KR101429047B1

KR101429047B1 - Plga 세포지지체

Info

Publication number: KR101429047B1
Application number: KR20130053022A
Authority: KR
Inventors: 전원배; 최성균
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2014-08-12
Also published as: US20150030655A1; US9345807B2

Abstract

본 발명은 PLGA 세포지지체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포독성이 없어 안전하며, 미국 FDA 승인을 받은 PLGA를 포함하고 세포부착능이 낮은 종래의 PLGA 세포지지체의 문제를 효과적으로 해결한 PLGA 세포지지체에 관한 것이다.

Description

PLGA 세포지지체{Poly(D,L-lactide-co-glycolide) cell scaffold}

최근 생명공학 분야 중에서도 조직의 치료 및 재생을 위한 조직공학(tissue engineering) 분야가 발달하고 있다. 조직공학(tissue engineering)은 세포학, 생명과학, 공학, 의학 등의 기존의 과학 영역을 응용하는 다학제간 학문으로 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체, 재생시키기 위한 새로운 융합 학문분야이다. 즉, 체내에 이식가능한 인공생체조직을 만들어 우리 몸의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는, 줄기세포의 증식 및 분화 연구, 세포 및 생체적합 삼차원적 지지체 개발, 및 다양한 조직공학적 툴 개발을 위한 연구 등이 있다. 이들 중에서도 줄기세포 또는 조직세포를 담지할 수 있는 삼차원적 지지체는 인공조직 및 장기 개발에 있어서 핵심적인 요소이다.

인체 조직의 재생을 위해서 사용되는 지지체 재료의 주된 요건으로는 조직세포가 재료표면에 유착하여 3차원 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 해내야 하고, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 중간 장벽으로서의 역할도 해야하는데 이는 이식 후 혈액 응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성이 있어야 함을 의미한다. 또한 이식된 세포가 충분히 조직으로서 제 기능과 역할을 하게 되면 원하는 시간에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성을 지녀야 한다. 따라서, 지지체는 주로 합성 및 천연 고분자, 그리고 이들의 복합체를 이용하여 3차원적으로 제조되며 다양한 형태와 물성이 있다. 현재 널리 상용되고 있는 합성 생분해성 고분자로는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL)과 이들의 유도체 및 공중합체들이 대부분이다. 천연 생분해성 고분자로는 콜라겐, 알기네이트, 히알루론산, 젤라틴, 키토산, 피브린 등이 사용되고 있다. 지지체의 형태로는 스폰지, 겔, 섬유 및 미세구슬 등의 여러 가지 형태가 사용되고 있으며, 이들 중 다공성의 스폰지와 주입형의 하이드로겔이 가장 널리 사용되고 있다.

현재 조직공학의 여러 가지 기술적인 제약들 중에서도 지지체와 관련한 시급한 요소기술은 무엇보다도 지지체 내의 세포적합 표면 환경조성 기술이다. 지지체의 주요 임무가 세포부착 및 성장에 유리한 삼차원적인 환경을 제공하는 것에 비추어 세포부착이 일어나는 지지체 표면의 특징은 현재 및 미래의 세포거동을 결정짓는 중요한 잣대가 될 수 있다.

하지만 세포 지지체(Scaffold) 사용 기반 연구의 부족으로 인해 적용에 많은 어려움이 있으며, 인체 조직과 유사한 3차원적 입체구조의 세포 지지체 개발 및 인체 적용이 미비하다는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 세포독성이 없어 안전하며 우수한 생체 적합성을 가지면서도 인체 조직과 유사한 3차원의 다공성 세포 지지체 및 그 제조방법을 제공하려는 목적이 있다.

본 발명은 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide)를 CHCl₃에 용해시켜 PLGA 용액을 제조하는 단계; 및 상기 PLGA 용액에 NaHCO₃를 첨가하여 다공성 구조를 포함하는 PLGA 세포지지체를 제조하는 단계; 를 포함하는 세포지지체 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PLGA 세포지지체 표면에 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC(REP) 기질로 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 1 내지 200 ㎍ 코팅된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 PLGA 용액에 시트르산(citric acid)을 더 포함하며, 상기 PLGA에 100 중량부에 대하여 NaHCO₃ 100 ~ 300 중량부 및 시트르산 2 ~ 20 중량부 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, PLGA 100 중량부에 대하여 CHCl₃ 4,000 ~ 5,000 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 PLGA는 분자량 40,000 ~ 75,000이며, 락티드(lactide) 100 중량부에 대하여 글리콜산(glycolide) 80 ~ 150 중량부 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 REP 기질로 코팅된 세포지지체에 레티노산(retinoic acid) 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide) 세포 지지체; 및 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC(REP) 기질; 을 포함하는 세포지지체를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PLGA 세포지지체는 NaHCO₃를 이용한 가스 포밍방법(gas foaming method)으로 제작되며 다공성 구조를 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포지지체는 레티노산(retinoic acid)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 세포 지지체는 세포 부착율 및 세포 증식율이 향상되어 생체 적합성이 우수하며, 3차원의 다공성 세포 지지체를 제공함으로써 인체적용 연구에 다양한 세포 지지체에 활용방법을 제공할 수 있다.

