CN115998838A - 一种具有降血糖协同增效作用的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有降血糖协同增效作用的组合物及其应用,属于食品营养保健和生物医药技术领域。所述组合物包括牡蛎肽和花色苷提取物。所述牡蛎肽和所述花色苷提取物的质量比为1:10~3:1。通过实验验证,本发明的组合物体内外降血糖协同增效作用显著,且消化稳定性得到显著提升;动物实验证实组合物对Ⅱ型糖尿病小鼠具有协同降糖作用,其降血糖作用比单一牡蛎肽或花色苷降糖效果显著,且长期使用对动物无毒性作用;通过体内实验明确了牡蛎肽和花色苷组合后的部分协同降糖机制。本发明为降血糖以及II糖尿病的治疗和预防提供了新方向。
Description
技术领域
本发明涉及食品营养保健和生物医药技术领域,特别是涉及一种具有降血糖协同增效作用的组合物及其应用。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,可诱发各种慢性并发症,如心肌梗死、中风和心血管死亡等。近年来,糖尿病发病率在全世界迅速增长,目前已成为继心脑血管疾病、癌症的第三大危害人类生命健康的疾病。我国糖尿病患者人数已居世界第二位,据统计,2021年我国的糖尿病患者数量为1.4亿人,十年间增幅达56%,预计2030年我国糖尿病患者人数将超过1.6亿人。II型糖尿病患者人数约占糖尿病患者人数的90%,其主要机制是胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷,且II型糖尿病发展周期较长,给患者身心健康及家庭经济带来沉重的负担。因此,开发一种经济有效的、通过膳食摄入的食品源降糖功能因子对于预防改善糖尿病症状具有非常积极的意义。
目前预防及治疗糖尿病的药物多以化学合成类为主,存在安全性低、药物依赖性强、副作用多、成本高的问题,而天然降糖功能因子具有安全性高、副作用小,来源广泛,价格低廉的特点。目前,天然降糖功能因子有多糖类、黄酮类、活性肽、生物碱类、萜类等。其中,活性肽因其安全性高、营养价值高、易消化的特点备受青睐。
牡蛎,俗称蚝,富含优质蛋白,有“海洋牛奶”的美誉,是我国卫生部门批准的第一批药食同源的海产品之一。牡蛎蛋白源活性肽(牡蛎肽)因具备特殊海洋环境赋予的独特氨基酸序列结构,在降糖应用方面具有天然优势,但其消化稳定性差的问题,极大地限制了降糖活性的发挥。花色苷是一类广泛存在于果蔬中的天然色素,具有显著的降血糖功能,降糖应用价值较大,但花色苷易受温度、pH、光等条件和消化系统影响发生快速降解,导致其活性发挥受限。
协同降糖组合物主要集中于多糖类、多酚类、生物碱类、脂肪酸类等活性物质之间,还未有关于活性肽(牡蛎肽)与花色苷协同组合物的研究。虽然文献研究已报道单独的牡蛎肽和花色苷具有降血糖作用,但是单独的牡蛎肽和花色苷的消化稳定性差、体内有效降糖活性较低,因而效果不太理想。同时,牡蛎肽与花色苷协同组合物中牡蛎降糖肽的结构特征、花色苷的种类等直接影响二者组合效果的因素也有待研究。因此,非常有必要开展创新性研究和开发消化稳定性好、有效降糖活性强、保健效果更佳的组合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有降血糖协同增效作用的组合物及其应用,以解决上述现有技术存在的问题,将牡蛎肽和花色苷提取物按照特定比例组合可以显著增强降血糖功能。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种具有降血糖协同增效作用的组合物,包括牡蛎肽和花色苷提取物。
优选的是,所述牡蛎肽和所述花色苷提取物的质量比为1:10~3:1。更优选的是,所述牡蛎肽和所述花色苷提取物的质量比为3:1。
