KR102561317B1 - 흰 전나무 추출물등을 포함하는 체내 축적 독소 및 노폐물 제거를 위한 해독작용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 식물유래 복합물을 유효성분으로 포함하는 체내 독소 제거 및 독소 축적에 인한 증상 개선용 건강기능식품 조성물 및 이를 이용한 건강기능식품은 우수한 항산화 효과 (DPPH 자유라디칼 소거능)과 당 독소 생성 억제와 당 독소 축적으로 인한 당뇨 및 당뇨합병증 원인 물질 제거 (알파 글루코시다아제 활성 억제) 효과가 있고, 알코올에 의해 손상된 간 세포 보호 뿐만 아니라 간 독소 제거 (Aldehyde Dehydrogenase, Alcohol Dehydrogenase 효소 활성 증가)효과가 있다.

Description

흰 전나무 추출물등을 포함하는 체내 축적 독소 및 노폐물 제거를 위한 해독작용 조성물{Detoxification composition for removing toxins and wastes accumulated in the body.}
본 발명은 흰 전나무를 유효성분으로 포함하는 식물유래 복합물의 체내 독소 제거 효과를 가지고 독소 축적으로 발생될 수 있는 여러 증상 개선할 수 있는 흰 전나무를 포함하는 식물유래 복합물을 유효성분으로 포함하는 체내 독소 제거 및 독소 축적으로 인한 증상 개선용 건강기능식품 조성물 및 이를 이용한 건강기능식품에 관한 것이다.
현대사회를 살아가는 사람들은 화학첨가물, 미세먼지, 환경호르몬, 공해물질, 의약품에 의한 독소, 비위생적 환경에 의한 독소 등 수많은 유해물질에 노출된 삶을 살아가고 있다. 이러한 유해물질이 체내 독소 형태로 배출되지 않고 지속적으로 축적될 경우 면역력을 떨어뜨리고 균형을 무너뜨려 신체기능을 망가뜨리고 삶의 질을 저하시키는 만성질환을 일으키게 된다.
독소 중에서 가장 핵심적인 산소독성, 즉 활성산소는 생명유지 과정에서 산소가 체내 여러 반응에 의해 생성되며 제거가 잘 이루어지지 않는 경우 체내 필수 성분인 단백질, 당, DNA 등에 손상을 일으켜 암, 심혈관 질환, 노화와 같은 증상을 유발한다. 체내에는 활성산소를 제거하기 위한 자연적인 장치로 과산화물제거효소(Superoxide dismutase, SOD), 글루타티온과산화효소(glutathione peroxidase,GPX), 카탈라아제(catalase, CAT), 글루타티온환원효소(glutathione reductase), 글루타티온-S-전달효소 (glutathione-S-transferase) 등이 존재하지만 체내 축적되는 독소를 모두 분해하기엔 한계가 있다. 최근에는 이를 보완하기 위해 항산화효과에 도움을 주는 음식들과 천연물 유래 황산화제에 대한 연구가 증가하고 있다.
당독소란 단백질과 당이 결합하며 발생되는 최종당화산물 (AGEs)을 의미한다. 최종당화산물은 단백질의 아미노기 (NH3+)와 당의 카르보닐기 (C=O)와 결합하는 반응의 산물로서 말 그대로 단백질 혹은 지방에 당이 비정상적인 공유 결합을 형성하여 "당화"된 물질이다. 이 반응은 무작위, 비가역적으로 일어나며 단백질의 구조를 변형시키고 제 기능을 수행하지 못하게 한다.
이러한 당 독소의 대표적인 특징은 체내에서 배출되지 못하고 축적되는 것이다. 실제로 당 독소는 혈관 콜라겐을 손상시켜 고혈압, 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 알츠하이머의 원인이 되기도 하며 특히, 혈관이 손상되기 쉬운 당뇨병 환자들에게는 치명적인 물질이다. 또한 당뇨 자체 뿐아니라 당뇨 합병증을 일으키는 주된 요인이 되기도 하는데, 혈액 중 적혈구 안에 있는 헤모글로빈에 당이 결합된 대표적인 최종당화산물인 당화혈색소(HbA1c)가 증가하면 세포에 필요한 산소를 공급해주지 못하여 합병증을 일으키기 때문이다.
