KR102552690B1

KR102552690B1 - 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102552690B1
Application number: KR1020210014628A
Authority: KR
Inventors: 박지종; 양희석; 이민석; 전진; 방석호
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2023-07-21
Also published as: KR20220112312A

Abstract

본 발명은 3차원 세포 스페로이드가 담지되는 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치로서, 상기 다수의 패치들은 독립된 각 패치에 포함되는 각각의 컨케이브 입구를 개방형 구조 또는 폐쇄형 구조 중에서 선택적으로 조절 가능한 것이거나; 독립된 각 패치에서 컨케이브의 입구가 개방된 개방형 구조와 컨케이브의 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조의 융합된 구조를 가지는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치와 이의 제조방법, 및 이를 이식하여 이용하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치는 패치 가장자리의 개방형 구조는 세포 스페로이드가 이식 가능하도록 역할을 하고, 안쪽의 폐쇄형 구조에서는 세포 스페로이드에서 분해되는 사이토카인에 의해 가장자리에서 이식되는 세포 스페로이드의 분화, 이식 후 생존율을 높일 수 있는 시너지 효과를 가진다.

Description

세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치 및 이의 제조 방법{CONCAVE FOR CELL SPHEROID RESERVATION BASED ON 3D PRINTING, TRANSPLANT PATCH USING THE SAME, AND METHOD FOR PREPARING THEREOF}

본 발명은 3D 프린팅 기반 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치, 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 상세하게는 3D 프린팅 기술을 이용하여 제조된 다양한 크기의 컨케이브를 이용하여 개방형과 폐쇄형 구조를 조절할 수 있는 융합형 구조를 가지는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

실제 체내 세포 또는 조직은 복잡한 3차원 구조를 가지고 있으며 세포간의 상호 작용으로 인해 성장, 분화하는 특성을 가지고 있다. 대부분의 2차원 세포배양으로는 체내 세포 환경 조건을 제대로 모사하지 못하기 때문에 생체 내 효과를 확인하기 위하여 3차원 세포 스페로이드 제조가 필요하다.

이에 3차원 세포 스페로이드를 만들기 위해서는 배양 접시의 뚜껑을 이용한hanging drop 방법, 3차원 배양 바이오리엑터, 그리고 최근 세포 담지용 컨케이브 (cancave) 등이 사용되고 있다.

그러나 종래의 기술로는 3차원 세포 스페로이드를 회수하여 이식하는 방법으로 진행되고 있어서 배양된 세포의 회수 과정이 필요하다. 또한 환부로 이식된 세포 스페로이드는 응집되어 있던 형태를 잃고 단일 세포로 형태가 바뀌어 이식 후 세포 생존율이 현저히 떨어지는 단점이 있어 하이드로젤을 추가적으로 함께 이식하는 과정이 필요하지만 이 또한 이식되는 하이드로젤로 인해 이식된 세포가 하이드로젤에 의한 조직내로의 직접적인 이식효율이 떨어지는 단점이 있다.

형성된 세포 회수 및 이식 방법은 바이오리엑터, 합성 담지체를 이용한 스페로이드 제작 등의 다양한 방식이 사용되고 있다. 이식된 세포 스페로이드의 조직 접착 및 스페로이드 형태 소실은 스페로이드의 효과를 잃어간다는 단점이 있으며, 이러한 현상을 억제하기 위하여 생분해성 고분자에 세포 스페로이드를 탑재하고 이식하는 방법이 연구되어지고 있다.

그러나, 상기 생분해성 고분자 담지체에 세포 스페로이드를 탑재하고 이식하는 방법은 이식한 세포 스페로이드가 숙주와 격리되어 융화되지 못한다는 단점을 가지고 있다. 줄기세포의 경우 세포 스페로이드를 이식하였을 때 숙주의 혈관, 근육, 골 등으로 분화하여 조직 재건이 이루어지지만 담지체에 의해 격리될 경우 그 효과는 떨어지게 된다.

이에 대한 종래 기술로는 한국공개특허 2017-0003177에서는 복수개의 다각형 기둥인 마이크로웰을 포함한 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트에 있어서, 상기 다각형 기둥인 마이크로 웰은 세포 또는 세포 집합체 배양이 이루어지는 공간으로서 육각 기둥인 것을 특징으로 하고; 상기 육각 기둥의 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 이루어지며; 및 상기 복수개의 육각 기둥은 수직으로 정렬하면서 일정한 간격으로 연속적으로 배열;하여 이루어지는 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법을 제시하였다.

상기 특허에서는 3차원 세포 또는 세포 집합체 배양하는 것이 가능하게 한 효과는 있으나, 상기 마이크로 플레이트는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리카보네이트(PC), 폴리(1-트리메틸실릴-1-프로핀)(PTMSP), 폴리테트라플로로에틸렌(PTFE), 우레탄, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 및 Agarose로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질을 사용하고 있는데, 이러한 재료들은 모두 생체내에 사용하는 데는 부작용이 있을 수 있어 바람직하지 못한 문제가 있다.

