、B. M. Sandmaier、R. Sackstein、J Biol
Chem 276巻、47623頁(2001年))。重要なことに、E−セレクチンは、髄および皮膚の微小血管内皮上で構成的に発現されているが、この分子は、直接的な組織傷害(例えば、熱傷、外傷、褥瘡性潰瘍等)、虚血/血管事象(例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等)、感染症(例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、SIRS等)、異常増殖(例えば、乳がん、肺がん、リンパ腫等)、免疫学的/自己免疫症状(例えば、移植片対宿主病、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、乾癬等)、変性疾患(例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、アルツハイマー病等)、先天的/遺伝的疾患(例えば、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等)、薬物副作用(例えば、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等)、毒性傷害(例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋症、コカイン心筋症等)、代謝異常(例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等)、医原性症状(例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等)および/または特発性の過程(例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群[Parsonnage-Turner Syndrome]等)によって誘導されるかどうかにかかわ
らず、急性および慢性型両方の全ての炎症の部位で内皮ベッド上で優勢に発現される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
対象の標的組織への細胞送達を強化する、そして/または前記対象の前記標的組織における組織定着を増大する方法であって、
前記対象にE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記細胞の投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
(項目2)
対象における炎症および/または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状を処置する方法であって、
前記対象にE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記細胞投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、
前記集団が、前記投与された細胞の天然集団と比較して前記炎症および/または損傷組織内で増大された局在化および/または定着を呈示する方法。
(項目3)
対象における標的組織への細胞送達を改善する方法であって、
前記対象にE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を、血管への送達によっておよび/または直接組織注射によって(すなわち、罹患組織部位に直接)および/または髄腔内および/または腔内および/または膀胱内および/または解剖学的管路(胆管系、泌尿器系等)中および/または組織上に(すなわち、罹患組織上への配置)投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記細胞の投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、
前記投与された細胞の集団が、細胞の天然集団と比較して増大されたホーミング、定着および生着のうちの1つまたは複数を実現する方法。
(項目4)
対象の炎症および/または損傷組織において細胞送達および定着を増大する方法であって、
E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を前記炎症および/または損傷組織へ直接注射するまたはその上/中に配置するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記注射/配置が、前記標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
(項目5)
対象の標的組織への細胞送達、定着および/または生着を増大する方法であって、
前記対象の血管系を通じてE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
(項目6)
対象において標的組織内での細胞集団の付着、定着および/または生着を増大する方法であって、
E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を前記標的組織に直接注射するまたは前記標的組織上へ配置するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記注射が、前記標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、
前記集団が、前記細胞の天然集団と比較して増大された標的組織定着を実現する方法。(項目7)
対象における炎症および/または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状を処置する方法であって、
前記対象にE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記注射が、前記炎症および/または損傷組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記炎症および/または損傷組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
(項目8)
対象において腫瘍/悪性疾患を処置する方法であって、
前記対象にE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記投与が、腫瘍/悪性細胞を保有している組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または腫瘍/悪性細胞を保有している前記組織内の白血球の蓄積と一致して行われる方法。
(項目9)
対象における炎症および/または損傷組織として現れる疾患、障害、または病状の処置用医薬の製造に使用するためのE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団であって、前記処置が、前記対象にE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の前記集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記処置が、前記集団を前記炎症および/または損傷組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致してならびに/または前記炎症および/もしくは損傷組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む、集団。
(項目10)
腫瘍/悪性疾患の処置用医薬の製造に使用するためのE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の集団であって、前記処置が、対象にE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞の前記集団を投与するステップを含み、前記集団が、前記細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルで前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、
前記処置が、前記集団を前記腫瘍/悪性組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または前記腫瘍/悪性組織内の白血球の蓄積と一致して投与するステップを含む、集団。
(項目11)
前記細胞投与が、前記標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現、およびL−セレクチンを有する白血球の浸潤と一致して行われる、項目1から10のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目12)
前記投与/注射が、ある/前記炎症および/または損傷組織への白血球の浸潤の間に行われる、項目1から11のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目13)
ある/前記炎症および/または損傷組織の環境における、前記投与された細胞の集団の生着をさらに含む、項目1から12のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目14)
免疫調節効果が、ある/前記炎症および/または損傷組織における細胞の定着により実現される、項目1から13のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目15)
組織修復効果が、ある/前記炎症および/または損傷組織における投与された細胞の定着により実現される、項目1から14のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目16)
増大された宿主防御/免疫応答効果が、ある/前記炎症および/または損傷組織における投与された細胞の送達および定着により実現される、項目1から15のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目17)
抗悪性効果が、ある/前記腫瘍/悪性組織部位における投与された細胞の定着により実現される、項目1から16のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目18)
前記投与/注射が、前記細胞集団の1回または一連の注射を含む、項目1から17のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目19)
前記投与/注射が、前記細胞集団の毎日、毎週、隔週、毎月または毎年の注射を含む、項目1から18のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
(項目20)
前記対象における事前投与/注射の免疫調節効果が低下したら、前記細胞集団を1回または複数回追加で投与/注射するステップをさらに含む、項目1から9のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
(項目21)
前記細胞集団が、静脈内投与/注射される、項目1から20のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
(項目22)
前記細胞集団が、前記炎症および/または損傷組織への直接注射により投与される、項目1から21のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
(項目23)
前記細胞集団が、前記炎症組織および/または損傷組織上に配置される、項目1から21のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
