KR102531617B1 - Tmem176b, 이의 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Tmem176b, 이의 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
TMEM176B를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 조성물에 의하면, 별아교세포의 아밀로이드-베타의 대식작용을 촉진하고, 아밀로이드 플라크를 감소시킬 뿐만 아니라, 알츠하이머 동물 모델에서 행동 및 인지기능 개선의 효과가 있어 다양한 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
Description
퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적 원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 퇴행성 뇌질환의 종류로는 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 파킨슨 질환 (Parkinson's disease) 및 기억 장애 등 이 있다. 퇴행성 뇌질환은 급격히 또는 천천히 진행되는 괴사 (necrosis)나 아폽토시스 (apoptosis)에 의한 신경세포의 사멸이 나타난다. 따라서 신경세포의 사멸기전에 대한 이해는 중추신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위하여 이루어져야 한다.
한편, 퇴행성 뇌질환의 한 종류인 알츠하이머의 중요한 병리적 특징은 노인성 플라크 (senile plaque)라고 불리는 펩티드 응집체의 형성이며, 이는 시냅스 기능장애 및 신경세포의 사멸을 유발한다. 이러한 노인성 플라크의 성분 중 하나는 40-42 아미노산 길이의 아밀로이드-베타 (amyloid-beta)이다. 아밀로이드-베타 단량체는 올리고머, 원섬유 (protofibril) 및 베타-시트가 풍부한 섬유로 자가조립(self-assemble)되기 쉽고, 신경 독성의 발병과 관련이 있다.
아밀로이드-베타 플라크와 신경 독성 사이의 상관관계에 대해서는 아직 명확히 밝혀진 바가 없지만, 아밀로이드-베타의 중간 올리고머 또는 응집체로의 자가 조립은 알츠하이머병과 같은 뇌신경 질환의 발병과 관련된 것으로 여겨지고 있다.
한편, 최근 신경아교세포와 미세아교세포가 알츠하이머의 주요 발병 원인 펩타이드인 아밀로이드-베타를 대식작용(phagocytosis) 할 수 있음이 보고되어 있다(Chung, W.S., et al., Do glia drive synaptic and cognitive impairment in disease?, Nat Neurosci, 2015. 18(11): p. 1539-45.)
따라서, 아밀로이드-베타 응집 억제 또는 응집체를 분해하거나, 비정상적으로 과인산화되어 있는 타우 단백질을 감소시키거나, 신경아교세포의 대식작용을 증가시키는 것이 알츠하이머, 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환의 치료를 위한 방법으로 제안된다.
일 양상은 TMEM176B(Transmembrane Protein 176B) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 포함하는 인지 장애의 예방 또는 개선 또는 기억력 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
일 양상은 TMEM176B 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "TMEM176B(Transmembrane protein 176B)"은 막 관통영역을 가지는 단백질일 수 있고, LR8 또는 MS4B2라고도 한다. 본 명세서에서 상기 TMEM176B는 TMEM176B의 파라로그, 오솔로그, 또는 호몰로그를 모두 포함하는 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 TMEM176B 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA (gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 TMEM176B 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인 (complementary) 서열도 포함하는 것일 수 있다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건 (stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
상기 활성 또는 발현 증진제는 TMEM176B에 직접 또는 간접적으로 작용하여 TMEM176B의 발현 또는 활성을 개선, 유도, 자극, 증가시키는 물질을 의미한다. 이런 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 펩타이드, 단백질, 항체, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 포함한다. 상기 물질이 TMEM176B의 활성 또는 발현을 증진(촉진)시키는 기작은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 물질이 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키는 것을 말한다.
일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은,
(1) 아밀로이드-베타의 수준 또는 아밀로이드-베타의 응집 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체;
(2) 타우 단백질의 응집 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체;
(3) 타우 단백질의 인산화 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체;
(4) 신경아교세포(glia)의 기능이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 저하(dysfunction)되거나 저하될 위험이 있는 개체; 및
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 1 가지 이상에 해당하는 개체에게 투여하기 위한 것일 수 있다.
상기 아밀로이드-베타 또는 타우 단백질의 응집 수준은 아밀로이드-베타 응집체 또는 타우 단백질 응집체의 양 (농도) 또는 전체 아밀로이드-베타 또는 전체 타우 단백질에 대한 아밀로이드-베타 응집체 또는 타우 단백질 응집체의 비율을 의미할 수 있다.
상기 타우 단백질의 인산화 수준은 인산화된 타우 단백질의 양 (농도) 또는 전체 타우 단백질에 대한 인산화된 타우 단백질의 비율을 의미할 수 있다.