또한, 한국공개특허 2013-0013537에서는 측면이 곡면인 마이크로웰을 복수개 포함하는 마이크로 구조물에 액상의 폴리머를 주입하여 마이크로웰에 액상의 폴리머를 채우고; 상기 액상의 폴리머의 일부를 마이크로웰로부터 제거하여 마이크로웰에 남아 있는 액상의 폴리머가 표면장력에 의해 메니스커스(meniscus)를 형성하도록 하고; 메니스커스를 형성하고 있는 액상의 폴리머를 경화시키는 것을 포함하는 반구형 마이크로웰을 포함하는 마이크로 구조물의 제조 방법, 반구형 마이크로웰을 포함하는 마이크로 구조물의 제조 방법, 이에 따라 제조된 마이크로 구조물 및 이를 이용한 세포 집합체의 형성 방법을 제시하였다.

상기 특허에서는 세포집합체의 대량 생산을 가능하게 하는 반구형 마이크로웰을 포함하는 마이크로 구조물의 제조방법을 제시하고 있으나, 상기 특허 역시 액상의 폴리머로서 실리콘 폴리머, 폴리부타디엔, 폴리이소부틸렌 또는 폴리우레탄 등의 고분자 물질을 사용하고 있어 이 역시 생체 재료적인 측면에서 바람직하지 못하다고 할 수 있다.

따라서, 생분해성 고분자를 이용하여 생체적합성을 높이면서도, 세포 스페로이드와 결합되어 이식 후에도 세포로부터 격리되지 않고 그 형태를 잘 유지할 수 있으며, 이식효율이 높아 세포생존율을 높일 수 있으며, 다른 조직의 재생에도 기여할 수 있는 세포 담지체의 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 2017-0003177 한국공개특허 2013-0013537

Kim, Se-jeong, et al. "Lotus seedpod-inspired hydrogels as an all-in-one platform for culture and delivery of stem cell spheroids." Biomaterials 225 (2019): 119534.

본 발명에서는 3D 프린팅 기법으로 제조된 복수의 컨케이브를 하이드로겔을 이용하여 각각의 패치 내에서 컨케이브가 개방형 구조와 폐쇄형 구조를 선택적으로 가지도록 조절가능한 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 3D 프린팅 기법으로 제조된 복수의 컨케이브를 하이드로겔을 이용하여 각각의 패치 내에서 세포 스페로이드를 효과적으로 이식할 수 있는 개방형 구조를 가지는 컨케이브와 세포 스페로이드에서 분비되는 사이토카인에 의해 가장자리에서 이식되는 세포 스페로이드의 분화, 이식 후 생존율을 높일 수 있는 폐쇄형 구조를 가지는 컨케이브의 융합형 구조를 가지는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 제공하는 데 그 목적이 있다.

추가로, 본 발명은 상기 구조를 가지는 각각의 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 각각의 하이드로겔 패치에 세포 스페로이드를 담지시킨 하이드로겔 담지체를 피부 또는 심장의 이식에 이용하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치는; 3차원 세포 스페로이드가 담지되는 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치이고, 상기 다수의 패치들은 독립된 각 패치에 포함되는 각각의 컨케이브 입구를 개방형 구조 또는 폐쇄형 구조 중에서 선택적으로 조절 가능할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치는; 3차원 세포 스페로이드가 담지되는 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치이고, 상기 다수의 패치들은 독립된 각 패치에서 컨케이브의 입구가 개방된 개방형 구조와 컨케이브의 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조의 융합된 구조를 가질 수 있다.

상기 각 구조에서의 컨케이브는 300~900㎛의 크기를 가지며, 3D 프린팅 기법으로 제조되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 각 구조에서, 상기 컨케이브의 입구가 개방된 개방형 구조는 세포 스페로이드를 이식시키는 역할을 하며, 상기 컨케이브의 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조는 상기 세포 스페로이드 형태를 3차원 구형으로 유지시킴과 동시에, 분비되는 사이토카인에 의해 상기 이식되는 세포 스페로이드를 분화시키고, 이식 후의 세포 생존율을 높일 수 있다.

또한, 상기 각 구조에서, 상기 하이드로겔은 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 가교시킨 것이 바람직하게 이용될 수 있다.

또한, 상기 각 구조에서, 상기 개방형 구조는 인장강도가 100kPa 이상인 것이 바람직하다.

상기 각 구조에서, 상기 폐쇄형 구조는 팽윤도(swelling ratio)가 35% 이상인 것이 바람직하다.

상기 각 구조에서, 상기 세포 스페로이드는 구형의 3차원 구조를 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 패치 제조를 위한 주형을 3D 프린팅 기법으로 제조하는 제1단계, 상기 패치들의 복수의 컨케이브의 중앙으로부터 사방 40~60 %의 크기를 제외한 영역에 제1하이드로겔 용액을 첨가하고 가교시켜 상기 주형의 형태대로 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 제조하는 제2단계, 각 패치들에서 제1하이드로겔 용액이 첨가되지 않은 나머지 컨케이브에 제2하이드로겔 용액을 첨가하여 가교시키는 제3단계, 상기 제1단계의 3D 프린팅 기법으로 제조된 세포 스페로이드 담지용 패치 주형을 제거시키는 제4단계, 및 상기 주형을 제거시킨 각 하이드로겔 패치의 컨케이브에 세포를 주입시켜 배양시킴과 동시에, 상기 2단계와 3단계에서 가교된 각 패치를 팽윤시키는 제5단계를 포함하는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치의 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 제1하이드로겔 용액과 제2하이드로겔 용액은 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 포함할 수 있다.