도 1은 PLGA 지지체의 표면을 REP 기질로 코팅하는 과정의 모식도이다.
도 2는 실험예 1에서 측정한 PLGA 지지체의 FT-IR 스펙트럼이다.(A: 실시예 2에서 제조한 PLGA 지지체(CS), B: 실시예 3에서 제조한 실시예 3에서 제조한 PLGA 지지체(S3))
도 3은 실험예 2-1에서 촬영한, 실시예 2에서 제작한 PLGA 지지체(CS)의 SEM 사진이다.
도 4는 실험예 2-1에서 촬영한, 실시예 3에서 제작된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체 중 S1의 SEM 사진이다.
도 5는 실험예 2-1에서 촬영한, 실시예 3에서 제작된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체 중 S2의 SEM 사진이다.
도 6은 실험예 2-1에서 촬영한, 실시예 3에서 제작된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체 중 S3의 SEM 사진이다.
도 7은 실험예 2-1에서 촬영한, 실시예 3에서 제작된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체 중 S4의 SEM 사진이다.
도 8은 실험예 2-1에서 촬영한, 실시예 3에서 제작된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체 중 S5의 SEM 사진이다.
도 9는 실험예 2-2에서 촬영한, CS의 H&E-stained cross-sectional specimens의 이미지 J이다.
도 10은 실험예 2-2에서 촬영한, S4의 H&E-stained cross-sectional specimens의 이미지 J이다.(A: PLGA 지지체에 코팅된 REP의 작은 물방울(small droplet), B: PLGA 지지체에 코팅된 REP의 큰 물방울(big droplet))
도 11은 실험예 2-2에서 측정된 다공도 그래프이다.
도 12는 실험예 3-1의 세포부착 어세이에서 측정된 흡광도이다.
도 13은 실험예 3-2의 세포증식 어세이에서 측정된 흡광도이다.
도 14는 실험예 4의 세포분화 어세이에서 측정된 qRT-PCR 그래프이다.
도 15는 실험예 5에서 REP 기질이 코팅된 PLGA 지지체 표면의 NPCs를 8시간 배양시킨 후 측정한 SEM 사진이다.(A: S3, B: S4, C: S5)
도 16은 실험예 5에서 REP 기질이 코팅된 PLGA 지지체 표면의 NPCs를 36시간 배양시킨 후 측정한 SEM 사진이다.(A: S3, B: S4, C: S5)
도 17은 실험예 5에서 REP 기질이 코팅된 PLGA 지지체 표면의 NPCs 세포 형태 관찰을 위하여 측정한 H&E-staining 방법으로 촬영한 SEM 사진이다.(A: S4, B: S4 + RA)

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.

본 발명의 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지는 것을 의미하는 것이다.

또한, 본 발명의 "인공세포외 기질"은 세포의 부착, 이동, 분화 등에 중요한 역할을 하는 세포외 기질을 유전자 클로닝(Gene cloning) 기법을 이용하여 인공적으로 생산한 세포외기질을 포함할 수 있으며, 엘라스틴 인공 단백질(Elastin mimetic protein)을 기본 구조(back bone)로 인테그린 중재적 상호작용(integrin mediated interaction)에 관여하는 마르기닐 글리실 아스파르트산(Arginyl Glycyl Aspartic acid; Arg-Gly-Asp (RGD)) 모티프(motif)를 포함하고 있는 인공단백질을 의미하는 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 세포 지지체는 세포 지지체 사용 기반 연구의 부족으로 인해 적용에 많은 어려움이 있으며, 인체 조직과 유사한 3차원적 입체구조의 세포 지지체 개발 및 인체 적용이 미비하다는 문제점이 있었다.

이에 본 발명은 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide) 세포 지지체; 및 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC(REP) 기질; 을 포함하는 세포지지체를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 세포 부착율 및 세포 증식율이 향상되어 생체 적합성이 우수하며, 3차원의 다공성 세포 지지체를 제공함으로써 인체적용 연구에 다양한 세포 지지체에 활용방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 세포지지체는 PLGA 세포지지체 및 REP 기질을 포함하여 종래의 PLGA 세포지지체보다 세포 부착율 및 세포 증식율을 향상시킬 수 있었다.

먼저, 상기 PLGA 세포지지체는 통상의 세포지지체로 사용될 수 있는 재료 및 형태의 폴리락트산-글리콜산 공중합체라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 분자량 40,000 ~ 75,000일 수 있고, 락티드(lactide) 100 중량부에 대하여 글리콜산(glycolide) 80 ~ 150 중량부 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 PLGA 및 NaHCO₃를 이용한 가스 포밍방법(gas foaming method)으로 제작되며 다공성 구조를 가질 것일 수 있다.

또한, 상기 PLGA 세포지지체는 통상적으로 세포지지체로 사용될 수 있는 크기라면 특별히 제한하지 않으며 사용하고자 하는 조직재생 부위에 따라 모양 및 형태를 구성할 수 있으나, 바람직하게는 3 ㎝ × 5 ㎝ × 3 ㎝ (가로 × 세로 ×높이) ~ 10 ㎝ × 15 ㎝ × 10 ㎝ (가로 × 세로 ×높이) 인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 ㎝ × 7 ㎝ × 5 ㎝ (가로 × 세로 ×높이) ~ 7 ㎝ × 10 ㎝ × 7 ㎝ (가로 × 세로 ×높이) 인 것일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

다음으로, 상기 REP 기질은 엘라스틴 유사 인공세포외 기질로서, 통상의 방법으로 제조 또는 판매되는 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC 기질(matrix)라면 특별히 제한하지 않는다. 상기 REP 기질은 PLGA 세포지지체를 코팅됨으로써 종래의 PLGA가 갖는 낮은 세포 부착율 및 세포 증식율을 증가시킬 수 있다.

또한, REP 기질은 PLGA 세포지지체에 코팅되는 것이라면 코팅하는 양은 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 1 내지 200 ㎍ 코팅된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 3 내지 150 ㎍ 코팅된 것일 수 있다. 만약 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 200 ㎍을 초과하여 코팅될 경우, PLGA 세포지지체 표면의 다공성 구조가 감소하는 문제가 발생할 수 있고, PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 1 ㎍ 미만으로 코팅될 경우, PLGA 세포지지체의 생체 적합성이 손상되어 세포지지체로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 세포지지체은 레티노산을 더 포함할 수 있다. 상기 레티노산은 통상적으로 구매 또는 제조할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 상기 세포지지체가 포함하는 레티노산의 농도는 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 ~ 20 μM인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 ~ 13 μM인 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

또한, 본 발명은 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide)를 CHCl₃에 용해시켜 PLGA 용액을 제조하는 단계; 및 상기 PLGA 용액에 NaHCO₃를 첨가하여 다공성 구조를 포함하는 PLGA 세포지지체를 제조하는 단계; 를 포함하는 세포지지체 제조방법을 제공한다.

먼저, 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide)를 CHCl₃에 용해시켜 PLGA 용액을 제조하는 단계를 설명한다.

상기 폴리락트산-글리콜산 공중합체는 통상적으로 구매 또는 제조할 수 있는 재료 및 형태의 폴리락트산-글리콜산 공중합체라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 분자량 40,000 ~ 75,000일 수 있고, 락티드(lactide) 100 중량부에 대하여 글리콜산(glycolide) 80 ~ 150 중량부 포함하는 것일 수 있다.

상기 PLGA 용액은 CHCl₃에 PLGA를 용해시킨 것이라면 특별히 농도를 제한하지 않으나, 바람직하게는 PLGA 100 중량부에 대하여 CHCl₃ 4,000 ~ 5,000 중량부 포함하는 것, 더욱 바람직하게는 PLGA 100 중량부에 대하여 CHCl₃ 4,200 ~ 4,500 중량부 포함할 수 있다.

다음으로, 상기 PLGA 용액에 NaHCO₃를 첨가하여 다공성 구조를 포함하는 PLGA 세포지지체를 제조하는 단계를 설명한다.

통상적으로 PLGA 용액에 NaHCO₃를 첨가하여 다공성 구조의 PLGA 세포지지체를 제조하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 PLGA 및 NaHCO₃를 이용한 가스 포밍방법(gas foaming method)으로 다공성 구조를 포함하는 PLGA 세포지지체를 제조하는 것일 수 있다. 또한, 상기 PLGA 용액에 첨가되는 NaHCO₃은 양을 특별히 제한하지 않으나, PLGA에 100 중량부에 대하여 NaHCO₃ 1,000 ~ 2,000 중량부 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 PLGA 용액은 NaHCO₃ 및 시트르산(citric acid)을 포함할 수 있다. 상기 PLGA 용액에 포함되는 NaHCO₃ 및 시트르산의 첨가량은 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 PLGA에 100 중량부에 대하여 NaHCO₃ 100 ~ 300 중량부 및 시트르산 2 ~ 20 중량부 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 PLGA에 100 중량부에 대하여 NaHCO₃ 150 ~ 230 중량부 및 시트르산 5 ~ 15 중량부 포함할 수 있다.

또한, 상기 PLGA 세포지지체는 통상적으로 세포지지체로 사용될 수 있는 크기라면 특별히 제한하지 않으며 사용하고자 하는 조직재생 부위에 따라 모양 및 형태를 구성할 수 있으나, 바람직하게는 3 ㎝ × 5 ㎝ × 3 ㎝ (가로 × 세로 ×높이) ~ 10 ㎝ × 15 ㎝ × 10 ㎝ (가로 × 세로 ×높이) 인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 ㎝ × 7 ㎝ × 5 ㎝ (가로 × 세로 ×높이) ~ 7 ㎝ × 10 ㎝ × 7 ㎝ (가로 × 세로 ×높이), 이에 제한하지는 않는다.

본 발명의 일구현예에 따르면, PLGA 세포지지체 표면에 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC (REP) 기질로 코팅하는 단계를 설명한다.

상기 REP 기질은 엘라스틴 유사 인공세포외 기질로서, 통상의 방법으로 제조 또는 판매되는 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC 기질(matrix)라면 특별히 제한하지 않는다. 또한, 상기 REP 기질은 PLGA 세포지지체를 코팅함으로써 종래의 PLGA가 갖는 낮은 세포 부착율 및 세포 증식율을 증가시킬 수 있다.

나아가, REP 기질은 PLGA 세포지지체에 코팅하는 것이라면 코팅되는 양은 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 1 내지 200 ㎍ 코팅된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 3 내지 150 ㎍ 코팅된 것일 수 있다. 만약 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 200 ㎍을 초과하여 코팅될 경우, PLGA 세포지지체 표면의 다공성 구조가 감소하는 문제가 발생할 수 있고, PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 1 ㎍ 미만으로 코팅될 경우, PLGA 세포지지체의 생체 적합성이 손상되어 세포지지체로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 REP 기질로 코팅된 세포지지체에 레티노산을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 레티노산은 통상적으로 구매 또는 제조할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 상기 세포지지체에 처리하는 레티노산의 농도는 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 ~ 20 μM인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 ~ 13 μM인 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 엘라스틴 유사 인공세포외 기질 제작

엘라스틴 유사 인공세포외 기질(Elastin-like artificial extracellular matrix)인 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC(REP) 기질(matrix)을 제작하였다. REP 기질은 pET-25b(+)-1 플라스미드(미국에 소재한 Novagen사 제품)를 사용하여 제조하였다. 이후 생산된 REP 기질은 역 열주기(inverse thermal cycling)로 E. coli BLR(DE3)로부터 정제된다. 정제된 REP 기질은 PBS(phosphate buffered saline; pH 7.4, 제조사 : 미국에 소재한 Gibco)에 용해하여 REP 기질로 사용하였다.

실시예 2. 세포 지지체 제작

세포 지지체는 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide), lactide:glycolide = 50:50, MW 40,000-75,000, 제조사 : 미국 소재 Sigma-Aldrich)를 사용하여 PLGA 지지체를 제작하였다. 상기 PLGA 지지체는 유도물질로 NaHCO₃(제조사 : 한국 소재 덕산 케미칼스)을 사용하여 가스 포밍 방법(gas foaming method)로 제작하였다. 1g의 PLGA는 셰이킹 로타이터(shaking rotater)의 팔콘 튜브에서 30 ㎖의 CHCl₃에 용해시켜 PLGA 용액을 제조하고, 상기 PLGA 용액에 2g의 NaHCO₃(지름 53 ~ 106 ㎛)이 포함된 10개 유리병(넓이 1.5 ㎝ × 높이 6.5 ㎝)을 첨가하였다. 이때, NaHCO₃ : PLGA의 질량비는 15 : 1 을 사용하였다. 상기 PLGA 용액은 층류후드(laminar flow hood) 하에서 2일 동안 건조하였고, 이후 12시간 동안 25 ℃에서 진공건조하여 PLGA 지지체를 제조하였다. 이후 제조된 PLGE 지지체는 유리병에 5 ㎖의 시트르산(citric acid) 용액을 첨가하여 셰이킹 로타이터(shaking rotater)에서 2일 동안 교반하여 PLGA 지지체를 다공성으로 제조하였다. 상기 유리병에 남아있는 시트르산을 진공흡입법으로 제거한 후, PLGA 지지체는 5 ㎖의 PBS로 2번 씻었다. 이후 PLGA 지지체는 25 ℃에서 12시간 동안 진공 하에서 건조하여 PLGA 지지체를 제조하였다.

실시예 3. PLGA 지지체 표면 개질

실시예 2에서 제조한 PLGA 지지체는 유리병(넓이 2 ㎝ × 높이 5 ㎝)에 1 ㎖ PBS 및 실시예 1에서 제조한 REP 기질 30 ㎍, 60 ㎍, 300 ㎍, 600 ㎍ 또는 1200 ㎍과 함께 침지하고 2시간 동안 4 ℃로 유지하였다. 이후 PLGA 지지체는 세포 컬처 챔버(cell culture chamber)에서 37 ℃로 1시간 동안 배양하여 PLGA 지지체 표면을 개질시켜 REP 코팅된 PLGA 지지체를 제조하였다. 상기 PLGA 지지체의 표면을 REP 기질로 코팅하는 과정을 하기 도 1에 나타내었다. 도 1의 A는 매크로 모양(macroscopic appearance)이고, B는 REP 기질에 침지된 PLGA 지지체의 모습이고, C는 REP 기질의 열변이에 의해 PLGA 지지체의 표면을 개질화시키는 과정의 모식도이다.