대한당뇨병학회의 자료에 따르면 국내 성인 7명중 1명은 당뇨병 환자이지만 인슐린 조절을 위한 투약 이외에 당뇨합병증 예방을 위한 방법에는 한계가 있는 상황이다. 비인슐린 의존성 당뇨합병증 치료제의 경우 다당류를 단당류로 분해하는 효소인 알파-글루코시다아제(alpha-glucosidase)를 억제하여 탄수화물의 소화과정을 조절하는 아카보스(acarbose)가 존재하지만 사용자에 따라 복부팽만, 설사 등의 부작용이 보고되고 있기에 따라서 식후 혈당조절을 위한 보다 안전한 혈당강하제의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 당독소는 나이가 들수록 체내 축적량이 증가하며 노화를 유발하는 핵심인자로 피부주름, 치매, 관절염 등 노인성 질환과 밀접한 상관성이 있다. 이와 같이 당독소는 생애주기 동안 음식을 통해 흡수되고 체내에서 당과 단백질의 반응으로 생성되어 우리 건강에 지속적으로 영향을 미치는 요소이기에 실생활에서 이를 꾸준히 관리할 수 있는 물질의 개발이 필수적이다.
간은 우리 몸에서 해독을 담당하는 중요한 기관으로서 간이 독소에 노출되고 축적되면 다른 기관에까지 큰 문제를 일으킨다. 간 독소의 직접적인 원인 중 하나는 알코올이다. 알코올 섭취가 지속되었을 때 나타나는 대표적인 증상은 지방간이다. 지방간은 관리정도에 따라 얼마든지 회복 가능한 가역적인 특징이 있지만 이에 대한 마땅한 치료없이 음주가 이어진다면 간으로 염증 유발 세포들이 침투해와서 간염(hepatitis)이 발생하고 간이 점차 손상되며 비가역적 질병으로 전환된다. 간염이 반복되다 보면 간이 딱딱하게 굳는 간섬유화(fibrosis), 섬유화가 심해져 작은 덩어리인 결절이 발생하는 간경변증(cirrhosis), 더 이상 간이 제 기능을 못하는 간부전(liver failure)까지 순서대로 진행된다.
특히, 간은 손상 시 자각 증상이 없기 때문에 초기에 미리 관리하는 것이 가장 중요하다. 또한, 알코올은 간 뿐아니라 중추 신경계를 억제하고 점진적으로 뇌 기능을 저해하는 물질로서 뇌 활동에 영향을 미치는 중독 증상을 유발하고 신체의 조정력 결함과 행동 변화를 유발하기에 간의 해독능력이 떨어지면 신체 전반에 걸친 문제점이 발생한다.
간의 해독능력을 평가하기 가장 좋은 지표는 알코올 분해효소인 알코올 탈수소효소(Aldehyde Dehydrogenase, ADH)와 알데하이드 탈수소효소 (Alcohol Dehydrogenase, ALDH)이다. ADH는 간세포에 존재하며 NAD+의존적으로 에탄올을 아세트알데하이드로 전환시키는 역할을 한다. 이 때 발생되는 아세트알데하이드가 숙취를 유발하는 원인물질로 알려져있으며 이를 분해하는 효소가 바로 ALDH이다. ALDH는 아세트알데하이드가 아세트산염으로 전환되는 과정을 촉매하며 알코올로부터 유래되는 독소 분해에 핵심적인 역할을 한다.
이에 본 발명은 부작용이 거의 없는 천연물인 흰 전나무 또는 흰 전나무를 포함하는 식물유래 복합물의 항산화 효과와 당 독소, 간 독소 제거효과를 확인함으로써 흰 전나무 또는 흰 전나무를 포함하는 식물유래 복합물의 항산화성 조성물을 제공하고자 한다.
국내 공개특허번호 제10-2022-0080587호에는 우수한 피부 주름 개선 효과, 피부 탄력 개선 효과, 피부 가려움증 개선 효과, 또는 피부 보습 효과를 나타낼 수 있는 염에 의한 삼투압 및 분자 압축 탈수 공정을 이용하는 오크라의 추출방법 및 이에 의해 제조된 항노화용 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-2165239호에는 국내 자생 천연식물 유래로 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있으면서, 간보호 효능이 있어 간질환의 예방 및 치료와 간기능 개선 또는 숙취해소용 건강식품에 사용할 수 있는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 간보호 및 간기능 개선용 약학 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허번호 제10-2015-0072660호에는 잔대 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 잔대를 유효성분으로 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 조성물 또는 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허번호 제10-2021-0002378호에는 송화분 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 송화분을 유효성분으로 포함하는 간 질환 치료 또는 예방용 조성물 또는 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물에 관하여 개시하고 있다.