상기 제1하이드로겔 용액의 가교는 가교된 후 측정한 하이드로겔의 인장강도가 100kPa 이상인 것이 바람직하다.

상기 제2하이드로겔 용액의 가교는 가교된 후 24시간 동안 수중에서 측정한 하이드로겔 팽윤도(swelling ratio)가 35% 이상을 만족하도록 약하게 가교된 것이 바람직하다.

상기 세포는 지방유래 줄기세포, 섬유아세포 중에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 세포 스페로이드는 3차원 구조를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법은; 상기 제4단계의 각 패치의 팽윤 단계를 거쳐, 상기 2단계의 하이드로겔을 포함하는 패치는 세포 스페로이드가 이식 가능한 개방형 구조를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법은; 상기 제4단계의 각 패치의 팽윤 단계를 거쳐, 상기 3단계의 하이드로겔을 포함하는 패치는 폐쇄된 구조를 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폐쇄된 구조를 가지는 제3단계의 하이드로겔을 포함하는 패치에서는 세포 스페로이드에서 분비되는 사이토카인에 의해 제2단계의 하이드로겔을 포함하는 패치에서 이식되는 세포 스페로이드의 분화를 촉진하여, 이식 후의 세포 생존율을 높일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 각 하이드로겔 패치에 세포 스페로이드를 담지시킨 하이드로겔 담지체를 피부의 창상, 화상; 또는 심장의 허혈성 질환의 이식에 이용하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 3D 프린팅 기법을 이용하여 다양한 크기를 가지는 컨케이브를 복수개로 포함하는 패치가 다수 개로 구성된 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 제조할 수 있으며, 상기 각 패치에서는 개방형 구조를 가지는 컨케이브와 폐쇄형 구조를 가지는 컨케이브, 또는 이를 모두 포함하는 융합형 구조를 선택적으로 포함되도록 조절 가능할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치는 패치 가장자리의 개방형 구조는 세포 스페로이드가 이식 가능하도록 역할을 하고, 안쪽의 폐쇄형 구조에서는 세포 스페로이드에서 분해되는 사이토카인에 의해 가장자리에서 이식되는 세포 스페로이드의 분화, 이식 후 생존율을 높일 수 있는 시너지 효과를 가질 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 융합형 구조를 가지는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치는 하나의 패치에서 사용되는 하이드로겔의 가교도 및 팽윤도를 적절히 조절함으로써 제조될 수 있으며, 한 번의 세포 분주에 의해 세포 스페로이드가 만들어지고, one-step으로 세포 스페로이드를 이식하여 이식된 세포 스페로이드의 생착율과 이식후 사멸을 줄임과 동시에 이식된 부위의 조직 재건에 효과적으로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치의 구조를 도식한 것이고,
도 2와 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치에서 개방형 구조와 폐쇄형 구조를 가지는 원리를 설명한 도면이고,
도 4는 제조예 1~6에 따라 제조된 각 하이드로겔(G1~G6)의 인장강도 측정 결과이고,
도 5와 6은 제조예 1~6에 따라 제조된 각 하이드로겔(G1~G6)의 팽창률(swelling ratio) 측정 결과이고,
도 7은 실시예 1에 따라 제조된 세포 스페로이드가 담지된 하이드로겔 패치의 제조 과정을 나타낸 것이고,
도 8은 실시예 1에 따라 제조된 세포 담지된 하이드로겔 패치에서 세포 스페로이드의 형성 여부를 확인한 광학현미경 사진이고,
도 9는 제조예 1~6의 각각의 그룹(G1~G6)에서 제조된 하이드로겔을 팽창시킨 다음 각 구조를 광학현미경으로 측정한 사진이고,
도 10은 실시예 1에 따라 제조된 세포 담지된 하이드로겔 패치의 구조를 광학현미경으로 측정한 사진이고,
도 11은 실시예 1의 하이드로겔 패치 제작 중 제 2단계의 제1하이드로겔을 주형 전체에 도포하여 제작한 패치에서 형성된 스페로이드의 RNA 발현양 차이를 통한 사이토카인의 양을 확인한 결과이고,
도 12는 실시예 1에 따라 제조된 패치를 측면으로 뉘었을 때 개방형 컨케이브에서의 섬유아세포 탈출 가능여부를 확인한 광학현미경 사진이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 발명은 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치와 이의 제조방법, 및 이를 피부 또는 심장에 이식하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 다음 도 1을 참조하여 설명하면, 3차원 세포 스페로이드가 담지되는 다양한 크기의 컨케이브(10a, 20a, 30a, 40a)를 복수개로 포함하는 다수의 패치들(10, 20, 30, 40)로 이루어져 있으며, 상기 다수의 패치들(10, 20, 30, 40)은 독립된 각 패치에 포함되는 각각의 컨케이브의 입구를 개방형 구조 또는 폐쇄형 구조로 선택적으로 조절 가능한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 다음 도 1을 참조하여 설명하면, 3차원 세포 스페로이드가 담지되는 다양한 크기의 컨케이브(10a, 20a, 30a, 40a)를 복수개로 포함하는 다수의 패치들(10, 20, 30, 40)로 이루어져 있으며, 상기 다수의 패치들(10, 20, 30, 40)은 독립된 각 패치에서 컨케이브의 입구가 개방된 개방형 구조와 컨케이브의 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조의 융합된 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다음 도 1에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치에서는 독립된 4개의 패치들(10, 20, 30, 40)로 이루어져 있으며, 상기 각 패치들(10, 20, 30, 40)은 그 내부에 다양한 크기를 가지는 컨케이브(10a, 20a, 30a, 40a)를 복수개로 포함하는 구조를 가질 수 있다.