(項目24)
前記細胞集団が、ある/前記炎症組織および/または損傷組織上に配置される、項目1から21のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
(項目25)
前記細胞集団が、他の促進剤、抗炎症剤、または組織骨格/移植可能なデバイス/ゲルと組み合わせて利用される、項目1から21のいずれか一項に記載の方法または細胞の集団。
(項目26)
細胞の前記集団が、E−セレクチンリガンドおよびL−セレクチンリガンドを発現する、項目1から25のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目27)
前記E−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドが、造血細胞E−/L−セレクチンリガンド(HCELL)、神経細胞接着分子E−セレクチンリガンド(NCAM−E)、CD43E、CLAおよびESL−1のうちの1つまたは複数から選択される、項目1から26のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目28)
前記E−セレクチンリガンドが、造血細胞E−/L−セレクチンリガンド(HCELL)および/または神経細胞接着分子E−セレクチンリガンド(NCAM−E)である、項目1から27のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目29)
前記E−セレクチンリガンドが、HCELLである、項目1から28のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目30)
前記E−セレクチンリガンドが、NCAM−Eである、項目1から29のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目31)
前記L−セレクチンリガンドが、HCELLである、項目1から30のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目32)
前記細胞集団が、上皮、内皮、ニューロン、脂肪、心臓、骨格筋、繊維芽および免疫細胞(例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、白血球[例えば、NK細胞、Bリンパ球、Tリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球(CD4+/CD25+/FOXP3+)などのTリンパ球のサブセット]、細胞傷害性リンパ球、等)、肝、脾、肺、循環血液細胞、血小板、生殖細胞、消化管、腎臓、骨髄、膵臓細胞、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹/前駆細胞[例えば、神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞]、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞、または誘導多能性幹細胞、または胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞から得られる分化した前駆細胞、または成体幹細胞から得られる分化した前駆細胞、または任意の組織(例えば、脳、肝臓、肺、腸、胃、脂肪、筋肉、精巣、子宮、卵巣、皮膚、脾臓、内分泌器および骨)から単離される初代細胞、または培養により増大された前駆細胞集団、または培養により増大された幹細胞集団、または培養により増大された初代細胞集団のうちの1つまたは複数を含む、項目1から31のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目33)
前記細胞集団が、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹/前駆細胞、臍帯幹細胞または胚性幹細胞である、項目1から32のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目34)
前記細胞集団が、白血球(例えば、NK細胞、Bリンパ球、Tリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球[CD4+/CD25+/FOXP3+]、細胞傷害性T細胞等などのTリンパ球のサブセット等)である、項目1から33のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目35)
前記疾患、障害または病状が、直接的な組織傷害(例えば、熱傷、外傷、褥瘡性潰瘍等)、虚血/血管事象(例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等)、感染症(例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、敗血症、SIRS等)、異常増殖(例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、リンパ腫、白血病等)、免疫学的/自己免疫症状(例えば、移植片対宿主疾患、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、乾癬等)、変性疾患(例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、アルツハイマー病等)、先天的/遺伝的疾患(例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等)、薬物副作用(例えば、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等)、毒性傷害(例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋障害、コカイン心筋症等)、代謝異常(例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等)、医原性症状(例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等)および/または特発性の過程(例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群等)のうちの1つまたは複数である、項目1から34のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目36)
前記疾患、障害または病状が、糖尿病である、項目1から35のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目37)
前記疾患、障害または病状が、多発性硬化症である、項目1から36のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目38)
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである、項目1から37のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目39)
前記対象がヒト患者である、項目1から38のいずれか一項に記載の方法または集団。(項目40)
前記細胞集団が、E−セレクチンおよび/またはL−セレクチンリガンドが強制発現された修飾細胞集団を形成するように処理され、前記細胞集団が、前記処理の24時間後に少なくとも70%の生存率を有する、項目1から39のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目41)
前記細胞集団が、前記処理の24時間後に少なくとも80%の生存率を有する、項目1から40のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目42)
前記細胞集団が、前記処理の48時間後に少なくとも70%の生存率を有する、項目1から40のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目43)
対象へ前記細胞集団を投与すると、前記細胞集団が浸潤白血球を含む組織中に付着する、項目1から42のいずれか一項に記載の方法または集団。
(項目44)
前記投与が、前記組織への直接注射または前記組織上への配置である、項目43に記載の方法または集団。
(項目45)
前記投与が血管に対してである、項目43に記載の方法または集団。
(項目46)
前記集団が、末梢血管アクセスまたは中心血管アクセスのいずれかによって全身的に投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。
(項目47)
前記集団が、カテーテルに基づく手法、または対象とする部位に血管への細胞のボーラスを送達し得る他の血管アクセスデバイスを使用して、前記対象とする組織部位の解剖学的栄養血管内に血管内投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。
(項目48)
前記集団が、脊柱管および/または脳室内への導入により投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。
(項目49)
前記集団が、カテーテルに基づく手法または直接注射のいずれかにより体腔へと直接投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。
(項目50)
前記集団が、血管内手法もしくは経皮手法のいずれかを使用して局所組織直接注射により、もしくは解剖学的に到達可能な組織部位へ直接、および/または画像技術による誘導で投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。(項目51)
前記集団が、関連する組織表面/部位への直接配置により投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。
(項目52)
前記集団が、骨格内に投与され、もしくは組織中に配置された骨格内に埋め込まれ、そして/またはゲル中にて投与され、そして/または促進剤と一緒に投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。
(項目53)
前記集団が、脳脊髄液へ投与される、項目1から21または25から42のいずれかに記載の方法または集団。
本開示は、対象において炎症および/または損傷組織として現れる疾患、障害または病状またはがんを処置する方法を対象とする。本方法は、組織修復/再生またはがん処置を必要とする対象への、細胞の天然集団のE−セレクチンおよび/またはL−セレクチン結合レベルを超えるレベルでE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現する細胞集団の投与を含む。細胞の組成物は、対象への投与のためまたは対象への投与前に貯蔵する(例えば、冷凍保存する)ために薬学的に許容される溶液、懸濁液、担体または媒体中に置かれる。
(投与のタイミング)
(適応症)
源から得られる幹細胞および前駆細胞、ヒトおよび動物における適用、ならびに四肢再生、再建外科手順/適応、単独または促進剤との組み合わせ;
ない。
る。
(投与経路)
(修飾細胞およびそれらの調製方法)