인간 아밀로이드-베타 (amyloid-beta)는 약 36-43개 아미노산을 포함하는 펩타이드 분자로서, 알츠하이머 환자의 뇌에서 발현되는 아밀로이드 플라크의 주된 성분으로, 알츠하이머병의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 아밀로이드-베타 펩타이드 분자는 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein (APP); UniProtKB P05067)을 베타 세크레타제 (beta secretase)와 감마 세크레타제 (gamma secretase)로 절단하여 얻어지는 것일 수 있다. 아밀로이드-베타 펩타이드 분자는 응집하여 신경세포 독성 올리고머를 형성하여, 퇴행성 뇌질환을 유발한다.
상기 타우 (Tau) 단백질은 N-말단 돌출 부분, 프롤린 (proline) 응집 도메인, 미세소기관 결합 도메인 및 C-말단의 4부분으로 구성되어 있으며(Mandelkow et al., Acta. Neuropathol., 103, 26-35, 1996), 중추신경계의 신경세포 속에서 타우가 비정상적으로 과인산화되거나 변형되는 경우 파킨슨병, 타우병증 (tauopathy)과 같은 퇴행성 뇌질환을 유발한다고 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "퇴행성 뇌질환"은 뇌의 퇴행성 변화와 관련된 모든 질환, 특히, 뇌 및/또는 뇌신경세포에서의 아밀로이드-베타의 응집 등의 요인에 의하여 유발될 수 있는 모든 질환 (뇌질환)을 포괄적으로 기재하기 위하여 사용된다. 일 구체예에서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증 (Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군 (Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조 (Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병 (Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매 (Lewy Body Dementia), 근육긴장이상 (Dystonia), 진행성 핵상 마비 (Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매 (Frontotemporal Dementia)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 아밀로이드-베타의 응집에 기인한 질병이라면 어느 질병이라도 대상이 될 수 있다.
상기 "정상"은 상기 약학적 조성물의 적용 개체와 동종의 개체 중에서 상기 정의한 "퇴행성 뇌질환"을 갖지 않는 개체 또는 상기 개체로부터 분리 및/또는 배양된 뇌조직 또는 뇌세포 (뇌신경세포)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 TMEM176B 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 활성 또는 발현 증진제는 신경아교세포 (glial cell)의 아밀로이드-베타에 대한 대식 작용을 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 신경아교세포는 뇌실막세포(ependymal cell), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), 별아교세포(astrocyte), 또는 미세아교세포(microglia)인 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 상기 TMEM176B 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 활성 또는 발현 증진제는 개체의 뇌 내의 아밀로이드-베타의 응집 및/또는 축적을 억제할 수 있어, 퇴행성 뇌질환을 포함하는 아밀로이드-베타의 응집에 기인한 질병에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양상은 TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 서열번호 1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질은 서열번호 1로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
다른 양상은 TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터(adeno-associated virus, AAV)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 아데노-연관 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명은 TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터를 제공하는 것일 수 있다. 바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 입자의 형태이다. 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어, AAV로부터 유래되는 것들을 제조하고 변형시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. AAV 게놈은 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이는 AAV 입자의 생산에 필요한 기능을 인코딩한다. 이러한 기능은 AAV 게놈을 AAV 입자로 캡시드화하는 것을 포함하여, 숙주 세포에서 AAV의 복제 및 패키징 사이클에서 작용하는 것들을 포함한다. 자연 발생 AAV는 복제-결핍성이며 복제 및 패키징 사이클을 완료하기 위해 인 트랜스 (in trans) 헬퍼 기능의 제공에 의존한다. AAV 게놈은 양성 또는 음성-센스의 단일-가닥 형태이거나, 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 사용은 표적 세포에서 DNA 복제 단계를 우회할 수 있게 하므로, 트랜스진 발현을 가속시킬 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 자연적으로 유래된 혈청형, 분리물 또는 클레드 (clade)로부터 비롯될 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 자연 발생 AAV의 완전한 게놈일 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 자연에서 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다. 일반적으로, AAV는 이들의 혈청형에 관하여 지칭된다. 혈청형은 AAV의 변이체 아종에 상응하는데, 이는 캡시드 표면 항원의 발현 프로파일 때문에, 다른 변이체 아종으로부터 이를 구별하는데 사용될 수 있는 독특한 반응성을 가지고 있다. 전형적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차-반응하지 않는다. AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 최근에 영장류 뇌에서 확인된 Rec2 및 Rec3과 같은 재조합 혈청형을 포함한다. 이러한 임의의 AAV 혈청형은 본 발명에 사용될 수 있다.