상기 각 컨케이브는 300~900㎛의 크기로 다양하게 조절 가능하며, 구형체 혹은 정육면체의 기둥 모양으로 주형을 만들어 3D 프린팅 기법을 이용하여 정교하게 제조되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서는 상기 각 컨케이브의 크기나 간격을 조절하여 독립된 패치의 크기를 결정한다.

본 발명에 따른 상기 각 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치에서, 컨케이브의 입구가 개방된 개방형 구조는 세포 스페로이드를 이식시키는 역할을 하며, 컨케이브의 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조는 세포 스페로이드의 형태를 3차원의 구형 구조로 유지시킴과 동시에, 분비되는 사이토카인에 의해 상기 이식되는 세포 스페로이드를 분화시키고, 이식 후의 세포 생존율을 높이는 역할을 한다.

따라서, 본 발명의 하이드로겔 패치의 각 컨케이브 내에 포함된 세포 스페로이드는 구형의 3차원 구조를 유지할 수 있는 특징을 가진다.

상기와 같은 구조 및 특징을 가지는 본 발명에 따른 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치의 제조방법은 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 패치 제조를 위한 주형을 3D 프린팅 기법으로 제조하는 제1단계, 상기 패치들의 복수의 컨케이브의 일부에 제1하이드로겔 용액을 첨가하고 가교시켜 상기 주형의 형태대로 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 제조하는 제2단계, 각 패치들에서 제1하이드로겔 용액이 첨가되지 않은 나머지 컨케이브에 제2하이드로겔 용액을 첨가하여 가교시키는 제3단계, 상기 제1단계의 3D 프린팅 기법으로 제조된 세포 스페로이드 담지용 패치 주형을 제거시키는 제4단계, 및 상기 주형을 제거시킨 각 하이드로겔 패치의 컨케이브에 세포를 주입시켜 배양시킴과 동시에, 상기 2단계와 3단계에서 가교된 각 패치를 팽윤시키는 제5단계를 포함하는 것을 그 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 스페로이드 담지용 패치의 제1단계는 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 패치 제조를 위한 주형을 3D 프린팅 기법으로 제조하는 단계이다.

세포 스페로이드 담지용 패치에 포함되는 독립된 각 패치들은 300~900㎛의 크기 내에서 컨케이브의 크기를 다양하게 결정하여, 구형체 혹은 정육면체의 기둥 모양으로 만들어 3D 프린팅 기법으로 주형을 제조할 수 있다.

제2단계는 상기 패치들의 복수의 컨케이브의 일부에 제1하이드로겔 용액을 첨가하고 가교시켜 상기 주형의 형태대로 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 제조하는 단계이다.

이때 각 독립된 패치에서 제1하이드로겔 용액을 첨가할 컨케이브를 결정하여 소정의 컨케이브에만 제1하이드로겔 용액을 첨가하고 가교시키는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 복수의 컨케이브로 구성된 각 패치 중에서 중앙으로부터 사방 40~60 %의 크기를 제외한 외곽의 영역을 의미한다.

따라서, 제2단계에서는 상기 제1하이드로겔 용액을 이용하여 인장강도가 100kPa 이상이 되도록 완전히 가교시키는 것이 바람직하다. 이는 이후 제5단계의 팽윤 과정에서 상기 제1하이드로겔 용액으로 가교된 패치가 컨케이브 형태까지 팽윤되지 않도록 하기 위함이다.

따라서, 최종 제조된 하이드로겔 패치의 구조에 따라, 예를 들어, 독립된 각 패치에 포함되는 각각의 컨케이브의 입구를 개방형 구조 또는 폐쇄형 구조로 선택적으로 조절 가능한 구조인 경우, 상기 제1하이드로겔 용액을 독립된 하나의 패치에서 랜덤하게 소정의 컨케이브에 가하여 가교시킬 수 있다.