优选的是,所述牡蛎肽包括如下肽链:LYF、ILGF(SEQ ID NO:1)、LLVK(SEQ ID NO:2)、TLFLK(SEQ ID NO:3)、EKISP(SEQ ID NO:4)、IEPSLR(SEQ ID NO:5)、IRAGYD(SEQ IDNO:6)、AHFNPF(SEQ ID NO:7)、TLHHRVH(SEQ ID NO:8)、ARNEANVNIY(SEQ ID NO:9)、AILQGDHTTH(SEQ ID NO:10)、KESTLHLVLR(SEQ ID NO:11)、IQDKEGIPPDQQR(SEQ ID NO:12)和AILQGDHTTHTA(SEQ ID NO:13)。
优选的是,所述花色苷提取物包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和芍药色素-3-O-葡萄糖苷,所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷:飞燕草素-3-O-葡萄糖苷:芍药色素-3-O-葡萄糖苷的质量比为40:3:1。
优选的是,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计,所述花色苷提取物中花色苷的质量分数为28.2%。
本发明还提供所述的组合物在制备降血糖药物中的应用。
本发明还提供所述的组合物在制备治疗或者预防II型糖尿病的药物中的应用。
本发明还提供所述的组合物在制备协同降血糖药物中的应用。
本发明还提供一种药物,包括所述的组合物。
本发明还提供一种食品,包括所述的组合物。
本发明提供的组合物用于制备特殊医学食品、保健食品、功能食品和药物等。本发明利用该组合物或以该组合物为主要原料配合其他成分,如药食同源物质成分、药用辅料、食品添加剂等,通过常规工艺制备而成的食品、保健食品或者药物。
本发明公开了以下技术效果:
单独的牡蛎肽和花色苷的消化稳定性差、体内有效降糖活性较低,因而效果不太理想,而本发明公开的由牡蛎肽和花色苷构建的组合物,经过动物实验证实对高血糖小鼠具有协同降糖作用,其降血糖效果比单一牡蛎肽或花色苷的降血糖效果显著,且长期服用对小鼠无毒性作用。此外,本发明明确了部分牡蛎肽和花色苷组合物的降血糖协同增效机制,牡蛎肽和花色苷组合物具有降血糖协同增效作用的机理可能与其协同抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV活性;协同促进血清中高密度脂蛋白合成,降低总胆固醇、甘油三酯、糖化血清蛋白和游离脂肪酸合成,缓解脂代谢紊乱;协同修复肝脏中受损的抗氧化酶,降低机体内氧化压力;协同促进肝糖原和肌糖原的合成,调节糖代谢,进而发挥降血糖协同增效作用。因此,本发明公开的牡蛎肽和花色苷组合物的降血糖效果明显,对于制备具有降血糖功能的产品具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明牡蛎肽与花色苷组合物对α-淀粉酶抑制作用的2D协同计算图;
图2为本发明牡蛎肽与花色苷组合物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的2D协同计算图;
图3为本发明牡蛎肽与花色苷组合物对DPP-IV抑制作用的2D协同计算图;
图4为胃肠消化前后牡蛎肽及其与花色苷组合物的降糖活性;a:牡蛎肽;b:牡蛎肽与花色苷组合物;
图5为牡蛎肽、花色苷及其组合物对Ⅱ型糖尿病小鼠的摄食量、摄水量影响;a:摄食量(g/d);b:摄水量(mL/d),NC:正常组;DC:糖尿病模型组;PC:阳性对照组,阳性药为罗格列酮;OD组:牡蛎肽组(0.9g/kg);AD组:花色苷组(0.3g/kg);HD:牡蛎肽与花色苷组合物高剂量组(2.0g/kg);MD:牡蛎肽与花色苷组合物中剂量组(1.2g/kg);LD:牡蛎肽与花色苷组合物低剂量组(0.4g/kg)。不同字母者表示经方差分析有统计学意义,p<0.05;