AAV는 또한 클레드 또는 클론에 관하여 지칭될 수 있다. 이것은 자연적으로 유래된 AAV의 계통발생학적 관계를 지칭하며, 전형적으로 공통 조상으로 거슬러 올라갈 수 있는 AAV의 계통발생학적 그룹을 지칭하고, 이의 모든 자손을 포함한다. 추가로, AAV는 특정 분리물, 즉, 자연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 분리물에 관하여 지칭될 수 있다. 용어 유전적 분리물은 다른 자연 발생 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪은 AAV의 집단을 기술함으로써 유전적 수준에서 인지 가능한 별개의 집단을 정의한다.
당업자는 이들의 공통된 일반적인 지식에 기초하여 본 발명에 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클레드, 클론 또는 분리물을 선택할 수 있다.
상기 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터는 특정 세포에 바이러스를 만들 수 있는 재료들을 도입하여 제작된 것이고, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 AAV에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장 (packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 AAV 용액을 얻고, 이를 이용하여 뇌세포, 신경세포 및/또는 신경전구세포 등의 세포를 감염시킴으로써 세포에 TMEM176B 유전자를 도입할 수 있다.
AAV를 포함한 상기 벡터는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미하는 것일 수 있다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예를 들어, 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것일 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
또한, 상기 벡터는 유전자 치료용 발현벡터를 의미하는 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 바이러스 벡터는 원하는 세포, 조직 및/또는 기관으로 치료 유전자 또는 유전물질을 전달할 수 있는 바이러스 벡터를 의미하는 것일 수 있다. 상기 용어 "유전자 치료 (gene therapy)"는 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병을 치료하기 위하여, 유전자 이상이 있는 세포에 정상 유전자를 삽입하거나 새로운 기능을 제공하여 그의 기능을 정상화시키는 방법을 의미하는 것일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 재조합 벡터는 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또 다른 양상은 TMEM176B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에 도입했을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상을 의미하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 줄기세포, 전구세포 또는 동물세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포는 구체적으로 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 줄기세포에서 분화된 줄기세포, 예컨대 배아줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 신경줄기세포 등을 모두 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 세포는 자가 (autologous) 또는 타가, 또는 동종이계 (allogenic) 또는 이종 (Xenogenic) 세포일 수 있다.
본 발명의 상기 형질전환된 세포는 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 병적 증상의 경감 또는 개선, 질환의 부위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태 또는 증상의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 용어 "예방"은 특정 질병을 갖지 않는 대상에게 작용하여 상기 특정 질병이 발병하지 않도록 하거나, 그 발병 시기를 늦추거나, 발병 빈도를 낮추는 모든 기작 및/또는 효과를 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "약학적 조성물"은, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭할 수 있다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 상기 유효성분에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 유화제 (계면활성제), 윤활제, 감미제, 향미제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 상기 약학적 조성물이 적용되는 제형에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 약제학 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 모든 보조제들 중에서 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 유효성분의 유효량 또는 상기 약학적 조성물은 임상투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강 (Nasal), 흡입, 안구 또는 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있고, 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 상기 약학적 조성물은 활성 성분이 위에서의 분해되지 않도록 하기 위하여 활성 성분을 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호 가능한 제형으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "유효성분"은 본 명세서에서 언급된 물질이 본 명세서에서 언급된 약리학적 활성 (예를 들면, 퇴행성 뇌질환 치료)을 달성하기 위해 사용되는 생리활성 물질을 의미하는 것일 수 있고, 이는 본 명세서에서 언급된 질병을 치료하기 위해 상기 물질을 단독 투여 하거나, 다른 물질과 함께 병용 투여, 또는 부가적으로 투여하는 것과는 구분된다. 즉, 상기 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포 및 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제는 퇴행성 뇌질환의 직접적인 치료 효과를 위한 단독의 유효성분으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 수성 또는 유성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제제화될 수 있으며, 제제화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체 (Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 (Ascorbic acid) 또는 글루타치온 (Glutathione)과 같은 항산화제 (Antioxidants), 킬레이트화제 (Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 그 투여 용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여될 수 있다. 약학적 조성물의 투여량은 1일 1 ug/kg/일 내지 1,OOO mg/kg/일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 또는 1회 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 퇴행성 뇌질환의 치유를 필요로 하는 개체일 수 있다.