또한, 독립된 각 패치에서 컨케이브의 입구가 개방된 개방형 구조와 컨케이브의 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조의 융합된 구조를 가지도록 하는 경우에는, 상기 제1하이드로겔 용액을 독립된 하나의 패치에서 중앙으로부터 사방 40~60 %의 크기를 제외한 가장 자리의 컨케이브에만 가하여 가교시키는 것이 바람직하다.

상기 제1하이드로겔 용액은 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 혼합한 것으로, 인장 변형(tensile strain)이 100kPa 이상이 되도록 완전히 가교시키는 것이 차후 독립된 하나의 패치에서 제2하이드로겔 용액을 첨가하여 팽윤시킬 때 변형을 일으키지 않도록 하기 위한 목적에서 바람직하며, 인장 변형(tensile strain)이 100kPa 미만인 경우에는 팽윤 과정에서 팽윤이 과하게 발생되어 본 발명에서 목적하는 폐쇄된 구조를 가질 수 없기 때문에 바람직하지 못하다.

다음 제3단계는 상기 각 패치들에서 제1하이드로겔 용액이 첨가되지 않은 나머지 컨케이브(중앙으로부터 사방 40~60 %의 크기)에 제2하이드로겔 용액을 첨가하여 가교시키는 단계이다.

이때 사용되는 제2하이드로겔 용액은 상기 제1하이드로겔 용액과 동일한 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 혼합한 것으로, 팽윤도(swelling ratio)가 35% 이상을 가지도록 약하게 가교시키는 것이 바람직하다. 여기서 '약하게 가교시킨다'는 의미는 가교 후 물 속에서 측정된 팽윤도가 35% 이상으로 팽윤될 수 있다는 것을 포함하는 것으로, 상기 제1하이드로겔 용액을 이용하여 가장자리의 컨케이브가 팽윤시킬 때 변형을 일으키지 않는 것과는 상반적인 의미로 이해될 수 있다. 따라서, 상기 제3단계의 제2하이드로겔 용액을 이용하여 팽윤도가 35% 미만이 되도록 가교를 강하게 시키는 경우 패치 내에서 오픈된 구조를 가지도록 할 수 없어 바람직하지 못하다.

그 다음 제4단계는 상기 제1단계의 3D 프린팅 기법으로 제조된 세포 스페로이드 담지용 패치 주형을 제거시키는 단계이다. 소정의 하이드로겔 패치 형태를 가지므로 상기 주형은 제거시키는 것이 바람직하다.

마지막으로, 상기 주형을 제거시킨 각 하이드로겔 패치의 컨케이브에 세포를 주입시켜 배양시킴과 동시에, 상기 2단계와 3단계에서 가교된 각 패치를 팽윤시키는 제5단계를 포함한다. 상기 과정은 세포가 배양되는 과정인 동시에 가교된 하이드로겔이 팽윤되는 과정이라 할 수 있다. 세포를 컨케이브에 주입시키기 위해서는 배양 접시에서 배양된 세포를 효소처리 (Trypsin EDTA)를 통하여 분리시킨 다음, 상기 주형을 제거시킨 각 하이드로겔 패치를 세포배양액에 담군다. 이때, 상기 각 하이드로겔 패치의 컨케이브에 1.0x10³~ 3.0x10⁴ cell/concave의 양으로 세포가 분주되어 배양시키면서 현탁액 상태인 세포와 배양배지 간의 밀도 차에 의하여 컨케이브 안으로 세포가 들어가게 된다. 세포의 배양 범위가 1.0x10³ cell/concave 미만인 경우 효과 주입 효과가 미흡하고, 또한 상기 범위를 초과하여 3.0x10⁴ cell/concave의 양으로 주입되는 경우 세포가 넘치게 되어 추후 세포 배지 교환 과정에서 자연스럽게 사라지게 된다.

상기 주입되는 세포에는 섬유아세포, 지방유래 줄기세포 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 이때 상기 제2단계와 3단계에서 가교된 각 하이드로겔 패치를 팽윤시키는 과정도 동시에 진행된다. 즉, 상기 팽윤 과정은 상기 제조된 하이드로겔 패치를 세포배양액에 담궈서 세포를 배양시키는 침지시키는 과정(약 24시간)에서 이루어진다.

이 과정을 다음 도 2와 3을 참조하면, 독립된 하나의 패치를 팽윤시킬 때, 상기 제2단계를 거쳐 제조된 하이드로겔이 포함된 컨케이브는 인장 변형(tensile strain)이 100kPa 이상이 되도록 가교가 충분히 진행되어 물 속에서 팽윤(swelling)이 훨씬 적게 진행되고, 상기 제3단계를 거쳐 제조된 하이드로겔이 포함된 컨케이브는 팽윤도(swelling ratio)가 35% 이상을 가지도록 가교가 약하게 진행되어 팽윤(swelling)이 훨씬 많이 진행될 것으로 예상할 수 있다.

