KR102567330B1

KR102567330B1 - 매듭풀 함유 식물혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102567330B1
Application number: KR1020230080747A
Authority: KR
Inventors: 김인성; 문은정; 강준철; 김남주; 윤유경
Original assignee: (주)더마랩
Priority date: 2023-06-23
Filing date: 2023-06-23
Publication date: 2023-08-17

Abstract

본 발명은 매듭풀(Kummerowia stipulacea), 레드신코나나무(Cinchona pubescens) 및 마누카(Leptospermum scoparium) 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 혼합추출물은 세포생존률에는 영향을 미치지 않으면서 보습 및 피부장벽기능 관련 인자의 유전자 발현 증가, 콜라겐 합성 관련 인자의 유전자 발현 증가, 콜라겐 분해 효소의 활성 억제, 콜라겐 합성 관련 인자의 유전자 발현 증가, 피지 생성 관련 인자의 유전자 발현 감소, 진피치밀도 증가, 모공의 크기 및 개수 감소에 우수한 효과를 가지고 있어, 피부 보습 및 진피 치밀도 증대, 피부탄력, 피지억제 및 모공개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

매듭풀 함유 식물혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising plant complex extract containing Kummerowia striata extract as an active ingredient}

본 발명은 매듭풀(Kummerowia striata) 함유 식물혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 매듭풀(Kummerowia striata), 레드신코나 나무(Cinchona pubescens) 및 마누카(Leptospermum scoparium)의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 보습, 진피 치밀도 증대, 피부탄력, 피지억제 및 모공개선 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

인체의 최외각에 위치하는 피부는 인체의 경계면에서 건조한 대기, 자외선, 미생물, 화학적 및 물리적 자극 등 외부 환경요인으로부터 개체를 보호하는 장벽기능을 한다. 피부조직은 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성된다. 이중 가장 외부에 존재하는 표피의 각질층은 각질세포와 피부지질로 구성되며, 피부지질 중에서도 각화세포(Keratinocytes)가 분화되며 생성되는 지질은 각질세포간의 공간을 채워 세포간의 결합력을 부여하여 피부장벽기능을 담당한다.

또한, 피부표피의 각질세포에서 발현되는 filaggrin(FGN)과 hyaluronan shynthase-1(HAS-1)에 의해 생성되는 히알루론산(hyaluronic acid)은 피부의 천연 보습인자로 피부의 보습능력을 평가하는 대표적인 지표로 사용되는데, 이는 표피층에서 수분을 잡아두는 기능을 유지 시켜 수분을 잡아두는 중요 기질이다.

주름은 근육이 오랜 기간 동안 특정 방향으로의 반복적인 움직임에 따라 형성되는데, 피부 노화, 물리적인 외부환경, 자외선 조사 등에 영향을 받는다. 이러한 인자들에 의해 발생한 피부 세포의 손상은 진피 매트릭스를 구성하는 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴의 생성이 원활하지 못하게 만들고, 이로 인해 매트릭스의 견고성이 떨어져서 피부의 탄력이 떨어지고 주름이 생성되는 일련의 과정이 일어난다.

모공(hair follicle)은 털이 자라나는 구멍으로 지름은 대략 0.02~0.05㎜ 정도이며, 피지선과 연결되어 있어 피지선에서 생성되는 피지가 모공을 통해 표피로 분비된다. 모공에서 분비되는 피지는 세균 감염 등 외부 인자로부터 피부를 보호하고 피부를 촉촉하게 하는 기능을 한다. 피지샘이 커지고 피지의 분비가 많아지면 외부로 배출되는 과정에서 피지가 모공 안에서 정체되면서 피지가 모공을 더욱 넓히기도 한다. 또한, 피부의 노화는 모공을 지지하는 역할을 하는 콜라겐 섬유와 탄력섬유의 변성 또는 감소에 영향을 주고, 이에 모공을 지지해 주는 힘이 부족하게 되면서 모공은 자연스럽게 넓어진다.