본 발명의 유효성분이 재조합 벡터인 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유할 수 있고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유할 수 있으며, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 103~1012 IU (10 내지 1010 PFU)를 함유할 수 있고, 좀 더 구체적으로는 105 내지 1010 IU를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 유효성분이 세포인 경우, 구체적으로 103 내지 108개를 함유할 수 있고, 좀 더 구체적으로 104 내지 107개를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 재조합 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자 (105 내지 109 IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏일 수 있고, 구체적으로 재조합 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자 (106 내지 108 IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105세포/㎏일 수 있으며, 일일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 상기 조성은 반드시 이에 제한되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
또 다른 양상은 약학적 유효량의 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포 및 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 퇴행성 뇌질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 약학적 유효량의 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포 및 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환을 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 아밀로이드-베타 응집 억제 및/또는 분해가 필요한 개체에게 약학적 유효량의 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포 및 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-베타 응집 억제 및/또는 분해 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 아밀로이드-베타 응집 억제 및/또는 분해를 필요로 하는 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 타우 단백질 분해 (및/또는 응집 억제) 및/또는 타우 단백질 인산화 억제를 필요로 하는 개체에게 약학적 유효량의 상기 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포 및 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 타우 단백질 분해 (및/또는 응집 억제) 및/또는 타우 단백질 인산화 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 타우 단백질 분해 (및/또는 응집 억제) 및/또는 타우 단백질 인산화 억제를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포 및 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 포함하는 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
또 다른 양상은 TMEM176B 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 포함하는 인지 장애의 예방 또는 개선 또는 기억력 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "인지"는 사고, 경험 및 감각을 통해 지식과 이해를 얻는 정신적 활동 또는 과정일 수 있다. 여기에는 지식, 주의, 기억 및 작업 기억, 판단 및 평가, 추론 및 계산, 문제 해결 및 의사 결정, 언어의 이해 및 생성과 같은 과정이 포함될 수 있다. 상기 인지 장애는 학습, 기억, 지각 및 문제 해결에 주로 영향을 끼치는 정신 건강 장애의 범주로서, 기억상실증, 치매 및 섬망 (delirium)을 포함할 수 있다.
상기 기억력 개선은 신경해부학적 구조의 손상의 결과, 기억의 저장, 보유 및 재수집을 개선하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 진행성일 수 있는 (알츠하이머병을 포함함) 기억력 장애를 개선하는 것을 의미할 수 있다.
상기 건강 기능성 식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (이하, '기능성 원료')을 사용하여 제조한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강 기능성 식품은 각종 식품, 음료 조성물, 식품 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건강 기능성 식품에 함유된 유효성분의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.0001 내지 99 중량%, 0.0001 내지 95 중량%, 0.0001 내지 90 중량%, 0.0001 내지 80 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 0.001 내지 99 중량%, 0.001 내지 95 중량%, 0.001 내지 90 중량%, 0.001 내지 80 중량%, 0.001 내지 50 중량%, 0.01 내지 99 중량%, 0.01 내지 95 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 80 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 0.1 내지 95 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 80 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 0.1 내지 30 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 1 내지 99 중량%, 1 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 50 중량%, 1 내지 30 중량%, 1 내지 10 중량%, 10 내지 99 중량%, 10 내지 95 중량%, 10 내지 90 중량%, 10 내지 80 중량%, 10 내지 50 중량%, 10 내지 30 중량%, 25 내지 99 중량%, 25 내지 95 중량%, 25 내지 90 중량%, 25 내지 80 중량%, 25 내지 50 중량%, 25 내지 30 중량%, 40 내지 99 중량%, 40 내지 95 중량%, 40 내지 90 중량%, 40 내지 80 중량%, 40 내지 50 중량%, 50 내지 99 중량%, 50 내지 95 중량%, 50 내지 90 중량%, 50 내지 80 중량%, 60 내지 99 중량%, 60 내지 95 중량%, 60 내지 90 중량%, 또는 60 내지 80 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제 (치즈, 초콜릿등), 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 전체 건강 기능성 식품 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발명에 대해 기술한 용어 및 방법 등은 각 발명들 간에 동일하게 적용된다.
일 양상에 따른 신경아교세포의 아밀로이드-베타 대식작용을 증가시키는 TMEM176B 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 활성 또는 발현 증진제를 유효성분으로 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물에 의하면, 별아교세포의 아밀로이드-베타의 대식작용을 촉진하고, 아밀로이드 플라크를 감소시킬 뿐만 아니라, 알츠하이머 동물 모델에서 행동 및 인지기능 개선의 효과가 있어 다양한 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 TMEM176B억제제가 처리된 별아교세포의 FAM-표지된 아밀로이드- 베타에 대한 대식작용을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 아데노 연관 바이러스를 이용하여 TMEM176B 유전자를 도입한 별아교세포에서 TMEM176B 발현 증가를 확인한 웨스턴 블랏 결과 및 그래프이다.
도 3은 아데노 연관 바이러스를 이용하여 TMEM176B 유전자를 도입한 별아교세포 의 대식작용이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 4는 알츠하이머병 모델 마우스에서의 TMEM176B-아데노-연관 바이러스의 치료 효과를 확인하기 위한 투여 및 평가방법에 대한 모식도이다.