즉, 상기 제3단계를 거쳐 제조된 하이드로겔이 포함된 컨케이브는 인장 변형률이 100kPa로 딱딱한 구조의 제2단계를 거쳐 제조된 하이드로겔이 포함된 컨케이브로 사방이 가로막혀 있어 충분한 팽윤이 일어나지 못하고, 다음 도 3과 같이 양쪽이 휘어지는 구조를 가질 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 제2단계를 거쳐 제조된 하이드로겔이 포함된 컨케이브는 그 입구가 개방된 개방형 구조를 가지고, 제3단계를 거쳐 제조된 하이드로겔이 포함된 컨케이브는 그 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조가 융합된 컨케이브들로 이루어진 독립된 하나의 패치를 제조할 수 있는 원리이다.

따라서, 본 발명에서는 폐쇄형 구조의 컨케이브와 개방형 구조의 컨케이브가 하나의 패치로서 세포 스페로이드 담지할 수 있는 융합형 세포 스페로이드 패치를 원-스텝(one-step)으로 제조할 수 있다.

또한, 이렇게 제조된 융합형 세포 스페로이드 패치는 패치 가장자리에서는 세포 스페로이드가 이식 가능한 개방형과 안쪽 패치에서는 세포 스페로이드에서 분해되는 사이토카인에 의해 가장자리에서 이식되는 세포 스페로이드의 분화, 이식 후 생존율을 높일 수 있는 효과를 가진다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

제조예 1~6 : 하이드로겔 용액 선정을 위한 하이드로겔 패치 제조

1) 3D 프린팅을 이용한 주형 제조

4개의 독립된 패치를 포함하는 세포 스페로이드 담지용 패치 제조를 위해, 각 독립된 패치 안에는 300, 500, 700, 900㎛ 크기의 구형의 컨케이브가 36개씩 포함된 구조로 된 주형을 3D 프린팅 기법으로 제조하였다.

2) 하이드로겔 용액 제조 및 가교

40wt%의 아크릴아미드 모노머와 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 2wt%를 다음 표 1의 조성으로 상기 3D 프린팅 기법으로 제조된 주형에 붓고 30분 동안 가교시켜 하이드로겔을 제조하였다.

제조예 (함량 :㎕)	아크릴아미드	가교제	완충제(1M)	초순수	인장강도(kPa)
1	1000	75	50	3875	8
2	1000	200	50	3750	6
3	1000	500	50	3450	9
4	1000	1000	50	2950	66
5	1875	750	50	2325	104
6	1875	3000	50	75	144.5

실험예 1 : 인장강도 측정

그 다음, 가교된 각 시료를 직사각형 형태로 제작된 그룹별 겔을 지그에 물리고 상하로 20 mm/min으로 인장시켰을 때의 인장강도를 4회 측정하였으며, 그 결과를 평균내어 상기 표 1과 다음 도 4에 나타내었다.

상기 표 1과 다음 도 4를 참조하면, 아크릴아미드 모노머와 가교제의 함량에 따라 인장 변형률(tensile strain)은 0.25~2.5(mm/mm)로 차이가 났으며, 최대 로드에서 인장 변형률(tensile stress at maximum load)는 1.0 ~ 150 kPa로 측정되었다. 대체로 가교가 많이 진행될수록 (G1→G6) 인장강도 물성은 좋아지는 것으로 확인되었다.

실험예 2 : 팽창률(팽윤률) 측정

상기 가교된 각 하이드로겔 시료들의 팽창률 측정을 위하여 각 시료를 24시간 동안 물(세포 배지)에 담군 다음, 물에 담구기 전과 후의 길이 차이로 팽창률(Swelling ratio, %)을 다음 식으로 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 5와 6에 나타내었다.

다음 도 5와 6의 결과를 참고하면, 가교제 및 단량체의 농도가 낮을수록 수분의 침투 공간이 늘어나며, 낮은 인장강도에 의하여 형태를 유지하지 않고 팽창하는 성질을 가짐을 확인할 수 있다. 즉, 수분 흡수 후 팽창률은 50%에서 1% 까지 다양하게 나타남을 확인하였는데, 그룹 1의 시료에서 팽창률이 50% 이상으로 가장 높은 것으로 측정되었다. 즉, 가교도가 낮을수록 하이드로겔이 수분 흡수를 많이 하여 팽창률은 높은 것으로 나타났다.

실시예 1 : 세포 스페로이드가 담지된 하이드로겔 패치의 제조

상기 제조예에서 제조된 3D 프린팅을 이용한 900㎛ 크기의 컨케이브가 6x6개로 이루어진 동립된 패치가 4개로 이루어진 주형에 상기 독립된 패치 중, 중앙으로부터 3x3개의 컨케이브 구역을 제외한 나머지 각 컨케이브에 상기 제조예의 그룹 6의 조성으로 이루어진 하이드로겔 용액을 붓고 30분 동안 가교시켰다. 상기 가교된 하이드로겔의 인장강도는 시편 제작시 150 kPa 였다.

그 다음, 상기에서 제외시킨 나머지 컨케이브에 상기 제조예의 그룹 1에 따른 조성으로 된 하이드로겔 용액을 붓고 30분 동안 가교시켰다. (도 7 참조)

상기 2단계의 하이드로겔 용액의 가교가 끝난 다음에는, 상기 사용된 3D 프린팅 기법으로 제조된 세포 스페로이드 담지용 패치 주형을 제거시켰다.