본 발명은 현대사회에서 발생하는 만성질환인 당독소와 간 독소 유래의 질병을 예방할 수 있도록 흰 전나무 또는 흰 전나무를 포함하는 식물유래 복합물의 간 독소 제거 및 간 건강건강기능식품 조성물 및 이의 건강기능식품을 제공하고자 한다.
본 발명의 실시예에 따르면 흰 전나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 체내 독소 축적억제 및 독소 제거용 건강기능 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 흰 전나무 추출물, 드레곤 헤드 추출물, 오크라 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 체내 최종당화산물(AGEs) 생성억제 및 제거용 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 흰 전나무 추출물, 드레곤 헤드 추출물, 오크라 추출물로 구성되는 건강식품 조성물에 있어서, 상기 조성물은 드레곤헤드 0.5~1 중량부, 흰 전나무 1~3중량부, 오크라 1~6중량부를 포함하여 구성되는 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 활성산소 독성, 당 독소,당뇨 합병증, 알코올에 의한 간 독소를 제거하고, 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증 (diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 또는 당뇨성 혈관합병증 중 하나 이상 선택되는 당뇨 합병증을 예방할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 체내 독소 축적억제 및 독소 제거용 건강기능 식품일 수 있다. 상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료의 형태인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 실험예에 따르면 우수한 항산화 효과 (DPPH 자유라디칼 소거능)과 당 독소 생성 억제와 당 독소 축적으로 인한 당뇨 및 당뇨합병증 원인 물질 제거 (알파 글루코시다아제 활성 억제) 효과가 있고, 알코올에 의해 손상된 간 세포 보호 뿐만 아니라 간 독소 제거 (Aldehyde Dehydrogenase, Alcohol Dehydrogenase 효소 활성 증가)효과가 있음을 확인하였다.
도 1은 본 발명 식물 유래 복합물의 최종 당화산물 생성 억제 효과를 나타낸다
도 2는 본발명 식물유래 복합물의 알파 글루코시다아제 활성 억제효과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 식물유래 복합물이 간세포 생존율을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 식물유래 복합물이 알코올에 의해 손상이 유도된 간세포 보호 효과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 식물유래 복합물의 ALDH 효소 활성 촉진 효과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실험예에서 사용된 세 가지 추출물의 성상을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실험예에서 사용된 추출물로 제조한 제조예이다.
본 발명은 DPPH 라디칼 소거능, 체내 최종당화산물 생성 억제, 알파 글루코시다아제 활성억제, 알코올에 의해 손상된 간세포 보호, 알코올 분해효소 활성 테스트를 통해 흰 전나무 추출물 및 흰 전나무 추출물을 포함하는 식물유래 복합물의 체내독소 축적 억제 및 제거 효과를 확인하였다. 이를 토대로 천연물질 유래의 부작용이 적은 디톡스 효능을 갖는 건강기능식품 조성물 및 이를 활용한 건강기능식품을 제공하고자 한다.
이하, 본 발명의 식물유래 복합물을 유효성분으로 포함하는 체내 독소 제거 및 독소 축적으로 인한 증상 개선용 건강기능식품 조성물 및 이를 이용한 건강기능식품과 관련한 실험예를 들어 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 실험예는 흰 전나무를 포함하는 식물 유래 복합물의 디톡스 효능 및 체내 독소 축적으로 인한 증상 개선효과를 확인하기 위해 효소반응 실험 및 세포실험을 진행하였다.
<실험예 1> 흰 전나무 추출물 및 식물유래 복합물 추출물 제조
1-1. 흰 전나무 추출물 제조방법
깨끗이 씻고 건조한 흰전나무 껍질에 증류수를 가하고, 100℃에서 가열하여 추출액을 획득하였다.추출된 용액은 5um 포어사이즈의 필터를 이용하여 여과한 다음 감압회전 농축기로 농축하였다. 여과 후 남은 잔사에 다시 동량의 증류수를 사용하여 동일 과정으로 2번 더 추출, 여과 및 감압 농축하였다. 농축된 열수 추출물을 분무건조장치 (Spray dryer)를 이용하여 분무 건조하였다. 건조된 분말은 농도에 맞게 물에 희석하여 실험의 최종 원료로 사용되었다.
1-2. 드레곤헤드 추출물 제조방법
깨끗이 씻고 건조한 드레곤 헤드 잎에 30% 에탄올을 가하여 추출액을 획득하였다. 추출된 용액 외 잔여물은 제거하였고 제거 후 다시 한번 여과한 다음 유동층 과립기를 사용하여 건조하였다. 건조된 분말은 농도에 맞게 물에 희석하여 실험의 최종 원료로 사용되었다.
1-3. 오크라 추출물 제조방법
깨끗이 씻고 건조한 오크라 열매에 증류수를 가하고 100℃에서 가열하여 추출액을 획득하였다. 추출된 용액은 5um 포어사이즈의 필터를 이용하여 여과한 다음 감압회전 농축기로 농축하였다. 여과 후 남은 잔사에 다시 동량의 증류수를 사용하여 동일 과정으로 2번 더 추출, 여과 및 감압 농축하였다. 농축된 열수추출물을 분무건조장치 (Spray dryer)를 이용하여 분무 건조하였다. 건조된 분말은 농도에 맞게 물에 희석하여 실험의 최종 원료로 사용되었다.
1-4. 다양한 조합비의 흰 전나무를 포함하는 식물 유래 복합물 제조
후술할 실험을 위해 비교예를 1 내지 4로 설정하였고 흰 전나무 및 식물유래 복합물의 최적 혼합비율을 도출하기 위한 실시예를 1 내지 9로 설정하여 실험을 실시하였다. 하기의 표 1은 드레곤헤드, 흰전나무, 오크라의 비교예를 나타내고, 표 2는 상기 식물유래 추출물의 최적 혼합비를 도출하기 위한 혼합 조성비를 나타낸다.
드레곤 헤드, 흰 전나무, 오크라 비교예
　 드레곤헤드 흰전나무 오크라
비교예 1 1 0 0
비교예 2 0 1 0
비교예 3 0 0 1
비교예 4 1 1 1
식물 유래 추출물의 혼합 조성비율
　 드레곤헤드 흰전나무 오크라
실시예 1 1 1 4
실시예 2 1 1 5
실시예 3 1 1 6
실시예 4 1 2 1
실시예 5 1 2 2
실시예 6 1 2 5
실시예 7 1 2 6
실시예 8 1 3 1
실시예 9 0.5 2 1
본 발명의 흰 전나무 추출물, 드레곤 헤드 추출물, 오크라 추출물을 포함하는 식물 유래 복합 조성물의 조성비는 드레곤헤드 0.5~1 중량부, 흰 전나무 1~3중량부, 오크라 1~6중량부로 이루어지는 것일 수 있다.
1-5. 통계처리
본 발명의 실험 결과는 SPSS package program(version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균과 표준편차 를 구하였으며 실험군 간 차이의 유의성은 Tne-way ANOVA Multiple comparisons, Tukey test에 의하여 P<0.05 수준에서 검증하였다.
<실험예 2> 항산화 효과 확인
상기 실험예 1에 따라 설정된 비교예 및 실시예의 식물유래 복합물의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 확인하는 실험을 수행하였다.
상기 배합비에 따른 샘플은 여러농도 (31, 62, 125, 250, 500, 1000㎍/㎖)로 제조하여 실험에 사용되었으며 DPPH solution과 1:5 비율로 반응시켰다. 잘 섞어준 후 차광하여 실온에서 30분 반응시키고 microplate를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 소거효과의 비교를 위한 positive control는 EGCG를 사용하였으며 계산식1에 대입하여 실시예의 산화억제 효과를 평가하였다.
[계산식 1]
Inhibition ratio of sample (%) :{(Acs-As)/Acs}*100
Acs: 샘플이 첨가되지 않은 DPPH 용액의 흡광도 As: 샘플과 DPPH가 반응한 흡광도
하기의 표 3은 비교예 1 내지 3의 식물유래 복합물의 각 농도에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내고 표 4는 비교예 4 및 실시예 1 내지 9의 식물유래 복합물의 각 농도에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸다.
비교예 1 내지 3의 DPPH 라디칼 소거능
DPPH radical scavenging activity, % of control
농도 (㎍/㎖) 드레곤헤드 (비교예1) 흰전나무 (비교예2) 오크라 (비교예3)
1,000 37% 51% 36%
500 32% 46% 28%
250 27% 37% 22%
125 22% 34% 17%
62.5 14% 30% 11%
31.25 12% 27% 7%
비교예 4 및 실시예 1 내지 9의 DPPH 라디칼 소거능
DPPH radical scavenging activity, % of control
농도(㎍/㎖) 1:1:1 1:1:4 1:1:5 1:1:6 1:2:1 1:2:2 1:2:5 1:2:6 1:3:1 0.5:2:1 EGCG
1,000 45% 33% 31% 31% 50% 52% 40% 35% 64% 58% 73%
500 36% 28% 27% 27% 45% 45% 32% 30% 57% 52% 74%
250 29% 24% 24% 22% 44% 45% 24% 26% 52% 48% 72%
125 28% 21% 21% 21% 42% 41% 27% 24% 47% 47% 63%
62.5 24% 20% 19% 19% 40% 40% 23% 24% 44% 44% 58%
31.25 26% 22% 21% 19% 39% 39% 18% 23% 41% 42% 51%
실험결과, 여러 농도의 세 가지 추출물 단독 실험 시 (비교예 1~3) 세 가지 군 모두 항산화 능력을 확인하였으며 비교예 2에서 가장 우수한 효능이 확인되었다. 이를 토대로 세 추출물의 시너지 효과가 가장 잘 나타날 수 있는 최적의 배합비 (실시예 1~9)를 연구하였으며 그 결과를 통상적인 배합비 (비교예 1)와 비교하였다.
표 4의 결과에 따르면 실시예 1~9는 통상적인 배합비인 1:1:1 (비교예 4)에 비해 DPPH 소거활성이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 특히 1:3:1 비율에서 가장 우수한 효능이 나타났으며 양성대조군으로 사용된 EGCG의 70~87%에 해당하는 수치이다. 또한 가장 효과가 좋은 실시예 8에서 DPPH radical이 50% 소거되는 농도 (IC50)는 250㎍/㎖로 확인되었다.
<실험예 3> 식물유래 복합물의 당 독소 제거 효과 확인
3-1. 최종당화산물 (AGEs) 생성 억제 효과 확인
본 발명의 실험군은 상기 실험예 2에서 우수한 항산화 효과를 보인 상위 4개 배합비 (실시예 4, 5, 8, 9)와 비교예 2, 4를 비교하는 방식으로 진행하였으며 IC50 농도를 기준으로 효과가 나타날 것이라 예상되는 125, 250, 500㎍/㎖ 농도에 대해 실험을 실시하였다.
당 독소 축적으로 발생되는 최종당화산물은 체내에서 노화를 촉진하고 만성염증을 일으켜 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 암 등 여러 만성질환을 일으키는 원인 물질이다. 본 실험예에서는 다양한 배합비의 식물유래 복합물의 최종당화산물 생성 억제에 미치는 효과를 확인하였다.
최종당화산물 생성 억제 실험은 Vinson&Howar법을 변형하여 진행하였다. 10mg의 BSA를 0.2M Phosphate buffer (pH 7.4)에 용해하여 10mg/ml농도의 BSA를 준비하였으며 반응기간 동안 박테리아 등의 오염을 방지하기 위해 0.02%(w/v) 소듐 아자이드(sodium azide)를 넣어주었다.
BSA와 소듐 아자이드가 섞인 용액에 0.2M의 Glucose와 125, 250, 500㎍/㎖농도의 샘플 (비교예 2,4와 실시예4,5,8,9를 1:1:1 비율로 혼합하여 60℃에서 3일간 반응시킨 후, fluorescence spectrophotometer를 이용하여 반응 전후의 발광 정도(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)를 측정하였다.
또한, 최종당화산물에 억제효과가 있다고 알려진 양성대조군으로 아미노구아니딘 (aminoguanidine, AG)을 사용하여 동일한 농도에서 효능을 비교하였다. 최종당화산물 억제율은 계산식 2에 대입하여 계산하였다.
[계산식 2]
Inhibition ratio of sample (%) : 100 - (As/Acs) * 100
Acs : 샘플이 첨가되지 않은 시료의 발광도 As : 샘플이 첨가된 시료의 발광도
음성대조군으로는 샘플을 넣지 않은 상태에서 BSA (10mg/ml)와 글루코스 (0.2M)만 반응시킨 시료를 사용하였다.
하기의 표 5는 실험 조성물별 최종 당화산물 생성 억제율을 나타내고, 도 1은 실험예 3에 따른 식물 유래 복합물의 최종당화산물 생성억제효과를 나타낸다.
실험 조성물별 최종 당화산물 생성 억제율
Inhibition ratio of glycation, % of control
농도(㎍/㎖) 비교예2 비교예4 실시예4 실시예5 실시예8 실시예9 PC
125 23 38 54 50 58 55 66
250 28 43 52 56 63 60 70
500 34 45 58 56 65 61 78
실험결과, 비교예 2, 4 그리고 실시예 4, 5, 8, 9 모두 당화가 유도된 군에 비해 유의하게 (p<0.05) 최종당화산물의 생성을 억제하였다. 흰 전나무 단독군인 비교예 2는 농도 의존적인 최종당화산물 생성 억제효과를 나타내었으며 3종 복합물은 비교예 2보다 탁월한 억제능을 가짐이 확인되었다.
이 수치는 비교예 2, 4에 비해 우수한 값으로 실시예 4, 5, 8, 9에서 시너지효과가 나타났음을 의미한다. 또한, 모든 실시예에서는 양성대조군으로 사용된 아미노구아니딘과 유사한 효과를 나타내었으며 특히 실시예 8은 양성대조군의 최종당화산물 억제율에 83~92%에 해당하는 우수한 효능을 보였다.
3-2. α-글루코시데이즈 활성 효과 확인
실험군은 상기 실험예 3-1과 동일하게 실시하였다. 당뇨병환자의 식후 급격한 혈당 상승을 억제하는 α-글루코시데이즈 억제제 작용기전은 인슐린 분비를 통하지않고 이당류 분해효소를 가역적으로 억제하여 장에서의 탄수화물 흡수를 지연시켜 식후 혈당을 감소시키고 인슐린 비의존성 당뇨병의 고혈당으로 인한 인슐린 분비 지연을 개선시킨다. 따라서, α-글루코시데이즈 억제 활성에 의하여 당뇨병 치료 활성을 시험할 수 있다.
알파-글루코시다아제 활성을 평가하기 위해 효소-기질반응을 이용한 분광학적 방법으로 측정하였다. 먼저, 96well plate에 농도별 비교예 2, 4와 실시예 4, 5, 8, 9를 각각 10μL씩 분주한 후 0.1M phosphate buffer에 용해한 알파글루코시다아제 (1U/ml) 100μL을 분주하여 실온에서 20분간 1차 반응을 시켜주었다.
이 때 억제능을 비교할 수 있는 양성대조군으로는 아카보스를 사용하였으며 실시예와 동일한 농도로 처리해주었다. 여기에 기질로 사용된 1 mM 농도의 pNPG(p-nitrophenol glucoside) 100 μL을 가하여 37℃에서 10분간 2차 효소반응을 시킨 후, 기질로부터 유리되어 나오는 p-nitrophenol을 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 알파글루코시다아제 활성 저해율은 계산식 3에 대입하여 계산하였다.
[계산식 3]
저해율 (%) = (시료 첨가군 -대조구 첨가군)/대조구 첨가군 * 100
하기의 표 6은 실험 조성물별 알파 글루코시다아제 활성 억제율을 나타내고, 도 2는 실험예 3에 따른 식물유래 복합물의 알파 글루코시다아제 활성 억제효과를 나타낸다.
실험 조성물별 alpha glucosidase activity의 저해율
Inhibition ratio of alpha glucosidase activity, % of control
농도(㎍/㎖) 비교예2 비교예4 실시예4 실시예5 실시예8 실시예9 PC
125 21 34 51 49 61 57 71
250 36 51 56 63 72 65 78
500 56 68 74 78 86 73 92
아무것도 처리하지 않은 음성대조군에서의 효소활성을 100%로 기준잡아 실험 샘플의 억제능을 평가하였다. 실험결과, 양성대조군인 아카보스를 투여한 군에서는 농도의존적으로 71~92%의 억제효과가 나타났으며 비교예 2, 4와 실시예 4, 5, 8, 9에서도 유의한 (p<0.05) 억제 효과가 관찰되었다.
비교예 2 125㎍/㎖ 우수한 효과를 보이진 못했지만 농도 의존적으로 억제효과가 증가하였으며 실시예 4, 5, 8, 9는 통상적인 배합비인 비교예 4에 비해 우수한 효능을 보였다. 다른 실험예에서와 마찬가지로 실시예 3에서의 효능이 가장 탁월하였으며 그 외 배합비에서도 시너지 효과가 일어났음을 유추할 수 있다. 다양한 배합비의 식물유래 복합물이 치료제로 사용되는 아카보스와 유사한 효능을 갖는만큼 천연물 유래의 혈당강하제 소재로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
<실험예 4> 식물유래 복합물의 알코올에 의해 유도된 간 독소 제거 효과 확인
4-1. 식물유래 복합물이 간세포 생존율에 미치는 영향
실험 조성물은 상기 실험예 3과 동일하게 실시하였다. 흰 전나무를 포함하는 식물유래 복합물이 간세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 인간간암 세포주인 HepG2를 이용하였다. HepG2 세포는 10% FBS와 1%의 항생제(100 U/ml penicillin streptomycin)가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
96well에 HepG2를 5 * 103 cells/well 농도로 분주한 후 24시간 배양하여 세포를 부착하였다. 이후 농도별 식물유래 복합물을 처리하여 24시간 동안 배양하였고 정확한 생존율 측정을 위해 PBS로 3번 세척하였다. 그 후 0.5mg/ml의 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 100㎕ 분주하여 2시간 동안 배양한 후 DMSO를 분주하여 결정화된 formazan crystal을 용해하였다. 용해된 formazan의 흡광도는 570nm에서 측정하였다. 각 군의 세포 생존율은 아무것도 처리하지 않은 대조군을 100%로 간주하여 샘플 처리군의 생존율(viability)를 퍼센트로 표시하였다.
도 3은 본 발명의 실험예 4에 따른 식물유래 복합물이 간세포 생존율을 나타낸다. 실험결과, 다양한 농도의 식물유래 복합물은 간세포 생존율에 영향을 미치지 않는 안전한 농도임을 확인하였다.
4-2. 식물유래 복합물이의 알코올 처리된 간세포 생존율에 미치는 영향
흰 전나무를 포함하는 식물유래 복합물이 간세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 인간간암 세포주인 HepG2를 이용하였다. HepG2 세포는 10% FBS와 1%의 항생제(100 U/ml penicillin streptomycin)가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
알코올성 간 손상 유도를 위해 24시간 동안 96well에 배양된 HepG2 세포에 0.4M의 ethyl alchol을 첨가하였고 식물유래 복합물의 간 세포 보호 효과를 확인하기 위해 농도별 샘플을 함께 처리하였다.
효과를 비교하기 위한 간 세포 손상 유도군은 샘플대신 DW를 분주하였고 효과를 비교하기 위한 양성대조군으로는 일반적으로 시판되는 밀크시슬 원료를 사용하였다. 24시간 배양 후 0.5mg/ml의 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)용액을 100㎕분주하여 2시간 동안 배양하였으며 DMSO를 분주하여 결정화된 formazan crystal을 용해하였다. 용해된 formazan의 흡광도는 570nm에서 측정하였다. 간 세포 손상이 유도되지 않은 군의 생존율을 100%로 간주하고 각 군의 세포 생존율(viability)를 퍼센트로 표시하였다.
도 4는 본 발명의 실험예 4에 따른 식물유래 복합물이 알코올에 의해 손상이 유도된 간세포 보호 효과를 나타낸다. 실험결과, HepG2 세포에 0.4M의 알코올을 처리하였을 경우, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 대비 약 60%의 생존율을 보였지만 농도별 식물유래 복합물을 처리하여 함께 배양할 경우 농도의존적으로 손상이 줄어 생존율이 증가함을 확인할 수 있었다.
또한 고농도의 식물유래 복합물은 동일 농도의 양성대조군과 유사한 세포 보호효과를 가짐이 확인되었다. 이를 통해, 식물유래 복합물은 알코올로 인한 독성으로부터 HepG2 세포를 보호한다는 것을 확인할 수 있다.
4-3. Aldehyde Dehydrogenase 활성 촉진 효과 확인
알코올에 의한 간 독소 제거에 필수적인 알데하이드 탈수소 효소 (Aldehyde Dehydrogenase, ALDH)는 아세트알데하이드를 아세트산으로 산화시켜주는 역할을 한다. 이 때 NAD+ 한 분자를 환원시켜 NADH양이 증가하게 되는데 시중에 판매되는 ALDH 활성을 측정하는 키트들은 이 원리를 이용한다.
본 실험에서는 ALDH 활성을 측정하기 위해 sigma사의 Aldehyde Dehydrogenase activity colorimetric assay kit을 활용하였다. 우선, HepG2 세포는 10% FBS와 1%의 항생제(100 U/ml penicillin/streptomycin)가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 배양 시 다양한 농도의 비교예, 실험예을 첨가하였으며 효과를 비교하기 위한 음성대조군으로는 동량의 DW를, 양성대조군으로는 동량의 시판되는 밀크시슬 원료를 이용하였다.
배양 후 kit에서 제공되는 Assay buffer를 통해 회수 및 균질화 과정을 거쳤으며 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 실험에 적용할 샘플을 회수하였다. kit제조사에서 제공한 배합리로 혼합한 assay buffer, ALDH 기질, 아세트알데하이드 mix 50㎕에 샘플 50㎕을 혼합하여 실온에서 5분 반응 후 매2~3분간 450nm에서 흡광도를 측정하였다. ALDH 활성은 계산식 4에 대입하여 계산하였으며 대조군의 활성을 100으로 기준잡아 %로 환산하여 표7, 도5에 나타내었다.
[계산식 4]
ALDH activity (%) = B / △T * V * 희석배율 = nmol/min/ml = mU/ml
B: 실험군에서 발생한 NADH 양(nmol) △T: 반응 시간(분)
V: 반응 웰에서 사용된 실험군 부피(ml)
하기의 표 7은 실험 조성물별 ALDH 효소 활성율을 나타내었고, 표 8은 각각의 실험군간 통계결과를 나타내었다. 실험군간 유의한 차이가 있으면 공란으로, 유의한 차이가 없다면 Not significant (NS)로 표시하였다. 도 5는 식물유래 복합물의 ALDH 활성효과를 나타낸다.
실험결과, 비교예 2, 4에서는 음성대조군 대비 38~62%의 활성 촉진 효과를확인하였으며 양성대조군 역시 64~79%의 우수한 활성 촉진능을 보였다. 실시예 4,5,8,9의 경우, 모두 음성대조군 대비 농도의존적 유의성 (p<0.05)을 보였으며 실시예 8의 경우, 모든 실시예 중 가장 우수한 효능을 보이며 양성대조군에 웃도는 효과를 확인하였다. 이는 흰전나무 추출물을 포함하는 식물유래 복합물이 간 독성 개선 효과가 있음을 시사하며 시판되는 타 원료대비 우수한 효능을 가짐을 확인하였다.
실험 조성물별 ALDH activity 활성율
Inhibition ratio of alpha glucosidase activity, % of control
농도(㎍/㎖) 비교예2 비교예4 실시예4 실시예5 실시예8 실시예9 PC
125 138 148 162 164 171 159 164
250 149 157 170 172 180 169 174
500 158 162 176 181 190 182 179
본 발명에서는 DPPH 라디칼 소거능, 체내 최종당화산물 생성 억제, 알파 글루코시다아제 활성억제, 알코올에 의해 손상된 간세포 보호, 알코올 분해효소 활성 테스트를 통해 흰 전나무 추출물 및 흰 전나무 추출물을 포함하는 식물유래 복합물의 체내독소 축적 억제 및 제거 효과를 확인하였다. 이를 토대로 천연물질 유래의 부작용이 적은 디톡스 효능을 갖는 건강기능식품 조성물 및 이를 활용한 건강기능식품의 제공이 가능하다.
5. 흰 전나무 추출물을 포함하는 건강기능성 식품제형물 제조
흰 전나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 체내 축적 독소 및 노폐물 제거를 위한 해독작용을 갖는 조성물은 정제 및 캡슐제, 연질 캡슐제, 과립제, 액제 형태로 제조될 수 있다. 도 7은 흰 전나무 추출물을 이용한 건강기능성 식품 제형물로 제조된 정제형을 나타낸다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 체내 독소 축적억제 및 독소 제거용 건강기능성 식품일 수 있다. 상기 건강기능식품은 상기 조성물이 0.01 내지 99.9중량%로 포함되도록 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료의 형태인 것일 수 있다.
본 발명은 천연물을 원료로 하는 식물 유래 추출물 및 복합 추출물을 제공하여 부작용이 거의 없는 체내 독소 축적억제 및 독소 제거용 건강기능 식품 조성물 및 건강기능 식품을 제공하여 건강에 관심도가 높은 현대인의 수요에 맞춰 경쟁력이 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 흰 전나무 추출물, 드레곤 헤드 추출물, 오크라 추출물로 이루어진 식품 조성물에 있어서, 드레곤헤드 1 중량부, 흰 전나무 3 중량부, 오크라 1 중량부를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 체내 최종당화산물(AGEs) 생성억제 및 제거용 건강기능식품 조성물
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 활성산소 독성, 당 독소, 당뇨 합병증, 알코올에 의한 간 독소를 제거하는 것을 특징으로 하는 체내 최종당화산물(AGEs) 생성억제 및 제거용 건강기능식품 조성물
  4. 청구항 3에 있어서, 당 독소, 당뇨 합병증은 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증 (diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 또는 당뇨성 혈관합병증 중 에서 선택되는 하나 이상의 당뇨 합병증을 예방할 수 있는 것을 특징으로 하는 체내 최종당화산물(AGEs) 생성억제 및 제거용 건강기능식품 조성물
  5. 청구항 2의 건강기능식품 조성물을 포함하며, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 티백제, 침출차, 건강 음료중에 선택되는 어느 하나의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 체내 최종당화산물(AGEs) 생성억제 및 제거용 건강기능 식품
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