BR112017014361B1

BR112017014361B1 - Uso de uma população de células-tronco mesenquimais (MSCS) modificadas com fucosiltransferase VI (FTVI) que expressa o ligante de E-L Selectina de célula hematopoiética (HCELL) para tratar diabetes

Info

Publication number: BR112017014361B1
Application number: BR112017014361-5A
Authority: BR
Inventors: Robert Sackstein
Original assignee: The Brigham And Women´S Hospital, Inc.
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2023-10-31
Also published as: AU2015374198B2; SG11201705401YA; EP3240893B1; HK1245132A1; US20160184367A1; KR20230127358A; CA2972899A1; EP4012024A1; US20200281985A1; SG10202013095YA; AU2015374198A1; BR112017014361A2; CN107249601A; AU2022201482A1; CA2972899C; JP2018502117A; WO2016109543A1; JP2023156522A; KR102569540B1; EP3240893A1

Abstract

uso de uma população de células-tronco mesenquimais (mscs) que expressa o ligante de e-/l-selectina de célula hematopoiética (hcell) para tratar diabetes. a presente invenção refere-se a métodos de tratamento incluindo administração de uma população de células modificadas para reforçar a expressão de um ligante de e-selectina e/ou um de l-selectina, a população de célula modificada tendo uma viabilidade celular de pelo menos 70% após um tratamento para reforçar tal expressão.

Description

[001] A presente invenção foi feita com apoio do governo sob concessões PO1 HL107146 (NHLBI Program of Excellence in Glycosciences), RO1 HL73714 e RO1 HL60528, concedidos pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.

[002] A presente invenção refere-se a composições e métodos para modificação da superfície celular e à eficiência e à aplicabilidade aperfeiçoadas de tais células modificadas em tratamento à base de célula de condições inflamatórias, lesão/dano a tecido e câncer.

[003] O sucesso de agentes terapêuticos à base de célula (também conhecidos como "agentes terapêuticos celulares adotivos") depende de levar as células relevantes para o(s) sítio(s) onde elas são necessárias em quantidade(s) suficiente(s) para obter o(s) efeito(s) biológico(s) pretendido(s). Administração de células para indicações clínicas pode ser obtida através de injeção direta (local) em tecido(s) envolvido(s), através de administração intravascular (por exemplo, sistemicamente ou através de administração à base de cateter a um leito vascular particular) ou através de aplicação/colocação das células diretamente sobre a área afetada (por exemplo, para úlceras de pele, queimaduras, etc). Em todas as formas de administração celular, seria vantajoso que as células administradas possuíssem moléculas de membrana que promovessem alojamento da célula dentro do sítio administrado precisamente dentro de microambientes de tecido que são críticos para obter o efeito pretendido, por exemplo, controle de inflamação, reparo de tecido, eliminação de rejeição, erradicação de câncer, etc. Um tipo de tal sítio microambiental são as "áreas perivasculares" presentes em e ao redor de microvasos dentro do tecido lesionado, uma vez que é bem conhecido que integridade da microvasculatura, e produção de novos microvasos (isto é, "angiogênese"), é um pré-requisito para regeneração/reparo de tecido. Na verdade, em todos os sítios de lesão de tecido, inflamação e câncer, células endoteliais dentro dos microambientes de tecido(s) afetado(s) exibem um conjunto característico de moléculas de adesão que servem um papel-chave em recrutamento de células em circulação (de origem sanguínea) para o sítio alvo. Essas moléculas endoteliais são suprarreguladas em citocinas inflamatórias tais como fator de necrose de tumor (TNF) e interleucina 1 (IL-1) e em humanos incluem as moléculas E-selectina e em camundongos as moléculas E-selectina e P-selectina, que são lectinas pertencentes a uma família de moléculas de adesão conhecidas como "selectinas" (a serem descritas em mais detalhes abaixo). Ainda, leucócitos que foram recrutados para um sítio de inflamação (incluindo câncer) ou para um sítio de lesão/dano de tecido exibem L-selectina, selectina do "leucócito"e, desta maneira, expressão de ligantes para L-selectina em células administradas promoveria alojamento de tais células em regiões de infiltrados de leucócito dentro do(s) tecido(s) afetado(s).

[004] À primeira vista, administração direta pareceria ser a abordagem mais eficiente para administração celular, especialmente considerando que um bolo concentrado de células poderia ser aplicado a uma área afetada. No entanto, há situações onde injeção local pode ser realmente contraproducente para os efeitos terapêuticos produzidos e, além disso, injeção local é prática para apenas certos locais anatômicos: (1) através da introdução de células pertinentes em suspensão de meio sob pressão hidrostática, o procedimento de injeção poderia prejudicar as células administradas e, ainda, poderia comprometer mais a integridade do tecido e romper reparo de tecido incipiente e/ou processos de defesa de hospedeiro, desta maneira exacerbando a condição inflamatória ou combatendo reações imunes apropriadas in situ; (2) em virtude de ser um método invasivo, a agulha/dispositivo de injeção (e a solução de suspensão) poderiam induzir dano de tecido alvo e/ou instigar dano de tecido colateral; (3) Injeção direta é mais factível para órgãos/tecidos com limites anatômicos bem definidos (por exemplo, o coração), e é imprático para tecidos sem apoio de tecido conectivo extensivo (por exemplo, o pulmão); (4) O procedimento de injeção poderia ser tecnologicamente exigente e de trabalho intensivo, requerendo uso de sistemas de administração sofisticados com apoio de imagem substancial, especialmente para órgãos/tecidos inacessíveis e/ou frágeis (por exemplo, o sistema nervoso central); (5) Mais importante, muitas condições degenerativas e inflamatórias são amplamente distribuídas e de natureza multifocal (por exemplo, osteoporose, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, etc) e então injeção direta não é nem prática nem eficaz. Desta maneira, embora haja condições/situações clínicas onde injeção local é possível, a via de administração por vasculatura é ordenada para todos os distúrbios "sistêmicos", bem como para qualquer tecido com acesso e/ou anatomia problemático não condescendente à injeção local (por exemplo, o pâncreas em diabetes, o pulmão em doença pulmonar obstrutiva crônica). A capacidade em administrar células repetidamente com esforço mínimo é uma outra vantagem prática importante de infusão sistêmica. Desta maneira, criação de metodologias para otimizar a expressão/atividade de efetores moleculares direcionando ambas a adesão/instalação de células diretamente injetadas dentro do ambiente infamatório e a migração fisiológica de células intravascularmente administradas ao(s) sítio(s) afetado(s) é uma chave para obter a grande promessa de todos os agentes terapêuticos à base de célula.

[005] A capacidade para direcionar migração de células de origem no sangue para um local predeterminado (direcionamento ("homing")) tem implicações profundas para uma variedade de processos fisiológicos e patológicos. Recrutamento de células em circulação para um sítio anatômico específico é iniciado por interações adesivas diferentes entre células em fluxo e endotélio vascular no(s) tecido(s) alvo(s). As moléculas que fazem a mediação desses contatos são chamadas "receptores de direcionamento" e, como historicamente definido, essas estruturas dirigem tropismo de células no sangue para o respectivo tecido alvo. Historicamente, três "receptores de direcionamento específicos de tecido" foram descritos: L-selectina para nós linfáticos periféricos, a4ß7(LPAM-1) para intestinos e tecido linfoide associado ao intestino, e uma glicoforma especializada da molécula Ligante-1 de Glicoproteína de P-selectina (PSGL-1) conhecida, especificamente, como o "Antígeno de Linfócito Cutâneo"(CLA) que promove migração celular para a pele (R. Sackstein, Curr. Opin. Hematol. 12, 444 (2005)). Notadamente, com exceção desses tecidos, foi reconhecido por várias décadas que células em circulação, especialmente células-tronco hematopoiéticas (HCSs), navegam efetivamente para a medula óssea (T. Lapidot, A., Dar, O. Kollet, Blood 106, 1901 (2005)), e vários estudos apontaram para um papel para selectina, predominantemente E-selectina se ligando a ligantes de E- selectina HSC, na mediação de recrutamento de HCSc para a medula óssea.

[006] A partir de uma perspectiva biofísica, um receptor de direcionamento funciona como um freio molecular, realizando ligação inicial então contatos de rolamento sustentatos de células em um fluxo sanguíneo no endotélio vascular em velocidades abaixo daquelas da corrente sanguínea prevalente (Etapa 1) (R. Sackstein, Curr. Opin. Hematol. 12, 444 (2005)). Em seguida, uma cascata de eventos segue, tipicamente potencializada por quimiocinas, resultando em ativação de adesividade de integrina (Etapa 2), aderência firme (Etapa 3) e transmigração endotelial (Etapa 4) (T. A. Springer, Cell 76, 301 (1994)). Este "paradigma de multietapa" sustenta que migração específica de tecido é regulada por uma combinação diferente de expressão de receptor de direcionamento e receptor de quimiocina em uma dada célula em circulação, permitindo reconhecimento de um "sinal de tráfego"pertinente exibido pelos ligantes adesivos de vasculatura relevantes e quimiocinas expressas dentro do endotélio alvo de uma maneira especifica de órgão. Seguindo a participação de receptor(es) de direcionamento direcionando o tráfego de células para a medula óssea, várias linhas de evidência indicam que uma quimiocina em particular, SDF-1 (CXCL12), desempenha um papel essencial em recrutamento de células para este sítio mediada pela Etapa 2 (T. Lapidot, A. Dar, O. Kollet, Blood 106, 1901 (2005); A. Peled e outros, Science 283, 845 (1999); D. A. Sipkins e outros, Nature 435, 969 (2005)). No entanto, expressão de SDF-1 não é limitada à medula óssea, e esta quimiocina é tipicamente expressa em todos os sítios de lesão/inflamação de tecido (R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)).

[007] Os efetores mais eficientes de interações de rolamento de Etapa 1 são as selectina (E-, P- e L-selectina) e seus ligantes (R. Sackstein, Curr. Opin. Hematol. 12, 444 (2005)). Como o nome implica, as selectinas são selectinas que se ligam a determinantes de carboidrato especializados, consistindo em sialofucosilações contendo uma(s) substituição(ões) de ácido siálico ligado a a(2,3) e uma modificação(ões) de flucose ligada a a(1,3) prototipicamente exibidas como o tetrassacarídeo sialila Lewis X (sLex; Neu5Aca2-3Galß1- 4 [Fuca1-3]GlcNAcß1)) (R. Sackstein, Curr. Opin. Hematol. 12, 444 (2005); M. J. Polley e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6224 (1991)). O glicano sLexé reconhecido por uma variedade de anticorpos monoclonais (mAbs), incluindo o mAb conhecido como "HECA452". Ee P-selectinas são expressas em endotélio vascular (P-selectina também em plaquetas) e L-selectina é expressa em leucócitos em circulação (R. Sackstein, Curr. Opin. Hematol. 12, 444 (2005). E- e P- selectina são tipicamente moléculas de membrana endotelial induzíveis que são proeminentemente expressas apenas em sítios de lesão de tecido e inflamação, onde sua expressão é gerada em resposta a citocinas inflamatórias. No entanto, a microvasculatura de medula óssea e pele expressam constitutivamente essas selectinas, e elas desempenham um papel-chave em recrutamento de estado uniforme de células de origem sanguínea para esses sítios (R. Sackstein, J. Invest. Dermatology, 122:1061-1069 (2004)). Importante, dentro de todos os sítios inflamatórios e sítios de lesão/dano a tecido em primatas (mas não roedores, E-selectina é a selectina de vasculatura principal mediando recrutamento celular, uma vez que o elemento promotor responsivo às citocinas inflamatórias TNF e IL-2 foi deletado do gene da P-selectina (R. Sackstein, Immunnol. Rev. 230: 140-163 (2009)).

[008] Dois ligantes principais para E-selectina foram identificados em células-tronco/progenitoras hematopoiéticas humanas (HSPC), a glicoforma de CLA altamente sialofucosilada de PSGL-1 (Z. Laszik e ouros, Blood, 88, 3010 (1996), R. Sackstein, Immunol. Ver. 230; 140163 (2009)) e uma glicoforma CD44 sialofucosilada especializada conhecida como Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL) (C. J. Dimitroff, J. Y. Less, S. Rafii, R. C. Fuhlbridge, R. Sackstein, J. Cell. Biol. 153, 1277 (2001); C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, R. C. Fuhlbridge, R. Sackstein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13841 (2000)). CD44 é uma proteina de membrane cellular bastante ubíqua, mas o fenótipo HCELL é encontrado predominantemente em HSPCs humanas. Em contraste com a distribuição restrita de HCELL, CLA/PSGL-1 é amplamente expresso dentre progenitores hematopoiéticos e células mielóides e linfoides mais maduras dentro da medula (Z. Laszik e outros, Blood 88, 3010 (1996), R. Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)). HCELL é operacionalmente definido como CD44 que se liga à E-selectina e L-selectina sob condições de cisalhamento, e é identificado através de análise Western blot de lisatos de célula como a glicoforma CD44 reativa com quimera de E-selectina-Ig (E-Ig) e com mAb HECA452, que reconhece sialila Lewis X (e, em adição a sLex, HECA452 reconhece o isômero de tetrassacarídeo de sLex conhecido como um "Lewis a sialilado" (sLea) onde fucose é ligada em ligação a(1,4) à N-acetiglicosamina dentro de uma estrutura principal de lactosamina tipo 1). Em adição a CLA e HCELL, leucócitos humanos e HSPCs podem também expressar uma glicoforma CD43 conhecida como "CD43-E" que pode servir como um ligante de E-selectina (Fuhlbrigge e outros, Blood 107:14211426 (2006), Merzaban e outros, Blood 118:1774-1783 (2011)) e, em leucócitos de camundongo, um outro ligante de E-selectina conhecido como Ligante- 1 de E-selectina (ESL-1) foi descrito (Merzaban e outros, Blood 118:1774-1783 (2011). Em todos os ligantes de selectina de glicoproteína (por exemplo, CD43-E, CLA e HCELL) ligação à E-selectina (e, também, à E-selectina e P-selectina) é criticamente dependente de modificações de ácido a(2,3)-siálico e a(1,3)-fucose (C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, S. Rafii, R. C. Fulhbridge, R., Sackstein, J. Cell. Biol. 153, 1277 (2001); C. J. Dimitroff; J. Y. Lee, R. C., Fuhlbrigge, R. Sackstein, Proc. Natl. Acad. Sci. US A 97, 13841 (2000); R. Sackstein, C. J. Dimitroff, Blood 96, 2765 (2000); C. J. Dimitroff, J. Y. Lee., K. S. Schor, B. M. Sandmaier, R. Sackstein, J. Biol. Chem. 276, 47623 (2001)). Em HSPCs, HCELL exibe os determinantes de ligação à selectina sialofucosilada pertinentes em N-glicanos (C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, S. Rafii, R. C. Fuhlbrigge, R., Sackstein, J. Cell Biol. 153, 1277 (2001); R. Sackstein, C. J. Dimitroff, Blood 96, 2765 (2000)). Ensaios in vitro de ligação de E- e L-selectina sob estresse de cisalhamento hemodinâmico indicam que HCELL é o ligante mais potente para essas moléculas expressas em qualquer célula humana (C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, S. Rafii, R. C. Fuhlbrigge, R., Sackstein, J. Cell Biol. 153, 1277 (2001); C. J. Dimitroff, J. Y. Lee, K. S. Schor, B. M. Sandmaier, R. Sackstein, J. Biol. Chem. 276, 47623 (2001)). Importante, embora E-selectina seja constitutivamente expressa em endotélio microvascular da medula óssea e pele, esta molécula é proeminentemente expressa em leitos endoteliais em todos os sítios de infamação, esta molécula é proeminentemente expressa em contas endoteliais em todos os sítios de inflamação -- ambos os tipos agudos e crônicos -- sem importar se ela é induzida por lesão de tecido direta (por exemplo, queimaduras, trauma, úlceras de decúbito, etc), eventos isquêmicos/vasculares (por exemplo, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, choque, hemorragia, coagulopatia, etc), infecções (por exemplo, celulite, pneumonia, meningite, SIRS, etc), neoplasia (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, linfoma, etc), condições imunológicas/autoimunes (por exemplo, doença enxerto vs. hospedeiro, esclerose múltipla, diabetes, doença inflamatória do intestino, lúpus eritematoso, artrite reumatoide, psoríase, etc), doenças degenerativas (por exemplo, osteoporose, osteoartrite, doença de Alzheimer, etc), doenças congênitas/genéticas (por exemplo, distrofias musculares, doenças de armazenamento lisossomal, doença de Huntington, etc), efeitos adversos de fármaco (por exemplo, hepatite induzida por fármaco, lesão cardíaca induzida por fármaco, etc), lesões tóxicas (por exemplo, exposição(ões) à radiação, exposição(ões) química(s), hepatite alcoólica, pancreatite alcoólica, cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia por cocaína, etc), desarranjos metabólicos (por exemplo, pericardite urêmica, acidose metabólica, etc), condições iatrogênicas (por exemplo, lesão de tecido induzida por radiação, complicações relacionadas à cirurgia, etc) e/ou processos idiopáticos (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, Síndrome de Parsonnage-Tumer, etc).

[009] Dentre os vários aspectos da presente invenção está a provisão de métodos para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição médica tendo expressão de E-selectina sobre células endoteliais vasculares e/ou infiltrados de leucócito dentro de tecido(s) afetado(s). A E-selectina se liga a carboidratos fucosilados, sialilados (por exemplo, membros das famílias Lewis X e Lewis A sialiladas presentes nativamente na superfície de certos leucócitos e células- tronco-progenitoras hematopoiéticas, isto é, células mielóides (por exemplo, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, macrófagos, etc), células dendríticas (derivadas de ambos linfoide e mieloide), linfócitos (por exemplo, células T puras e de memória, células B puras e de memória, células T efetoras, células T reguladoras, células assassinas naturais (células NK), etc), células progenitoras hematopoiéticas e células-tronco hematopoiéticas. Esses tipos são então encontrados em sítios inflamatórios agudos e crônicos, recrutados por E-selectina vascular para tais sítios inflamatórios. Leucócitos e HSPCs exibem caracteristicamente L-selectina. L-selectina, sozinha, se liga a carboidratos fucosilados, sialilados, tal como sLex. Desta maneira, sítios inflamatórios têm células que expressam E-selectina (em células endoteliais) e L-selectina (em leucócitos infiltrados e HSPCs).

[0010] A habilidade em obter resultado(s) pretendidos de agentes terapêuticos à base de célula é criticamente dependente da administração de células administradas a sítios onde elas são necessárias e, também, da localização das células administradas dentro de microambientes específicos de tecido. Desta maneira, há uma necessidade na técnica de métodos para aumentar a administração vascular de células administradas a sítios de lesão/dano de tecido, a sítios de inflamação, a sítios de câncer e a sítios de infecção. Há também uma necessidade na técnica de aumentar o alojamento/colonização das células administradas dentro do tecido afetado. Em suma, desta maneira, a presente invenção refere-se a métodos de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição médica se manifestando como tecido inflamado e/ou danificado e/ou câncer em um indivíduo, os métodos compreendendo administração ao indivíduo de uma população de célula que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina em um nível que excede aquele de uma população nativa das células. A administração ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo (por exemplo, tecido inflamado e/ou danificado, tecido canceroso) e/ou coincidente como o acúmulo de leucócitos (por exemplo, infiltrado leucocíticos) dentro do tecido alvo. A administração pode ser através de injeção direta dentro do tecido alvo e/ou através da vasculatura e/ou através de outro meio como descrito em mais detalhes abaixo.

[0011] A presente invenção refere-se ainda a um método para o tratamento de inflamação com uma população viável de células que expressam um ligante de E-selectina e/ou L-selectina. A população de célula viável expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L- selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células. A administração ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo por exemplo, tecido inflamado e/ou danificado, tecido canceroso) e/ou coincidente com o acúmulo de leucócitos (por exemplo, infiltrados leucocíticos) dentro do tecido alvo. A administração pode ser através de injeção direta no tecido alvo e/ou através da vasculatura (e/ou através de outros meios como descrito em mais detalhes abaixo) e tratamento da doença, distúrbio ou condição médica necessária ser acompanhada através de enxerto a longo prazo da das células administradas (isto é, o tratamento poderia ser obtido ou com colonização transiente ou com persistência/longevidade a longo prazo das células administradas no sítio de tratamento ou com proliferação de células administradas no sítio de tratamento ou com diferenciação e/ou maturação de células administradas no sítio de tratamento).

[0012] A presente invenção refere-se ainda a uma população viável de células que expressam um ligante de E-selectina e/ou L-selectina para uso na fabricação de um medicamento para tratamento de inflamação em um indivíduo. A população de célula viável expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células. A administração ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo (por exemplo, tecido inflamado e/ou danificado, tecido canceroso) e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos (por exemplo, infiltrados de leucócito) dentro do tecido alvo. A administração pode ser através de injeção direta no tecido alvo e/ou através da vasculatura e/ou através de outros meios como descrito em mais detalhes abaixo.

[0013] A presente invenção refere-se ainda a uma população viável de células que expressam um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor/doença maligna, o tratamento compreendendo administração ao indivíduo da população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, onde a população expressa o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa de células, onde o dito tratamento compreende administração à população coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tumor/tecido maligno e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tumor/tecido maligno.

[0014] A presente invenção refere-se ainda a uma população viável de células que expressam um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de um estado de doença manifestando inflamação, o tratamento compreendendo administração ao indivíduo de uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L- selectina, onde a população expressa o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde o dito tratamento compreende administração à população coincidente com o início de expressão de E- selectina em células endoteliais dentro do tumor/tecido maligno e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tumor/tecido maligno.

[0015] Outros métodos envolvendo a administração (por exemplo, através da vasculatura e/ou através de injeção direta no tecido e/ou através de outros meios) descritos aqui incluem, por exemplo, método de aumento da administração e colonização de célula em um tecido inflamado e/ou danificado ou sítio de câncer em um indivíduo (coletivamente, um tecido "alvo"), métodos de aumento da administração celular em um tecido alvo de um indivíduo e/ou aumento de colonização de tecido no tecido alvo do indivíduo, métodos de aperfeiçoamento de administração celular para um tecido alvo em um indivíduo, métodos de aumento da administração e colonização de célula em um tecido alvo de um indivíduo, método de aumento de direcionamento e enxerto de uma população de célula dentro de um tecido alvo em um indivíduo, métodos de tratamento de uma condição inflamatória em um indivíduo, métodos de aumento de reparo/regeneração de tecido em um indivíduo e métodos de tratamento de tumor/doença maligna em um indivíduo.

[0016] Em geral, qualquer uma de uma variedade de condições inflamatórias (por exemplo, aguda e/ou crônica) e/ou tecido danificado pode ser tratada de acordo com os métodos descritos aqui incluindo, mas não limitado a, aqueles iniciados por lesão a tecido direta (por exemplo, queimaduras, trauma, úlceras de decúbito, etc), eventos isquêmicos/vasculares (por exemplo, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, choque, hemorragia, coagulopatia, etc), infecções (por exemplo, celulite, pneumonia, meningite, SIRS, etc), neoplasia (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, linfoma, etc), condições imunológicas/autoimunes (por exemplo, doença enxerto vs. hospedeiro, esclerose múltipla, diabetes, doença inflamatória do intestino, lúpus eritematoso, artrite reumatoide, psoríase, etc), doenças degenerativas (por exemplo, osteoporose, osteoartrite, doença de Alzheimer, etc), doenças congênitas/genéticas (por exemplo, epidermólise bolhosa, osteogênese imperfecta, distrofias musculares, doença de armazenamento lisossomal, doença de Huntington, etc), efeitos adversos de fármaco (por exemplo, hepatite induzida por fármaco, lesão cardíaca induzida por fármaco, etc), lesões tóxicas (por exemplo, exposição(ões) à radiação, exposição(ões) química(s), hepatite alcoólica, pancreatite alcoólica, cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia por cocaína, etc), desarranjos metabólicos (por exemplo, pericardite urêmica, acidose metabólica, etc), condições iatrogênicas (por exemplo, lesão a tecido induzida por radiação, complicações relacionadas à cirurgia, etc) e/ou processos idiopáticos (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, Síndrome de Personnage-Tumer, etc).

[0017] Em certas modalidades, por exemplo, o ligante de E- selectina e/ou L-selectina expresso pela população celular é selecionado de um ou mais de ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL), Ligante de E-selectina de Molécula de Adesão de Célula Neural (NCAM-E), CD43E e CLA. Em uma modalidade, o ligante de E-selectina é Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL) e/ou Ligante de E-selectina de Molécula de Adesão de Célula Neural (NCAM-E). Em uma outra modalidade, o ligante de E-selectina é HCELL. Em uma outra modalidade, o ligante de E-selectina é NCAM-E. Em uma outra modalidade, o ligante de L-selectina é HCELL. Notadamente, uma vez que E-selectina é expressa dentro de leitos endoteliais do tecido afetado e leucócitos expressam caracteristicamente L-selectina, expressão de HCELL, um ligante de E-selectina e L-selectina potente, serviria para promover alojamento de tecido expressamente dentro dos microambientes de imunorreatividade/dano a tecido mais intenso.

[0018] Como discutido em outro ponto aqui em mais detalhes, uma variedade de métodos pode ser utilizada para preparar a população de células para administração ao indivíduo. Em uma modalidade, a população é preparada através de contato da célula ou uma população de células com glicosiltransferase junto com açúcar de nucleotídeo doador apropriado. Por exemplo, engenharia de glicano pode ser usada para sialofucosilar CD44 para reforçar a expressão de Ligante de E- selectina de Célula Hematopoiética (HCELL), através de expressão reforçada por glicosiltransferase de resíduos de fucose (fucosilação), resíduos de ácido siálico (sialilação) ou ambos (sialofucosilação). Alternativamente, glicosiltransferases tal como fucosiltransferase podem ser usadas para transferir estruturas de glicano intactas tal como sialil-Lewisx ou sialil-Lewisa para superfícies celulares. Ainda, métodos não enzimáticos podem ser usados para ligar covalentemente ou não covalentemente ligantes de E-selectina e/ou L-selectina a superfícies celulares. Por exemplo, aptâmeros, sLex (sialil-Lewisx), glicomiméticos e/ou peptidomiméticos de sLex glicanos, sLea (sialil-Lewisa), glicomiméticos e/ou peptidomiméticos de sLea glicanos e outras porções que se ligam a E-selectina e/ou L-selectina podem ser não covalentemente ligados a superfícies celulares usando pares de biotina- estreptavidina ou covalentemente ligados a superfícies celulares; seja covalente ou não covalente, a ligação pode ser direta ou através de um ligante. A título de exemplo adicional, partículas de exibição de fago ou anticorpos que se ligam a E-selectina e/ou L-selectina podem ser covalentemente ou não covalentemente ligadas à superfície celular, em cada caso mediando aderência de células tratadas à E-selectina e/ou L- selectina.

[0019] Em geral, e independente da maneira de preparação da população celular, a maneira de preparação provê uma população celular modificada tendo uma viabilidade de pelo menos 70% em 24 horas a partir do momento da modificação. Em uma modalidade do tipo, a população celular modificada tem uma viabilidade de pelo menos 80% em 24 horas a partir do momento da modificação. Em algumas modalidades, a população de célula modificada tem uma viabilidade de pelo menos 85% em 24 horas a partir do momento da modificação. Em algumas modalidades, a população de célula modificada tem uma viabilidade de pelo menos 90% em 24 horas a partir do momento da modificação. A viabilidade pode ser determinada através de métodos conhecidos na técnica tal como exclusão do azul tripano ou através de avaliação por citometria de fluxo colorida dupla para iodeto de propídio e tingimento com Anexina V. Preferivelmente, o fenótipo das células (outro que não a modificação de superfície celular) é preservado após tratamento. Por fenótipo preservado quer dizer que a célula mantém sua função e/ou atividade nativa. Por exemplo, se a célula for uma célula- tronco ela retém sua potência regenerativa, por exemplo, sua totipotência ou sua pluripotência ou sua multipotência ou sua onipotência.

[0020] As populações de célula modificadas são viáveis (isto é, têm uma viabilidade de pelo menos 70% em 24 horas desde o momento de modificação como descrito acima) e têm ligação aumentada à E- selectina e/ou L-selectina em relação a uma população nativa das células. A administração de células pode ser através da vasculatura e/ou através de injeção direta no tecido (e/ou através de outros meios como descrito em detalhes abaixo). Em uma modalidade, a população de célula modificada é administrada em um momento coincidente com o início de inflamação ou a infiltração de leucócitos em tecido. Em uma outra modalidade, a população de célula modificada é administrada um pouco antes do início de inflamação ou a infiltração de leucócitos no tecido.

[0021] Em casos onde células sofrem engenharia de glicano para reforçar expressão de sLex ou sofrem decoração com estruturas de sLex (por exemplo, através de técnicas de avidina-estreptavidina), medição de expressão de sLex aumentada em células tratadas pode ser realizada através de tingimento com fluorescência com mAb HECA452 ou qualquer outro mAb que reconheça determinantes de sLex, seguido por citometria de fluxo para detectar intensidade de fluorescência. O limiar de fluorescência predeterminada da população de célula modificada é determinado primeiro analisando uma amostra de células nativas (não tratadas). Aumentos em sLex de células tratadas é definido como aumento de porcentagem de células positivas para marcador (por exemplo, células reativas a HECA452) de mais de 10% comparado com população nativa de células e/ou por um aumento de 10% em intensidade de fluorescência de canal média em relação àquela da população de célula de linha de base (não tratada). Para detecção de se a população de célula tratada tem ligação aumentada à E-selectina, ligação à E-selectina pode ser avaliada usando ou estudos de câmara de fluxo de placa paralelo sob condições de estresse de cisalhamento como descrito aqui ou através de tingimento com quimera de E-selectina-Ig e avaliação de intensidade de fluorescência através de citometria de fluxo. A amostra controle (linha de base) de células é ensaiada usando o ensaio de ligação de E-selectina funcional descrito em outro ponto aqui ou através de um outro ensaio de ligação de fluorescência de E-selectina geralmente aceito conhecido na técnica. Os níveis de fluorescência de ligação à E-selectina são medidos para a amostra de população controle (linha de base). Ligação aumentada à E-selectina é definida como células tratadas tendo aderência aumentada à E-selectina em um ensaio de ligação específico para E-selectina. Em uma modalidade, ligação aumentada à E-selectina pode ser definida através de uma mudança de fluorescência em um ensaio de ligação à E-selectina usando reagentes conjugados à fluorcromo, por exemplo, por exemplo, ligação de quimera de E-selectina-Ig conforme ensaiado através de citometria de fluxo, onde o número de células dentro da população que possui aumento de ligação à E-selectina aumenta em pelo menos 10% mais do que aquele da ligação de linha de base (isto é, aumento de 10% em população positiva para marcador) e/ou é pelo menos 10% maior em fluorescência de canal média do que um limiar de fluorescência predeterminado (associado com a população de célula nativa). Em uma outra modalidade, a porcentagem de células que possui reatividade de E-selectina aumentada é aumentada em 25% e/ou a população modificada excede o limiar de fluorescência predeterminado em 25%. Em uma outra modalidade, a população modificada excede a reatividade de linha de base e/ou limiar de fluorescência predeterminado em 50%. Em uma outra modalidade, a porcentagem de células que possui reatividade para E-selectina aumentada é aumentada em 75% em relação àquela da população de linha de base de células de ligação à E-selectina e/ou a população modificada excede o limiar de florescência predeterminado em 75%. Em uma outra modalidade, pelo menos 90% das células na população modificada excederam a população de ligação à E-selectina de linha de base e/ou o limiar de fluorescência predeterminado. Em uma outra modalidade, pelo menos 95% das células na população modificada excederam a população de ligação à E-selectina de linha de base e/ou o limiar de fluorescência predeterminado.

[0022] Aumento da ligação à L-selectina pode ser determinada através de um aumento em ligação à L-selectina usando um ensaio de ligação à L-selectina funcional com especificidade alta tal como uma câmara de fluxo de placa paralelo sob condições de estresse de cisalhamento dinâmico ou um Ensaio Stamper-Woodruff, onde o tratamento celular aumenta a porcentagem de células apoiando aderência mediada por L-selectina. No caso de ensaios de placa paralela, a população de célula tratada exibe aumento de pelo menos 10% em interações adesivas de ligação/rolamento com L-selectina (afixada e exibida na superfície de apoio de plástico ou vidro da câmara) comparado com aquela de linha de base (células não tratadas). No caso do ensaio Stamper-Woodruff, aderência de linfócito à L-selectina aumentada é definida por um aumento de pelo menos 10% em ligação de célula tratada a linfócitos L-selectina+ sob um cisalhamento giratório de 80 rpm; ligação de célula de linha é avaliada nos não tratados (população controle) e diretamente comparada com aquela na população de célula tratada.

[0023] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente conhecido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporados a título de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo definições, prevalecerá. Ainda, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes.

[0024] Outros objetos e características serão em parte aparentes e em parte apontados a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] Figuras 1(A)-1(D). Efeitos de exofucosilação (tratamento FTVI) sobre expressão de ligante de E-selectina por células-tronco mesenquimais de camundongo (MSCs). (A) MSCs derivadas de medula de C57BL/6 não têm a expressão de CD45 e expressam marcadores de MSC de camundongos característicos Sca-1, CD29, CD44, CD73 e CD105. MSCs nativamente não têm reatividade com mAb HECA452 e com quimera de E-selectina-Ig (mE-Ig) (isotipo = cor vermelha e anticorpo = cor azul). (B) Fucosiltransferase VI (FTVI)- MSC modificado (linha sólida) tingiu positivo para mAbs HECA452 e foram reativos com mE-Ig. Digestão de MSCs modificadas com FTVI com bromelina e proteinase K (histograma sombreado) reduziu significantemente reatividade de quimera de E-selectina-Ig de murino (mE-Ig), mas não tingimento de HECA452, indicando que glicoproteínas sensíveis à bromelina servem como o(s) ligante(s) de E-selectina principal(ais) em MSCs modificadas com glicano (isto é, tratadas com FTVI). A linha pontilhada representa controles de tingimento (controle isotipo para tingimento de HECA452 e quelação de cálcio com EDTA para tingimento de mE-Ig). (C) Análise Western blot de reatividade de HECA452 (esquerda) e mE-Ig (direita) de lisatos de célula de MSCs não modificadas (-) e MSCs modificadas com FTVI (+). Modificação com FTVI induziu porções reativas a HECA452 e mE-Ig predominantemente em uma faixa de glicoproteína dupla de ~10 kDa. (D) CD44 foi imunoprecipitada a partir de quantidades equivalentes de lisato de célula de MSCs modificadas com FTVI (+) ou não modificadas (-). Imunoprecipitados sofreram então eletroforese e blot com CD44 (mAbs KM114 e IM7; esquerda) e HECA452 (direita).

[0026] Figura 2. Ensaio de câmara de fluxo de placa paralelo de aderência de MSC do tipo selvagem modificada com FTVI e não modificada a células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) tratada com TNF-a. Modificação com FTVI melhorou notadamente adesão de MSC à HUVEC em 0,5 dynas/cm2, com ligação evidente em estresse de cisalhamento de 20 dynas/cm2. Tratamento de HUVEC com mAb de bloqueio de função anti-E-selectina (anti-CD62E) reduziu interações adesivas de rolamento de MSCs modificadas com FTVI para níveis similares àqueles de MSCs não modificadas. Similarmente, remoção de determinantes de sLexatravés de tratamento com sialidase de MSCs modificadas com FTVI reduziu a adeção para níveis equivalentes a MSCs não modificadas.

[0027] Figuras 3(A)-3(C). Efeitos de administração intravenosa de MSC não modificada e modificada com FTVI sobre hiperglicemia em camundongos NOD diabéticos de início novos. (A) NOD hiperglicêmico injetado com PBS (controle não tratado) não mostrou nenhuma reversão de hiperglicemia (níveis de glicose acima de 600 mg de glicose/dL). Comparado com infusão de MSCs não modificadas (B), infusão de MSCs modificadas com FTVI (C) resultou em um aumento notável em número de camundongos com reversão para normoglicemia e na durabilidade de reversão de diabetes. Setas no eixo X significam dias de infusão de MSC.