도 5는 아밀로이드-베타 염색을 통해 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군에서 플라크 감소를 확인한 사진이다.
도 6은 아밀로이드-베타 염색을 통해 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군에서 플라크 감소를 확인한 그래프이다.
도 7은 수중미로시험을 통하여 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군에서 플랫폼에 도달하는 시간이 감소된 것을 확인한 그래프이다.
도 8은 플랫폼 제거 후 행동평가에서 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군의 인지기능이 개선된 것을 확인한 그래프이다.
도 2는 아데노 연관 바이러스를 이용하여 TMEM176B 유전자를 도입한 별아교세포에서 TMEM176B 발현 증가를 확인한 웨스턴 블랏 결과 및 그래프이다.
도 3은 아데노 연관 바이러스를 이용하여 TMEM176B 유전자를 도입한 별아교세포 의 대식작용이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 4는 알츠하이머병 모델 마우스에서의 TMEM176B-아데노-연관 바이러스의 치료 효과를 확인하기 위한 투여 및 평가방법에 대한 모식도이다.
도 5는 아밀로이드-베타 염색을 통해 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군에서 플라크 감소를 확인한 사진이다.
도 6은 아밀로이드-베타 염색을 통해 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군에서 플라크 감소를 확인한 그래프이다.
도 7은 수중미로시험을 통하여 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군에서 플랫폼에 도달하는 시간이 감소된 것을 확인한 그래프이다.
도 8은 플랫폼 제거 후 행동평가에서 TMEM176B-아데노-연관 바이러스 투여군의 인지기능이 개선된 것을 확인한 그래프이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. TMEM176B 억제에 의한 별아교세포 (astrocyte)의 대식작용 확인
TMEM176B를 억제함에 따라 별아교세포의 대식작용에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.
구체적으로, TMEM176B의 억제제는 BAYK8644 (Merck)를 사용하였고 별아교세포 (Abm)에 억제제를 처리한 뒤 대식작용을 확인하는 방법은 하기와 같이 진행하였다. 별아교세포를 96 웰 검정색 세포 배양 플레이트 (SPL)에 FBS (GIBCO) 10%, 페니실린/스트렙토마이신 (Thermo), 인간 EGF 10ng/mL (Abm), L-글루타민 (Abm)이 포함된 PriGrow IV 배지 (Abm)를 이용하여 웰당 50,000개 세포수로 배양을 시작했다. 이 때 TMEM176B 억제제를 0 μM, 3.703 μM, 11.11 μM, 33.33 μM, 100 μM 농도로 처리한 뒤 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 18 내지 24시간 배양하여 안정화시켰다. 형광을 띄는 FAM-표지된 아밀로이드-베타를 5μM 농도로 차가운 PBS (Anaspec)에 녹여준 뒤 빛을 차단하고 4 ℃ 냉장고에서 24시간 보관하여 올리고머로 제작하였다. 안정화가 끝난 세포에 24시간 동안 보관한 올리고머 아밀로이드-베타를 처리한 뒤, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 18 내지 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 뒤 배양액을 흡입하여 제거하고 0.4% 트립판블루 (GIBCO)를 넣고 1분간 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 1분 뒤 트립판블루를 흡입하여 제거하고 형광측정이 가능한 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 485 nm 여기/535 nm 방출 파장대를 이용하여 대식작용이 일어난 올리고머 아밀로이드-베타를 측정하였다. 측정이 끝나고 PBS로 1회 세척한 뒤 50 μg/ml의 Hoechst Dye 33342 (abcam)를 추가하고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 30분간 배양하여 핵을 염색하였다. 배양이 끝난 뒤 PBS로 1회 세척하고 360nm 여기/465 nm 방출 파장대를 이용하여 염색된 핵을 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, TMEM176B 억제제를 별아교세포에 처리한 결과, 아밀로이드-베타 올리고머에 대한 대식작용 기능이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, TMEM176B의 과발현, 또는 활성 증진시킬 경우, 알츠하이머병을 포함한 퇴행성 뇌질환의 치료 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 2. TMEM176B의 발현 또는 활성 증진으로 인한 별아교세포에 대한 효과 확인
TMEM176B 유전자를 발현하도록 만든 재조합 아데노-연관 바이러스를 이용하여 별아교세포에서의 TMEM176B 과발현을 유도한 후 그 효과를 확인하였다.