图6为本发明牡蛎肽、花色苷及其组合物对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖和胰岛素的调节作用;a:空腹血糖(FBG);b:口服葡萄糖耐量(OGTT);c:OGTT曲线下面积AUC;d:血清中胰岛素含量(mIU/L);不同字母者表示经方差分析有统计学意义,p<0.05;
图7为本发明牡蛎肽、花色苷及其组合物对小鼠血清中DPP-IV活性的影响;
图8为本发明牡蛎肽、花色苷及其组合物对小鼠糖原的影响;a:肝糖原含量(mg/g肝);b:肌糖原含量(mg/g肌肉)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1牡蛎肽和花色苷的获取方法
牡蛎肽的制备方法如下:用香港牡蛎全肉经流水解冻后,按料液比1:3.9(w/v)加水匀浆,在自然pH、47℃的条件下,按3300U/g的加酶量酶解3h,酶解结束后沸水浴灭酶10min,迅速冷却至室温,以4℃、转速8000r/min离心15min后,用四层脱脂棉纱布过滤,取上清液,冷冻干燥48h备用。牡蛎肽也可按目前已有文献报道的制备方法得到,但前提是必须满足牡蛎降糖肽的结构特征:主要含有肽链:LYF、ILGF、LLVK、TLFLK、EKISP、IEPSLR、IRAGYD、AHFNPF、TLHHRVH、ARNEANVNIY、AILQGDHTTH、KESTLHLVLR、IQDKEGIPPDQQR、AILQGDHTTHTA。
花色苷可以采用已有市售的相应商品形式的提取物或者单一纯品,也可以按目前已有文献报道的制备方法得到,但前提是必须满足其主要成分为:上述花色苷为花色苷提取物(花色苷含量为28.2%,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计算),其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷:飞燕草素-3-O-葡萄糖苷:和芍药色素-3-O-葡萄糖苷=40:3:1。
实施例2具有降血糖协同增效作用的组合物制备方法
按照质量比1:10称取牡蛎肽和花色苷粉末到1000mL烧杯中,加入适量蒸馏水混合均匀后,盖上保鲜膜,在常温下使用磁力搅拌水浴锅搅拌2h,冷冻干燥48h,获得具有降血糖协同增效作用的组合物。
实施例3
与实施例2的区别在于:牡蛎肽和花色苷粉的质量比为2.5:10;其他步骤均相同。
实施例4
与实施例2的区别在于:牡蛎肽和花色苷粉的质量比为3:10;其他步骤均相同。
实施例5
与实施例2的区别在于:牡蛎肽和花色苷粉的质量比为1:1;其他步骤均相同。
实施例6
与实施例2的区别在于:牡蛎肽和花色苷粉的质量比为1:5;其他步骤均相同。
实施例7
与实施例2的区别在于:牡蛎肽和花色苷粉的质量比为2:1;其他步骤均相同。
实施例8
与实施例2的区别在于:牡蛎肽和花色苷粉的质量比为3:1;其他步骤均相同。
以下以实施例8制备的具有降血糖协同增效作用的组合物进行体外和体内效果验证。
试验例1
1、方法
体外模拟胃肠道消化稳定性分析:称取1.0g牡蛎肽到100mL烧杯中,并加入0.2gNaCl和50mL去离子水,用1.0mol/L的HCl溶液调节pH值至2.0,加入0.05g胃蛋白酶后于37℃水浴反应2h,消化结束后用100℃沸水灭酶,冷却至室温后补水至100mL,移取50mL胃消化液用水定容至100mL,牡蛎肽在反应体系的浓度为5mg/mL,将稀释后的胃消化液于4℃、8000r/min离心15min,取上清液进行α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV抑制活性测定。