상기 주형을 제거시킨 각 하이드로겔 패치를 24시간 동안 섬유아세포 세포 배양액에 담궈 각 하이드로겔 패치의 컨케이브에 3.0 x 10⁴ cell/concave 의 함량으로 주입되도록 세포를 배양시킴과 동시에, 상기 실험예 2와 동일한 조건으로 팽윤시켜 세포가 담지된 최종 하이드로겔 패치를 제조하였다.

실험예 3 : 세포 담지된 하이드로겔 패치에서 세포 스페로이드의 형성 확인

상기 제조된 하이드로겔 패치에서 세포가 3차원의 스페로이드를 형성하면서 잘 담지되었는지를 세포 배양 후와 하루(24시간)가 지난 다음의 구조를 광학현미경으로 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 8에 나타내었다.

다음 도 8을 참조하면, 컨케이브 내부에 세포가 들어가게 되고 세포는 시간이 경과함에 따라 컨케이브의 바닥에 붙지 않고 (일반적 2D culture에서는 바닥에 붙어 자람) 세포간의 부착을 보이며 3차원 구조의 스페로이드를 형성함을 확인하였다.

실험예 4 : 세포 담지된 하이드로겔 패치의 구조 확인

상기 제조예 1~6의 각각의 그룹에서 제조된 하이드로겔을 팽창시킨 다음 각 구조를 광학현미경으로 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 9에 나타내었다.

다음 도 9를 참조하면, 각 그룹에서 제조된 하이드로겔은 그 팽창률의 차이에 따라 폐쇄형 담지체가 형성되거나(G1), 또는 개방형 담지체가 형성(G2~G6)됨을 확인할 수 있다.

따라서, 이러한 결과로부터 상기 G1 하이드로겔의 경우 섬유아세포 스페로이드를 담지하고 유지하는 폐쇄형 구조를 가지고, G2~G6에 따른 하이드로겔은 세포 전달용으로 사용할 수 있는 개방형 구조를 가짐을 알 수 있다.

실험예 5 : 세포 담지된 하이드로겔 패치의 구조 확인

상기 실시예 1에 따라 제조된 세포 담지된 하이드로겔 패치의 구조를 광학현미경으로 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 10에 나타내었다.

다음 도 10을 참조하면, 상기 각 오픈형 구조의 컨케이브와 폐쇄형 구조의 컨케이브 모두에서 지방유래 줄기세포는 3차원 구조의 스페로이드가 형성됨을 확인할 수 있다.

실험예 6 : 세포 스페로이드 형성에 의한 RNA 발현량 변화 측정

상기 실시예 1의 하이드로겔 패치 제작 중 제 2단계의 제1하이드로겔을 주형 전체에 도포하여 제작한 패치에서 형성된 스페로이드의 RNA 발현량 차이를 통한 사이토카인의 양을 확인하였다. (폐쇄형의 경우, 세포 회수가 용이하지 않아 실험 진행 불가)

각각의 담지체에서 배양된 지방유래 줄기세포는 회수되어 Trizol 용액에 용해하여 세포 내 물질을 추출하고, 클로로포름을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 oligo dT를 사용하여 무작위로 역전사 하여 cDNA를 얻었으며 이를 각 표적 유전자의 프라이머와 PCR을 진행하고, 전기영동법을 사용하여 분리 후 DNA의 양을 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 11에 나타내었다. 또한, 다음 도 11에서는 같은 수의 세포를 2d (일반적인 세포배양법) 배양으로 세포를 배양하고 이를 single group으로 사용하여 비교하였다.)

다음 도 11을 참조하면, 항존유전자(House keeping gene)인 GAPDH와 상대적인 양을 비교해 보았을 때, 혈관의 형성을 유도하는 성장인자(growth factor)인 VEGF, HGF, FGF2의 발현양이 Spheroid group(실시예 1)에서 Single group보다 높은 수준의 발현이 나타나는 것이 확인되었으며, 세포사멸 항 인자인 Bcl-2 또한 Spheroid group(실시예 1)에서 Single group보다 높은 양이 발현됨을 확인하였다. 이는 혈관이 소실된 환부에 세포치료를 했을 때, 혈관유입을 유도하고, 세포사멸을 방지하여 높은 세포 생존율을 유도할 수 있으며, 더 높은 세포치료 효과를 보여 줄 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 7 : 개방형 컨케이브에서의 세포 탈출 가능 여부 확인

본 발명에 따라 제조된 세포 스페로이드 담지된 하이드로겔 패치에서 환부 표면에 용이하게 이식가능 여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 1에 따라 제조된 패치를 측면으로 뉘었을 때 개방형 컨케이브에서의 섬유아세포 탈출 가능여부를 확인하였으며, 그 결과를 광학현미경 사진으로 측정하여 다음 도 12에 나타내었다.