[0028] Figuras 4(A)-4(H). Tingimento come imunofluorescência de ilhotas para avaliar expressão de E-selectina e localização de MSCs no pâncreas. Figuras 4(A) e 4(B): ilhotas pancreáticas de (A) camundongos BALB/c diabéticos-resistentes e (B) camundongos NOD foram tingidos quanto à expressão de insulina (verde) e E-selectina (vermelho). As ilhotas foram demarcadas por linha pontilhada. Comparado com BALB/c (A), camundongos NOD (B) mostraram produção de insulina diminuída devido à insulite. Nas Figuras 4(C)-4(G), seções de criostato de pâncreas de camundongos NOD tratados com MSC tingidos com DAPI (azul). Figuras 4(C) e 4(D): tingimento de seções sequenciais de pâncreas de NOD demonstrou co-localização de marcador endotelial CD31 (C) e E-selectina (D), confirmando a presença de E-selectina em células endoteliais de peri-ilhota. Figura 4(E): co-tingimento de ilhota de NOD com DAPI (azul), marcador de célula T CD3 (verde) e insulina (vermelho) (E) revela infiltração de célula T característica nas margens da ilhota. Figuras 4(F) e 4(G): imagens de imunofluorescência de uma seção de criostato tingida para MSC infiltrante (visualizada com mAb HECA452 anti-sLex conjugado a FITC; verde); ilhota (F) (visualizada através de mAb anti-insulina conjugado a APC; vermelho) e microvaso expressando E-selectina (G) (visualizado com mAb anti-E-selectina conjugado a PE; vermelho. Tingimento identifica MSCs HECA452+ em zonas de insulinas, em proximidade com microvasos expressando E-selectina na área de peri-ilhota e agrupadas dentro de áreas de infiltrados linfocíticos (isto é, células que expressam caracteristicamente L-selectina). Figura 4(H): infiltração pancreática de MSCs intravenosamente administradas em hospedeiros NOD e BALB/c. Acúmulo de MSCs modificadas com FTVI em pâncreas de camundongos NOD é 3 vezes maior comparado com aquele de MSCs não modificadas (p<0,01), enquanto nenhuma diferença em infiltrados pancreáticos é observada em hospedeiro BALB/c (n=3 camundongos por grupo; mínimo de 30 campos contado por grupo em ampliação de 60X).

[0029] Figuras 5(A)-5(B). Modificação de MSCs com FTVI não afeta sobrevivência celular ou capacidade imunossupressora. (A) Níveis similares de hGH foram detectados no soro de camundongos NOD em pontos de tempo diferentes seguindo injeção com MSCs modificadas com FTVI ou não modificadas pHRST-hGH transduzidas com pHRST-hGH. (B) MSCs modificadas com FTVI e não modificadas suprimem igualmente proliferação de células T CD4+ de NOD estimuladas com CD3/CD28, indicando que modificação com glicano não aumenta a capacidade de MSC em suprimir proliferação de linfócito.

[0030] Figuras 6(A)-6(D). Falta de expressão de CD44 anula o efeito antidiabético de MSC modificada com FTVI sistemicamente administrada. (A) Como comparado com MSC do tipo selvagem não modificada (Figura 3B), administração de MSCs deficientes em CD44 mostrou efeito antidiabético modesto. Apenas 1 camundongo NOD (de 7) recebendo MSCs KO CD44 não modificadas mostrou reversão de hiperglicemia que foi transiente (recorrência de diabetes no dia ~30) e 6 de 7 camundongos NOD diabéticos permaneceram hiperglicêmicos. (B) Como comparado com resultados em camundongos recebendo MSCs do tipo selvagem modificadas com FTVI (Figura 3C), administração de MSCs KO CD44 modificadas com FTVI conferiu efeitos antidiabéticos mínimos, com apenas 1 de 6 camundongos NOD mostrando reversão de hiperglicemia. (C) Acúmulo de MSCs em pâncreas de NOD não foi diferente em camundongos recebendo MSCs KO CD44 modificadas com FTVI (barra branca) comparado com camundongos recebendo MSCs KO CD44 não modificada (barra preta) (p<0,01), e em cada caso foi similar àquele recebendo MSC não modificada (Figura 4H). Infiltrados de MSC foram quantificados em ampliação de X60. (D) Ambos MSCs KO CD44 modificados com FTVI e não modificados possuem capacidade imunossupressora, similarmente diminuindo proliferação de célula T no ensaio de estimulação de célula T CD3/CD28.

[0031] Figura 7. Caracterização de MSCs derivadas de medula óssea de camundongo. MSCs foram diferenciadas em osteócitos, adipócitos e condrócitos (ampliação de X200).

[0032] Figura 8. Modificação com FTVI de MSCs CD44+/- resulta em aumento similar em reatividade de HECA452 como MSCs do tipo selvagem (WT). MSC não modificada (linha pontilhada) não mostra nenhuma reatividade com HECA452, enquanto MSC modificada com FTVI (linha sólida) e MSC KO CD44 modificada com FTVI (preenchido de cinza) mostraram níveis de tingimento similares com HECA452, indicando que exofucosilação cria epítopos sialofucosilados em bases alternativas (isto é, não CD44) em MSC KO CD44.

[0033] Figuras 9(A)-9(B): células-tronco neurais (NSCs) não têm ligantes de E-selectina, mas expressam várias outras moléculas de adesão de superfície celular. (A) Análise citométrica de fluxo de expressão de HECA452, KM93, CSLEX-1, ligante de E-selectina (ligação à quimera de E-selectina-Ig (E-Ig)) e ligante de P-selectina (ligação à quimera de P-selectina-Ig (P-Ig)) em NSCs. Os controles de isotipo correspondentes mostraram sinais de sobreposição para cada anticorpo pesquisado, isto é, RatIgM (para HECA-452; MFI: 1,9), IgM de camundongo (para KM93 e CSLEX-1; MFI: 2,7) e IgG1 humano (para E-Ig e P-Ig; MFI: 3,5). Um gráfico de histograma representando um perfil de ligação a E-Ig típico ilustra que mais de 99% das células expressam consistentemente ligação a E-Ig seguindo estereossubstituição programada por glicosiltransferase (GPS) através de tratamento de superfície celular com Fucosiltransferase VI. (B) Análise citométrica de fluxo de CD43 (S7 e 1B11), PSGL-1 (2PH1, 4RA10), CD44 (IM7, KM114), NCAM, PSA, CD49d, CD49e, CD29, LPAM-1, CD11a, CD18 e CXCR4. A linha pontilhada é controle de isotipo, a linha preta é anticorpo específico. Todos os resultados exibidos são representativos de n=5 experimentos de citometria de fluxo realizados em NSCs.

[0034] Figuras 10(A)-10(C): tratamento com GPS (isto é, a(1,3)- exofucosilação através de tratamento com FTVI) de NSCs gera sialofucosilação principalmente em glicoproteínas, algumas das quais são ligadas a glicofosfatidilinositol (GPI). (A) Análise citométrica de fluxo de reatividade de HECA452, CD15, KM93, CSLEX1, E-Ig e P-Ig em BT-NSCs (barras pretas) e GPS-NSCs (barras cinzas). Os controles de isotipo correspondentes para cada anticorpo pesquisado foram: IgM de rato (para HECA-452; MFI: 1,8), IgM de camundongo (para CD15, KM93 e CSLEX-1; MFI: 1,9) e IgG1 humano (para E-Ig e P-Ig; MFI: 3,2). Os resultados exibidos são representativos de cinco experimentos separados. (B) Análise citométrica de fluxo de reatividade de HECA452 de GPS-NSCs não digerida (barras pretas) ou digeridas com bromelina (barras cinzas) antes de tratamento com GPS. Os valores são média ± SEM. (n = 3 para cada grupo). (C) Análise citométrica de fluxo de reatividade de HECA452 de GPS-NSCs não digeridas (barras pretas) ou digeridas com fosfolipase C (PI-PLC) para clivar âncoras de GPI (barras cinzas). Os valores são média ± SEM. (n = 3 para cada grupo).

[0035] Figuras 11(A)-11(C): tratamento com GPS de NSCs cria ligantes de E-selectina transientes em 100, 120 e 140 kDa que corresponde a HCELL e N-CAM-E. (A) CD44 foi imunoprecipitado (com IM7 e KM114 mAb para CD44) a partir de quantidades equivalentes de lisatos de célula de NSCs tratadas com GPS (GPS) ou tratadas com tampão (BT). Análise Western blot foi realizada em imunoprecipitados de NSCs e sobrenadantes (SN) dos imunoprecipitados, que sofreram eletroforese e blot com HECA452, E- Ig e CD44. (B) N-CAM foi imunoprecipitado (com N-CAM 13) a partir de quantidades equivalentes de lisatos celulares de lisatos de NSCs tratadas com GPS (+) ou tratadas com tampão (-) que tinham sido ou tratadas ou com PNGaseF (+) ou não (-). Imunoprecipitados então sofreram eletroforese e blot com E-Ig e N-CAM. Tingimento com E-Ig foi realizado na presença de Ca2+. (C) NSCs foram tratadas com GPS no Dia 0 e culturadas por mais 3 dias em meio de crescimento normal. Todas as alíquotas de 24 horas de células foram removidas e ensaiadas quanto à atividade de ligante de E-selectina através de citometria de fluxo. Vide também Figuras 11(A)-11(C), 12(A)-12(B) e 13(A)-13(F).

[0036] Figuras 12(A)-12(B): GPS-NSCs têm interações adesivas resistentes a cisalhamento notadamente aumentadas com E- selectina endotelial sob condições de estresse de cisalhamento definidas. (A) BT-NSCs ou NSCs foram perfundidas em HUVECs estimuladas com IL-1ß e TNF-a a 1,0 dyn/cm2. Acúmulo de NSC foi então determinado em estresses de cisalhamento de 1, 2, 4, 8, 16, 25 e 32 dyn/cm2. GPS-NSCs mostram interações adesivas de rolamento em HUVECs em um estresse de cisalhamento de até 32 dyn/cm2. Para controlar a especificidade de ligação de GPS-NSCs, EDTA foi adicionado ao tampão de ensaio (grupo de EDTA), ou HUVECs estimuladas foram pré-tratadas com um mAb de bloqueio de função para E-selectina (grupo anti-E-Sel) antes do uso em ensaios de adesão. Os valores são média ± SEM. (n = 4 para cada grupo). P < 0,001 para comparações de GPS- NSCs com todos os outros grupos em todos os níveis de estresse de cisalhamento. (B) Gráfico de barra de adesão para ensaio de rolamento de blot (células de rolamento/mm2) para células CHO-E perfundidas em immunoblots de SDS-PAGE de glicoproteínas de membrana reativa a HECA-452 de NSCs a 0,6 dyna/cm2. Imunoprecipitados de CD44/HCELL e panNCAM de ambos BT-NSC (barras pretas) e GPS-NSCs (barras cinzas) foram separados através de SDS-PAGE e sofreram blot para HECA-452 antes da realização do ensaio. Para controlar a especificidade de ligação a CHO-E para glicoproteínas de membrana, EDTA foi adicionado ao tampão contendo as células CHO-E antes do uso em ensaios de adesão; quaisquer células se ligaram sob esta condição (dados não mostrados). Os resultados apresentados são representativos de rodadas múltiplas (n=4) em blots de HECA-452 de preparações de membrana múltiplas (n=3) de NSCS.

[0037] Figuras 13(A)-13(F): GPS-NSCs exibem direcionamento aperfeiçoado em um modelo in vivo de EAE. (A-D) GPS-NSCs migram para o parênquima do SNC mais eficientemente do que BT- NSCs. 1 x 106 GPS-NSCs ou BT-NSCs foram marcadas com corante PKH26 e foram injetadas intravenosamente em camundongos EAE induzidos com MOG no dia 9 e no dia 13 pós-imunização (PI). (A) Análise do cérebro anterior de camundongos EAE (no dia 17 PI) que não receberam nem BT-NSCs nem GPS-NSCs revelou que números menores de células positivas para PKH26 são vistos em animais injetados com BT-NSCs comparado com GPS-NSCs. As setas amarelas indicam NSCs e as setas brancas indicam infiltrados. A linha branca pontilhada indica bordas meningeais. As Figuras 20(A)-20(B) mostram análise adicional dessas seções para confirmar que NSCs (PKH26; vermelho) estão localizadas fora dos recipientes de Flk-1 (verde) e que elas são positivas para SOX-2 (verde). (B) Cordões espinhais lombo-sacrais (inserto) foram coletados no dia 17 PI. No dia 17 PI, mais GPS-NSCs migraram para fora dos vasos sanguíneos para o parênquima do cordão espinhal do que BT-NSCs. Os vasos sanguíneos foram visualizados através de tingimento com Flk-1 (VEGFR2; verde). A borda do parênquima do cordão espinhal é destacada com uma linha pontilhada branca. NSCs marcadas com corante PKH26 são mostradas em vermelho e núcleos contratingidos com TO-PRO-3 são azuis. WM, matéria branca. V, vasos sanguíneos. (C) Os insetos mostram uma vista tridimensional das NSCs migradas indicadas pelas setas em A. (D) Quantificação de números de BT-NSCs e GPS-NSCs por migração 200x por área de cordão espinhal no dia 17 PI foi determinada. Um aumento significante nos números de GPS- NSCs migratórias em BT-NSCs foi evidente, *p < 0,05. (E) Quantificação de biodistribuição e NSCs. GPS-NCSs (barras cinzas) ou BT-NSCs (barras pretas) foram marcadas com CFDA-SE e injetadas intravenosamente em camundongos C57BL6 tratados com MOG no dia 9 e no dia 13 pós-imunização. Cérebro, nós linfáticos, baço, fígado e pulmão foram analisados 16 horas após a última injeção para determinar a porcentagem de células positivas para CFSE presentes dentro de uma porta definida representando NSCs. Camundongos não- EAE que receberam GPS-NSCs ou BT-NSCs foram usados para padronizar os sinais observados em cada tecido testado. Os camundongos que não receberam células foram usados para determinar o sinal de base. Barras de erro representam o erro padrão da média. Os dados são representativos de 2 experimentos separados onde 10 camundongos por grupo foram testados. (F) Demonstração confocal in vivo que NSCs exofucosiladas são encontradas em contato íntimo com células T CD4 no baço in vivo (NSCs são marcadas de rosa e células T CD4 de verde); esta colocalização de NSCs e linfócitos seria ocasionada por NSC HCELL se ligando a L-selectina de linfócito.

[0038] Figuras 14(A)-14(I): GPS-NSCs contribuem para melhora significante de sintomas de EAE através de neuroproteção aumentada. (A) As classificações clínicas de EAE em camundongos C57BL/6 imunizados com MOG 35-55 no Dia 0 e subsequentemente injetados com 1x106 NSCs tratadas com tampão marcadas com GFP (BT-NSC; triângulos vermelhos cheios; n = 30), NSCs tratadas com GPS (GPS-NSC; círculos verdes cheios; n = 30) ou camundongos falso- tratados (Sem NSC; círculos pretos cheios; n = 30) no dia 9 e dia 13 após imunização foram determinadas. Os camundongos que receberam GPS-NSCs exibiram um aperfeiçoamento clínico pronunciado comparado com camundongos falso-tratados (p=0,0001) e camundongos injetados i.v. com BT-NSCs (p=0,006). (B) A carga cumulativa de doenças foi avaliada através de realização de uma análise de regressão linear comparando a inclinação das curvas em (A). Esses dados destacam que GPS-NSCs (linha verde pontilhada) melhoram significantemente as classificações clínicas acima daquelas de BT-NSCs (linha vermelha). Os camundongos recebendo ou GPS- NSCs ou BT-NSCs exibiram classificações clínicas significantemente aperfeiçoadas comparado com camundongos que não receberam NSCs (quaisquer NSCs; linha preta). Esses dados também sugerem que BT-HSPCs (linha azul) e GPS-HSPCs (linha púrpura) pioraram a doença (vide Fig. 21(C)). (C) Neuropatologia no dia 30 PI do cérebro de camundongos EAE injetados com NSCs foi analisada através de tingimento com anti-CD11b mAb (verde) e o marcador nuclear To-Pro3 (azul). Injeção de GPS-NSC leva a significantemente menos lesão por seção cerebral conforme medido através da numeração de macrófago/micróglia de CD11b de 20 seções diferentes de 3 cordões espinhais diferentes. Gráficos em barra mostram a numeração de macrófago/micróglia de CD11b em seções de cordão espinhal por campo de energia alto (HPF) de camundongos EAE que receberam Nenhuma NSC, BT-NSC ou GPS-NSC e também a numeração de infiltrados por HPF foi calculada com base em tingimento com To-Pro3. Setas amarelas correspondem a micróglias ativadas e setas brancas correspondem a infiltrados nas meninges (m). Notar que as micróglias nas amostras Sem NSC são mais ativadas do que aquelas encontradas nas amostras de BT-NSC e GPS-NSC. Também o tamanho dos infiltrados nas meninges é maior do que nas amostras Sem NSC do que nas amostras de BT-NSC. Barras de escala, 100 µM para painéis superiores. Barras de escala, 50 µm para painéis inferiores. (D) Neuropatologia do cérebro de camundongos EAE injetados com NSCs foi analisada através de tingimento de 20 seções diferentes de 3 cérebros separados de camundongos que receberam ou quaisquer NSCs (EAE Sem NSCs), BT-NSC (EAE BT-NSCs) ou GPS-NSC (EAE GPS-NSCs) com CD4 (para medir infiltrações de célula T), CNPase (para quantificar células remielinantes), Olig-2 (para medir diferenciação oligodendroglial) ou SOX-9 (para medir a multipotência de precursores neurais) (verde) e To-Pro3 (azul). Injeção de GPS-NSC levou a significantemente menos infiltração de célula T, remielinação aumentada, números maiores de oligodendroglias e preservação de números de progenitor. (E) Gráficos em barra mostram a numeração de células T CD4, CNPase, Olig2, SOX-9 em seções cerebrais por campo de energia alto (HPF) de camundongos EAE que receberam Nenhuma NSC, BT-NSC ou GPS-NSC (como mostrado em (D)), indicando que animais que receberam GPS-NSCs exibiram neuroproteção aumentada de células progenitoras. (F-I) Injeção de GPS-NSC e BT-NSC leva à regeneração axonal e proteção axonal aumentadas comparado com controle Sem NSC conforme medido através de tingimento de GAP-43 (verde; p<0,001) (F) e através de tingimento menor com o anticorpo monoclonal SMI32 (vermelho; p<0,001) (H) conforme avaliado através de imagem confocal quantitativa de intensidade de pixel de GAP43 em mais de 500 medições individuais. Corante de tingimento To-Pro3 foi usado para detectar núcleos de célula (azul). (G,H) Com base em imagem confocal quantitativa de mais de 500 medições individuais de representação gráfica de intensidade de pixel de GAP-43 (Imitola, J., Cote, D. e outros, 2011) (G) e SMI32 (I) foram determinadas; notar que padrões de SMI32 (I) demonstraram ovoides axonais em animais com EAE, mas redução em animais injetados com NSCs (I) e intensidade de pixel de SMI32 mostrou uma correção gradual de integridade axonal em animais com GPS-NSCs. Há uma redução de ovoide axonal e fragmentos axonais comparado com controles e BT-NSCs como mostrado no desenho abaixo (I) Barra de escala, 100 µm exceto pelo tingimento com SMI32 onde a barra de escala, 50 µm.

[0039] Figura 15: tratamento com citocina inflamatória não induz expressão de ligante de selectina em NSCs de camundongo. NSCs foram estimuladas com 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de IL-1ß, 10 ng/ml de IFNYindependentemente ou em combinação (todos a 10 ng/ml). Em 24 h, NSCs foram coletadas e analisadas através de citometria de fluxo quanto à ligação de E-selectina. Controles incluíam células NSCs e Kg1a não tratadas (controle positivo para ligação à E- selectina).

[0040] Figuras 16(A)-16(C): HCELL é o único ligante de E- selectina criado por tratamento com GPS em uma linhagem de NSC humana (exemplar) (CC-2599). (A) Análise citométrica de fluxo de CD15, CSLEX-1, HECA452 e ligante de E-selectina (ligação a E-Ig), expressão em NSCs humanas ou tratadas com GPS (barras cinzas) ou tratadas com tampão (BT; barras pretas). A intensidade de fluorescência média é mostrada para cada anticorpo medido. (B) Análise citométrica de fluxo de CD44, PSGL-1, NCAM e CD43. (C) Análise Western blot de reatividade a E-Ig de lisatos de NSC de fontes de camundongo e humanas. CD44 e NCAM foram imunoprecipitados de quantidades equivalentes de lisatos de célula de NSCs de camundongo ou NSCs humanas tratadas com GPS (+) ou tratadas com tampão (-). Os imunoprecipitados foram então eletroforados e sofreram blot com E-Ig. Tingimento de NSCs tratadas com GPS com E-Ig foi realizado na presença de Ca2+.

[0041] Figura 17: tratamento com GPS não afeta a habilidade de NSCs em formar neuroesferas. 200 NSCs GFP+viáveis foram plaqueadas por cavidade em uma placa de 96 cavidades imediatamente seguindo tratamento com GPS por 7 dias. As neuroesferas resultantes foram contadas e a frequência de neuroesfera foi calculada como o número de neuroesferas dividido pelo número de células plaqueadas. Não havia nenhuma diferença estatisticamente significante na densidade de neuroesferas ou no número de neuroesferas formadas entre BT-NSCs e GPS-NSCs. Uma imagem representativa das neuroesferas de GFP+ usadas para estes experimentos é mostrada onde a fluorescência vermelha indica expressão de Nestin e a fluorescência verde indica GFP. Notar que NSCs BT- e GPS-GFP+ foram ambas capazes de formar neuroesferas igualmente. Esta Figura está relacionada às Figuras 11(A)-11(C).

[0042] Figuras 18(A)-18(D): tratamento com GPS não afeta a capacidade de diferenciação de NSC em neurônios (A), astrócitos (B, D) ou precursores de oligodendrócitos (C, D). 1x105 BT- e GPS- NSC foram culturadas nos meios de diferenciação apropriados e após 120 horas, números de neurônios MPA-2+ (A), astrócitos GFAP+ (B, D) e oligodendrócitos NG2+ (C) foram contados por campo de visão 20x. Não havia nenhuma diferença estatisticamente significante entre a habilidade de BT e GPS-NSCs em diferenciar ao longo dessas três linhagens (p=0,01). (D) Astrócitos GFAP+ e oligodendrócitos NG2+são mostrados em vermelho e To-Pro3 é usado para tingir núcleos de células-tronco neurais tradas in vitro com tampão controle (BT) ou FTVI (GPS). Barra de escala, 50 µm. Essas Figuras são relacionadas às Figuras 11(A)-11(C).

[0043] Figuras 19(A)-19(C): tratamento com GPS não afeta a função de imunomodulação de NSCs in vitro. Efeitos imunossupressivos in vitro diretos de NSCs sobre células de nó linfático (LNCs) foram medidos através de co-cultura de NSCs irradiadas com LNCs isoladas de camundongos C57BL/6 puros. Ambas BT-NSC e GPS-NSC irradiadas suprimiram incorporação de 3H-timidina (A) em LNCs em resposta à concanavalina A (ConA) de uma maneira dependente da dose e também suprimiram produção de citocina inflamatória (B) conforme medido através de ELISA para um grau igual; as razões correspondem a números de NSCs para números de LNCs (1:4, 1:2, 1:1, 2:1 e 4:1). Notar que através do aumento da razão de NSC:LNC comparado com LNC sozinha (primeira barra), a quantidade de incorporação de 3H-timidina diminuiu significantemente (p=0,0005). Notar também que não houve nenhuma diferença estatisticamente significante entre a habilidade de BT-NSC e GPS-NSC em inibir proliferação (p=0,2). (C) 1x106 BT-NSCs ou GPS-NSCs foram tratadas por 24 h com ou sem citocinas inflamatórias (IFN-Y 10 ng/mL e TNF- a15 ng/mL) e com ou sem E-Ig (5 ng/mL) antes da extração de RNA e síntese de cDNA. RT-PCR em tempo real revelou a razão de aumento de expressão de gene (relacionado a BT ou GPS-NSCs sozinha) calculada usando 2-???CT e a expressão relativa de mRNA de LIF foi ensaiada em relação ao gene de manutenção GAPDH. Os valores são média ± SEM (n = 4 experimentos). Essas Figuras estão relacionadas às Figuras 11(A)-11(C).

[0044] Figuras 20(A)-20(B): GPS-NSCs migram para o parênquima do SNC mais eficientemente do que BT-NSCs. 1 x 106 GPS-NSCs ou BT-NSCs foram marcadas com corante PKH26 e foram injetadas intravenosamente em camundongos EAE induzidos por MOG no dia 9 e no dia 13 pós-imunização (PI). Os cérebros foram coletados no dia 17 PI e rapidamente congelados antes de seções de 20 µm serem preparadas e tingidas com anticorpos: anti-Flk-1 (VEGFR2; verde) ou anti-SOX-2 (vermelho) para revelar vasos sanguíneos e a posição das NSCs, respectivamente. (A) BT NSCs estão principalmente localizadas com células endoteliais FLK-1+ enquanto GPS-NCS são encontradas no parênquima uma vez que elas cruzaram o endotélio. Essas NSCs expressam sox-2, um marcador para células-tronco neurais (B). Essas Figuras estão relacionadas às Figuras 13(A)-13(F).

[0045] Figuras 21(A)-21(C): tratamento com GPS gera atividade de ligante de E-selectina robusta em HSPCs de camundongo, mas isso não se traduz em melhora de EAE. (A) Análise citométrica de fluxo de reatividade de E-Ig em células-tronco/progenitoras hematopoiéticas de camundongo BT- e GPS (HSPC; LineagenegC- kitpos). A intensidade de fluorescência média é mostrada acima de cada histograma para o controle de isotipo hIgG1, reatividade de E-Ig em BT- HSPC e reatividade de E-Ig em GPS-HSPC. Essas células foram usadas para experimentos EAE in vivo como um controle. (B) As classificações clínicas de EAE em camundongos C57BL/6 imunizados com MOG 35-55 no Dia 0 e subsequentemente injetados com 1x106 HSPC tratados com tampão (BT-HSPC; diamantes azuis abertos; n = 30), HSPC tratada com GPS (GPS-HSPC; diamantes púrpura abertos; n = 30) ou camundongos falso-tratados (Sem NSC; círculos pretos cheios; n = 30) no dia 9 e no dia 13 após imunização foram determinadas. Nenhum aperfeiçoamento significante nas classificações clínicas foi evidente em camundongos recebendo ou BT- ou GPS- HSPC. (C) A carga cumulativa de doença foi avaliada através da realização de uma análise de regressão linear comparando a inclinação das curvas em (B). Essas Figuras estão relacionadas com as Figuras 14(A)-14(H).

[0046] Figura 22: nenhuma evidência de sinal de GFP foi observada no Dia 30 PI de BT- ou GPS-NSCs injetadas em camundongos EAE. Camundongos C57BL/6 foram sacrificados 30 dias após imunização com MOG 35-55 (no dia 0) e injeção subsequente com 1x106 NSCs tratadas com tampão (BT-NSC), NSCs tratadas com GPS (GPS-NSC) ou camundongos falso-tratados (Sem NSC) no dia 9 e no dia 13 e imunoistoquímica para células GFP+ foi realizada. Em 30 dias células GFP+ PI não foram identificadas em seções de grupos de estudo relevantes, mesmo quando anticorpos contra GFP (vermelho) foram comparados com sinal de GFP endógeno (EGFP; verde). NSCs culturadas antes da injeção foram usadas como um controle positivo (NSC-Pre Tx) e mostraram um sinal de GFP robusto. Barra de escala, 50 µm. Esta Figura está relacionada com as Figuras 14(A)-14(H).

[0047] Figura 23: modelo de neurorrestauração fornecido pelo tratamento com GPS de proteínas de superfície de NSC nativas, CD44 e NCAM, criando novos efetores de etapa 1, HCELL e NCAM-E, que se ligam eficientemente à E-selectina endotelial em camundongos EAE. Como um resultado de lesão, células endoteliais e glias podem produzir sinais de lesão (por exemplo, SDF-1a e E-selectina) que direcionam GPS-NSCs em direção a nichos induzidos por lesão em número maior do que em camundongos controle. Apesar do número aumentado de NSCs recrutadas, ao invés de substituição de célula, NSCs oferecem modulação local de imunidade e regeneração endógena de SNC através do aumento do número de oligodendróglias SOX-9/Olig2+. Isto leva subsequentemente a células oligodendrogliais mais maduras (CNPase+), menos perda axonal e mais regeneração axonal. Moléculas de nicho secretadas por células-tronco neurais primitivas podem promover alguns dos efeitos providos por sua colonização aumentada.

[0048] Figura 24. Tratamento com FTVII de MSCs derivadas de adiposo de indivíduos magros e de indivíduos obesos resulta em criação de estruturas de sLex na superfície celular. Gráficos de barra exibem resultados de citometria de fluxo (MFI, média ± SEM) de expressão de sLex (reatividade de HECA452) seguindo a(1,3)- exofucosilação de MSCs derivadas de adiposo (n=4 amostras de MSCs derivadas de indivíduos magros e obesos).

[0049] Figura 25. Análise Western blot de lisatos de célula de MSCs derivadas de adiposo. Lisatos de MSCs de medula óssea (BM- MSCs) e de tecido adiposo magro e obeso (A-MSCs) foram exofucosilados com FTVII (+) ou tratados com tampão sozinho (-), então forma submetidos à SDS-PAGE e sofreram blot com HECA452 ou com mAb CD44 anti-humano. Lisatos da linhagem de célula hematopoiética KG1a (controle) e da linhagem de célula de fibroblasto PIF sofreram co- eletroforese e blot. Células KG1a expressam HCELL (CD44 reativa a HECA-452 em mw de ~80 kDa). Como mostrado na figura, tratamento com FTVII resulta em expressão reforçada de HCELL (CD44 reativa a HECA452) em células PIF e em MSCs derivadas de tecido adiposo de indivíduos magros e obesos (painel superior); tingimento para expressão de CD44 em cada lisato é mostrado abaixo no blot de HECA452. Expressão de HCELL (faixa reativa a HECA452 de ~80 kDa) é anulada seguindo tratamento com sialidase de células (painel inferior), consistente com sensibilidade à sialidase de expressão de HCELL (isto é, eliminação de sLEx). Notar que HCELL pode aparecer como um dupleto a ~80 kDa (vide perfil de A-MSC tratada com FTVII em painel inferior), que reflete glicosilação variável da glicoproteína de núcleo que não afeta atividade de ligação de E-selectina ou L-selectina da molécula de HCELL.

[0050] Figura 26. Resultados de estudos de câmara de fluxo de placa paralelo de MSCs perfundidas em relação a células endoteliais da veia umbilical humana estimuladas por TNF (HUVEC). Conforme medido sob condições de cisalhamento hemodinâmicas definidas (dynas/cm2, mostrado no eixo x), a(1,3)exofucosilação (tratamento com FTVII) de A-MSCs derivadas de indivíduos magros (LA-MSCs) e de indivíduos obesos (OA-MSCs) confere ligação à E-selectina potente em E-selectina exibida em HUVEC estimulada por TNF; a atividade de ligante de E-selectina de MSCs derivadas de adiposo tratadas com FTVII (HCELL+) é equivalente àquela de MSCs derivadas da medula óssea tratadas com FTVII (HCELL+) (BM-MSCs; painel inferior). MSCs não tratadas não têm quaisquer interações de ligação significantes sobre HUVEC em nenhum dos níveis de estresse de cisalhamento.

[0051] Figuras 27(A)-27(C). Análise de efeitos de a(1,3)- exofucosilação sobre ligação à E-selectina de vários leucócitos. (A) Análise de câmara de fluxo de placa paralelo de interações de ligação e rolamento de leucócitos de sangue periférico nativos com E-selectina endotelial (expressos em células endoteliais da veia umbilical humanas estimuladas com TNF (HUVEC)). Monócitos, células T CD4, células T CD8 e células B foram recém-isoladas e então perfundidas em HUVECs estimuladas por TNF (isto é, TNF induz HUVEC para expressar E- selectina) em uma taxa de fluxo variando de 0,5-16 dynas/cm2 e rolamento de célula foi observada e registrada para análise de vídeo. Monócitos e células T CD4 mostram interações de adesivo de rolamento sobre HUVEC ativada por TNF em um estresse de cisalhamento de até 16 dynas/cm3, enquanto células CD8 e B mostram interações adesivas resistentes a cisalhamento adesivas mínimas. Notar que rolamento de célula de monócitos foi 3 vezes maior do que células T CD4. Os valores são média ± SEM para um mínimo de 3 experimentos independentes. (B) Histogramas citométricos de fluxo representativos de tingimento com quimera de E-selectina-Ig ("E-Ig", uma sonda para ligantes de E- selectina (da R&D Systems)) (esquerda e mAb HECA452 (direita) de monócitos, células T CD4 e CD8 e células B. As curvas preenchidas representam controle de isotipo (ou, para tingimento de E-Ig, ligação à E-selectina na ausência de Ca2+ de entrada) e curvas abertas mostram reatividade específica (para E-Ig, ligação na presença de Ca2+ de entrada). (C) Células não tratadas (linha preta sólida) ou tratadas com protease (bromelina) (linha pontilhada) foram tingidas com mAb HECA452 e analisadas através de citometria de fluxo. Tratamento com protease (bromelina) (linha pontilhada) diminui notadamente tingimento de HECA452 de monócitos, células T CD4, células T CD8 e células B, mostrando que glicoproteínas são os principais carreadores de determinantes de sLex nessas células.

[0052] Figuras 28(A)-28(C). Expressão de ligante de E-selectina funcional em monócitos e linfócitos é aumentada por tratamento com a(1,3)-exofucosilação. (A) Monócitos humanos foram tratados com FTVII ou tratados com tampão (falso) e submetidos à imunoprecipitação com quimera de E-selectina-Ig ("E-Ig", uma sonda para ligantes de E-selectina (da R&D Systems)) seguido por SDS-PAGE e sofreram blot com mAbs HECA-452, anti-CD43, anti-CD44 e anti- PSGL-1, respectivamente. Notar imunoprecipitação aumentada com E- Ig seguindo tratamento com FTVII de monócitos, proeminentemente em CD44 (isto é, criação de HCELL) e CD43 (criação de ligante de CD43- E-selectina ("CD43-E"). (B) Análise Western blot de imunoprecipitação sequencial de PSGL-1, CD43 e CD44 de lisatos de células T CD4, células T CD8 e células B, seguido por tingimento com E-Ig. (C) Análise de câmara de fluxo de placa paralelo de interações de ligação e rolamento de não tratadas ("unt") e tratadas com FTVII (isto é, a(1,3)- exofucosilação; "FT7") de monócitos, células T CD4 e CD8, e células B em HUVEC ativada por TNF-a (que expressa E-selectina). Tratamento com FTVII ("FT7") aumenta notadamente aderência mediada por E- selectina de células de fluxo para HUVEC sob todos os níveis de estresse de cisalhamento testados.

[0053] Figuras 29(A)-29(C): CD44 expresso por células dendríticas derivadas de monócito (isto é, culturadas seguindo seleção de monócitos através de expressão de CD14 (CD14-S mo- DCS)) se liga à E-selectina. (A) histogramas citométricos de fluxo representativos de tingimento de reatividade de mAb HECA-452 e E-Ig de mo-DCs. Linhas cinzas representam controle de isotipo ou, para E- Ig, tingimento na ausência de CS2+, enquanto linha preta pontilhada representa mo-DCs PA-S e linhas pretas sólidas são mo-DCs CD14-S. (B) Análise Western blot de tingimento de E-selectina de lisatos mo-DC CD14-S e PA-S. Lisatos de célula inteira equivalentes a 2 x 106 mo-DCs foram separados em um gel SDS-PAGE e sofreram immunoblot. Marcadores de MS estão ao longo do eixo X (em kDa). Mo-DCs culturados em contas CD14 (CD14-S Mo-DCs) têm expressão de HCELL maior (faixa de ~80 kDa) do que aqueles culturados em plástico (PA Mo-DCs). (C) Análise Western blot de imunoprecipitados de CD44 de lisatos de célula de mo-DCS CD14-S e PA-S. Imunoprecipitados de CD44 (CD44 IP) sofreram então blot e foram tingidos com quimera de E-Ig ou mAb anti-CD44. Marcadores de MW são notados ao longo do eixo Y (em kDa). Notar expressão pronunciada de HCELL em mo-DCs CD14-S.