하기에는 REP 기질 30 ㎍으로 코칭한 PLGA 지지체는 S1, REP 기질 60 ㎍으로 코팅된 PLGA 지지체는 S2, REP 기질 300 ㎍으로 코팅된 PLGA 지지체는 S3, REP 기질 600 ㎍으로 코팅된 PLGA 지지체는 S4 및 REP 기질 1200 ㎍으로 코팅된 PLGA 지지체는 S5로 기재하였다.

실험예 1. FT - IR 스펙트럼

실시예 3에서 제조한 REP 코팅된 PLGA 지지체의 화학구조를 FT-IR 스펙트럼(Nicolet FT-IR 380)으로 분석하였는데, FT-IR 스펙트럼은 4000 ~ 525 ㎝ 사이의 파장을 측정하였다. 상기 FT-IR 스펙트럼에서 측정한 스펙트럼은 OMNIC^TM 소프트웨어로 분석하였고, 상기 FT-IR 스펙트럼 그래프는 하기 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 2에서 제조한 PLGA 지지체(CS)는 3000-2800 ㎝^-1에서 C-H 결합, 1750-1735 ㎝^-1에서 C=O 결합,1470-1430 ㎝^-1에서 CH₃ 비대칭 결합, 1425 ㎝^-1에서 CH₂-C=O 비대칭 결합, 1395-1365 ㎝^-1에서 CH₃ 대칭 결합, 1330-1050 ㎝^-1에서 C=O 및 O-C-C 결합, 1250-800 ㎝^-1에서 CH₃ 결합 및 770-720 ㎝^-1에서 CH₂ 결합의 피크를 확인할 수 있었다.

또한, 도 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 3에서 제조한 REP 기질 300 ㎍으로 코팅된 PLGA 지지체(S3)는 3개의 새로운 시그니처 피크(3288 ㎝^-1, 1645 ㎝^- ¹및 1539 ㎝^-1)를 확인할 수 있었다. 상기 피크들은 각각 인공세포외 기질(폴리펩타이드)의 아마이드 A(amide A), 아마이드 Ⅰ 및 아마이드 Ⅱ를 나타냈다. 상기 아마이드 A 피크는 수소 결합 펩타이드 N-H 결합으로부터 유래된 것이고, 아마이드 Ⅰ 피크는 C=O 결합과 연결된 N-H 결합 진동으로부터 유래된 것이며, 아마이드 Ⅱ 피크는 N-H 결합 진동과 연결된 C-N 결합으로부터 유래된 것이다.

상기 아마이드 A, 아마이드 Ⅰ 및 아마이드 Ⅱ의 발현 피크는 실시예 2에서 제조한 REP 기질로 코팅되지 않은 PLGA 지지체에서는 전혀 발현되지 않은 것이다. 이는 REP 기질 코팅 과정에서 화학적 반응 없이도 PLGA 지지체에 REP 기질 코팅한 것을 확인할 수 있었다.

나아가, 도 2에서 확인되는 바와 같이, REP 기질의 농도가 30 ㎍/㎖에서 120 ㎍/㎖ 또는 300 ㎍/㎖으로 증가하면 아마이드 Ⅱ 결합의 통합 영역은 4배 또는 10배 증폭되는 것을 확인하였다.

실험예 2. PLGA 지지체 특성

실험예 2-1 : SEM 사진

실시예 2에서 제작된 PLGA 지지체 및 실시예 3에서 제작된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체는 Hidachi 4800 스케닝 전자 현미경으로 SEM 사진을 촬영하였다. 상기 SEM 사진 중 실시예 2에서 제작된 PLGA 지지체(CS)는 하기 도 3, 실시예 3에서 제작된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체 중 S1은 하기 도 4, S2는 도 5, S3은 도 6, S4는 도 7 및 S5는 도 8에 나타내었다.

도 3 내지 7에서 확인되는 바와 같이, CS, S1, S2, S3 및 S4의 SEM 사진은 부드러운 표면 특성을 확인하였고, 또한 도 8에서 확인되는 바와 같이, S5의 SEM 사진은 15 ㎛ 이하 크기의 굴곡진 표면을 확인하였다.

실험예 2-2 : 공극률 측정

실시예 2의 PLGA 지지체(CS) 및 실시예 3의 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체(S1 ~ S5)의 공극률은 25 ℃, 1 atm 하에서 하기 수학식 1을 통해 계산되었다.

상기 D_scaffold는 지지체의 질량/지지체의 부피이고, D_material은 지지체 제작에 사용된 재료의 밀도이다. 이때, PLGA의 밀도는 1.25 g/㎤이고, REP 기질의 밀도는 1.22 g/㎤를 사용하였다.

또한, 다공도는 H&E-staining 방법에 의해 정의되는 이미지 J를 사용한 H&E-stained cross-sectional specimens 이미지 분석을 통해 측정하였고, 측정된 다공도는 하기 도 11에 나타내었다.

나아가, 공극의 크기와 공극의 구조는 H&E-stained cross-sectional specimens의 이미지 J에 의해 평가하였다. CS의 공극 크기 및 공극 구조의 이미지 J는 하기 도 9에 나타내었다. 또한, S4의 공극 크기 및 공극 구조의 이미지 J는 하기 도 10에 나타내었다.

도 10의 A 및 B에서 확인되는 바와 같이, 핑크 또는 바이올렛은 REP 기질층을 나타내고, 작은 물방울 모양들은 지지체의 표면 및 경계선에서 쉽게 관찰할 수 있었다. 또한, 상기 작은 물방울 모양들은 지름이 5 ~ 50 ㎛로 측정되었다.

도 3 내지 8의 전자현미경 SEM 사진 및 도 9 내지 10에 H&E 이미지는 공극들 사이의 바람직한 결합을 보여준다.

도 11에서 확인되는 바와 같이, 다공도는 각각 CS 48.8 %, S1 51.3 %, S2 47.3 %, S3 45.5 %, S4 44.2 % 및 S5 42.9 %로 확인되었다. 이는 PLGA 지지체를 코팅하는 REP 기질의 농도가 증가할수록 PLGA 지지체의 다공도가 감소하는 결과이다.

실험예 3. 세포 부착능 및 세포 증식 어세이

실험예 3-1 : 세포 부착 어세이

세포 부착 어세이(assay)를 위해서, 지름 6.5 ㎜ 및 높이 2 ㎜의 실시예 2에서 제조된 PLGA 지지체(CS) 및 실시예 3에서 제조된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체(S1 내지 S5) 각각을 96-웰 플레이트(96-well plate)에 놓았다. 상기 PLGA 지지체들은 부유방지를 위해 O-링을 사용하여 웰의 바닥에 고정하였고, UV선으로 하루 동안 살균하였다. 이후 NPCs(100 ㎕ NCM에 5 ×10⁴ cells)를 웰에 첨가하고 플레이트는 8시간 동안 37 ℃에서 5% CO₂ 챔버에서 배양되었다. 배양 이후, 세포가 성장된 지지체들은 새로운 96-웰 플레이트(96-well plate)로 옮겨졌다. 상기 새로운 96-웰 플레이트의 세포 수 측정을 위해, 각 웰에 90 ㎕ 신경 셀루션 메디아(Neural Cellutions Media; NCM, 제조사 : 미국소재 DV biologic) 및 10 ㎕ 세포 카운팅 키트-8(CCK-8; Cell Counting Kit-8, 제조사 : 일본소재 도진도몰 테크.) 시약을 첨가하여 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이후 Multiskan Ex 마이크로플레이트 리더에서 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 하기 도 12에 나타내었다.

상기 NPCs(미국소재 DV biologics사의 PN003-F)는 N-Gri-001-S(1 %, 제조사 : 미국소재 DV biologics사), N2 supplement (1 %, 제조사 : 미국소재 DV biologics사), 20 ng/㎖의 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, 제조사 : Gibco), 20 ng/㎖의 상피 성장 인자(epidermal growth factor, 제조사 : Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, 제조사 : Gibco) 및 2.5 ㎍/㎖의 암포테라신 B(amphotericin B, 제조사 : Gibco)를 포함하는 NCM에서 배양되었다. 이후 상기 NCM에 FBS를 첨가하였는데, 세포 부착 어세이 및 세포 증식 어세이에는 10 %를 첨가하고, 세포 분화 어세이에는 1%를 첨가하였다.

실험예 3-2 : 세포 증식 어세이

세포 증식 어세이를 위하여, 2개의 24-웰 플레이트를 준비하였는데 하나(A)는 3일 동안 세포 성장 어세이를 위한 것이고, 다른 하나(B)는 6일 동안의 세포 성장 어세이를 위한 것이다. 각 플레이트는 지름 10 ㎜ 및 높이 2 ㎜의 실시예 2에서 제조된 PLGA 지지체(CS) 및 실시예 3에서 제조된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체(S1 내지 S5)를 O-링을 사용하여 웰의 바닥에 고정하였고, UV선으로 하루 동안 살균하였다. 살균 이후 각 플레이트 각 지지체에 NPCs(500 ㎕ NCM에 1 ×10⁵ cells)를 첨가하였다. 상기 플레이트는 세포배양을 위해, 37 ℃에서 5% CO₂ 배양기로 옮겨졌다.

3일 후 세포 수 측정을 위해, 하나의 플레이트(A)는 CO₂ 배양기에서 꺼내서 50 ㎕의 CCK-8 시약을 각 세포-성장 웰에 첨가하고, 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 하기 도 13에 나타내었다.

6일째날 다른 하나의 플레이트(B)는 CO₂ 배양기에서 꺼내서 100 ㎕의 CCK-8 시약을 각 세포-성장 웰에 첨가하고, 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 하기 도 13에 나타내었다.

도 12에서 확인되는 바와 같이, NPC 부착률은 CS 대비 S1이 100%, S2는 105.5%, S3은 113.1 %, S4는 125.0% 및 S5는 129.8% 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 세포 부착 정도는 코팅되는 REP 기질의 농도 증가에 비례하여 증가하는 결과이다.

REP 기질 코팅이 NPC 세포 배양에 미치는 영향을 분석한 도 13에서 알 수 있듯이, NPC 세포 증식은 3일 또는 6일 후에 정량화되었다. 대조군인 CS와 비교하여, 3일 후 세포 증식은 S1이 116.2 %, S2는 150.6 %, S3은 146.1 %, S4는 155.3 % 및 S5는 150.4 %를 나타내었고, 6일 후 세포 증식은 S1이 115.4 %, S2는 136.7 %, S3은 160.1 %, S4는 163.6 % 및 S5는 165.4 %를 나타내었다.

이는 REP 코팅한 세포지지체의 경우, REP를 코팅하지 않은 세포지지체에 비해 세포증식을 향상시키는 것을 확인한 것이다. 또한 REP 코팅 농도가 증가함에 따라 세포 부착 및 세포의 증식이 촉진되어 REP를 코팅한 PLGA 세포지지체가 REP를 코팅하지 않은 세포지지체보다 더욱 적합한 것을 확인한 결과이다.

실험예 4. 세포 분화 어세이

세포 분화 분석을 위해, 지름 10 ㎜ 및 높이 2 ㎜의 실시예 2에서 제조된 PLGA 지지체(CS) 및 실시예 3에서 제조된 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체(S1 내지 S5)에서 24 시간 동안 실험예 1의 NPCs와 같은 NPC 배양균을 배양하였다. 세포 분화는 10 μM 농도의 레티노산(RA; all-trans-retinoic acid)을 첨가하여 유발되고, 레티노산 처리 4일 또는 8일 후 분석하였다.

NPC 세포 분화에서 REP 기질 코팅의 유효성은 5개 뉴런의 바이오마커 mRNA 트랜스크립트, NSE, TuJ1, NF68, 뉴런에 대한 MAP2, 애스트로사이드(astrocyte)에 대한 GFAP 및 연골세포에 대한 CNP의 상대수도(relative abundance) qRT-PCR 분석으로 측정하였다. 측정된 qRT-PCR 그래프는 하기 도 14에 나타냈다.

상기 qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)은 하기와 같은 방법으로 측정되었다. 모든 RNA는 실험예 3에서 사용한 NPCs와 같은 조건의 NPCs로부터 RNeasy 키트(제조사 : 미국소재 Qiagen)를 사용하여 분리하였다. cDNA는 4 ㎍의 상기 RNA로부터 하이-카파시티 cDNA 역전사 키트(high-capacity cDNA reverse transcription kit, 제조사 : 미국소재 applied biosystems)를 사용하여 합성된다. qRT-PCR은 SYBR Green PCR master mix kit(제조사 : 미국소재 applied biosystems)를 사용하여 ABI 7500 RT-PCR 시스템에서 측정하였다. 측정 조건은 2분 동안 50 ℃, 10분 동안 95 ℃ 이후 15초 동안 95 ℃ 및 1분 동안 60 ℃를 40번 반복하여 측정하였다. 프라이머 세트는 Genbank사의 인간 유전자 시퀀스(human gene sequences available)를 골격으로 프라이머 익스프레스 3.0 소프트웨어(primer express 3.0 software, 제조사 : 미국소재 applied biosystems)를 사용하여 디자인하였다.

도 14에서 확인되는 바와 같이, 레티노산(RA)를 처리하지 않은 S4 지지체의 NSE, MAP2, GFAP 및 CNP의 발현은 REP 코팅이 없는 실시예 2에서 제조한 PLGA 지지체인 CS와 유사한 것으로 확인되었다.

또한, RA를 첨가한 S4의 CNP를 제외한 모든 마커들의 mRNA 발현양은 RA를 첨가한 CS보다 1.8 ~ 6.9배 많이 발현되었고, RA를 첨가한 S4의 세포 성장에 있어서, mRNA의 상대수도는 GFAP(36.7%), TuJ1(28.8%), NF68(19.1%), NSE(8.0%), MAP2(4.6%) 그리고 CNP(1.5%) 순으로 측정되었다.

나아가, REP 및 RA의 복합처리로 인해, 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 특징의 CNP 유전자의 발현은 CS보다 1.4배 많았다.

또한, RA을 첨가한 S4에서의 세포 성장에 의해 발현하는 뉴런 및 아스트로그리알(astroglial) 마커 mRNA들의 양은 RA를 첨가하지 않은 S4 및 RA를 첨가한 CS보다 많이 발현되었다.

이는 TuJ1, NF68, NSE 및 MAP2는 신경세포(neuronal cell)의 분화 마커(marker)이며, GFAP 및 CNP는 각각 별아교세포(astrocyte)와 희돌기교세포(oligodendrocyte)의 분화 마커(marker)이다. 각각의 마커 별 mRNA 발현량의 증가는 신경줄기세포의 분화의 증거로 확인할 수 있으며 mRNA 발현량이 증가할수록 각각의 세포로 분화가 잘 되었다는 것으로 판단할 수 있다. 따라서 본 결과는 REP기질이 코팅된 PLGA 세포지지체, 신경분화물질 및 RA를 동시에 처리하였을 때, RA만 단독처리한 REP기질이 코팅된 PLGA 세포지지체에 비해 분화가 촉진되는 것을 확인한 결과이다.

실험예 5. REP 기질이 코팅된 PLGA 지지체 표면의 세포 형태

실시예 3에서 제조한 REP 기질이 코팅된 PLGA 지지체에서 배양된 NPCs 세포형태를 관찰하기 위하여, 실험예 4의 세포 분화 어세이와 같은 방법으로 각각의 지지체에 NPCs 세포를 배양하였다. 이후 세포가 배양된 지지체는 실험예 2-1에서 사용한 방법과 같은 방법으로 촬영한 전자현미경 SEM 사진을 측정하여 하기 도 15 내지 16에, 실험예 2-2에서 사용한 H&E-staining 방법으로 촬영한 SEM 사진은 도 17에 나타내었다.

도 15의 A 내지 C에서 확인되는 바와 같이, S3, S4 및 S5에서 배양 8시간 후 NPCs의 발현은 지름 10 ~ 20 ㎛의 원형으로 나타났다. 또한, 도 16의 A 내지 C에서 확인되는 바와 같이, S3, S4 및 S5에서 배양 36시간 후 NPCs는 확산되었고, 다른 부분과 연결되어 구형 세포들로 구성된 다세포층(multicellular layer)이 확인되었다.

도 17의 A에서 확인되는 바와 같이, 레티노산을 첨가하지 않은 S4에서 8일 동안 배양된 NPCs의 H&E-staining 이미지는 원형의 NPCs를 확인할 수 있었다. 또한, 도 17의 B에서 확인되는 바와 같이, 10 μM의 레티노산을 첨가한 S4에서 8일 동안 배양된 NPCs는 단일 세포로 배양되었거나, REP 기질 코팅 내에서 세포군 형태로 발현되었다.

이는 REP기질이 코팅된 PLGA 세포지지체상에서 세포의 이동이 촉진되어 일어난 현상으로 세포이동을 통해 형성된 세포군은 세포-세포간 상호작용을 통하여 단일 세포 상태로 배양되는 것에 비해 증식 및 분화를 촉진할 수 있다는 것을 확인한 결과이다.

상기 실시예 및 실험예를 통해 확인할 수 있듯이, 본원 발명의 REP 기질로 코팅된 PLGA 지지체는 세포 부착성이 좋지 않은 PLGA지지체를 REP 기질로 코팅하여 세포 부착 및 이동, 뿐만 아니라 세포의 증식 및 분화에도 적절한 미세환경을 제공해주는 장점이 있어, 체내 조직재생을 위한 줄기세포 및 세포지지체의 이식에 있어 효과적인 생체 적합성 물질로 유용하게 사용할 수 있을 것입니다.

Claims

폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide)를 CHCl₃에 용해시켜 PLGA 용액을 제조하는 단계;
상기 PLGA 용액에 NaHCO₃를 첨가하여 다공성 구조를 포함하는 PLGA 세포지지체를 제조하는 단계;
상기 PLGA 세포지지체 표면에 TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC(REP) 기질로 코팅하는 단계; 및
상기 REP 기질로 코팅된 세포지지체에 레티노산(retinoic acid) 처리하는 단계; 를 포함하는 세포지지체 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 1 내지 200 ㎍ 코팅된 것을 특징으로 하는 세포지지체 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, PLGA 100 중량부에 대하여 CHCl₃ 4,000 ~ 5,000 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포지지체 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 PLGA는 분자량 40,000 ~ 75,000이며, 락티드(lactide) 100 중량부에 대하여 글리콜산(glycolide) 80 ~ 150 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 세포지지체 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 PLGA 용액에 시트르산(citric acid)을 더 포함하며, 상기 PLGA에 100 중량부에 대하여 NaHCO₃ 100 ~ 300 중량부 및 시트르산 2 ~ 20 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 세포지지체 제조방법.
폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA; Poly(D,L-lactide-co-glycolide) 세포 지지체; 및
TGPG[VGRGD(VGVPG)₆]₂₀WPC(REP) 기질과 레티노산(retinoic acid)을 함유하고, 상기 세포지지체 표면을 코팅하는 기질 코팅층; 을 포함하는 세포지지체.
제8항에 있어서, 상기 PLGA 세포지지체 단면적 1 ㎠ 당 REP 기질이 1 내지 200 ㎍ 코팅된 것을 특징으로 하는 세포지지체.
제8항에 있어서, 상기 PLGA는 분자량 40,000 ~ 75,000이며, 락티드(lactide) 100 중량부에 대하여 글리콜산(glycolide) 80 ~ 150 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 세포지지체.
삭제
제8항에 있어서, 상기 PLGA 세포지지체는 NaHCO₃를 이용한 가스 포밍방법(gas foaming method)으로 제작되며 다공성 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 세포지지체.