통상 환부로 이식된 스페로이드는 환부 표면에(세포가 부착되기 유리한 환경) 점착 후 스페로이드의 형태를 잃고 단일 세포(single cell)로 나뉘어진다. 이로 인해 스페로이드 형태에서 분비되는 성장인자의 효과가 약해지는 문제가 있다.

그러나, 다음 도 12를 참조하면, 본 발명의 상기 실시예 1에 따라 제조된 하이드로겔 패치에서 개방된 컨케이브 구조를 통하여 섬유아세포(화살표 표시 부분)가 탈출되어 효과적으로 방출되는 것을 확인할 수 있다.

Claims

3차원 세포 스페로이드가 담지되는 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치이고,
상기 다수의 패치들은 독립된 각 패치에 포함되는 복수의 컨케이브의 중앙으로부터 사방 40~60 %의 크기를 제외한 영역에는 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 가교시킨 인장강도가 100kPa 이상인 하이드로겔을 이용하여 각각의 컨케이브 입구가 개방형 구조를 가지거나,
또는 독립된 각 패치에 포함되는 복수의 컨케이브의 중앙으로부터 사방 40~60 %의 영역에는 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 가교시킨 팽윤도(swelling ratio)가 35% 이상인 하이드로겔을 이용하여 각각의 컨케이브 입구가 폐쇄형 구조 중에서 선택적으로 조절 가능한 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치.
3차원 세포 스페로이드가 담지되는 다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치이고,
상기 다수의 패치들은 독립된 각 패치에 포함되는 복수의 컨케이브의 중앙으로부터 사방 40~60 %의 크기를 제외한 영역에는 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 가교시킨 인장강도가 100kPa 이상인 하이드로겔을 이용하여 각각의 컨케이브 입구가 개방형 구조와,
독립된 각 패치에 포함되는 복수의 컨케이브의 중앙으로부터 사방 40~60 %의 영역에는 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 가교시킨 팽윤도(swelling ratio)가 35% 이상인 하이드로겔을 이용하여 각각의 컨케이브 입구가 폐쇄형 구조의 융합된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 컨케이브는 300~900㎛의 크기를 가지며, 3D 프린팅 기법으로 제조되는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 컨케이브의 입구가 개방된 개방형 구조는 세포 스페로이드를 이식시키는 역할을 하며,
상기 컨케이브의 입구가 폐쇄된 폐쇄형 구조는 상기 세포 스페로이드 형태를 3차원 구형으로 유지시킴과 동시에, 분비되는 사이토카인에 의해 상기 이식되는 세포 스페로이드를 분화시키고, 이식 후의 세포 생존율을 높이는 것인 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 세포 스페로이드는 구형의 3차원 구조를 가지는 것인 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치.
다양한 크기의 컨케이브를 복수개로 포함하는 다수의 패치들로 이루어진 세포 스페로이드 담지용 패치 제조를 위한 주형을 3D 프린팅 기법으로 제조하는 제1단계;
상기 패치들의 복수의 컨케이브의 중앙으로부터 사방 40~60 %의 크기를 제외한 영역에 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 포함하는제1하이드로겔 용액을 첨가하여 가교 후 측정한 제1하이드로겔의 인장강도가 100kPa 이상이 되도록 가교시켜 상기 주형의 형태대로 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치를 제조하는 제2단계;
각 패치들에서 제1하이드로겔 용액이 첨가되지 않은 나머지 컨케이브에 아크릴아미드 모노머와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 가교제를 포함하는 제2하이드로겔 용액을 첨가하여 가교시키되, 가교 후 24시간 동안 수중에서 측정한 제하이드로겔 팽윤도(swelling ratio)가 35% 이상이 되도록 약하게 가교시키는 제3단계;
상기 제1단계의 3D 프린팅 기법으로 제조된 세포 스페로이드 담지용 패치 주형을 제거시키는 제4단계; 및
상기 주형을 제거시킨 각 하이드로겔 패치의 컨케이브에 세포를 주입시켜 배양시킴과 동시에, 상기 2단계와 3단계에서 가교된 각 패치를 팽윤시키는 제5단계를 포함하는 세포 스페로이드 담지용 하이드로겔 패치의 제조방법.
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제 9 항에 있어서,
상기 세포는 지방유래 줄기세포, 섬유아세포 중에서 선택되는 1종 이상인 것인 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 세포 스페로이드는 3차원 구조를 가지는 것인 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 제4단계의 각 패치의 팽윤 단계를 거쳐,
상기 2단계의 하이드로겔을 포함하는 패치는 세포 스페로이드가 이식 가능한 개방형 구조를 가지는 것인 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 제4단계의 각 패치의 팽윤 단계를 거쳐,
상기 3단계의 하이드로겔을 포함하는 패치는 폐쇄된 구조를 가지는 것인 제조방법.
제 16 항에 있어서,
상기 폐쇄된 구조를 가지는 제3단계의 하이드로겔을 포함하는 패치에서는 세포 스페로이드에서 분비되는 사이토카인에 의해 제2단계의 하이드로겔을 포함하는 패치에서 이식되는 세포 스페로이드의 분화를 촉진하여, 이식 후의 세포 생존율을 높이는 것인 제조방법.
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