[0054] Figuras 30(A)-30(E). a(1,3)Exofucosilação de mo-DCs humanos reforça atividade de ligante de E-selectina maior e expressão de E-selectina endotelial promove migração transendotelial (TEM) de DCs exofucosiladas. (A) Análise Western blot comparando ligação de E-selectina (E-Ig) de lisatos de 2 x 106 de células KG1a e de mo-DCs. (B) Análise Western blot de reatividade de E-Ig de mo-DC que foram tratados com tampão (-) ou tratados com FTVI (+). Tratamento com FTV1 induz ligação à E-Ig a ~80 kDa, indicando expressão reforçada de HCELL. (C) Ensaio de migração transendotelial (TEM) de mo-DCs tratadas com tampão (BT) e tratadas com FTVI sob condições de fluxo de cisalhamento (2 dynas/cm3) em HUVEC estimulada com TNF-a. O valor de TEM é a razão de aumento em migração de células em HUVEC estimulada por TNF-a comparado com células transmigradas em HUVECs não tratadas (que foi mínimo). TEM foi analisado sob condições diferentes: HUVEC preincubada com clone de mAb anti-E-selectina de bloqueio de função 68-5H11, mo-DC preincubada com anti-VLA-4 mAb HP2/1 de bloqueio de função ou isotipo mAb e mo-DC tratada com sialidase ou toxina da coqueluche (PTX). Como mostrado, DCs exofucosiladas têm TEM maior do que células não tratadas; TEM é anulado por anticorpos de bloqueio de função para E-selectina e VLA-4 e por tratamento de células com sialidase ou PTX. (A) Análise do número de mo-DCs de ligação e rolamento (por cm2 de área de superfície endotelial) e número de células de adesão firme (por cm2 de área de superfície endotelial) no ensaio TEM. Notar interações de ligação/rolamento maiores com DCs exofucosiladas. (E) Velocidade de rolamento média de mo-DCs tratados com tampão (BT) e tratados com FTVI no ensaio TEM. O número de célula foi contado em 2,0 dyna/cm2 de estresse de cisalhamento (isto é, perfundido em HUVEC estimulada com TNF-a, a 2,0 dyna/cm2 de estresse de cisalhamento). Valores são médias ± SD (n=3). Diferenças estatísticas significantes (p<0,05) são indicadas por parênteses e asteriscos. O rolamento mais lento de DCs tratadas com FTVI é indicativa de eficiência maior de interações de ligação de DC à E- selectina endotelial sob condições de cisalhamento hemodinâmicas.

[0055] Figura 31. Expressão de FoxP3 sobre células T reguladoras geradas através da expansão in vivo de células CD4+ humanas na presença de anticorpos para CD3 e CD28 e suplementação de IL-2. Histogramas de citometria de fluxo de cor dupla mostrando expressão de CD4 e FoxP3 em células T de nível baixo de CD4+/CD127; tingimento de FoxP3 alto indica que todas as células expandidas em cultura são Tregs.

[0056] Figura 32. Perfis de citometria de fluxo de expressão de sLex (tingimento de HECA452) de Tregs tratadas com tampão (preenchido com cinza claro) e exofucosiladas (tratadas com FTVII; preenchidas de preto). Notar que Tregs tratadas com tampão não têm nenhuma expressão de sLex (isto é, o perfil é similar a tingimento controle de isotipo (linha pontilhada)), enquanto células tratadas com FTVII exibem níveis altos de sLex.

[0057] Figura 33. Análise Western blot de tingimento de E-Ig de Tregs tratadas com TFVII e tratada com tampão (BT) comparado com a linhagem de célula de leucemia mieloide humana KG1a. Tregs tratadas com tampão não têm quaisquer ligantes de E-selectina. a(1,3)-Exofucosilação induz expressão de vários ligantes de E-selectina de glicoproteína em Tregs, incluindo expressão de HCELL (faixa de ~80 kDa). Células KG1a expressam nativamente HCELL.

[0058] Figura 34. Titulação de dosagem de célula T reguladora em doença enxerto versus hospedeiro xenogênica (GVHD). Perda de peso associada à GVHD xenogênica (medida no dia 50 pós-injeção de PBMCs) é anulada através da injeção intravenosa de 1,5 x 105 Tregs, mas não injeção de dose similar de Tregs tratadas com tampão (valores em peso são média de N=3 camundongos). No entanto, injeção de 5 x 105 Tregs previne perda de peso de GVHD sem importar a a(1,3)- exofucosilação de células Treg administradas (média de N=3 camundongos). Desta maneira, a(1,3)-exofucosilação de Tregs aumenta a potência em imunomodulação de GVHD em 3 vezes.

MODALIDADES

[0059] A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição médica se manifestando como tecido inflamado e/ou danificado ou câncer em um indivíduo. Os métodos envolvem a administração, a um indivíduo com necessidade de reparo/regeneração de tecido ou tratamento para o câncer, de uma população de célula que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina em níveis que excedem o nível de ligação de E- selectina e/ou L-selectina de uma população nativa das células. A composição de células é disposta em uma solução, suspensão, carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável para administração a um indivíduo ou para armazenamento (por exemplo, criopreservada) antes da administração a um indivíduo.

[0060] Administração de populações celulares descritas aqui para indicações terapêuticas pode ser obtida de uma variedade de maneiras, em cada caso como clinicamente garantido/indicado, usando uma variedade de dispositivos de acesso anatômicos, uma variedade de dispositivos de administração e uma variedade de abordagens anatômicas, com ou sem apoio de modalidades de imagem anatômicas (por exemplo, radiológica, MRI, ultrassom, etc) ou tecnologias de mapeamento (por exemplo, procedimentos de mapeamento epifisiológicos, procedimentos eletromiográficos, procedimentos de eletrodiagnóstico, etc). As células podem ser administradas sistemicamente, através ou de acesso vascular periférico (por exemplo, colocação intravenosa, dispositivos de acesso venoso periférico, etc) ou acesso vascular central (por exemplo, cateter/dispositivos venosos centrais, dispositivos/abordagens de acesso arterial, etc). As células podem ser administradas intravascularmente em recipientes de alimentação anatômicos de um sítio de tecido pretendido usando abordagens à base de cateter ou outros dispositivos de acesso vascular (por exemplo, cateterização cardíaca, etc), que administrarão um bolo vascular de células ao sítio pretendido. As células podem ser introduzidas no canal espinhal e/ou intraventricularmente (isto é, intratecalmente, no espaço subaraquinoide para distribuir dentro do fluido cerebrospinal e/ou dentro dos ventrículos). As células podem ser administradas diretamente em cavidades corporais ou compartimentos anatômicos através ou de abordagens à base de cateter ou injeção direta (por exemplo, intraperitoneal, intrapleural, intrapericardial, intravesicularmente (por exemplo, na bexiga, na vesícula biliar, na medula óssea, no sistema biliar (incluindo rede de duto biliar e duto pancreático), intrauretralmente, através de abordagens da pélvis renal/intrauretral, intravaginalmente, etc)). As células podem ser introduzidas através de injeção a tecido local direta, usando ou abordagens intravasculares (por exemplo, injeção endomiocardial) ou abordagens percutâneas ou através de exposição/abordagens cirúrgicas ao tecido ou através de abordagens laparoscópicas/toracoscópicas/endoscópicas/colonoscópicas ou diretamente em sítios de tecido anatomicamente acessíveis e/ou guiadas por técnicas de imagem (por exemplo, intra-articular, em discos espinhais e outra cartilagem, em ossos, em músculos, na pele, em tecidos conectivos e em tecidos/órgãos relevantes tais como sistema nervoso dentral, sistema nervoso periférico, coração, fígado, fins, baço, etc). As células podem também ser postas diretamente em superfícies/sítios de tecido relevantes (por exemplo, colocação sobre tecido diretamente, sobre úlceras, sobre superfícies queimadas, sobre superfícies serosais ou mucosais, sobre o epicárdio, etc). As células podem ser também administradas a tecido ou dispositivos de apoio estrutural (por exemplo, dispositivos de base de tecido e/ou incrustradas dentro de bases postas em tecidos, etc) e/ou administradas em géis e/ou administradas junto com agentes de potencialização (por exemplo, misturadas com células de apoio, citocinas, fatores de crescimento, resolvinas, agentes anti- inflamatórios, etc).

[0061] A população celular é administrada ao indivíduo durante um período de (isto é, coincidente com) expressão induzida (e, preferivelmente, coincidente com o início de expressão induzida) de E- selectina sobre endotélio vascular dentro de um ou mais tecidos do indivíduo. A expressão reforçada de ligantes de E-selectina sobre a superfície de células administradas ajudará na revascularização, na defesa do hospedeiro (por exemplo, contra infecção ou câncer) e/ou em reparo/regeneração de tecido e/ou faz a mediação de processos imunomoduladores que diminuirão a inflamação e/ou prevenirão a inflamação. A expressão de ligantes para E-selectina guia a administração de células intravascularmente administradas para sítios de inflamação através da mediação de ligação de células de origem sanguínea à E-selectina vascular expressa em células endoteliais em sítios de inflamação. Além disso, se células forem administradas sistemicamente, intravascularmente, ao canal espinhal e/ou intraventricularmente (isto é, intratecalmente, ao espaço subaracnoide para distribuir dentro do fluido cerebrospinal), diretamente a cavidades corporais ou compartimentos, através de injeção a tecido local direta, ou através de colocação em superfícies/sítios de tecido relevantes, a expressão de ligantes para E-selectina e/ou L-selectina em células administradas promove alojamento de células dentro do ambiente de tecido afetado, em oposição a células carregando E-selectina (isto é, células endoteliais) e/ou L-selectina (isto é, leucócitos), respectivamente, dentro do sítio alvo. Desta maneira, a distribuição e localização espaciais de células administradas dentro do tecido alvo são moduladas pela expressão de ligantes de E-selectina e/ou L-selectina em células administradas.

[0062] Particularmente, a colonização de um tipo de célula desejado em um sítio de inflamação ocorre como um resultado da expressão reforçada de ligantes de E-selectina da superfície celular nas células administradas, de maneira que as células administradas têm ligação aumentada à E-selectina, desta maneira promovendo a administração sistêmica das células desejadas e/ou o alojamento de células quando injetadas diretamente no sítio afetado. Por exemplo, a expressão reforçada de ligantes de E-selectina (por exemplo, HCELL, CD43-E, CLA/PSLG-1, ESL-1, NCAM-E, etc) é vantajosamente capaz de ancorar diretamente células injetadas dentro dos recipientes de expressão de E-selectina em sítios de inflamação, lesão de tecido ou câncer. Desta maneira, os presentes métodos aumentam a eficiência na administração de células relevantes em ou a um sítio de inflamação, lesão a tecido ou câncer incluindo, por exemplo, a capacidade de administrar células-tronco reparadoras de tecido, para administração de células imunomoduladoras (por exemplo, células-tronco mesenquimais, células T reguladoras, células NK, células dendríticas, etc) e a capacidade de administrar células imunoefetoras para combater a incitação de processo inflamatório ou câncer (por exemplo, no caso de infecção ou malignidade, administração de células T imunoefetoras específicas de patógeno ou células T citotóxicas específicas de câncer ou células NK, respectivamente); tais células imunológicas (células T reguladoras, células NK, células T citotóxicas, células dendríticas, etc) podem ser pulsadas com antígeno, pulsadas com célula de tumor, pulsadas com vírus e outros meios para criar especificidade de antígeno. Similarmente, a expressão reforçada de ligantes de L-selectina (por exemplo, HCELL, PSGL-1, etc) é vantajosamente capaz de ancorar células diretamente injetadas dentro de sítios de inflamação, lesão de tecido ou câncer infiltrando células expressando L-selectina.

[0063] A expressão aumentada de um ligante de E-selectina sobre a superfície celular direcionará o direcionamento vascular de células para qualquer sítio onde E-selectina for expressa. Em várias modalidades, a população celular expressa Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL) e/ou Ligante de E-selectina de Molécula de Adesão de Célula Neural (NCAM-E). Outros ligantes de E-selectina que podem ser expressos por células incluem, por exemplo, CD43-E, ESL-1, PSGL-1 e a glicoforma CLA de PSGL-1. Por exemplo, uma vez que CD44 é uma proteina de membrana celular ubiquamente expressa e é exibida sobre populações de célula-tronco/progenitora de ambos os tipos "adulto" e embriônico, a capacidade em modificar glicosilação desta proteina através de engenharia de glicano ex vivo para criar o fenótipo HCELL (glicoforma CD44) direcionará a migração de células injetadas (por exemplo, intravascularmente) (adotivamente transferidas) in vivo para medula óssea ou qualquer sítio de tecido/órgão onde E-selectina seja expressa. Desta maneira, as células modificadas podem ser usadas em ambientes terapêuticos para obter migração de célula direcionada em uma variedade de processos fisiológicos e patológicos incluindo, por exemplo, doenças ósseas, doenças imunes, doenças infecciosas e agentes terapêuticos para câncer, para nomear algumas condições.

[0064] Foi também constatado que a doença, distúrbio ou condição médica tendo inflamação associada pode ser tratado usando os presentes métodos mesmo na ausência de diferenciação de população celular no indivíduo. Isto é, há efeitos tróficos de células administradas no sítio de inflamação sem enxerto e/ou repopulação persistente das células administradas, sem importar o tipo de tecido envolvido. Esses efeitos tróficos incluem liberação de citocinas/fatores de crescimento que promovem revascularização (por exemplo, VEGF), que promovem reparo de tecido (por exemplo, TGF-ß), que são imunomoduladoras, (por exemplo, IL-10), que estimulam crescimento/proliferação de progenitores residentes em tecido (por exemplo, SCF, LIF, etc) e muitos outros processos reparadores de tecido (por exemplo, administração de mitocôndrias a células). Ainda, células administradas (por exemplo, Tregs, MSCs, células dendríticas, etc) podem ter propriedades imunomoduladoras potentes, incluindo supressão direta de linfócitos ativados (por exemplo, através de expressão de PDL-1).

[0065] Como exemplificado pelas Figuras 4(A)-4(H), e como descrito em mais detalhes nos exemplos, as populações celulares modificadas para ter atividade de ligação à E-selectina e/ou L-selectina aumentada em relação às populações nativas do tipo de célula têm capacidade aumentada em se dirigir a, infiltrar e colonizar tecido na vizinhança de vasculatura expressando E-selectina. Ainda, em uma modalidade, tais células se alojam em sítios de inflamação através da ligação à E-selectina em células endoteliais ou se alojam em sítios de leucócitos de infiltração dentro do sítio inflamatório (por exemplo, vide Figuras 4(F) e 4(G). Ainda, efeitos benéficos (por exemplo, melhora da doença) podem ser obtidos através da administração parenteral ou através de injeção direta no sítio de inflamação ou no sítio de infiltração de leucócitos mesmo na ausência de diferenciação das células (ou enxerto a longo prazo) após alojamento de célula administrada dentro do sítio (isto é, enxerto transiente pode ser suficiente para administrar efeito(s) biológico(s) pretendido(s)).

[0066] Em certas modalidades, os métodos para engenharia de glicano descritos na Pat. U.S. N°. 8.084.236 para o reforço de expressão de HCELL em populações de célula viáveis, discutidos em detalhes abaixo, podem induzir quantidades maiores de expressão de ligantes de E-selectina em tais células para promover sua administração vascular a sítios de inflamação e podem induzir quantidades maiores de ligantes de E-selectina e ligantes de L-selectina que promovem alojamento de células dentro do ambiente de tecido afetado.

[0067] Tratamento do indivíduo se refere à redução ou eliminação em um indivíduo de um sintoma clínico de uma doença, distúrbio ou condição médica tendo inflamação associada ou retardo ou prevenção em um indivíduo do início de um sintoma clínico de tal doença, distúrbio ou condição médica. Por exemplo, tratamento pode significar redução de um sintoma de uma condição caracterizada por uma inflamação aguda e/ou crônica em, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100%. Os sintomas reais associados com inflamações aguda e crônica são bem conhecidos e podem ser determinados por um versado comum na técnica ao levar em consideração fatores incluindo, sem limitação, a localização da inflamação aguda e/ou crônica, a causa da inflamação aguda e/ou crônica, a severidade da inflamação aguda e/ou crônica e/ou o tecido ou órgão afetado pela inflamação aguda e/ou crônica. Aqueles de habilidade na técnica conhecerão os sintomas ou indicadores apropriados associados com um tipo específico de inflamação aguda e/ou crônica e conhecerão como determinar se um indivíduo é um candidato para tratamento como aqui revelado.

[0068] Os indivíduos que podem ser tratados de acordo com os métodos descritos aqui incluem qualquer animal (por exemplo, um humano), tal como um mamífero que pode ser suscetível a uma doença. Exemplos incluem, por exemplo, um humano, um primata não humano, uma vaca, um cavalo, um porco, uma ovelha, uma cabra, um cachorro, um gato ou um roedor tal como um camundongo, um rato, um hamster ou um porquinho-da-índia. Um indivíduo pode ser um indivíduo diagnosticado com uma doença, distúrbio ou condição médica tendo inflamação associada ou de outra maneira conhecido ter uma doença, distúrbio ou condição médica cujo resultado ou sintoma é inflamação aguda e/ou crônica. Em algumas modalidades, um indivíduo pode ser diagnosticado como, ou conhecido estar, sob risco de desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição médica tendo inflamação associada. Em certas modalidades, um indivíduo pode ser selecionado para tratamento com base em uma doença, distúrbio ou condição médica conhecido no indivíduo cujo resultado ou sintoma é uma inflamação aguda e/ou crônica. Em algumas modalidades, um indivíduo pode ser selecionado para tratamento com base em uma doença, distúrbio ou condição médica suspeita tendo inflamação associada no indivíduo. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição médica pode ser diagnosticado através da detecção de uma mutação ou outra anormalidade em uma amostra biológica (por exemplo, urina, esputo, sangue integral, soro, fezes, etc, ou qualquer combinação dos mesmos). Desta maneira, uma população de célula modificada pode ser administrada a um indivíduo com base, pelo menos em parte, no fato que uma mutação, sintoma ou outra anormalidade é detectada em pelo menos uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia ou qualquer outra amostra biológica) obtida a partir do indivíduo. Em algumas modalidades, diabetes, esclerose múltipla ou câncer (por exemplo) não pôde ser detectado ou localizado no indivíduo, mas a presença de uma mutação, sintoma ou outra anormalidade associada com diabetes, esclerose múltipla ou câncer em pelo menos uma amostra biológica pode ser suficiente para administrar células modificadas ao indivíduo de acordo com os métodos descritos aqui. Em algumas modalidades, a composição pode ser administrada para prevenir o desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição médica tal como diabetes, esclerose múltipla ou câncer. No entanto, em algumas modalidades, a presença de uma doença, distúrbio ou condição médica existente pode ser suspeita, mas ainda não identificada, e uma composição da invenção pode ser administrada para prevenir crescimento ou desenvolvimento adicional da doença, distúrbio ou condição médica. As células administradas podem ser derivadas de fontes autólogas (isto é, derivadas do próprio hospedeiro), fontes singeneicas (derivadas de um gêmeo idêntico) ou fontes alogeneicas (derivadas de doador não geneticamente idêntico).

Momento de Administração

[0069] Como acima mencionado, a população celular é administrada ao indivíduo coincidente com expressão induzida (e preferivelmente coincidente com o início de expressão induzida) de E- selectina por células endoteliais do indivíduo, ou um pouco antes da expressão de E-selectina aumentada dentro de um tecido afetado (isto é, como profilaxia antes da ou coincidente com administração de estímulo inflamatório de indução de E-selectina (por exemplo, terapia de radiação)) ou em antecipação de uma reação a um patógeno ou processo de doença com suprarregulagem subsequente de expressão de E-selectina vascular (por exemplo, seguindo exposição à ou reativação endógena de um agente infeccioso, antes do episódio de fase aguda claro de uma doença autoimune, antes da elaboração de doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), etc)). Desta maneira, os métodos de tratamento descritos aqui podem ser implementados, por exemplo, quando o indivíduo (por exemplo, um paciente humano) apresenta ao seu médico e/ou cuidador um ou mais sintomas de inflamação ou surto agudo inflamatório antecipado. Para um indivíduo com diabetes, por exemplo, tais sintomas iniciais podem incluir poliuria, nocturia, perda/ganho de peso e/ou falta de saciedade, momento quando (e antes do início de cetoacidose diabética) o indivíduo pode ser administrado com as células modificadas de acordo com a invenção. Para um indivíduo com esclerose múltipla, por exemplo, tais sintomas iniciais podem incluir perturbações sensoriais transientes (por exemplo, entorpecimento, formigamento) e/ou fasciculações (espasmos) e/ou episódios de fraqueza muscular.

[0070] Em geral, os aspectos temporais da administração das células modificadas podem depender, por exemplo, das células modificadas particulares ou da natureza da doença, distúrbio ou condição média (e inflamação, lesão a tecido ou câncer associado) sendo tratado. Outras considerações podem incluir a severidade da doença, distúrbio ou condição médica; atividade das células específicas ou fragmentos de célula e modificações empregadas; a composição específica empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo; o momento de administração, via de administração e taxa de excreção; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coincidentes com o regime de tratamento; e fatores similares.

[0071] Desta maneira, administração das células modificadas pode ocorrer como um evento único ou durante um curso de tempo de tratamento. Por exemplo, as células modificadas podem ser administradas em um regime horário (por exemplo, de hora em hora, a cada duas horas, a cada três horas, a cada quatro horas, a cada cinco horas, a cada seis horas e assim por diante), diariamente, semanalmente, duas vezes por semana, duas vezes por mês ou mensalmente. Para tratamento de condições agudas, por exemplo, o curso de tempo de tratamento pode ser pelo menos várias horas, dias ou semanas. Certas condições poderiam prolongar o tratamento de vários dias a várias semanas, meses ou anos. Por exemplo, o tratamento poderia se estender durante uma semana, duas semanas ou três semanas ou mais (por exemplo, um a vários meses). Para condições mais crônicas, o tratamento poderia se estender de várias semanas a vários meses, um ano ou mais, ou por toda a vida do paciente com necessidade de tal tratamento. Alternativamente, os compostos e agentes podem ser administrados em regime horário, diariamente, semanalmente, duas vezes por semana, duas vezes por mês ou mensalmente, por um período de várias semanas, meses, anos ou durante a vida do paciente como um agente profilático ou como uma medida terapêutica.

[0072] Será também compreendido que a frequência de doses pode ser aumentada ou diminuída com base na natureza e na severidade da doença, distúrbio ou condição médica (e inflamação associada) e/ou o estágio da doença, distúrbio ou condição médica no indivíduo. Por exemplo, dependendo desses e outros fatores, administração menos frequente pode ser desejável no início do tratamento e administração mais frequente pode ser desejável no ou próximo do estágio final, ou vice versa. Os vários alvos e sintomas podem ser também acompanhados (por exemplo, níveis de insulina em um indivíduo diabético) e a administração e quantidade de dose podem ser ajustadas adequadamente.

[0073] Se desejado, as células podem ser divididas em doses múltiplas para propósitos de administração; consequentemente, composições de dose única podem conter tais quantidades ou submúltiplos das mesmas para formar a dose.

INDICAÇÕES

[0074] A presente invenção refere-se ao tratamento de uma doença, distúrbio ou condição médica onde E-selectina é expressa em leitos endoteliais do(s) tecido(s) afetado(s) e/ou leucócitos expressando L-selectina infiltraram/acumularam no(s) tecido(s) afetado(s). Como acima discutido, E-selectina e L-selectina se ligam, cada uma, a carboidratos fucosilados, sialilados, e expressão reforçada dessas estruturas de glicano sialofucosiladas na superfície celular serve para programas ligação a essas selectinas. Desta maneira, a invenção descreve métodos para aumentar o direcionamento para tecido(s) alvo através do aumento da expressão de ligantes de E-selectina sobre células administradas; ainda, na descrição dos métodos para aumentar a expressão de ligantes de E-selectina e L-selectina potentes (tal como HCELL) sobre células administradas para promover aderência à E- selectina sobre células endoteliais vasculares e/ou de L-selectina sobre leucócitos de infiltração em tecido dentro de tecido(s) afetado(s), cuja descrição provê um meio para aumento de colonização/alojamento das células dentro de microambientes de tecido relevantes onde efeitos biológicos são pretendidos. Em geral, os métodos descritos aqui têm utilidade no aperfeiçoamento do resultado de qualquer abordagem terapêutica baseada em célula, seja em aplicações de imunoterapia (por exemplo, administração de células T específicas de antígeno expandidas em cultura e/ou células NK expandidas em cultura para aplicações em câncer ou doença infecciosa, administração de células T com receptor de antígeno quimérico (CAR) expandidas em cultura, administração de células dendríticas pulsadas com antígeno, etc), aplicações terapêuticas imunomoduladoras/imunossupressoras (por exemplo, administração de células T reguladoras expandidas em cultura (Tregs), administração de células dendríticas pulsadas com antígeno, administração de células-tronco mesenquimais, administração de células NKT expandidas em cultura, etc) ou aplicações de medicina reparadora/regenerativa de tecido (por exemplo, uso de células-tronco e/ou progenitoras ou outras células reparadoras de tecido para regeneração/restauração de tecido; uso de células-tronco expandidas em cultura e/ou células progenitoras expandidas em cultura para regeneração/restauração de tecido). Dentro de utilidade em aplicações de medicina regenerativa, é compreendido que células administradas podem contribuir para regenerar o tecido alvo por meio de enxerto a longo prazo (com proliferação/diferenciação concomitante) fornecendo células específicas de tecido (por exemplo, tal como em transplante de células-tronco hematopoiéticas para produção de célula sanguínea) e/ou podem fornecer um efeito restaurador/reparador de tecido sem enxerto ou diferenciação a longo prazo em células residentes em tecido (por exemplo, através da administração de efeitos tróficos que estimulam tronco/progenitoras residentes para reparar o(s) tecido(s) lesionado(s) e/ou através de diminuição dos processos inflamatórios que promovem lesão e impedem reparo). Todas as aplicações para todas as indicações descritas aqui podem ser usadas sozinhas ou em combinação com agentes de potencialização (por exemplo, fatores de crescimento, bases para tecido, etc).

[0075] Qualquer uma e todas das doenças, distúrbios ou condições médicas tendo inflamação associada (por exemplo, aguda e/ou crônica), lesão/dano a tecido ou condições neoplásticas podem ser tratados de acordo com os métodos descritos aqui incluindo, mas não limitado a, aqueles iniciados por lesão a tecido direta (por exemplo, queimaduras, traumas, fratura óssea, deformidades ósseas, úlceras de decúbito, etc), eventos isquêmicos/vasculares (por exemplo, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, choque, hemorragia, coagulopatia, etc), infecções (por exemplo, celulite, pneumonia, meningite, cistite, sepse, SIRS, etc), neoplasia (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de célula renal, linfoma, leucemia, etc), condições imunológicas/autoimunes (por exemplo, GVHD aguda ou crônica, esclerose múltipla, diabetes, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa), artrite reumatoide, psoríase, etc), doenças degenerativas (por exemplo, osteoporose, osteoartrite, degeneração do disco espinhal, doença de Alzheimer, aterosclerose, etc), doenças congênitas/genéticas (por exemplo, epidermólise bolhosa, osteogênese imperfecta, distrofias musculares, doenças de armazenamento lisossomal, doença de Huntington, etc), efeitos adversos de fármaco (por exemplo, toxidez de tecido/órgão induzida por quimioterapia), toxidez por radioterapia, hepatite induzida por fármaco, lesão cardíaca induzida por fármaco, etc), lesões tóxicas (por exemplo, exposição(ões) à radiação, exposição(ões) química(s), hepatite alcoólica, pancreatite alcoólica, cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia por cocaína, etc), desarranjos metabólicos (por exemplo, pericardite urêmica, acidose metabólica, etc), condições iatrogênicas (por exemplo, lesão a tecido induzida por radiação, complicações relacionadas à cirurgia, etc) e/ou processos idiopáticos (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, Síndrome de Parsonnage-Tumer, etc).

[0076] Outras doenças, distúrbios ou condição médica gerais e específicos que podem ser tratados de acordo com os métodos descritos aqui incluem, mas não estão limitados a:

[0077] Leucemias Agudas, por exemplo, Leucemia Bifenotípica Aguda, Leucemia Linfocítica Aguda (ALL), Leucemia Mielógena Aguda (AML) e Leucemia Não diferenciada Aguda;

[0078] Síndromes Mielodisplásticas, por exemplo, Leucemia Mielomonocítica Crônica de Amiloidose (CMML), Anemia Refratária (RA), Anemia Refratária com Blastos em Excesso (RAEB), Anemia Refratária com Blastos em Excesso em Transformação (RAEB-T) e Anemia Refratária com Sidroblastos em Anel (RARS);

[0079] Distúrbios Mieloproliferativos, por exemplo, Mielofibrose Aguda, Metaplasia Mieloide Agnogênica (Mielofibrose), Trombocitemia Essencial, leucemia mielógena crônica e Policitemia Vera;

[0080] Distúrbios de Fagócito, por exemplo, Síndrome de Chediak- Higashi, Doença Granulomatosa Crônica, Deficiências de adesão de leucócito, deficiência de mieloperoxidase, Deficiência de Actina no Neutrófilo e Disgênese Reticular;

[0081] Doenças de Armazenamento Lisossomal, por exemplo, Adrenoleucodistrofia, Alfa Manosidose, Doença de Gaucher, Síndrome de Hunter (MPS-II), Síndrome de Hurler (MPS-IH), Doença de Krabbe, Síndrome de Maroteaux-Lamy (MPS-VI), Leucodistrofia Metacromática, Síndrome de Morquio (MPS-IV), Mucolipidose II (Doença de célula I), Mucopolissacaridoses (MPS), Doença de Niemann-Pick, Síndrome de Sanfilippo (MPS-III), Síndrome de Scheie (MPS-IS), Síndrome de Sly, Deficiência de Beta-Glucuronidase (MPS-VII) e Doença de Wolman;

[0082] Anormalidades de Eritrócito Herdadas, por exemplo, Beta Talassemia, Anemia de Diamond Blackfan, Aplasia de Célula Vermelha Pura e Doença Falciforme;

[0083] Anormalidades de Plaqueta Herdadas, por exemplo, Amegacariocitose/Trombocitopenia Congênita, síndrome da plaqueta cinzenta;

[0084] Males de órgão sólido, por exemplo, Tumores Cerebrais, Sarcoma de Ewing, Neuroblastoma, Câncer Ovariano, Carcinoma de Célula Renal, Cânceres de Pulmão, Cânceres de Mama, Cânceres Gástricos, Cânceres Esofageais, Cânceres de Pele, Cânceres Orais, Cânceres Endócrenos, Cânceres de Fígado, Cânceres do Sistema Biliar, Câncer Pancreático, Câncer de Próstata e Câncer Testicular.

[0085] Outras aplicações, por exemplo, Transplantes de Medula Óssea, Doença Cardíaca (infarto do miocárdio), Doença Hepática, Distrofia Muscular, Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, Lesão ao Cordão Espinhal, Doença/degeneração do disco espinhal, Doença Óssea, Fratura Óssea, Acidente Vascular Cerebral, Doença Vascular Periférica, Trauma Craniano, Doenças bolhosas, Doenças mitocondriais, populações de células-tronco e progenitora expandidas Ex vivo e In vivo, aplicação e aumento de fertilização In vitro, Situações de Resgate Hematopoiético (Quimio/Radiação Intensa), Células-tronco e células progenitoras derivadas de várias fontes de tecido, Aplicação em humanos e animais e Regeneração de membro, procedimentos/indicações cirúrgicas reconstrutivas, sozinhos ou em combinação com agentes potencializadores;

[0086] Leucemias crônicas, por exemplo, Leucemia Linfocítica Crônica (CLL), Leucemia Mielógena Crônica (CML), Leucemia Mielógena Crônica Juvenil (JCML) e Leucemia Mielomonocítica Juvenil (JMML);

[0087] Distúrbios de Célula-tronco, por exemplo, Anemia Aplástica (Severa), Citopenia Congênita, Disceratose Congênita, Anemia Fanconi e Hemoglobinúria Paroxística Noturna (PNH);

[0088] Distúrbios linfoproliferativos, por exemplo, Doença de Hodgkin, Linfomas Não Hodgkin e Leucemia Prolinfocítica;

[0089] Distúrbios Histiocíticos, por exemplo, Linfoistiocitose Eritrofagocítica Familiar, Hemofagocitose, Linfoistiocitose Hemofagocítica, Histiocitose-X e Histiocitose de Célula de Langerhans;

[0090] Distúrbios do Sistema Imune Congênitos (Herdados), por exemplo, Ausência de Células T e B, Ausência de Células T, SCID de Célula B Normal, Ataxia-Telangiectasia, Síndrome de Linfócito Nu, Imunodeficiência Variável Comum, Síndrome de DiGeorge, Síndrome de Kostmann, Deficiência de Adesão de Leucócito, Síndrome de Omenn, Imunodeficiência Combinada Severa (SCID), SCID com Deficiência de Adenosina Desaminase, Síndrome de Wiskott-Aldrich e Distúrbio Linfoproliferativo Ligado ao X;

[0091] Outros distúrbios herdados; por exemplo, Hipoplasia de Cartilagem-Pilosa, Lipofuscinose Ceroide, Porfiria Eritropoiética Congênita, Febre Mediterrânea Familiar, Trombastenia de Glanzmann, Síndrome de Lesch-Nyhan, Osteopetrose e Doença de Sandhoff;

[0092] Distúrbios de Célula Plasmática, por exemplo, Mieloma Múltiplo, Leucemia de Célula Plasmática e Macroglobulinemia de Waldenstrom; e

[0093] Doenças Autoimunes, por exemplo, Esclerose Múltipla, Artrite Reumatoide, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Escleroderma, Espondilite anquilosante, Diabetes Mellitus e Doença Inflamatória do Intestino.

[0094] Doenças/condições articulares e esqueletais, por exemplo, degeneração do disco, doença sinovial, degeneração de cartilagem, trauma de cartilagem, rasgamentos de cartilagem, artrite, fraturas ósseas, deformidades ósseas, reconstrução óssea, osteogênese imperfecta, doenças/condições ósseas congênitas, doenças/condições ósseas genéticas, osteoporose. Osteopetrose, hipofosfatasia, doença óssea metabólica, etc.

[0095] Doenças ou condições de pele/tecido mole tais como doenças bolhosas, psoríase, eczema, epidermólise bolhosa, condições ulcerativas de pele, deformidades de tecido mole (incluindo deformidades de pele e tecido mole pós-cirúrgicas), indicações de cirurgia plástica/cirurgia reconstrutiva, etc.

[0096] Em geral, sintomas de inflamação associados que incluem, sem limitação, febre, dor, edema, hiperemia, eritema, vermelhidão, tenderness, rigidez, inchaço, calafrios, distúrbios respiratórios, hipotensão, hipertensão, nariz stuffy, cabeça stuffy, problemas respiratórios, retenção de fluido, coágulos sanguíneos, perda de apetite, perda de peso, poliuria, nocturia, anuria, dispneia, dispneia em exercício, fraqueza muscular, mudanças sensoriais, taxa cardíaca aumentada, taxa cardíaca diminuída, arritmias, polidipsia, formação de granulomas, fibrinose, pus, fluido seroso não viscoso ou úlceras. Os sintomas reais associados com uma inflamação aguda e/ou crônica são bem conhecidos e podem ser determinados por um versado comum na técnica levando em conta fatores incluindo, sem limitação, a localização da inflamação, a causa da inflamação, a severidade da inflamação, o tecido ou órgão afetado e o distúrbio associado.