본 발명자들은 피부 보습, 피부 주름개선, 피부장벽 강화 및 모공을 축소 시키는 천연물 유래의 새로운 화장료를 개발하고자 하였으며, 스크리닝을 통해 최종적으로 매듭풀, 레드신코나 나무껍질과 마누카 잎을 선택하였다. 이들을 혼합하여 추출할 경우 피부 보습, 진피 치밀도 증대, 피부 탄력개선, 피지억제 및 모공개선에 있어서 유효한 효과가 나타나는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 공개특허 제10-2015-0144137호 (2015.12.24) (0002) 대한민국 공개특허 제10-2021-0140845호 (2021.11.23) (0003) 대한민국 등록특허 제10-2369110호 (2022.02.24)

본 발명은 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 보습, 피부장벽 강화, 진피 치밀도 증대, 피부 탄력개선, 피지억제 및 모공축소 활성을 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10.0 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

바람직하게는, 상기 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물은 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎이 각각 6~8:1~3:1의 중량비율로 혼합되어 제조되는 것이다.

상기 혼합추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출되어 제조된다.

상기 화장료 조성물은 피부 보습, 피부장벽 강화, 피부 주름 및 탄력개선, 피지 생성 억제 또는 모공 축소용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 매듭풀 함유 식물혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 천연 식물추출물을 함유하여 안전하며, 그 상승작용에 의하여 우수한 피부 보습, 진피 치밀도 증대, 피부 탄력개선, 피부장벽강화, 피지 생성 억제 및 모공축소 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물의 피지 생성 관련 유전자 발현 감소효과를 나타내는 것이고,
도 2는 발명의 일 실시예에 따른 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물의 진피 치밀도 증가 효과를 나타내는 것이고,
도 3 및 도 4는 발명의 일 실시예에 따른 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물의 모공 축소 효과를 나타내는 것이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

매듭풀(Kummerowia striata)은 콩과(Fabaceae) 매듭풀속(Kummerowia)의 식물로 우리나라 전역의 산, 들, 길가 등에서 자생하는 한해살이풀이다. 식물 하부에서 가지가 많이 갈라지며, 줄기의 높이는 10~30 ㎝로 줄기 밑에 밑을 향하는 잔털이 있다. 잎은 어긋나며, 3장의 작은잎으로 구성된 겹잎이다. 작은잎은 긴 도란형이다. 꽃은 8~9월에 잎겨드랑이에서 1~2개씩 개화하며, 연한 홍색이다. 꽃잎은 길이 5㎜쯤으로 꽃받침보다 2배가량 길며, 폐쇄화에는 꽃잎이 없다. 꽃받침은 짧은 털이 있으며 끝이 5갈래로 갈라진다. 열매는 협과이며 난형으로 씨가 1개씩 들어 있다(국립생물자원관, 2016).

레드신코나나무(Cinchona pubescens)는 기나나무속(Cinchona)의 상록 교목 또는 관목이다. 남아메리카의 볼리비아와 페루의 안데스 산맥 동쪽 해발고도 1,200~3,600m의 고원지를 원산으로 높이는 25m에 달한며, 열대지방에 주로 분포한다. 꽃은 방사대칭이며 원추꽃차례로 가지 끝에 피며, 잎은 타원형으로 마주나며 두텁고 잎자루가 있으며 톱니는 없다. 나무껍질에 알칼로이드의 일종인 키니네를 함유하고 있다.

마누카(Leptospermum scoparium)는 도금양과(Myrtaceae)의 다작의 상록 교목 또는 관목이다. 호주와 뉴질랜드를 원산으로 높이는 2~5m이며 최대 15m까지 생장하고 가지가 빽빽하게 난다. 꽃은 흰색 또는 분홍색으로 5개의 꽃잎을 가진다. 잎은 피침형으로 길이 7~20㎜, 너비 2~6㎜로 작으며 엽병은 없다.

본 발명에 따르면 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10.0 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물은 다음과 같이 제조된다. 먼저 건조된 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎을 혼합한다. 이때, 바람직하게는 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎을 각각 6~8:1~3:1의 중량비율로 혼합한다. 이때, 매듭풀은 전초, 뿌리, 꽃, 잎 및 줄기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 사용될 수 있다.

이어서 상기 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매를 가하여 통상의 방법에 따라 추출 및 여과하여 추출물을 제조한다.

추출 원물인 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎을 혼합하여 추출할 수도 있고, 각각의 추출물을 제조한 후 혼합할 수도 있다.

이와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎을 혼합하여 추출물을 제조하는 경우, 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 또는 마누카 잎을 단독으로 추출한 추출물의 경우에 비해 같은 용량에서 피부 보습, 주름 및 탄력 개선, 피부장벽 강화, 피지 생성 억제, 모공개선 효능이 더욱 우수하였다. 따라서 이들을 혼합할 시 피부기능 개선 효과에 있어서 상승작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명의 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물은 피부유래 세포주의 생존률에 영향을 미치지 않으면서(시험예 1), 상승작용에 의하여 피부보습 및 피부장벽 기능과 관련된 인자의 유전자 발현을 증가시켰으며(시험예 2), 콜라겐 분해 효소의 활성을 억제하고(시험예 3), 콜라겐 생합성과 관련된 인자의 유전자 발현을 증가시켰다(시험예 4). 또한, 피지 생성과 관련된 유전자 인자의 발현을 감소시켰으며(시험예 5), 진피치밀도를 증가시켰고(시험예 6), 모공축소 효과로서 모공의 개수와 크기를 감소시키는 것을 확인하였다(시험예 7).

이 혼합추출물은 세럼 및 크림제형에 적용하였을 때 실온, 냉장, 항온 조건에서 제형안정성을 나타내었다(시험예 8). 그러므로 상기 화장료 조성물은 피부 보습, 피부 주름 및 탄력개선, 피부장벽 강화, 피지 생성 억제 및 모공축소용 화장품으로 유용하게 사용될 수 있다.

유효성분으로서 상기 혼합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10.0 중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1 ~ 3: 매듭풀, 레드신코나 나무껍질, 마누카 잎 추출물의 제조

건조된 매듭풀, 레드신코나 나무껍질, 마누카 잎에 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 1일간 실온에서 방치하여 상등액을 분리하고, 획득한 상등액을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150 mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 1 ~ 24: 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물의 제조

건조된 매듭풀, 레드신코나 나무껍질, 마누카 잎을 하기 표 1의 중량비로 혼합한 혼합물에 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

중량비	매듭풀	레드신코나 나무껍질	마누카 잎
실시예 1	6	1	-
실시예 2	7	1	-
실시예 3	8	1	-
실시예 4	6	2	-
실시예 5	7	2	-
실시예 6	8	2	-
실시예 7	6	3	-
실시예 8	7	3	-
실시예 9	8	3	-
실시예 10	6	-	1
실시예 11	7	-	1
실시예 12	8	-	1
실시예 13	-	1	1
실시예 14	-	2	1
실시예 15	-	3	1
실시예 16	6	1	1
실시예 17	7	1	1
실시예 18	8	1	1
실시예 19	6	2	1
실시예 20	7	2	1
실시예 21	8	2	1
실시예 22	6	3	1
실시예 23	7	3	1
실시예 24	8	3	1

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

세포 독성 여부를 확인하기 위해 인간 각질세포주인 HaCaT를 10% FBS (fetal bovne serum)를 첨가한 DMDM 배지에 배양하였으며 96 well plate에 1×10⁵의 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 추출물을 시료농도가 0.01, 0.1, 1% 가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎖씩 첨가한 후(3 ㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 ㎕의 디메틸 설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

구분	세포 생존율(%)
구분	0%	1%	2%
제조예 1	100	100	98
제조예 2	101	102	101
제조예 3	103	100	97
실시예 1	102	102	101
실시예 2	102	100	96
실시예 3	100	99	102
실시예 4	99	101	100
실시예 5	99	97	98
실시예 6	99	101	97
실시예 7	102	102	97
실시예 8	102	100	97
실시예 9	100	100	102
실시예 10	103	99	98
실시예 11	100	99	102
실시예 12	101	97	99
실시예 13	98	103	98
실시예 14	100	101	100
실시예 15	101	100	96
실시예 16	97	98	97
실시예 17	100	100	99
실시예 18	101	100	102
실시예 19	102	101	97
실시예 20	100	98	102
실시예 21	97	98	102
실시예 22	101	97	98
실시예 23	103	99	100
실시예 24	103	98	102

상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 매듭풀 추출물, 레드신코나 나무껍질 추출물, 마누카 잎 추출물 및 이들의 혼합추출물 모두 HaCaT 세포주에서 95% 이상의 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에 영향을 미치지 않으며 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: 피부 보습 및 피부장벽강화 관련 유전자 발현 증가효과 확인

세포는 인간 유래 각질형성세포(Keratinocyte, HaCaT)를 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), penicillin(100 IU/ml) 및 streptomycin(100 ug/ml)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 6 well plate에 세포를 1×10⁶ cells/well 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. UV lamps 를 이용하여 UVB 144 mJ/cm² 을 조사하고, 농도별로 시료를 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 6시간 배양하였다.

배지를 제거한 후 Trizol reagent(Invitrogen)를 사용하여 RNA를 추출하고 Chloroform을 가하여 Phenol 성분을 제거하였다. 상등액과 동량의 Isopropanol을 넣어 RNA를 침전시킨 뒤 알코올을 가하여 세척 및 건조하였다. 건조한 RNA에 Diethyl pyrocarbonate(DEPC) water 30㎕를 첨가한 후 260 nm / 280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 정량하였다. 분리한 동량의 RNA(2μg)로부터 Components mixture(Invitrogen)를 추가하여 cDNA를 합성하였다.

PCR Premix(Bioneer)에 합성된 cDNA와 Hyaluronan synthase-1(HAS-1) 및 Filaggrin(FGN) primer를 반응시킨 다음 T100 Thermal cycler(Bio Rad)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 Predenature, 95℃에서 45초 동안 Denature, 60℃에서 1분 동안 Annealing cycle, 72℃에서 45초 동안 Extension 과정을 30번 반복함으로써 증폭시킨 뒤, 72℃에서 10분 동안 Final extension을 시키고 4℃에서 반응을 종결, 보관하였다. 프라이머 이름 및 염기서열은 표 3과 같다.

증폭된 PCR 산물들은 TAE buffer를 전해질로 사용한 1.5% agarose gel을 이용하여 100V에서 30분 동안 전기영동 시킨 후 SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen)을 30분 동안 반응시켰다. UV(Davinch Chemi imager, Davinch K)하에서 mRNA 발현 정도를 관찰하였다. PCR 산물들을 이용한 전기영동의 band intensity는 Image J 프로그램을 사용하여 면적을 측정하였으며 그래프로 나타내었다. House keeping gene으로 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 사용하였다. HAS-1, FGN의 발현 증가율은 아래의 식에 따라 계산하였고 그 결과는 하기의 표 4, 표 5에 나타내었다.

mRNA 발현율(%)=(시료첨가군의 mRNA 발현양/ 대조군의 mRNA 발현양)×100

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Forward : GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
GAPDH	Reverse : ATGGTGGTGAAGACGCCAGT
HAS-1	Forward : CCACCCAGTACAGCGTCAAC
HAS-1	Reverse : CATGGTGCTTCTGTCGCTCT
FGN	Forward : AGGGAAGATCCAAGAGCCCA
FGN	Reverse : ACTCTGGATCCCCTACGCTT

구분	HAS-1 발현 증가율(%)
구분	1%	2%
제조예 1	6	12
제조예 2	4	9
제조예 3	5	10
실시예 1	11	18
실시예 2	14	21
실시예 3	14	21
실시예 4	12	19
실시예 5	13	19
실시예 6	13	19
실시예 7	12	18
실시예 8	10	16
실시예 9	10	19
실시예 10	14	21
실시예 11	15	21
실시예 12	17	23
실시예 13	10	17
실시예 14	11	17
실시예 15	13	19
실시예 16	21	30
실시예 17	23	32
실시예 18	30	40
실시예 19	19	27
실시예 20	20	28
실시예 21	20	28
실시예 22	19	28
실시예 23	20	28
실시예 24	22	30

구분	FGN 발현 증가율(%)
구분	1%	2%
제조예 1	13	15
제조예 2	12	13
제조예 3	11	12
실시예 1	16	17
실시예 2	16	18
실시예 3	19	21
실시예 4	17	19
실시예 5	23	24
실시예 6	24	26
실시예 7	24	26
실시예 8	22	23
실시예 9	17	19
실시예 10	27	29
실시예 11	28	29
실시예 12	28	30
실시예 13	24	26
실시예 14	23	25
실시예 15	23	25
실시예 16	37	40
실시예 17	40	43
실시예 18	47	51
실시예 19	37	40
실시예 20	37	40
실시예 21	36	39
실시예 22	39	42
실시예 23	40	43
실시예 24	41	44

상기 표 4 및 표 5에서 확인되는 바와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 또는 마누카잎 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 혼합추출물인 실시예에서 우수한 HAS-1, FGN의 발현 증가율을 나타내었으며, 특히 실시예 16~24에서 더욱 우수한 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 실시예 18이 가장 효과가 우수하였다.

시험예 3: MMP-1 활성 억제 효과 확인

세포는 human dermal fibroblasts adult(HDFa)를 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 6 well plate에 세포를 3×10⁴ cells/well 농도로 분주하고, 37℃, 5 % CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다.

배지를 제거한 후 PBS로 2회 세척하고 1 ml의 PBS 추가한다. plate의 뚜껑을 닫고 UV lamps를 이용하여 UVB 144 mJ/cm² 을 조사하였다. PBS를 제거하고 DMEM 배지에 선행한 세포 독성 시험의 결과에 따라 독성이 없는 것으로 판단된 4가지 농도로 시료를 처리하고 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 72시간 후 배양액을 취하여 정량용 완충액 100 ㎕를 well에 넣은 다음 각각 희석한 배양액 및 표준액을 각 100 ㎕를 넣고 상온에서 2시간 배양하였다. well에서 배양액을 제거한 다음 세척용 완충액 400 ㎕로 2회 씻어내었다. Substrate Solution 100 ㎕를 넣고 상온에서 2시간 반응시킨 다음 세척용 완충액 400 ㎕로 2회 씻어내었다. Streptavidin HRP 희석액 100 ㎕를 넣고 상온에서 20분 반응시킨 다음 PBS 400 ㎕로 3회 씻어내었다 Substitude Solution 100 ㎕를 넣고 상온에서 20분간 반응시켰다. Stop Solution 50 ㎕를 넣고 완전히 섞이도록 plate를 가볍게 두드린 후 450 nm 파장에서 SPARK Microplate Reader로 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 6에 나타내었다.

MMP-1 억제율(%)=100 - (UV + Sample의 MMP-1 분비량/ UV + 무처리군의 MMP-1 분비량 × 100)

구분	MMP-1 억제율(%)
구분	1%	2%
제조예 1	2	3
제조예 2	1	2
제조예 3	1	4
실시예 1	4	6
실시예 2	2	6
실시예 3	4	7
실시예 4	3	7
실시예 5	3	6
실시예 6	3	5
실시예 7	2	4
실시예 8	2	5
실시예 9	2	4
실시예 10	4	7
실시예 11	3	7
실시예 12	2	4
실시예 13	3	6
실시예 14	3	6
실시예 15	3	5
실시예 16	3	7
실시예 17	3	7
실시예 18	6	12
실시예 19	3	7
실시예 20	3	7
실시예 21	5	10
실시예 22	5	10
실시예 23	4	8
실시예 24	5	9

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 또는 마누카 잎 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 혼합추출물인 실시예에서 우수한 MMP-1 분비 억제율을 나타내었으며, 특히 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎의 혼합추출물인 실시예 16~24에서 더욱 우수한 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

시험예 4 : 콜라겐 생합성 관련 유전자 발현 증가효과 확인

Human dermal fibroblasts adult(HDFa)를 10% fetal bovine serum(FBS) 과 1% penicillin streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 48 well plate에 세포를 3×10⁴ cells/well 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 배지를 교체한 후 시료를 농도별(0, 1, 2%)로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양하였다. 양성대조군으로 transforming growth factor beta 1(TGF-β1) 10 ng/mL을 사용하였다. UV lamps 를 이용하여 UVB 144 mJ/cm² 을 조사하여 세포에 스트레스를 주었다.

시험에는 Procollagen type I peptide EIA kit(Takara Biomedical Co., Japan)를 사용하였으며, Anti body PoD conjugate solution 100 ㎕를 넣은 다음 Sample 및 Standard solution 20 ㎕를 넣고 37℃에서 3시간 배양하였다. Substrate solution TMBZ; 3,3', tetramethylbenzidine 100 ㎕를 넣은 뒤 상온에서 15분간 배양하였다. 이후 Stop solution(1N H2SO4) 100 ㎕을 넣고 SPARK Microplate Reader (TECAN, Austria)로 450 nm에서 측정하였다. 그 결과는 표 7에 나타내었다.

Procollagen Type Ⅰ secretory activity(%)=[(Sample 처리군의 Collagen 분비량 / 무처리군의 Collagen 분비량) × 100] - 100

구분	Procollagen Type Ⅰ secretory activity(%)
구분	1%	2%
제조예 1	4	6
제조예 2	2	3
제조예 3	3	5
실시예 1	7	9
실시예 2	7	8
실시예 3	7	8
실시예 4	6	8
실시예 5	7	9
실시예 6	7	8
실시예 7	6	7
실시예 8	5	6
실시예 9	5	7
실시예 10	4	5
실시예 11	5	6
실시예 12	5	7
실시예 13	2	3
실시예 14	3	4
실시예 15	3	5
실시예 16	8	11
실시예 17	9	12
실시예 18	11	15
실시예 19	8	10
실시예 20	9	11
실시예 21	9	11
실시예 22	9	12
실시예 23	8	10
실시예 24	9	11
TGF-β1	36

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 또는 마누카잎 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 혼합추출물인 실시예에서 보다 우수한 콜라겐 생합성 관련 유전자 발현 증가효과를 나타내었다.

시험예 5 : 피지 생성 관련 유전자 발현 감소효과 확인

세포는 인간 유래 각질형성세포(Keratinocyte, HaCaT)를 사용하였다. 세포를 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 6 well plate에 세포를 5×10⁶ cells/well 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 배양하였다. 배지를 교체한 후 시료를 농도별(0, 1, 2%)로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포는 RNeasy^® Plus Mini Kit를 이용하여 RNA를 추출하고, cDNA Synthesis Kit를 이용하여 cDNA를 확보하였다. 이후, AccuPower Multiplex PCR PreMix를 사용하여 PCR을 하고, gel에 분주하여 20분간 100V로 전기영동을 진행한다. 이후 PSRemote system을 이용하여 측정하고, Image J를 사용하여 정량하였다. SRD5A2의 발현 감소는 아래의 식에 따라 계산하였고 그 결과는 하기의 표 8에 나타내었다.

DNA 발현율(%)=(시료첨가군의 DNA 발현양/ 대조군의 DNA 발현양) × 100

구분	DNA 발현율(%)
구분	1%	2%
제조예 1	97	96
제조예 2	98	96
제조예 3	99	98
실시예 1	98	94
실시예 2	95	90
실시예 3	98	96
실시예 4	98	96
실시예 5	96	93
실시예 6	98	93
실시예 7	95	91
실시예 8	95	91
실시예 9	98	96
실시예 10	98	94
실시예 11	97	95
실시예 12	98	96
실시예 13	96	91
실시예 14	95	93
실시예 15	97	93
실시예 16	95	91
실시예 17	97	91
실시예 18	95	87
실시예 19	97	90
실시예 20	96	88
실시예 21	95	89
실시예 22	93	83
실시예 23	97	92
실시예 24	97	92

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 또는 마누카잎 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 혼합추출물인 실시예에서 보다 우수한 피지생성 억제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 실시예 18~22에서 더욱 우수한 효능을 나타내었다. 그 중에서도 실시예 22의 혼합추출물 시료에서 가장 효과가 우수하였다(도 1).

시험예 6 : 진피치밀도 증가효과 확인

본 발명의 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 또는 마누카 잎 각각의 추출물인 제조예와 이들 혼합추출물의 진피치밀도 개선효과에 대한 임상시험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

진피 치밀도는 매일 아침, 저녁으로 2회씩 3주간 추출물을 안면에 도포하고, Dermalab Ultrasound probe를 사용하여 20 MHz의 초음파로 인체 적용 시험대상자의 안면 도포 부위를 수직으로 probe를 접촉하여 값이 읽히는 동안 수평을 유지시키면서 skin thickness값을 측정하였다. 측정 결과는 Dermalab USB 전용 분석 프로그램 Application software version 1.09를 이용하여 이미지 및 skin thickness 값(㎛)을 확보하였다. 그 결과는 표 9에 나타내었다.

진피치밀도 증가율(%) = (제품 사용후 측정값 - 제품 사용전 측정값 / 제품 사용 전 측정값) × 100

구분	진피치밀도 증가율(%)
구분	1%	2%
제조예 1	2	4
제조예 2	1	3
제조예 3	1	2
실시예 1	3	4
실시예 2	5	6
실시예 3	2	4
실시예 4	4	5
실시예 5	3	5
실시예 6	5	6
실시예 7	4	6
실시예 8	5	6
실시예 9	3	5
실시예 10	4	5
실시예 11	5	7
실시예 12	3	4
실시예 13	2	4
실시예 14	3	5
실시예 15	5	6
실시예 16	7	8
실시예 17	5	7
실시예 18	10	14
실시예 19	7	9
실시예 20	6	8
실시예 21	8	11
실시예 22	8	10
실시예 23	6	7
실시예 24	7	8

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 또는 마누카 잎 각각의 추출물인 제조예보다 이들의 혼합추출물인 실시예에서 우수한 진피치밀도 증가율을 확인할 수 있었으며, 특히 실시예 18~22에서 더욱 우수한 효능을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 실시예 18이 가장 효과가 우수하였다(도 2).

시험예 7 : 모공축소 효과 확인

모공축소 효과를 확인하기 위해 모공크기 및 개수 감소에 대한 임상시험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

모공축소 평가는 매일 아침, 저녁으로 2회씩 3주간 추출물을 안면에 도포하고, visioface와 PC35를 이용하여 측정하였다. 모공개수는 visioface기기로 인체 적용 시험대상자의 전체 얼굴을 촬영하여 측정하였고, 모공크기는 PC35기기로 probe를 시험대상자의 눈과 코가 수직으로 만나는 지점의 볼 부위를 측정하였다. 모든 측정 결과는 CSI(Complete skin investigation) 프로그램을 이용하여 이미지와 백분율(%)로 분석하였으며, 이를 도포 이전과 비교평가 하였다. 그 결과는 하기 표 10, 표 11에 나타내었다.

모공개수 감소율(%) = (제품 사용후 측정값 - 제품 사용전 측정값 / 제품 사용 전 측정값) × 100

모공크기 감소율(%) = (제품 사용후 측정값 - 제품 사용전 측정값 / 제품 사용 전 측정값) × 100

구분	모공개수 감소율(%)
구분	1%	2%
제조예 1	2	3
제조예 2	2	3
제조예 3	1	3
실시예 1	3	4
실시예 2	3	5
실시예 3	2	3
실시예 4	2	4
실시예 5	4	6
실시예 6	4	5
실시예 7	4	5
실시예 8	2	4
실시예 9	3	5
실시예 10	4	6
실시예 11	2	4
실시예 12	3	4
실시예 13	4	5
실시예 14	2	4
실시예 15	2	3
실시예 16	4	6
실시예 17	5	7
실시예 18	4	7
실시예 19	4	7
실시예 20	5	8
실시예 21	5	8
실시예 22	6	10
실시예 23	4	7
실시예 24	5	8

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물인 실시예에서 보다 높은 모공개수 감소율을 나타내었다. 그 중에서도 실시예 22의 효과가 가장 우수하였다(도 3).

구분	모공크기 감소율(%)
구분	1%	2%
제조예 1	2	3
제조예 2	1	2
제조예 3	1	3
실시예 1	7	9
실시예 2	5	8
실시예 3	4	6
실시예 4	5	9
실시예 5	5	9
실시예 6	6	9
실시예 7	4	8
실시예 8	5	8
실시예 9	5	7
실시예 10	6	8
실시예 11	4	7
실시예 12	4	8
실시예 13	7	9
실시예 14	5	7
실시예 15	7	9
실시예 16	8	12
실시예 17	9	13
실시예 18	10	16
실시예 19	9	13
실시예 20	10	14
실시예 21	8	14
실시예 22	13	21
실시예 23	8	14
실시예 24	10	15

상기 표 11에서 확인되는 바와 같이 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물인 실시예 16~24에서 더욱 우수한 모공 크기 감소 효능을 나타내었다. 그 중에서도 실시예 22의 효과가 가장 우수하였다(도 4).

실시예 25 : 매듭풀, 레드신코나나무껍질 및 마누카잎 혼합추출물을 함유하는 세럼의 제조

상기 실시예 18과 22의 혼합추출물을 함유한 세럼을 하기의 표 12, 표 13의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카잎 혼합추출물(실시예 18)	2.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄 오일	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

원료	함량(중량%)
매듭풀, 레드신코나나무껍질 및 마누카잎 혼합추출물(실시예 22)	2.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄 오일	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

실시예 26: 매듭풀, 레드신코나나무껍질 및 마누카잎 혼합추출물을 함유하는 크림의 제조

상기 실시예 18과 22의 혼합추출물을 함유한 크림을 하기 표 14, 표 15의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
매듭풀, 레드신코나나무껍질 및 마누카잎 혼합추출물(실시예 18)	2.0
시어버터	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
미네랄 오일	10.0
디메치콘	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
세테아릴알코올	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지??400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.25
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

원료	함량(중량%)
매듭풀, 레드신코나나무껍질 및 마누카잎 혼합추출물(실시예 22)	2.0
시어버터	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
미네랄 오일	10.0
디메치콘	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
세테아릴알코올	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지??400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.25
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

시험예 8 : 제형안정도 확인

상기 실시예 25 및 26에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12 및 24주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인하였다. 결과는 표 16에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인(변색, 변취 및 분리)
	실시예 25		실시예 26
	세럼	크림	세럼	크림
실온(25℃)	0	0	0	0
냉장(4℃)	0	0	0	0
항온(50℃)	0	0	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

상기 표 16에서 나타낸 바와 같이 실시예 25 및 26의 세럼과 크림 제형 모두 25℃, 4℃ 및 50℃ 온도 조건하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

Claims

매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10.0 중량% 함유하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎 혼합추출물은 매듭풀, 레드신코나 나무껍질 및 마누카 잎이 각각 6~8:1~3:1의 중량비율로 혼합되어 제조되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출되어 제조되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부장벽 강화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 및 탄력개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피지 생성 억제용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 모공축소용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.