<2-1> TMEM176B-아데노-연관 바이러스 제조
TMEM176B-아데노-연관 바이러스는 아데노-연관 바이러스 혈청형 9번을 이용하여 CMV 프로모터와 마우스 유래 TMEM176B 서열을 도입한 바이러스로 Vigene Biosciences에 의뢰하여 생산하였다.
<2-2> TMEM176B-아데노-연관 바이러스 접종된 별아교세포의 TMEM176B 발현 확인
별아교세포를 12 웰 세포 배양 플레이트 (Corning)에 FBS (GIBCO) 10%, 페니실린/스트렙토마이신 (Thermo), 인간 EGF 10ng/mL (Abm), L-글루타민 (Abm)이 포함된 PriGrow IV 배지 (Abm)를 이용하여 웰당 100,000개 세포수로 접종하였다. 적정 접종 농도를 알기 위해 24시간 뒤 0.5, 1, 2X106 GC(genome copies)/cell로 아데노-연관 바이러스를 접종하고 48시간 뒤 감염여부를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 웨스턴 블랏은 항-TMEM176B 항체(Abclonal) 와 HRP-접합 항-토끼 면역글로불린G 항체(Thermo)를 이용하여 진행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 1X106 GC/cell 접종 조건에서 TMEM176B의 발현이 약 2배 증가하는 것을 확인하였다.
<2-3> TMEM176B 과발현된 별아교세포의 대식작용 확인
TMEM176B가 감염된 별아교세포와 일반 별아교세포를 96 웰 검정색 세포 배양 플레이트 (SPL)에 FBS (GIBCO) 10%, 페니실린/스트렙토마이신 (Thermo), 인간 EGF 10ng/mL (Abm), L-글루타민 (Abm)이 포함된 PriGrow IV 배지 (Abm)를 이용하여 웰당 50,000개 세포수로 접종하였다. 이 때 TMEM176B-아데노-연관 바이러스가 접종된 별아교세포에만 TMEM176B 억제제를 0 μM, 10 μM, 50 μM 농도로 처리한 뒤 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 18 내지 24시간 배양하여 안정화시켰다. FAM-표지된 아밀로이드-베타(Anaspec)를 5μM 농도로 차가운 PBS 에 녹여준 뒤 빛을 차단하고 4 ℃ 냉장고에서 24시간 보관하여 올리고머로 제작하였다. 안정화가 끝난 세포에 24시간동안 보관한 올리고머 아밀로이드-베타를 처리한 뒤 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 18 내지 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 뒤, 배양액을 제거하고 0.4% 트립판블루 (GIBCO)를 넣고 1분간 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 1분 뒤 트립판블루를 제거하고 형광측정이 가능한 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 485nm 여기/535nm 방출 파장대를 이용하여 대식작용이 일어난 올리고머 아밀로이드-베타를 측정하였다. 측정이 끝나고 PBS로 1회 세척한 뒤 50 μg/ml의 Hoechst Dye 33342 (abcam)를 추가하고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 30분간 배양하여 핵을 염색하였다. 배양이 끝난 뒤 PBS로 1회 세척하고 형광측정이 가능한 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 360nm 여기/465nm 방출 파장대를 이용하여 염색된 핵을 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, TMEM176B-아데노-연관 바이러스가 접종된 별아교세포에서 대식작용이 증가하는 것을 확인하였고, TMEM176B 억제제에 의하여 농도 의존적으로 대식작용이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, TMEM176B의 과발현 또는 활성 증진시킬 경우, 별아교세포의 아밀로이드-베타에 대한 대식작용이 증가함에 따라 알츠하이머병을 포함한 퇴행성 뇌질환의 치료 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 3. TMEM176B-아데노-연관 바이러스를 알츠하이머병 마우스에 투여하여 치료 효과 확인
아데노-연관 바이러스에 TMEM176B를 도입하여 생체 내(in vivo) 감염 시 TMEM176B이 과발현 되도록 하였다. 알츠하이머병 마우스에 TMEM176B-아데노-연관바이러스를 감염시켜 뇌내 아밀로이드-베타의 응집체 형성을 확인하고 수중미로시험을 이용한 행동평가를 통해 치료효과를 확인하였다.