[0097] Padrões específicos de inflamação aguda e/ou crônica são vistos durante situações particulares que surgem no corpo, tal como quando inflamação ocorre em uma superfície epitelial, ou bactérias piogênicas estão envolvidas. Por exemplo, inflamação granulomatosa é uma inflamação resultante da formação de granulomas que surgem a partir de um número limitado, mas diverso, de doenças, incluindo, sem limitação, tuberculose, leprosia, sarcoidose e sífilis. Inflamação purulenta é uma inflamação resultando em quantidade grande de pus, que consiste em neutrófilos, células mortas e fluido. Infecção por bactérias piogênicas tais como staphylococci é característica deste tipo de inflamação. Inflamação serosa é uma inflamação resultante de efusão copiosa de fluido seroso não viscoso, geralmente produzido por células mesoteliais de membranas serosas, mas pode ser derivada de plasma sanguíneo. Bolhas na pele exemplificam este padrão de inflamação. Inflamação ulcerativa é uma inflamação resultante da perda necrótica de tecido da superfície epitelial, exposição de camadas inferiores e formação de uma úlcera.

[0098] Um sintoma de inflamação aguda e/ou crônica pode estar associado com um grupo não relacionado, grande, de distúrbios que baseiam uma variedade de doenças e distúrbios. O sistema imune está frequentemente envolvido com distúrbios inflamatórios agudos e/ou crônicos, demonstrados em ambas as reações alérgicas, condições artríticas e algumas miopatias, com muitos distúrbios do sistema imune resultando em inflamação anormal. Doenças não imunes com origens etiológicas em processos inflamatórios agudos e/ou crônicos incluem câncer, aterosclerose e doença cardíaca isquêmica. Exemplos não limitantes de distúrbios exibindo inflamação aguda e/ou crônica como um sintoma incluem, sem limitação, acne, refluxo ácido/azia, degeneração macular relacionada com a idade (AMD), alergia, rinite alérgica, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, anemia, apendicite, arterite, artrite, asma, aterosclerose, distúrbios autoimunes, balanite, blefarite, bronquiolite, bronquite, um pênfigo bolhoso, queimadura, bursite, câncer, parada cardíaca, cardite, doença celíaca, celulite, cervicite, colangite, colecistite, corioamnionite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (e/ou suas exacerbações), cirrose, colite, falência cardíaca congestiva, conjuntivite, lesão a tecido induzida por fármaco (por exemplo, cistite induzida por ciclofosfamida), fibrose cística, cistite, resfriado comum, dacrioadenite, úlceras de decúbito, demência, dermatite, dermatomiosite, diabetes, neuropatia diabética, retinopatia diabética, nefropatia diabética, úlcera diabética, doença do sistema digestivo, eczema, enfisema, encefalite, endocardite, endocrinopatias, endometrite, enterite, enterocolite, epicondilite, epididimite, fascite, fibromialgia, fibrose, fibrosite, gastrite, gastroenterite, gengivite, glomerulonefrite, glossite, doença cardíaca, disfunção da válvula cardíaca, hepatite, hidradenite supurativa, doença de Huntington, pancreatite hiperlipidêmica, hipertensão, ileíte, infecção, doença inflamatória do intestino, cardiomegalia inflamatória, neuropatia inflamatória, resistência à insulina, cistite intersticial, nefrite intersticial, irite, isquemia, doença cardíaca isquêmica, queratite, queratoconjuntivite, laringite, nefrite por lúpus, degeneração macular, mastite, mastoidite, meningite, síndrome metabólica (síndrome X), uma enxaqueca, mucosite, esclerose múltipla, mielite, miocardite, miosites, nefrite, neuronite, esteatoepatite não alcoólica, obesidade, omfalite, ooforite, orquite, osteocondrite, osteopenia, osteomielite, osteoporose, osteíte, otite, pancreatite, doença de Parkinson, parotite, doença inflamatória pélvica, pênfigo vulgar, pericardite, peritonite, faringite, flebite, pleurite, pneumonite, nefrite policística, proctite, prostatite, psoríase, pulpite, pielonefrite, pileflebite, lesão induzida por radiação, falência renal, lesão por reperfusão, retinite, febre reumática, rinite, salpingite, sarcoidose, sialadenite, sinusite, cólons espástico, dermatite de estase, estenose, estomatite, acidente vascular cerebral, complicação cirúrgica, sinovite, tendinite, tendinose, tenossinovite, tromboflebite, tireoidite, amidgalite, trauma, lesão cerebral traumática, rejeição de transplante, trigonite, tuberculose, tumor, úlceras, uretrite, ursite, uveíte, vaginite, vasculite e vulvite.

[0099] Categorias gerais de doenças, distúrbios e traumas que podem resultar em ou de outro modo causar inflamação aguda e/ou crônica incluem, mas não estão limitadas a, doenças genéticas, neoplasias, lesão a tecido direta, doenças autoimunes, doenças infecciosas, doenças/complicações vasculares (por exemplo, lesão por isquemia/reperfusão), causas iatrogênicas (por exemplo, efeitos adversos de fármaco, lesão por radiação, etc) e manifestações alérgicas.

[00100] Em uma modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica compreende uma inflamação de tecido. Em geral, inflamação de tecido é uma inflamação aguda e/ou crônica que é confinada a um tecido ou órgão particular. Desta maneira, por exemplo, uma inflamação de tecido pode compreender uma inflamação de pele, uma inflamação de músculo, uma inflamação de tendão, uma inflamação de ligamento, uma inflamação de osso, uma inflamação de cartilagem/junta, uma inflamação de pulmão, uma inflamação do coração, uma inflamação do fígado, uma inflamação da vesícula biliar, uma inflamação pancreática, uma inflamação do rim, uma inflamação da bexiga, uma inflamação da gengiva, uma inflamação do esôfago, uma inflamação do estômago, uma inflamação intestinal, uma inflamação anal, uma inflamação retal, uma inflamação de vaso, uma inflamação vaginal, uma inflamação uterina, uma inflamação testicular, uma inflamação penil, uma inflamação vulvar, uma inflamação de neurônio, uma inflamação oral, uma inflamação ocular, uma inflamação aural, uma inflamação do cérebro, uma inflamação ventricular/meningeal e/ou inflamação envolvendo células/elementos do sistema nervoso central ou periférico.

[00101] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica compreende uma inflamação sistêmica. Embora os processos envolvidos sejam similares, se não idênticos, à inflamação de tecido, inflamação sistêmica não é confinada a um tecido particular, mas ao contrário envolve sítios múltiplos dentro do corpo, envolvendo o epitélio, endotélio, tecidos nervosos, superfícies serosais e sistemas de órgão. Quando ela é devido à infecção, o termo sepse pode ser usado, com bacteremia sendo aplicada especificamente para sepse bacteriana e viremia especificamente para sepse viral. Vasodilatação e disfunção de órgão são problemas sérios associados com infecção disseminada que pode levar a choque séptico e morte.

[00102] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma artrite. Artrite inclui um grupo de condições envolvendo dano às juntas do corpo devido à inflamação do sinóvio incluindo, por exemplo, osteoartrite, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, espondiloartropatias tal como espondilite anquilosante, artrite reativa (síndrome de Reiter), artrite psoriática, artrite enteropática associada com doença inflamatória do intestino, doença de Whipple e doença de Behcet, artrite séptica, gota (também comumente referida como artrite gotosa, sinovite cristal, artrite metabólica), pseudogota (doença de deposição de pirofosfato de cálcio) e doença de Still. Artrite pode afetar uma junta única (monoartrite), duas a quatro juntas (oligoartrite) de cinco ou mais juntas (poliarterite) e pode ser ou uma doença autoimune ou uma doença não autoimune.

[00103] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por um distúrbio autoimune. Doenças autoimunes podem ser amplamente divididas em distúrbios autoiumunes sistêmicos e específicos de órgão, dependendo das características clinico-patológicas principais de cada doença. Doenças autoimunes sistemas incluem, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de Sjogren, Escleroderma, artrite reumatoide e polimiosite. Doenças autoimunes locais podem ser endocrinológicas (Diabetes Mellitus Tipo 1, tireoidite de Hashimoto, doença de Addison, etc), dermatológicas (pênfigo vulgar), hematológicas (anemia hemolítica autoimune), neural (esclerose múltipla) ou podem envolver virtualmente qualquer massa circunscrita de tecido corporal. Tipos de distúrbios autoimunes incluem, sem limitação, encefalomielite disseminada aguda (ADEM), doença de Addison, uma alergia ou sensibilidade, esclerose lateral amiotrófica (ALS), síndrome de anticorpo antifosfolipídeo (APS), artrite, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença do ouvido interno autoimune, pancreatite autoimune, pênfigo bolhoso, doença celíaca, doença de Chagas, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (incluindo sua exacerbação aguda), diabetes mellitus tipo 1 (IDDM), endometriose, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, doença de Grave, síndrome Guillain-Barre (GBS), tireoidite de Hashimoto, hidradenite supurativa, trombocitopenia púrpura idiopática, doença inflamatória do intestino (IBD), cistite intersticial, lúpus (incluindo lúpus eritematoso discoide, lúpus eritematoso induzido por fármaco, nefrite por lúpus, lúpus neonatal, lúpus eritematoso cutâneo subagudo e lúpus eritematoso sistêmico), morfeia, esclerose múltipla (MS), miastenia grave, miopatias, narcolepsia, neuromiotonia, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, cirrose biliar primária, encefalomielite disseminada recorrente (encefalomielite disseminada multifásica), febre reumática, esquizofrenia, escleroderma, síndrome de Sjogren, tenossinovite, vasculite e vitiligo. Em uma modalidade particular, a inflamação aguda e/ou crônica resulta de ou é de outra maneira causada por diabetes no indivíduo. Em uma outra modalidade particular, a inflamação aguda e/ou crônica resulta de ou é de outra maneira causada por esclerose múltipla no indivíduo.

[00104] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma miopatia. Em geral, miopatias são causadas quando o sistema imune ataca inapropriadamente componentes do músculo, levando à inflamação no músculo. Uma miopatia inclui, por exemplo, uma miopatia inflamatória e uma miopatia autoimune. Miopatias incluem, por exemplo, dermatomiosite, miosites de corpo de inclusão e polimiosite.

[00105] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma vasculite. Vasculite é um grupo variado de distúrbios caracterizando inflamação de uma parede de vaso incluindo vasos linfáticos e vasos sanguíneos tais como veias (flebite), artérias (arterite) e capilares devido à migração de leucócito e dano resultante. A inflamação pode afetar vaso sanguíneo de qualquer tamanho, em qualquer lugar no corpo. Ela pode afetar ou artérias e/ou veias. A inflamação pode ser focal, significando que ela afeta um local único dentro de um vaso, ou ela pode ser disseminada, com áreas de inflamação espalhadas em um órgão ou tecido particular, ou até mesmo afetando mais de um sistema de órgão no corpo. Vasculite inclui, sem limitação, doença de Buerger (tromboangiite obliterante), vasculite cerebral (vasculite do sistema nervoso central), vasculite associada a ANCA, arterite de Churg-Strauss, crioglobulinemia, vasculite crioglobulinêmica essencial, arterite de célula gigante (temporal), vasculite de Golfer, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculite por hipersensibilidade (vasculite alérgica), doença de Kawasaki, poliarterite/poliangiite microscópica, poliarterite nodosa, polimialgia reumática (PMR), vasculite reumatoide, arterite de Takayasu, granulomatose de Wegener e vasculite secundária a distúrbios do tecido conectivo tais como lúpus eritematosos sistêmico (SLE), artrite reumatoide (RA), policondrite relapsante, doença de Behcet ou outros distúrbios do tecido conectivo, vasculite secundária à infecção viral.

[00106] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por um distúrbio de pele. Distúrbios de pele incluem, por exemplo, uma acne, incluindo acne vulgar, um pênfigo bolhoso, uma dermatite, incluindo dermatite atópica e dermatite actínica aguda e/ou crônica, um eczema atópico tipo eczema, eczema de contato, eczema xerótico, dermatite seborreica, disidrose, eczema discoide, eczema venoso, dermatite, dermatite herpetiforme, neurodermatite e autoeczematização e dermatite de estase, complicações de pele diabética, hidradenite supurativa, líquen plano, psoríase incluindo psoríase em placas, psoríase da unha, psoríase gutata, psoríase do couro cabeludo, psoríase inversa, psoríase pustular, psoríase da eritrodermia e artrite psoriática, rosácea e escleroderma, incluindo morfeia, úlceras.

[00107] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por um distúrbio gastrointestinal. Um distúrbio gastrointestinal inclui, por exemplo, doença do intestino irritável (IBD), uma doença inflamatória do intestino incluindo doença de Crohn e uma colite ulcerativa tal como proctite de ulcerativa, colite do lado esquerdo, pancolite e colite fulminante.

[00108] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma doença cardiovascular. Quando colesterol LDL fica incrustrado nas paredes arteriais, ele pode invocar uma resposta imune. Inflamação aguda e/ou crônica pode eventualmente danificar as artérias, o que pode fazer com que elas se rompam. Em geral, doença cardiovascular é qualquer uma de várias doenças específicas que afetam o próprio coração e/ou o sistema de vaso sanguíneo, especialmente as veias e as artérias que levam para e a partir do coração. Há em média 60 tipos de distúrbios cardiovasculares incluindo, por exemplo, uma hipertensão, endocardite, miocardite, disfunção da válvula cardíaca, falência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, uma condição cardíaca diabética, inflamação do vaso sanguíneo tais como arterite, flebite, vasculite; doença oclusiva arterial tal como arteriosclerose e estenose, cardiomegalia inflamatória, uma doença arterial periférica; um aneurisma; um embolismo; uma dissecação; um pseudoaneurisma; uma má-formação vascular; um nevo vascular; uma trombose; uma tromboflebite; uma veia varicose; um acidente vascular cerebral. Sintomas de um distúrbio cardiovascular afetando o coração incluem, sem limitação, dor no peito ou desconforto no peito (angina), dor em um ou ambos os braços, no ombro esquerdo, pescoço, mandíbula ou costas, perda de fôlego, tontura, batimentos cardíacos mais rápidos, náusea, batimentos cardíacos anormais, sensação de fadiga. Sintomas de um distúrbio cardiovascular que afeta o cérebro incluem, sem limitação, entorpecimento ou fraqueza repentina da face, braço ou perna, especialmente em um lado do corpo, fala ou linguagem compreensível confusa ou com dificuldade, dificuldade repentina em enxergar com um ou ambos os olhos, tontura repentina, dificuldades em andar ou perda de equilíbrio ou coordenação, cefaleia severa repentina sem nenhuma causa conhecida. Sintomas de distúrbio cardiovascular afetando as pernas, pélvis e/ou braço incluem, sem limitação, claudicação, que é uma dor, aflição ou câimbra nos músculos e sensação fria ou de entorpecimento nos pés ou dedos dos pés, especialmente à noite.

[00109] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por um câncer. Em geral, inflamação orquestra o microambiente ao redor de tumores, contribuindo para proliferação, sobrevivência e migração. Por exemplo, inflamação fibrinosa resulta de um aumento grande em permeabilidade vascular que permite que a fibrina passe pelos vasos sanguíneos. Se estímulo procoagulativo apropriado estiver presente, tais como células cancerosas, um exudato fibrinoso é depositado. Isto é comumente visto em cavidades serosas, onde a conversão de exudato fibrinoso em uma cicatriz pode ocorrer entre membranas serosas, limitando sua função. Em um outro exemplo, um câncer é um câncer inflamatório tal como câncer inflamatório direcionado por NF-KB.

[00110] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é uma inflamação farmacologicamente induzida. Certos fármacos ou compostos químicos exogênicos, incluindo deficiências em vitaminas e minerais-chave, são conhecidos afetar inflamação. Por exemplo, deficiência de Vitamina A causa um aumento em uma resposta inflamatória, deficiência de Vitamina C causa doença do tecido conectivo e deficiência de Vitamina D leva à osteoporose. Certos agentes farmacológicos podem induzir complicações inflamatórias, por exemplo, hepatite induzida por fármaco. Certos fármacos ilícitos tais como cocaína e ecstasy podem exercer alguns de seus efeitos prejudiciais através da ativação de fatores de transcrição intimamente envolvidos com inflamação (por exemplo, NF-kB). Terapia de radiação pode induzir toxidez pulmonar, queimaduras, miocardite, mucosite e outras lesões a tecido dependendo do sítio de exposição e dose.

[00111] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma infecção. Um organismo infeccioso pode escapar dos limites do tecido imediato através do sistema circulatório ou sistema linfático, onde ele pode se espalhar para outras partes do corpo. Se um organismo não for contido pelas ações de inflamação aguda, ele pode obter acesso ao sistema linfático através de vasos linfáticos vizinhos. Uma infecção dos vasos linfáticos é conhecida como linfangite, e infecção de um nó linfático é conhecida como linfadenite. Um patógeno pode obter acesso à corrente sanguínea através de drenagem linfática para o sistema circulatório. Infecções incluem, sem limitação, cistite bacteriana, encefalite bacteriana, influenza pandêmica, encefalite viral e hepatite viral (A, B e C).

[00112] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma lesão a tecido ou órgão. Lesões a tecido ou órgão incluem, sem limitação, uma queimadura, uma laceração, uma ferida, uma punção ou um trauma.

[00113] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma rejeição de transplante. Rejeição de transplante ocorre quando um órgão ou tecido transplantado não é aceito pelo corpo do recipiente transplantado porque o sistema imune do recipiente ataque o órgão ou tecido transplantado. Uma resposta imune adaptativa, rejeição de transplante é mediada por ambos mecanismos mediados por célula T e imunes humorais (anticorpos). Uma rejeição de transplante pode ser classificada como uma rejeição hiperaguda, uma rejeição aguda ou uma rejeição crônica. Rejeição aguda e/ou crônica de um órgão ou tecido transplante é onde a rejeição é devido a uma resposta inflamatória e imune aguda e/ou crônica pobremente compreendida contra o tecido transplantado. Também incluída como rejeição de transplante é a doença enxerto-versus- hospedeiro (GVHD), GVHD aguda ou crônica. GVHD é uma complicação comum de transplante da medula óssea alogeneico onde células imunes funcionais na medula óssea transplantada reconhecem o recipiente como "estranho" e montam um ataque imunológico. Ela pode também acontecer em uma transfusão de sangue sob certas circunstâncias. GVHD é dividida em formas aguda e crônica. GVHD aguda e crônica parecem envolver subconjuntos de célula imune diferentes, perfis de citocina diferentes, alvos de hospedeiro um pouco diferentes e respondem diferentemente a tratamento. Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica é induzida por uma doença inflamatória mediada por Th1. Em sistema imune com bom funcionamento, uma resposta imune deve resultar em uma resposta a Th1 proinflamatória bem equilibrada e uma resposta a Th2 anti- inflamatória que é adequada para se endereçar à provocação imune. Falando de um modo geral, uma vez uma resposta a Th1 proinflamatória sendo iniciada, o corpo se apoia na resposta anti-inflamatória invocada por uma resposta a Th2 para combater esta resposta a Th1. Esta resposta de combate inclui a liberação de citocinas tipo 2 tais como, por exemplo, IL-4, IL-5 e IL-13, que são associadas à promoção de respostas de IgE e eosinofílica em atopia, e também IL-10, que tem uma resposta anti-inflamatória. Uma doença inflamatória mediada por Th1 envolve uma resposta proinflamatórias excessiva produzida por células Th1 que leva à inflamação aguda e/ou crônica. A doença mediada por Th1 pode ser viralmente, bacterialmente ou quimicamente (por exemplo, ambientalmente) induzida. Por exemplo, um vírus que causa a doença mediada por Th1 pode causar uma infecção crônica ou aguda, que pode causar um distúrbio respiratório ou influenza.

[00114] Em uma outra modalidade, uma inflamação aguda e/ou crônica compreende uma inflamação neurogênica aguda e/ou crônica. Inflamação neurogênica aguda e/ou crônica se refere a uma resposta inflamatória iniciada e/ou mantida através da liberação de moléculas inflamatórias tal como SP ou CGRP que liberaram dos terminais de nervo sensorial periférico (isto é, uma função eferente, em contraste com a sinalização aferente normal ao cordão espinhal nesses nervos). Inflamação neurogênica aguda e/ou crônica inclui ambas inflamação neurogênica primária e inflamação secundária. Inflamação neurogênica primária se refere à inflamação de tecido (sintomas inflamatórios) que é iniciada por, ou resulta de, liberação de substâncias de terminais do nervo sensorial primário (tais como fibras delta C e A). Inflamação neurogênica secundária refere-se à inflamação de tecido iniciada por fontes não neuronais (por exemplo, extravasamento de leito vascular ou derivada de interstício, tal como de mastócitos ou células imunes) de mediadores inflamatórios, tais como peptídeos ou citocinas, estimulando terminais de nervo sensorial e causando uma liberação de mediadores inflamatórios a partir dos nervos. O efeito real de ambas as formas (primária e secundária) de inflamação neurogênica aguda e/ou crônica é ter um estado inflamatório que é mantido pela sensibilização das fibras do nervo sensorial periférico. A consequência fisiológica da inflamação neurogênica aguda e/ou crônica resultante depende do tecido em questão, produzindo, tal como, por exemplo, dor cutânea (alodinia, hiperalgesia), dor na junta e/ou artrite, dor visceral e disfunção, disfunção pulmonar (asma, COPD) e disfunção da bexiga (dor, bexiga hiperativa).

VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

[00115] A população celular expressando um ligante de E-selectina e/ou L-selectina pode ser administrada a indivíduos de acordo com várias vias de administração adequadas. Métodos exemplares podem incluir injeção vascular, por exemplo, injeção intravenosa (i.v.) ou implante direto de células em um sítio alvo em um indivíduo.

[00116] Outros métodos de administração podem incluir administração intratraqueal, administração intratecal, administração intraóssea, administração pulmonar, administração bucal, administração aerossol, administração por inalação e administração oral. Ainda outros métodos podem incluir administração intra-arterial, administração intracerebral, administração intraintestinal, administração intracardíaca, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intraorbital, administração intracapsular, administração intraespinhal, administração intraperitoneal, administração intrasternal, administração intravesical, administração intralinfática, administração intracavital, administração vaginal, administração retal, administração transuretral, administração intradermal, administração intraocular, administração aural, administração intramamária, administração ortotópica, administração intratraqueal, administração intralesional, administração percutânea, administração endoscópica, administração transmucosal, administração sublingual e aplicação direta a superfícies corporais (por exemplo, diretamente sobre a superfície da pele).

[00117] As células podem ser inseridas em um dispositivo de administração que facilita introdução através de injeção ou implante nos indivíduos. Tais dispositivos de administração podem incluir tubos, por exemplo, cateteres, para injeção das células e fluidos no corpo de um indivíduo recipiente. Tais dispositivos de administração podem incluir também dispositivos e métodos de administração endoscópica. Preferivelmente, os tubos têm ainda uma agulha, por exemplo, uma seringa, através da qual as células da invenção podem ser introduzidas no indivíduo em um local desejado.

[00118] As células podem ser administradas subsequente a manipulações/procedimentos para aumentar a atividade de ligação à E-selectina e/ou L-selectina ou, em algumas modalidades, criopreservadas e então descongeladas antes da administração a um indivíduo. As células podem ser preparadas para administração em uma variedade de formas diferentes. Por exemplo, as células podem ser suspensas em uma solução ou gel ou incrustradas em uma matriz de apoio quando contidas em tal dispositivo de administração. As células podem ser misturadas com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável onde as células da invenção permanecem viáveis. Carreadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. O uso de tais carreadores e diluentes é bem conhecido na técnica. A solução é preferivelmente estéril e fluida. Preferivelmente, a solução é estável sob as condições de fabricação e armazenamento e preservada contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos através do uso de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similar. Soluções podem ser preparadas através da incorporação das células como aqui descrito em um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável e, conforme necessário, outros ingredientes, seguido por esterilização filtrada.

[00119] Administração intravascular através de técnicas de injeção com agulhas ou dispositivos vascular-auxiliados (por exemplo, com base em cateter) para administração celular pode ser também usada para obter distribuição através de toda a vasculatura, ou à vasculatura de um órgão particular, tal como, por exemplo, fígado ou rim ou qualquer outro órgão. Isto inclui direcionamento não específico da vasculatura. Alternativamente, qualquer órgão pode ser direcionado através de seleção de um sítio de injeção específico tal como, por exemplo, uma veia portal do fígado. Alternativamente, a injeção pode ser realizada sistemicamente em qualquer veia do corpo. Este método é útil para aumento dos números de célula-tronco em pacientes idosos. Ainda, as células podem funcionar para popular nichos de célula-tronco vazios ou criar novas células-tronco para reabastecer o órgão, desta maneira aperfeiçoando a função do órgão. Por exemplo, as células podem assumir locais de pericitos dentro da vasculatura.

[00120] Em algumas modalidades, as células são introduzidas no indivíduo como parte de um agregado celular (por exemplo, uma ilhota pancreática), tecido ou órgão, por exemplo, como parte de um método de transplante de órgão.

[00121] Administração de células pode também ser usada para direcionar sítios de angiogênese ativa. Por exemplo, administração de células progenitoras endoteliais ou células-tronco ou progenitoras mesenquimais pode aumentar a resposta angiogênica em um sítio de ferimento. Direcionamento de angiogênese pode também ser útil para uso de células como um veículo para direcionar fármacos a tumores.

CÉLULAS MODIFICADAS E MÉTODOS PARA SUA PREPARAÇÃO

[00122] Devido, pelo menos em parte, às suas capacidades de direcionamento aumentadas, certas células expressando E- e/ou L- selectina são úteis nos métodos descritos aqui. A título de exemplo, as células podem aperfeiçoar o enxerto de células-tronco tais como HSPCs em transplante clínico para uso de MSC em terapia à base de célula (por exemplo, para doenças ósseas) ou direcionamento de migração e infiltração de células progenitoras/tronco em tecido(s) lesionado(s)/danificado(s) para agentes terapêuticos regenerativos de acordo com os métodos descritos aqui.

[00123] Desta maneira, as células usadas nos métodos descritos aqui expressam um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L- selectina. Desta maneira, por exemplo, após modificação, a célula se liga à E-selectina e/ou L-selectina. Em várias modalidades, a célula modificada pode se ligar à P-selectina. Em uma modalidade particular, após modificação as células expressam a glicoforma CD44 sialofucosilada conhecida como Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL). Em uma outra modalidade particular, após modificação as células em excesso expressam Ligante de E-selectina de Molécula de Adesão de Célula Neural (NCAM-E). Em certas modalidades, após modificação as células expressam ambos os HCELL e NCAM-E. Em certas modalidades as células expressam HCELL e/ou CD43-E e/ou CLA. Após modificação, a célula é capaz de se dirigir in vivo para a medula óssea ou sítios de inflamação.

[00124] Em certas modalidades, as células usadas nos métodos descritos aqui expressam um ligante de L-selectina. Em uma modalidade particular, após modificação as células expressam o ligante de L-selectina potente conhecido como Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL), glicoforma CD44 sialofucosilada. Em uma outra modalidade, as células expressam quantidades aumentadas dos ligantes de L-selectina HCELL e/ou PSGL-1 ou os ligantes de selectina HCELL, CLA, CD43-E, NCAM-E ou ESL-1. Tais células podem se alojar em sítios de inflamação através de ligação à E-selectina ou células endoteliais ou através de ligação à L-selectina expressa em leucócitos de infiltração dentro do sítio inflamatório.

[00125] Para engenharia personalizada ex vivo de glicanos de superfície de célula viva usando glicosiltransferases, é imperativo que as células tratadas permaneçam viáveis e fenotipicamente conservadas seguindo tratamento(s). Anteriormente, cofatores de metal divalentes tal como manganês foram considerados críticos para atividade enzimática para a(1,3)-fucosiltransferases, com o uso de tais co-fatores em níveis que eram notoriamente citotóxicos (por exemplo, 10 mM Mn++). No entanto, é agora conhecido que essas glicosiltransferases possuem atividade enzimática na ausência de, ou na presença de, quantidades relativamente pequenas de, co-fatores de metal divalente (por exemplo, cátions divalentes tais como manganês, magnésio, zinco, cobalto ou níquel). Além disso, essas enzimas podem ser armazenadas na ausência de estabilizadores tal como glicerol que sozinhos podem ser tóxicos para as células. Certas composições de glicosiltransferase descritas na Pat. U.S. N°. 7.875.585 são particularmente úteis em modificação de glicanos em células vivas, células e/ou partículas ou fragmentos das mesmas que podem então ser usados nos métodos de tratamento descritos aqui. Em aplicações usando células-tronco, é também importante analisar se diferenciação junto a linhagens características é afetada por tratamento enzimático.

[00126] Vários métodos podem ser utilizados para preparação de células que se ligam à E-selectina e/ou L-selectina.

[00127] Por exemplo, as Patentes U.S. N°s. 7.875.585 e 8.084.236 proveem composições e métodos para modificação ex vivo de glicanos de superfície celular em uma célula viável, a última das quais pode por sua vez ser utilizada em métodos de tratamento de inflamação aguda ou crônica como aqui descrito. As composições incluem um polipeptídeo glicosiltransferase purificado e uma solução fisiologicamente aceitável para uso junto com açúcares de nucleotídeo doadores apropriados em tampões de reação e condições de reação especificamente formulados para reter viabilidade celular. Em certas modalidades preferidas, a solução fisiologicamente aceitável é livre ou substancialmente livre de cofatores de metal divalente, até certo ponto que a viabilidade celular não seja comprometida. Nessas e outras modalidades preferidas, a composição é também livre ou substancialmente livre de compostos estabilizadores tal como, por exemplo, glicerol. Glicosiltransferase inclui, por exemplo, fucosiltransferase, galactosiltransferase, sialiltransferase e N-acetilglicosaminiltransferase. Em uma modalidade, a fucosiltransferase é uma alfa 1,3-fucosiltransferase tal como uma alfa 1,3-fucosiltransferase III, alfa 1,3 fucosiltransferase IV, uma alfa 1,3 fucosiltransferase V, uma alfa 1,3 fucosiltransferase VI, uma alfa 1,3 fucosiltransferase VII ou uma alfa 1,3 fucosiltransferase IX. A sialiltransferase pode ser ST3Galll, ST3GalIV ou ST3GalVI.

[00128] Os glicanos são modificados na superfície de uma célula através de contato de uma população de células com uma ou mais composições de glicosiltransferase descritas acima. As células são contatadas com a composição de glicosiltransferase junto com doador de açúcar de nucleotídeo apropriado (por exemplo, GDP-fucose, CMP- ácido siálico) sob condições onde a glicosiltransferase tem atividade enzimática. Modificação de glicano de acordo com este método resulta em células que têm pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais viabilidade em 24 horas ou mais após tratamento. Em uma modalidade, por exemplo, as células têm pelo menos 70% de viabilidade em 48 horas após tratamento. Em uma modalidade do tipo, por exemplo, as células têm pelo menos 75% de viabilidade em 48 horas após tratamento. Em uma modalidade, por exemplo, as células têm pelo menos 80% de viabilidade em 48 horas após tratamento. Ainda, o fenótipo das células (outra que não a modificação de glicano) é preferivelmente preservado após tratamento. Por fenótipo preservado quer dizer que a célula mantém sua função e/ou atividade nativa. Por exemplo, se a célula fora uma célula-tronco, ela retém sua potência, isto é, sua totipotência ou pluripotência ou multipotência ou onipotência relevante, como seria característico deste tipo de célula-tronco particular.

[00129] Um outro método de modificação de células para uso nos métodos de tratamento descritos aqui pode ser encontrado na Pub. de Pedido de Patente U.S. N°. 2013/0040837. De acordo com os métodos descritos aqui, ácidos nucleicos (por exemplo, um aptâmero) que se ligam especificamente a um alvo de ácido nucleico podem ser imobilizados na membrana celular. Os aptâmeros podem ser selecionados para um alvo específico, tais como aqueles capazes de se ligar a proteínas particulares. Desta maneira, por exemplo, aptâmeros que se ligam a receptores de superfície celular/moléculas de adesão celular (por exemplo, E-selectina, L-selectina) podem ser imobilizados sobre a superfície da célula para aperfeiçoar direcionamento à célula. Os aptâmeros podem ser conjugados à superfície celular usando um processo de modificação de três etapas que inclui (i) tratamento de células (em uma suspensão após tripnização) com botinil-N-hidroxi- succinimida sulfonada (NHS-biotina) para introduzir grupos biotina na superfície celular, (ii) complexação com estreptavidina e (iii) acoplamento com aptâmeros biotinilados. Usando esta abordagem, Karp e outros relataram na US 2013/0040837 que tipicamente ~21.000 moléculas foram ligados por célula usando este procedimento e que a densidade de sítio de aptâmeros na superfície celular poderia ser prontamente afinada através do ajuste da concentração de aptâmero usada na conjugação.

[00130] Expressão de ligação à selectina pode ser também induzida por adição covalente de porções sLex ou sLea ou outros complexos de oligossacarídeo que se ligam a selectinas. Por exemplo, como descrito em mais detalhes e como exemplificado por Karp e outros na US2011/0206740, conjugação de biotina-estreptavidina foi utilizada para incorporar quimicamente a porção sialil-LewisXà superfície celular. Mais especificamente, os grupos amina livres presentes na superfície das células foram deixados reagir com grupo N-hidroxi-succinimida de bitinil-N-hidroxi-succinimida para biotinilar a superfície celular. Esta etapa foi subsequentemente seguida pela reacao da porção biotina da superfície celular com uma molecula de estreptavidina. A interação forte entre biotina e estreptavidina permite que a molécula de estreptavidina seja imobilizada sobre a superfície celular. A estreptavidina é então reagida com sLex biotinilado (Sialil-Lex-PAA-Biotina) para introduzir sLex na superfície celular.

[00131] Em uma modalidade alternativa para engenharia de glicano das superfícies celulares, uma fucosiltransferase é usada para incorporar uma montagem en bloc de um glicano sLex ou sLea em uma superfície celular como descrito, por exemplo, por Srivastava e outros, J. Biol. Chem. 1992, 267:22356-22361. Mais especificamente, Srivastava e outros relataram que uma Le-FucT parcialmente purificada de leite humano, que normalmente usava GDP-fucose como o doador para a transferência de um resíduo de fucose único, também transferirá um resíduo de fucose substituído em C-6 através de uma estrutura estericamente exigente muito grande. Desta maneira, a fucosiltransferase poderia ser usada para transferir um glicano tal como um sialil-LewisX para aumentar o nível de expressão de ligante de E- selectina e/ou um ligante de L-selectina na superfície de uma população de células que é maior do que o nível de expressão para uma população nativa de tais células.

[00132] Em uma outra modalidade, uma variedade de ligantes químicos bifuncionais pode ser usada para ligar covalentemente glicanos sLex ou sLea, ou glicomiméticos de sLex ou sLea, ou peptidomiméticos de sLex ou sLea (por exemplo, como poderia ser gerado através de tecnologia de exibição de fago). Similarmente, mAb ou fragmentos de mAb dos mesmos que se ligam à E-selectina e/ou L- selectina poderiam ser conjugados à superfície celular para aumentar a ligação à E-selectina e/ou L-selectina, respectivamente.

[00133] Em adição ao acima, quaisquer outros métodos de modificação de uma célula ou células que expressam um ligante de E- selectina e/ou um ligante de L-selectina podem ser utilizados. Isto inclui, por exemplo, a promoção de interações covalentes e/ou não covalentes, ligação de hidrogênio e/ou forças van der Wals entre a superfície celular e o ligante, produto de exibição de fago e similar.

