KR20240054856A

KR20240054856A - 혈장 유래 단백질을 포함하는 노화 방지용 조성물

Info

Publication number: KR20240054856A
Application number: KR1020230061859A
Authority: KR
Inventors: 김종필; 김준엽; 황예림
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2022-10-18
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2024-04-26

Abstract

본 발명은 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc가 처리된 혈장으로부터 유래한 GCLC, ENO1, Map1s, KNG1과 이들의 다양한 조합을 포함하는 노화 방지용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 GCLC, ENO1, Map1s, KNG1 의 다양한 조합은 in vitro 및 in vivo에서 노화 관련 표현형을 개선하고, 노화에 의해 발병하는 혈관내피세포 노화로 유도되는 질환, 장기의 노화로 유도되는 질환, 신경의 노화로 유도되는 질환, 퇴행성 뇌질환 등을 개선하는바, 노화 관련 질병을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

혈장 유래 단백질을 포함하는 노화 방지용 조성물{A composition for inhibiting senescence comprising plasma-derived proteins}

본 발명은 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc가 처리된 혈장으로부터 유래한 GCLC, ENO1, Map1s, KNG1과 이들의 다양한 조합을 포함하는 노화 방지용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

최종적으로 분화된 체세포는 4개의 야마나카 인자 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc(OSKM)의 과발현을 통해 만능 줄기 세포(유도 만능 줄기 세포, iPSC)로 재프로그래밍될 수 있다. 수많은 연구에서 세포 운명이 상기 인자의 강제 발현에 의해 변경될 수 있음이 입증되어 많은 질병의 치료를 위해 세포 재프로그래밍을 이용한 접근법의 가능성을 확인하였으며, 노화 방지에 대해서도 이러한 접근법의 가능성이 확인된 바 있다.

상기 OSKM을 이용한 노화 방지 기술로, 부분적 세포 역분화가 연구된 바 있다. 부분적 세포 역분화란, 생체 내에서 OSKM을 부분적으로 짧은 시간 동안 발현시켜, 생체 내에서 노화된 세포 및 조직을 완전히 역분화 리프로그래밍시키지 않고, 부분적으로 역분화 리프로그래밍시키는 것으로, 이를 통해 특정 부위에 발병하는 노화 관련 질환을 특이적으로 치료할 수 있다.

그러나, 생체 내 OSKM의 일시적인 발현은 다양한 조직에서 종양 형성을 유발하는 것으로 보고된 바 있으며(K. Ohnishi et al., Cell 156, 663-677, 2014), 세포 재프로그래밍을 위한 Klf4 및 c-Myc과 같은 인자의 과발현시 역분화 과정에서 기형종(teratoma) 형성을 유발할 위험성이 있음이 보고된 바 있다(M. Abad et al., Nature 502, 340-345, 2013). 또한, 역분화 리프로그래밍 초기 단계의 이소성(ectopic) Oct4 유전자의 발현은 무분별한 전사체 네트워크(transcriptome network)를 유도하기 때문에 표적 외 리프로그래밍이 진행된다. 이로 인하여, 생체 내 OSKM의 발현을 통한 세포 리프로그래밍 기반 노화 방지 기술은 안정성과 효율성 측면에서 여전히 큰 한계가 존재하는 기술이다.

이에, 생체 내에서 직접적으로 OSKM을 발현시키지 않으면서, OSKM을 이용한 효율적이고 안전한 노화 방지 방법이 요구되고 있는 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 생체 내에서 직접적으로 OSKM이 처리된 혈장으로부터 유래한 특정 단백질들 및 이의 조합이 in vitro 및 in vivo에서 노화 관련 표현형을 개선하고, 노화에 의해 발병하는 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 및 간부전의 증상을 개선함으로써 노화 관련 질병을 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 유효성분으로 하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물을 유효성분으로 하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 노화 방지 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물; 중 선택되는 어느 하나를 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 하나의 양태는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 유효성분으로 하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물을 유효성분으로 하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질은, 상기 단백질 중 2, 3 또는 4개 조합으로서, 구체적으로, 2개 조합은 GCLC 및 ENO1(GE); GCLC 및 KNG1(GK); GCLC 및 MAP1S(GM); ENO1 및 MAP1S(EM); MAP1S 및 KNG1(MK); 또는 ENO1 및 MAP1S(EK)이고, 3개 조합은 GCLC, ENO1 및 MAP1S(GEM); GCLC, ENO1 및 KNG1(GEK); GCLC, MAP1S 및 KNG1(GMK); 또는 ENO1, MAP1S 및 KNG1(EMK)이고, 4개 조합은 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1(GEMK) 이다.

따라서, 본 발명의 일 구현예는 상기 단백질의 2개의 조합, 즉 GCLC 및 ENO1(GE); GCLC 및 KNG1(GK); GCLC 및 MAP1S(GM); ENO1 및 MAP1S(EM); MAP1S 및 KNG1(MK); 및 ENO1 및 MAP1S(EK) 중에서 선택되는 조합, 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 단백질의 3개의 조합, 즉 GCLC, ENO1 및 MAP1S(GEM); GCLC, ENO1 및 KNG1(GEK); GCLC, MAP1S 및 KNG1(GMK); 및 ENO1, MAP1S 및 KNG1(EMK) 중에서 선택되는 조합, 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 단백질의 4개의 조합, 즉 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1(GEMK)의 조합, 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, “글루타메이트-시스테인 리가제 촉매 서브유닛(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit, GCLC)"란 글루타메이트-시스테인 리가제(Glutamate-cysteine ligase, GCL)의 서브유닛으로, 글루타티온(Glutathione, GSH) 합성 경로의 전체 속도를 결정하는 속도 제한(rate-limiting) 효소이다.

본 발명에 있어서, GCLC 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 GCLC 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 GCLC 단백질은 공지의 데이터 베이스인 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에서 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 GCLC 단백질의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 발명의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ET AL/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 GCLC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Gclc 유전자일 수 있다.

본 발명의 GCLC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예로, 본 발명의 GCLC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 GCLC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 GCLC 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 Gclc 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 발명의 Gclc 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, GCLC 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 GCLC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 12의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “미세소관 관련 단백질 1S(Microtubule-associated protein S1, MAP1S)"란 DNA 결합능을 가지며, 세포 사멸 및 게놈 파괴(MAGD)를 초래하는 미토콘드리아의 응집을 매개하는 단백질로, 미세소관 조직화 센터를 중심체에 고정시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, MAP1S 단백질은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 MAP1S 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MAP1S 단백질의 아미노산 서열은 상기 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 MAP1S 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Map1s 유전자일 수 있다.

본 발명의 MAP1S 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예로, 본 발명의 MAP1S 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 MAP1S 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 MAP1S 단백질은 서열번호 4의 염기서열로 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 Map1s 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 또는 본 발명의 Map1s 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, MAP1S 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 MAP1S 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “에놀라제 1(Enolase 1, ENO1)"이란 2-포스포글리세르산(2-phosphoglycerate)을 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate)로 전환하는 활성을 갖는 효소로, 알파-에놀라제(alpha-Enolase, α-Enolase)로도 명명된다.

본 발명에 있어서, ENO1 단백질은 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 ENO1 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 ENO1 단백질의 아미노산 서열은 상기 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 ENO1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Eno1 유전자일 수 있다.

본 발명의 ENO1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예로, 본 발명의 ENO1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 ENO1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 ENO1 단백질은 서열번호 6의 염기서열로 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 Eno1 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 또는 본 발명의 Eno1 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, ENO1 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 ENO1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 6의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “키니노겐 1(Kininogen 1, KNG1)"이란 저분자량 키니노겐, 고분자량 키니노겐(kininogen) 및 이로부터 분비되는 브래디키닌(bradykinin)의 전구체 단백질이다. 상기 고분자량 키니노겐은 혈액 응고 및 칼리크레인-키닌(kallikrein-kinin) 시스템의 구성에 필수적인 요소로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, KNG1 단백질은 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 KNG1 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 KNG1 단백질의 아미노산 서열은 상기 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 KNG1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Kng1 유전자일 수 있다.

본 발명의 KNG1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예로, 본 발명의 KNG1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 KNG1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 KNG1 단백질은 서열번호 8의 염기서열로 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 Kng1 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 또는 본 발명의 Kng1 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, KNG1 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 KNG1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 8의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 단백질의 발현을 증대시키는 조성물은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 단백질의 발현을 증대시키는 인핸서(enhancer) 등을 포함할 수 있다.

일 예로, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물은, GCLC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, MAP1S 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, ENO1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 KNG1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 각각의 유전자를 포함한 별개의 벡터이거나, 하나의 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드 중 어느 2 이상을 포함할 수 있다.본 발명에서 용어, “벡터(vector)"란 목적하는 DNA 단편을 숙주 세포에 도입시켜 증식할 수 있는 DNA로써 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. "발현 벡터"는 목적하는 코딩서열과, 특정 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 벡터는 발현 벡터와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있고, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으며, 바이러스 벡터로서 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 내재적 발현 및/또는 활성을 야생형 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 내재적 발현 및/또는 활성에 비해 증대시킬 수 있다.

본 발명의 용어, "노화"는 일반적으로 나이가 들면서 신체의 구조와 기능이 저하되어 일어나는 쇠퇴적인 변화현상을 포괄하는 개념으로, 노화로 인한 변화는 실질세포수의 감소에 의한 각 조직의 중량 및 체중의 감소, 결합조직의 변화, 체조성의 변화, 혈관이나 피부 등의 탄력성 저하, 각 장기기능의 감퇴, 면역능력을 비롯한 항병회복능의 저하, 감각기 기능의 저하, 기억력, 인지기능, 학습능력 및 비교능력의 저하 등 매우 다양하다.

본 발명의 "노화 억제"는 본 발명의 조성물의 투여에 의해 전술한 노화 증상을 억제 또는 방지 또는 개선 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로, 전술한 노화와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 노화 증상이 호전, 완화되거나 이롭게 변경되는 행위를 포함한다. 또한, 상기 용어는"노화 방지"와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 "노화 억제"는 "노화의 치료(treating)"로도 표현 될 수 있으며, 노화와 관련된 질환의 치료 및/또는 개선 역시 포함한다.

본 발명에서, 용어 "노화 관련 질환"은 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조기 노화를 유도하는 질환은 일 예로, 허친슨 길포드(Hutchinson Guilford) 조로증 증후군(HGPS), HIV 감염과 관련된 조기 노화, 근육 퇴행 위축, 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease), 베르너(Werner) 증후군, 인슐린 내성 타입 II 당뇨병, 골다공증, 피부 노화 및 제한 피부병증(restrictive dermopathy) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 조기 노화의 병리학적 특징을 포함하는 질환이라면 모두 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 조기 노화를 유도하는 질환은 허친슨 길포드 조로증 증후군일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 노화에 의해 유도되는 질환은 일 예로, 동맥경화, 간부전, 뇌졸중, 퇴행성 뇌질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 고혈압, 인지기능장애, 근감소증, 안구건조증, 황반변성, 원시, 근시, 백내장, 이명, 난청, 소화불량, 설사, 자가면역질환, 폐렴, 독감, 파상풍, 감염성 심내막염, 폐렴, 독감, 파상풍, 감염성 심내막염, 암, 과민성 방광, 요실금, 전립선 비대증, 하부요로증상, 사구체 신염, 만성 신부전, 뇌졸중, 골다공증, 관절염, 당뇨병, 신부전, 만성폐쇄성 폐질환 및 폐섬유화증 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 노화에 의해 발생되는 병리학적 특징을 포함하는 질환이라면 모두 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 노화에 의해 유도되는 질환은 혈관내피세포 노화로 유도되는 질환, 장기의 노화로 유도되는 질환, 신경의 노화로 유도되는 질환, 퇴행성 뇌질환 등일 수 있고, 보다 구체적으로, 동맥경화, 간부전, 뇌졸중, 알츠하이머병 및 파킨슨병 중 선택되는 1 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 노화 관련 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 노화 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 노화 관련 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 구체적으로는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 노화 관련 질환을 예방 또는 치료하는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 그 예로, 본 발명의 약학적 조성물은 OSKM, OSKM을 발현하는 벡터 또는 OSKM이 처리된 혈장을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 500mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋을 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다. 여기에서, 동물이란 가축 및 반려동물을 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 세포 노화 억제 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 세포 노화 억제 효과는 본 발명에서 제공하는 조성물의 처리에 따른 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 내재적 발현 및/또는 활성에 의해 달성되는 것일 수 있다.

상기 세포 노화 억제 효과는 다음 중 선택되는 어느 하나 이상의 효과일 수 있다:

i) 노화 관련 유전자의 발현 수준 감소;

ii) DNA 이중 가닥 파손 수준 감소; 및

iii) 베타 갈락토시다제 양성 세포 수 감소.

상기 i)의 노화 관련 유전자는 스트레스 반응 유전자, ECM(extracellular matrix) 리모델링 유전자, SASP(Senescence-Associated Secretory Phenotype) 유전자 및 노화 관련 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 스트레스 반응 유전자는 일 예로, Ccl8, p16, p21, Btg2 및 Atf 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 ECM 리모델링 유전자는 일 예로, MMP12, MMP13 및 IL-6 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 SASP 유전자는 일 예로, Cdkn2a, Cdkn1a 및 IL-a 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 i) 노화 관련 유전자의 발현 수준 감소와 관련하여, 본 발명의 일 구현예에서, 노화된 섬유아세포에서 노화 관련 유전자인 Ccl8, IL-6, Cdkn2a, Btg2, Atf3, MMP12, MMP13, p16 및 p21의 발현 수준이 현저히 증가되었으나, dCas9-activator 벡터의 도입에 의해 회복되었다(도 2e).

이로부터 노화 섬유아세포에서 dCas9-activator 벡터가 내인성 Oct4 활성화를 활성화함으로써 노화 관련 분자 표현형을 효율적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.

상기 ii) DNA 이중 가닥 파손 수준 감소와 관련하여, 본 발명의 일 구현예에서, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 발현을 유도한 돌연변이 laminA/C(LMNA)가 형질도입되어 노화된 마우스 섬유아세포에서 세포 노화와 관련된 DNA 이중 가닥 파손 수준을 평가하기 위해 히스톤 마커 H3K9me3 및 H4K20me3의 발현 수준을 분석한 결과, OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 발현을 유도하는 경우(도 2c-d), H3K9me3의 발현 수준은 증가하고 H4K20me3의 발현 수준이 감소하여 노화 관련 지표가 개선됨을 확인하였다.

특히, GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독 처리하였을 때는 노화가 되었을 때 감소한다고 알려진 후성 유전학적 마커 (H3K9me3)의 변화가 없었으나, 2가지 이상의 조합을 처리하였을 때에, H3K9me3 의 양의 현격한 증가가 관찰되었다. 이는 상기 4종 단백질 중 2 이상의 조합을 사용하였을 때, 세포의 노화의 수준을 크게 억제할 수 있음을 나타내는 결과이다.

상기 iii) 베타 갈락토시다제 양성 세포 수 감소와 관련하여, 본 발명의 일 구현예에서, GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독 및 이의 다양한 조합을 발현하는 벡터[GCLC+ENO1(GE), GCLC+KNG1(GK), GCLC+MAP1S(GM), ENO1+MAP1S(EM), MAP1S+KNG1(MK), ENO1+MAP1S(EK), GCLC+ENO1+MAP1S(GEM), GCLC+ENO1+KNG1(GEK), GCLC+MAP1S+KNG1(GMK), ENO1+MAP1S+KNG1(EMK), GCLC+MAP1S+ENO1+KNG1(GEMK) 벡터]를 야생형 마우스 꼬리 끝 섬유아세포에 각각 형질전환하고 3일 후, 노화 관련 베타 갈락토시다제 양성 세포 수를 측정하였다.

그 결과, GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독 처리에서 베타 갈락토시다제 양성 세포가 감소하였으나, 이들의 2 또는 3개의 조합을 처리하였을 때 베타 갈락토시다제 양성 세포 감소 효과가 더 우수하였으며, GCLC+MAP1S+ENO1+KNG1(GEMK)을 처리하였을 때 베타 갈락토시다제 양성 세포 감소 효과가 가장 우수하여, 대조군인 야생형 마우스 섬유아세포와 유사한 수준으로 감소함을 확인하였다(도 3).

이로부터 GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단백질 단독 및 이의 조합의 발현을 유도하는 경우, 세포에서 노화 관련 지표가 개선됨을 확인하여, 노화 억제 효과가 있음을 확인하였다.

특히, GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단백질 단독보다 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질을 2 이상 포함하는 조합을 발현시켰을 때 세포에서 노화 관련 지표가 개선되었고, 3가지 또는 4가지 단백질 모두를 포함하는 경우 노화 관련 지표가 현저히 개선되어, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 2 이상을 포함하는 단백질의 조합에서 노화 억제 효과가 현저함을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질을 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 노화 관련 질환을 개선하는 효과를 갖는 것일 수 있다.

상기 노화 관련 질환을 개선하는 효과는 다음 중 선택되는 어느 하나 이상의 효과일 수 있다:

i) 척추 곡률 감소;

ii) 체중 감소 억제;

iii) 수명 증가;

iv) 운동 활성 증가; 및

v) 장기 및 피부의 노화 개선.

본 발명의 일 구현예에서, 조기 노화 모델 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 OSKM 처리 혈장을 주사한 결과, 대조군 대비 척추 곡률 감소를 포함하여 외관이 상당히 개선되었으며(도 4c), 체중 감소가 억제되고(도 4a), 수명이 증가됨을 확인하였다(도 4b).

본 발명의 다른 일 구현예에서, 6개월(young), 18개월(mid-aged) 및 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 OSKM 처리 혈장을 주사 후 오픈 필드 테스트를 수행한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 운동 활성이 증가하였다(도 5a).

본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 조기 노화 모델 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 OSKM 처리 혈장 주사 후 4주 뒤 간, 비장, 신장 및 피부에서의 노화 증상을 H&E 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군(5개월령 마우스) 대비 장기 및 피부 노화 증상이 개선되었다(도 4f-g).

또한, 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) 야생형 C57BL/6 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 간, 비장 및 신장에서의 노화 증상을 동일하게 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군(6개월령 마우스) 대비 장기 노화 증상이 개선되었다(도 6a).

본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 조기 노화 모델 마우스 및 24개월령 야생형 C57BL/6 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 4주 뒤 심장 대동맥 조직에서 심근세포(Cardiac Myofibroblast) 수를 α-SMA 면역형광 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 α-SMA 양성 세포가 증가하여, 심근세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다(도 6d-e).

또한, 조기 노화 모델 마우스 및 24개월령 야생형 C57BL/6 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 4주 뒤 심장 대동맥 조직에서 심근세포(Cardiac Myofibroblast) 수를 α-SMA 면역형광 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 α-SMA 양성 세포가 증가하여, 심근세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다(도 6d-e).

본 발명에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환을 포함할 수 있다.

상기 조기 노화를 유도하는 질환에 대해서는 전술한 바와 같으며, 구체적으로 허친슨 길포드 조로증 증후군일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 노화에 의해 유도되는 질환에 대해서는 전술한 바와 같으며, 구체적으로, 상기 노화에 의해 유도되는 질환은 혈관내피세포 노화로 유도되는 질환, 장기의 노화로 유도되는 질환, 신경의 노화로 유도되는 질환, 퇴행성 뇌질환 등일 수 있고, 보다 구체적으로, 동맥경화, 간부전, 뇌졸중, 알츠하이머병 및 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 혈관내피세포 노화로 유도되는 질환을 개선하는 효과를 갖는 것일 수 있다.

상기 혈관내피세포 노화로 유도되는 질환은 구체적으로 동맥경화일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 동맥경화의 개선은 대동맥의 경직 감소 및/또는 대동맥의 섬유화 감소 효과에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 조기 노화 모델 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 OSKM 처리 혈장 주사 후 4주 뒤 대동맥에서 경직 및 섬유화 증상을 H&E, VVG, MT 및 ORO 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 대동맥 경직 및 섬유화 증상이 개선되었다(도 4d-e).

또한, 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) 야생형 C57BL/6 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 4주 뒤 대동맥에서 경직 및 섬유화 증상을 H&E 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군(6개월령 마우스) 대비 대동맥 경직 및 섬유화 증상이 개선되었다(도 6b-c).

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질을 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 장기의 노화로 유도되는 질환을 개선하는 효과를 갖는 것일 수 있다.

상기 장기의 노화로 유도되는 질환은 구체적으로 간부전일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 간부전의 개선은 다음 중 선택되는 어느 하나 이상의 효과에 의해 달성되는 것일 수 있다:

i) ATL(alanine transaminase)의 수준 감소

ii) AST(aspartate transaminase)의 수준 감소;

iii) 혈장 ALB(albumin)의 수준 감소.

본 발명의 일 구현예에서, 간부전 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 혈장 단백질을 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 ATL(alanine transaminase), AST(aspartate transaminase)의 수준이 감소하고, 혈장 ALB(albumin)의 수준이 증가하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 간부전 증상을 개선함을 확인하였다(도 10).

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질을 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 신경의 노화로 유도되는 질환을 개선하는 효과를 갖는 것일 수 있다.

상기 신경의 노화로 유도되는 질환은 구체적으로 뇌졸중일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 뇌졸중의 개선은 경색(infarct) 용적 감소 및/또는 신경학적 결손 점수(neurological deficit score) 감소 효과에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 뇌졸중 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 뇌 조직을 신경학적 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 경색 용적과 신경학적 결손 점수가 감소하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 뇌졸중 증상을 개선함을 확인하였다(도 9).

전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예에서, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질을 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 퇴행성 뇌질환을 개선하는 효과를 갖는 것일 수 있다.

상기 퇴행성 뇌질환은 구체적으로 알츠하이머병 또는 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 알츠하이머병 또는 파킨슨병의 개선은 아밀로이드 베타(amyloid-beta, Aβ) 플라크 및 Aβ42/40 비율의 수준 감소 또는 도파민성 신경세포 특이 유전자인 Map2, 시냅신(Synapsin), DAT 및 TH의 발현 수준 감소 효과에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 12개월령 알츠하이머 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 뇌 조직에서 알츠하이머병 특이 아밀로이드 베타(amyloid-beta, Aβ) 플라크 및 Aβ42/40 비율의 수준을 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 Aβ 플라크 및 Aβ42/40 비율이 감소하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 알츠하이머병 증상을 개선함을 확인하였다(도 7).

본 발명의 다른 일 구현예에서, 12개월령 파킨슨 질환 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 중뇌 조직에서 도파민성 신경세포 특이 유전자인 Map2, 시냅신(Synapsin), DAT 및 TH의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 도파민성 신경세포 특이 유전자인 Map2, 시냅신, DAT 및 TH의 mRNA 발현 수준이 증가하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 파킨슨병 증상을 개선함을 확인하였다(도 8).

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 노화 방지 방법을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료 방법일 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질을 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 단백질의 발현을 증대시키는 조성물;은 노화 억제 효과 및/또는 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환을 개선하는 효과를 갖는바, 이를 포함하는 약학적 조성물은 노화 방지 또는 개선, 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 사용할 수 있다.

상기 조기 노화를 유도하는 질환은 허친슨 길포드 조로증 증후군일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 노화에 의해 유도되는 질환은 혈관내피세포 노화로 유도되는 질환, 장기의 노화로 유도되는 질환, 신경의 노화로 유도되는 질환, 퇴행성 뇌질환 등일 수 있고, 보다 구체적으로, 동맥경화, 간부전, 뇌졸중, 알츠하이머병 및 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개체"는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있다. 또한 인간을 제외한 동물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 노화 관련 질환의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 약학적 조성물은 노화 관련 질환을 예방 또는 치료하는 것을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 일 예로, 본 발명에서 제공하는 조성물은 Fgf17, Gpld1, GDF11, superoxide dismutase (SOD), Catalase (CAT), Glutathione(GSH), Glutathione peroxidase(GPx), oxidized glutathione (GSSG). Glutathione S-transferase (GST), Ascorbic acid (vitamin C), α-tocopherol (vitamin E), Folic acid (vitamin B), Polyphenols, carotenoids, Flavonoids, Phenolic Acids, Ferulic acid, Tannin, Catechinic acid, Rosmarinic acid, Apiolin, Hesperetin, Agathisflavone, Monodehydroascorbate reductase (MDHAR), Dehydroscorbate reductase (DHAR), Ascorbate peroxidase (APx), Glutathione reductase (GR), Albumins, Lactoferrin, Metallothioneins, Polyamines, Vitamin K, Ubiquinone, Zinc, Selenium, copper (Cu), iron (Fe) and manganese (Mn), selenium (Se)Allium, Allyl sulfides, Coenzyme Q10, Uric acid, Hydroxycinnamic acid, Hydroxybenzoic acid, lycopene, zeaxanthine, proanthocyanidins, Albumin, Ceruloplasmin, Ferritin, Myoglobin, Transferrin, NADPH, NADH, Lipoic acid, FGF21, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), Nicotinamide mononucleotide (NMN), Resveratrol, Metformin, Vitamin D3, Statin, Aspirin, Alpha lipoic acid (ALA), Spermidine, Quercetin, Fisetin, TMG (trimethylglycine or betaine) 중 선택되는 1 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물; 중 선택되는 어느 하나를 포함하는, 노화 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선 용도를 갖는 것일 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 조성물은 노화 억제 효과 및/또는 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환을 개선하는 효과를 갖는바, 이를 포함하는 약학적 조성물은 노화 방지 또는 개선, 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하며, 노화 억제 또는 방지 또는 개선 또는 지연 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강기능식품은 필수 성분으로 상기 CRISPR/dCas9 복합체 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 건강기능식품과 같이 여러가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 성분 외에도 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물; 중 선택되는 어느 하나를 포함하는, 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 주사제 조성물을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 주사제 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물; 중 선택되는 어느 하나를 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

상기 세포 노화 억제는 ex vivo, in vivo 또는 in vitro에서의 노화일 수 있다.

상기 조성물은 ex vivo, in vivo 또는 in vitro에서 세포 노화를 억제하는 것일 수 있고, 일 예로, ex vivo 또는 in vitro에서 세포 노화를 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc(OSKM)이 처리된 혈장으로부터 유래한 GCLC, ENO1, Map1s, KNG1 중 선택되는 2 이상의 조합은 in vitro 및 in vivo에서 노화 관련 표현형을 개선하고, 노화에 의해 발병하는 혈관내피세포 노화로 유도되는 질환, 장기의 노화로 유도되는 질환, 신경의 노화로 유도되는 질환, 퇴행성 뇌질환 등을 개선하는바, 노화 관련 질병을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 OSKM이 유도된 4F2A 마우스로부터 유래하는 혈장(OSKM 처리 혈장) 내 단백질을 분석하기 위하여 LC/MS을 수행한 결과이다. (a)는 OSKM 처리 혈장에서 특이적으로 유도되는 단백질을 스크리닝 하는 과정을 나타낸 모식도이다. (b-c)는 OSKM 처리 혈장의 LC/MS 분석 및 단백질 발현 패턴을 분석한 데이터이다. (d)는 OSKM 처리 혈장에서 특이적으로 유도된 단백질의 목록이다.
도 2는 OSKM 처리 혈장을 처리한 세포 또는 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 발현을 유도한 세포에서 노화 관련 지표를 분석한 결과이다. (a)는 세포에 OSKM 처리 혈장 처리 후 노화 관련 히스톤 마커인 H3K9me3 및 H4k20me3의 발현 수준을 분석한 결과, 및 (b)는 이를 정량화한 데이터이다. (c)는 세포에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 발현을 유도 후 H3K9me3 및 H4k20me3의 발현 수준을 분석한 결과, (d)는 이를 정량화한 데이터이다.
도 3은 야생형 마우스 꼬리 끝 섬유아세포에 GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독과 이들의 다양한 조합을 과발현시킨 후 베타 갈락토시다제를 포함한 노화마커를 통한 노화 세포 감소 수준을 정량화한 결과이다. 또한, 다양한 조합 중 2가지 이상의 조합에서 노화 마커 감소뿐만 아니라 노화 관련 후성유전학적 마커의 변화가 유도됨을 확인하였다. 예를 들어 도3-c 데이터에서 GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독 처리하였을 때는, 노화가 되었을 때 감소한다고 알려진 후성 유전학적 마커 (H3K9me3)의 변화가 없었으나, 2가지 이상의 조합을 처리하였을 때에, H3K9me3 의 양의 현격한 증가가 관찰되었다. 다시 말해서, 2가지 이상의 조합을 사용하였을 때 세포의 노화의 수준을 크게 억제 및 되돌릴 수 있다는 점을 보여준다.
도 4는 OSKM 처리 혈장 또는 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 투여에 의한 조기 노화 모델 마우스에서의 노화 관련 지표를 분석한 결과이다. 10개월령 조기 노화 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장을 주사 후 체중 감소 억제(a), 수명 증가(b) 및 척추 곡률 감소(c)를 확인한 데이터이다. (d-e)는 조기 노화 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 주사 후 4주 뒤 대동맥에서 경직 및 섬유화 증상을 H&E, VVG, MT 및 ORO 염색을 통해 분석한 데이터이다. (f-g)는 조기 노화 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 주사 후 4주 뒤 간, 비장, 신장 및 피부에서의 노화 증상을 H&E 염색을 통해 분석한 데이터이다.
도 5는 (a)는 6개월(young), 18개월(mid-aged) 및 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) 야생형 C57BL/6 마우스에 OSKM 처리 혈장을 주사 후 오픈 필드 테스트를 수행한 데이터이다. (b)는 6개월(young) 및 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) 마우스에 OSKM 처리 혈장을 주사 후 노화 관련 유전자의 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 데이터이다.
도 6은 (a)는 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) 야생형 C57BL/6 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 간, 비장 및 신장에서의 노화 증상을 H&E 염색을 통해 분석한 데이터이다. (b)는 24개월령(old) 야생형 C57BL/6 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 4주 뒤 대동맥에서 경직 및 섬유화 증상을 H&E 염색을 통해 분석한 데이터, 및 (c) 이를 정량화하였다. 10개월령 조기 노화 모델 마우스(d) 및 24개월령 야생형 C57BL/6 마우스(e)에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 4주 뒤 심장 대동맥 조직에서 심근세포(Cardiac Myofibroblast) 수를 α-SMA 면역형광 염색을 통해 분석한 데이터이다.
도 7은 12개월령 알츠하이머 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 뇌 조직에서 알츠하이머병 특이 아밀로이드 베타(amyloid-beta, Aβ) 플라크(a) 및 Aβ42/40 비율(b)의 수준을 분석한 데이터이다.
도 8은 12개월령 파킨슨 질환 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 중뇌 조직에서 도파민성 신경세포 특이 유전자인 Map2(a), 시냅신(Synapsin) (b), DAT(c) 및 TH(d)의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 분석한 데이터이다.
도 9는 뇌졸중 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 뇌 조직의 경색(infarct) 용적(a) 및 신경학적 결손 점수(neurological deficit score) (b)이다.
도 10은 간부전 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 혈장 내 ATL(alanine transaminase), AST(aspartate transaminase) 및 혈장 ALB(albumin)의 수준을 분석한 데이터이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실험예

<실험예 1> Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc(OSKM) 처리 혈장 제조

4F2A 마우스에 4주 간 독시사이클린(Doxycycline)이 포함된 식수를 섭식시켜 생체 내에서 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc(OSKM) 유전자 발현을 유도하였다. 이후 OSKM이 유도된 4F2A 마우스에서 혈액을 분리한 후 3000rpm에서 30분간 원심분리 한 뒤 혈장(OSKM 처리 혈장)을 분리하였다.

<실험예 2> 모델 마우스 제작 및 OSKM 처리 혈장 및 OSKM 처리 혈장 유래 단백질 주입

조기 노화 마우스 모델은 프로게린(Progerin)을 과발현하는 마우스(프로게린 마우스, Jackson laboratory)를 사용하였다. 알츠하이머 마우스 모델은 아밀로이드 베타(amyloid-beta, Aβ) 관련 돌연변이 유전자 5종(APP 관련 유전자 3종, PSEN1 관련 유전자 2종)이 과발현된 5xFAD(Jackson laboratory) 마우스를 사용하였다. 뇌졸중(Stroke) 마우스 모델은 나일론 실을 이용하여 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion, MCAO)을 유도하여 제작하였다. 상기 MCAO 유도는 이전 방법(임병철 외, 한국콘텐츠학회논문지, Vol. 19, No. 7, 2019)을 참고할 수 있다. 파킨슨병 마우스 모델은 마우스 복강에 20 mg/kg의 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine)를 주사하여 제작하였다. 간부전(Liver failure) 마우스 모델은 CCl4(dimethylnitrosamine,thioacetamide):올리브유를 1:3 (v/v)으로 혼합한 혼합물을 1 μL/g 농도로 주 2회 마우스 복강에 투여하여 제작하였다. 야생형 C57BL/6 수컷 마우스는 한국생명공학연구원에서 입수하였다.

모든 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었으며, 23 ± 1℃에서 12시간/12시간 명암 주기 조건을 유지하였다. 마우스를 트리브로모에탄올(Avertin, 120 mg/kg)로 마취시키고, 0.9% 식염수(0.9% w/v 소듐 클로라이드(sodium chloride) 함유)에 희석한 OSKM 처리 혈장; 또는 polycistronic 형태로 제작한, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 발현하는 벡터;를 꼬리 정맥에 주사하였다. 구체적으로, 초원심분리를 통해 펠렛화된 렌티바이러스를 20ul PBS로 재현탁시킨 후 바이러스 5ul를 현탁액 300ul를 섞어 마우스 꼬리 정맥으로 주입하였다. 여기서 사용한 바이러스 5ul의 역가(titer)는 바이러스 역가(감염 단위 mL^-1)가 결정되기 전에 FUW-GFP를 대조군으로 사용하여 GFP 발현을 모니터링하고 감염 다중도를 산출 후의 바이러스 입자수를 의미한다. 상기 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 발현하는 벡터는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 동일 비율로 발현하였다. 주사 후, 마우스는 마취에서 완전히 회복될 때까지 따뜻하게 유지하였다. 주사 후 2주 또는 4주 뒤 마우스를 생화학적 및 행동학적으로 분석하였다.

<실험예 3> 세포 배양

모든 세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 DMEM 배지(Gibco)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 꼬리 끝(tail-tip) 섬유아세포(TTFs)는 꼬리 끝의 1-2mm 절편을 마우스로부터 수득하고 30초 동안 70% 에탄올로 세척하였다. 조직을 신선한 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 멸균 면도날을 사용하여 10cm 조직 배양 접시에서 잘게 다진 다음 EDTA(ethylene-diamine-tetraacetic acid)가 포함된 0.25% 트립신(Gibco)과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다.

<실험예 4> RNA 분리 및 RT-qPCR

모든 RNA는 eCube 조직 RNA 미니 키트(Philekorea)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수집 및 정제되었다. 그런 다음 AccuPower® CycleScript RT PreMix(Bioneer, #K-2044-B)를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. RT-qPCR 분석은 하기 표 1의 프라이머와 함께 AccuPower® PCR PreMix(Bioneer, #K-2016)를 사용하여 수행하였다. 모든 반응은 Rotor-Gene Q real-time PCR cycler(Qiagen)를 사용하여 수행하였다.

서열번호	서열명	서열(5' - > 3')
9	P21_F	CGGTGTCAGAGTCTAGGGGA
10	P21_R	ATCACCAGGATTGGACATGG
11	Atf3_F	CTCTGGCCGTTCTCTGGA
12	Atf3_R	GGTCGCACTGACTTCTGAGG
13	Btg2_F	GCGAGCAGAGACTCAAGGTT
14	Btg2_R	TAGCCAGAACCTTTGGATGG
15	Mmp13_F	TGATGAAACCTGGACAAGCA
16	Mmp13_R	GGTCCTTGGAGTGATCCAGA
17	Mmp12_F	AGTCCAGCCACCAACATTAC
18	Mmp12_R	GCTCCTGCCTCACATCATAC
19	IL-6_F	TGATGCACTTGCAGAAAACA
20	IL-6_R	ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC
21	IL-1a_F	GAAGAAGAGACGGCTGAGTTT
22	IL-1a_R	AACCAAGTGGTGCTGAGATAG
23	Cdkn1a_F	CGTGGACAGTGAGCAGTT
24	Cdkn1a_R	GACACCAGAGTGCAAGACA
25	Cdkn2a_F	CGTTCACGTAGCAGCTCTT
26	Cdkn2a_R	ATCGCACGATGTCTTGATGT
27	Cxcl1_F	CCGCTCGCTTCTCTGTG
28	Cxcl1_R	GACCATTCTTGAGTGTGGCTAT
29	Cxcl2_F	GTGAACTGCGCTGTCAATG
30	Cxcl2_R	GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC

<실험예 5> 웨스턴 블롯

세포 및 조직을 RIPA 완충액(1% NP-40, 0.5% DOC(sodium deoxycholate), 0.1% SDS 및 150mmol/L NaCl를 포함하는 50mmol/L Tris, pH 8.0, Sigma-Aldrich) 및 1x 프로테아제 억제제와 혼합하여 균질화하였다. 다음으로, 샘플을 5x 로딩 버퍼와 혼합하고 100℃에서 10분 동안 끓였다. 10 ug의 추출된 단백질을 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE를 수행하여 분리하고 니트로셀룰로오스 막(10600001, GE Healthcare)으로 옮겼다. 단백질 농도는 Quick Start Bradford 단백질 분석(Bio-Rad)을 사용하여 정량하였다. 막을 5% BSA(Bovine serum albumin)에서 차단하고 4℃에서 일차 항체와 함께 밤새 배양하였다. 막을 PBS로 3회 세척한 다음, 실온에서 2시간 동안 이차 항체와 함께 배양하였다. 각 단백질 밴드는 ECL kit (DG-WF200; Dogen)를 사용하여 시각화하였고, ImageJ(NIH) 소프트웨어로 정량하였다. 사용된 항체는 항-H3K9me3(abcam, #ab8898), 항-H4K20me3(abcam, #ab78517), α-SMA(Alpha Smooth Muscle Actin) 및 항-β-액틴(abfrontier, #LF-PA0207)이며, β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.

<실험예 6> 동물 행동 실험

행동 분석을 위해 모델 마우스를 대상으로 오픈 필드 테스트를 수행하였다. 마우스를 직사각형 챔버(가로 50cm, 세로 50cm, 높이 38cm)에 놓고, 15분 동안 마우스가 직사각형 챔버의 중앙영역(가로 25cm, 세로 25cm)으로 이동하는 빈도를 계수하여 마우스의 운동성(Locomotor)을 측정하였다.

<실험예 7> 세포 염색

마우스 대동맥(Aorta)를 분리하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)로 세포를 고정한 다음 이를 파라핀 블록으로 제작하여 마이크로톰으로 대동맥 조직을 미세 절단하였다. 이 후 절단된 파라핀조직 샘플을 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin)을 이용하여 H&E 염색하였다. 그 외 VVG(Verhoeff Van Gieson), MT(Masson's Trichrome) 및 ORO(Oil Red O) 염색은 절단된 파라핀조직 샘플과 키트(Verhoeff Van Gieson Elastic Stain Kit, Masson's Trichrome Stain Kit, Oil Red O - Lipid Stain Kit)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 염색하였다.

<실험예 8> 면역형광 염색

세포를 OSKM 처리 혈장 또는 GCLC, Map1s, ENO1 및 KNG1 발현 벡터로 형질전환시킨 후 24시간 동안 24 웰 플레이트에서 배양하였다. 면역형광 염색을 위해 PBS로 세포를 세척한 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 처리하여 상온에서 10분간 고정하였다. 이후 PBS로 두 번 세척한 후 3% BSA와 0.1% Triton X-100이 포함된 PBS로 상온에서 3시간 동안 차단하였다. 일차 항체는 제조사에서 권장하는 희석도로 사용하였다. 세포를 일차 항체로 4℃에서 24시간 동안 염색한 다음, Alexa488 또는 Alexa 594(Invitrogen)와 접합된 이차 항체와 배양하고, DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole) 염색하였다. 다용도 공초점 현미경(LSM-800, Zeiss)을 사용하여 200X 배율에서 플레이트에서 무작위로 선택된 10개 필드의 세포 수를 산출하였다. 사용된 항체는 항-H3K9me3(abcam, #ab8898), 항-H4K20me3(abcam, #ab78517), α-SMA(Alpha Smooth Muscle Actin) 및 항-β-액틴(abfrontier, #LF-PA0207)이며, β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.

<실험예9> 액체 크로마토그래피 질량분석기(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC/MS) 분석

마우스로부터 혈액을 수득하고 3000rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액인 혈청을 분리한 다음, LC/MS를 이용하여 분리된 혈청 속 단백질 분자의 정성 및 정량적 분석을 수행하였다.

<실험예 10> 벡터 제작

마우스 게놈 DNA에서 Gclc, Eno1, Map1s 및 Kng1 단백질의 코딩 영역에 해당하는 염기서열을 PCR로 증폭시켰다. Gclc, Eno1, Map1s 및 Kng1 단백질의 각각의 조합(GEMK, GEM, GEK, GMK, EMK, GE, GM, GK, EM, EK, MK)에 해당하는 염기서열을 렌티바이러스 벡터에 도입하고, 2A sequence를 통하여 각 조합별 벡터를 제작하였다. 각 유전자 및 조합 유전자 발현을 위하여 CMV 프로모터를 사용하였다. 제작된 벡터는 이후 렌티바이러스로 제작되었다.

<실험예 11> 렌티바이러스 벡터 제작

FUW-TetO-돌연변이 laminA/C(LMNA)에 대한 마우스 상보적 DNA(cDNA)를 포함하고, 프로게린(Progerin)을 과발현하는 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. HEK293T 세포를 10% FBS 및 1% P/S를 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 형질감염 전날, 2X10⁷ 개의 세포를 배지를 포함하는 15 cm 배양 접시에 시딩하였다. 다음날, 세포를 인산칼슘 공동 침전을 통해 렌티바이러스 구축물 psPAX2, pMD2.G 및 FUW-tetO-돌연변이 LMNA로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에 배지를 교체하고, 형질감염 72시간 후에 바이러스를 수득하였다. 렌티바이러스를 함유하는 상층액을 수집하고, 원심분리하여 세포 파편을 제거한 다음, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다. 렌티바이러스를 표준 초원심분리를 통해 펠렛화하고 차가운 PBS로 재현탁시켰다. 바이러스 역가(감염 단위 mL^-1)가 결정되기 전에 FUW-GFP를 대조군으로 사용하여 GFP 발현을 모니터링하고 감염 다중도를 산출하였다.

<실험예 12> 형질감염

형질감염 전날, 세포를 플레이트에 대해 75-80%의 밀도로 시딩하였다. 리포펙타민 3000(Lipofectamine 3000) 시약(Thermo Fisher)을 사용하여 72시간 동안 3회 연속 형질감염을 수행하였다. 6 웰 플레이트에 있는 세포의 단층을 리포펙타민 3000 시약 대 DNA의 5:2 또는 6:2 비율의 구조물로 형질감염시킨 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 12시간 동안 배양하였다. 형질감염 12시간 후에 배지를 교체하였다.

<실험예 13> 노화 연관 베타-갈락토시다제(Senescence-associated beta-galactosidase, SA-β-gal) 분석

세포를 4% 파라포름알데히드로 실온에서 5분 동안 고정시킨 다음, PBS로 2회 세척하였다. 40mM 시트르산/Na 인산염 완충액, 5mM K4[Fe(CN)6] 3H2O, 5 mM K3[Fe(CN)6], 150mM 염화나트륨, 2mM 염화마그네슘 및 1mg/ml X-gal을 포함하는 염색 용액에서 37℃로 밤새 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 메탄올로 1회 세척하고, 세포를 건조시킨 다음 명시야 현미경을 사용하여 촬영하였다.

<실험예 14> 신경학적 분석

뇌졸중 마우스 모델의 신경학적 분석을 위해 NSS(Neurological severity score) 측정 및 경색(Infarcted) 부위 부피를 측정하였다. NSS 측정을 위해 케이지 안에서 마우스가 앞다리를 이용하여 정상적인 운동성을 보이는지 측정하여 Zea-longa score를 매겼다. 또한, 높이 70 cm, 0.5 cm 직경의 바(Bar)를 앞다리로 잡고 유지하는 능력 평가(Grab and hold ability test), 앞다리로 바닥과 접촉을 유지하는 능력 평가(Circling behavior Test)를 수행하였다. 경색 부위 부피를 측정하기 위해, 마우스 뇌를 분리하여 4% PFA로 세포를 고정한 뒤 이를 0.45 um 두께로 절단하여 TTC(Triphenyltetrazolium chloride) 및 CV(cresyl violet) 염색을 수행하였다.

실시예

<실시예 1> OSKM 처리 혈장 내 단백질 스크리닝 및 OSKM 처리 혈장 및 OSKM 처리 혈장 유래 단백질의 노화 관련 지표 개선

OSKM이 유도된 4F2A 마우스로부터 유래하는 혈장(OSKM 처리 혈장) 내 단백질을 분석하기 위하여 LC/MS를 수행하고, OSKM이 유도되지 않은 4F2A 마우스 유래의 혈장(대조군)과 비교하였다(도 1a-c).

그 결과, OSKM 처리 혈장에서는 대조군 혈장 대비 특이적으로 17종의 혈장 단백질(GCLC, MAP1S, ENO1, KNG1, AFP, A2m, SAA2, YWHAG, PFKM, GDI2, ORM2, PCSK9, PSMD9, SNAP91, SLC17A9, PRG4, 및 SLC16A7)이 유도됨을 확인하였다(도 1d).

이에, 17종 단백질 중 암 관련 단백질 13종을 제외한 나머지 4종 단백질(GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1)을 선정하였다.

다음으로, 돌연변이 laminA/C(LMNA)가 형질도입되어 노화된 마우스 섬유아세포를 OSKM 처리 혈장을 10㎕/ml 농도로 처리하여 5일간 배양하거나, 17종의 단백질 중 4종의 단백질(GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1)을 코딩하는 벡터로 세포 내 형질전환하여 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 발현을 유도하고 5일 후, 각 세포에서 노화 관련 히스톤 마커(H3K9me3 및 H4K20me3)의 발현 수준을 면역형광 염색을 통해 분석하였다.

그 결과, 세포에 OSKM 처리 혈장을 처리하거나(도 2a-b), OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 발현을 유도하는 경우(도 2c-d), H3K9me3의 발현 수준은 증가하고, H4K20me3의 발현 수준이 감소하여 노화 관련 지표가 개선됨을 확인하였다.

다음으로, 6개월(young) 및 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) C57BL/6 마우스에 OSKM 처리 혈장을 주사 후, 각 장기 유래 세포에서 노화 관련 유전자의 발현 수준을 평가하기 위해 스트레스 반응 유전자인 p21, Btg2 및 Atf, ECM(extracellular matrix) 리모델링 유전자인 MMP12, MMP13 및 IL-6, SASP(Senescence-Associated Secretory Phenotype) 유전자인 IL-1a, Cdkn1a 및 Cdkn2a, 노화 관련 유전자인 Cxcl1 및 Cxcl2에 대한 qRT-qPCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 노화 마우스 유래 섬유아세포에서 노화 관련 유전자의 발현 수준이 현저히 증가되었으나, OSKM 처리 혈장을 처리한 세포에서는 노화 관련 유전자의 발현 수준이 감소되었다(도 5b).

이로부터 OSKM 처리 혈장을 처리하거나, OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1의 발현을 유도하는 경우, 세포에서 노화 관련 지표가 개선됨을 확인하여, OSKM 처리 혈장에서 특이적으로 발현되는 17종의 단백질 중 상기 4종의 단백질이 노화 억제 효과가 있음을 확인하였다.

OSKM 처리 혈장에서 특이적으로 발현되는 17종의 단백질 중 노화 억제 효과가 있는 것으로 확인된 GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1을 포함한 다양한 조합을 발현하는 벡터[GCLC+ENO1(GE), GCLC+KNG1(GK), GCLC+MAP1S(GM), ENO1+MAP1S(EM), MAP1S+KNG1(MK), ENO1+MAP1S(EK), GCLC+ENO1+MAP1S(GEM), GCLC+ENO1+KNG1(GEK), GCLC+MAP1S+KNG1(GMK), ENO1+MAP1S+KNG1(EMK), GCLC+MAP1S+ENO1+KNG1(GEMK) 벡터]를 야생형 마우스 꼬리 끝 섬유아세포에 각각 형질전환하고 3일 후, 노화 관련 베타 갈락토시다제 양성 세포 수와 노화가 진행됨에 따라 증가하는 세포 노화 마커인 cleaved-Caspase3 및 gamma-H2AX의 intensity를 측정하였다.

그 결과, GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독 처리에서 베타 갈락토시다제 양성 세포가 감소하였으나, 이들의 2 이상의 조합을 처리하였을 때 베타 갈락토시다제 양성 세포 감소 효과가 더 우수하였으며, 특히, 3개 조합 GCLC+ENO1+MAP1S(GEM), GCLC+ENO1+KNG1(GEK), GCLC+MAP1S+KNG1(GMK), ENO1+MAP1S+KNG1(EMK)과 4개 조합 GCLC+MAP1S+ENO1+KNG1(GEMK)을 처리하였을 때, 베타 갈락토시다제 양성 세포 및 cleaved-Caspase3 와 gamma-H2AX의 intensity 감소 효과가 가장 우수하여, 대조군인 야생형 마우스 섬유아세포와 유사한 수준으로 감소함을 확인하였다(도 3).

이로부터 GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독 및 이의 조합의 발현을 유도하는 경우, 세포에서 노화 관련 지표가 개선됨을 확인하여, OSKM 처리 혈장에서 특이적으로 발현되는 17종의 단백질 중 상기 4종의 단백질이 노화 억제 효과가 있음을 확인하였다.

특히, GCLC, MAP1S, ENO1 또는 KNG1 단독보다 4가지 단백질 중 2 이상을 포함하는 다양한 조합을 통하여 발현시켰을 때 세포에서 노화 관련 지표가 현저히 개선되어, 4종의 단백질의 조합에서 노화 억제 효과가 현저함을 확인하였다.

<실시예 2> OSKM 처리 혈장 및 OSKM 처리 혈장 유래 단백질 투여에 의한 노화 모델 마우스에서의 노화 관련 지표 개선

OSKM 처리 혈장 투여를 통해 in vivo에서 노화 관련 표현형을 개선할 수 있는지를 조사하였다.

10개월령 조기 노화 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장을 주사하여 외관, 대동맥 및 장기에서의 노화 관련 지표가 개선되는지를 조사하였다.

주사 후 마우스에서는 대조군 대비 척추 곡률 감소를 포함하여 외관이 상당히 개선되었으며(도 4c), 체중 감소가 억제되고(도 4a), 수명이 증가됨을 확인하였다(도 4b).

다음으로, 조기 노화 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 주사 후 4주 뒤 대동맥에서 경직 및 섬유화 증상을 H&E, VVG, MT 및 ORO 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 대동맥 경직 및 섬유화 증상이 개선되었다(도 4d-e).

다음으로, 조기 노화 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 주사 후 4주 뒤 간, 비장, 신장 및 피부에서의 노화 증상을 H&E 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군(5개월령 마우스) 대비 노화가 진행됨에 따라 증가하는 거대(enlarged) 세포가 간에서 감소하였고, 비장의 생식 중심(germinal center)의 크기가 증가하였다. 또한, 신장의 사구체(glomeruli) 수가 증가하였고, 피부에서는 표피(epidermis) 두께가 증가함에 따라 노화 증상이 개선되었다(도 4f-g).

다음으로, 6개월(young), 18개월(mid-aged) 및 자연적으로 노화가 유도된 24개월령(old) 야생형 C57BL/6 마우스에 OSKM 처리 혈장을 주사 후 오픈 필드 테스트를 수행한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 운동 활성이 증가하였다(도 5a).

다음으로, OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 투여를 통해 in vivo에서 심장 노화 관련 표현형을 개선할 수 있는지를 조사하였다.

10개월령 조기 노화 모델 마우스 및 24개월령 야생형 C57BL/6 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주사 후 4주 뒤 심장 대동맥 조직에서 심근세포(Cardiac Myofibroblast) 수를 α-SMA 면역형광 염색을 통해 분석한 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 α-SMA 양성 세포가 증가하여, 심근세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다(도 6d-e).

이로부터 OSKM 처리 혈장 및 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 조기 노화 모델 마우스 및 노화 마우스의 외관, 대동맥 및 장기에서 노화 관련 지표가 개선됨을 확인하였다.

<실시예 3> OSKM 처리 혈장 유래 단백질 투여에 의한 알츠하이머병 모델 마우스에서의 알츠하이머병 관련 지표 개선

12개월령 알츠하이머 모델 마우스에 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 뇌 조직에서 알츠하이머병 특이 아밀로이드 베타(amyloid-beta, Aβ) 플라크 및 Aβ42/40 비율의 수준을 분석하였다.

그 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 Aβ 플라크 및 Aβ42/40 비율이 감소하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 알츠하이머병 증상을 개선함을 확인하였다(도 7).

<실시예 4> OSKM 처리 혈장 유래 단백질 투여에 의한 파킨슨병 모델 마우스에서의 파킨슨병 관련 지표 개선

12개월령 파킨슨 질환 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 중뇌 조직에서 도파민성 신경세포 특이 유전자인 Map2, 시냅신(Synapsin), DAT 및 TH의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 도파민성 신경세포 특이 유전자인 Map2, 시냅신, DAT 및 TH의 mRNA 발현 수준이 증가하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 파킨슨병 증상을 개선함을 확인하였다(도 8).

<실시예 5> OSKM 처리 혈장 유래 단백질 투여에 의한 뇌졸중 모델 마우스에서의 뇌졸중 관련 지표 개선

뇌졸중 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 뇌 조직을 신경학적 분석하였다.

그 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 경색(infarct) 용적과 신경학적 결손 점수(neurological deficit score)가 감소하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 뇌졸중 증상을 개선함을 확인하였다(도 9).

<실시예 6> OSKM 처리 혈장 유래 단백질 투여에 의한 간부전 모델 마우스에서의 간부전 관련 지표 개선

간부전 모델 마우스에 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물을 주입한 후 2주 뒤 혈장 단백질을 분석하였다.

그 결과, 주사 후 마우스에서는 대조군 대비 ATL(alanine transaminase), AST(aspartate transaminase)의 수준이 감소하고, 혈장 ALB(albumin)의 수준이 증가하여, GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1을 포함하는 조성물 투여가 간부전 증상을 개선함을 확인하였다(도 10).

상기 실시예의 결과로부터, OSKM 처리 혈장 및 OSKM 처리 혈장 유래 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1은 in vitro 및 in vivo에서 노화 관련 표현형을 개선하고, 노화 관련 질환인 조로증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 간부전 등의 증상을 개선하는바, 노화 관련 질병을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 유효성분으로 하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물을 유효성분으로 하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 GCLC 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 MAP1S 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ENO1 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 KNG1 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물은 GCLC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, MAP1S 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, ENO1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 KNG1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 2 이상을 포함하는 벡터인 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 세포 노화 억제 효과를 갖는 것인 것인, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 세포 노화 억제 효과는 다음 중 선택되는 어느 하나 이상의 효과인 것인, 조성물:
i) 노화 관련 유전자의 발현 수준 감소;
ii) DNA 이중 가닥 파손 수준 감소; 및
iii) 베타 갈락토시다제 양성 세포 수 감소.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 노화 관련 질환을 개선하는 효과를 갖는 것인 것인, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 노화 관련 질환의 개선 효과는 다음 중 선택되는 어느 하나 이상의 효과인 것인, 조성물:
i) 척추 곡률 감소;
ii) 체중 감소 억제;
iii) 수명 증가;
iv) 운동 활성 증가; 및
v) 장기 및 피부의 노화 개선.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 조기 노화를 유도하는 질환 또는 노화에 의해 유도되는 질환 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조기 노화를 유도하는 질환은 허친슨 길포드(Hutchinson Guilford) 조로증 증후군(HGPS), 조로증, HIV 감염과 관련된 조기 노화, 근육 퇴행 위축, 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease), 베르너(Werner) 증후군, 인슐린 내성 타입 II 당뇨병, 골다공증, 피부 노화 및 제한 피부병증(restrictive dermopathy)으로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 노화에 의해 유도되는 질환은 동맥경화, 간부전, 뇌졸중, 퇴행성 뇌질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 고혈압, 인지기능장애, 근감소증, 안구건조증, 황반변성, 원시, 근시, 백내장, 이명, 난청, 소화불량, 설사, 자가면역질환, 폐렴, 독감, 파상풍, 감염성 심내막염, 폐렴, 독감, 파상풍, 감염성 심내막염, 암, 과민성 방광, 요실금, 전립선 비대증, 하부요로증상, 사구체 신염, 만성 신부전, 뇌졸중, 골다공증, 관절염, 당뇨병, 신부전, 만성폐쇄성 폐질환 및 폐섬유화증으로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항의 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 노화 방지 방법.
GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물; 또는 GCLC, MAP1S, ENO1 및 KNG1 중 선택되는 2 이상의 단백질의 발현을 증대시키는 조성물; 중 선택되는 어느 하나를 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 in vitro 또는 ex vivo에서 세포 노화를 억제하는 것인, 세포 노화 억제용 조성물.