ることができ(所与の細胞産物における同種異系ドナー細胞の組み合わせを含める)、または異種細胞起源を使用することができる。細胞は、初代細胞、例えば、初代肝細胞、初代ニューロン細胞、初代筋芽細胞、初代間葉系幹細胞、初代前駆細胞であることができ、または細胞は、樹立細胞株または培養により増大された細胞(例えば、T細胞、樹状細胞等)の細胞であることができる。細胞は、細胞分裂を受ける能力がある必要はなく;最終分化した細胞を、本明細書に記述される方法に使用することができる。この文脈において、細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞、血液前駆細胞、組織前駆細胞、上皮、内皮、ニューロン、脂肪、心臓、骨格筋、繊維芽、免疫細胞(例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、白血球[例えば、Bリンパ球、Tリンパ球などのリンパ球、または調節性リンパ球(CD4+/CD25+/FOXP3+)などのTリンパ球のサブセット]、ナイーブ T細胞、セントラルメモリT細胞、エフェクターメモリT細胞、エフェクターT細胞、NK細胞等)、肝、脾、肺、循環血液細胞、血小板、生殖細胞、消化管細胞、腎臓細胞、骨髄細胞、心臓細胞、内皮細胞、内分泌細胞、皮膚細胞、筋細胞、ニューロン細胞および膵臓細胞を含むがこれに限定されない任意の細胞型であり得る。細胞は、細胞株、幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、組織幹/前駆細胞[例えば、神経幹細胞、消化管幹細胞、筋幹細胞、心筋前駆細胞/幹細胞、内皮前駆細胞、または肺幹細胞]、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞、または脳、肝臓、肺、腸、胃、脂肪、筋肉、精巣、子宮、卵巣、皮膚、脾臓、内分泌器および骨等を含むがこれに限定されない任意の組織から単離される初代細胞であることができる。
および/または解剖学的管路(胆管系、泌尿器系等)中および/または組織上に(すなわち、罹患組織上への配置)投与するステップを含み、集団が、細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドを発現し、前記細胞投与が、標的組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致しておよび/または標的組織内の白血球の蓄積と一致して行われ、前記投与された細胞集団が、細胞の天然集団と比較して増大されたホーミング、定着および生着のうちの1つまたは複数を実現する方法。
(実施例1)
脂肪由来間葉系幹細胞のアルファ(1,3)−フコシルトランスフェラーゼ処理は、HCELLの発現を強制する
(実施例2)
ヒト血液白血球のアルファ(1,3)−フコシルトランスフェラーゼ処理は、細胞上の高レベルE−セレクチンリガンド活性を誘導し、HCELLの発現を強制する
T細胞)等)を含む)上のHCELLならびに他のE−セレクチンリガンドおよび/またはL−セレクチンリガンドの発現の強制は、養子細胞療法において利用することができる(組織再生/修復のため、および/または免疫を増強するもしくは免疫を弱めるための免疫療法のため)。よって、決定的なことに、HCELLの強制発現は、E−セレクチン依存性内皮相互作用による標的部位への血管内投与された細胞の効率的な輸送を可能にし、血液で運ばれる細胞の動員を生じ、その後、別々の組織微小環境による、血管外遊出した細胞のE−セレクチン媒介性およびL−セレクチン媒介性の付着を生じるであろう。さらに、同様に、斯かる細胞を、炎症組織/損傷の罹患部位(単数または複数)またはがんの部位へと直接注射した場合、HCELLおよび他のE−セレクチン/L−セレクチンリガンドの強制発現は、組織環境内における細胞のE−セレクチン媒介性およびL−セレクチン媒介性の付着/定着を促進するであろう。
(実施例3)
ヒト樹状細胞の初代培養物のアルファ(1,3)−フコシルトランスフェラーゼ処理は、細胞上の高レベルE−セレクチンリガンド活性を誘導し、HCELLの発現を強制する
(実施例4)
ヒト調節性T細胞(Treg)の初代培養物のアルファ(1,3)−フコシルトランスフェラーゼ処理は、細胞上の高レベルE−セレクチンリガンド活性を誘導し、HCELLの発現を強制する;HCELL+Treg投与は、自家細胞によって誘導される異種間GVHDを抑制する
(実施例5)
MSCおよびヒト血液白血球のアルファ(1,3)−フコシルトランスフェラーゼ処理は、スタンパーウッドラフリンパ球附着性アッセイによって評価される通り、細胞上のL−セレクチンリガンド活性を誘導する
63頁(2009年))。リンパ節高内皮細静脈へのリンパ球結合の分子基盤を評価するために1970年代半ばに考案されたこのアッセイは、関連する細胞の表面に発現されたその同族リガンド(単数または複数)に取り付くL−セレクチン(生きているリンパ球の表面において元々発現されている)の能力を測定する。本アッセイは、回転性剪断条件下で行われ、これにより、結合相互作用に別々の生物物理学的制限を設ける:最も強力なL−セレクチンリガンド(ガラスに取り付いている細胞の表面に提示)のみが、回転するリンパ球懸濁液上に呈示されたL−セレクチンの附着性を支持し得る。実際に、このアッセイにおけるリンパ球のL−セレクチン媒介性結合の支持に十分なほど頑強な唯一のL−セレクチンリガンドは、リンパ節高内皮細静脈において呈示されたHCELLおよび「内皮」L−セレクチンリガンド(まとめると、これらのL−セレクチンリガンドは、「アドレシン」と呼ばれる)である(R. Sackstein、Immunol. Rev.230巻:140〜163頁(2009年))。
し、細胞遠心分離した細胞の総細胞叢(lawn)内の斯かる細胞のパーセンテージを定量化する(表1のキーに示す通り)。
T細胞、単球、樹状細胞およびTregにおいて著しく誘導され得る。いずれの場合でも、このL−セレクチン結合活性は、強制されたHCELL発現の反映であり、図25、図28(A)〜図28(C)、図30(A)〜図30(E)および図33に表示されているsLex/E−Igを染色するウェスタンブロットデータによって示される通り、これらの細胞上のHCELL発現の結果と釣り合っている。
(実施例6)
マウスMSC上のHCELL発現は、NODマウスにおける向膵臓性(Pancreatotropism)を認可し、自己免疫性糖尿病の耐久性のある回復を付与する
(序文)
(材料と方法)
(マウス)
(MSC培養)
(MSC特徴付けおよび分化)
.3%オイルレッド溶液で染色して、脂質を含んだ液胞を評価した。
(MSCエクソフコシル化)
(ウェスタンブロット解析)
(フローサイトメトリーおよび免疫沈降研究)
(平行平板型フローチャンバー接着アッセイ)
(hGHウイルスベクターによるMSCの形質導入)
(GFPウイルスベクターによるMSCの形質導入)
(免疫蛍光)
0総拡大率)を使用して、免疫蛍光像を取得した。特異的染色に関するさらなる詳細については、補足方法セクションを参照されたい。
(マイトジェン刺激CD3/CD28 T細胞増殖アッセイ)
(NODマウスにおける新たに発症した高血糖の回復の研究)
(統計学)
(補足方法)
(フローサイトメトリーおよび免疫沈降研究)
(平行平板型フローチャンバー接着アッセイ)
(免疫蛍光)
(結果)
(FTVI修飾されたMSCの発現および機能解析)
キメラ(E−Ig)への結合の非存在によって示される通り、E−セレクチンリガンドを元々発現しなかった(図1(B))。
(FTVI修飾マウスMSCは、生理的剪断応力条件下でE−セレクチンへの結合増加を有する)
(全身投与されたFTVI修飾されたMSCは、NODマウスにおける新たに発症した高血糖を強力に回復させる)
(NODマウスの膵臓におけるE−セレクチン発現およびMSC局在化)
(エクソフコシル化は、MSC免疫抑制能力またはin vivo生存に効果がない)
(MSC CD44発現の非存在は、FTVI修飾されたMSCの抗糖尿病効果を抑止する)
MSCの投与が、抗糖尿病活性を付与したか否かを評価するために、それぞれ5×105個の細胞のFTVI修飾および未修飾CD44 KOならびにC57BL/6野生型MSCを、高血糖発病後2、7および30日目に新たに発症した糖尿病NODマウスに注射した。未修飾CD44 KO MSCを与えた6匹のマウスのうち5匹、およびFTVI修飾CD44 KO MSCを与えた7匹のマウスのうち6匹における自己免疫性糖尿病の回復失敗によって実証される通り、野生型MSCと比較して、MSCのCD44欠乏は、その抗糖尿病効果に有意な損壊をもたらした(それぞれ図6(A)および図6(B))。NODマウスにおける注射後に、CFSE標識したFTVI修飾および未修飾CD44
KO MSCは、膵臓への輸送に差を示さず(図6(C))、野生型MSCに観察されるものと同様のレベルであった(図4(H))。in vitroにおけるMSC抑制能力は、MSC CD44発現の欠如によっても、CD44 KO MSCのエクソフコシル化によっても抑止されず(図6(D))、投与されたFTVI処理CD44−/−MSCの正常血糖効果(単数または複数)の非存在が、免疫調節における固有の欠損に起因し得ないことを示唆する。注目すべきことに、エクソフコシル化が、CD44 KO MSC上のHECA452によって認識可能な細胞表面シアロフコシル化の発現をもたらすにもかかわらず、斯かる細胞が、糖尿病NODマウスにおける意図される生物学的成果を実現しないという知見は、細胞表面グリカン操作によって生じる強制されたセレクチン結合の生物学的影響の規定/予測における、誘導されるE−IgおよびHECA452免疫反応性を評価するためのごく単純なフローサイトメトリー研究を越えた、生化学的研究(例えば、ウェスタンブロット解析)の重要性を明らかに強調する。
(考察)
同種異系MSC製品の使用を支持するため、完全に同種異系供給源MSCの能力を増強するための戦略を用いることが有利となるであろう。HEC452反応性によって検出可能なFTVI依存性表面シアロフコシル化決定基が明らかに作製されたにもかかわらず、エクソフコシル化CD44 KO MSCが、高血糖の耐久性のある回復を誘導する能力を欠くという知見は、CD44骨格に明確に呈示されるE−セレクチン結合決定基(すなわち、HCELLの発生)が、強力な抗糖尿病効果の達成に必要とされることを示す。これは、必要な組織ホーミングおよび血管外遊出を成就するためのHCELL発現の重要な役割に関係している可能性があり[27]、そして/または関連する微小環境部位における適切な付着を達成するためのHCELL/CD44発現の要求を反映し得る[28]。MSC効果(単数または複数)を達成するためのin situ組織付着の役割は、免疫特権ゾーンを生じる膵島同種異系移植片とのMSC同時移植の研究によって強調されてきた[29〜31]。この点について、膵島血管周囲区域内および膵島白血球浸潤内のHCELL+MSCの観察される局在化は、免疫調節のライセンス化におけるHCELLの作動的役割を強調する:E−セレクチンは、罹患組織の内皮床内で発現され、白血球は、L−セレクチンを特徴的に発現するため、強力なE−セレクチンおよびL−セレクチンリガンドであるHCELLの発現は、最も激しい免疫反応性の微小環境内で明確に組織付着を促進するように機能する。in vivoにおけるMSCの免疫調節効果のさらなる研究が正当化されるが、本明細書におけるデータは、T1Dの治療法におけるHCELL+MSCの全身投与による増大された向膵臓性の潜在力を強調する。より広範には、E−セレクチンが、あらゆる炎症性部位における内皮床内でTNFおよびIL−1等のサイトカインによって上方調節されるという事実[17、18]は、多種多様な炎症性状態のためにMSCに基づく治療法の効力を改善するために強制されたMSC HCELL発現を活用する機会を提供する。
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rejection of fully allogenic islet grafts by the immunosuppressive activity of matrix metalloproteinase-2 and -9. Diabetes. 2009;58:1797-1806.
(実施例7)
神経幹細胞の細胞表面グリカン操作は、向神経性を増強し、多発性硬化症のマウスモデルにおける回復を改善する
(序文)
、1994年)。細胞動員における第1の必須事象は、内皮表面上の流動細胞の剪断抵抗性接着が関与し、これは、それぞれの対応する受容体に結合する、3種のCa2+依存性レクチンのファミリーであるセレクチン(E−、P−およびL−セレクチンで構成される)によって最も効率的に媒介されるプロセスである。このような相互作用は、最初に血管壁へと細胞を係留し、血管剪断流の文脈において、一般的な血行動態流を下回る速度において内皮表面に沿って細胞をローリングさせる(ステップ1)。このプロセスは、血管周囲区域に存在する適切なケモカインへの特異的細胞由来のケモカイン受容体の会合を容易にし、これにより、インテグリンファミリーメンバーの接着性増加をもたらす内側から外側へのシグナル伝達事象を誘発する(ステップ2)。次に、活性化された細胞インテグリンと、その対応する内皮細胞カウンター受容体との間の接着性相互作用は、ローリングの静止および血管壁への細胞の堅固な接着をもたらし(ステップ3)、最終的に、経内皮遊走(血管外遊出、ステップ4)をもたらす。
。注目すべきことに、E−セレクチンは、血管が枝分かれする部位においてパッチ状分布で炎症性期間を通じて発現され、優先的動員区域の存在を示唆する(Piccio, L.、Rossi, B.ら、2002年)。E−セレクチンは、MS患者における急性プラーク由来の血管
においても特徴的に見出される(Lee, S.J.およびBenveniste, E.N.、1999年;Washington, R.、Burton, J.ら、1994年)。これらの知見は、E−セレクチンが、炎
症性疾患における脳への循環細胞の動員において支配的な役割を果たすことを示唆する。
)。硫酸化に主に関与する追加的な構造修飾は、sLexへのP−およびL−セレクチンの結合親和性を増加させるが、斯かる修飾のいずれも、E−セレクチンの最適な結合に必要とされない(Leppanen, A.、White, S.P.ら、2000年;Rosen, S.D.、2004
年)。
O.、Grigoriadis, N.ら、2006年;Imitola, J.、Raddassi, K.ら、2004年
;Lee, S.T.、Chu, K.ら、2008年;Pluchino, S.、Quattrini, A.ら、2003
年;Pluchino, S.、Zanotti, L.ら、2005年;Ziv, Y.、Avidan, H.ら、2006年)。NSCが、それぞれCXCR4(Bezzi, P.、Domercq, M.ら、2001年;Flax, J.D.、Aurora, S.ら、1998年;Imitola, J.、Raddassi, K.ら、2004年)
およびVLA−4(Pluchino, S.、Zanotti, L.ら、2005年;Rampon, C.、Weiss,
N.ら、2008年)等、ステップ2およびステップ3/4エフェクターを発現することが周知であるが、NSCがステップ1エフェクターを元々発現するか否かに関するデータはない。したがって、本発明者らは、マウスNSCにおけるステップ1エフェクターの発現を調べ、このような細胞が、ステップ1エフェクター、特に、E−セレクチンリガンドを顕著に欠くことを見出した。EAEモデルを使用して、本発明者らは、細胞表面グリカン操作による強制されたE−セレクチンリガンド活性が、投与されたNSCの遊走およびより重要なことに、投与された細胞の治療効果(単数または複数)に影響を与えるか解析した。この目的のため、本発明者らは、グリコシルトランスフェラーゼプログラム化立体置換(GPS)と呼ばれる技術を利用して、関連するセレクチン結合グリカン決定基を細胞表面に作製した(Sackstein, R.、Merzaban, J.S.ら、2008年)。本明細書にお
いて、本発明者らは、2種の神経幹細胞膜糖タンパク質であるCD44およびNCAMのグリカンを修飾し、それぞれE−セレクチンリガンドHCELL(造血細胞E−/L−セレクチンリガンド)およびNCAM−Eを作製することにより、GPSが、NSC上のE−セレクチンリガンドの発現を強制することを報告する。NSC E−セレクチンリガンド活性の糖鎖工学的操作は、向神経性の増加をもたらし、検出可能な長期生着の非存在下でEAEにおける臨床転帰の改善を生じ、このような組織特異的幹細胞が、直接的な再生効果ではなく、回復効果を生じたことを示す。重要なことに、GPS操作されたマウス造血幹/前駆細胞(HSPC)の投与は、EAE臨床経過を改善しなかったため、この神経回復効果は、成体幹細胞の普遍的な特性ではない。これらの知見は、細胞遊走のエフェクターを作製するための細胞表面糖鎖工学的操作が、幹細胞に基づく治療法の効力を改善し得ることの最初の直接的な証拠の提供において、著しい臨床意義を有し、また、神経炎症性疾患の処置におけるNSCの使用に関する新たな展望も提供する。
(結果)
(神経幹細胞上の細胞遊走の分子エフェクターの発現)
L.ら、2006年;Campos, L.S.、Leone, D.P.ら、2004年;Imitola, J.、Raddassi, K.ら、2004年;Ji, J.F.、He, B.P.ら、2004年;Leone, D.P.、Relvas, J.B.ら、2005年;Pluchino, S.、Quattrini, A.ら、2003年;Pluchino,
S.、Zanotti, L.ら、2005年)(図9(B))。NSCは、十分に説明されたポリシアル酸(PSA)に加えて、神経細胞接着分子(NCAM)も特徴的に発現した(Vitry, S.、Avellana-Adalid, V.ら、2001年)(図9(B))。NSCは、PSGL−1、CD43、LFA−1(CD11a(α1)およびCD18(β2)鎖の両方を欠く)およびLPAM−1(α4β7)を発現しなかった(図9(B))。これらの結果は、NSCが、細胞遊出の多段階カスケードのステップ1エフェクターの発現を欠損しているにもかかわらず、血管外遊出におけるステップ2〜4を媒介し、放射状遊走による脳の発達におけるその動員にも関与するケモカイン受容体および関連するインテグリンエフェクターを発現することを示す(Imitola, J.、Comabella, M.ら、2004年)。
(GPSは、神経幹細胞上のE−セレクチンリガンド活性を強制する)
本発明者らは、α(1,3)−結合特異的フコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼVI(FTVI)でNSCを処理した。この酵素は、末端2型−ラクトサミン単位にフコースを特異的に配置する;該ラクトサミンが、α(2,3)−結合型シアル酸によりキャッピングされる場合、sLexが作製される。NSCのFTVI処理後に(GPS−NSC)、mAbであるCSLEX1、KM93およびHECA452との反応性を誘導したところ、sLexエピトープの強い発現(図10(A))、関連するE−Ig結合(図10(A))と一貫したが、P−Ig結合の誘導(図10(A))はなかった。注目すべきことに、CD15(SSEA−1またはLexとしても公知)の発現は、NSCにおいて高く(図10(A))、FTVIは、シアル酸付加されていない末端ラクトサミンをフコシル化し、これにより、CD15(SSEA−1)を得ることができるが、CD15の発現は、強制されたフコシル化の後に変化しなかった(図10(A))。まとめると、これらのデータは、α(1,3)−エクソフコシル化が、シアル酸付加されたラクトサミニル(lactosaminyl)グリカンにおいてのみ生じたことを示す。GPS処理に先立つNSCのブロメライン消化は、HECA452反応性を顕著に低減した(図10(B))。これは、糖脂質ではなく糖タンパク質が、シアロフコシル化決定基の優勢な担体であることを実証する。ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼC(PI−PLC)によるGPS−NSCの処理は、FACSによるHECA452シグナルの中程度の、ただし有意な減少をもたらした(図10(C))。これは、sLexデコレートされた糖タンパク質の少集団が、グリコホスファチジル(GPI)−結合型であることを示す。
、2007年;Rutishauser, U.、2008年)に基づき、本発明者らは、NCAMが、追加的なE−セレクチンリガンドとして機能していた可能性を推測した。よって、本発明者らは、汎NCAM mAbによる免疫沈降を行い、CD44の徹底的免疫沈降後に持続する残渣バンドが実際に、NCAMのものであったことを観察した(図11(B))。NCAM上の関連するシアロフコシル化が、N−グリカンにおいて呈示されたか否かを決定するために、本発明者らは、N−グリコシダーゼFによる消化後のGPS−NSCの溶解物のウェスタンブロットにおけるE−Ig反応性を検査した(図11(A));消化後のE−Igによる明らかな染色は観察されず、関連するE−セレクチン結合決定基(単数または複数)が、N−グリカンに呈示されることを示す(indicBing)。PI−PLC処理
後のHECA452シグナル(およびE−Igシグナル−データ図示せず)の僅かな減少によって示される通り、NSCの強制されたフコシル化後の全体的なsLex発現に対するNCAM−EのGPIアンカー型の寄与は、中程度である(図10(C))。したがって、マウスNSCの強制されたα(1,3)−フコシル化は、HCELLと共に、本発明者らが「NCAM−E」と命名した神経前駆体分子NCAMの特有のE−セレクチンリガンド反応性型を作製した。興味深いことに、ヒトNSC(CC−2599)は、GPS処理後にHCELLのみを発現し、NCAM−Eを発現しない(図16(A)〜図16(C))。
弱めることが示されている。NSCのこの免疫調節機能が、強制されたE−セレクチンリガンド活性によって影響されるか否かを評価するために、本発明者らは、Con A活性化に応答してリンパ節細胞の増殖を抑制するGPS−NSCおよび対照バッファー処理NSC(BT−NSC)の能力を調べた。図19(A)〜図19(C)に表示される通り、GPS−およびBT−NSCは両者共に、T細胞増殖を減少させると共に、等しく炎症性サイトカイン産生のレベルを抑制することができ、NSC上のGPS処理それ自体によって提供される免疫調節上の利点または不利益がないことを示唆する。興味深いことに、本発明者らは、E−IgへのGPS処理細胞の結合の際に増大された、BT−およびGPS−NSCの両方に関して、炎症性サイトカイン処理の際のNSCからの白血病阻害因子(LIF)の等しい放出も観察した(図19(C))。よって、NSCの強制されたエクソフコシル化は、in vitro研究によって決定される通り、NSC表現型または機能における望ましくない効果を伴うことなく一過性E−セレクチンリガンド活性を誘導した。
(GPS−NSCは、E−セレクチンとの頑強な生理的ローリング相互作用を呈示する)
に(PI 17日目)、腰部仙髄および脳を収集した。脳の共焦点解析は、脳におけるより多量のGPS−NSC(図13(A))およびFlk−1+血管外側の局在化(図20(A)〜図20(B))の両方を実証した。さらに、EAEにおける病理の大部分が生じる脊髄の並行して行った解析(図13(B)〜図13(D))は、PI 17日目までにBT−NSC浸潤よりも2倍多い数の血管外GPS−NSC浸潤を実証した(図13(D))。これらのデータは、GPS−NSCが、脳および脊髄の両方において、BT−NSCよりも有意に有効にCNS実質に浸潤することを示す。本発明者らの共焦点データをさらに確認するために、本発明者らは、in vivoでのNSCの短期ホーミングにおけるGPS操作されたE−セレクチンリガンド活性の効果を研究した。蛍光色素追跡用色素、CFSA−SE(カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル)を使用してNSCを染色し、材料と方法に記載されている通りにMOGによるPI 9日目および13日目にC57BL/6マウスへと養子移入した。2回目の細胞注射後16時間以内に、本発明者らは、GPS−NSCが、BT−NSCよりも3〜5倍効率的に脳、脾臓および肝臓に蓄積したことを観察した(図13(E))。脳、脾臓および肝臓への浸潤におけるGPS−NSCの相対的利点は、in situでのこれらの細胞の単純な優先的増大ではなく、輸送における真の差を反映したが、このことは、それらの平均CFDA−SE蛍光が、BT−NSCと比べて低減されなかったことから分かる(データ図示せず)。脾臓へと遊走した細胞から実際に、CD4+ T細胞とNSCとの密接な相互作用が存在することが明らかである(図13(F))。注射された細胞は、肺にも蓄積したが、GPS−およびBT−NSCの間に差はなく、おそらく、肺微小血管における立体的トラップの反映である(図13(E))。よって、GPS処理後にNSCに形成されたsLex構造は、これらの器官へのこれらの細胞の遊走を認可し、in vivoでのNSCの組織特異的遊走の駆動におけるE−セレクチンリガンド活性の決定的役割を強調する。
(GPS−NSCは、EAEにおける内在性間接的神経再生の増大によって、神経病理学の寛解に繋がるホーミングを増加させた)
対照NSC(BT−NSC)の注射は、HSPCおよび偽処置動物と比較して、EAEの臨床重症度を減弱した(p=0.006)。しかし、GPS−NSCのi.v.注射(n=30)は、BT−NSC(n=30;p=0.006)、GPS−HSPC(n=30;p<0.0001)、BT−HSPC(n=30;p<0.0001)および偽(n=30;p<0.0001)処置動物と比較して、より有意に改善された臨床スコアを示した。GPS−HSPCの注射(顕著に増加されたE−セレクチンリガンド活性を呈示する、図21(A)(Merzaban, J.S.、Burdick, M.M.ら、2011年)を参照)または
BT−HSPCの注射のいずれも、対照動物と比較して、MOG誘導動物の臨床スコアにおける改善を示さなかった(図21(B)〜図21(C)および表3)ため、疾患重症度のこの寛解が、NSCに特異的であることに留意することが重要である。
実際に、GPS−またはBT−HSPCのいずれかの注射は、臨床転帰悪化に向かう傾向を示したが、これは、NSC注入の観察される有益な効果が、成体幹細胞の一般特性ではないことを示す。
(考察)
る。MS等の播種性神経学的疾患の場合、組織特異的NSCの使用は、CNS快復の達成における臨床的有用性を立証することができるが、この目標を成し遂げるための直近のハードルは、神経傷害の部位に適切な数の細胞を送達することである。先の研究は、脳卒中、脊髄外傷およびMSの実験モデルにおける移植されたNSCの利益を示した(Ben-Hur,
T.、Einstein, O.ら、2003年;Einstein, O.、Fainstein, N.ら、2007年;Einstein, O.、Grigoriadis, N.ら、2006年;Imitola, J.、Raddassi, K.ら、2004年;Lee, S.T.、Chu, K.ら、2008年;Pluchino, S.、Quattrini, A.ら、
2003年;Pluchino, S.、Zanotti, L.ら、2005年;Ziv, Y.、Avidan, H.ら、2006年)。これらの研究において送達経路として罹患部位への直接注射を使用したが、疾患のびまん性の性質およびそれに伴う解剖的制約を考慮すると、多巣性CNS疾患における罹患組織(単数または複数)内のNSCの適切な定着を成就するために、局所投与(すなわち、in situ注射)であることが要求される送達の血管経路は、非実用的である。今までに、NSC上の細胞遊走の分子エフェクターの発現を評価する研究はなく、より重要なことに、斯かるエフェクターの発現を最適化する仕方について取り組む研究のうち、NSC向神経性を増大できたものはなかった。
S.J.およびBenveniste, E.N.、1999年;Piccio, L.、Rossi, B.ら、2002年)。よって本明細書において、本発明者らは、E−セレクチンリガンドの発現を強制するためのNSCのグリカン操作が、細胞の全身送達を増大し、結果として、MSモデルにおいて生物学的効果を有するか評価しようと試みた。
05年;Pluchino, S.、Quattrini, A.ら、2003年)を発現することを示す。際だ
ったことに、マウスNSCのエクソフコシル化は、顕著にこれらの糖タンパク質上のsLex決定基の高発現を生じ、CD44から強力なE−セレクチンリガンドHCELLへの変換をプログラム化し(Dimitroff, C.J.、Lee, J.Y.ら、2000年;Dimitroff, C.J.、Lee, J.Y.ら、2001年)、また、本発明者らが「NCAM−E」と命名した、ほぼ120kDaおよびほぼ140kDaのNCAMの2種のシアロフコシル化グリコフォームの発現を誘導する。ブロットローリングアッセイは、HCELLが、GPS−NSC上に発現される主要なE−セレクチンリガンドであることを明らかにした(図12(B))。これらの知見は、PI−PLC消化によるNCAM−Eの除去後のフローサイトメトリーの結果によって裏づけされ、NSC sLex発現およびE−Ig反応性の相当な保持を示す(図10(C))。
AMは、脳における前駆体細胞遊走の媒介において決定的な役割を果たすものと思われる(Glaser, T.、Brose, C.ら、2007年;Lavdas, A.A.、Franceschini, I.ら、2
006年;Zhang, H.、Vutskits, L.ら、2004年)。そこで、本発明者らのデータ
は、NCAMが、sLex決定基を作製するためのエクソフコシル化のアクセプターとして機能することができる関連する末端α−(2,3)−シアリルラクトサミニルグリカンを呈示することの最初の証拠を提供する。NSCの細胞表面糖鎖工学的操作後に、PSA発現レベルは変化せず、強制されたフコシル化の72時間以内にsLex発現の完全な損失があったため、誘導されたE−セレクチンリガンド活性は永続的なものではない(図11(A)〜図11(C))。よって、血管外遊出の後に、天然NCAMへの一時的な復帰が起こる筈であり、続いて浸潤NSCは、内在性NCAM媒介性実質内CNS遊走を起こすことができるのであろう。注目すべきことに、マウスNSCは、α−(2,3)−シアリルラクトサミニルグリカンを有するNCAMを発現するが、ヒトNSC(CC−2599)に関する本発明者らの研究は、このような細胞が、エクソフコシル化後にHCELLのみを発現し、NCAM−Eを発現しないことを示す(図15);よって、ヒトNSCは、CD44のみにおける強制されたフコシル化のアクセプターとして機能する関連するシアロラクトサミニルグリカンを発現することができる。齧歯類系においてヒトNSCが使用される異種移植研究を解釈する際に、このような種の差について考慮するべきである(Goncharova, V.、Das, S.ら、2014年)。
ガンドストロマ細胞由来因子1α(SDF−1α、CXCL12としても公知)を局所アストロサイトおよび内皮が上方調節するCNS傷害に向けたin vivoでの遊走を促進することが示されている(Imitola, J.、Raddassi, K.ら、2004年)。これらの
観察は、CNS傷害へのNSCホーミングの促進における卓越したステップ2エフェクターとしてCXCR4を規定する。VLA−4の対応する内皮受容体であるVCAM−1も、傷害に対する脳の炎症性応答において上方調節される(Justicia, C.、Martin, A.ら、2006年)。CXCR4に加えてVLA−4を構成的に発現するNSCのみが、EAEの罹患病変における炎症したCNS微小血管の周りに蓄積することができたという点において、VLA−4/VCAM−1軸は同様に、NSCの遊走において決定的な役割を果たすことが示された(Pluchino, S.、Zanotti, L.ら、2005年)。近年の異種移植
研究は、インテグリンが、ラット脳卒中モデルにおけるヒトNSC上の遊走のステップ1メディエータとしての役割を果たし得ることを示唆し、セレクチン相互作用が、このモデル系に必ずしも必要ないことを示唆する(Goncharova, V.、Das, S.ら、2014年)
。さらなる研究が正当化されるが、ステップ1相互作用のメディエータとしてのインテグリンの変動する役割(単数または複数)は、使用した炎症性モデル、宿主動物系、血管の透過性、該炎症部位における内皮接着分子の発現、部位における可溶性接着分子の存在、および流速を定める血管の物理的特性(すなわち、血管の直径)における差を反映している可能性がある(Berlin, C.、Bargatze, R.F.ら、1995年;Ding, Z.M.、Babensee, J.E.ら、1999年;Zarbock, A.、Kempf, T.ら、2012年;Zarbock, A.、Lowell, C.A.ら、2007年)。いずれの場合でも、NSCにおけるステップ1エフェク
ターとしてのE−セレクチンリガンドの発現は、CXCR4およびVLA−4の構成的発現を補完するように機能し、これにより、炎症性部位へのNSCの動員を最適化するであろう。したがって、本発明者らは、静脈内投与された(非修飾)BT−NSCが、EAEマウスの脳に浸潤することができることを観察したが(図13(E))、糖鎖工学的操作による強制されたE−セレクチンリガンド発現は、脳へのNSCの顕著に増加された遊走を生じた。この増加された向神経性に伴って、CNS炎症は顕著に縮小された(図14(A)〜図14(I))。さらに、図13(A)〜図13(F)に示す通り、CNS実質におけるNSC蓄積は、注射後17日目までにBT−NSCよりもGPS−NSCの間で2倍高く、ステップ1エフェクターの強制発現が、血管外遊出を促進することを示す。
長類および齧歯類において記載されており(Alam, H.B.、Sun, L.ら、2000年;Drake, T.A.、Cheng, J.ら、1993年;Redl, H.、Dinges, H.P.ら、1991年;Schweitzer, K.M.、Drager, A.M.ら、1996年)、CNS炎症性状態で特徴的に発現さ
れる炎症誘発性サイトカインによって上方調節される(Emamgholipour, S.、Eshaghi, S.M.ら、2013年;Weishaupt, A.、Jander, S.ら、2000年);実際に、ポリマ
ーへのsLexのコンジュゲーションは、脾臓内における斯かるポリマーの蓄積を顕著に増大することが示され(Horie, K.、Sakagami, M.ら、2000年;Horie, K.、Sakagami, M.ら、2004年)、sLex発現が、脾臓送達を促進することの直接的な証拠を提供する。NSCによる脾臓の浸潤が、常在性脾臓細胞(例えば、マクロファージ)による炎症性サイトカインの産生を弱め、抗炎症性効果をもたらすことが報告された(Lee, S.T.、Chu, K.ら、2008年)。他の研究は、血管内投与されたNSCが、神経再生の増大による(Martino, G.およびPluchino, S.、2006年;Pluchino, S.、Zanotti,
L.ら、2009年;Wang, L.、Shi, J.ら、2009年)のではなく、CNS傷害を
制限する末梢免疫抑制(Einstein, O.、Fainstein, N.ら、2007年;Einstein, O.、Grigoriadis, N.ら、2006年)または局所免疫調節をもたらすことを報告した。よって、NSCにおけるE−セレクチンリガンド活性の強制発現による観察される脾臓ホーミング増加は、免疫細胞に対するNSCの組織比増加の理由から、免疫調節による神経保護に寄与する一因であり得る。この概念は、GPS−NSCが、対照NSCにより観察されるものと比較して免疫調節利点を付与しなかったが、脾細胞に対するインプットNSCの比が増加するにつれて、T細胞増殖が減少することを示す本発明者らのin vitroデータによって支持される(図19(A))。
(材料と方法)
説明すると、マウス胎生期12日目の終脳VZから単離された、解離されたNSCの懸濁液(1ml当たり5×105細胞)を、コーティングされていない25cm2フラスコ(Falcon)内で、98%DMEM/F12(GIBCO)、1%N2サプリメント(GIBCO)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO)、8mg/mlヘパリン(Sigma)、10ng/ml白血病阻害因子(LIF、Chemicon)、20ng/ml bFGF(Calbiochem)において37℃、5%CO2にて培養した。大部分の実験に関して、2回目の継代後のNSCを使用した。ヴェルセン(Versene)(Life Technologies)におけるニューロスフェアの機械的解離に
より、神経幹細胞の単一細胞懸濁液を達成した。
に提示するデータに使用した。
ら、2008年)。簡潔に説明すると、先ずニューロスフェアを収集し、PBS/EDTA(0.02%)と15分間37℃でインキュベートすることにより単一細胞へと解離させた。次に、細胞をHBSSで洗浄し、計数し、20mM HEPES、0.1%ヒト血清アルブミンおよび1mM GDP−フコースを含有するHBSS(Ca2+またはMg2+なし)における60mU/ml FTVIに40分間37℃で再懸濁した。1時間0.1U/mlを使用して、37℃でPI−PLC反応を行った。HBSS+2%BSA+0.1%ブロメラインにおいて1時間37℃でブロメライン反応を行った。
、SDS−PAGEによって分離されたNSC膜タンパク質のセレクチン結合活性の検出に使用した。NSC膜調製物のウェスタンブロットを抗CLA(HECA−452)で染色し、10%グリセロールを含有するDMEMにおける浸漬により半透明にした。2mM
CaCl2および10%グリセロールを含有するDMEMにおいてCHO−E細胞を再懸濁した(5×106/mL)。平行平板型フローチャンバー下にブロットを置き、1.0ダイン/cm2の生理的に関連する剪断応力でCHO−E細胞を灌流し、流動培地における10%グリセロールの存在による粘性の増加を償うために容積測定流速における調整を行った。染色された目的のバンドの上におけるフローチャンバーの配置を助けるガイドとして分子量マーカーを使用した。1平方ミリメートル当たりの相互作用する細胞の数は、分子量領域の関数として作表し、接着ヒストグラムにコンパイルした。流動培地における5mM EDTAを含有するCHO−E細胞懸濁液を灌流することにより、非特異的接着を評価した。
が非常に可変的であるため、脊髄を選んだ。FACS解析のため、次に脊髄をホモジナイズし、その結果得られるペレットを0.25%トリプシン−EDTA(Invitrogen)に再懸濁し、37℃で10分間インキュベートした。0.01%SBTI、0.001%DNaseおよび0.075%BSAを含有するDMEMを使用して、消化プロセスを停止した。組織学解析のため、脳および脊髄を液体窒素中で手早く凍結し、切片作製まで−80℃で貯蔵した。腰部仙髄または前、中および後脳のクリオスタット切片(20μm)を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、続いて目的の抗体で染色した。血管を抗Flk−1(VEGFR2、Sigma)によって可視化し、NSCを抗sox−2(Millipore)で染色した、またはPKH26色素により赤色に可視化した。続いて、脊髄をホモジナイズし、その結果得られるペレットを0.25%トリプシン−EDTA(Invitrogen)に再懸濁し、37℃で10分間インキュベートした。0.01%SBTI、0.001%DNaseおよび0.075%BSAを含有するDMEMを使用して、消化プロセスを停止した。Flk−1(VEGFR2)染色によって血管を可視化した。
Laboratories、Campbell、California)を腹腔内注射する。盲検法様式でEAEをスコア化した;研究者は、注射に関与しておらず、群の組成を認識していなかった。次のグレードを使用した:グレード1、ぐったりした尾またはぐったりした尾を伴わない単離された歩調の弱さ;グレード2、部分的後肢麻痺;グレード3、全後肢または部分的後および前肢麻痺;グレード4、全後肢および部分的前肢麻痺;グレード5、瀕死または死んだ動物。0.2mlの容量のHBSSにおいて、細胞懸濁液としてBT−NSC、GPS−NSC、BT−HSPC、GPS−HSPCをEAEマウスの尾静脈に注射した。HBSS単独を注射した偽処置マウス(NSCなし)を陰性対照として使用した。
スフェアを形成する、MAP2+ニューロンに分化する、およびConA活性化リンパ節細胞の増殖を阻害するその能力に関して、in vitroでBT−およびGPS−NSCを比較した。NSC分化および自己再生能力:FGF/EGF含有培地において最初に培養されたニューロスフェアを、ポリ−D−リシン(PDL)コーティングされたガラス製カバーガラスに蒔いて増殖させ、続いて収集し、バッファー(対照)で1時間処理し、またはFTVI(60mU/mL)で酵素処理し、その後、その結果得られるBT−NSCおよびGPS−NSCを1μl当たり20個の細胞のクローン密度で蒔いて、ニューロスフェアとして96時間から5日間増殖させた。Axiovision顕微鏡(NY)によりニューロスフェアイメージングを捕捉した。ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト分化のため、24ウェルプレート内のPLコーティングされたガラス製カバーガラス上に解離されたニューロスフェアを蒔き、FGF/EGFなしで、ただし1%Glutamax、1%抗生物質/抗真菌薬および2%B27−サプリメントを含有するニューロベーサル(neurobasal)培地の存在下で培養した。5日目まで1日おきに新鮮培地を添加し、続いて細胞を、MAP2(ニューロン)、GFAP(アストロサイト)およびNG2(オリゴデンドロサイト前駆体)による免疫蛍光染色に付した。処理に関して盲検化された研究者による標準立体解析学的技法を使用して、MAP2+、GFAP+およびNG2+細胞を計数した。神経幹細胞およびリンパ節細胞の同時培養:ナイーブC57BL/6マウスからリンパ節を単離した。以前に記載された通りに、ウェル当たり2×105個の細胞で、96ウェルプレートにおいて単一細胞懸濁液としてリンパ節細胞(LNC)を培養した(Einstein, O.、Fainstein, N.ら、2007年)。培養培地は、2
.5μg/mlコンカナバリンA(ConA、Sigma)ありまたはなしで、10%ウシ胎仔血清、L−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、2−メルカプトエタノール、HEPESおよび抗生物質(BioWhittaker)を補充したRPMI−1640からなった。ニューロスフェアを解離させ、先ず、GPSで処理しまたは処理せず(BT)、その後、3,000ラドで放射線照射した。放射線照射後に、解離されたNSCを、ConA刺激LNCと異なる比でLNC培養培地に直接添加した。NSC数対LNC数の検査した比は:1:4、1:2、1:1、2:1および4:1であった。次に、チミジンを添加する前に細胞を48時間培養した。16時間後にチミジン取込みアッセイを行った。
脳におけるCNS病変は、サイズおよび位置が非常に可変的であるため、脊髄を選んだ。フローサイトメトリー解析のため、続いて脊髄をホモジナイズし、その結果得られるペレットを0.25%トリプシン−EDTAに再懸濁し、37℃で10分間インキュベートした。0.01%SBTI、0.001%DNaseおよび0.075%BSAを含有するDMEMを使用して、消化プロセスを停止した。組織学解析のため、脳および脊髄を液体窒素中で手早く凍結し、切片作製まで−80℃で貯蔵した。腰部仙髄または前、中および後脳のクリオスタット切片(20μm)を固定し、続いて目的の抗体で染色した。抗Flk−1(VEGFR2)によって血管を可視化し、抗SOX−2でNSCを染色した、またはPKH26色素によって赤色で可視化した。神経病理学解析のため、異なる群における動物の立体解析学的解析によって細胞定量化を行った。脊髄および脳の切片を作製し、頸部および腰仙部領域の3枚毎の切片を染色し、3〜5枚の切片の細胞定量化を強拡大率で行った。電動式ステージを備えるLSM 510共焦点顕微鏡を使用して、染色強度および総細胞数/強拡大率を立体解析学的に計算した。
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Claims (20)
- 対象における炎症および/または損傷組織として現れる疾患、障害または病状を処置するための組成物であって、
造血細胞E−/L−セレクチンリガンド(HCELL)を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでHCELLを発現し、前記幹細胞の集団が前記対象へと静脈内投与されることを特徴とし、
前記幹細胞の集団の投与が、前記炎症および/または損傷組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致した時間で行われ、
前記幹細胞の集団が、前記投与された幹細胞の天然集団と比較して前記炎症および/または損傷膵臓組織内で増大された局在化および/または定着を呈示する、組成物。 - 対象の炎症および/または損傷組織への幹細胞の送達を増大するための、および/または前記対象の前記炎症および/または損傷組織における幹細胞の組織定着を増大するための組成物であって、
造血細胞E−/L−セレクチンリガンド(HCELL)を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでHCELLを発現し、前記幹細胞の集団が、前記対象へと静脈内投与されることを特徴とし、
前記幹細胞の集団の投与が、前記炎症および/または損傷組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致した時間で行われる、組成物。 - 対象における炎症および/または損傷組織への幹細胞の送達を改善するための組成物であって、
造血細胞E−/L−セレクチンリガンド(HCELL)を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでHCELLを発現し、前記幹細胞の集団が、前記対象へと静脈内投与されることを特徴とし、
前記幹細胞の集団の投与が、前記炎症および/または損傷組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致した時間で行われ、
前記投与された幹細胞の集団が、幹細胞の天然集団と比較して増大されたホーミング、定着および生着のうちの1つまたは複数を実現する、組成物。 - 対象の炎症および/または損傷組織への幹細胞の送達、付着、定着および/または生着を増大するための組成物であって、
造血細胞E−/L−セレクチンリガンド(HCELL)を発現する幹細胞の集団を含み、前記集団が、幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでHCELLを発現し、前記幹細胞の集団が前記対象の血管系を通じて静脈内投与されることを特徴とし、
前記投与が、前記炎症および/または損傷組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致した時間で行われる、組成物。 - 対象における炎症および/または損傷組織の処置のための医薬の製造に使用するための造血細胞E−/L−セレクチンリガンド(HCELL)を発現する幹細胞の集団であって、前記処置が、前記対象にHCELLを発現する前記幹細胞の集団を静脈内投与するステップを含み、前記集団が、前記幹細胞の天然集団の発現のレベルを超えるレベルでHCELLを発現し、
前記処置が、前記集団を前記炎症および/もしくは損傷膵臓組織内の内皮細胞上のE−セレクチン発現と一致した時間で投与するステップを含む、幹細胞の集団。 - 前記幹細胞が、神経幹細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物または請求項5に記載の幹細胞の集団。
- 前記炎症および/または損傷組織が、神経組織である、請求項1から4または6のいずれか一項に記載の組成物または請求項5または6のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記炎症および/または損傷組織として現れる疾患、障害または病状が、多発性硬化症である、請求項1に記載の組成物。
- 前記対象が、多発性硬化症を有する、請求項2から4または6から7のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記炎症および/または損傷組織の環境において、前記投与された幹細胞の集団がさらに生着することを特徴とする、請求項1から4または6から9のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 免疫調節効果が、前記炎症および/または損傷組織内における前記投与された幹細胞の定着により実現される、請求項1から4および6から10のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から10のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 組織修復効果が、前記炎症および/または損傷組織内における前記投与された幹細胞の定着により実現される、請求項1から4および6から11のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から11のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記投与が、前記幹細胞集団の1回または一連の注射を含む、請求項1から4および6から12のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から12のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記投与が、HCELLを発現する前記幹細胞の集団の毎日、毎週、隔週、毎月または毎年の注射を含む、請求項1から4および6から13のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から13のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記対象における事前投与の免疫調節効果が低下したら、前記幹細胞集団が1回または複数回さらに前記対象に投与されることを特徴とする、請求項1から4および6から14のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から14に記載の幹細胞の集団。
- 前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである、請求項1から4および6から15のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から15のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記対象がヒト患者である、請求項1から4および6から16のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から16のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記幹細胞の集団が、HCELLが強制発現された幹細胞の修飾集団を形成するように処理され、前記幹細胞集団が、前記処理の24時間後に少なくとも70%の生存率を有する、請求項1から4および6から17のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から17のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記幹細胞の集団が、前記処理の48時間後に少なくとも70%の生存率を有する、請求項1から4および6から18のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から18のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
- 前記組成物または前記幹細胞の集団が、末梢血管アクセスまたは中心血管アクセスのいずれかによって全身的に静脈内投与される、請求項1から5および6から19のいずれか一項に記載の組成物または請求項5から7および9から19のいずれか一項に記載の幹細胞の集団。
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