<3-1> 알츠하이머병 모델 마우스를 이용하여 TMEM176B 효능 확인 실험
Jackson Lab에서 구입한 APP/PS1 알츠하이머병 모델 마우스를 사용하였고 사육 및 실험은 케이피씨 (KPC)에서 진행하였다. 입고된 마우스는 6개월간 순화 및 노화를 진행한 후 TMEM176B-아데노-연관바이러스 투여를 개시하였다. 순화기간 중 각 마우스는 케이지당 1마리씩 사육되었으며, 마우스의 식별은 이어텍으로 표시하였고 추가적으로 케이지에 레이블지를 부착하여 구분하였다. 군 분리 시에도 각 마우스 고유번호를 이용하였으며, 군 분리 및 시험 개시 후에는 사육상자 별로 개체식별카드 (군 정보, 마우스 번호, 성별, 투여기간)를 부착하였다. 각 군은 야생형 (Wild Type; WT) 대조군 5수, APP/PS1 대조군 8수, APP/PS1 TMEM176B 투여군 8수로 구성하여 진행하였다. Isoflurane (아이소플루레인) 흡입 마취제를 사용하여 동물을 마취시킨 후 머리를 뇌정위 기구 (stereotaxic instrument)에 고정시켰다. ICV (intracerebroventricular) 투여할 뇌 위치(AP: -0.58, ML: -1.25, DV: -2.1)에 해밀턴 시린지 (Hamilton syringe)를 삽입하고 시험물질 5 ㎕를 1㎕/min의 속도로 주입하였다. 시험물질이 주변으로 확산되도록 5분 내지 10분 정도 시간을 둔 후 시린지를 뺐다. 32 내지 34주차에 1회 투여한 뒤 8주 후에 행동평가를 실시하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 8개월차에 1회 투여한 뒤 2개월 후에 행동평가를 실시하여 TMEM176B 효능을 확인하였다.
도 4는 알츠하이머병 모델 마우스를 이용하여 TMEM176B-아데노-연관 바이러스의 치료 효과를 확인하기 위한 실험일정을 나타낸 것이다.
<3-2> 아밀로이드-베타 염색을 통한 플라크 감소 확인
치료 및 행동 테스트가 끝난 후 마우스를 희생시킨 다음 야생형 (WT) (G1), APP/PS1 대조군 (G2), APP/PS1 TMEM176B 투여군 (G3)의 아밀로이드-베타 플라크를 검출하여 분석하였다. 구체적으로, 뇌를 4 % PFA 용액에 고정한 다음 파라핀블록을 제작한 뒤 마이크로톰 (HM340E, Thermo, USA) 에서 4μm 두께로 절단하고 슬라이드에 부착하였다. 슬라이드를 자일렌으로 탈파라핀화하고 에탄올 (100 % -95 % -80 % -70 %)로 재수화하여 파라핀을 완전히 제거하였다. 내인성 과산화 효소 차단을 위해 0.03 % H2O2로 처리한 후 Tris/EDTA pH 9.0 완충액으로 열 매개 항원 검색을 수행했다. 슬라이드를 1시간 동안 1차 항체 (6E10, 1:2000), 2차 항체 (Envision anti-rabbit HRP)와 30 분 동안 배양한 다음 DAB (diaminobenzidine)로 발색한 후, Mayer's Hematoxylin으로 카운터 염색하였다. 공초점 현미경 (confocal microscopy) 을 이용하여 분석을 진행하였고 플라크의 수와 면적을 측정하였고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 TMEM176B 투여군 (G3)에서 플라크 수는 뇌 전체, 해마와 피질에서 모두 감소하였다.
<3-3> 모리스 수중미로 시험 (Morris water maze test)을 통한 인지기능 개선 확인
모리스에 의해 고안된 방법을 기초로 하여 수중미로 실험을 실시하였다. 구체적으로, 스테인리스 풀 (직경 90cm, 높이 50 cm)에 물(22±1 ℃)을 채워 수면 높이를 30cm가 되도록 하였다. 숨겨진 플랫폼 (직경 9cm)은 수면 아래 1cm 지점에 위치하도록 하였다. 평가 첫날 3번 내지 4번의 훈련을 실시하였다. 한 마우스 당 전체 수영시간은 60초로 설정하였으며, 60초 이내에 플랫폼을 찾은 마우스는 10초간 플랫폼 위에서 머무르도록 하여 기억을 유도하였다. 60초가 지나도 플랫폼을 찾지 못한 마우스는 인위적으로 플랫폼으로 안내하여 플랫폼 위에서 10초간 머무르도록 하며 이때의 escape time은 60초로 하였다. 5일간의 인지 시험 (acquisition test: AQ test)를 실시하였고 플랫폼에 도달하는 시간을 일자별로 비교하여 시험물질의 인지기능과 관련한 유효성을 검증하였다. 1일차에는 플랫폼에 도달하는 시간을 기록하지 않고 동서남북 네 방향에서 visual cues를 이용하여 플랫폼에 도달하는 훈련을 하였다. 2일차 (Aq1으로 표기) 부터 4일간 플랫폼에 도달하는 시간을 기록하였고 실험은 동서남북 각 방향에서 시작하여 플랫폼에 도달하는 시간을 기록하였으므로 마우스당 4개의 값이 기록되었고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 일자별로 G2군과 비교하였을 때, G1군은 Aq 2일차부터 마지막 날인 Aq 4 일차까지 플랫폼에 도달하는 시간이 유의하게 감소하였다 (Aq2, p=0.025; Aq3, p=0.018; Aq4, p<0.001). 또한 TMEM176B 투여군 (G3)에서 G2군과 비교하였을 때, Aq 4일차에서 유의한 차이가 관찰되었다 (p =0.042).