[00134] Em geral, qualquer tipo de célula pode ser modificado e usado nos métodos de tratamento descritos aqui. Para uso animal é preferido que a célula seja de origem animal, enquanto para uso humano é preferido que a célula seja uma célula humana; em cada caso, uma fonte de célula autóloga poderia ser usada, uma célula de fonte singeneica poderia ser usada, uma célula de fonte alogeneica poderia ser usada (incluindo uma combinação de células doadoras alogeneicas em um dado produto celular) ou uma fonte de célula xenogeneica pode ser utilizada. A célula pode ser uma célula primária, por exemplo, um hepatócito primário, uma célula neuronal primária, um mioblasto primário, uma célula-tronco mesenquimal primária, célula progenitora primária ou ela pode ser uma célula de uma linhagem de célula estabelecida ou de uma cultura de célula expandida (por exemplo, células T, células dendríticas, etc). Não é necessário que a célula seja capaz de sofrer divisão celular; uma célula termicamente diferenciada pode ser usada nos métodos descritos aqui. Neste contexto, a célula pode ser de qualquer tipo incluindo, mas não limitado a, células-tronco embriônicas, células-tronco de adulto, células-tronco pluripotentes induzidas, células progenitoras de sangue, células progenitoras de tecido, células epiteliais, endoteliais, neuronais, adiposas, cardíacas, de músculo esqueletal, fibroblasto, imunes (por exemplo, células dendríticas, monócitos, macrófagos, leucócitos (por exemplo, um linfócito tal como um linfócito B, um linfócito T ou um subconjunto de linfócitos T, tal como linfócito regulador (CD4+/CD25+/FOXP3+)), uma célula T pura, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora, uma célula T efetora, células NK, etc), células hepáticas, esplênicas, de pulmão, sanguíneas em circulação, plaquetas, células reprodutoras, células gastrintestinais, células renais, células da medula óssea, células cardíacas, células edoteliais, células endócrinas, células de pele, células de músculo, células neuronais e células pancreáticas. A célula pode ser uma linhagem celular, uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco hematopoiética, uma célula- tronco/progenitora de tecido (por exemplo, uma célula-tronco neural, célula-tronco gastrointestinal, célula-tronco de miócito, célula-tronco progenitora/ de cardiomiócito, célula progenitora endotelial ou célula- tronco pulmonar), uma célula-tronco de cordão umbilical ou uma célula-tronco embriônica ou uma célula primária isolada de qualquer tecido incluindo, mas não limitado a, cérebro, fígado, pulmão, intestino, estômago, gordura, músculo, testículos, útero, ovário, pele, baço, órgão endócrino e osso e similar.

[00135] Onde a célula for mantida sob condições in vitro, condições e métodos de cultura de tecido convencionais podem ser usados e são conhecidos daqueles de habilidade na técnica. Isolamento e métodos de cultura para várias células estão dentro do conhecimento de um versado na técnica.

[00136] Ainda, ambas as populações celulares heterogênea e homogênea são compreendidas para uso com os métodos e composições descritos aqui. Ainda, agregados de células, células ligadas a ou encapsuladas dentro de partículas, células dentro de veículos de administração injetáveis tais como hidrogéis e células ligadas a substratos transplantáveis (incluindo bases) ou aplicadas a tecido(s) que carrega bases/substratos transplantáveis são compreendidos para uso com os métodos e composições descritos aqui. Além disso, células podem ser usadas em combinação com agentes proliferativos/potencializadores de tecido e/ou agentes anti- inflamatórios (por exemplo, fatores de crescimento, citocinas, prostaglandinas, agentes tróficos, Resolvins, NSAIDS, esteroides, etc).

[00137] A presente invenção inclui ainda as modalidades enumeradas que seguem.

[00138] Modalidade 1. Um método de aumento da administração celular a um tecido alvo de um indivíduo e/ou aumento da colonização de tecido no tecido alvo do indivíduo, o método compreendendo: administração ao indivíduo de uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde a dita administração celular ocorre coincidente com expressão de E- selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo e/ou coincidente com o acúmulo de leucócitos dentro do tecido alvo.

[00139] Modalidade 2. Um método de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição médica se manifestando como tecido inflamado e/ou danificado em um indivíduo, o método compreendendo: administração ao indivíduo de uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde a dita administração celular ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido alvo, e onde a dita população exibe localização e/ou colonização aumentada dentro do tecido inflamado e/ou danificado em relação a uma população nativa das células administradas.

[00140] Modalidade 3. Um método de aperfeiçoamento de administração celular a um tecido alvo em um indivíduo, o método compreendendo: administração ao indivíduo, através de administração vascular e/ou através de injeção direta a tecido (isto é, diretamente ao(s) sítio(s) de tecido afetado)) e/ou intratecalmente e/ou intracavitalmente e/ou intravesicalmente e/ou dentro de conduítes anatômicos (sistema biliar, sistema urinário, etc) e/ou em tecido (isto é, colocação sobre tecido afetado), uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde a dita administração celular ocorre coincidente com expressão de E- selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido alvo, e onde a dita população celular administrada obtém um ou mais de direcionamento, colonização e enxerto aumentado em relação a uma população nativa de células.

[00141] Modalidade 4. Um método de aumento de administração e colonização celular em um tecido inflamado e/ou danificado de um indivíduo, o método compreendendo: injetar diretamente no ou pôr sobre/dentro do dito tecido inflamado e/ou danificado uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L- selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde a dita injeção/colocação ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido alvo.

[00142] Modalidade 5. Um método de aumento da administração, colonização e/ou enxerto celular em um tecido alvo de um indivíduo, o método compreendendo: administração através da vasculatura do indivíduo de uma população de células que expressa um ligante de E- selectina e/ou um ligante de L-selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde a dita administração ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido alvo.

[00143] Modalidade 6. Um método de aumento de alojamento, colonização e/ou enxerto de uma população de célula dentro de um tecido alvo em um indivíduo, o método compreendendo: injeção diretamente no tecido alvo ou colocação no tecido alvo de uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde a dita injeção ocorre coincidente com expressão de E-selectina sobre células endoteliais dentro do tecido alvo e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido alvo, e onde a dita população obtém colonização de tecido alvo aumentada em relação a uma população nativa das células.

[00144] Modalidade 7. Um método de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição médica se manifestando como tecido inflamado e/ou danificado em um indivíduo, o método compreendendo: administração a um indivíduo de uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou o ligante de L- selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, e onde a dita injeção ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido inflamado e/ou danificado e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido inflamado e/ou danificado.

[00145] Modalidade 8. Um método de tratamento de um tumor/doença maligna em um indivíduo, o método compreendendo: administração ao indivíduo de uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, a população expressando o ligante de E-selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde a dita administração ocorre coincidente com a expressão de E-selectina em células endoteliais dentro de tecido(s) que carrega células de tumor/malignas e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido(s) carregando células de tumor/malignas.

[00146] Modalidade 9. Uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição médica se manifestando como tecido inflamado e/ou danificado em um indivíduo, o tratamento compreendendo administração ao indivíduo da população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, onde a população expressa o ligante de E-selectina e/ou ligante de E-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde o dito tratamento compreende administração da população coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tecido inflamado e/ou danificado e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido inflamado e/ou danificado.

[00147] Modalidade 10. Uma população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de E-selectina para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor/doença maligna, o tratamento compreendendo administração ao indivíduo da população de células que expressa um ligante de E-selectina e/ou um ligante de L-selectina, onde a população expressa o ligante de E- selectina e/ou ligante de L-selectina em um nível que excede o nível de expressão de uma população nativa das células, onde o dito tratamento compreende administração da população coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais dentro do tumor/tecido maligno e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tumor/tecido maligno.

[00148] Modalidade 11. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-10, onde a dita administração celular ocorre coincidente com expressão de E-selectina em células endoteliais e infiltrados de leucócitos carregando L-selectina dentro do tecido alvo.

[00149] Modalidade 12. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-11, onde a dita administração/injeção ocorre durante infiltração de leucócitos em um/no tecido inflamado e/ou danificado.

[00150] Modalidade 13. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-12, compreendendo ainda enxerto da população de células administrada em um ambiente de um/do tecido inflamado e/ou danificado.

[00151] Modalidade 14. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-13, onde um efeito imunomodulador é obtido através da colonização de células dentro de um/do tecido inflamado e/ou danificado.

[00152] Modalidade 15. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-14, onde um efeito reparador de tecido é obtido através de colonização de células administradas dentro de um/do tecido inflamado e/ou danificado.

[00153] Modalidade 16. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-15, onde um efeito de defesa de hospedeiro/resposta imune aumentado é obtido através de administração ou colonização de células administradas dentro de um/do tecido inflamado e/ou danificado.

[00154] Modalidade 17. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-16, onde um efeito antimalignidade é obtido através de colonização de células administradas dentro de um/do sítio de tecido de tumor/maligno.

[00155] Modalidade 18. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-17, onde a dita administração/injeção compreende uma ou uma série de injeções da população celular.

[00156] Modalidade 19. O método ou população de células de qualquer uma das Modalidades 1-18, onde a dita administração/injeção compreende injeções diariamente, semanalmente, duas vezes por semana, mensalmente ou anualmente da população celular.

[00157] Modalidade 20. O método ou população de células de qualquer uma das Modalidades 1-9, compreendendo ainda uma ou mais administrações/injeção adicionais da população celular quando de uma diminuição no indivíduo de um efeito imunomodulador de uma administração/injeção anterior.

[00158] Modalidade 21. O método ou população de células de qualquer uma das Modalidades 1-20, onde a população celular é administrada/injetada intravenosamente.

[00159] Modalidade 22. O método ou população de células de qualquer uma das Modalidades 1-21, onde a população celular é administrada através de injeção direta ao tecido inflamado e/ou lesionado.

[00160] Modalidade 23. O método ou população de células de qualquer uma das Modalidades 1-21, onde a população celular é posta no tecido inflamado e/ou tecido lesionado.

[00161] Modalidade 24. O método ou população de células de qualquer uma das Modalidades 1-21, onde a população celular é posta sobre uma/o tecido inflamado e/ou tecido lesionado.

[00162] Modalidade 25. O método ou população de células de qualquer uma das Modalidades 1-21, onde a população celular é utilizada em combinação com outros agentes de potencialização, agentes anti-inflamatórios ou com bases de tecido/dispositivos transplantáveis/géis.

[00163] Modalidade 26. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-25, onde a população de células expressa um ligante de E-selectina e um ligante de L-selectina.

[00164] Modalidade 27. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-26, onde o ligante de E-selectina e/ou ligante de L- selectina é selecionado de um ou mais de Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL), Ligante de E-selectina de Molécula de Adesão de Célula Neural (NCAM-E), CD43E, CLA e ESL-1.

[00165] Modalidade 28. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-27, onde o ligante de E-selectina é Ligante de E-/L- selectina de Célula Hematopoiética (HCELL) e/ou Ligante de E- selectina de Molécula de Adesão de Célula Neural (NCAM-E).

[00166] Modalidade 29. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-28, onde o ligante de E-selectina é HCELL.

[00167] Modalidade 30. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-29, onde o ligante de E-selectina é NCAM-E.

[00168] Modalidade 31. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-30, onde o ligante de L-selectina é HCELL.

[00169] Modalidade 32. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-31, onde a população celular compreende um ou mais de células epiteliais, endoteliais, neuronais, adiposas, cardíacas, de músculo esqueletal, fibroblasto e imunes (por exemplo, células dendríticas, monócitos, macrófagos, leucócitos (por exemplo, um linfócito tal como célula NK, um linfócito B, um linfócito T ou um subconjunto de linfócitos T, tal como linfócito regulador (CD4+/CD25+/FOXP3+)), um linfócito citotóxico, etc), células hepáticas, esplênicas, de pulmão, de sangue em circulação, plaquetas, células reprodutoras, células gastrintestinais, renais, medula óssea, pancreáticas, uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco mesenquimal, um célula-tronco hematopoiética, uma célula- tronco/progenitora de tecido (por exemplo, uma célula-tronco neural, uma célula-tronco de miócito ou célula-tronco pulmonar)), uma célula- tronco de cordão umbilical ou uma célula-tronco embriônica ou uma célula-tronco pluripotente induzida ou uma progenitora diferenciada derivada de uma célula-tronco embriônica ou de uma célula-tronco pluripotente induzida ou uma progenitora derivada de uma célula-tronco adulta ou uma célula primária isolada de qualquer tecido (por exemplo, cérebro, fígado, pulmão, intestino, estômago, gordura, músculo, testículo, útero, ovário, pele, baço, órgão endócrino e osso) ou uma população de célula progenitora expandida em cultura ou uma população de célula-tronco expandida em cultura ou uma população de célula primária expandida em cultura.

[00170] Modalidade 33. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-32, onde a população celular é uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco hematopoiética, uma célula- tronco/progenitora de tecido, uma célula-tronco de cordão umbilical ou uma célula-tronco embriônica.

[00171] Modalidade 34. O método ou população de qualquer uma das modalidades 1-33, onde a população celular é um leucócito (por exemplo, um linfócito tal como uma célula NK, linfócito B, um linfócito T ou um subconjunto de linfócitos T, tal como linfócito regulador (CD4+/CD25+/FOXP3+)), uma célula T citotóxica, etc).

[00172] Modalidade 35. O Método ou população de qualquer uma das modalidades 1-34, onde a doença, distúrbio ou condição médica é um ou mais de lesão a tecido direta (por exemplo, queimaduras, trauma, úlceras de decúbito, etc), eventos isquêmicos/vasculares (por exemplo, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, choque, hemorragia, coagulopatia, etc), infecções (por exemplo, celulite, pneumonia, meningite, sepse, SIRS, etc), neoplasia (por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de próstata, linfoma, leucemia, etc), condições imunológicas/autoimunes (por exemplo, doença enxerto vs. hospedeiro, esclerose múltipla, diabetes, doença inflamatória do intestino, lúpus eritematoso, artrite reumatoide, psoríase, etc), doenças degenerativas (por exemplo, osteoporose, osteoartrite, doença de Alzheimer, etc), doenças congênitas/genéticas (por exemplo, epidermólise bolhosa, osteogênese imperfeita, distrofias musculares, doenças de armazenamento lisossomal, doença de Huntington, etc), efeitos de fármaco adversos (por exemplo, hepatite induzida por fármaco, lesão cardíaca induzida por fármaco, etc), lesões tóxicas (por exemplo, exposição(ões) à radiação, exposição(ões) química(s), hepatite alcoólica, pancreatite alcoólica, cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia por cocaína, etc), desarranjos metabólicos (por exemplo, pericardite urêmica, acidose metabólica, etc), condições iatrogênicas (por exemplo, lesão a tecido induzida por radiação, complicações relacionadas à cirurgia, etc) e/ou processos idiopáticos (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, Síndrome Parsonnage-Turner, etc).

[00173] Modalidade 36. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-35, onde a doença, distúrbio ou condição médica é diabetes.

[00174] Modalidade 37. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-36, onde a doença, distúrbio ou condição médica é esclerose múltipla.

[00175] Modalidade 38. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-37, onde o indivíduo é um humano, primata não humano, camundongo, rato, cachorro, gado, cavalo ou vaca.

[00176] Modalidade 39. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-38, onde o indivíduo é um paciente humano.

[00177] Modalidade 40. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-39, onde a população celular é tratada para formar uma população de célula modificada tendo uma expressão reforçada de um ligante de E-selectina e/ou um de L-selectina, e a população celular tem uma viabilidade de pelo menos 70% em 24 horas após o tratamento.

[00178] Modalidade 41. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-40, onde a população celular tem uma viabilidade de pelo menos 80% em 24 horas após o tratamento.

[00179] Modalidade 42. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-40, onde a população celular tem uma viabilidade de pelo menos 70% em 48 horas após o tratamento.

[00180] Modalidade 43. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-42 onde, quando da administração da população celular a um indivíduo, a população celular se aloja dentro de um tecido compreendendo leucócitos de infiltração.

[00181] Modalidade 44. O método ou população da Modalidade 43, onde a administração é uma injeção direta no tecido ou colocação sobre o tecido.

[00182] Modalidade 45. O método ou população da Modalidade 43, onde a administração é vascular.

[00183] Modalidade 46. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-25 ou 25-42, onde a população é administrada sistemicamente, através ou de acesso vascular periférico ou acesso vascular central.

[00184] Modalidade 47. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-21 ou 25-42, onde a população é administrada intravascularmente a vasos alimentadores anatômicos de um sítio de tecido pretendido usando abordagens à base de cateter ou outros dispositivos de acesso vascular que administrarão um bolo vascular de células ao sítio pretendido.

[00185] Modalidade 48. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-21 ou 25-42, onde a população é administrada através da introdução no canal espinhal e/ou intraventricularmente.

[00186] Modalidade 49. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-21 ou 25-42, onde a população é administrada diretamente a cavidades corporais ou através de abordagens à base de cateter ou injeção direta.

[00187] Modalidade 50. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-21 ou 25-42, onde a população é administrada através de injeção a tecido local direta, usando ou abordagens intravasculares ou abordagens percutâneas ou diretamente em sítios de tecido anatomicamente acessíveis e/ou guiado por técnicas de imagem.

[00188] Modalidade 51. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-21 ou 25-42, onde a população é administrada através da colocação diretamente sobre superfícies/sítios de tecido.

[00189] Modalidade 52. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-21 ou 25-42, onde a população é administrada em bases ou incrustradas em bases postas em tecidos e/ou administrada em géis e/ou administradas junto com agentes potencializadores.

[00190] Modalidade 53. O método ou população de qualquer uma das Modalidades 1-21 ou 25-42, onde a população é administrada no fluido cerebroespinhal.

[00191] Tendo descrito a invenção em detalhes, será aparente que modificações e variações são possíveis sem se afastar do escopo da invenção definida nas reivindicações apensas. Ainda, deve ser compreendido que todos os exemplos na presente invenção são providos como exemplos não limitantes.

EXEMPLOS

[00192] Os exemplos não limitantes que seguem são providos para ilustrar mais a presente invenção. Deve ser compreendido por aqueles versados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que seguem representam abordagens que os inventores constataram funcionar bem na prática da invenção, e então podem ser consideradas constituir exemplos de modos para sua prática. No entanto, aqueles de habilidade na técnica devem, à luz da presente invenção, compreender que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades especificas que são reveladas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1: TRATAMENTO COM ALFA(1,3)- FUCOSILTRANSFERASE DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DE ADIPOSE REFORÇA A EXPRESSÃO DE HCELL

[00193] Estudos anteriores indicaram que células-tronco mesenquimais (MSCs) derivadas da medula óssea podem ser engenheiradas com glicano através de a(1,3)-fucosiltransferases para criar o ligante de E- e L-selectina potente HCELL (R. Sackstein e outros, Nature medicine 14:181-187 (2008)). Para determinar se expressão de HCELL pode ser reforçada em MSC derivada de fontes da medula óssea, a requerente analisou os efeitos de a(1,3)-exofucosilação sobre células- tronco mesenquimais derivadas de adiposo. Para esta finalidade, tecido adiposo foi obtido de material de lipossucção de ambos indivíduos magros e obesos e células-tronco mesenquimais foram culturadas como descrito (R., Sackstein e outros, Nature Medicine 14:181-187 (2008)). As células foram cultivadas em densidade baixa (confluência <60%) sob ambas as condições normóxicas (O2 21%) e hipóxicas (O2 < 5%) em meio MSC suplementado ou com FBS (DMEM com FBS 20% e penicilina/estreptomicina 1%) ou com lisato de plaqueta humano (DMEM com lisato de plaqueta humano 5% e penicilina/estreptomicina 1%). MSCs foram passadas quando confluência atingiu 60% e MSCs foram coletadas nas passagens 3-6. MSCs (20 x 106 ml) foram então tratadas com Fucosiltransferase VII (FTVII; preparada pela R&D Systems em suspensão sem cátions divalentes) a 20 ug/ml ou com Fucosiltransferase VI (60 mU/ml (R., Sackstein e outros, Nature Medicine 14:181-187 (2008)) em cada caso em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) sem cátions divalentes contendo HEPES 10 mM, albumina de soro humano 0,1% e GDP-fucose 1 mM (Sigma) por 60 min a 37°C, enquanto células controle (tratadas com tampão) foram tratadas no mesmo tampão sem FTVII ou sem FTVI. A viabilidade celular foi avaliada rotineiramente através de citometria de fluxo a laser dupla usando tingimento com iodeto de propídio e anexina V. A viabilidade celular foi consistentemente maior do que 80% em 24 horas seguindo a(1,3)-exofucosilação ou com FTVI ou FTVII. Vide Figuras 24-26.

EXEMPLO 2: TRATAMENTO COM ALFA(1,3)- FUCOSILTRANSFERASE DE LEUCÓCITOS DE SANGUE HUMANO INDUZ ATIVIDADE DE LIGANTE DE E-SELECTINA DE NÍVEL ALTO NAS CÉLULAS E REFORÇA EXPRESSÃO DE HCELL

[00194] A expressão reforçada de ligantes de E-selectina (isto é, HCELL e outros ligantes de E-selectina) sobre a superfície de células desejadas (por exemplo, células-tronco, células progenitoras, leucócitos, etc) conferiria capacidade aumentada dessas células em trafegar intravascularmente para sítios de inflamação/dano a tecido e para sítios de tumor/infiltrados de câncer com base na expressão de E- selectina vascular em células endoteliais dentro do(s) tecido(s) afetado(s). Ainda, uma vez extravasada, a expressão de HCELL (ou outros ligantes de E-selectina/L-selectina reforçados) sobre a superfície celular administrada relevante serviria para promover colonização das células administradas dentro do tecido alvo, uma vez que as células administradas se reuniriam dentro de áreas perivasculares através de aderência de ligante de E-selectina à E-selectina expressa nas células endoteliais e, ainda, células administradas também ancorariam através de aderência de ligação de L-selectina à L-selectina exibida sobre as superfícies de leucócitos infiltrantes dentro do ambiente de tecido inflamado/danificado ou de câncer. Desta maneira, reforço da expressão de HCEL e de outros ligantes de E-selectina e/ou ligantes de L-selectina sobre as células-tronco/células progenitoras e em subconjuntos de leucócito específicos (incluindo, por exemplo, células NK, células T CD4, células T CD8, Tregs, monócitos, células dendríticas e granulócitos, bem como leucócitos relevantes expandidas em cultura para propósitos terapêuticos (por exemplo, células T específicas de antígeno, células NK expandidas, células T de receptor de antígeno quimérico (células T CAR), etc)) poderia ser atrelado em agentes terapêuticos de célula adotiva (para regeneração/reparo de tecido e/ou para imunoterapia ou para aumento de imunidade ou para diminuir a imunidade). Desta maneira, criticamente, expressão reforçada de HCELL permitiria tráfego eficiente de células intravascularmente administradas para sítios alvo através de interações endoteliais de E- selectina fornecendo recrutamento de células de origem no sangue, logo depois seguido por alojamento mediado por E-selectina e mediado por L-selectina das células extravasadas com microambientes de tecido diferentes. Além disso, similarmente, se tais células foram injetadas diretamente no(s) sítio(s) afetado(s) de lesão/dano a tecido ou em sítios de câncer, expressão reforçada de HCELL e outros ligantes de E- selectina/L-selectina promoveria alojamento/colonização mediada por E-selectina e L-selectina das células dentro do ambiente de tecido.

[00195] Para analisar os alvos moleculares de a(1,3)-exofucosilação de superfície celular e os efeitos de exofucosilação sobre atividade de ligante de E-selectina e L-selectina de leucócito, foram realizados estudos em leucócitos de sangue periférico humano primário obtidos de sangue integral citrado. Os leucócitos foram separados através de classificação de conta imunomagnética (Miltenyi) em monócitos (células CD14+), linfócitos CD4+, linfócitos CD8+ e células B (células CD19+). As células foram tratadas com Fucosiltransferase VII (FTVII; preparada pela R&D Systems em suspensão sem cátions divalentes) a 20 ug/ml ou com Fucosiltransferase VI (a 60 mU/ml (R., Sackstein e outros, Nature Medicine 14:181-187 (2008)) em cada caso em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) sem cátions divalentes contendo HEPES 10 mM, albumina de soro humano 0,1% e GDP-fucose 1 mM (Sigma) por 60 min a 37°C, enquanto células controle (tratadas com tampão) foram tratadas no mesmo tampão sem FTVII ou sem FTVI. Viabilidade celular foi avaliada rotineiramente através de citometria de fluxo a laser dupla usando tingimento com iodeto de propídio e anexina V. A viabilidade celular era consistentemente maior do que 80% em 24 horas seguindo exofucosilação ou com FTVI ou FTVII. Vide Figuras 27(A)- 27(C) e Figuras 28(A)-28(C).

EXEMPLO 3: TRATAMENTO COM ALFA(1,3)- FUCOSILTRANSFERASE DE CULTURAS PRIMÁRIAS DE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS INDUZ NÍVEL ALTO DE ATIVIDADE DE LIGANTE DE E-SELECTINA NAS CÉLULAS E REFORÇA EXPRESSÃO DE HCELL

[00196] Para avaliar a capacidade de a(1,3)-exofucosilação para modular atividade de ligante de E-selectina e L-selectina de células dendríticas humanas, monócitos foram isolados de células mononucleares de sangue periférico humano usando contas magnéticas revestidas com anti-CD14 (Miltenyi Biotech) (CD14-S) ou através de aderência a plástico (PA-S), e então culturadas de acordo com protocolos padrão com citocinas IL-4 e GM-CSF por 6 dias para induzir diferenciação em células dendríticas derivadas de monócito (mo- DCs). A pureza do monócito foi avaliada através de citometria de fluxo para expressão de CD14, e diferenciação e maturação de mo-DCs foi avaliada através de tingimento quanto à expressão de BDCA-1, HLA- DR, CD80 e CD86 (cada um da BD Biosciences). mo-DCs foram então tratadas com Fucosiltransferase VII (FTVII; preparado através de R&D Systems em suspensão sem cátions divalentes) a 20 ug/ml ou com Fucosiltransferase VI (60 mU/ml (R. Sackstein e outros, Nature Medicine 14:181-187 (2008))) em cada caso em solução salina equilibrada com Hank (HBSS) sem cátions divalentes contendo HEPES 10 mM, albumina de soro bovino humano 0,1% e GDP-fucose 1 mM (Sigma) por 60 min a 37°C, enquanto células controle (tratadas com tampão) foram tratadas no mesmo tampão sem FTVII ou sem FTVI. A viabilidade celular foi avaliada rotineiramente através de citometria de fluxo a laser dupla usando tingimento com iodeto de propídio e anexina V. A viabilidade celular foi consistentemente maior do que 80% em 24 horas seguindo exofucosilação ou com FTVI ou FTVII. Vide Figuras 29(A)- 29(C) e Figuras 30(A)-30(E).

EXEMPLO 4: TRATAMENTO COM ALFA(1,3)FUCOSILTRANSFERASE DE CULTURAS PRIMÁRIAS DE CÉLULAS T REGULADORAS HUMANAS (TREGS) INDUZ ATIVIDADE DE LIGANTE DE E-SELECTINA DE NÍVEL ALTO NAS CÉLULAS E REFORÇA EXPRESSÃO DE HCELL; ADMINISTRAÇÃO DE HCELL + TREGS SUPRIME GVHD XENOGENEICA INDUZIDA POR CÉLULAS AUTÓLOGAS

[00197] A habilidade em aumentar a administração de células imunomoduladoras (tais como MSCs e Tregs) a sítios de inflamação serviria para aperfeiçoar o potencial de agentes terapêuticos de célula adotiva para diminuir dano a tecido em doenças imunológicas (por exemplo, GVHD, artrite reumatoide, etc) e em respostas inflamatórias exuberantes a infecções (por exemplo, sepse, hepatite viral fulminante, etc). Para esta finalidade, a requerente investigou os efeitos de a(1,3)- exofucosilação sobre a capacidade de Tregs humanas primárias intravascularmente administradas para tratar doença enxerto-versus- hospedeiro xenogeneica em um modelo GVHD humano-camundongo. A requerente procurou avaliar a capacidade de Tregs derivadas da fonte de linfócito autóloga que induziu GVHD, uma vez que esta estratégia seria relevante para transplante de células-tronco hematopoiéticas clínicas (isto é, Tregs seriam expandidas a partir de inóculo de célula hematopoiética/imune doadora e, então, Tregs doadoras seriam usadas para tratar GVHD induzida por células imunes doadoras). Para esta finalidade, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram obtidas de centrifugação de gradiente Ficoll de sangue integral de um doador humano saudável. Células T com nível alto de CD4/nível baixo de CD127 foram isoladas usando um sistema de imunoconta magnética de seleção negativa (Miltenyii) e expandidas em cultura na presença de mAb anti-CD3/anti-CD28 suplementado com IL-2 para produzir células CD4+/FoxP3+/CD25+ (Tregs). PBMCs não fracionadas do mesmo indivíduo doador foram injetadas IP (107células/camundongo) em camundongos hospedeiros NSG intraperitonealmente. Quatorze dias após injeção (desta maneira, no dia 14 de expressão de Treg) as células Treg expandidas foram coletadas e então tratadas com Fucosiltransferase VII (FTVII; preparadas pela R&D Systems em suspensão sem cátions divalentes) a 20 ug/ml ou com Fucosiltransferase VI (60 mU/ml (R., Sackstein e outros, Nature Medicine 14:181-187 (2008))) em cada caso em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) sem cátions divalentes contendo HEPES 10 mM, albumina de soro bovino humano 0,1% e GDP-fucose 1 mM (Sigma) por 60 min a 37°C, enquanto células controle (tratadas com tampão) foram tratadas no mesmo tampão sem FTVII ou sem FTVI (a viabilidade celular foi avaliada rotineiramente através de citometria de fluxo a laser dupla usando tingimento com iodeto de propídio e anexina V; a viabilidade celular era consistentemente maior do que 80% em 24 horas seguindo exofucosilação ou com FTVI ou FTVII). Os camundongos foram então injetados intravascularmente ou com Tregs tratadas com tampão (BT) ou com Tregs exofucosiladas em uma dose de 2,5 x 105células/camundongo. Os camundongos foram então acompanhados clinicamente e os pesos dos camundongos foram monitorados por 50 dias após injeção inicial de PMBC. Os dados como mostrado nas Figuras revelam que tratamento com FTVII em Tregs humanas induz expressão de ligantes de E-selectina, incluindo HCELL. Injeção de Tregs autologamente derivadas exofucosiladas em camundongos com GVHD xenogeneica (induzidas através de administração anterior de PBMCs autólogas) resulta em diminuição de GVHD, como evidenciado por reversão de perda de peso; Tregs exofucosiladas são 3 vezes mais potentes em reversão de GVHD do que são Tregs não fucosiladas. Vide Figuras 31-34.

EXEMPLO 5: TRATAMENTO COM ALFA(1,3)-FUCOSILTRANSFERASE DE MSC E DE LEUCÓCITOS DE SANGUE HUMANO INDUZ ATIVIDADE DE LIGANTE DE L-SELECTINA NAS CÉLULAS CONFORME AVALIADO ATRAVÉS DE ENSAIO DE ADERÊNCIA DE LINFÓCITO STAMPERWOODRUFF

[00198] O ensaio de aderência de linfócito Stamper Woodruff é a ferramenta convencional para avaliar atividade de ligante de L-selectina (R., Sackstein, Immunol. Rev. 230:140-163 (2009)). Este ensaio, que foi concebido em meados dos anos 70 para avaliar a base molecular de linfócito se ligando a vênulas endoteliais com nível alto de nó linfático, mede a capacidade de L-selectina - como nativamente expressa sobre a superfície de um linfócito vivo - para se ligar a seu ligante(s) cognato expresso sobre a superfície de uma célula relevante. O ensaio é realizado sob condições de cisalhamento giratório, desta maneira impondo uma restrição biofísica diferente sobre a interação de ligação: apenas os ligantes de L-selectina mais potentes (presentes na superfície de células ligadas a vidro) apoiarão a aderência de L- selectina exibida sobre a suspensão giratória de linfócitos. Na verdade, os únicos ligantes de L-selectina que são robustos o suficiente para apoiar ligação mediada por L-selectina de linfócitos neste ensaio são HCELL e os ligantes de L-selectina "endoteliais" exibidos em vênulas endoteliais com alto teor de nó linfático (coletivamente, esses ligantes de L-selectina são chamados "adressinas") (R., Sackstein, Immunol. Rev. 230: 140-163 (2009)).

[00199] Para avaliar a expressão de atividade de ligante de L- selectina através de a(1,3)-exofucosilação, o Stamper-Woodruff foi realizado em preparações de Cytospin de células nativas, células tratadas com tampão e células a(1,3)-exofucosiladas. Em suma, suspensões de linfócito preparadas a partir de sangue humano (107/ml de linfócitos em meio RPMI 1640) foram postas em lâminas de vidro contendo preparações de células relevantes postas nas lâminas através de citocentrifugação. As lâminas foram postas em uma plataforma giratória para incubação sob cisalhamento (80 rpm) a 4°C por 30 minutos. As lâminas foram então enxaguadas em PBS para remover linfócitos não aderentes, fixadas em glutaraldeído 3% e tingidas com verde de metila- tionina. As lâminas foram examinadas quanto à aderência de linfócito a células centrifugadas através de microscopia de luz. Atividade de ligante de L-selectina foi medida através de contagem do número de linfócitos aderentes a uma área confluente de células centrifugadas usando uma grade ocular sob 250x de ampliação. As células citocentrifugadas que têm linfócitos aderentes são classificadas, e a porcentagem de tais células dentro da área total de células citocentrifugadas é quantificada (como mostrado na Chave na Tabela 1). Tabela 1. Resultados de Ensaio Stamper-Woodruff (Atividade de ligação de L-selectina de células) ATIVIDADE DE LIGANTE DE L-SELECTINA

[00200] Como mostrado na Tabela 1, MSCs nativas não têm nenhuma atividade de ligação à L-selectina, mas a(1,3)-exofucosilação de MSCs induz atividade de ligação à L-selectina profunda, com ligação de linfócito mediada por L-selectina sendo observada em essencialmente todas as células exofucosiladas. Células T CD4 humanas, monócitos humanos e células dendríticas humanas cada um exibe atividade de ligação à L-selectina modesta, mas essas células apoiam aderência de linfócito mediada por L robusta seguindo a(1,3)- exofucosilação. Tregs, células B e células C8 humanas não possuem nativamente atividade ligante de L-selectina, mas cada tipo de célula pode ser induzido para se ligar à L-selectina através de a(1,3)- exofucosilação, com Tregs exofucosiladas mostrando aumentos notáveis em aderência à L-selectina. Desta maneira, ligação à L- selectina é aumentada em essencialmente todos os leucócitos humanos seguindo a(1,3)-exofucosilação e, em particular, atividade de ligante de L-selectina pode ser profundamente induzida em MSC, células T CD4, monócitos, células dendríticas e Tregs humanos através de a(1,3)- exofucosilação. Em cada caso, esta atividade de ligação à L-selectina é um reflexo de expressão de HCELL reforçada, e é comensurada com resultados de expressão de HCELL nessas células como exibido por dados de Western blot de tingimento para sLex/E-Ig como mostrado nas Figuras 25, 28(A)-28(C), 30(A)-30(E) e 33.

EXEMPLO 6: EXPRESSÃO DE HCELL EM MSC DE MURINO PERMITE PANCREATOTROPISMO E CONFERE REVERSÃO DURÁVEL DE DIABETES AUTOIMUNE EM CAMUNDONGOS NOD Introdução

[00201] Apesar dos avanços significantes na farmacoterapia de controle de glicemia, o diabetes tipo 1 (T1D) é ainda associado com morbidez e mortalidade significantes e continua a representar uma carga à saúde pública grande exigindo estratégias de tratamento inovadoras [1,2]. Terapia imunomoduladora à base de célula emergiu como uma abordagem promissora no tratamento de T1D [3]. Devido às suas propriedades imunomoduladoras, perfil de segurança, fácil aquisição e expansão ex vivo robusta, células-tronco mesenquimais (MSCs) se tornaram a terapia celular que mais rapidamente cresce para o tratamento de várias doenças imunomediadas refratárias incluindo T1D [4-7]. Em modelos pré-clínicos usando camundongos NOD, a requerente e outros relataram recentemente que MSCs sistemicamente administradas têm utilidade em diminuir o diabetes autoimune [8,13]. No entanto, os benefícios de terapia com MSC em reversão de hiperglicemia foram temporários, destacando uma necessidade urgente de desenvolver estratégias para aperfeiçoar a eficácia de terapia à base de MSC para T1D [6].

[00202] A eficácia de terapia celular imunomoduladora está intimamente relacionada à habilidade das células infundidas em trafegar para o tecido inflamado [14, 15]. Para alguns órgãos (por exemplo, o coração), injeção direta (local) de células no sítio afetado pode obter colonização necessária para benefício fisiológico [16]. No entanto, para o tratamento de T1D, a via de administração celular vascular é principal, uma vez que injeção direta de células no parênquima pancreático dispararia liberação de protease e outras enzimas que poderiam induzir inflamação pancreática ameaçadora à vida, profunda. A migração de células de origem no sangue para tecidos é iniciada através de interações adesivas de ligação/rolamento em endotélio de tecido alvo. Os mediadores mais potentes dessas interações de ligação são as selectinas, uma família de três lectinas dependentes de Ca++ (E-, P- e L-selectina, também conhecidas como CD62E, CD62P e CD62L, respectivamente) que se ligam a determinantes de glicano sialofucosilados expressos em seus respectivos ligantes [17]. Importante, dentro da microvasculatura em todos os sítios inflamatórios, a selectina endotelial, E-selectina, é induzivelmente expressa em resposta a citocinas inflamatórias tal como TNF-a [17,18]. E-selectina se liga a glicoproteínas de membrana e/ou glicolipídeos em células em circulação que exibem prototipicamente o tetrassacarídeo sialofucosilado conhecido como "Lewis X sialilado" (sLex). No entanto, MSCs não expressam ligantes de E-selectina nativamente [19]. Este déficit em tráfego limita o enxerto de MSCs em tecidos periféricos inflamados seguindo administração intravenosa [17, 20], limitando a utilidade de agentes terapêuticos à base de MSC. Desta maneira, a requerente procurou investigar se tráfego de MSC para pâncreas inflamado poderia ser aumentado através de modificação de glicano na superfície celular para reforçar expressão de ligante de E-selectina e se isso impactaria o(s) efeito(s) terapêutico(s) de MSC em diabetes autoimune de início novo em camundongos NOD. As constatações da requerente proveram novas compreensões da biologia de efeitos de MSC em diabetes, destacando um papel único e proeminente para expressão reforçada de ligante de E-selectina HCELL em aumento da capacidade de MSCs de murino em reverter hiperglicemia em camundongos NOD diabéticos.

MATERIAIS E MÉTODOS CAMUNDONGOS

[00203] Camundongos C57BL/6, B6. 129(Cg)-Cd44tm1Hbg/J (CD44-/- em base genética de CD57BL/6; inativado em CD44" ("CD44-KO")), camundongos BALB/c e NOD foram comprados da Jackson Laboratories e foram alojados e/ou criados em um ambiente livre de patógeno na Harvard Medical School Facilities for Animal Care and Housing. Os experimentos necessitando o uso de camundongos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee.

Cultura de MSC

[00204] MSCs da medula óssea foram derivadas como anteriormente descrito [9, 10]. Em suma, células da medula óssea isoladas de camundongos C57BL/6 (tipo selvagem) ou de CD44-KO foram semeadas em meio de cultura consistindo em Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco com soro bovino fetal 10% (Lonza), fator de crescimento de fibroblasto 10 ng/ml (PeproTech), penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 ug/ml (Gibco). MSCs em 4 a 6 passagens em cultura foram usadas para experimentos.

Caracterização e diferenciação de MSC

[00205] MSCs foram caracterizadas através de citometria de fluxo usando anticorpos anticamundongo (todos da eBioscience) direcionados a marcadores de superfície celular Sca1, CD44, CD73, CD45, CD29 e CD105, junto com controles de isotipo relevantes. Quimera de E-selectina de camundongo (CD62E)-Fc humano recombinante foi comprada da R&D Systems. MSCs foram testadas quanto à sua capacidade de diferenciação em várias linhagens mesodermais como anteriormente descrito [21, 22]. Em suma, diferenciação condrogênicas de MSCs foi induzida com ácido ascórbico (50 µg/ml) em TGFßl (1 ng/ml) em meio de cultura. Após 3 semanas de cultura, as placas foram lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% e tingidas com azul alciano 0,05% para visualização microscópica de luz de cartilagem. Diferenciação osteogênica foi induzida com ácido ascórbico (50 µg/ml), ß-glicerofosfato de sódio (10 mM) e dexametasona (10 nM) em meio de cultura. Duas semanas depois, as placas foram lavadas, fixadas com paraformaldeído 4% e tingidas com vermelho alizarina 2% para visualização de depósitos de cálcio característicos. Diferenciação adipogênica foi induzida pela adição de dexametasona (100 nm) e insulina (6 ng/ml) em meio F12 suplementado com soro bovino fetal 1%, glutamina 1%, penicilina-estreptomicina 1%. As células foram fixadas em paraformaldeído 4% e tingidas com solução de Oil Red 0,3% em Isopropanol 60% para avaliar vacúolos carregados com lipídeo.

Exofucosilação de MSC

[00206] MSCs em suspensão (10 x 106 por 200 ul de reação) foram tratadas por 90 min a 37°C com 60 um/mL de fucosiltransferase VI (FTVI) em tampão de reacao consistindo em Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) livre de Ca2+ - e Mg2+ contendo HEPES 20 mM, albumina de soro humano 0,1% e GDP-fucose 1 mM ("MSC modificada com FTVI") ou com tampão de reação sozinho (MSC não modificada). Seguindo tratamento, MSCs foram lavadas com HBSS contendo HSA 0,2% e HEPES 20 mM. Viabilidade celular foi avaliada através de exclusão com azul tripano e tingimento com iodeto de propídio (consistentemente >85% de viabilidade 24 horas pós-descolamento e tratamento). Modificação de FTVI foi avaliada através de citometria de fluxo. Enzima FTVI foi fornecida pelo Dr. Roland Wohlgemuth (Sigma Chemical Corporation).

Análise Western blot

[00207] Lisatos de MSC modificada com FTVI e não modificada foram preparados através de incubação com Nonidet P-40 2% (NP-40) em Tampão A (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, fluoreto de fenilmetilsulfonila 20 mg/mL, azida de sódio 0,02% e comprimido de coquetel inibidor de protease (Roche Molecular Biochemicals). Todos os Western blots de lisatos de célula inteira ou de proteina imunoprecipitada foram realizados sob condições de reação em géis SDS-PAGE 7,5% como anteriormente descrito [19]. A quantidade de lisato em cada faixa foi normalizada para número celular para cada Western blot realizado. Blots foram visualizados com quimioluminescência usando Lumi-Light Western blotting Substrate (Roche).

Estudos de citometria de fluxo e imunoprecipitação

[00208] Citometria de fluxo foi realizada como anteriormente descrito [19]. Para mais detalhes vide seção Métodos Suplementares.

ENSAIO DE ADESÃO DE CÂMARA DE FLUXO DE PLACA PARALELO

[00209] Um ensaio de adesão de fluxo dinâmico foi realizado usando uma câmara de fluxo de placa paralelo (profundidade do canal de 250 µm x 5,0 mm de largura do canal) para avaliar ligação de MSC mediada por E-selectina em células endoteliais de veia umbilical humana estimuladas (HUVEC) como anteriormente descrito [19]. Para mais detalhes vide seção Métodos Suplementares.

TRANSDUÇÃO DE MSCs COM VETOR VIRAL DE hGH

[00210] MSCs foram transduzidas com o lentivírus contendo construto de plasmídeo hGH como anteriormente descrito [21]. Níveis de hGH foram medidos através de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (Roche Diagnostics) em sobrenadantes de MSC e em soro de animais injetados.

Transdução de MSC com vetor viral de GFP

[00211] MSCs foram transduzidas com um plasmídeo de retrovírus contendo GFP (GFP-MSC) como anteriormente descrito [21]. MSC transduzida foi avaliada quanto à expressão perinuclear de GFP através de microscopia fluorescente. Em uma abordagem complementar para usar o GFP-MSCs para avaliar direcionamento, MSCs (não transduzidas com GFP) foram marcadas com o corante fluorescente CFSE.

Imunofluorescência

[00212] Pâncreas foram incrustrados em Tissue Tek OCT, congelados e seccionados em um criomicrotomo. Imagens de imunofluorescência foram adquiridas usando um microscópio de epifluorescência Nikon E-1000 (ampliação total X400). Para mais detalhes de tingimento específico vide a seção Métodos Suplementares.

Ensaio de proliferação de célula T CD3/CD28 com estimulação de mitógeno

[00213] O ensaio de proliferação de célula T usando estimulação anti-CD3 e anti-CD28 foi usado para avaliar efeitos de modificação de FTVI sobre a capacidade imunomoduladora de MSCs. Em suma, 1x105 esplenócitos de NOD foram estimulados com anti-CD3e e anti-CD28 de camundongo purificados (cada um em 1 µg por cavidade; eBioscience) por 72 horas em meio RPMI (Lonza), suplementado com soro bovino fetal 10% (Gemini Bio-Products), penicilina estreptomicina 1% (Lonza) e glutamina 1% (Lonza), na presença de uma concentração de titulação (5x102 - 5x104) de MSCs não modificadas e modificadas com FTVI irradiadas (3000 rad). Nas últimas 12 horas do período de incubação de 72 horas, as células foram pulsadas com 1 µCi de timidina tritiada e proliferação de linfócito (incorporação de 3H-timidina) foi medida através de contagem com cintilação. Os resultados são relatados como uma média de amostras em triplicata (cpm média ± SEM).

Reversão de estudos de hiperglicemia de início novo em camundongos NOD

[00214] MSCs não modificadas e modificadas com FTVI (0,5 x 106 células em 200 ul) foram injetadas intravenosamente através da veia da cauda sem anestesia em camundongos NOD fêmeas no segundo dia de hiperglicemia (>250 mg glicose/dL) e no dia 7 e dia 30 seguindo o início de hiperglicemia. Para avaliar o efeito de administração de MSC sobre hiperglicemia, sangue foi obtido através da veia da cauda e glicose medida como descrito anteriormente [9, 10].

Estatísticas

[00215] Dados de ensaios experimentais e experimentos imunoistológicos foram analisados usando test t de Student e testes Mann Whitney. Dados da sobrevivência foram avaliados usando análise Kaplan-Meyer. Para realizar a análise e gerar gráficos, software Prism foi usado (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). O valor P <0,05 foi considerado significante. Os dados representam média ± SEM.

MÉTODOS SUPLEMENTARES Estudos de citometria de fluxo e Imunoprecipitação

[00216] Citometria de fluxo foi realizada como anteriormente descrito19 usando mAb biotinilado HECA452 (antígeno de linfócito cutâneo anti-humano, que reconhece sLex; IgM de rato (BioLegend)) e mAb CD44 anticamundongo (KM114; IgG1 de rato), mAb CD44 anticamundongo purificado (IM7; IgG2b de rato) e estreptavidina marcada com ficoeritrina (PE) (todos obtidos da BD Pharmingen). Para Western blotting, lisatos de MSC foram incubados com anticorpos de imunoprecipitação anti-CD44 (KM114/IM7) ou com controles de isotipo apropriados e então coletados com Protein G-agarose (Invitrogen). Os imunoprecipitados foram lavados extensivamente usando Tampão A contendo NP-40 2%, SDS 1% e então submetidos à SDS-PAGE, transferido para membrana de difluoreto de polivinilideno e imunotingidos com anticorpos HECA452 ou CD44 anticamundongo (KM114/IM7), seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados a HRP apropriados para visualização através de quimioluminescência usando Lumi-Light Western blotting Substrate (Roche).

Ensaio de Adesão de Câmara de Fluxo de Placa Paralelo

[00217] HUVECs confluentes foram estimuladas por 6 horas com TNF-a (40 ng/ml) para suprarregular expressão de E-selectina. MSC do tipo selvagem (WT) e CD44KO foram coletadas com Tripsina 0,005%/EDTA e foram ou modificadas com FTVI ou tratadas com tampão sozinho (controle) por 90 minutos a 37°C. MSC foram então ressuspensas a 106células/ml em Solução Salina Equilibrada de Hank suplementada com cloreto de cálcio 1 mM, cloreto de magnésio 1 mM, HEPES 5 mM e BSA 1 mg/ml. MSC foram perfundidas na monocamada de HUVEC a 0,5 dynas/cm2 e então submetidas a níveis de estresse de cisalhamento de 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0 e 30,0 dynas/cm2 em intervalos de 3 minutos. MSC que interagiu com HUVEC (células que rolaram no campo de visão ou rolaram para o mesmo dentro de um prazo de 10 segundos) foram vistas no centro da câmara, mínimo de 6 campos de visão em cada nível de estresse de cisalhamento. Como controles para avaliar especificidade de ligação à E-selectina para HUVEC estimulada, MSC modificada com FTVI foram tratadas com sialidase de Vibrio cholerae (0,1 U/ml; Roche) para clivar ácido siálico terminal de sLex, e aderência foi também avaliada na presença de mAb de E-selectina anti- humano de função de bloqueio (10 ug/ml) (BD Pharmingen).

Imunofluorescência

[00218] Tecidos foram seccionados por criostato em 10 um de espessura e fixados em lâminas em acetona gelada por 5 min. Após secagem, as seções foram bloqueadas com BSA 1% e incubadas em anticorpo primário de um dia para o outro. As seções foram lavadas 3X em Solução Salina tamponada com Tris (TBS) e incubadas com anticorpo secundário por uma hora. Tingimento com E-selectina (CD62E) foi realizado usando CD62E anticamundongo de rato primário (R&D Systems, 1:100) e IgG antirrato de cabra conjugado a PE secundário (Southern Biotech, 1:500). mAb de rato de isotipo compatível foi usado como um controle de tingimento. Tingimento com CD31 foi realizado usando CD31 anticamundongo de rato (Biocare, 1:200) e IgG antirrato de cabra conjugado a PE secundário (Southern Biotech, 1:500). Avaliação de colocalização de CE31 e E-selectina foi realizada em seções sequenciais. Tingimento de insulina realizado usando anti- insulina de porquinho-da-índia purificada (Dako, 1:5) e IgG anti- porquinho-da-índia de burro conjugado a APC (H+L) (Jackson Immunoresearch, 1:200). mAb HECA452 (mAb IgM anti-CLA de rato (Biolegend, 1:200)) e IgM antirrato de camundongo conjugado a FITC (Biolegend, 1:500) foram usados para detectar MSC modificada com FTVI dentro de seções de tecido. As seções foram superpostas com meio de montagem sozinho ou, quando indicado, com meio de montagem contendo DAPI (Vector Labs), cobertas e então visualizadas através de microscopia de imunofluorescência.

RESULTADOS Análise de expressão e funcional de MSC modificada com FTVI

[00219] MSCs derivadas da medula óssea de camundongos C57BL/6, ("tipo selvagem"), uma cepa resistente a diabetes e de CD44- KO (CD44-/- em base de C57BL/6) mostraram padrão do tipo fibroblasto em fuso pequeno característico e puderam ser diferenciadas em tipos de célula mesodermal (Figura 7). Marcadores de superfície celular expressos em MSCs característicos de MSCs (Figura 1(A)). MSCs não expressaram nativamente ligantes de E-selectina, como mostrado pela ausência de reatividade com mAb HECA 452 (que reconhece determinantes de ligação à E-selectina sialofucosilados canônicos (tal como Lewis X sialilado (sLex)) e através da ausência de ligação à quimera de E-selectina-Ig (E-Ig) que serve como uma sonda para atividade de ligante de E-selectina (Figura 1(B)).

[00220] Um estudo anterior de MSCs humanas mostrou que glicoengenharia de superfície celular (isto é, Estereossubstituição Programada de Glicosiltransferase (GPS)) usando a a-(1,3)- fucosiltransferase VI (FTVI) induz aderência à E-selectina através da conversão de CD44 de membrana nativa na molecula conhecida como Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL), uma glicovariante de sialillactosaminila fucosilada de CD44 que se liga potencialmente à E-selectina [19]. Para determinar se exofucosilação de superfície celular poderia programar atividade ligante de E-selectina em MSCs de murino, as células foram tratadas com FTVI usando condições de reação que foram otimizadas para preservar viabilidade celular. Modificação com FTVI de MSCs induziu notadamente tingimento com mAb HECA452, bem como ligação com uma quimera de E-selectina-Ig de murino (Figura 1(B)). Notadamente, digestões com protease de MSCs antes da modificação com FTVI reduziu notadamente reatividade de mE-Ig, indicando que glicoproteínas, não glicolipídeos, eram carreadores predominantes de determinantes de ligação à E-selectina (Figura 1(B)). Seguindo exofucosilação de MSC de camundongo, Western blot de lisatos de célula inteira (Figura 1(C)) e de CD44 imunoprecipitado (Figura 1(D)) revelou que a glicoproteína de membrana principal decorada com as sialofucosilações reconhecidas por E-Ig e HECA-452 era a forma "padrão"(isto é, não contendo quaisquer éxons de variante de união) de CD44 (~100 kDa). Esses dados indicam que modificação com FTVI converte CD44 de superfície de MSC de murino em HCELL.

MSCs de camundongos modificadas com FTVI têm ligação aumentada a E-selectina sob condições de estresse de cisalhamento fisiológico

[00221] Para avaliar a capacidade de MSCs de camundongo modificadas com FTVI em se ligar à E-selectina sob condições de estresse de cisalhamento fisiológico, a requerente realizou ensaios de câmara de fluxo de placa paralelo de ambas as MSCs não modificadas e modificadas com FTVI. Para esta finalidade, monocamadas de HUVEC foram primeiros estimuladas com THF-a para suprarregular expressão de E-selectina. Como mostrado na Figura 2, modificação com FTVI permitiu adesão de MSC à HUVEC em níveis de estresse de cisalhamento de 0,5 dynas/cm2 a um máximo de 20 dynas/cm2. Em estudos de câmara de fluxo, aderência de MSC à HUVEC estimulada foi estritamente dependente de interações de receptor/ligante de E- selectina uma vez que incubação de HUVEC com mAb de E-selectina de bloqueio de função e tratamento com sialidase de MSCs (para eliminar exibição de sLex) cada um reduziu profundamente adesão de MSCs modificadas com FTVI para níveis similares àqueles de MSCs modificadas (Figura 2). Juntas, essas constatações indicam que modificação com FTVI em MSC de murino induz atividade de ligação à E-selectina potente, capaz de sustentar aderência à E-selectina em níveis de estresse de cisalhamento hemodinâmico bem além daqueles típicos de vênulas pós-capilar [17].

MSCs modificadas com FTVI sistemicamente administradas revertem potencialmente hipoglicemia de início novo em camundongos NOD

[00222] Para avaliar se modificação com FTVI afetou a capacidade de MSCs em modular diabetes em camundongos NOD, camundongos NOD diabéticos de início novo ou não receberam quaisquer células (controle não controlado) ou receberam 5 x 105 MSCs de C57BL/6 modificadas com FTVI ou 5 x 105não modificadas intravenosamente (através da veia da cauda) no dia 2 de hiperglicemia (glicose >250 mg/dL), seguido por injeções intravenosas nos dias 7 e 30 após início de hiperglicemia. Como mostrado na Figura 3(A), camundongos NOD não tratados mostraram um aumento rápido em seus níveis de glicose no sangue e, com exceção de um animal, morreram dentro de algumas semanas do início de hiperglicemia. Como comparado com a administração de MSCs não modificadas (Figura 3(B)), que resultou em uma reversão temporária de diabetes autoimunes (isto é, 3 de 9 camundongos eram normoglicêmicos em 3 semanas, 2 de 9 animais eram normoglicêmicos em 6 semanas e todos os animais eram hiperglicêmicos em 12 semanas), a infusão de MSCs modificadas com FTVI robustamente e duravelmente reverteu hiperglicemia (Figura 3(C)). Surpreendentemente, 7 de 8 camundongos eram normoglicêmicos por 3 semanas, 6 de 8 camundongos permaneceram normoglicêmicos por 6 semanas e 5 de 8 camundongos estavam livres de diabetes por até 12 semanas seguindo o tratamento inicial (Figura 3(C)). Embora a maioria dos camundongos no grupo de MSC não modificada e modificada com FTVI que tinha níveis de glicose no sangue acima de 600 mg/dl tenha sobrevivido até 90 dias, apenas um (de 7 camundongos) no grupo tratado (isto é, não recebendo quaisquer MSCs) sobreviveu 90 dias.

Expressão de E-selectina e localização de MSC no pâncreas de camundongos NOD

[00223] Para examinar o efeito de modificação de FTVI sobre tráfego de MSC para o pâncreas, a requerente primeiro avaliou a expressão de E-selectina dentro da microvasculatura do pâncreas de camundongos NOD de 14 semanas de vida usando microscopia de imunofluorescência. Microvasos ao redor das ilhotas são relatados ser o principal sítio de tráfego de célula inflamatória que resulta em insulite [23, 24]. Não há nenhuma expressão de E-selectina em pâncreas de camundongos diabéticos-resistentes (Figura 4(A)), enquanto microvasos ao redor das ilhotas dos pâncreas de camundongos NOD expressaram E-selectina (Figura 4(B)), que co-localizaram com tingimento com CD31 em seções sequencias (Figuras 4(C) e 4(D)). Infiltração de células T nas margens da ilhota de diabéticos foi confirmada através de tingimento com CD3 de pâncreas de NOD durante início diabético (Figura 4(E)). Para avaliar infiltração pancreática de MSCs modificadas com FTVI sistemicamente administradas em camundongos NOD, a requerente tingiu seções congeladas de pâncreas com anticorpo HECA452. Como mostrado nas Figuras 4(F) e 4(G), MSCs HECA452+ foram observadas na área ao redor da ilhota dentro da vizinhança de microvasculatura expressando E-selectina 1 dia após transplante, colonizando regiões perivasculares (expressando E- selectina) e áreas (expressando L-selectina) de infiltrados de célula T. Para avaliar o grau de direção de MSCs modificadas com FTVI e não modificadas após administração sistêmica, MSCs modificadas com FTVI e não modificadas transduzidas com GFP foram intravenosamente injetadas em camundongos NOD, e seus pâncreas, nós linfáticos pancreáticos e mesentéricos e baço foram coletados no dia 4 pós- injeção, seccionados e avaliados quanto à presença de MSCs através de microscopia por fluorescência. MSCs modificadas com FTVI mostraram uma infiltração 3 vezes maior de pâncreas comparado com MSCs não modificadas, enquanto nenhuma diferença em infiltrados pancreáticos de MSC modificada com FTVI e não modificada infundida foi vista em camundongos BALC/c diabetes-resistentes (Figura 4(H)). No entanto, nenhuma diferença foi notada no grau de direcionamento de MSCs modificadas com FTVI e não modificadas para tecidos linfoides de camundongos NOD tratados.

Exofucosilação não tem nenhum efeito sobre capacidade imunossupressora de MSC ou em sobrevivência in vivo

[00224] A requerente relatou anteriormente que medição de hormônio de crescimento humano (hGH) produzido por MSCs transduzidas com hGH é um método sensível para verificar a longevidade de MSCs administradas [21]. Para avaliar se reversão aumentada de hiperglicemia de MSCs modificadas com FTVI administradas era consequente para uma vantagem de sobrevivência, 5x105 de MSCs modificadas com FTVI e não modificadas transduzidas com hGH foram injetadas em camundongos NOD nos dias 2 e 7 seguindo início de hiperglicemia, e hGH no soro foi medida em vários pontos de tempo pós-injeção. Como mostrado na Figura 5(A), não havia nenhuma diferença no padrão de produção hGH, indicando que modificação de FTVI não afetou persistência de MSC in vivo. Para avaliar se exofucosilação modifica capacidades de imunomodulação de MSC, a requerente realizou cocultura de ensaios de supressão de célula T. Proliferação de célula T foi igualmente diminuída por MSCs modificadas com FTVI e não modificadas (Figura 5(B)), indicando que exofucosilação não prejudica propriedades de imunomodulação adicionais em MSCs.

Ausência de expressão de CD44 de MSC anula o efeito antidiabético de MSC modificada com FTVI

[00225] Para examinar se expressão de CD44 é requisitada para a potência antidiabética aumentada de MSCs modificadas com FTVI, a requerente gerou MSCs a partir de camundongos CD44 KO (CD44-/- em base genética de C57BL/6). Com exceção de CD44, MSCs geradas da medula óssea de camundongos CD44 KO mostraram níveis idênticos de moléculas de adesão de superfície celular. Através de citometria de fluxo, MSCs CD44 KO exofucosiladas mostraram reatividade a HECA452 equivalente àquela de MSCs do tipo selvagem exofucosiladas (Figura 8), indicando que determinantes sialofucosilados foram criados em bases alternativas (isto é, não CD44). Para avaliar se administração de MSCs CD44 KO conferiu atividade antidiabética, 5x105células de cada MSCs CD44 KO e C57BL/6 do tipo selvagem modificadas com FTVI e não modificadas foram injetadas em camundongos NOD diabéticos de início novo nos dias 2, 7 e 30 após início da hiperglicemia. Comparado com MSCs do tipo selvagem, deficiência de CD44 de MSCs resultou em um prejuízo significante no efeito antidiabético, conforme demonstrado por falha em reversão de diabetes autoimune em 5 de 6 camundongos recebendo MSCs CD44 KO não modificadas, e em 6 de 7 recebendo MSCs CD44 KO modificada com FTVI (Figuras 6(A) e 6(B), respectivamente). Seguindo injeção em camundongos NOD, MSCs CDFF KO modificadas com FTVI e não modificadas marcadas com CFSE não mostraram nenhuma diferença no tráfego para o pâncreas (Figura 6(C)), com níveis similares àqueles observados para MSCs do tipo selvagem (Figura 4(H)). Capacidade supressiva de MSC in vitronão foi anulada pela falta de expressão de CD44 de MSC nem pela exofucosilação de MSCs CD44 KO (Figura 6(D)), sugerindo que a ausência de efeito(s) euglicêmico(s) de MSCs CD44-/- tratadas com FTVI não é atribuível a déficits inerentes em imunorregulação. Notadamente, a constatação que exofucosilação torna a expressão de sialofucosilações de superfície celular reconhecível por HECA452 em MSCs CD44 KO, ainda que tais células não obtenham os resultados biológicos pretendidos em camundongos NOD diabéticos, destaca claramente a importância de estudos bioquímicos (por exemplo, análise Western blot) - além de apenas estudos de citometria de fluxo para avaliar imunorreatividade a E-Ig e HECA452 - na definição/previsão do impacto biológico de ligação à selectina reforçada produzido por engenharia de glicano de superfície celular.

DISCUSSÃO

[00226] Devido às suas propriedades imunomoduladoras, perfil de segurança e expansão robusta in vivo, MSCs se tornaram o foco de vários testes humanos para tratar várias doenças imunomediada refratarias incluindo T1D [6]. MSCs foram verificadas suprimir insulite e diabetes autoimunes através de efeitos imunomoduladores multifacetados sobre componentes patogênicos críticos para elaboração de T1D [25, 26]. Esses efeitos incluem a capacidade em modular a expressão de citocinas inflamatórias vs. reguladoras desta maneira promovendo expansão de células DC e T reguladoras e expressão de MSC de moléculas coestimuladoras negativas (por exemplo, PDL-1) que pode inibir diretamente células T autorreativas [810, 13]. Desta maneira, terapia com MSC tem grande potencial para ser uma estratégia excitante e única para tratamento de T1D. Não obstante, há uma necessidade urgente de estudos para aperfeiçoar a eficácia de terapia baseada em MSC em T1D [6].

[00227] Em estudos anteriores, a requerente observou que administração intravenosa de MSCs integralmente alogeneicas estava associada com uma reversão transiente de hiperglicemia em camundongos NOD diabéticos [9]. A requerente tomou como hipótese que um obstáculo próximo na realização de um efeito antidiabético mais robusto seria a relativa insuficiência de direcionamento de MSC a pâncreas inflamado. Aqui, a requerente procura avaliar se administração sistêmica de MSCs com capacidade de direcionamento aumentada através de expressão de HCELL reforçada influenciaria a reversão de diabetes no modelo NOD. Para esta finalidade, a requerente utilizou a linhagem C57BL/6 como a fonte alogeneica de MSCs uma vez que o fenótipo CD44 KO estava disponível nesta base genética. A requerente focou em controle metabólico como o ponto final principal para avaliação da eficácia de terapia com MSC, uma vez que ela tinha anteriormente examinado os mecanismos imunes mediando efeitos antidiabéticos de MSC [9, 10].

[00228] Em contraste com outros estudos que avaliam caracteristicamente os efeitos de intervenções antidiabéticas por períodos de tempo relativamente curtos (tipicamente <30 dias), neste estudo os efeitos de MSC sobre reversão de diabetes autoimune foram avaliados durante um período de observação prolongado (90 dias). Os dados da requerente indicam aqui que conversão de CD44 de membrana nativa em HCELL pela a-(1,3)-exofucosilação da superfície celular ("modificação com FTVI) confere ligação de MSC de camundongo de alta eficiência à E-selectina. A requerente observou expressão de E-selectina na área próximo à ilhota de pâncreas de camundongos NOD com insulite, mas não em pâncreas de camundongos diabéticos-resistentes. Consistente com essas constatações, a requerente não observou diferenças no nível de direcionamento de MSCs modificadas com FTVI e não modificadas de C57BL/6 alogeneicas injetadas para o pâncreas de camundongos diabéticos-resistentes (hospedeiros BALB/c), mas, comparado com MSCs não modificadas, houve infiltração pancreática aumentada de MSCs modificadas com FTVI de C57BL/6 (alogeneicas) sistemicamente administradas em camundongos NOD diabéticos, com reversão durável concomitante de diabetes. Notadamente, a requerente não observou diferenças em infiltração de tecidos linfoides entre animais recebendo MSCs modificadas com FTVI e não modificadas, mas houve um aumento notavel em alojamento/enxerto de células dentro das regiões perivasculares de microvasos expressando E-selectina e dentro de grupos de leucócitos. Coletivamente, esses dados chamam atenção para um papel primário de colonização pancreática de MSC em supressão de diabetes autoimune, mas não excluem a contribuição potencial de efeitos extrapancreáticos de MSCs.

[00229] Comparado com os efeitos antidiabéticos observados usando MSCs não modificadas integralmente alogeneicas intravenosamente administradas neste estudo e em estudos anteriores [9], o aperfeiçoamento notável em reversão de T1D usando MSCs modificadas com FTVI (HCELL) integralmente alogeneicas observado aqui não parece ser atribuível a uma capacidade imunossupressora aumentada da MSC glicoengenheirada sozinha ou à vantagem de sobrevivência in vivo dotada por glicoengenharia de MSCs. Em um estudo anterior, a requerente observou efeitos antidiabéticos aperfeiçoados em camundongos NOD seguindo administração intravenosa de MSCs semialogeneicas obtidas de camundongos NOR [10], provavelmente um reflexo de rejeição menor das MSCs semialogeneicas fornecendo colonização/persistência de tecido in vivo de células. No entanto, em aplicações clínicas, seria vantajoso empregar estratégias para aumentar a potência de MSCs de fonte integralmente alogeneica, especialmente uma vez que questões de fabricação e reguladoras apoiam o uso de produtos de MSC alogeneica "fora da prateleira" (isto é, expandidas em cultura, agrupadas). A constatação que MSCs CD44 KO exofucosiladas não têm a capacidade de induzir reversão durável de hiperglicemia, apesar da criação evidente de determinantes sialofucosilados na superfície dependentes de FTVI detectáveis através de reatividade de HEC452, indica que determinantes de ligação à E-selectina exibidos expressamente na base de CD44 (isto é, elaboração de HCELL) são requeridos para obter efeitos antidiabéticos potentes. Isto pode estar relacionado a um papel-chave para expressão de HCELL para obter direcionamento e extravasamento de tecido com necessidade [27] e/ou poderia refletir uma necessidade de expressão de HCELL/CD44 para obter alojamento apropriado em sítios microambientais relevantes [28]. Um papel para alojamento de tecido in situ para obter efeito(s) de MSC foi destacado por estudos de cotransplante de MSC com aloenxertos de ilhota gerando zonas imunoprivilegiadas [29-31]. Com relação a isso, a localização observada de MSCs HCEL+ dentro de áreas perivasculares da ilhota e dentro de infiltrados de leucócito de ilhota destaca um papel operatório para HCELL em permissão de imunomodulação: uma vez que E-selectina é expressa dentro de leitos endoteliais do tecido afetado e leucócitos expressam caracteristicamente L-selectina, expressão de HCELL, um ligante de E-selectina e L-selectina potente, serve para promover alojamento de tecido expressamente dentro dos microambientes de imunorreatividade mais intensa. Embora estudos adicionais dos efeitos imunomoduladores de MSC in vivo sejam garantidos, os dados aqui destacam o potencial de pancreatotropismo aumentado através de administração sistêmica de MSCs+ HCELL na terapia de T1D. Mais amplamente, o fato de que E-selectina é suprarregulada por citocinas tais como TNF e IL-2 dentro de leitos endoteliais em todos os sítios inflamatórios [17, 18] oferece a oportunidade de explorar expressão de HCELL MSC reforçada para aperfeiçoar a eficácia de terapia à base de MSC para uma variedade grande de condições inflamatórias.

REFERÊNCIAS - EXEMPLO 6

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EXEMPLO 7 - ENGENHARIA DE GLICANO DE SUPERFÍCIE CELULAR DE CÉLULAS-TRONCO NEURAIS AUMENTA NEUROTROPISMO E APERFEIÇOA RECUPERAÇÃO EM UM MODELO DE MURINO DE ESCLEROSE MÚLTIPLA INTRODUÇÃO

[00261] A natureza desenvolveu um mecanismo extremamente eficiente para administrar células em circulação a sítios de inflamação e lesão. Este processo é controlado por uma cascata altamente ordenada de interações moleculares (Butcher, E.C. 1991; Sackstein, R., 2005; Springer, T.A. 1994). O primeiro evento essencial em recrutamento celular envolve adesão resistente a cisalhamento de células de fluxo na superfície endotelial, um processo mais eficientemente mediado por selectinas, uma família de três lectinas dependentes de Ca2+ (compreendidas de E-, P- e L-selectina), se ligando a seus respectivos contrarreceptores. Essas interações inicialmente ligam a célula à parede do vaso e, no contexto de fluxo de cisalhamento vascular, fazem com que a célula role ao longo da superfície endotelial em velocidades abaixo daquelas da corrente hemodinâmica prevalente (Etapa 1). Este processo facilita o comprometimento de receptores de quimiocina de origem celular específicos com quimiocinas pertinentes presentes nas áreas perivasculares, desta maneira disparando eventos de transdução de sinal de dentro-para-fora levando à adesividade aumentada de membros da família integrina (Etapa 2). Interações adesivas entre as integrinas de célula ativadas e seus contrarreceptores de célula endotelial cognatos então levam à parada de rolamento e adesão firme da célula à parede celular (Etapa 3) e, por fim, migração transendotelial (extravasamento, Etapa 4).

[00262] Em esclerose múltipla (MS), e em seu modelo animal, encefalomielite autoimune experimental (EAE), recrutamento de efetores imunológicos é mediado pela suprarregulagem das selectinas vasculares, E- e P-selectina. E- e P-selectina são expressas no endotélio cerebral após ativação in vivo com LPS ou TNF-a, no entanto, em EAE de murino, P-selectina é expressa apenas transientemente (Piccio, L., Rossi, B. e outros, 2002). Notadamente, E-selectina é expressa em todo o período inflamatório com uma distribuição desigual em sítios onde os recipientes ramificam, sugerindo a existência de áreas de recrutamento preferidas (Piccio, L., Rossi, B. e outros, 2002). E- selectina é também caracteristicamente encontrada em recipientes de placas agudas em pacientes MS (Lee, S. J. e Benveniste, E. N. 1999; Washington, R., Burton, J. e outros, 1994). Essas constatações sugerem que E-selectina desempenha um papel dominante no recrutamento de células em circulação para o cérebro em doenças inflamatórias.

[00263] Todas as três selectinas se ligam a determinantes de carboidrato especializados, compreendidos de sialofucosilações contendo uma substituição de ácido siálico ligado a a(2,3) em galactose e uma modificação de fucose ligada a a(1,3) em N-acetilglicosamina, prototipicamente exibidos como o tetrassacarídeo terminal sialila Lewis X (sLex) (Polley, M.J., Phillips, M.L., e outros 1991; Sackstein, R. 2005). Esta estrutura, também conhecida como "CD15s", pode ser exibida ou sobre uma base de proteína (isto é, uma glicoproteína) ou uma base de lipídeo (isto é, um glicolipídeo), e é reconhecida por mAb tal como SCLEX-1 e HECA-452 (Alon, R., Feizi, T. e outros, 1995; Dimitroff, C.J., Lee, J.Y. e outros, 2001; Fuhlbrigge, R.C., Kieffer, J.D. e outros, 1997; Gadhoum, S.Z. e Sackstein, R. 2008; Merzaban, J.S., Burdick, M.M. e outros, 2011). Embora modificações estruturais adicionais envolvendo principalmente sulfação aumentem afinidade de ligação de P- e L- selectina a sLex, nenhuma de tais modificações é necessária para ligação ótima de E-selectina (Leppanen, A., White, S.P. e outros, 2000; Rosen, S.D. 2004).

[00264] Terapia baseada em célula-tronco neural (NSC) gerou muita esperança para parada e/ou reversão de progressão de doença em doenças inflamatórias e/ou degenerativas do SNC (Ben-Hur, T., Einstein, O. e outros, 2003; Einstein, O., Fainstein, N. e outros, 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N. e outros, 2006; Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004; Lee, S T., Chu, K. e outros, 2008; Pluchino, S., Quattrini, A. e outros, 2003; Pluchino, S., Zanotti, L. e outros, 2005; Ziv, Y., Avidan, H. e outros, 2006). É bem conhecido que NSCs expressam efetores de Etapa 2 e Etapa 3/4, tal como CXCR4 (Bezzi, P., Domercq, M. e outros, 2001; Flax, J.D., Aurora, S. e outros, 1998; Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004) e VLA-4 (Pluchino, S., Zanotti, L. e outros, 2005; Rampon, C, Weiss, N. e outros, 2008), respectivamente, mas não há quaisquer dados se NSCs expressam nativamente efetores de Etapa 1. Desta maneira, a requerente examinou a expressão de efetores da Etapa 1 em NSCs de camundongo e constatou que essas células são proeminentemente destituídas de efetores de Etapa 1, em particular ligantes de E-selectina. Usando o modelo EAE, a requerente analisou se atividade de ligante de E-selectina reforçada através de engenharia de glicano de superfície celular impactaria na migração de NSCs administradas e, mais importantemente, o(s) efeito(s) terapêutico(s) de células administradas. Para esta finalidade, a requerente utilizou uma tecnologia chamada substituição programada de glicosiltransferase (GPS) para criar determinantes de glicano de ligação à selectina relevantes na superfície celular (Sackstein, R., Merzaban, J. S. e outros, 2008). A requerente relata aqui que GPS reforça expressão de ligantes de E-selectina em NSCs através da modificação de glicanos de duas glicoproteínas de membrana de célula-tronco neural, CD44 e NCAM, criando os ligantes de E-selectina HCELL (Ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética) e NCAM-E, respectivamente. Glicoengenharia de atividade de ligante de E-selectina de NSC resultou em neurotropismo aumentado e forneceu resultado clínico aperfeiçoado em EAE na ausência de enxerto detectavel a longo prazo, indicando que essas células-tronco específicas de tecido produziram um efeito restaurador, não um efeito regenerativo direto. Importante, este efeito neurorrestaurador não é uma propriedade universal de células-tronco adultas, uma vez que administração de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas de camundongos (HSPC) engenheiradas por GPS não aperfeiçoaram o curso clínico de EAE. Essas constatações têm implicações clínicas profundas na provisão da primeira evidência direta que glicoengenharia de superfície celular para criar efetores de migração celular pode aperfeiçoar a eficácia de agentes terapêuticos à base de célula-tronco, e também provê novas perspectivas sobre o uso de NSCs no tratamento de doenças neuroinflamatórias.

RESULTADOS Expressão de efetores moleculares de migração celular em células-tronco neurais

[00265] Para analisar a expressão de efetores moleculares de Etapa 1, Etapa 2 e Etapas 3/4 de migração celular, citometria de fluxo foi realizada em culturas primárias de NSCs de camundongo. NSCs foram destituídas de reatividade com quimera de E-selectina-Ig (E-Ig) e quimera de P-selectina-Ig (P-Ig), indicando ausência de ligantes de E- e P-selectina (Figura 9(A)) mesmo na presença de mediadores inflamatórios (Figura 15); elas também não tingiram com mAb CSLEX1, KM93 ou HECA452 (cada uma identifica sLex). NSCs expressavam CD44 e as integrinas VLA-4 (CD49d/CD29) e VLA-5 (CD49e/CD29), bem como o receptor de quimiocina CXCR4; este padrão de expressão de marcador de NSC foi observado por outros (Back, S.A., Tuohy, T.M. e outros, 2005; Campos, L.S., Decker, L. e outros, 2006; Campos, L.S., Leone, D.P. e outros, 2004; Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004; Ji, J.F. He, B.P. e outros, 2004; Leone, D.P., Relvas, J.B. e outros, 2005; Pluchino, S., Quattrini, A. e outros, 2003; Pluchino, S., Zanotti, L. e outros, 2005) (Figure 9(B)). As NSCs também expressaram caracteristicamente Molécula de Adesão de Célula Neural (NCAM) em adição ao ácido polissiálico (PSA) bem descrito (Vitry, S., Avellana- Adalid, V. e outros, 2001) (Figura 9(B)). NSCs não expressaram PSGL- 1, CD43, LFA-1 (sem ambas as cadeias CD11 a (a1) e CD18 (ß2)) e LPAM-1 (a4ß7) (Figura 9(B)). Esses resultados indicam que NSCs são deficientes em expressão de efetores de Etapa 1 da cascata múltipla de transmigração celular, ainda que expressem receptores de quimiocina e efetores de integrina relevantes que fazem a mediação de Etapas 2-4 em extravasamento e que estão também envolvidos em sua mobilização no cérebro em desenvolvimento através de migração radial (Imitota, J., Comabella, M. e outros, 2004).

GPS reforça atividade de ligante de E-selectina em células-tronco neuronais

[00266] CD44, uma molécula envolvida em migração de NSCs (Deboux, C., Ladraa, S. e outros, 2013) e células-tronco de câncer cerebral (Fu, J., Yang, Q.Y. e outros, 2013), é fortemente expressa dentre NSCs em cultura (Figura 9(B)). No entanto, a constatação que NSC não exibe ligação à E-selectina (Figura 9(A)) indica que essas células não expressam nativamente a glicoforma de ligação à E- selectina de CD44 conhecida como HCELL (Dimitroff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2000; Dimitroff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2001; Sackstein, R., 2004). A requerente procurou então determinar se uma manipulação não genética usando estereossubstituição programada por glicosiltransferase (GPS) de glicanos CD44 reforçaria expressão de HCELL (Sackstein, R., Marzaban, J. S. e outros, 2008). Para esta finalidade, a requerente tratou NSCs com a fucosila transferase específica de ligação a(1,3), fucosiltransferase VI (FTVI). Esta enzima localiza especificamente uma fucose em uma unidade 2-lactosamina do tipo terminal; se esta lactostamina for capeada com um ácido siálico ligado a a(2,3), sLexé criado. Seguindo tratamento com FTVI em NSCs (GPS-NSC), reatividade com mAbs CSLEX1, KM93 e HECA452 foi induzida, consistente com expressão forte de epítopos sLex (Figura 10(A)), com ligação à E-Ig associada (Figura 10(A)), mas sem indução de ligação à P-Ig (Figura 10(A)). Notadamente, expressão de CD15 (também conhecida como SSEA-1 ou Lex) é alta em NSCs (Figura 10(A)), e embora FTVI possa fucosilar lactosaminas terminais não sialiladas desta maneira fornecendo CD15 (SSEA-1), a expressão de CD15 não foi mudada seguindo fucosilação reforçada (Figura 10(A)). Juntos, esses dados indicam que a(1,3)-exofucosilação apenas ocorreu em lactosaminil glicanos sialilados. Digestão com bromelina de NSCs antes de tratamento com GPS reduziu notadamente reatividade de HECA452 (Figura 10(B)), demonstrando que glicoproteínas, não glicolipídeos, foram os carreadores predominantes de determinantes sialofucosilados. Tratamento de GPS-NSCs com fosfatidilinositol fosfolipase C (PI-PLC) resultou em uma diminuição modesta, mas significante, no sinal de HECA452 através de FACS (Figura 10(C)), indicando que uma população pequena de glicoproteínas decoradas com sLex é ligada à glicofosfatidila (GPI).

[00267] Western blot de lisatos de célula e CD44 imunoprecipitado GPS-NSCs revelou que uma das glicoproteínas decoradas com as sialofucosilações essenciais reconhecidas por HECA452 era a forma padrão, não unida, de CD44 (~100 kDa; Figura 11(A) e CD44 também reagiu com E-Ig (Figura 11(A)). No entanto, seguindo imunoprecipitação exaustiva de CD44, outro(s) ligante(s) de E-selectina de glicoproteína candidato(s) foram identificados através de evidência de reatividade com E-Ig e HECA452 na fração de sobrenadante residual. Duas faixas eram aparentes em ~120 e ~140 kDa. Com base no perfil de peso molecular dessas faixas (Figura 11(A)) e na sensibilidade de PI-PLC parcial de ligação à E-selectina (Figura 10(C)), uma característica da forma de 120 kDa de NCAM (Gascon, E., Vutskits, L. e outros, 2007; Maness, P.F. e Schachner, M., 2007; Rutishauer, U., 2008), a requerente especulou que NCAM poderia servir como um ligante de E- selectina adicional. A requerente então realizou imunoprecipitação com um mAb pan-NCAM e observou que as faixas residuais persistindo após imunoprecipitação exaustiva de CD44 eram na verdade aquelas de NCAM (Figura 11(B)). Para determinar se sialofucosilações relevantes em NCAM eram exibidas em N-glicanos, a requerente testou a reatividade de E-Ig em Western blot de lisatos de GPS-NSC seguindo digestão com N-glicosidase F (Figura 11(A)); nenhum tingimento evidente com E-Ig seguindo digestão foi observado, indicando que os determinantes de ligação à E-selectina relevantes são exibidos em N- glicanos. A contribuição da forma ancorada a GPI de NCAM-E para expressão de sLex total após fucosilação reforçada de NSC é modesta, como mostrado por uma pequena diminuição em sinal de HECA452 (e sinal de E-Ig - dados não mostrados) seguindo tratamento com PI-PLC (Figura 10(C)). Desta maneira, fucosilação de a(1,3) reforçada de NSCs de murino criou HCELL bem como uma forma reativa de ligante de E- selectina única da molécula precursora NCAM, que foi chamada "NCAM-E"). Interessantemente, NSCs humanas (CC-2599) expressam apenas HCELL e não NCAM-E seguindo tratamento com GPS (Figuras 16(A)-16(C)).

[00268] Para avaliar a estabilidade de atividade de ligante de E- selectina engenheirado através de GPS em NSCs, a requerente mediu a reatividade de E-Ig através de citometria de fluxo em intervalos de 24 horas seguindo exofucosilação reforçada. A atividade de ligante de E- selectina era estável por até 24 horas, subsequentemente declinando para níveis não detectáveis em 72 horas, presumivelmente devido ao turnover (equilíbrio) proteico (Figura 11(C)). Viabilidade do NSC (Figura 17) não foi afetada pela exofucosilação reforçada e não houve quaisquer diferenças no número ou proliferação de neuroesferas em ensaios clonogênicos ou em diferenciação de NSCs (Figuras 18(A)- 18(D)). Desta maneira, não havia quaisquer diferenças fenotípicas evidentes induzidas por tratamento com GPS de NSCs, exceto pela criação de ligantes de E-selectina.

[00269] NSCs foram mostradas inibir a proliferação de células T in vitro (Einstein, O., Fainstein, N. e outros, 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N. e outros, 2006; Martino, G. e Pluchino, S., 2006) e, em particular, para parar as respostas mitogênicas de células T in vitro. Para avaliar se esta função imunorreguladora de NSCs é afetada por atividade de ligante de E-selectina reforçada, a requerente examinou a habilidade de GPS-NSCs e NSCs tratadas com tampão controle (BT-NSCs) em suprimir a proliferação de células de nó linfático em resposta à ativação de Con A. Como exibido nas Figuras 19(A)-19(C), ambas as NSCs GPS- e BT- foram capazes de diminuir proliferação celular, bem como suprimir o nível de produção de citocina inflamatória igualmente, sugerindo que não há nenhuma vantagem ou desvantagem imunomoduladora provida pelo tratamento com GPS em si sobre NSCs. Interessantemente, a requerente também observou liberação igual de fator inibidor de leucemia (LIF) a partir de NSCs quando do tratamento com citocina inflamatória para ambas as BT- e GPS-NSCs que foi aumentada quando da ligação de células tratadas com GPS à E-Ig (Figura 19C(C)). Desta maneira, exofucosilação reforçada de NSCs induziu atividade de ligante de E-selectina transiente sem efeitos indesejados sobre fenótipo ou função de NSC conforme determinado através de estudos in vitro.

GPS-NSCs exibe interações de rolamento fisiológico robustas com E-selectina

[00270] Para analisar a potência de atividade de ligante de E- selectina de GPS-NSCs sob condições de fluxo de sangue fisiológicas, estudos de câmara de fluxo de placa paralelo foram realizados usando células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) estimuladas por citocinas (IL-1ß e TNF-a) para expressar E-selectina. Como mostrado na Figura 12(A), GPS-NSCs exibiram atividade de ligante de E-selectina proeminente que foi completamente anulada na presença de EDTA ou através do uso de um mAb anti-E-selectina de bloqueio. Interações de rolamento resistentes a cisalhamento significantes foram observadas dentro de níveis de cisalhamento venular pós-capilar comuns (1-4 dynas/cm2) e persistiram acima de 20 dynas/cm2 (Figura 12(A)). Para analisar quais dos ligantes de E-selectina engenheirados com glicano, CHELL ou NCAM-E, é o ligante de E-selectina mais potente em NSCs, a requerente usou o ensaio de blot-rolamento. (Fuhlbrigge, R. C., King, S. L. e outros, 2002). Esta técnica permite a detecção de interações de ligante de selectina dependentes de cisalhamento em proteínas de membrana separadas através de SDS-PAGE, desta maneira permitindo a avaliação da contribuição individual de HCELL e NCAM-E para a atividade de ligante de E-selectina de GPS-NSC. Desta maneira, para avaliar as respectivas propriedades de ligação de E-selectina, células CHO transfectadas com E-selectina (CHO-E) foram perfundidas em blots imunotingidos com HECA-452 de lisatos de GPS-NSC. Como ilustrado na Figura 12(B), mais células CHO-E interagiram e aderiram a HCELL comprado ou com as formas de 120 kD ou 140 kD de NCAM-E. Células CHO-E suspensas em meio de fluxo contendo EDTA 5 mM tinham adesão insignificante a quaisquer regiões do blot, confirmando ligação dependente de Ca2+ consistente com atividade de ligante de selectina.

GPS-NSCs exibe direcionamento e infiltração em tecido aumentados in vivo em EAE

[00271] Para avaliar se NSCs injetadas infiltraram no parênquima do SNC, a requerente realizou estudos de microscopia confocal. Para esta finalidade, GPS-NSCs e BT-NSCs foram marcadas com corante PKH26 e foram injetadas intravenosamente em camundongos EAE crônicos induzidos com MOG em duas injeções i.v. separadas: antes do início da doença (dia 9 pós-imunização (PI)) e no início da doença (dia 13 PI). Esses dias foram escolhidos com base em estudos anteriores de expressão de E-selectina em endotélio cerebral em EAE (Piccio, L., Rossi, B. e outros, 2002). Cordões espinhais lombar-sacral e cérebros foram coletados 4 dias (dia 17 PI) após a segunda injeção de NSC. Análise confocal do cérebro demonstrou ambas quantidades maiores de GPS-NSCs (Figura 13(A)) e localização fora de vasos Flk-1+ no cérebro (Figuras 20(A)-20(B)). Ainda, análise paralela do cordão espinhal (Figuras 13(B)-13(D)), onde a maior parte da patologia ocorre em EAE, demonstrou números duas vezes maiores de infiltrados de GPS-NSCs extravasculares em relação a infiltrados de BT-NSCs por volta do dia 17 PI (Figura 13(D)). Esses dados indicam que GPS-NSCs infiltram no parênquima do SNC significantemente mais efetivamente do que BT-NSCs em ambos o cérebro e o cordão espinhal. Para confirmar mais os dados confocais, a requerente estudou o efeito de atividade de ligante de E-selectina engenheirado por GPS sobre direcionamento a curto prazo de NSCs in vivo. NSCs foram tingidas usando um corante de rastreamento fluorcromo, CFSA-SE (succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína) e adotivamente transferidas para camundongos C57BL/6 no dia 9 e no dia 31 PI com MOG como descrito em Materiais e Métodos. Dentro de 16 horas após a segunda injeção, a requerente observou que GPS-NSCs acumulou no cérebro, baço e fígado três a cinco vezes mais eficientemente do que BT-NSCs (Figura 13(E)). A vantagem relativa de GPS-NSCs em infiltrar no cérebro, baço e fígado revelou uma diferença verdadeira em tráfego, e não simplesmente a expansão preferencial dessas células in situ, uma vez que sua fluorescência de CFDA-SE média não foi reduzida em relação a BT- NSCs (dados não mostrados). Na verdade, daquelas células que migraram para o baço, é evidente que há interações próximas de NSCs com células T CD4+ (Figura 13(F)). As células injetadas também acumularam em pulmões, mas sem diferença entre GPS- e BT-NSC, provavelmente um reflexo de aprisionamento estérico em microvasos pulmonares (Figura 13(E)). Desta maneira, a estrutura de sLex formada em NSCs seguindo tratamento com GPS permite migração dessas células para esses órgãos, e destaca o papel crítico da atividade de ligante de E-selectina em direção de migração específica para tecido de NSCs in vivo.

Direcionamento aumentado de GPS-NSCs se traduz em melhora de neuropatologia através da neurodegeneração indireta endógena aumentada em EAE

[00272] Para resolver se direcionamento aperfeiçoado a tecido de NSC tinha um efeito terapêutico aumentado, a requerente monitorou o estado neurológico de camundongos C57BL/6 recebendo injeções de NSC seguindo EAE crônica induzida por MOG e analisou parâmetros clínicos bem como restauração e patologia de tecido. Precursores neurais foram administrados em duas injeções i.v. separadas no dia 9 PI e no dia 13 PI. Cinco grupos de camundongos EAE foram testados: (1) GPS-NSCs; (2) BT-NSCs; (3) HBSS (falso; isto é, sem células); (4) BT-HSPC; e (5) GPS-HSPC. A classificação clínica foi avaliada diariamente em camundongos individuais de uma maneira cega (Figura 14(A)) e a regressão linear de carga cumulativa de doença foi calculada (Figura 14(B)) e Tabela 2). Tabela 2.Características de EAE em camundongos C57BL/6 tratados i.v. com NSCs tratadas com GPS

[00273] A injeção de NSCs controle (BT-NSC) atenuou a severidade clínica de EAE comparado com animais tratados com HSPC e falso (p = 0,006). No entanto, injeção i.v. de GPS-NSCs (n = 30) mostrou uma classificação clínica significantemente mais aperfeiçoada comparado com animais tratados com BT-NSCs (n = 30; p = 0,006), GPS-HSPC (n = 30; p < 0,0001), BT-HSPC (n = 30; p < 0,0001) e falso (n = 30; p < 0,0001). É importante notar que esta melhora de severidade de doença é específica para NSCs, uma vez que nem a injeção de GPS-HSPC (que exibe atividade de ligante de E-selectina notadamente aumentada, vide Figura 21(A) (Merzaban, J.S., Burdick, M.M. e outros, 2011)) ou a injeção de BT-HSPC mostrou uma melhora na classificação clínica de animais induzidos por MOG comparado com animais controle (Figura 21(B)-21(C) e Tabela 3). *p<0,05 comparações múltiplas ANOVA

[00274] Tabela 3:características clínicas de EAE em camundongos C57BL/6 injetados com HSPCs tratadas com GPS i.v.

[00275] Na verdade, injeção ou de GPS- ou BT-HSPCs mostrou uma tendência a resultados clínicos piores indicando que os efeitos salutares observados de infusão de NSC não são uma propriedade geral de células-tronco adultas.

[00276] Notadamente, exame da neuropatologia no dia 30 após indução de EAE mostrou diferenças estatisticamente significantes em vários parâmetros de inflamação e neurodegeneração em camundongos que receberam GPS-NSC comparado com BT-NSC e animais falso-tratados (Figura 14(C)). Para determinar o impacto de injeções de NSC sobre a neuropatologia de EAE, a requerente avaliou vários marcadores diferentes. Primeiro, para avaliar a extensão de inflamação, a requerente tingiu seções de cordão espinhal de cada grupo de estudo de camundongos para CD11b, um marcador que identifica macrófagos infiltrantes e micróglia. Animais com EAE que receberam tampão de HBSS sozinho mostraram níveis altos de tingimento com CD11b, com células exibindo números aumentados de processos de membrana, evidência morfologia de um fenótipo ativado (Figura 14(C)). Os números de células tingidas com CD11b foram significantemente diminuídos em camundongos que receberam BT- NSCs (p < 0,001) e, notadamente, esses níveis foram ainda mais diminuídos em animais injetados com GPS-NSCs (p < 0,005 comparado com BT-NSCs). Importante, os macrófagos/micróglia exibiram tingimento com CD11b menor e processos de membrana mais diferentes indicativos de ativação diminuída (Figura 14(C)). Ainda, quantificação de células T CD4+ cerebrais nos grupos de tratamento diferentes revelou uma diminuição significante de células T infiltrantes em animais que receberam GPS-NSCs (Figuras 14(D) e 14(E)). Para avaliar neurodegeneração, a requerente tingiu seções de cordão espinhal para os marcadores GAP-43 e SMI-32 (Figuras 14(F)-14(I)). Em animais injetados com GPS-NSCs, havia uma expressão aumentada de GAP-43, uma molécula associada com integridade e regeneração de axônio, comparado com aquela em camundongos que receberam ou BT-NSCs ou tampão de HBSS sozinho (Figuras 14(F)-14(G)). Por outro lado, uma redução específica na expressão de SMI-32, um marcador de degeneração axonal, foi observada em animais que receberam GPS- NSCs comparado com camundongos que receberam ou BT-NSCs ou tampão de HBSS (Figuras 14(F)-14(I)). Esses dados apoiam a noção que os efeitos clínicos aperfeiçoados fornecidos por GPS-NSCs em relação a BT-NSCs são secundários à migração lesional aumentada de NSC específica de tecido fornecendo neuroproteção aumentada.

[00277] Para avaliar mais se os efeitos observados de GPS-NSCs refletem neurodegeneração aumentada, a requerente tingiu marcadores associados com oligodendrogênese e oligodendrócitos maduros, incluindo CNPase, Olig-2 e SOX9. A requerente observou um aumento estatisticamente significante no número de células Olig-2, SOX9 e CNPase em animais que receberam GPS-NSCs comparado com TB- NSCs ou controle falso (Figuras 14(D) e 14(E)). Embora houvesse evidência de NSCs injetadas no dia 17 PI (células SOX-2+; Figuras 20(A)-20(B)), a requerente não observou colonização persistente por NSC (marcada com GFP) em 30 dias PI (Figura 22) em nenhum dos grupos de injeção, sugerindo que o mecanismo de neuroproteção de NSC associado com direcionamento melhor não necessita da presença continuada, nem da diferenciação em relação a células de linhagem neural, de NSCs administradas. Juntos, esses dados indicam que o tratamento de camundongos com GPS-NSCs aumentou a administração de NSCs ao SNC e proveu neurorrestauração através de um efeito neurodegenerativo indireto, não através de neurodegeneração direta (isto é, substituição celular).

DISCUSSÃO

[00278] MS é uma doença desmielinante, crônica, do SNC caracterizada por lesões inflamatórias multifocais causando destruição gradual da bainha da mielina, levando à lesão e perda axonal (Imitola, J., Chitnis, T. e outros, 2006). Agentes terapêuticos à base de célula oferecem a promessa de reparo de tecido danificado/inflamado através da substituição de células afetadas (regeneração direta) e/ou através da produção de fatores apoiadores/tróficos no ambiente que evocam restauração de tecido por células endógenas (regeneração indireta). No caso de doenças neurológicas disseminadas tal como MS, uso de NSCs específicas de tecido poderia provar ser clinicamente útil em obter recuperação do SNC, mas um obstáculo próximo para atingir este objetivo é administrar números adequados de células a sítios de lesão neural. Estudos anteriores mostraram um benefício de NSCs transplantadas em modelos experimentais de acidente vascular cerebral, trauma ao cordão espinhal e MS (Ben-Hur, T., Einstein, O. e outros, 2003; Einstein, O., Fainstein, N. e outros, 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N. e outros, 2006; Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004; Lee, S. T., Chu, K. e outros, 2008; Pluchino, S., Quattrini, A. e outros, 2003; Pluchino, S., Zanotti, L. e outros, 2005; Ziv, Y., Avidan, H. e outros, 2006). Injeção direta no sítio afetado foi usada como uma via de administração nesses estudos, no entanto, a fim de obter colonização apropriada de NSC dentro de tecido(s) afetado(s) em doenças do SNC multifocais, a via de administração vascular que é requerida como administração local (isto é, injeção in situ) é impraticável devido à natureza difusa de doença e restrições anatômicas associadas. Até agora, não há quaisquer estudos para avaliar a expressão de efetores moleculares de migração celular sobre NSCs e, mais importante, quaisquer estudos para se endereçar a como otimização da expressão de tais efetores poderia aumentar o neurotropismo de NSC.

[00279] Os estudos da requerente revelaram que NSCs revelam efetores das Etapas 2-4 relevantes, mas são conspicuamente deficientes em efetores de Etapa 1: (1) elas não expressam nativamente ligantes para E-selectina ou P-selectina (mesmo quando cultivadas na presença de citocinas inflamatórias (Figura 15)); (2) elas não têm expressão do glicano sLex, que é o determinante de ligação à selectina canônico; e (3) elas não expressam a glicoproteína PSGL-1, um ligante de selectina em células Th1 específicas da mielina que foi relatado mediar o tráfego para o cérebro (Piccio, L., Rossi, B. e outros, 2005; Piccio, L., Rossi, B. e outros, 2002). Importante, expressão de selectinas endoteliais, especialmente E-selectina, está implicada em recrutamento de efetores imunológicos em MS e EAE (Lee, S. J. e Benveniste, E. N., 1999; Piccio, L., Rossi, B. e outros, 2002). Desta maneira, a requerente procurou aqui avaliar se engenharia de glicano de NSC para reforçar expressão de ligantes de E-selectina aumentaria a administração sistêmica das células e, em consequência, têm efeitos biológicos em um modelo de MS.

[00280] Os conjuntos de dados mostram aqui que NSC culturada expressa duas moléculas de superfície celular neural bem caracterizadas, CD44 e NCAM (Back, S. A., Tuohy, T. M. e outros, 2005; Pluchino, S., Quatrinni, A. e outros, 2003). Surpreendentemente, exofucosilação de NSCs de camundongo forneceu expressão alta de determinantes de sLex proeminentemente nessas glicoproteínas, programando conversão de CD44 no ligante de E-selectina potente HCELL (Dimitroff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2000; Dimitroff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2001) e também induzindo expressão de duas glicoformas sialofucosiladas de NCAM de ~120 kDa e ~140 kDa, que foram chamadas "NCAM-E". Ensaios de blot rolamento revelaram que HCELL é o ligante de E-selectina principal expresso em GPS-NSC (Figura 12(B)). Essas constatações são corroboradas por resultados de citometria de fluxo seguindo a remoção de NCAM-E através de digestão com PI-PLC, mostrando retenção considerável de expressão de sLeX de NSC e reatividade de E-Ig (Figura 10(C)).

[00281] NCAM, um membro da superfamília de imunoglobulina, é expressa em ambos o neurônio e a glia, e é convencionalmente visto como um mediador de interações célula-célula estabelecendo uma ancoragem física de células ao seu ambiente. Modificações em glicano pós-traducionais consistindo em ácido polissiálico (PSA) a-2,8-ligado no núcleo da proteina NCAM proveem propriedades únicas em migração neural (Gascon, E., Vutskits, L. e outros, 2007; Maness, P.F. e Schachner, M., 2007; Rutishauser, U., 2008) e PSA-NCAM parece desempenhar um papel crucial em mediação de migração de célula precursora no cérebro (Glaser, T., Brose, C. e outros, 2007; Lavdas, A. A., Franceschini, I. e outros, 2006; Zhang, H., Vutskits, L. e outros, 2004). Os dados da requerente agora proveem a primeira evidência que NCAM exibe a-(2,3)-sialillactosaminil glicanos terminais relevantes que podem servir como aceitadores para exofucosilação para criar determinantes de sLex. Seguindo glicoengenharia de superfície celular de NSCs, níveis de expressão de PSA não mudaram e a atividade de ligante de E-selectina induzida não é permanente, uma vez que houve perda completa de expressão de sLex dentro de 72 horas de fucosilação reforçada (Figuras 11(A)-11(C)). Desta maneira, subsequente ao extravasamento, reversão temporal para NCAM nativa ocorreria, e infiltração de NSCs seria então capaz de sofrer migração para o CNS intraparenquimal mediada por NCAM endógena. Notadamente, embora NSC de murino expresse NCAM carregando a-(2,3)-sialilgalactosaminil glicanos, os estudos da requerente de NSCs humanas (CC-2599) indicam que essas células apenas expressam HCELL e não NCAM-E seguindo exofucosilação (Figura 15); desta maneira, NSC humana pode expressar sialolactosaminil glicanos relevantes que servem como aceitadores para fucosilação reforçada apenas em CD44. Essas diferentes entre espécies devem ser consideradas quando interpretando estudos de xenoenxerto onde NSCs humanas são usadas em sistemas de roedor (Goncharova, V., Das, S. e outros, 2014).

[00282] A indução de atividade de ligante de E-selectina tem profundas implicações para tráfego de célula, servindo para direcionar migração celular para leitos endoteliais que expressam E-selectina. Como mostrado por outros, a requerente observou que NSCs exibem o receptor de quimiocina CXCR4 e a integrina VLA-4 (vide Figuras 9(A)- 9(B)). Foi mostrado que expressão de CXCR4 em NSCs humanas (Bezzi, P., Domercq, M. e outros, 2001; Flax, J. D., Aurora, S. e outros, 1998; Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004) promove migração in vivo em direção à lesão do SNC onde astrócitos locais e endotélio suprarregulam o fator 1a derivado de célula estromal ligante cognata (SDF-1a, também conhecida como CXCL12) (Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004). Essas observações definem CXCR4 como um efetor da Etapa 2 proeminente na promoção de direcionamento de NSC para lesão no SNC. O receptor endotelial correspondente para VLA-4, VCAM-1, é também suprarregulado na resposta inflamatória do cérebro à lesão (Justicia, C., Martin, A. e outros, 2006). O eixo VLA-4/VCAM-1 foi similarmente mostrado desempenhar um papel crítico em migração de NSC, pelo fato que apenas NSCs que expressam constitutivamente VLA-4, em adição a CXCR4, foram capazes de acumular ao redor de microvasos do SNC inflamados em lesões afetadas em EAE (Pluchino, S., Zanotti, L. e outros, 2005). Um estudo de xenoenxerto recente sugere que integrinas podem desempenhar um papel como mediadores na Etapa 1 de migração em NSCs humanas em um modelo de acidente vascular cerebral de rato sugerindo que interações com selectina não são necessárias neste sistema de modelo (Goncharova, V., Das, S. e outros, 2014). Embora trabalho adicional seja garantido, o(s) papel(éis) variável(eis) de integrinas como mediadores de interações da Etapa 1 poderia(m) refletir diferenças no modelo inflamatório usado, no sistema animal hospedeiro, na permeabilidade de vasos, na expressão de moléculas de adesão endoteliais neste sítio de inflamação, na presença de moléculas de adesão solúveis no sítio e nas propriedades físicas do recipiente que ditam a taxa de fluxo (isto é, diâmetro do vaso) (Berlin, C., Bargatze, R. F. e outros, 1995; Ding, Z. M., Babensee, J. E. e outros, 1999; Zarbock, A., Kempf, T. e outros, 2012; Zarbock, A., Lowell, C. A. e outros, 2007). Em qualquer caso, expressão de ligantes de E-selectina como efetores da Etapa 1 em NSCs serviria para complementar a expressão constitutiva de CXCR4 e VLA-4, desta maneira otimizando o recrutamento de NSC para os sítios inflamatórios. Desta maneira, embora a requerente tenha observado que BT-NSCs intravenosamente administradas (não modificadas) podem infiltrar no cérebro de camundongos EAE (Figura 13(E)), expressão de ligante de E-selectina reforçada por glicoengenharia forneceu migração notadamente aumentada de NSCs para o cérebro. Este neurotropismo aumentado era associado com inflamação do SNC notadamente diminuída (Figuras 14(A)-14(I)). Além disso, como mostrado nas Figuras 13(A)-13(F), acúmulo de NSC no parênquima do SNC era duas vezes maior dentre GPS-NSCs do que BT-NSCs por volta do dia 17 pós-injeção, indicando que expressão reforçada de efetores da Etapa 1 promove extravasamento.

[00283] Em adição a neurotropismo aumentado, dados de direcionamento a curto prazo também revelaram um acúmulo significantemente maior de GPS-NSCs no baço e no fígado do que em BT-NSCs (Figura 13(E)). Estas constatações estão de acordo com os resultados de um estudo relatando que NSCs sistemicamente administradas tendem a acumular nos cérebros de camundongos com EAE, e também no baço e no fígado (Politi, L. S., Bacigaluppi, M. e outros, 2007). Expressão de E-selectina no baço foi descrita em humanos, primatas não humanos e roedores (Alam, H. B., Sun, L. e outros, 2000; Drake, T. A., Cheng, J. e outros, 1993; Redl, H., Dinges, H. P. e outros, 1991; Schweitzer, K. M., Drager, A. M. e outros, 1996), e é suprarregulada por citocinas proinflamatórias que são caracteristicamente expressas em condições inflamatórias do SNC (Emamgholipour, S., Eshagni, S. M. e outros, 2013; Weishaupt, A., Jander, S. e outros, 2000); na verdade, conjugação de sLex a polímeros foi mostrada aumentar notadamente o acúmulo de tais polímeros dentro do baço (Horie, K., Sakagami, M. e outros, 2000; Horie, K., Sakagami, M. e outros, 2004), provendo evidência direta que expressão de sLex promove administração esplênica. Foi relatado que infiltração do baço por NSCs diminui a produção de citocinas inflamatórias pelas células residentes no baço (por exemplo, macrófagos) resultando em efeitos anti-inflamatórios (Lee, S. T., Chu, K. e outros, 2008). Outros estudos relataram que NSCs intravascularmente administradas proveem imunossupressão periférica (Einstein, O., Fainstein, N. e outros, 2007; Einstein, O., Grigoriadis, N. e outros, 2006) ou imunomodulação local que detém lesão ao SNC, ao invés de aumento da neurodegeneração (Martino, G. e Pluchino, S., 2006; Pluchino, S., Zanotti, L. e outros, 2009; Wang, L., Shi, J. e outros, 2009). Desta maneira, o direcionamento esplênico aumentado observado pela expressão reforçada de atividade de ligante de E-selectina em NSCs poderia contribuir para a neuroproteção através de imunomodulação em virtude de razão de tecido aumentada de NSCS para células imunes. Esta noção é apoiada pelos dados in vitro da requerente mostrando que embora GPS-NSCs não tenham conferido uma vantagem imunomoduladora comparado com aquela observada com NSCs controle, uma vez que a razão de NSCs de entrada para esplenócitos é aumentada, a proliferação de célula T diminui (Figura 19(A)).

[00284] Estudos anteriores de exoglicosilação de superfície celular tinham utilizado células-tronco mesenquimais humanas em um modelo de xenotransplante e não se endereçaram ao impacto terapêutico sobre lesão a tecido, isto é, se células-tronco glicoengenheiradas se direcionariam para um sítio de inflamação e se tais células teriam efeito(s) regenerativos e/ou protetores de tecido desejados. Embora recrutamento aumentado de NSCs para o SNC tenha sido observado seguindo infusão de GPS-NSCs, não houve nenhum aumento comensurado em enxerto a longo prazo de NSCs. Desta maneira, embora infiltração no SNC aumentada tenha sido obtida através da exploração de migração de célula fisiológica (isto é, de um amaneira não invasiva que preservaria arquitetura microambiental de tecido do SNC), a requerente não observou que NSCs administradas diferenciaram em progênie que regenera tecido do SNC funcional in situ (isto é, através de regeneração direta). Na realidade, a requerente observou que administração de GPS-NSCs aperfeiçoou a habilidade de progenitores neuronais endógenos em se tornar oligodendrogliomas (Figuras 14(D) e 14(E)). A constatação da requerente então não apoia o paradigma de neurorregeneração direta, mas ao invés disso sugere que o papel predominante de NSCs em reparo de tecido do SNC é através de efeitos tróficos que apoiam reparo através de células endógenas (Caplan, A. I., 2009; Hess, D. C. e Borlongan, C. V., 2008; Laterza, C., Merlini, A. e outros, 2013; Phinney, D. G. e Prockop, D. J., 2007), desta maneira fornecendo neurorrestauração (isto é, através de neurorregeneração direta). Consistente com esta noção, NSCs não diferenciadas foram relatadas reduzir significantemente formação de cicatriz e aumentar a sobrevivência e função de progenitores gliais e neuronais endógenos através da secreção de neurotrofinas tal como LIF (Laterza, C., Merlini, A. e outros, 2013). Ainda, NSCs apoiam a formação de nichos de crescimento induzidos por lesão através da expressão de moléculas tais como BMP-4 e Noggin (Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004; Pluchino, S., Zanotti, L. e outros, 2005) que disparam neurorregeneração indireta por células endógenas.

[00285] Coletivamente, os dados da requerente apoiam um mecanismo onde engenharia de glicano de NSC para reforçar expressão de ligantes de E-selectina aumenta colonização de tecido, mediando imunomodulação e reparo de tecidos em necessitar de enxerto persistente/a longo prazo de NSCs administradas. Notadamente, apesar de atividade de ligante de E-selectina aumentada, infusão de GPS-HSPC não aperfeiçoou o curso de EAE (na verdade, injeção de HSPC piora a doença, vide Figuras 21(A)-21(B) e Tabela 3), indicando que os efeitos neuroprotetores observados de GPS-NSCs não são uma propriedade geral de células-tronco adultas e são devido a efeitos neurorrestauradores inerentes a NSC. Consistente com esta constatação de efeito(s) biológico(s) específico(s) de célula-tronco adulta, HSPCs humanas foram verificadas elicitar rejeição imune de hospedeiro forte em um modelo de camundongo de doença corneal congênita enquanto outras células-tronco adultas tais como células- tronco mesenquimais suprimem a resposta imune de hospedeiro (Liu, H., Zhang, J. e outros, 2010). Embora estudos adicionais sobre mecanismo(s) celular(es) mediando a neuroproteção observada por NSCs sejam garantidos, os resultados da requerente indicam que engenharia de glicano de superfície celular não mudou a capacidade de autorrenovação, potencial de diferenciação ou alterou a capacidade imunomoduladora inata de células-tronco neurais. Coletivamente, os dados apresentados aqui levam a requerente a propor um modelo (Figura 23) de maneira que expressão de ligante de E-selectina reforçada através de exofucosilação da superfície de NSCs fornece recrutamento de tecido aumentado em sítios inflamatórios do SNC, desta maneira aumentado a administração de carga de fatores tróficos de NSC onde eles são necessários. Devido ao fato da expressão de E- selectina ser notadamente suprarregulada em leitos endoteliais em todos os sítios de inflamação em humanos, as constatações da requerente têm implicações traducionais profundas para testes clínicos futuros explorando engenharia de glicano de superfície celular para aperfeiçoar a eficácia de agentes terapêuticos de célula-tronco para MS bem como outras doenças inflamatórias multifocais devastadoras.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00286] Declaração ética: todos os experimentos com camundongo foram realizados de acordo com as orientações NIH para o cuidado e uso de animais e sob aprovação do Institutional Animal Care and Use Committees of Harvard Medical School. O que segue são as especificidades relacionadas ao uso de camundongos nesses experimentos. Justificativa para uso: EAE é um modelo valioso para a esclerose múltipla de doença humana. Não há quaisquer modelos matemáticos, simulações por computador ou sistemas in vitro que possam substituir a doença in vivo. Muitos dos tratamentos disponíveis para MS e outras doenças autoimunes foram primeiro testados e seus mecanismos investigados em EAE. EAE induzida por MOG em camundongos C57/BL6 é valiosa devido à disponibilidade de muitos camundongos inativados e transgênicos nesta base. Cuidado veterinário: os camundongos são manuseados e cuidados de acordo com orientações federais, institucionais e AAALAC. Procedimentos para minimizar efeitos adversos: após imunização, os animais são examinados diariamente. Aqueles afetados por EAE desenvolveram uma cauda frouxa (grau 1), membros traseiros parciais (grau 2), paralisia de membro traseiro completa (grau 3), quadriparese (grau 4), moribundo ou morte animal (quadro 5). A maioria dos animais tem um grau 0 a 3, e, raramente, os animais atingem grau 4 e em tais casos eutanásia é realizada. Quando os animais são afetados por EAE, eles são providos com pacotes de gel para assegurar acesso a fluidos e são providos com acesso a alimento dentro da gaiola. Eutanásia é realizada por inalação de CO2 administrado de acordo com orientações institucionais.

[00287] Reagentes: os anticorpos que seguem foram comprados da BD Pharmingen: E-selectina anti-humana de camundongo de bloqueio de função (68-5H11; IgG1), CLA anti-humano de rato (HECA-452; IgM), sLex anti-humano de camundongo (CSLEX-1; IgM), CD15 anti-humano de camundongo (IgM), PSGL-1 anticamundongo de rato (2PH1 e 4RA10; IgG1), PSGL-1 anti-humano de camundongo (KPL-1; IgG1), CD44 anticamundongo de rato (KM114 e IM7; IgG), CD44 anti-humano de camundongo (515; IgG1), CD43 anticamundongo de rato (S7; IgG2a), CD43 anti-humano de camundongo (1G10; IgG1), CD56 anti- (pan N-Cam antiadulto de camundongo e embriônico) de camundongo (NCAM13; IgG2b), CD56 anti-humano de camundongo (NCAM16.2; IgG2b), CXCR4 anti-humano de rato (2B11; IgG2b), CXCR4 anti- humano de camundongo (12G5; IgG2a), CD18 anticamundongo de rato (GAME-46; IgG1), CD29 anticamundongo de rato (KM16; IgG2a), CD49d anticamundongo de rato (9C10; IgG2b), CD11a anticamundongo de rato (2D7; IgG2a), CD11b anticamundongo de rato (M1/70; IgG2b), CD49e anticamundongo de rato (MFR5; IgG2a), isotipo IgG1,k de camundongo, isotipo IgG2a de camundongo, isotipo IgM de camundongo, isotipo IgG de rato, isotipo IgM de rato e isotipo IgG1 humano. Os anticorpos secundários que seguem foram também comprados da BD Pharmingen: PE Estreptavidina, IgM antirrato de biotina e Ig-HRP anticamundongo de cabra. Os anticorpos secundários que seguem foram comprados da Southern Biotech.: IgG-biotina antihumana de coelho, IgM-PE anticamundongo de cabra, IgG-PE antirrato de cabra, Ig-biotina anticamundongo de cabra, Ig-HRP antirrato de cabra e Ig-HPR anti-humano de cabra. Quimera de E-selectina/Ig humana de camundongo recombinante (E-Ig) e quimera de P- selectina/Ig humana de camundongo recombinante (P-Ig) eram da R&D. sLex anti-humano de camundongo (KM93; IgM) foi comprado da Calbiochem. CD43 anticamundongo de rato (1B11; IgG2a) foi comprado da Biolegend. LPAM-1 anticamundongo de rato (DATK32; IgG2a) e anti- SMI32 de camundongo (SMI-32; IgG1) foram comprados da Abcam. CD15 anti-humano de camundongo (80H5; IgM) foi comprado da Coulter-Immunotech. PNGase F foi comprado da New England Biolabs. PI-PLC, Bromelina, Inibidor de Tripsina da Soja, DNase, anti-Map2 de camundongo (HM-2; IgG1) foram comprados da Sigma. Anti GFP de camundongo (B2, IgG2a) foi comprado da Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). To-pro3 foi comprado da Invitrogen. Ácido polissiálico anti-humano de camundongo (PSA; IgG2a) foi um presente gentil do Dr. Nicholas Stamatos. A enzima fucosiltransferase VI (FTVI) foi um prosente do Dr. Roland Wohlgemuth (Sigma-Aldrich).

[00288] Células: NSCs de camundongo foram isoladas e culturadas como descrito (Imitola, J. Comabella, M. e outros, 2004; Imitola, J, Raddassi, K. e outros, 2004) de antemão. Em suma, uma suspensão de NSCs dissociadas (5x105 células por ml), isoladas do VZ telencefálico de murino embriônico no dia 12, foram culturadas em 98% de DMEM/F12 (GIBCO), suplemento de N2 1% (GIBCO), penicilina/estreptomicina 1% (GIBCO), heparina 8 mg/ml (Sigma), fator de inibição de leucemia 10 ng/ml (LIF, Chemicon), bFGF 20 ng/ml (Calbiochem) em frascos de 25 cm2não revestidos (Falcon) a 37°C em CO2 5%. NSCs foram usadas após segunda passagem para a maioria dos experimentos. Suspensão de célula única de células-tronco neurais foi obtida através de dissociação mecânica nas neuroesferas em Versene (Life Technologies).

[00289] Para isolamento de HSPC de camundongo, a medula óssea foi coletada do fêmur e tíbia de camundongos C57BL/6 e suspensões de célula única foram feitas. Células vermelhas do sangue foram lisadas usando tampão de lise de célula vermelha do sangue (Sigma). As células foram então lavadas e filtradas em um filtro de célula de 100 µm (BD Falcon) antes da depleção da linhagem usando o Lineage Cell Depletion Kit da Miltenyi Biotec. Preparações celulares foram depletadas usando o autoMACS® Separator (Miltenyi Biotec). Seguindo a depleção, depleção, as células são então positivamente selecionadas para c-kit usando CD117 MicroBeads (Miltenyi Biotec). A população LineagenegC-kitpos resultante (referida como HSPC) foi usada para estudos de camundongo EAE in vivo.

[00290] Células de ovário de hamster Chinês foram transfectadas com E-selectina de comprimento integral (CHO-E) e foram mantidas como anteriormente descrito (DImitroff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2001). A linhagem de célula NSC dependente de ßFGF, CC-2599, foi culturada como anteriormente descrito (Imitola, J., Raddassi, K. e outros, 2004) e usada para dados apresentados nas Figuras 16(A)-16(C)).

[00291] Tratamento com GPS, reações de PI-PLC e Bromelina: o procedimento para tratamento com GPS de NSCs de murino foi anteriormente descrito para MSCs (Sackstein, R., Merzaban, J. S. e outros, 2008). Em suma, neuroesferas foram primeiro coletadas e dissociadas em células únicas através da incubação com PBS/EDTA (0,02%) por 15 min a 37°C. As células foram então lavadas com HBSS, contadas e ressuspensas em 60 mU/ml de FTVI em HBSS (sem Ca2+ ou Mg2+) contendo HEPES 20 mM, albumina de soro humano 0,1% e GDP- fucose 1 mM por 40 min a 37°C. As reações de PI-PLC foram realizadas a 37°C usando 0,1U/ml por uma hora. As reações de bromelina foram realizadas a 37°C em HBSS+BSA 2%+bromelina 0,1% por uma hora.

[00292] Citometria de fluxo:alíquotas de células (2 x 105células) foram lavadas com PBS/FBS 2% e incubadas com mAbs primários ou com mAbs controle de isotipo (ou não conjugado ou conjugado a fluorcromo). As células foram lavadas em PBS/FBS 2% e, para imunofluorescência indireta, incubadas com anticorpos anti-isotipo conjugados a fluorcromo secundários apropriados. Após lavagem das células, intensidade de fluorescência de FITC ou PE foi determinada usando um citômetro de fluxo Cytomics FC 500 MPL (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA).

[00293] Estudos de imunoprecipitação:lisatos de célula de BT- NSC ou GPS-NSC foram incubados com anticorpos de imunoprecipitação ou com controles de isotipo apropriados e então incubados com Protein G-agarose. Imunoprecipitados foram lavados extensivamente usando Tampão A contendo NP-40 2%, SDS 1%. Em alguns experimentos, imunoprecipitados foram tratados com N- glicosidase F (New England Biolabs) como anteriormente descrito (Dimitroff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2001). Para análise Western blot, todos os imunoprecipitados foram diluídos em tampão de amostra de redução, fervidos, então submetidos a SDS-PAGE, transferidos para membrana de PVDF e imunotingidos com HECA-452 ou E-Ig.

[00294] Análise Western blot: BT e GPS-NSCs foram lisadas usando NP40 2% em Tampão A (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, PMSF 20 µg/ml, azida de sódio 0,02%; e comprimento de coquetel inibidor de protease (Roche Molecular Biochemicals). Western blots de lisatos de proteina quantificados ou de proteina imunoprecipitada foram realizados sob condições de redução como anteriormente descrito (Dimitroff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2001). Os blots foram visualizados com quimioluminescência usando Lumi-Light Western blotting Substrate (Roche).

[00295] Ensaios de Adesão de Câmara de Fluxo de Placa Paralelo: capacidade de ligação à E-selectina de BT-NSCs e GPS- NSCs foi comparada usando o ensaio de câmara de fluxo de placa paralelo (Glycotech; Gaithersburg, MD). NSCs (0,5 x 106 células/ml, suspensas em solução de HBSS/HEPES 10 mM/ CaCl2 2 mM) foram atraídas para monocamadas de HUVEC confluentes. Inicialmente, as NSCs foram deixadas contatar a monocamada de HUVEC em um estresse de cisalhamento de 0,5 dyna/cm2, subsequentemente a taxa de fluxo foi ajustada para exercer estresse de cisalhamento variando de 0,5 a 30 dynas/cm2. O número de BT- ou GPS-NSCs aderentes à monocamada de HUVEC foi quantificado no intervalo final de 15 seg em estresse de cisalhamento de 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 e 30 dyna/cm3. Cada ensaio foi realizado pelo menos 3 vezes e os valores tiveram média tirada. Ensaios controle foram realizados adicionando EDTA 5 mM ao tampão de ensaio para quelar Ca2+ requerida para ligação à selectina ou tratamento de HUVEC com mAb de E-selectina anti-humano de bloqueio de função a 37°C por 15 min antes do uso em ensaios de adesão.

[00296] Ensaio de rolamento de Blot: o ensaio de rolamento de blot foi descrito anteriormente (Dimitriff, C. J., Lee, J. Y. e outros, 2000; Fuhlbridge, R. C., King, S. L. e outros, 2002; Sackstein, R. e Fuhlbrigge, R, 2006) e aqui foi usado para detectar atividade de ligação à selectina de proteínas de membrana de NSC separadas através de SDS-PAGE. Western blots de preparações de membrana de NSC foram tingidos com anti-CLA (HECA-452) e tornadas transluzentes através de imersão em DMEM com glicerol 10%. Células CHO-E foram ressuspensas (5 x 106/mL) em DMEM contendo CaCl2 2 mM e glicerol 10%. Os blots foram postos sob uma câmara de fluxo de placa paralelo e células CHO-E foram perfundidas em um estresse de cisalhamento fisiologicamente relevante de 1,0 dyna/cm2, um ajuste na taxa de fluxo volumétrico foi feito para dar conta do aumento em viscosidade devido à presença de glicerol 10% no meio de fluxo. Marcadores de peso molecular foram usados como guias para auxiliar na colocação da câmara de fluxo sobre faixas tingidas de interesse. O número de células em interação por milímetro quadrado foi tabulado como uma função da região de peso molecular e compilado em um histograma de adesão. Adesão não específica foi avaliada através de perfusão de suspensões de célula CHO-E contendo EDTA 5 mM no meio de fluxo.

[00297] Imunização para indução de EAE e injeção de células- tronco neurais: NSCs ou HSPC da medula óssea (LineagenegC-kitpos) ou foram tratadas com GPS ou não e 1x106células foram injetadas na veia da cauda de camundongos C57BL/6 no dia 9 e no dia 13 após imunização (PI) com MOG 35-55 (subcutaneamente nos flancos; vide detalhes em Material Suplementar). EAE foi classificada de uma maneira cega; o investigador não estava envolvido nas injeções e não conhecida a composição dos grupos. Detalhes da escala de graduação usada são mostrados no Material Suplementar. BT-NSC, GPS-NSCs, BT-HSPCs ou GPS-HSPCs foram injetadas como uma suspensão celular na veia da cauda de camundongos EAE em um volume de 0,2 ml de HBSS. Camundongos falso-tratados (sem NSCs) injetados com HBSS sozinho foram usados como um controle negativo.

[00298] Estudos de Direcionamento de Curto Prazo: BT-NSCs e GPS-NSCs foram marcadas com CFDA-SE 5 mM (Invitrogen) por 5 min em temperatura ambiente em RPMI contendo FBS 10% e injetadas intravenosamente em camundongos C57BL6 tratados com MOG no dia 9 e no dia 13 pós-imunização (PI). Dois milhões de NSCs em um volume de 0,2 mL de HBSS foram injetados em cada camundongo em cada dia. Tampão de HBSS sozinho foi usado para determinar sinais de base. BT-NSCs e GPS-NSCs foram também injetadas nos animais que não eram imunizados com MOG e usadas para padronizar os sinais observados em cada tecido ensaiado. Dezesseis horas após a segunda transferência de NSC, os camundongos foram sacrificados e perfundidos com PBS 1X sem Ca2+ e Mg2+. O cérebro, cordão espinhal, nós linfáticos, baço, fígado e pulmão foram isolados. O cérebro e cordão espinhal foram homogeneizados. Os peletes resultantes foram ressuspensos em Tripsina-EDTA 0,25% (Invitrogen) e incubados a 37°C por 10 minutos. O processo de digestão foi parado usando DMEM contendo SBTI 0,01%, DNase 0,001% e BSA 0,075%. Os nós linfáticos, baço e fígado foram mecanicamente dissociados e as suspensões de célula única resultante foram avaliadas quanto a frequências de células positivas para CFDA-SE através de citometria de fluxo no canal de FL1. Dados citométricos de fluxo foram analisados e expressos como porcentagem de eventos positivos para CFDA-SE detectados em 200.000 células varridas dentro de uma porta estreita que é ajustada para incluir NSC. Esta porta foi determinada com base em mistura de NSCs culturadas com suspensões de células isoladas de cada tecido testado (cérebro, cordão espinhal, nó linfático, baço, fígado e pulmão).

[00299] Análise de migração de NSC para o SNC: BT-NSCs, GPS- NSCs foram marcadas com corante PKH26 (Invitrogen) e injetadas intravenosamente em camundongos C57BL6 tratados com MOG no dia 9 e no dia 13 pós-imunização (PI). Um milhão de NSCs em um volume de 0,2 mL de HBSS foi injetado em cada camundongo em cada dia. Tampão de HBSS sozinho foi usado para determinar sinais de base. Quatro dias após a segunda transferência de NSC, os camundongos foram sacrificados e perfundidos com 1X PBS sem Ca2+ e Mg2+ e cordões espinhais lombar-sacral foram coletados. O cordão espinhal foi escolhido porque no modelo B6, as lesões do SNC no cérebro anterior são muito variáveis em tamanho e localização comparado com os cordões espinais que possuem uma localização mais previsível (região lombossacral) e também patologia mais exuberante (Chitnis, T., Najafian, N. e outros, 2001; Rasmussen, S., Wang, Y. e outros, 2007; Wang, Y., Imitola, J. e outros, 2008). Para análise FACS, os cordões espinhais foram homogeneizados e os peletes resultantes foram ressuspensos em Tripsina-EDTA 0,25% (Invitrogen) e incubados a 37°C por 10 minutos. O processo de digestão foi parado usando DMEM contendo SBTI 0,01%, DNase 0,001% e BSA 0,075%. Para análise histológica, o cérebro e o cordão espinhal foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C até seccionamento. As seções de criostato (20 µm) de cordão espinhal lombo-sacral ou cérebro anterior, médio e posterior foram fixadas com paraformaldeído 4% por 15 minutos e então tingidas com anticorpos de interesse. Os vasos sanguíneos foram visualizados através de anti-Flk- 1 (VEGFR2, Sigma) e NSCs foram tingidas ou com anti-sox-2 (Millipore) ou visualizadas através de corante PKH26 em vermelho. Os cordões espinhais foram então homogeneizados e os peletes resultantes foram ressuspensos em Tripsina-EDTA 0,25% (Invitrogen) e incubados a 37°C por 10 minutos. O processo de digestão foi parado usando DMEM contendo SBTI 0,01%, Dnase 0,001% e BSA 0,075%. Os vasos sanguíneos foram visualizados através de tingimento com Flk-1 (VEGFR2).

[00300] Imunização para indução de EAE e injeção de NSC/HSPC: NSCs ou HSPC (LineagenegC-kitpos) foram ou tratadas com GPS ou não e 1x106células foram injetadas na veia da cauda de camundongos C57BL/6 no dia 9 e no dia 13 após imunização (PI) com MOG 35-55. MOG 35-55 (M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-O-V-H-L-Y-R-N- G-K) correspondendo à sequência de camundongo é sintetizado pela QCB Inc. Division of BioSource International (Hopkinton, MA) e purificado para >99% através de HPLC. Os camundongos são imunizados subcutaneamente nos flancos com 150-200 µm de peptídeo MOG em PBS 0,1 ml e CFA 0,1 ml contendo 0,4 mg de Mycobaterium Tuberculosis (H37Ra, Difco, Detroit, Michigan) e injetados intraperitonealmente com 200 ng de toxina da Coqueluche (List Laboratories, Campbell, Califórnia) no dia de imunização e 2 dias depois. EAE foi classificada de uma maneira cega; o investigador não estava envolvido nas injeções e não conhecida a composição dos grupos. Os graus que seguem foram usados: grau 1, cauda vacilante ou fraqueza isolada de marcha sem cauda vacilante; grau 2, paralisia da perna traseira parcial; grau 3, paralisia da perna traseira total ou das pernas traseira e frontal parcial; grau 4, paralisia da perna traseira total e perna frontal parcial; grau 5, animal moribundo ou morto. BT-NSC, GPS-NSCs, BT-HSPCs, GPS-HSPCs foram injetadas como uma suspensão celular na veia da cauda de camundongos EAE em um volume de 0,2 ml de HBSS. Camundongos falsos tratados (sem NSCs) injetados com HBSS sozinho foram usados como um controle negativo.

[00301] Tingimento imunoistológico:os camundongos foram perfundidos com 50 ml de solução salina normal antes do sacrifício para remover quaisquer PBMCs intravasculares. Para imagem confocal, os animais foram perfundidos intracardialmente com 10 ml de paraformaldeído 4% em PBS. O cérebro e o cordão espinhal foram removidos e incrustrados em O.C.T., rapidamente congelados em nitrogênio líquido e mantidos a -70°C até seccionamento. Seções de criostato (10 µm) de cordões espinhais foram fixadas com acetona ou paraformaldeído 4% e então marcadas com o anticorpo de interesse. Ig de isotipo compatível e omissão do anticorpo primário serviram como controles negativos. Cada espécime foi avaliado em um mínimo de três níveis diferentes de seccionamento. A seção de tecido inteira (uma seção de cordão espinhal longitudinal) foi avaliada para um dado marcador celular em ampliação de 40X. O número de células tingindo positivo para os dados marcadores foi contado em dez campos 40X (campos de alta energia) por seção. Os resultados de uma seção foram totalizados e os resultados entre as seções tiveram uma média tirada.

[00302] Tingimento para microscopia confocal: seções fixadas com paraformaldeído (40 µm) foram lavadas em PBS, bloqueadas em PBS contendo soro de cabra 4%, BSA 0,3% e triton 0,3% e subsequentemente incubadas com anticorpos primários de um dia para o outro e anticorpos secundários por duas horas em solução de bloqueio. A requerente usou anticorpos secundários altamente adsorvidos-cruzados para evitar reatividade cruzada (Alexa 488 e Alexa 594). Microscopia confocal foi realizada usando um software de análise 3D Zeiss Laser Scanning Microscope (Zeiss, Thornwood, NY) com um protocolo de aquisição de multifaixa para evitar sobreposição potencial dos dois fluorcromos.

[00303] Efeitos de tratamento de GPS sobre diferenciação de NSC, capacidade de autorrenovação e efeitos imunossupressores in vitro: o procedimento para tratamento com GPS de NSCs de murino foi como anteriormente descrito para MSCs (Sackstein, R., Merzaban, J. S. e outros, 2008). BT- e GPS-NSCs foram comparadas in vitro quanto à sua capacidade de autorrenovação, formar neuroesferas, diferenciar em neurônios MAP2+, e inibir a proliferação de células de nó linfático ativadas com ConA. Capacidade de diferenciação e autorrenovação de NSC: neuroesferas inicialmente culturadas em meios contendo FGF/EGF foram plaqueadas em tampas de vidro revestidas com poli-D-lisina (PDL) deixadas proliferar e então coletadas e tratadas por uma hora com tampão (controle) ou tratamento enzimático com FTVI (60 mU/mL), subsequentemente as BT-NSCs e GPS-NSCs resultantes foram plaqueadas em uma densidade clonal de 20 células por µl e deixadas proliferar como neuroesferas por 96 horas até 5 dias. Imagem de neuroesfera foi capturada com um microscópio Axiovision (NY). Para diferenciação neuronal, de astrócito e oligodendrócitos, neuroesferas dissociadas foram plaqueadas em tampas de vidro revestidas com PL em uma placa de 24 cavidades e culturadas sem FGF/EGF, mas na presença de meio neurobasal contendo Glutamax 1%, Antibiótico/Antimicótico 1% e B27-Suplemento 2%. Meio fresco foi adicionado dia sim dia não até o dia 5 e as células foram então submetidas a tingimento com imunofluorescência com MAP2 (neurônios), GFAP (astrócitos) e NG2 (precursores de oligodendrócito). Células MAP2+, GFAP+ e NG2+ foram contadas usando técnica estereológica padrão por um investigador cego para os tratamentos. Coculturas de Células-tronco Neurais e Células de Nó Linfático: nós linfáticos foram isolados de camundongos C57BL/6. Células de nó linfático (LNC) foram culturadas como suspensões de célula única em uma placa de 96 cavidades a 2x105 células por cavidade, como anteriormente descrito (Einstein, O., Fainstein, N. e outros, 2007). Meio de cultura consistia em RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal 10%, L-glutamina, piruvato de sódio, aminoácido não essencial, 2-mercaptoetanol, HEPES e antibióticos (BioWhittaker) com 2,5 µg/ml de concanavalina A (ConA, Sigma) ou sem. Neuroesferas foram dissociadas e foram primeiro ou tratadas com GPS ou não (BT) e subsequentemente irradiadas com 3.000 Rad. Seguindo irradiação, as NSCs dissociadas foram então adicionadas diretamente ao meio de cultura de LNC em razões diferentes com LNCs estimuladas com ConA. As razões testadas de números de NSCs para números de LNCs foram: 1:4, 1:2, 1:1, 2:1 e 4:1. As células foram então culturadas por 48 horas antes da adição de timidina. Ensaios de incorporação de timidina foram realizados 16 horas depois.

[00304] Avaliação de ligantes de E-selectina seguindo tratamento de NSCs com citocinas inflamatórias:1,5x106 células/cavidade foram semeadas em uma placa de 6 cavidades contendo 3 ml de meio de proliferação por cavidade e estimuladas ou com 10 ng/ml de TNFa (R&D; 410-TRNC), 10 ng/ml de IL-1ß (R&D; 401ML), 10 ng/ml IFNY (R&D; 485-MI) independentemente ou em combinação (todos os três a 10 ng/ml). Após 24 horas e 48 horas, as neuroesferas foram coletadas através de centrifugação e tingidas com E-Ig para análise citométrica de fluxo.

[00305] Medição de mRNA de LIF: 1x106 NSCs embriônicas de camundongo foram tratadas por 24 horas com ou sem citocinas inflamatórias (IFN-Y a 10 ng/ml e TNF-a a 15 ng/ml). RNA total foi então extraído usando reagente Trizol e a qualidade do RNA extraído foi medida usando Agilent 2200 Tab station system. Síntese de cDNA foi feita usando estojo de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems) e um Random Hexamer. O nível de mRNA foi medido usando RT-PCR e a razão de vezes em expressão de gene foi calculada usando método 2-??CT. A sequência de primer avançado para o gene LIF foi CCTACCTGCGTCTTACTCCATCA e o primer reverso foi CCCCAAAGGCTCAATGGTT (Sigma). A expressão relativa de mRNA de LIF foi ensaiada em relação ao gene de manutenção GAPDH onde TGCAAAACCAACTGCTTAGC foi usado como um primer avançado e GGCATGGACTGTGGTCATGAG como primer reverso.

[00306] Análise de migração de NSC para o SNC: BT-NSCs, GPS- NSCs foram marcadas com corante PKH26 (Invitrogen) e injetadas intravenosamente em camundongos C57BL6 tratados com MOG no dia 9 e no dia 13 pós-imunização (PI). Um milhão de NSCs foi injetado em cada camundongo em cada dia. Tampão de HBSS sozinho foi usado para determinar sinais de base. Ou 24 horas ou 4 dias após a segunda transferência de NSC, os camundongos foram sacrificados, perfundidos e os cordões espinhais lombo-sacrais foram coletados. O cordão espinhal foi escolhido porque no modelo B6, as lesões do SNC no cérebro anterior são muito variáveis em tamanho e localização comparado com os cordões espinhais, que possuem uma localização mais previsível (região lombossacral) e também patologia mais exuberante (Chitnis, T., Najafian, N. e outros, 2001; Rasmussen, S., Wang, Y. e outros, 2007; Wang, Y., Imitola, J. e outros, 2008). Para análise citométrica de fluxo, os cordões espinhais foram então homogeneizados e os peletes resultantes foram ressuspensos em Tripsina-EDTA 0,25% e incubados a 37°C por 10 minutos. O processo de digestão foi parado usando DMEM contendo SBTI 0,01%, DNase 0,001% e BSA 0,075%. Para análise histológica, o cérebro e o cordão espinhal foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C até seccionamento. As seções de criostato (20 µm) de cordão espinhal lombo-sacral ou cérebro anterior, médio e posterior foram fixadas e então tingidas com anticorpos de interesse. Os vasos sanguíneos foram visualizados através de anti-Flk-1 (VEGFR2) e NSCs foram tingidas ou com anti-SOX-2 ou visualizadas através de corante PKH26 em vermelho. Para análise de neuropatologia, quantificação celular foi realizada através de análise estereológica de animais em grupos diferentes. Os cordões espinhais e o cérebro foram seccionados e cada terceira seção das regiões cervical e lombossacral foi tingida, a quantificação celular foi realizada em ampliação de alta potência de 3-5 seções. Microscópio confocal LSM 510 com estágio motorizado foi usado para calcular esterologicamente a intensidade de tingimento e os números de célula totais/por ampliação de alta potência.

[00307] Análise estatística - os dados são expressos como a média ± SEM. Significância estatística de diferenças entre médias foi determinada através de ANOVA de duas vias. Se as médias forem mostradas ser significantemente diferentes, comparações múltiplas foram realizadas post-hoc através do teste t de Turkey. Significância estatística foi definida como p<0,05. REFERÊNCIAS - EXEMPLO 7 Alam HB, Sun L, Ruff P, Austin B, Burris D, Rhee P. 2000. E- and P- selectin expression depends on the resuscitation fluid used in hemorrhaged rats. The Journal of surgical research, 94: 145-152. Alon R, Feizi T, Yuen CT, Fuhlbrigge RC, Springer TA. 1995. Glycolipid ligands for selectins support leukocyte tethering and rolling under physiologic flow conditions. Journal of immunology, 154:5356-5366. Back SA, Tuohy TM, Chen H, Wallingford N, Craig A, Struve J, LuoNL, Banine F, Liu Y, Chang A e outros. 2005. Hyaluronan accumulates in demyelinated lesions and inhibits oligodendrocyte progenitor maturation. 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Claims

1. Uso de uma população de células-tronco mesenquimais (MSCs) modificadas com fucosiltransferase VI (FTVI) que expressa o ligante de E-/L-selectina de Célula Hematopoiética (HCELL), caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar diabetes, em que o uso ocorre coincidente com expressão de E- selectina em células endoteliais dentro do tecido alvo e/ou coincidente com acúmulo de leucócitos dentro do tecido alvo.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo está inflamado e/ou danificado.

3. Uso, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a administração é (i) eficaz para aumentar a distribuição de células no tecido alvo do indivíduo e/ou (ii) eficaz para aumentar a acomodação, colonização ou enxerto do tecido alvo do indivíduo.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a referida administração ocorre coincidente com a expressão de E-selectina em células endoteliais e infiltrados de leucócitos com L-selectina dentro do tecido alvo ou em que a referida administração ocorre durante a infiltração de leucócitos no tecido inflamado e/ou danificado.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida administração ocorre por via intravenosa, por injeção direta ou colocando a população de células no tecido alvo.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida administração compreende uma ou uma série de injeções da população de células ou em que a referida administração compreende injeções diárias, semanais, quinzenais, mensais ou anuais da população de células.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida administração é eficaz para atingir um efeito imunomodulador dentro do tecido alvo inflamado e/ou danificado no indivíduo, e em que o uso compreende ainda uma ou mais administrações adicionais da população de células após uma diminuição do efeito imunomodulador de uma administração anterior da população de células, em que o efeito imunomodulador é alcançado pela colonização de células dentro do tecido inflamado e/ou danificado.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a população de células é utilizada em combinação com outros agentes de potencialização, agentes anti- inflamatórios ou com bases de tecido/dispositivos transplantáveis/géis.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a população de células compreende células da medula óssea.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano, primata não humano, camundongo, rato, cachorro, gado, cavalo ou vaca, de preferência um humano.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que: a população é administrada sistemicamente, através ou de acesso vascular periférico ou acesso vascular central, ou a população é administrada intravascularmente a vasos alimentadores anatômicos de um sítio de tecido pretendido usando abordagens à base de cateter ou outros dispositivos de acesso vascular que administrarão um bolo vascular de células ao sítio pretendido, ou a população é administrada diretamente a cavidades corporais ou através de abordagens à base de cateter ou injeção direta, ou a população é administrada por injeção a tecido local direta, usando ou abordagens intravasculares ou abordagens percutâneas ou diretamente em sítios de tecido anatomicamente acessíveis e/ou guiado por técnicas de imagem, ou a população é administrada em bases ou incrustradas em bases postas em tecidos e/ou administrada em géis e/ou administradas junto com agentes potencializadores.