在上述胃消化体系中继续加入2mL胰蛋白酶溶液,用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.0,混匀后于37℃水浴反应2h,待消化结束于沸水浴中灭酶,冷却至室温后补水至100mL,此时牡蛎肽的体系浓度为5mg/mL,将稀释后的肠消化液在4℃、8000r/min条件下离心15min,取上清液进行α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV抑制活性测定。测定方法如下:
(1)α-葡萄糖苷酶抑制率的测定
采用pNPG法测定牡蛎肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性。移取110μL磷酸盐缓冲液(pH=6.8)于96孔板微孔,分别加入20μL样品溶液和20μLα-葡萄糖苷酶溶液(1U/mL),混匀后于37℃孵育10min后,加入20μL底物pNPG(1.25mmol/L),体系于37℃反应20min后,加入80μL碳酸钠(0.1mol/L)终止反应,以阿卡波糖作为阳性对照组,重复以上实验操作。用酶标仪在405nm处测定其吸光值,并按式(1)计算α-葡萄糖苷酶抑制率:
式中:A1、A2、A3和A4分别是样品组、样品空白组、对照组和空白组的吸光度值。
(2)α-淀粉酶抑制率的测定
采用DNS比色法测定牡蛎肽的α-淀粉酶抑制活性。玻璃试管中,加入300μL样液和300μL淀粉酶溶液(0.1U/mL),37℃水浴15min,加入300μL可溶性淀粉(体积分数为1%),37℃环境中反应30min后,加入500μL DNS在沸水浴中继续反应10min,冰浴冷却后加入8600μL蒸馏水,漩涡混匀。以阿卡波糖作为阳性对照组,重复以上实验操作,取200μL反应液在96孔板检测其在540nm处吸光值,并根据式(2)计算α-淀粉酶抑制率:
式中:A1、A2、A3和A4分别是样品组、样品空白组、对照组和空白组的吸光度值。
(3)DPP-IV抑制率的测定
采用Gly-Pro法测定牡蛎肽的DPP-IV抑制活性。在96孔板微孔中,分别加入25μL样品溶液和25μL底物甘氨酸对硝基苯胺溶液,混匀后于37℃孵育10min,加入50μL DPP-IV(0.01u/mL),体系于37℃反应60min后,加入100μL醋酸钠缓冲液(1M,pH=4)终止反应。以西格列汀作为阳性对照组,重复以上实验操作。采用酶标仪在405nm处测定其吸光值,并按式(3)计算DPP-IV抑制率:
式中:A1和A2分别是对照组和样品组的吸光度值。
2、结果
天然降糖肽经过胃肠消化后的活性变化趋势是判断其进入人体内活性作用强度的重要依据,消化稳定性强的天然活性肽更具有替代治疗药物的潜力。如图4中a所示,经过胃肠模拟消化后,牡蛎肽的降糖活性显著降低。与消化前相比,牡蛎肽经过胃消化后对DPP-IV酶、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分别降低了25.09%、6.23%、15.16%;经过肠消化后,牡蛎肽对三种酶的抑制率分别降低了32.48%、11.57%、24.70%。经过胃肠消化后,牡蛎肽的降糖活性大幅度降低可能是由于胃液中的强酸性条件、胃肠之间的急剧pH变化以及胃肠液中的消化酶破坏了牡蛎降糖肽的结构,即牡蛎降糖肽的消化稳定性较差,但消化后其仍具有一定的降糖活性,因此有必要采取一定的手段提升牡蛎肽的消化稳定性,保留其降糖活性。
由图4中a数据结果可知,牡蛎肽的消化稳定性较差,经过胃肠消化后的降糖活性损失大,因此考虑通过牡蛎肽协同花色苷来提高牡蛎肽的消化稳定性,提高其降糖活性。
试验例2
1、方法
设计牡蛎肽和花色苷的样品剂量协同矩阵,根据矩阵对应的不同组合浓度(比例)进行α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV抑制活性测定,利用多药物联用效应计算软件SynergyFinder(https://synergyfinder.org/)和Compusy(https://www.combosyn.com)中的ZIP模型、HSA模型和药物联合指数(CI)计算模型,对牡蛎肽和花色苷的协同降糖作用进行分析。同时用上述体外模拟胃肠道消化实验方法,测定胃肠消化后牡蛎肽协同花色苷的体外降糖活性,考察其协同组合物的消化稳定性。
2、结果
利用机器学习方法中多药物联用效应计算的Compusy模型、ZIP模型和HSA模型系统分析牡蛎肽和花色苷的协同降糖作用,结果显示,牡蛎肽和花色苷具有显著的协同作用。由表1可知,Compusy模型和ZIP模型分析结果表明牡蛎肽和花色苷对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶均表现出了协同抑制效果(CI<1,δ>0)。
表1实施例5的牡蛎肽和花色苷体外协同降糖计算结果
α-淀粉酶 | α-葡萄糖苷酶 | DPP-IV | |
<![CDATA[CI值<sup>1</sup>]]> | 0.867 | 0.764 | 0.971 |
<![CDATA[Synergy score(δ)<sup>2</sup>]]> | 7.037 | 8.388 | 4.952 |
注:1CI值:通过CI值的数值大小可以定量判断样品间相互作用的性质,CI>1为拮抗作用,CI=1为相加作用,0.3<CI<1为协同作用。
2Synergy score(δ):δ=0、>0和<0分别对应于样品间的零交互、协同和拮抗。
由图1-图3可知,在α-淀粉酶抑制实验中,牡蛎肽与花色苷组合物的HSA模型得分δ为3.632,当牡蛎肽浓度为1.83~7.32mg/mL、花色苷浓度为0.34~1.35mg/mL时δ得分较高,此时牡蛎肽与花色苷间的协同作用较强;在α-葡萄糖苷酶抑制实验中,牡蛎肽与花色苷组合物的HSA模型得分δ为3.503,当牡蛎肽和花色苷浓度分别在4.25~17mg/mL,3.25~13mg/mL范围内时有δ得分较高区域,且高分区域较为集中;在DPP-IV酶抑制实验中,牡蛎肽与花色苷组合物的HSA模型得分δ为3.156,当牡蛎肽和花色苷浓度分别在1.3~5.2mg/mL,3.24~12.96mg/mL范围内有δ得分较高区域,此时二者协同作用最强。
如图4中b所示,牡蛎肽协同花色苷的复合物经胃消化阶段后,对α-葡萄糖苷酶的抑制率升高了5.74%(p<0.05),经过肠消化阶段后,对α-葡萄糖苷酶的抑制率与消化前无显著性差异(p>0.05),这可能是复合物中花色苷在酸性环境的胃消化阶段较稳定,发挥最大的活性作用,在回到中性环境的肠消化阶段后,对α-葡萄糖苷酶的抑制作用又回到消化前水平。复合物经胃、肠消化阶段后,DPP-IV酶抑制率和α-淀粉酶抑制率都有一定程度的降低,但相比于单独使用牡蛎肽进行的体外模拟消化降糖实验结果(图4a),组合花色苷后的牡蛎肽对DPP-IV酶、α-淀粉酶的抑制率分别提升了18%和46%,且消化过程中抑制率的波动范围变小,说明牡蛎肽协同花色苷后,消化稳定性得到了提高。
试验例3
本试验例以实施例8制备的牡蛎肽和花色苷的组合物为例,考察该组合物的体内降血糖效果及增效作用。
1、Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立及分组
(1)Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立
对96只SPF级昆明种小鼠进行适应性饲养1周后,随机选取84只给以高糖高脂饲料喂养作为实验组;另取12只给以普通饲料作为正常对照组,两组小鼠均饮水自由。喂养4周后,实验组小鼠腹腔注射STZ(链尿佐菌素)注射液,剂量为90mg/kg,3天内注射两次。正常对照组用同样的方法注射等量的柠檬酸缓冲液,3天后测定空腹血糖值(小鼠尾静脉取血,使用拜耳血糖仪测定空腹血糖值)。以空腹血糖值高于11.1mmol/L者为Ⅱ型糖尿病模型成功小鼠。
(2)分组
选取造模成功的小鼠随机分为5组:模型阳性对照药组(阳性对照药为罗格列酮,2mg/kg,PC),模型阴性对照组(NC),牡蛎肽组(OD,0.90g/kg),花色苷组(AD,0.30g/kg),以及三组牡蛎肽和花色苷组合物组(实施例5制备),其中高剂量组(HD):2.0g/kg,中剂量组(MD):1.2g/kg,低剂量组(LD):0.4g/kg,组合物中牡蛎肽和花色苷的质量比为3:1。分组后正常组饲喂普通饲料,其它组继续饲喂高糖高脂饲料,并在此过程中每天记录小鼠摄食摄水量和体重,每周记录空腹血糖值。在饲喂4周后,小鼠眼球取血离心得血清,然后处死小鼠进行解剖,并用生理盐水将取出的肝脏、肌肉等组织清洗干净,存于液氮中。
小鼠饮食、体重及空腹血糖值分析:实验过程中,每天记录小鼠的摄食、摄水量和体重;每周记录空腹血糖值:测量空腹血糖值前,禁食不禁水过夜,小鼠尾静脉取血,室温静置后以8000r/min离心15min,取250μL上清液利用葡萄糖测定试剂盒说明书方法测定空腹血糖含量,评估牡蛎肽、花色苷及其组合物对高血糖引起的小鼠饮食、体重及空腹血糖值异常的改善作用。
口服葡萄糖耐量(OGTT)分析:在处死小鼠的前2天进行OGTT分析。所有实验组小鼠禁食12h后,灌以葡萄糖溶液(1.5g/kg b.w.)。然后在灌喂后0、30、60、90、120min后分别尾部取血测定血糖值,以时间为横坐标,血糖值为纵坐标作曲线图,并比较各曲线下面积(AUC,由GraphPad Prism version 5.0软件计算),评价牡蛎肽、花色苷及其组合物对高血糖小鼠葡萄糖耐量的改善作用。
2、结果
(1)高糖高脂饲料联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠主要症状有高血糖,饮水摄食量增加,体重下降。由图5可知,在饲养1-4周,正常组小鼠摄食量和摄水量变化较小,而糖尿病模型组小鼠的摄食摄水量变化显著。与糖尿病模型组小鼠相比,经过牡蛎肽、花色苷及其组合物喂养的小鼠的摄食量和摄水量都有了明显的降低,且第4周后,在降低摄食摄水量方面,低剂量的牡蛎肽与花色苷组合物具有和单独的牡蛎肽(0.9g/kg)和花色苷(0.3g/kg)相当的效果,但组合物用量更少(牡蛎肽:0.3g/kg;花色苷:0.1g/kg),说明牡蛎肽与花色苷组合物对改善糖尿病小鼠的摄食饮水方面有较好的协同效果。
(2)体重降低或增长缓慢是糖尿病的一个重要症状,由表2可知,在第1-4周,正常小鼠的体重增长率为6.21%,而糖尿病模型小鼠的体重增长率显著低于正常组小鼠,仅为3.41%(p<0.01),而与糖尿病模型组小鼠相比,经过牡蛎肽、花色苷及其组合物喂养的小鼠体重有了极显著的增长(p<0.01),其中,中剂量牡蛎肽与花色苷组合物的组小鼠体重增长率接近于阳性对照组,表明中剂量组合物对缓解糖尿病小鼠体重下降的症状有较好的改善效果。
表2牡蛎肽、花色苷及其组合物对Ⅱ型糖尿病小鼠的体重影响
(3)由图6知,在饲养的1-4周内,糖尿病模型组小鼠的FBG值均显著高于正常组小鼠(p<0.05),而组合物喂养组小鼠的FBG显著低于糖尿病模型组小鼠(p<0.05),且低剂量的组合物组降低FBG的效果与单独的牡蛎肽和花色苷相当,但低剂量的组合物中牡蛎肽和花色苷的用量(牡蛎肽:0.3g/kg;花色苷:0.1g/kg)显著少于单独的牡蛎肽(0.9g/kg)和花色苷(0.3g/kg),即在改善糖尿病小鼠FBG方面,牡蛎肽和花色苷具有显著的协同作用;OGTT结果显示,中剂量的组合物组小鼠的葡萄糖耐量接近阳性对照组(OGTT、AUC);胰岛素含量分析显示,组合物实验组能够有效降低血清中胰岛素的含量(<32.45mIU/L),且效果明显优于单独的牡蛎肽和花色苷(p<0.01)。综上结果表明,牡蛎肽和花色苷在改善糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)、口服葡萄糖耐量(OGTT)及血清中胰岛素含量方面具有显著的协同作用。
试验例4降糖协同机制相关指标测定
1、对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV的协同抑制作用按试验例2的方法进行。
2、血清中生化指标测定
血清中葡萄糖和胰岛素的含量,以及TG、TC、LDL-c、HDL-c、GSP、NEFA以及采用相应的试剂盒进行检测。所有的检测方法按照试剂盒说明书进行。
3、DPP-IV指标分析
采用小鼠ELISA试剂盒测定血清中的DPP-IV活性,分析组合物对高血糖小鼠血清DPP-IV活性的抑制效果。
4、肝脏中抗氧化酶分析
将小鼠肝脏冰浴中用生理盐水研磨成匀浆,低温离心15min(4℃,8000rpm)获取上清,采用试剂盒测定各组小鼠肝脏中SOD、CAT、GPX酶的酶活力,以及MDA的含量,分析抗氧化酶情况。
5、肝脏中糖异生(糖原)分析
将小鼠肝脏和肌肉在冰浴中用生理盐水研磨成匀浆,低温离心15min(4℃,8000rpm)获取上清,采用试剂盒测定各组小鼠肝脏和肌肉中肝糖原和肌糖原的含量,分析糖异生情况。
6、结果
(1)糖尿病患者常会伴有脂代谢紊乱,从而引发高血脂等心血管疾病。由表3可知,与糖尿病模型组小鼠相比,组合物实验组小鼠血清中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量显著降低(p<0.05),而高密度脂蛋白(HDL-c)含量显著升高(p<0.05),且中剂量组合物组TC和TG含量显著低于单样品实验组(p<0.05),效果与阳性对照组相当。此外,组合物实验组小鼠血清中的糖化血清蛋白(GSP)和游离脂肪酸(NEFA)含量也显著低于糖尿病模型组小鼠(p<0.05),且中剂量组小鼠血清中GSP和NEFA含量基本恢复到正常组小鼠水平。综上结果表明牡蛎肽和花色苷在发挥调节Ⅱ型糖尿病小鼠的脂代谢方面具有协同作用效果。
表3牡蛎肽、花色苷及其组合物对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中相关血脂指标的影响
注:NC:正常组;DC:糖尿病模型组;PC:阳性对照组,阳性药为罗格列酮;OD组:牡蛎肽组(0.9g/kg);AD组:花色苷组(0.3g/kg);HD:牡蛎肽与花色苷组合物高剂量组(2.0g/kg);MD:牡蛎肽与花色苷组合物中剂量组(1.2g/kg);LD:牡蛎肽与花色苷组合物低剂量组(0.4g/kg)。同一列数据中肩注不同字母者表示经方差分析有统计学意义,p<0.05。
(2)糖尿病患者的高血糖会导致机体内氧化压力增加,造成细胞损伤。此时抗氧化物质会有损失,包括过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH),而反应细胞损伤的物质含量会上升,比如丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)。由表4可知,糖尿病模型组小鼠肝脏中CAT、GSH、SOD含量最低,中剂量组合物实验组小鼠肝脏中的CAT和SOD、GSH显著高于阳性组和单样品组。在提示肝细胞损伤的MDA和XOD指标中,中剂量组合物实验组的MDA和XOD含量显著低于阳性对照组。综上结果表明,中剂量的牡蛎肽和花色苷组合物能够明显地修复肝脏中受损的抗氧化酶,从而降低机体内氧化压力,效果优于阳性药物和单独的牡蛎肽和花色苷,即牡蛎肽花色苷在发挥保护Ⅱ型糖尿病小鼠的体内抗氧化酶活性方面具有协同作用效果。
表4牡蛎肽、花色苷及其组合物对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中抗氧化酶和MDA含量的影响
注:NC:正常组;DC:糖尿病模型组;PC:阳性对照组,阳性药为罗格列酮;OD组:牡蛎肽组(0.9g/kg);AD组:花色苷组(0.3g/kg);HD:牡蛎肽与花色苷组合物高剂量组(2.0g/kg);MD:牡蛎肽与花色苷组合物中剂量组(1.2g/kg);LD:牡蛎肽与花色苷组合物低剂量组(0.4g/kg)。同一列数据中肩注不同字母者表示经方差分析有统计学意义,p<0.05。
(3)二肽基肽酶(DPP-IV)是内肠促胰素(GLP-1)的降解酶,抑制DPP-IV活性即有效减少GLP-1过快降解,从而延长GLP-1促进胰岛素分泌的作用,可显著降低血糖。由图7可知与正常组相比,糖尿病模型组小鼠血清中DPP-IV显著升高,而中剂量和低剂量的牡蛎肽和花色苷组合物的DPP-IV抑制效果显著优于单独的牡蛎肽和花色苷,即牡蛎肽和花色苷具有显著的DPP-IV抑制增效作用,尤其低剂量的组合物中牡蛎肽和花色苷的用量(牡蛎肽:0.3g/kg;花色苷:0.1g/kg)显著少于单独的牡蛎肽(0.9g/kg)和花色苷(0.3g/kg)。综上结果说明组合物中牡蛎肽和花色苷可协同抑制糖尿病小鼠血清中DPP-IV活性,进而发挥降血糖协同增效作用。
(4)肝脏和肌肉中的糖原合成困难也是II型糖尿病的表现之一,因此肝糖原含量和肌糖原含量是评价糖尿病患者病症改善的重要指标。由图8可知,与正常组小鼠对比,糖尿病模型组小鼠的肝糖原和肌糖原显著降低(p<0.05),而使用牡蛎肽与花色苷组合物喂养的小鼠,肌糖原、肝糖原含量显著升高,与阳性药物组相当,其中,低剂量的牡蛎肽与花色苷组合物实验组的肝糖原含量与单独的牡蛎肽和花色苷实验组的肝糖原含量相当,但组合物中牡蛎肽和花色苷的用量(牡蛎肽:0.3g/kg;花色苷:0.1g/kg)显著少于单独的牡蛎肽(0.9g/kg)和花色苷(0.3g/kg),可见组合物能通过促进肝糖原和肌糖原合成来调节糖代谢,缓解糖尿病引起的糖代谢紊乱症状,且牡蛎肽和花色苷具有一定的协同作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种具有降血糖协同增效作用的组合物,其特征在于,包括牡蛎肽和花色苷提取物。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述牡蛎肽和所述花色苷提取物的质量比为1:10~3:1。
3.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述牡蛎肽包括如下肽链:LYF、ILGF、LLVK、TLFLK、EKISP、IEPSLR、IRAGYD、AHFNPF、TLHHRVH、ARNEANVNIY、AILQGDHTTH、KESTLHLVLR、IQDKEGIPPDQQR和AILQGDHTTHTA。
4.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述花色苷提取物包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和芍药色素-3-O-葡萄糖苷,所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷:飞燕草素-3-O-葡萄糖苷:芍药色素-3-O-葡萄糖苷的质量比为40:3:1。
5.如权利要求4所述的组合物,其特征在于,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计,所述花色苷提取物中花色苷的质量分数为28.2%。
6.如权利要求1-5任一项所述的组合物在制备降血糖药物中的应用。
7.如权利要求1-5任一项所述的组合物在制备治疗或者预防II型糖尿病的药物中的应用。
8.如权利要求1-5任一项所述的组合物在制备协同降血糖药物中的应用。
9.一种药物,其特征在于,包括权利要求1-6任一项所述的组合物。
10.一种食品,其特征在于,包括权利要求1-6任一项所述的组合物。
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