그 다음, 수중미로 시험 6일차에 플랫폼을 제거한 후 probe test를 실시하여 공간지각능력(latency to target, target crossing numbers, percentage of time in SW area(%))을 측정하였다. 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다. 플랫폼이 있던 사분면 내 머물렀던 시간을 전체 수영 시간 중 비율로 계산한 값(Percentage of time in SW area, %), 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간(Latency to target, sec), 플랫폼이 있던 곳을 지난간 횟수(Target Crossing, numbers)를 비교하여 총 3가지 지표로 결과를 산출하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
상기 실험에서 얻어진 모든 데이터는 평균 ± 표준오차 (Standard Error Mean; SEM)으로 표기하고, 모든 결과는 SPSS(IBM SPSS Statistics, Version 22)를 이용하여 one-way ANOVA로 분석하였고 사후 검정은 LSD(The least significant difference) test로 실시하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, G3군과 G2군을 비교한 결과 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간 (latency to target) 지표에서 G3군이 유의한 차이를 보였고 (p = 0.012), 플랫폼이 있던 곳을 지나간 횟수 (target crossing)에서도 유의한 차이를 보였다 (p = 0.040).
이상의 결과는, 일 구체예에 따른 TMEM176B가 별아교세포의 아밀로이드-베타의 대식작용을 촉진하고, 아밀로이드 플라크를 감소시킬 뿐만 아니라, 알츠하이머 동물 모델에서 행동 및 인지기능 개선의 효과가 있어 퇴행성 뇌질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
<110> Amyloid Solution Inc.
<120> Composition for preventing or treating neurodegenerative brain
diseases comprising TMEM176B, its expression or activity
modulator as an active ingredient
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of TMEM176B
<400> 1
Met Ala Ala Val Val Leu Cys Val Asn Ser Phe Ile Trp Gln Thr Glu
1 5 10 15
Pro Phe Leu Tyr Ile Asp Thr Val Cys Asp Arg Ser Asp Pro Val Phe
20 25 30
Pro Thr Thr Gly Tyr Arg Trp Met Arg Arg Ser Gln Glu Asn Gln Trp
35 40 45
Gln Lys Glu Glu Cys Arg Ala Tyr Met Gln Met Leu Arg Lys Leu Phe
50 55 60
Thr Ala Ile Arg Ala Leu Phe Leu Ala Val Cys Val Leu Lys Val Ile
65 70 75 80
Val Ser Leu Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Arg Asn Leu Cys Gly Gln
85 90 95
Ser Ser Gln Pro Leu Asn Glu Glu Gly Ser Glu Lys Arg Leu Leu Gly
100 105 110
Glu Asn Ser Val Pro Pro Ser Pro Ser Arg Glu Gln Thr Ser Thr Ala
115 120 125
Ile Val Leu
130
Claims (14)
- TMEM176B(Transmembrane Protein 176B) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성 아밀로이드병, 노인성 치매 및 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물. - 청구항 1에 있어서, 상기 TMEM176B 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 아밀로이드-베타의 수준 또는 아밀로이드-베타의 응집 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체에게 투여하기 위한 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 신경아교세포(glia)의 대식작용이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 저하(dysfunction)되거나 저하될 위험이 있는 개체에 투여하기 위한 것인, 약학적 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 TMEM176B 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 신경아교세포 (glial cell)의 아밀로이드-베타에 대한 대식 작용을 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 신경아교세포는 뇌실막세포(ependymal cell), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), 별아교세포(astrocyte), 또는 미세아교세포(microglia)인 것인, 약학적 조성물
- TMEM176B(Transmembrane Protein 176B) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성 아밀로이드병, 노인성 치매 및 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물. - 청구항 8에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
- TMEM176B(Transmembrane Protein 176B) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성 아밀로이드병, 노인성 치매 및 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물. - 청구항 11에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 전구세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
- TMEM176B(Transmembrane Protein 176B) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품으로서,
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성 아밀로이드병, 노인성 치매 및 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 건강기능성 식품. - TMEM176B(Transmembrane Protein 176B) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 인지 장애의 예방 또는 개선 또는 기억력 개선용 건강기능성 식품.
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Legal Events
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |