TW202204629A - 用於ｉｄｓ基因轉移之腺相關病毒組成物及其使用方法 - Google Patents

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庫堤 帕托
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伊馮娜 懷特
賽琳娜 妮可 朵利維
利斯豪特 蘿拉 范
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Abstract

本發明提供可恢復細胞中之IDS基因功能的腺相關病毒（AAV）組成物，及使用此等AAV組成物治療與IDS基因功能降低相關之病症（例如 韓特氏症候群）的方法。亦提供用於製造該等AAV組成物之組成物、系統及方法。

Description

用於IDS基因轉移之腺相關病毒組成物及其使用方法
相關申請案
本申請案主張以下美國臨時專利申請案之優先權：2020年4月6日申請之第63/005,833號、2020年10月21日申請之第63/094,800號及2021年2月3日申請之第63/145,258號，其全部揭示內容在此以引用之方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中（該ASCII複本創建於2021年3月30日，名稱為「404217-HMW-037WO (182710) SL.txt」且大小為217,283個位元組）。
韓特氏症候群（Hunter syndrome），或第II型黏多醣病（mucopolysaccharidosis II；MPS II）為一種致命的溶酶體貯積症，其導致預期壽命嚴重縮短10至20年，且具有高度未獲滿足的醫療需求。此疾病為一種罕見的X性聯遺傳病症，其主要影響男性，且干擾身體分解及回收特定黏多醣，亦稱為醣胺聚醣（glycosaminoglycan；GAG）的能力。韓特氏症候群由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（iduronate-2-sulfatase；IDS）中之基因缺陷引起，IDS為GAG、硫酸乙醯肝素（heparan sulfate）及硫酸皮膚素（dermatan sulfate）的逐步降解所必需的溶酶體酶。IDS缺陷導致GAG在全身的細胞中累積，干擾某些細胞及器官的正常功能。隨著GAG持續累積，韓特氏症候群的病徵及症狀變得更加明顯。此等可包括：明顯的面部特徵、大頭、腹部增大、聽力喪失、導致心臟功能下降的心臟瓣膜增厚、阻塞性呼吸道疾病、睡眠呼吸中止、活動範圍減小及活動能力降低以及肝臟及脾臟增大。三分之二的韓特氏症候群患者罹患中樞神經系統（central nervous system；CNS）疾病，導致神經認知及行為異常。年齡低至2至4歲的兒童可展現諸如粗糙面部特徵、骨骼畸形、器官巨大（尤其肝臟），及伴有認知障礙之心血管併發症的症狀。美國韓特氏症候群的發病率為1:130,000。
目前，可用幾種不同的治療來管理韓特氏症候群。治療包括骨髓移植及酶替代療法（enzyme replacement therapy；ERT）。ERT需要定期投與，諸如對於移黏寶酶（Elaprase），其必須每週藉由持續1-8小時之間的輸注投與。經批准之ERT治療不足以治療與三分之二韓特氏症患者相關的神經退化。其他ERT治療仍在臨床測試階段，諸如SHP631，一種IDS與經工程改造以穿越血腦障壁之抗體的融合蛋白。其他治療包括活體外基因療法，涉及擴增經IDS基因轉導的周邊血液淋巴球，此為一種不建議用於患有認知疾病之患者的方法。儘管可獲得幾種不同的治療選項，但無法治癒韓特氏症候群。
基因療法提供治癒韓特氏症候群的機會。反轉錄病毒載體，包括慢病毒載體能將核酸整合至宿主細胞基因體中，因其非靶向插入至基因體中而產生安全性問題。舉例而言，存在載體破壞腫瘤抑制基因或活化致癌基因，藉此引起惡性腫瘤的風險。事實上，在藉由用γ反轉錄病毒載體轉導CD34+ 骨髓前驅物來治療X性聯嚴重合併性免疫缺失病（severe combined immunodeficiency；SCID）的臨床試驗中，十位患者中有四位罹患白血病（Hacein-Bey-Abina等人 ，J Clin Invest. (2008) 118(9):3132-42，以全文引用之方式併入本文中）。另一方面，非整合載體通常遭受活體內 表現量或表現持續時間不足的問題。
因此，此項技術中需要可有效且安全地恢復韓特氏症候群患者之IDS基因功能的改良基因療法組成物及方法。
本文提供可恢復細胞中之IDS基因功能的腺相關病毒（adeno-associated virus；AAV）組成物，及使用其治療與IDS基因功能降低相關之病症（例如 韓特氏症候群）的方法。亦提供用於製造該等AAV組成物之組成物、系統及方法。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus；rAAV），其包含：（a）包含AAV衣殼蛋白之AAV衣殼；及（b）rAAV基因體，其包含可操作地連接至包含內含子之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）內含子插入編碼序列的轉錄調控元件。
在某些實施例中，IDS內含子插入編碼序列編碼人類IDS蛋白。在某些實施例中，IDS內含子插入編碼序列編碼SEQ ID NO: 23中所闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，內含子為異源內含子。在某些實施例中，內含子與SEQ ID NO: 33中所闡述之核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
在某些實施例中，內含子位於IDS內含子插入編碼序列中對應於SEQ ID NO: 24中所闡述之IDS編碼序列之位置708及709的核苷酸之間。在某些實施例中，IDS內含子插入編碼序列包含與SEQ ID NO: 25、59或60中所闡述之核苷酸序列具有至少至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列。
在某些實施例中，內含子位於IDS內含子插入編碼序列中對應於SEQ ID NO: 26中所闡述之IDS編碼序列之位置580及581的核苷酸之間。在某些實施例中，IDS內含子插入編碼序列包含與SEQ ID NO: 27中所闡述之核苷酸序列具有至少至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列。
在某些實施例中，IDS內含子插入編碼序列包含SEQ ID NO: 25、27、59或60中所闡述之核苷酸序列。
在某些實施例中，轉錄調控元件包含選自由以下組成之群的元件中之一或多者：巨細胞病毒（cytomegalovirus；CMV）增強子元件、巨細胞病毒（CMV）啟動子、雞β-肌動蛋白（chicken-β-actin；CBA）啟動子、小型雞β-肌動蛋白（small chicken-β-actin；SmCBA）啟動子、甘油醛3-磷酸去氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）啟動子、β-葡萄糖醛酸苷酶（beta-glucuronidase；GUSB）啟動子、經修飾之人類EF-1α啟動子、CALM1啟動子、合成啟動子及其任何組合。
在某些實施例中，轉錄調控元件包含與SEQ ID NO: 29、30、36、39、40、41、42、44、46、47、48或55中所闡述之核苷酸序列具有至少至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列。在某些實施例中，轉錄調控元件包含SEQ ID NO: 29中所闡述之核苷酸序列。
在某些實施例中，rAAV基因體進一步包含位於IDS內含子插入編碼序列3'端之聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列為外源性聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，外源性聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，SV40聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之核苷酸序列。
在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 37、43、52、54、61、63、65、69、75或77中所闡述之核苷酸序列。
在某些實施例中，rAAV基因體進一步包含5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸及3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18、20或49具有至少95%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14、19、21或51具有至少95%序列一致性。
在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少80%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 51具有至少80%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 49具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 49具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 49具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 51具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 20具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 21具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列及3' ITR核苷酸分別包含SEQ ID NO: 18及14；18及19；18及51；49及14；49及19；40及51；或20及21之序列。
在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 28、38、50、53、56、57、58、62、64、66、70、71、72、73或74中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 72及74；72及28；73及74；或73及28中所闡述之核苷酸序列。
在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 38、50、62、64、66、70、76或78中所闡述之核苷酸序列。
在某些實施例中，AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。
在某些實施例中，（a）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G；（b）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；（c）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；（d）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；或（e）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。
在某些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列。
在某些實施例中，AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160的胺基酸為D；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。
在某些實施例中，（a）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G；（b）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；（c）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；（d）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；或（e）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。
在某些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列。
在某些實施例中，AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2的胺基酸為T；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸68的胺基酸為V；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119的胺基酸為L；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160的胺基酸為D；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。
在某些實施例中，（a）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2的胺基酸為T，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；（b）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65的胺基酸為I，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為Y；（c）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；（d）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119的胺基酸為L，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；（e）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G；（f）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；（g）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；（h）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；或（i）衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。
在某些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種用於在細胞中表現艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）多肽之方法，該方法包含用如本文所描述之重組腺相關病毒（rAAV）轉導細胞。
在某些實施例中，細胞為中樞神經系統的細胞。在某些實施例中，細胞為選自由以下組成之群的中樞神經系統區域的細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、海馬體、殼核、小腦（視情況，小腦核）及其任何組合。在某些實施例中，細胞為神經元及/或神經膠細胞，視情況其中該細胞為中樞神經系統及/或周邊神經系統的神經元及/或神經膠細胞。在某些實施例中，細胞為選自由以下組成之群的細胞：運動神經元、星狀細胞、寡樹突神經膠細胞、中樞神經系統中之大腦皮質的細胞、周邊神經系統之感覺神經元、許旺氏細胞（Schwann cell）及其任何組合。
在某些實施例中，細胞為肝臟細胞。在某些實施例中，細胞為心臟細胞。在某些實施例中，細胞為肺細胞。在某些實施例中，細胞為腎臟細胞。在某些實施例中，細胞為脾臟細胞。
在某些實施例中，細胞在哺乳動物個體中，且rAAV以可有效轉導個體中之細胞的量向個體投與。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含如本文所描述之rAAV。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療患有韓特氏症候群（HS）之個體的方法，該方法包含向個體投與有效量之如本文所描述之rAAV或如本文所描述之醫藥組成物。
在某些實施例中，rAAV或醫藥組成物經靜脈內投與。
在某些實施例中，韓特氏症候群（HS）與艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）基因突變相關。
在某些實施例中，個體為人類個體。
在另一態樣中，本發明提供一種用於製備rAAV之封裝系統，其中該封裝系統包含：（a）編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列；（b）編碼如本文所描述之rAAV之衣殼蛋白的第二核苷酸序列；及（c）包含如本文所描述之rAAV之rAAV基因體序列的第三核苷酸序列。
在某些實施例中，封裝系統包含有包含第一核苷酸序列及第二核苷酸序列之第一載體，及包含第三核苷酸序列之第二載體。
在某些實施例中，封裝系統進一步包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。在某些實施例中，第四核苷酸序列包含在第三載體內。在某些實施例中，第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群的病毒的基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒及巨細胞病毒（CMV）。
在某些實施例中，第一載體、第二載體及/或第三載體為質體。
在另一態樣中，本發明提供一種用於重組製備rAAV之方法，該方法包含在產生rAAV之條件下將本文所描述之封裝系統引入至細胞中。
在另一態樣中，本發明提供一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸包含在載體，視情況病毒載體（例如AAV載體、反轉錄病毒載體或腺病毒載體）或質體載體內。在另一態樣中，本發明提供包含前述多核苷酸之重組細胞。
在另一態樣中，本發明提供如本文所描述之rAAV、如本文所描述之醫藥組成物、如本文所描述之多核苷酸或如本文所描述之重組細胞，其用作藥劑。
在另一態樣中，本發明提供如本文所描述之rAAV、如本文所描述之醫藥組成物、如本文所描述之多核苷酸或如本文所描述之重組細胞，其用於治療韓特氏症候群（HS）。
在另一態樣中，本發明提供如本文所描述之rAAV、如本文所描述之醫藥組成物、如本文所描述之多核苷酸或如本文所描述之重組細胞，其用於治療患有韓特氏症候群（HS）之個體的方法，該方法包含向個體投與有效量之rAAV、醫藥組成物、多核苷酸或細胞。
本發明提供可恢復細胞中之IDS基因功能的AAV組成物，及使用其治療與IDS基因功能降低相關之病症（例如 韓特氏症候群）的方法。亦提供用於製造該等AAV組成物之組成物、系統及方法。I. 定義
如本文所用，術語「重組腺相關病毒」或「rAAV」係指包含缺乏功能性rep及cap基因之基因體的AAV。
如本文所用，術語「IDS基因」係指艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因。人類IDS基因由國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information；NCBI）基因ID 3423鑑別。IDS基因之互補編碼序列之例示性核苷酸序列以SEQ ID NO: 24提供。IDS多肽之例示性胺基酸序列以SEQ ID NO: 23提供。
如本文所用，術語「rAAV基因體」係指包含rAAV之基因體序列的核酸分子（例如 DNA及/或RNA）。熟習此項技術者將瞭解，在rAAV基因體包含轉殖基因（例如 可操作地連接至轉錄調控元件之IDS編碼序列）時，rAAV基因體可相對於轉殖基因之轉錄方向處於有義或反義定向。
如本文所用，術語「AAV衣殼蛋白」係指AAV VP1、VP2或VP3衣殼蛋白。術語「分枝系F衣殼蛋白」係指AAV VP1、VP2或VP3衣殼蛋白，其分別與本文中之SEQ ID NO: 1之胺基酸1-736、138-736及203-736中所闡述之VP1、VP2或VP3胺基酸序列具有至少90%一致性。
如本文所用，兩個核苷酸序列之間或兩個胺基酸序列之間的「一致性百分比」係藉由將比對序列對之間的匹配數乘以100，且除以比對區域的長度（包括內部間隙）來計算。一致性評分僅對完美匹配進行計數，且不考慮胺基酸彼此的相似性程度。應注意，長度中僅包括內部間隙，而不包括序列末端處之間隙。
如本文所用，術語「與IDS基因突變相關之疾病或病症」係指由IDS基因之突變引起、由IDS基因之突變加劇或與IDS基因之突變遺傳連鎖之任何疾病或病症。在某些實施例中，與IDS基因突變相關之疾病或病症為韓特氏症候群或第II型黏多醣病（MPS II）。
如本文所用，術語「編碼序列」係指互補DNA（cDNA）中編碼多肽之部分，在起始密碼子處開始且在終止密碼子處結束。基因可因替代性剪接、替代性轉譯起始及群體內變化而具有一或多個編碼序列。編碼序列可為野生型、經緘默改變的或內含子插入的。例示性野生型IDS編碼序列闡述於SEQ ID NO: 24中。
如本文所用，術語「經緘默改變」係指在不改變由編碼序列或內含子插入編碼序列編碼之多肽之胺基酸序列的情況下，基因之編碼序列或內含子插入編碼序列的改變（例如 藉由核苷酸取代）。此類緘默改變為有利的，因為其可提高編碼序列之轉譯效率及/或在編碼序列轉導至細胞中時防止與內源性基因之對應序列重組。如本文所描述之例示性經緘默改變之IDS編碼序列闡述於SEQ ID NO: 26、67或68中。
如本文所用，術語基因之「內含子插入編碼序列」係指包含插入基因之編碼序列中之一或多個內含子的核苷酸序列。基因之內含子插入編碼序列亦稱為包含內含子之內含子插入編碼序列。在某些實施例中，內含子中之至少一者為非原生或異源內含子，亦即 ，具有不同於基因之原生內含子之序列。在某些實施例中，內含子插入編碼序列中之所有內含子為非原生內含子。非原生內含子可具有來自不同物種之內含子的序列或來自相同物種或不同物種之不同基因中之內含子的序列。替代地或另外，非原生內含子序列之至少一部分可為合成的。熟練工作人員將瞭解，非原生內含子序列可藉由引入此項技術中已知的任何共有剪接模體（motif）來設計以介導RNA剪接。例示性共有剪接模體提供於Sibley等人, (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21中，其以全文引用之方式併入本文中。插入非原生內含子可促進載體封裝之效率及穩健性，因為此類序列可允許調整載體以達到最佳大小（例如 4.5-4.8 kb）。在某些實施例中，內含子中之至少一者為基因之原生內含子。在某些實施例中，內含子插入編碼序列中之所有內含子為基因之原生內含子。非原生或原生內含子可在編碼序列中之任何核苷酸間鍵處插入。在某些實施例中，預計將一或多個非原生或原生內含子插入於核苷酸間鍵處促進有效剪接（參見例如 Zhang (1998) Human Molecular Genetics, 7(5):919-32，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中）。在某些實施例中，將一或多個非原生或原生內含子插入於連接兩個內源性外顯子之核苷酸間鍵處。因此，在某些實施例中，基因之內含子插入編碼序列包含一或多個經設計用於有效剪接之內含子。在某些實施例中，一或多個內含子可插入基因之編碼序列中以增強基因之表現（例如經由內含子介導之增強（IME）。
如本文所用，術語「異源內含子」及「非原生內含子」係指並非給定基因原生之內含子。
在本發明中，IDS基因中之核苷酸位置係相對於起始密碼子之第一核苷酸指定。起始密碼子之第一核苷酸為位置1；位於起始密碼子之第一核苷酸5'端之核苷酸具有負數；位於起始密碼子之第一核苷酸3'端之核苷酸具有正數。人類IDS基因之例示性核苷酸1為NCBI參考序列之核苷酸170：NG_011900.3（寄存區域：NG_011900，區域5029..33347，分類單元9606，染色體X，圖Xq28），且人類IDS基因之例示性核苷酸3為NCBI參考序列之核苷酸172：NG_011900.3。與起始密碼子之5'端相鄰之核苷酸為核苷酸-1。
如本文所用，術語「轉錄調控元件」或「TRE」係指順式作用核苷酸序列，例如DNA序列，其調控（例如 控制、增加或減少）可操作地連接之核苷酸序列藉由RNA聚合酶轉錄形成RNA分子。TRE依賴於一或多個反式作用分子（諸如轉錄因子）來調控轉錄。因此，當一個TRE與不同反式作用分子接觸時，例如當其處於不同類型細胞中時，其可以不同方式調控轉錄。TRE可包含一或多個啟動子元件及/或增強子元件。熟習此項技術者應瞭解，基因中之啟動子及增強子元件可在位置上靠近，且術語「啟動子」可指包含啟動子元件及增強子元件之序列。因此，術語「增強子」不排除序列中之增強子元件。啟動子及增強子元件不需要衍生自相同基因或物種，且各啟動子或增強子元件之序列可與基因體中之對應內源性序列一致或實質上一致。
如本文所用，術語「可操作地連接」用於描述TRE與待轉錄之編碼序列之間的連接。通常，基因表現置於包含一或多個啟動子及/或增強子元件之TRE的控制下。若編碼序列之轉錄受TRE控制或影響，則編碼序列「可操作地連接」至TRE。TRE之啟動子及增強子元件可相對於編碼序列呈任何方向及/或距離，只要獲得所要轉錄活性即可。在某些實施例中，TRE在編碼序列上游。
如本文所用，術語「聚腺苷酸化序列」係指當轉錄成RNA時構成聚腺苷酸化信號序列的DNA序列。聚腺苷酸化序列可為原生的（例如 來自IDS基因）或外源性的。外源性聚腺苷酸化序列可為哺乳動物或病毒聚腺苷酸化序列（例如 SV40聚腺苷酸化序列）。
如本文所用，「外源性聚腺苷酸化序列」係指與IDS基因（例如 人類IDS基因）之內源性聚腺苷酸化序列不一致或實質上不一致的聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，外源性聚腺苷酸化序列為相同物種（例如 人類）中之非IDS基因的聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，外源性聚腺苷酸化序列為不同物種（例如 病毒）的聚腺苷酸化序列。
如本文所用，在向個體投與AAV之情形下，術語「有效量」係指達成所要預防或治療效果之AAV的量。
如本文所用，當提及可量測值（諸如IDS蛋白之表現水準）時，術語「約」或「大致」涵蓋適合於執行本文所揭示之方法之給定值或範圍±20%或±10%、±5%、±1%或±0.1%的變化。II. 腺相關病毒組成物
在一個態樣中，本文提供適用於在具有降低或以其他方式缺陷的IDS基因功能之細胞中表現IDS多肽的新穎rAAV組成物。在某些實施例中，本文所揭示之AAV包含：AAV衣殼，其包含衣殼蛋白（例如 AAV分枝系F衣殼蛋白）；及rAAV基因體，其包含可操作地連接至內含子插入IDS編碼序列（例如 經緘默改變之內含子插入IDS編碼序列）之轉錄調控元件，從而允許在經AAV轉導之細胞中IDS之染色體外表現。
來自此項技術中已知之任何衣殼之衣殼蛋白可用於本文所揭示之rAAV組成物中，包括但不限於來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型之衣殼蛋白。舉例而言，在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中：衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。在某些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列。
舉例而言，在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中：衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160的胺基酸為D；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。在某些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列。
舉例而言，在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，其中：衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2的胺基酸為T；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸68的胺基酸為V；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119的胺基酸為L；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160的胺基酸為D；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2的胺基酸為T，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65的胺基酸為I，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為Y。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119的胺基酸為L，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R。在某些實施例中，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。在某些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列。
在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO: 1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）具有由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）具有由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白。
在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸203-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸138-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸1-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO: 8之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 8之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 8之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO: 8之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 8之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 8之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO: 8之胺基酸203-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）具有由SEQ ID NO: 8之胺基酸138-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）具有由SEQ ID NO: 8之胺基酸1-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白。
在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO: 11之胺基酸203-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含與SEQ ID NO: 11之胺基酸138-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含與SEQ ID NO: 11之胺基酸1-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO: 11之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 11之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 11之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO: 11之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 11之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 11之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO: 11之胺基酸203-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）具有由SEQ ID NO: 11之胺基酸138-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）具有由SEQ ID NO: 11之胺基酸1-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白。
在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO: 13之胺基酸203-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含與SEQ ID NO: 13之胺基酸138-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含與SEQ ID NO: 13之胺基酸1-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO: 13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO: 13之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 13之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 13之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO: 13之胺基酸203-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）具有由SEQ ID NO: 13之胺基酸138-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）具有由SEQ ID NO: 13之胺基酸1-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白。
在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸1-736的序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之一或多者：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含以下中之兩者或更多者：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸1-736之胺基酸序列的衣殼蛋白。在某些實施例中，AAV衣殼包含：（a）具有由SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；（b）具有由SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白；及（c）具有由SEQ ID NO: 16之胺基酸1-736組成之胺基酸序列的衣殼蛋白。
適用於本文所揭示之AAV組成物中的rAAV基因體一般包含可操作地連接至內含子插入IDS編碼序列之轉錄調控元件（TRE）。在某些實施例中，rAAV基因體包含位於TRE及內含子插入IDS編碼序列5'端之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列，及位於TRE及內含子插入IDS編碼序列3'端之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。
在某些實施例中，內含子插入IDS編碼序列包含IDS基因之全部或實質上全部編碼序列。在某些實施例中，rAAV基因體包含編碼SEQ ID NO: 23之核苷酸序列，且可視情況進一步包含位於IDS編碼序列3'端之外源性聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，編碼SEQ ID NO: 23之內含子插入IDS編碼序列的核苷酸序列為野生型（例如 具有SEQ ID NO: 25中所闡述之序列）。在某些實施例中，編碼SEQ ID NO: 23之內含子插入IDS編碼序列的核苷酸序列經緘默改變（例如 具有SEQ ID NO: 27、59或60中所闡述之序列）。
在某些實施例中，內含子插入IDS編碼序列編碼包含IDS蛋白之全部或實質上全部胺基酸序列的多肽。在某些實施例中，內含子插入IDS編碼序列編碼野生型IDS蛋白（例如 人類IDS蛋白）之胺基酸序列。在某些實施例中，內含子插入IDS編碼序列編碼突變IDS蛋白（例如 人類IDS蛋白）之胺基酸序列，其中突變IDS多肽為野生型IDS多肽之功能等效物，亦即 ，可充當野生型IDS多肽。在某些實施例中，功能等效IDS多肽進一步包含至少一種未發現於野生型IDS多肽中的特徵，例如 抵抗蛋白質降解的能力。
在某些實施例中，適用於本文所揭示之AAV組成物中的rAAV基因體一般包含可操作地連接至編碼IDS之內含子插入編碼序列的轉錄調控元件（TRE）。
rAAV基因體可用於在任何哺乳動物細胞（例如 人類細胞）中表現IDS。因此，TRE可在任何哺乳動物細胞（例如 人類細胞）中具有活性。在某些實施例中，TRE在廣泛範圍的人類細胞中具有活性。此類TRE可包含組成型啟動子及/或增強子元件，包括巨細胞病毒（CMV）啟動子/增強子（例如 包含與SEQ ID NO: 29、40或46至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、SV40啟動子、雞ACTB啟動子（例如 包含與SEQ ID NO: 47至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、JeT啟動子（例如 包含與SEQ ID NO: 30至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、smCBA啟動子（例如 包含與SEQ ID NO: 55至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、人類延長因子1α（EF1α）啟動子（例如 包含與SEQ ID NO: 39至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、包含轉錄因子結合位點的小鼠細小病毒（MVM）內含子（例如 包含與SEQ ID NO: 33至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、人類磷酸甘油酯激酶（PGK1）啟動子、人類泛素C（Ubc）啟動子、人類β肌動蛋白啟動子、人類神經元特異性烯醇酶（ENO2）啟動子、人類β-葡萄糖醛酸苷酶（GUSB）啟動子、兔β-血球蛋白元件（例如 包含與SEQ ID NO: 41至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）、人類調鈣蛋白1（CALM1）啟動子（例如 包含與SEQ ID NO: 44至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）及/或人類甲基-CpG結合蛋白2（MeCP2）啟動子。此等TRE中之任一者可以任何順序組合以驅動有效轉錄。舉例而言，rAAV基因體可包含CMV增強子、CBA啟動子及來自兔β-血球蛋白基因之外顯子3的剪接受體（統稱為CAG啟動子）（例如 包含與SEQ ID NO: 42至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）。舉例而言，rAAV基因體可包含CMV增強子及CBA啟動子後接剪接供體及剪接受體之雜合體（統稱為CASI啟動子區域）（例如 包含與SEQ ID NO: 48至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列）。
或者，TRE可為組織特異性TRE，亦即 ，其在特定組織及/或器官中具有活性。組織特異性TRE包含一或多個組織特異性啟動子及/或增強子元件，及視情況選用之一或多個組成型啟動子及/或增強子元件。熟習此項技術者應瞭解，組織特異性啟動子及/或增強子元件可藉由此項技術中熟知之方法自特異性表現於組織中之基因分離。
在某些實施例中，TRE為腦特異性（例如 神經元特異性、神經膠細胞特異性、星狀細胞特異性、寡樹突神經膠細胞特異性、微膠細胞特異性及/或中樞神經系統特異性）。例示性腦特異性TRE可包含一或多種來自但不限於以下之元件：人類膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子、人類突觸蛋白1（SYN1）啟動子、人類突觸蛋白2（SYN2）啟動子、人類金屬硫蛋白3（MT3）啟動子及/或人類蛋白脂質1（PLP1）啟動子。更多腦特異性啟動子元件揭示於WO 2016/100575A1中，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，rAAV基因體包含兩個或更多個TRE，視情況包含以上揭示之TRE中之至少一者。熟習此項技術者應瞭解，此等TRE中之任一者可以任何順序組合，且組成型TRE及組織特異性TRE之組合可驅動有效且組織特異性轉錄。
在某些實施例中，rAAV載體進一步包含位於IDS編碼序列5'端或插入IDS編碼序列中之內含子。此類內含子可例如藉由減少轉錄緘默及增強自細胞核至細胞質之mRNA輸出而增加轉殖基因表現。在某些實施例中，rAAV基因體自5'至3'包含：非編碼外顯子、內含子及IDS編碼序列。在某些實施例中，在IDS編碼序列中插入內含子序列，視情況其中內含子插入在連接兩個原生外顯子的核苷酸間鍵處。在某些實施例中，內含子插入在連接原生外顯子1及外顯子2之核苷酸間鍵處。
內含子可包含IDS基因之原生內含子序列、來自不同物種或來自相同物種之不同基因的內含子序列（亦即 ，非原生或異源性內含子）及/或合成內含子序列。熟練工作人員將瞭解，合成內含子序列可藉由引入此項技術中已知的任何共有剪接模體來設計以介導RNA剪接（例如 ，在Sibley等人, (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21中，其以全文引用之方式併入本文中）。例示性內含子序列提供於Lu等人 (2013) Molecular Therapy 21(5): 954-63及Lu等人 (2017) Hum. Gene Ther. 28(1): 125-34，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，rAAV基因體包含SV40元件（例如 包含與SEQ ID NO: 31至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）或小鼠細小病毒（MVM）內含子（例如 包含與SEQ ID NO: 33至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）。在某些實施例中，rAAV基因體包含SV40元件（例如 包含SEQ ID NO: 31中所闡述之核苷酸序列）或小鼠細小病毒（MVM）內含子（例如 包含SEQ ID NO: 33中所闡述之核苷酸序列）。在某些實施例中，rAAV基因體包含嵌合內含子序列，其包含雞與兔序列之組合，其包含部分非轉錄雞ACTB（cACTB）啟動子、全部cACTB外顯子1、部分cACTB內含子1、部分兔HBB2（rHBB2）內含子2及部分rHBB2外顯子3（例如 SEQ ID NO: 32）。在某些實施例中，rAAV基因體包含嵌合內含子序列（例如 包含與SEQ ID NO: 32至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）。在某些實施例中，rAAV基因體包含嵌合內含子序列（例如 包含SEQ ID NO: 32中所闡述之核苷酸序列）。
在某些實施例中，rAAV基因體包含TRE，其包含CMV增強子、CBA啟動子及嵌合內含子序列（例如 包含與SEQ ID NO: 36至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列）。在某些實施例中，rAAV基因體包含TRE，其包含SEQ ID NO: 36。
在某些實施例中，rAAV基因體包含TRE，其包含與SEQ ID NO: 29至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體包含TRE，其包含SEQ ID NO: 29。
在某些實施例中，本文所揭示之rAAV基因體進一步包含轉錄終止子（例如 聚腺苷酸化序列）。在某些實施例中，轉錄終止子位於內含子插入IDS編碼序列3'端。轉錄終止子可為任何有效終止轉錄之序列，且熟悉此項技術者應瞭解，此類序列可自需要內含子插入IDS編碼序列之轉錄之細胞中表現的任何基因分離。在某些實施例中，轉錄終止子包含聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列與人類IDS基因之內源性聚腺苷酸化序列一致或實質上一致。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列為外源性聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列（例如 包含SEQ ID NO: 34、35或45中所闡述之核苷酸序列，或與其互補的核苷酸序列）。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列。
在某些實施例中，rAAV基因體自5'至3'包含：TRE、內含子插入IDS編碼序列及聚腺苷酸化序列。在某些實施例中，TRE與SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、35、36、39、40、41、42、44、46、47、48及/或55中之任一者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；內含子插入IDS編碼序列與SEQ ID NO: 25、27、59或60具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及/或聚腺苷酸化序列與SEQ ID NO: 34、35或45中之任一者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在某些實施例中，TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 25中所闡述之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列。
在某些實施例中，TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 27中所闡述之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列。
在某些實施例中，TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 59中所闡述之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列。
在某些實施例中，TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 60中所闡述之序列；及/或聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列。
在某些實施例中，rAAV基因體包含與SEQ ID NO: 37、43、52、54、61、63、65、69、75或77至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 37、43、52、54、61、63、65、69、75或77中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 37、43、52、54、61、63、65、69、75或77中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 37中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 37中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 43中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 43中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 52中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 52中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 54中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 54中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 61中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 61中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 63中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 63中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 65中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 65中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 69中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 69中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 75中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 75中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 77中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 77中所闡述之核苷酸序列組成。
在某些實施例中，本文所揭示之rAAV基因體進一步包含位於TRE 5'端之5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列，及位於內含子插入IDS編碼序列3'端之3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。來自其任何AAV血清型或其變異體之ITR序列可用於本文所揭示之rAAV基因體中。5'及3' ITR可來自相同血清型之AAV或不同血清型之AAV。用於本文所揭示之rAAV基因體中的例示性ITR闡述於本文中之SEQ ID NO: 14、18-21、28、49、51、57及72-74中。
在某些實施例中，5' ITR或3' ITR來自AAV2。在某些實施例中，5' ITR及3' ITR皆來自AAV2。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，或3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 37、43、52或54中之任一者中所闡述之核苷酸序列、具有SEQ ID NO: 18之序列之5' ITR核苷酸序列及具有SEQ ID NO: 14之序列之3' ITR核苷酸序列。
在某些實施例中，5' ITR或3' ITR來自AAV2。在某些實施例中，5' ITR及3' ITR皆來自AAV2。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，或3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 37、43、52或54中之任一者中所闡述之核苷酸序列、具有SEQ ID NO: 18之序列之5' ITR核苷酸序列及具有SEQ ID NO: 19之序列之3' ITR核苷酸序列。
在某些實施例中，5' ITR或3' ITR來自AAV5。在某些實施例中，5' ITR及3' ITR皆來自AAV5。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 20具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，或3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 21具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 20具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 21具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 37、43、52或54中之任一者中所闡述之核苷酸序列、具有SEQ ID NO: 20之序列之5' ITR核苷酸序列及具有SEQ ID NO: 21之序列之3' ITR核苷酸序列。
在某些實施例中，5' ITR核苷酸序列及3' ITR核苷酸序列彼此實質上互補（例如 除在5'或3' ITR中之1、2、3、4或5個核苷酸位置處之錯配外彼此互補）。
在某些實施例中，5' ITR或3' ITR經修飾以減少或消除由Rep蛋白進行之解析（「不可解析的ITR」）。在某些實施例中，不可解析的ITR包含末端解析位點之核苷酸序列中的插入、缺失或取代。此類修飾允許在感染細胞中複製rAAV基因體後形成AAV之自互補雙股DNA基因體。例示性不可解析的ITR序列為此項技術中已知的（參見例如 提供於美國專利第7,790,154號及第9,783,824號中之序列，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中）。在某些實施例中，5' ITR包含與SEQ ID NO: 49至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，5' ITR由與SEQ ID NO: 49至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR由SEQ ID NO: 49中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，3' ITR包含與SEQ ID NO: 51至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，5' ITR由與SEQ ID NO: 51至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些實施例中，3' ITR由SEQ ID NO: 51中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR由SEQ ID NO: 49中所闡述之核苷酸序列組成，且3' ITR由SEQ ID NO: 51中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR由SEQ ID NO: 49中所闡述之核苷酸序列組成，且3' ITR由SEQ ID NO: 14中所闡述之核苷酸序列組成。
在某些實施例中，5' ITR由衍生自野生型AAV2基因體序列之額外核苷酸序列側接。在某些實施例中，5' ITR由衍生自與野生型AAV2 ITR相鄰之野生型AAV2序列的額外46 bp序列側接。在某些實施例中，額外46 bp序列位於5' ITR內部。在某些實施例中，46 bp序列由SEQ ID NO: 71中所闡述之序列組成。在某些實施例中，5' ITR包含與SEQ ID NO: 71至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 72或73中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，5' ITR之核苷酸序列由與SEQ ID NO: 72或73至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些實施例中，5' ITR之核苷酸序列由SEQ ID NO: 72或73中所闡述之核苷酸序列組成。
在某些實施例中，3' ITR由衍生自野生型AAV2基因體序列之額外核苷酸序列側接。在某些實施例中，3' ITR由衍生自與野生型AAV2 ITR相鄰之野生型AAV2序列的額外37 bp序列側接。參見例如 Savy 等人 , Human Gene Therapy Methods (2017) 28(5): 277-289 （其以全文引用之方式併入本文中）。 在某些實施例中，額外37 bp序列位於3' ITR內部。在某些實施例中，37 bp序列由SEQ ID NO: 56中所闡述之序列組成。在某些實施例中，3' ITR包含與SEQ ID NO: 28、57或74至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，3' ITR包含SEQ ID NO: 28、57或74中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，3' ITR之核苷酸序列由與SEQ ID NO: 28、57或74至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列組成。在某些實施例中，3' ITR之核苷酸序列由SEQ ID NO: 28、57或74中所闡述之核苷酸序列組成。
在某些實施例中，rAAV基因體自5'至3'包含：5' ITR；內部元件，其自5'至3'包含：TRE、視情況選用之非編碼外顯子及內含子、內含子插入IDS編碼序列及聚腺苷酸化序列，如本文所揭示；不可解析的ITR；與內部元件互補之核苷酸序列；及3' ITR。此類rAAV基因體可在感染之後及複製之前形成AAV的自互補雙股DNA基因體。
在某些實施例中，rAAV基因體自5'至3'包含：5' ITR、TRE、內含子插入IDS編碼序列、聚腺苷酸化序列及3' ITR。在某些實施例中，5' ITR與SEQ ID: 18、20、49或73具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；TRE與SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、35、36、39、40、41、42、44、46、47、48及/或55中之任一者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；內含子插入IDS編碼序列與SEQ ID: 25、27、59或60具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；聚腺苷酸化序列與SEQ ID NO: 34、35或45中之任一者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及/或3' ITR與SEQ ID: 14、19、21、28、51、57或74具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在某些實施例中，5' ITR包含選自由以下組成之群的核苷酸序列或由其組成：SEQ ID: 18、20、49或73；TRE包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、35、36、39、40、41、42、44、46、47、48及/或55；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID: 25、27、59或60中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO: 34、35或45；及/或3' ITR包含選自由以下組成之群的核苷酸序列或由其組成：SEQ ID: 14、19、21、28、51、57或74。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 18或49中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 25、27、59或60中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 14或51中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 49中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 25中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 51中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 49中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 25中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 14中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 49中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 27中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 14中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 18中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 25中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 14中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 18中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 27中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 14中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 18中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 27中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 19中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 49中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 59中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 14中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 49中所闡述之序列或由其組成；TRE包含SEQ ID NO: 29中所闡述之序列；內含子插入IDS編碼序列包含SEQ ID NO: 60中所闡述之序列；聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 45中所闡述之序列；及/或3' ITR包含SEQ ID NO: 14中所闡述之序列或由其組成。
在某些實施例中，rAAV基因體包含與SEQ ID NO: 38、50、53、58、62、64、66、70、76或78至少90%（例如 至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%）一致的序列。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 38、50、53、58、62、64、66、70、76或78中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 38、50、53、58、62、64、66、70、76或78中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 38中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 38中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 50中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 50中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 53中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 53中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 58中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 58中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 62中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 62中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 64中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 64中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 66中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 66中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 70中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 70中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 76中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 76中所闡述之核苷酸序列組成。在某些實施例中，rAAV基因體包含SEQ ID NO: 78中所闡述之核苷酸序列。在某些實施例中，rAAV基因體之核苷酸序列由SEQ ID NO: 78中所闡述之核苷酸序列組成。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 51之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 51之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 51之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 19之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 19之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 19之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 59之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 59之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 59之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 60之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 60之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 60之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，rAAV包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及包含SEQ ID NO: 25、27、29、37、38、43、50、52、53、54、58、60、61、62、63、64、65、66、69、70、75、76、77或78中之任一者中所闡述之核苷酸序列的rAAV基因體；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及包含SEQ ID NO: 25、27、29、37、38、43、50、52、53、54、58、60、61、62、63、64、65、66、69、70、75、76、77或78中之任一者中所闡述之核苷酸序列的rAAV基因體；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及包含SEQ ID NO: 25、27、29、37、38、43、50、52、53、54、58、60、61、62、63、64、65、66、69、70、75、76、77或78中之任一者中所闡述之核苷酸序列的rAAV基因體。
在另一態樣中，本文提供包含與SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核酸序列的多核苷酸。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸之核酸序列由SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核酸序列組成。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸之核酸序列由SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核酸序列組成。
本文亦提供包含與SEQ ID NO: 25、27、59或60中所闡述之核酸序列至少80%（例如 至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）一致之核酸序列的多核苷酸。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 25、27、59或60中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸之核酸序列由SEQ ID NO: 25、27、59或60中所闡述之核酸序列組成。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 25中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸之核酸序列由SEQ ID NO: 25中所闡述之核酸序列組成。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 27中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸之核酸序列由SEQ ID NO: 27中所闡述之核酸序列組成。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 59中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸之核酸序列由SEQ ID NO: 59中所闡述之核酸序列組成。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 60中所闡述之核酸序列。在某些實施例中，多核苷酸之核酸序列由SEQ ID NO: 60中所闡述之核酸序列組成。
多核苷酸可包含DNA、RNA、經修飾DNA、經修飾RNA或其組合。在某些實施例中，多核苷酸包含在載體，例如 病毒載體或質體內。本文亦提供包含多核苷酸或載體之重組細胞。
在另一態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含如本文所揭示之AAV以及醫藥學上可接受之賦形劑、佐劑、稀釋劑、媒劑或載劑或其組合。「醫藥學上可接受之載劑」包括當與組成物之活性成分組合時允許該成分保留生物活性且不引起破壞性生理反應（諸如不希望的免疫反應）的任何物質。醫藥學上可接受之載劑包括水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、乳液（諸如油/水乳液）及潤濕劑。包含此類載劑之組成物係藉由諸如以下中所闡述的熟知習知方法來調配：Remington's Pharmaceutical Sciences, 當前版本, Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA；A. Gennaro (2000) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel等人, 第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe等人, 第3版 Amer. Pharmaceutical Assoc。III. 使用方法
在另一態樣中，本發明提供用於在細胞中表現IDS多肽之方法。該等方法一般包含用如本文所揭示之rAAV轉導細胞。此類方法在恢復IDS表現方面高效。因此，在某些實施例中，本文所揭示之方法涉及用如本文所揭示之rAAV轉導細胞。
本文所揭示之方法可應用於具有IDS基因中之突變的任何細胞。熟練工作人員將瞭解，需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的細胞尤其受關注。因此，在某些實施例中，該等方法應用於失去內源性I2S活性的任何細胞。
在某些實施例中，該方法應用於神經元及/或神經膠細胞。在某些實施例中，尤其受關注的為需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的神經元及/或神經膠細胞。在某些實施例中，該方法應用於中樞神經系統（CNS）的細胞及/或周邊神經系統（PNS）的細胞。在某些實施例中，尤其受關注的為需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的中樞神經系統及/或周邊神經系統的細胞。在某些實施例中，尤其受關注的為前腦、中腦、後腦、脊髓及其任何組合中的細胞。在某些實施例中，尤其受關注的為選自由以下組成之群的中樞神經系統區域之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、丘腦、海馬體、海馬體、殼核、小腦（例如 小腦核）及其任何組合。在某些實施例中，尤其受關注的為腦中之腦橋及髓質、脊髓之上升束及其任何組合的細胞。在某些實施例中，尤其受關注的為選自由以下組成之群的中樞神經系統（CNS）區域之需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、丘腦、海馬體、殼核、小腦（例如 小腦核）及其任何組合。在某些實施例中，尤其受關注的為中樞神經系統（CNS）中之運動神經元及星狀細胞譜、CNS中之寡樹突神經膠細胞（上升纖維）、CNS中之大腦皮質的細胞群及周邊神經系統之感覺神經元（PNS）。在某些實施例中，尤其受關注的為寡樹突神經膠細胞，諸如脊髓背束中之細胞。在某些實施例中，尤其受關注的為中樞神經系統中的神經膠譜，包括但不限於星狀細胞、寡樹突神經膠細胞、許旺氏細胞及其任何組合。在某些實施例中，尤其受關注的為運動神經元、星狀細胞、寡樹突神經膠細胞、中樞神經系統中之大腦皮質的細胞、周邊神經系統之感覺神經元、周邊神經系統之神經膠細胞（例如 許旺氏細胞）及其任何組合。
在某些實施例中，該方法應用於肝臟細胞（例如肝細胞）。在某些實施例中，尤其受關注的為需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的肝臟細胞。在某些實施例中，該方法應用於心臟細胞（例如心肌細胞）。在某些實施例中，尤其受關注的為需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的心臟細胞。在某些實施例中，該方法應用於肺細胞（例如呼吸道上皮細胞）。在某些實施例中，尤其受關注的為需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的肺細胞。在某些實施例中，該方法應用於腎臟細胞（例如腎上皮細胞）。在某些實施例中，尤其受關注的為需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的腎臟細胞。在某些實施例中，該方法應用於脾臟細胞（例如脾細胞）。在某些實施例中，尤其受關注的為需要活性內源性IDS（例如內源性I2S活性）的脾臟細胞。
本文所揭示之方法可試管內 進行用於研究目的或可活體外 或活體內 進行用於治療目的。
在某些實施例中，待轉導之細胞在哺乳動物個體中且AAV以可有效轉導個體中之細胞之量向個體投與。因此，在某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有與IDS基因突變相關之疾病或病症之個體的方法，該方法一般包含向個體投與有效量的如本文所揭示之rAAV。個體可為具有IDS突變之人類個體、非人類靈長類動物個體（例如 食蟹獼猴）或嚙齒動物個體（例如 小鼠）。與IDS基因突變相關之任何疾病或病症可使用本文所揭示之方法治療。適合的疾病或病症包括但不限於韓特氏症候群。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 51之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 51之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 51之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、野生型人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 25之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 19之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 19之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 18之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 27之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 19之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 59之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 59之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 59之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 60之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 60之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及自5'至3'包含以下遺傳元件之rAAV基因體：5' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 49之5' ITR）、轉錄調控元件（例如 包含SEQ ID NO: 29之序列的TRE）、經緘默改變之人類內含子插入IDS編碼序列（例如 SEQ ID NO: 60之內含子插入hIDS編碼序列）、SV40聚腺苷酸化序列（例如 SEQ ID NO: 45之SV40聚腺苷酸化序列）及3' ITR元件（例如 SEQ ID NO: 14之3' ITR）。
在某些實施例中，前述方法使用rAAV，其包含：（a）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸203-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及包含SEQ ID NO: 25、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、69或70中之任一者中所闡述之核苷酸序列的rAAV基因體；（b）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸138-736之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及包含SEQ ID NO: 25、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、69或70中之任一者中所闡述之核苷酸序列的rAAV基因體；及/或（c）包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的AAV衣殼蛋白，及包含SEQ ID NO: 25、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、69或70中之任一者中所闡述之核苷酸序列的rAAV基因體。
本文所揭示之方法尤其有利，因為其可在活體內 以及試管內 高效地在細胞中表現IDS蛋白。在某些實施例中，IDS蛋白之表現水準為在不具有IDS基因之突變的相同類型細胞中內源性IDS蛋白表現水準的至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約0.6%、至少約0.7%、至少約0.8%、至少約0.9%、至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%、至少約100%或其任何中間百分比。在某些實施例中，IDS蛋白之表現水準比不具有IDS基因之突變的相同類型細胞中內源性IDS蛋白之表現水準高至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。可使用測定IDS蛋白表現水準的任何方法，包括但不限於ELISA、西方墨點法、免疫染色及質譜。
在某些實施例中，用本文所揭示之AAV組成物轉導細胞可如本文所提供或藉由一般熟習此項技術者已知之任何轉導方法進行。在某些實施例中，可細胞與AAV在以下感染複數（multiplicity of infection；MOI）下接觸：50,000；100,000；150,000；200,000；250,000；300,000；350,000；400,000；450,000；或500,000，或提供細胞之最佳轉導的任何MOI。
本文所揭示之AAV組成物可藉由任何適當途徑，包括但不限於靜脈內、鞘內、腹膜內、皮下、肌肉內、鼻內、局部或皮內途徑向個體投與。在某些實施例中，組成物經調配以用於經由靜脈內注射或皮下注射投與。IV.       AAV 封裝系統
在另一態樣中，本發明提供用於重組製備本文所揭示之重組腺相關病毒（rAAV）的封裝系統。此類封裝系統一般包含：編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸；編碼如本文所揭示之AAV中之任一者之衣殼蛋白的第二核苷酸；及包含如本文所揭示之rAAV基因體中之任一者的第三核苷酸序列，其中封裝系統在細胞中可操作以便將rAAV基因體包裹於衣殼中以形成AAV。
在某些實施例中，封裝系統包含有包含編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列及編碼AAV衣殼蛋白之第二核苷酸序列的第一載體，及包含有包含rAAV基因體之第三核苷酸序列的第二載體。如於如本文所描述之封裝系統之情形下使用，「載體」係指一種核酸分子，其為用於將核酸引入細胞中之媒劑（例如 質體、病毒、黏質體、人工染色體等）。
任何AAV Rep蛋白均可在本文所揭示之封裝系統中使用。在封裝系統之某些實施例中，Rep核苷酸序列編碼AAV2 Rep蛋白。適合的AAV2 Rep蛋白包括但不限於Rep 78/68或Rep 68/52。在封裝系統之某些實施例中，編碼AAV2 Rep蛋白之核苷酸序列包含編碼與SEQ ID NO: 22之AAV2 Rep胺基酸序列具有最小序列一致性百分比之蛋白質的核苷酸序列，其中跨AAV2 Rep蛋白之胺基酸序列長度的最小序列一致性百分比為至少70%（例如 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%）。在封裝系統之某些實施例中，AAV2 Rep蛋白具有SEQ ID NO: 22中所闡述之胺基酸序列。
在封裝系統之某些實施例中，封裝系統進一步包含第四核苷酸序列，其包含一或多種輔助病毒基因。在封裝系統之某些實施例中，封裝系統進一步包含第三載體，例如 輔助病毒載體，其包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。第三載體可為獨立第三載體、與第一載體整合在一起或與第二載體整合在一起。
在封裝系統之某些實施例中，輔助病毒選自由以下組成之群：腺病毒、疱疹病毒（包括單純疱疹病毒（HSV））、痘病毒（諸如牛痘病毒）、巨細胞病毒（CMV）及桿狀病毒。在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因體包含一或多種選自由以下組成之群的腺病毒RNA基因：El、E2、E4及VA。在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為HSV，HSV基因體包含選自由以下組成之群的HSV基因中之一或多者：UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及UL30/UL42。
在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種質體內。在某些實施例中，第一載體及第三載體含於第一質體內。在某些實施例中，第二載體及第三載體含於第二質體內。
在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種重組輔助病毒內。在某些實施例中，第一載體及第三載體含於重組輔助病毒內。在某些實施例中，第二載體及第三載體含於重組輔助病毒內。
在另一態樣中，本發明提供一種用於重組製備如本文所描述之AAV的方法，其中該方法含在可操作以將rAAV基因體包裹於衣殼中以形成如本文所描述之rAAV的條件下，用如本文所描述之封裝系統轉染或轉導細胞。用於重組製備rAAV之例示性方法包括短暫轉染（例如 用一或多種轉染質體，其含有如本文所描述之第一、第二及視情況選用之第三載體）、病毒感染（例如 用一或多種重組輔助病毒，諸如腺病毒、痘病毒（諸如牛痘病毒）、疱疹病毒（包括HSV、巨細胞病毒或桿狀病毒，其含有如本文所描述之第一、第二及視情況選用之第三載體）及穩定的生產細胞株轉染或感染（例如 用穩定生產細胞，諸如哺乳動物或昆蟲細胞，其含有如本文所描述之編碼一或多種AAV Rep蛋白之Rep核苷酸序列及/或編碼一或多種AAV衣殼蛋白之Cap核苷酸序列，且其中如本文所描述之rAAV基因體以質體或重組輔助病毒形式遞送）。
因此，本發明提供一種用於製備重組AAV（rAAV）之封裝系統，其中該封裝系統包含編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列；編碼本文所描述之AAV中之任一者之衣殼蛋白的第二核苷酸序列；包含本文所描述之AAV中之任一者之rAAV基因體序列的第三核苷酸序列；及視情況選用之包含一或多種輔助病毒基因的第四核苷酸序列。V. 實例
本文所揭示之重組AAV載體在試管內 及活體內 介導高效基因轉移。以下實例證明使用如本文所揭示之基於AAV之載體有效恢復IDS基因（其在某些人類疾病，諸如韓特氏症候群中突變）之表現。提供此等實例作為說明，而非作為限制。
在以下實例5、6及11中，2.2e13 vg/kg、6.5e13 vg/kg及1.1e14 vs/kg劑量之AAV相對於載體基因體中之人類IDS基因滴定。當使用載體基因體中之SV40 polyA序列滴定時，AAV之等效劑量為2e13 vg/kg、6e13 vg/kg及1e14 vg/kg。在以下實例9、10及12中，1.8e14 vg/kg劑量之AAV相對於載體基因體中之人類IDS基因滴定。當相對於載體基因體中之SV40 polyA序列滴定時，AAV之等效劑量為1e14 vg/kg。實例 1 ：人類 IDS 轉移載體
此實例提供用於在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS（hIDS）之人類IDS轉移載體pHM-05205、pHM-05213、pHM-05214、pHM-05216及pHM-05217。a ） pHM-05205
如圖1A所示，IDS轉移載體pHM-05205自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；野生型人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。b ） pHM-05213
如圖1B所示，IDS轉移載體pHM-05213自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；野生型人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。c ） pHM-05214
如圖1C所示，IDS轉移載體pHM-05214自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；經緘默改變之人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。d ） pHM-05216
如圖1D所示，IDS轉移載體pHM-05216自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；野生型人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。e ） pHM-05217
如圖1E所示，IDS轉移載體pHM-05217自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；經緘默改變之人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表1中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。表 1 ：人類 IDS 轉移載體 pHM-05210 、 pHM-05213 、 pHM-05214 、 pHM-05216 及 pHM-05217 中的遺傳元件
遺傳元件 pHM-05205 pHM-05213 pHM-05214 pHM-05216 pHM-05217
SEQ ID NO:
5' ITR元件 49 49 49 18 18
轉錄調控元件 29 29 29 29 29
人類IDS編碼序列 25 25 27 25 27
SV40聚腺苷酸化序列 45 45 45 45 45
3' ITR元件 14 14 14 14 19
rAAV基因體（自啟動子至polyA序列） 75 37 43 52 54
rAAV基因體（自5' ITR至3' ITR） 76 38 50 53 58
本文所揭示之載體可封裝於AAV衣殼，例如 AAV分枝系F衣殼，諸如但不限於AAVHSC5、AAVHSC7、AAVHSC15或AAVHSC17衣殼中。經封裝之病毒粒子可向野生型動物或IDS缺乏動物投與。實例 2 ：第 II 型黏多醣病（ MPS ）（韓特氏症候群）小鼠模型中之 IDS 基因轉移
韓特氏症候群為一種罕見的X性聯遺傳病症，主要為影響男性的疾病。此疾病由溶酶體酶艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）中之基因缺陷引起。IDS為醣胺聚醣（GAG）、硫酸乙醯肝素（HS）及硫酸皮膚素（DS）逐步降解所必需。IDS主要在中樞神經系統中表現。
為了活體內 研究IDS基因轉移的影響，使用MPS II小鼠模型。MPS II小鼠模型B6J.Cg-Idstm1Muen /HMI為Ids 剔除（Ids KO）小鼠，其包含鼠類Ids 基因之外顯子4及外顯子5之部分中的缺失，消除基因表現。參見Garcia等人 (2007) J. Inherit. Metab. Dis. 30(6): 924-934。Ids KO小鼠缺乏I2S活性且展現提高的組織及器官GAG水準，以及尿液GAG排泄。Ids KO小鼠之組織中LAMP1表現提高。Ids KO小鼠展現進行性骨骼畸形，諸如趾變粗及踝關節腫脹。
在此實例中，使用野生型及Ids KO半合子（Ids KO hemi）雄性7-9週齡。向小鼠靜脈內投與2e13個載體基因體/公斤體重（vg/kg）之單次劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205或封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205。在給藥後4週處死小鼠。
發現載體基因體及hI2S活性在Ids KO hemi小鼠之腦及肝臟組織中偵測到。圖2顯示在野生型、Ids KO hemi雄性或投與如所指示之rAAV的Ids KO hemi雄性之肝臟中偵測到的載體基因體（圖2A）及I2S活性（圖2B）。相比於WT，*指示p＜0.05的統計顯著性；***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。圖3顯示在野生型、Ids KO hemi雄性或投與如所指示之rAAV的Ids KO hemi雄性之腦中偵測到的載體基因體（圖3A）及hI2S活性（圖3B）。發現與腦相比，肝臟中之載體基因體之量以及hI2S活性較高。在腦中，發現載體基因體水準在吻尾軸（rostro-caudal axis）上相似，且相比於投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠，在投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠中似乎較高。
圖4顯示相比於投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠，投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠之肝臟及腦中的hI2S活性。發現相比於投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠，對於投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠，在肝臟中偵測到的hI2S活性水準均為超生理的（圖4A顯示呈肝臟中野生型I2S活性水準百分比形式的I2S活性；圖4B顯示呈肝臟中正常人類I2S活性百分比形式的I2S活性）。亦發現相比於投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠，投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠展現顯著較高hI2S活性。在腦中，發現投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠相比於投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠，hI2S活性水準分別為野生型小鼠之約40%及約45%，及成人水準之約75%及約82%（圖5A顯示呈腦中小鼠I2S活性水準百分比形式的I2S活性；圖5B顯示呈腦中正常人類I2S活性百分比形式的I2S活性）。*指示p＜0.05的統計顯著性。
發現相比於未經處理之Ids KO hemi小鼠（經媒劑處理之Ids KO hemi小鼠），投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠及封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠降低腦、肝臟及尿液中之GAG水準。圖6顯示野生型（WT）、Ids KO hemi小鼠（MPS II）、投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（AAV9-hIDS）、投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）及/或代表性人類之肝臟（圖6A）、腦（圖6B）及尿液（圖6C）中的GAG水準。發現投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠及投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO小鼠的肝臟及腦中之GAG水準降低至野生型水準。在尿液中，發現投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠之GAG水準顯著低於野生型小鼠中。*指示p＜0.05之統計顯著性，且**指示p＜0.01之統計顯著性。
圖7顯示在野生型（WT）、Ids KO hemi小鼠（MPS II）、投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（AAV9-hIDS）、投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）及/或代表性人類之肝臟（圖7A）及腦（圖7B）中偵測到之hIDS的mRNA表現。
在給藥後12週的肝臟組織及尿液中，投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠展示表型之耐久性及挽救。圖8A顯示在所指示的時間，尿液樣品中的GAG水準挽救至野生型水準：野生型小鼠（WT）、Ids KO hemi小鼠（MPS II）及投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）。***指示p＜0.001之統計顯著性。圖8B顯示肝臟中之GAG水準挽救至野生型水準：野生型小鼠（WT）、Ids KO hemi小鼠（MPS II）及投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）。****指示p＜0.0001之統計顯著性。圖8C顯示肝臟中之I2S活性提高：野生型小鼠（WT）及投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）。****指示p＜0.0001之統計顯著性。另外，如使用抗LAMP1抗體藉由免疫組織化學所偵測，發現投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠減少肝臟組織中之LAMP1。
在給藥後12週之腦中，投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠顯示表型之耐久性及挽救。圖9A顯示腦GAG水準挽救至野生型濃度：野生型小鼠（WT）、Ids KO hemi小鼠（MPS II）及投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）。*指示p＜0.05的統計顯著性，且**指示p＜0.01的統計顯著性。在野生型小鼠（WT）及投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠之腦中偵測到hI2S活性（圖9B及圖9C）。*指示p＜0.05的統計顯著性。實例 3 ：人類 IDS 轉移載體
此實例提供人類IDS轉移載體T-004、T-005及T-006，用於在其中轉導載體之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS（hIDS）。a ） T-004
如圖10A所示，IDS轉移載體T-004自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；經緘默改變之人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表2中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。b ） T-005
如圖10B所示，IDS轉移載體T-005自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；經緘默改變之人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表2中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。c ） T-006
如圖10C所示，IDS轉移載體T-006自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；經緘默改變之人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表2中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。表 2 ：人類 IDS 轉移載體中的遺傳元件 T-004 、 T-005 及 T-006
遺傳元件 T-004 T-005 T-006
SEQ ID NO:
5' ITR元件 49 49 49
轉錄調控元件 29 29 29
人類IDS編碼序列 59 60 27
SV40聚腺苷酸化序列 45 45 45
3' ITR元件 14 14 14
rAAV基因體（自啟動子至polyA序列） 61 63 65
rAAV基因體（自5' ITR至3' ITR） 62 64 66
本文所揭示之載體可封裝於AAV衣殼，例如 AAV分枝系F衣殼，諸如但不限於AAVHSC5、AAVHSC7、AAVHSC15或AAVHSC17衣殼中。經封裝之病毒粒子可向野生型動物或IDS缺乏動物投與。實例 4 ：第 II 型黏多醣病（ MPS ）（韓特氏症候群）小鼠模型中之 IDS 基因轉移
在此實例中，使用野生型及Ids KO半合子（Ids KO hemi；亦稱為MPS II）雄性小鼠，6-9週齡。向小鼠靜脈內投與2e13 vg/kg之單次劑量的封裝於AAVHSC15衣殼或AAV9衣殼中之pHM-05205、T-004、T-005或T-006。在給藥後4週處死小鼠。
圖11顯示以下小鼠之尿液中偵測到的GAG水準（圖11A）及血清I2S活性（圖11B）：四隻野生型小鼠（WT）；四隻Ids KO hemi小鼠（MPS II）；四隻投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（AAV9-hIDS）；四隻投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）；八隻投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-004的Ids KO hemi小鼠（HSC15-T-004）；四隻投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-005的IDS KO hemi小鼠（HSC15-T-005）；及四隻投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-006的IDS KO hemi小鼠（hIDS-T-006）。如圖11A所示，相比於未經處理之Ids KO hemi小鼠（經媒劑處理之Ids KO hemi小鼠），經處理Ids KO hemi小鼠之尿液中的GAG水準降低。如圖11B所示，在投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-004、T-005或T-006的Ids KO hemi小鼠中可偵測到血清I2S活性。*指示p＜0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。
圖12顯示以下小鼠之腦及肝臟中偵測到的GAG水準（圖12A及圖12B）以及腦及肝臟中的I2S活性（圖12C及圖12D）：野生型小鼠（WT）；Ids KO hemi小鼠（MPS II）；投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（AAV9-hIDS）；投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO hemi小鼠（HSC15-hIDS）；投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-004的Ids KO hemi小鼠（HSC15-T-004）；投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-005的Ids KO hemi小鼠（HSC15-T-005）；及/或投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-006的Ids KO hemi小鼠（hIDS-T-006）。如圖所示，相比於未經處理之Ids KO hemi小鼠（經媒劑處理之Ids KO hemi小鼠），經處理Ids KO hemi小鼠之腦（圖12A）及肝臟（圖12B）中之GAG水準降低。如圖所示，在投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-004、T-005或T-006的Ids KO hemi小鼠中可偵測到腦（圖12C）及肝臟（圖12D）中的I2S活性。*指示p＜0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。實例 5 ：第 II 型黏多醣病（ MPS ）（韓特氏症候群）小鼠模型中之 IDS 基因轉移
在此實例中，使用野生型及Ids KO半合子（Ids KO hemi；亦稱為MPS II）雄性，7-10週齡。向小鼠靜脈內投與包含2.2e13 vg/kg、6.5e13 vg/kg及1.1e14 vg/kg之劑量範圍之封裝於AAVHSC15衣殼中的pHM-05217，每組5隻小鼠。在給藥後4週處死小鼠。在此實例中，未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
為了研究封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的安全性，研究向野生型小鼠投與病毒之影響。當在各劑量上及隨時間推移未觀測到體重下降的證據時，證明對封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的耐受性（圖13A及圖13B）。如圖13A及圖13B所示，經封裝於AAVHSC15中之pHM-05217處理的野生型及Ids KO hemi小鼠均未顯示隨時間推移的體重減少。在圖13A中，第1組：Ids KO hemi小鼠對照；第2組：以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的Ids KO hemi小鼠；第3組：以6.5e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的Ids KO hemi小鼠；第4組：以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的Ids KO hemi小鼠；及第5組：野生型小鼠。在圖13B中，第5組：野生型小鼠；第6組以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的野生型小鼠；及第7組：以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的野生型小鼠。
發現在投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217後，野生型小鼠中之I2S活性為劑量依賴性的。在血清中，在給藥後兩週（圖14A）及四週（圖14B），以如所指示之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的野生型小鼠展現I2S活性的劑量依賴性提高。未經處理之野生型（WT）小鼠及Ids KO半合子（MPS II）小鼠用作對照。在肝臟中，在給藥後四週（圖14C），以如所指示之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的野生型小鼠展現I2S活性的劑量依賴性提高。此證明在野生型小鼠中可偵測到人類I2S活性，且在野生型小鼠中提高I2S活性超出正常水準不影響體重。
投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的野生型小鼠中之GAG水準與野生型未經處理之小鼠類似，且未發現其進一步降低至野生型水準以下。在腦（圖15A）及肝臟（圖15B）中，發現經處理之Ids KO hemi小鼠的GAG水準與野生型未經處理之小鼠（對照）相當。***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。
發現在投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217後，腦及肝臟中之表現為劑量依賴性的。圖16A顯示以所指示之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之Ids KO hemi小鼠的腦表現，展現隨劑量增加之表現增加。圖16B顯示以所指示之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之Ids KO hemi小鼠的肝臟表現，展現隨劑量增加之表現增加。一般而言，發現肝臟的經緘默改變之IDS表現量高於腦。*指示p＜0.05的統計顯著性，且***指示p＜0.001的統計顯著性。
為了研究封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的功效，研究向Ids KO hemi小鼠投與病毒的影響。投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的Ids KO hemi小鼠的血清I2S活性在兩週時偵測到（圖17A），且在給藥後四週保持一致（圖17B）。在四週時，發現直至6.5e13 vg/kg之劑量，血清I2S活性為劑量依賴性的。**指示p＜0.01的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。
封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217亦顯示肝臟中之劑量依賴性I2S活性。圖18顯示投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217之Ids KO hemi小鼠的肝臟I2S活性。**指示p＜0.01的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。
在給藥後兩週（圖19A）及四週（圖19B），發現投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO hemi小鼠之尿液中的GAG水準藉由所有劑量降低至野生型水準。在給藥後四週，發現投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠之尿液中的GAG硫酸肝素（GAG-HS）（圖19C）及GAG硫酸皮膚素（GAG-DS）（圖19D）水準降低至野生型水準。GAG水準藉由質譜確定，且相對於各尿液樣品中之肌酸酐水準標準化。使用二因子變異數分析（ANOVA）進行統計分析：ns指示無統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。
在給藥後四週，發現投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之Ids KO hemi小鼠的肝臟（圖20A）、心臟（圖20B）、肺（圖20C）、腦（圖20D）、腎臟（圖20E）及脾臟（圖20F）中之GAG水準藉由所有劑量降低至野生型水準。*指示p＜0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。實例 6 ：第 II 型黏多醣病（ MPS ）（韓特氏症候群）小鼠模型中之 IDS 基因轉移
在另一實例中，在成年野生型及Ids KO半合子小鼠（Ids KO hemi；亦稱為MPS II）中進行4週單次靜脈內劑量範圍發現研究。向小鼠靜脈內投與2.2e13 vg/kg、6.5e13 vg/kg及1.1e14 vg/kg封裝於AAVHSC15衣殼中的pHM-05217，每組4-5隻小鼠。在給藥後4週處死小鼠。在此等實驗中，發現封裝於AAVHSC15中之pHM-05217穿越血腦障壁且轉導腦細胞，引起腦中I2S表現及顯著硫酸乙醯肝素減少及劑量依賴性LAMP1減少。亦發現血清及肝臟I2S活性為劑量依賴的。在所有劑量下，發現在所有測試的周邊組織中，硫酸乙醯肝素水準均降低。基於MPS II或WT經處理動物不具有體重減少，發現至多1.1e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15中的pHM-05217耐受。
發現單次靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217引起載體基因體（圖21A）及關鍵鼠類周邊及中央器官中hIDS轉錄本（圖21B）之水準的劑量依賴性提高。圖21B顯示相對於野生型hIDS轉錄本標準化的經緘默改變之hIDS轉錄本的百分比。在所有劑量下在所有器官中，發現硫酸乙醯肝素（圖21C）、硫酸皮膚素（圖21D）及/或總GAG水準降低。在圖21C及21D中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，****指示p＜0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。
在給藥後4週，投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠展現腦中載體基因體水準（圖22A）、相對於人類野生型hIDS轉錄本標準化的經緘默改變之hIDS轉錄本百分比（圖22B）及I2S活性（圖22C）的劑量依賴性提高。在給藥後四週，發現投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠之腦中的硫酸乙醯肝素水準藉由所有劑量降低（圖22D）。如圖22A-22D中所展現，封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217穿越血腦障壁，轉導腦組織，表現經緘默改變之hIDS，引起腦中可偵測之I2S活性，且減少腦組織特異性GAG。在圖22A-22D中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且ns指示不顯著。
為了進一步評定投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217對腦病理之影響，藉由免疫組織化學（IHC）分析小腦（圖23A）、脊髓（圖23B）及海馬體（圖23C）之溶酶體相關膜蛋白1（LAMP1）。LAMP1之存在為溶酶體負擔的證據。使用兔多株抗LAMP1抗體（Abcam，ab24170）進行藉由免疫組織化學（IHC）進行的LAMP1偵測。簡言之，將福馬林固定之石蠟包埋（FFPE）樣品以4 µm或6 µm切片且安裝在帶電載玻片上。使用自動染色器處理並加工載玻片，且將其用抗LAMP1初級抗體染色30分鐘（0.25 µg/ml），且用抗兔標記聚合物-HRP染色30分鐘。拍攝染色切片之影像且分析像素平均灰度值，從而允許對各切片中之LAMP1表現進行半定量報告。如圖23A-23C所示，封裝於AAVHSC15中之pHM-05217穿越血腦障壁，且在經處理之MPS II小鼠之CNS中引起LAMP1減少的劑量依賴性趨勢。在圖23A-23C中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，****指示p≤0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。
亦在包括肝臟、脾臟、心臟、腎臟及肺之關鍵器官中藉由IHC分析LAMP1表現。以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠之定性分析展現，與未經處理之MPS II小鼠（投與媒劑之MPS II小鼠）相比，經處理之MPS II小鼠之肝臟、脾臟、心臟、腎臟及肺中的LAMP1表現降低。
在給藥後四週，投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠顯示血清（圖24）及肝臟（圖25）中I2S活性的劑量依賴性提高。在圖24及圖25中，**指示p≤0.01的統計顯著性，****指示p＜0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。實例 7 ：野生型及經緘默改變之 hIDS 轉移載體之間的比較
此實例提供人類IDS轉移載體pHM-05205，用於在其中轉導載體之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS（hIDS）。此實例提供hIDS轉移載體T-006及pHM-05205之功效之間的比較。T-006描述於實例3中，且pHM-05205描述於下文中。 pHM-05205
如圖26A所示，IDS轉移載體pHM-05205自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；野生型人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表3中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。表 3 ：人類 IDS 轉移載體 pHM-05205 中的遺傳元件
遺傳元件 pHM-05205
SEQ ID NO:
5' ITR元件 49
轉錄調控元件 29
人類IDS編碼序列 25
SV40聚腺苷酸化序列 45
3' ITR元件 14
rAAV基因體（自啟動子至polyA序列） 75
rAAV基因體（自5' ITR至3' ITR） 76
為了測試包含野生型hIDS編碼序列之hIDS轉移載體（pHM-05205）及包含經緘默改變之hIDS編碼序列之hIDS轉移載體（T-006）的功效，將T-006及pHM-05205各自封裝於AAVHSC15中且以6e13 vg/kg之劑量向MPS II小鼠投與。在給藥後4週處死小鼠，且量測血清（圖26B）及肝臟（圖26C）中的I2S活性，以及相對於鼠類G蛋白路徑抑制子1（GPS1）表現標準化之hIDS轉錄本的相對表現（圖26D）。如圖26B及26C所示，在經處理之MPS II小鼠中，與投與野生型hIDS轉移載體（HM-05205；「SC WT」）相比，投與經緘默改變之hIDS轉移載體（T-006；「SC SA」）分別在血清及肝臟中引起顯著較高I2S活性。圖26D顯示在經處理之MPS II小鼠中，與投與野生型hIDS轉移載體相比，投與經緘默改變之hIDS轉移載體引起腦組織中顯著較高的hIDS轉錄本之相對表現。經媒劑處理之MPS II小鼠用作對照。在圖26B-26D中，****指示p≤0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。實例 8 ：單股與自互補 hIDS 轉移載體之間的比較
此實例提供人類IDS轉移載體pHM-05211，用於在其中轉導載體之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS（hIDS）。此實例提供hIDS轉移載體pHM-05205與pHM-05211之間的比較。pHM-05205描述於實例7中，且pHM-05211描述於下文中。 pHM-05211
如圖27A所示，IDS轉移載體pHM-05211自5'至3'包含以下遺傳元件：5' ITR元件；包含CMV啟動子之轉錄調控元件；野生型人類IDS內含子插入編碼序列；SV40聚腺苷酸化序列；及3' ITR元件。此等元件之序列闡述於表4中。此載體能夠在其中轉導載體之細胞（例如 人類細胞或小鼠細胞）中表現人類IDS蛋白。表 4 ：人類 IDS 轉移載體 pHM-05211 中的遺傳元件
遺傳元件 pHM-05211
SEQ ID NO:
5' ITR元件 18
轉錄調控元件 29
人類IDS編碼序列 25
SV40聚腺苷酸化序列 45
3' ITR元件 14
rAAV基因體（自啟動子至polyA序列） 77
rAAV基因體（自5' ITR至3' ITR） 78
進行單股hIDS轉移載體（pHM-05211；「SS WT」）與自互補hIDS轉移載體（pHM-05205；「SC WT」）之間的比較。圖27B展示在以2e13 vg/kg之劑量投與各自封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05211或pHM-05205的MPS II小鼠中偵測到之血清hI2S活性水準。如所指示，在給藥後6或8週量測血清hI2S活性。在單股與自互補hIDS轉移載體誘導血清hI2S活性的能力之間未發現顯著差異。圖27C顯示經單股或自互補轉移載體處理之MPS II小鼠中相對於鼠類G蛋白路徑抑制子1（GPS1）表現標準化之hIDS轉錄本的相對表現。如所指示，在給藥後2或8週處死小鼠，且在各組中在經單股或自互補轉移載體處理的小鼠之間未偵測到hIDS轉錄本之相對表現之間的差異。ns指示不顯著。
分析超離心沈降速度（AUC）為一種用於根據沈降係數定量巨分子的分析方法。對於rAAV樣品的分析，AUC可用於確定含DNA（完整及部分完整衣殼）及空衣殼的相對百分比。確定單股及自互補轉移載體之AUC概況。與自互補轉移載體之AUC概況相比，單股轉移載體之AUC概況展現具有較高百分比完整衣殼之概況。自互補轉移載體（pHM-05205）引起31.7%完全封裝之衣殼，且單股轉移載體（pHM-05211）引起85.0%完全封裝之衣殼。實例 9 ：第 II 型黏多醣病（ MPS ）（韓特氏症候群）小鼠模型中之 hIDS 基因轉移
此實例描述成年野生型及Ids KO半合子小鼠（Ids KO hemi；亦稱為MPS II小鼠）中之52週單次靜脈內劑量時程、耐久性及功效研究。向小鼠靜脈內投與1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中的pHM-05217，每組3-5隻小鼠。
與對照媒劑處理之MPS II小鼠相比，發現向MPS II小鼠靜脈內投與單次1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217引起顯著血清I2S活性（圖28A）。直至給藥後52週可偵測到血清I2S活性。
在給藥後52週，載體基因體及表現得到維持。直至給藥後52週，在經轉移載體處理之MPS II小鼠之腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟及肺組織中偵測到載體基因體（圖28B）及hIDS轉錄本（圖28C）水準。經1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217給藥後52週，與經媒劑處理之MPS II小鼠相比，腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟及肺組織中醣胺聚醣硫酸乙醯肝素（GAG-HS）水準降低（圖28D）。
在腦中，在給藥後52週觀測到LAMP-1染色減少，如在脊髓中（圖28E）及海馬體（圖28F）中藉由IHC分析。在海馬體中，與經媒劑處理之MPS II小鼠相比，LAMP-1染色在經轉移載體處理之MPS II小鼠中顯著減少。在圖28E及28F中，*指示p≤0.05的統計顯著性，且ns指示不顯著。
為了評定血-神經障壁（BNB）的穿越及周邊神經系統（PNS）的轉導，自動物收集三叉神經節。相比於經媒劑處理之MPS II小鼠及野生型小鼠，在給藥後39週，在投與1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠中偵測到載體基因體（圖28G）。如圖28G所示，發現封裝於AAVHSC15中之pHM-05217穿越BNB且轉導PNS的細胞。
在投與1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠中偵測到肝臟及腦組織特異性I2S酶活性。在給藥後12、24、39及52週偵測到肝臟特異性I2S酶活性（圖28H），且在給藥後12週（圖28I）、24週（圖28J）、39週（圖28K）及52週（圖28L）偵測到腦特異性I2S酶活性。在圖28J-28L中，正常成人腦組織用作額外對照。
相比於經媒劑處理之MPS II小鼠，發現在投與1.8e14 vg/kg之封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠尿液中偵測到之GAG-HS水準降低，直至給藥後至少52週（圖28M）。尿液GAG-HS水準藉由質譜確定，且相對於各尿液樣品中之肌酸酐水準標準化。在圖28M中，資料呈現為各劑量組之平均水準（n=每組3-5隻小鼠）。
MPS II小鼠之特徵在於小腦中普金斯細胞神經元之進行性退化。投與1.8e14 vg/kg之封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠在給藥後52週對普金斯細胞層（PCL）細胞線性密度進行定量。在用蘇木精及伊紅（H&E）共染色的矢狀腦切片上進行普金斯細胞線性密度定量。收集小腦的影像，且對沿普金斯細胞層（PCL）之400 µm長區域之普金斯細胞體總數進行手動計數。每個切片隨機取樣三個PCL區域（每隻動物n= 1個切片）。發現與經媒劑處理之MPS II小鼠相比，在投與1.8e14 vg/kg之封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠改善普金斯細胞退化（圖28N）。在圖28N中，**指示p＜0.01的統計顯著性，如藉由以單因子變異數分析（ANOVA）檢定計算。
MPS II小鼠之特徵在於骨骼畸形，包括與野生型動物相比，顴骨弓增厚、趾變粗及後爪增大。使用測徑尺在動物去皮顱骨上評定顴骨弓基部形態量測結果。發現與經媒劑處理之MPS II小鼠相比，投與1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠的顴骨弓厚度減小（圖28O）。在圖28O中，***指示p＜0.01的統計顯著性，且ns指示不顯著。
在給藥後52週，與未經處理之MPS II小鼠（投與媒劑之MPS II小鼠）相比，經1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15中之pHM-05217處理的MPS II小鼠顯示後爪及踝增大減少。踝及爪量測使用數位卡尺在經麻醉之小鼠上進行，且根據圖29A中所提供之示意圖。如圖29B及29C所示，與經媒劑處理之MPS II對照小鼠相比，隨時間推移，經轉移載體處理之MPS II小鼠展現爪增粗改善，如藉由爪寬度（圖29B）及深度（圖29C）兩者所量測。如圖29D及29E所示，與經媒劑處理之MPS II對照小鼠相比，隨時間推移，經轉移載體處理之MPS II小鼠展現踝關節腫脹改善，如藉由踝寬度（圖29D）及深度（圖29E）兩者所量測。實例 10 ：第 II 型黏多醣病（ MPS ）（韓特氏症候群）小鼠模型中之 IDS 基因轉移
此實例描述成年野生型及Ids KO半合子小鼠（Ids KO hemi；亦稱為MPS II）中之8週單次靜脈內劑量生物動力學研究。向小鼠靜脈內投與1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中的pHM-05217，每組4-5隻小鼠。
發現向MPS II小鼠投與單次1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217產生顯著血清I2S活性，與對照媒劑處理之MPS II小鼠相比可早在給藥後一天量測（圖30A）。在所有測試時間點，在腦、心臟、肝臟及脾臟組織中偵測到靜脈內投與單次1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠中的載體基因體（圖30B）及表現（圖30C）水準。在給藥後8週，在靜脈內投與單次1.8e14 vg/kg劑量之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的MPS II小鼠中偵測到肝臟組織（圖30D）及腦組織（圖30E）特異性I2S活性。在用1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217給藥後8天（圖31A）、2週（圖31B）及8週（圖31C）時間點，與經媒劑處理之MPS II小鼠相比，發現腦、心臟、肝臟及脾臟組織中之醣胺聚醣硫酸乙醯肝素（GAG-HS）水準降低。發現相比於經媒劑處理之MPS II小鼠，在投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠尿液中偵測到的GAG-HS水準在給藥後3天內自基線降低，且長達至少8週（圖31D）。在圖30A-31D中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，***指示p≤0.001的統計顯著性，且ns指示無統計顯著性。實例 11 ：第 II 型黏多醣病（ MPS ）（韓特氏症候群）小鼠模型中之 IDS 基因轉移
小鼠腦脊髓液（CSF）中的醣胺聚醣硫酸乙醯肝素（GAG-HS）水準係藉由使用高效液層析質譜量測肝素酶消化後CSF樣品中的硫酸乙醯肝素特異性雙醣而確定。給藥後12週，在以下小鼠之CSF中量測GAG-HS水準：野生型（WT）小鼠、經媒劑處理之MPS II小鼠及以6e13 vg/kg（MPS II 6E+13）、1e14 vg/kg（MPS II 1E+14）或2e14 vg/kg（MPS II 2E+14）之劑量靜脈內投與之封裝於AAVHSC15衣殼中的pHM-05217處理之MPS II小鼠，如圖32A中所指示。與經媒劑治療之MPS II小鼠相比，在所有測試劑量下觀測到CSF GAG-HS水準之降低。在圖32A中，各組具有自總共五隻小鼠彙集的三個CSF樣品。使用單因子變異數分析（ANOVA）進行統計分析。*指示p＜0.05的統計顯著性，且**指示p＜0.01的統計顯著性。給藥後12週，以下小鼠之腦組織中的GAG-HS水準：野生型（WT）小鼠、經媒劑處理之MPS II小鼠及以6e13 vg/kg（MPS II 6E+13）、1e14 vg/kg（MPS II 1E+14）或2e14 vg/kg（MPS II 2E+14）之劑量靜脈內投與之封裝於AAVHSC15衣殼中的pHM-05217處理之MPS II小鼠，如圖32B中所指示。如圖32B所示，與經媒劑處理之未經處理MPS II小鼠相比，在所有測試劑量下觀測到腦GAG-HS水準之降低。使用單因子變異數分析（ANOVA）進行統計分析。****指示p＜0.0001的統計顯著性。
給藥後12週，在以下小鼠之腦組織中偵測I2S水準：野生型（WT）小鼠、MPS II小鼠及以6e13 vg/kg（MPS II 6E+13）、1e14 vg/kg（MPS II 1E+14）或2e14 vg/kg（MPS II 2E+14）之劑量靜脈內投與之封裝於AAVHSC15衣殼中的pHM-05217處理之MPS II小鼠，如圖32C中所指示。正常成人腦組織用作額外對照。使用單因子變異數分析（ANOVA）檢定進行統計分析。*指示p＜0.05的統計顯著性，且***指示p＜0.001的統計顯著性。實例 12 ： IDS 基因轉移交叉校正
為了研究由AAV基因轉移載體表現之I2S的交叉校正能力，向MPS II小鼠靜脈內投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217，且分析血清。
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶在轉譯後經修飾。初始73-78 kDa IDS蛋白經由添加甘露糖6-磷酸（M6P）部分轉化成90 kDa磷酸化前驅物。接著，90 kDa前驅物經由蛋白水解裂解經由各種中間物加工為主要55 kDa中間物，伴隨18 kDa多肽釋放。藉由硫醇蛋白酶進行進一步蛋白水解裂解產生45 kDa成熟形式，其含有雜合及複雜型寡醣鏈。
簡言之，培養IDS KO HeLa細胞，且將其與給藥後8天自經1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217處理的MPS II小鼠獲得之小鼠血清一起培育。在存在或不存在M6P之情況下將細胞與經處理之小鼠血清一起培育48小時。使用山羊抗hIDS初級抗體探測，且使用驢抗山羊抗二級抗體偵測之西方墨點法證實以下：（1）由封裝於AAVHSC15中之pHM-05217製造的hIDS蛋白以90 kDa前驅物形式在經處理之MPS II小鼠的血清中循環；（2）90 kDa形式具有催化活性；及（3）90 kDa形式由IDS KO HeLa細胞經由M6P依賴性路徑吸收，且在IDS KO HeLa細胞之溶酶體中加工成中間55 kDa及成熟45 kDa蛋白。
將IDS KO HeLa細胞與自經處理之MPS II小鼠獲得之小鼠血清一起培育之後，離心細胞且移除上清液。接著使沈澱細胞溶解且分析hI2S活性。圖33顯示在IDS KO細胞（對照）、在無M6P之情況下與經處理之MPS II小鼠血清一起培育之IDS KO細胞及與處理之MPS II小鼠血清以及M6P一起培育之IDS KO細胞中偵測到的I2S活性水準。如圖33所示，在用投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217後8天獲自MPS II小鼠之血清處理的IDS KO HeLa細胞溶解產物中，可偵測到I2S活性。發現當M6P存在時I2S活性較低，表明在不受任何理論束縛之情況下，M6P競爭M6P受體，且因此hI2S吸收由M6P受體路徑試管內 介導。*指示p＜0.05的統計顯著性，且***指示p＜0.001的統計顯著性。 *    *      *
本發明之範疇不受本文所描述之特定實施例限制。實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此類修改意欲屬於所附申請專利範圍之範疇內。
本文中所引用之所有參考文獻（例如 公開案或專利或專利申請案）均以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻（例如 公開案或專利或專利申請案）具體地且個別地指示為出於所有目的而以全文引用之方式併入一般。其他實施例在以下申請專利範圍內。
無
圖 1A 、 1B 、 1C 、 1D 及 1E 分別為pHM-05205、pHM-05213、pHM-05214、pHM-05216及pHM-05217載體的載體圖譜。
圖 2A 及 2B. 圖 2A 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中每ng經轉導細胞之DNA的載體基因體數目的圖。圖 2B 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中以nmol/hr/mg蛋白質表示的I2S活性的圖。在圖2A及2B中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；AAV9-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠。在圖2B中，人類肝臟係指正常人類肝臟中的代表性I2S活性水準。相比於WT，*指示p＜0.05的統計顯著性；***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 3A 及 3B. 圖 3A 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠腦（前腦、中腦及後腦）中每ng經轉導細胞之DNA的載體基因體數目的圖。圖 3B 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠前腦中以nmol/hr/mg蛋白質表示的I2S活性的圖。在圖3A及3B中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；AAV9-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠。在圖3B中，人腦係指正常成人腦中的代表性I2S活性水準。n.s指示不顯著。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 4A 及 4B. 圖 4A 為顯示在Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到的I2S活性水準的圖，該等小鼠以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205（AAV9-hIDS），或以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205（HSC15-hIDS），活性水準以給藥後四週，小鼠肝臟中代表性野生型I2S活性水準之百分比表示。圖 4B 為顯示在Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到的I2S活性水準的圖，該等小鼠以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205（AAV9-hIDS），或以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205（HSC15-hIDS），活性水準以給藥後四週，肝臟中代表性正常人類I2S活性水準之百分比表示。在圖4A及4B中，*指示p＜0.05的統計顯著性。
圖 5A 及 5B. 圖 5A 為顯示在Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到的I2S活性水準的圖，該等小鼠以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205（AAV9-hIDS），或以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205（HSC15-hIDS），活性水準以給藥後四週，小鼠腦中代表性野生型I2S活性水準之百分比表示。圖 5B 為顯示在Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到的I2S活性水準的圖，該等小鼠以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205（AAV9-hIDS），或以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205（HSC15-hIDS），活性水準以給藥後四週，腦中代表性正常人類I2S活性水準之百分比表示。
圖 6A 、 6B 及 6C. 圖 6A 為顯示給藥後四週，在野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到之GAG水準的圖。圖 6B 為顯示給藥後四週，在野生型及Ids KO半合子小鼠腦中偵測到之GAG水準的圖。圖 6C 為顯示給藥後四週，在野生型及Ids KO半合子小鼠尿液中偵測到之GAG水準的圖。在圖6A、6B及6C中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；AAV9-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠。在圖6A中，人類肝臟係指人類肝臟中之代表性GAG水準。在圖6B中，人腦係指人腦中之代表性GAG水準。在圖6A-6C中，*指示p＜0.05的統計顯著性，且**指示p＜0.01的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 7A 及 7B. 圖 7A 為顯示給藥後四週，相對於小鼠GAPDH之表現水準標準化的野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中之hIDS表現的圖。圖 7B 為顯示給藥後四週，相對於小鼠GAPDH之表現水準標準化的野生型及Ids KO半合子小鼠腦中之hIDS表現的圖。在圖7A及7B中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；AAV9-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠。在圖7B中，人腦係指在成人正常人腦中的代表性IDS表現水準。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 8A 、 8B 及 8C. 圖 8A 為顯示隨時間推移在野生型及Ids KO半合子小鼠尿液中偵測到之總GAG水準的圖。圖 8B 為顯示給藥後十二週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到之GAG水準的圖。圖 8C 為顯示給藥後十二週時，野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中以nmol/hr/mg蛋白質表示之I2S活性的圖。在圖8A、8B及8C中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠。在圖8A-8C中，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 9A 、 9B 及 9C. 圖 9A 為顯示給藥後十二週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠腦中偵測到之GAG水準的圖。圖 9B 為顯示給藥後十二週時，野生型及Ids KO半合子小鼠腦中以nmol/hr/mg蛋白質表示之I2S活性的圖。在圖9A及9B中，*指示p＜0.05的統計顯著性，且**指示p＜0.01的統計顯著性。圖 9C 為顯示給藥後十二週時，以代表性野生型小鼠I2S活性之百分比表示的野生型及Ids KO半合子小鼠腦中I2S活性的圖。在圖9A、9B及9C中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 10A 、 10B 及 10C 分別為T-004、T-005及T-006載體的載體圖譜。
圖 11A 及 11B. 圖 11A 為顯示給藥後四週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠尿液中偵測到之總GAG水準的圖。圖 11B 為顯示給藥後四週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠中偵測到之以nmol/hr/mg表示之血清I2S活性的圖。在圖11A及11B中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；AAV9-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；HSC15-T-004係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-004的Ids KO半合子小鼠；HSC15-T-005係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-005的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-T-006係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-006的Ids KO半合子小鼠。在圖11A及11B中，*指示p＜0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 12A 、 12B 、 12C 及 12D. 圖 12A 為顯示給藥後四週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠腦中偵測到之GAG水準的圖。圖 12B 為顯示給藥後四週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到之GAG水準的圖。圖 12C 為顯示給藥後四週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠腦中偵測到之I2S活性的圖。圖 12D 為顯示給藥後四週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到之I2S活性的圖。在圖12A、12B、12C及12D中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；AAV9-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAV9衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；HSC15-hIDS係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205的Ids KO半合子小鼠；HSC15-T-004係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-004的Ids KO半合子小鼠；HSC15-T-005係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-005的Ids KO半合子小鼠；且HSC15-T-006係指以2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之T-006的Ids KO半合子小鼠。在圖12A、12B及12D中，*指示p＜0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 13A 及 13B 為顯示直至給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠之體重的圖。在圖13A及13B中，第1組：未經處理的Ids KO半合子對照；第2組：以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；第3組：以6.5e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；第4組：以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；第5組：野生型小鼠對照；第6組：以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的野生型小鼠；及第7組：以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217的野生型小鼠。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 14A 、 14B 及 14C 為顯示投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的野生型小鼠中之劑量依賴性I2S活性的圖。圖 14A 為顯示給藥後兩週，在野生型及Ids KO半合子小鼠中偵測到的以nmol/hr/ml為單位的血清I2S活性的圖。圖 14B 為顯示給藥後四週，在野生型及Ids KO半合子小鼠中偵測到的以nmol/hr/ml為單位的血清I2S活性的圖。圖 14C 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中以nmol/hr/mg為單位的I2S活性的圖。在圖14A、14B及14C中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；WT - 2.2E+13係指以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的野生型小鼠；且WT - 1.1E+14係指以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的野生型小鼠。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 15A 及 15B. 圖 15A 為顯示給藥後四週，野生型及半合子小鼠腦中之總GAG水準的圖。圖 15B 為顯示給藥後四週，野生型及半合子小鼠肝臟中之總GAG水準的圖。在圖15A及15B中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；WT - 2.2E+13係指以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的野生型小鼠；且WT - 1.1E+14係指以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的野生型小鼠。在圖15A及15B中，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 16A 及 16B. 圖 16A 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠腦中之IDS表現水準的圖。圖 16B 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中之IDS表現水準的圖。在圖16A及16B中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 2.2E+13係指以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 6.5E+13係指以6.5e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；且MPS II - 1.1E+14係指以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠。在圖16A及16B中，*指示p＜0.05的統計顯著性，且***指示p＜0.001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 17A 及 17B. 圖 17A 為顯示給藥後兩週時，在野生型及Ids KO半合子小鼠中偵測到之血清I2S活性的圖。圖 17B 為顯示給藥後四週時，在野生型Ids KO半合子小鼠中偵測到之血清I2S活性的圖。在圖17A及17B中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 2.2E+13係指以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 6.5E+13係指以6.5e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；且MPS II - 1.1E+14係指以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠。在圖17A及17B中，**指示p＜0.01的統計顯著性，****指示統計顯著性p＜0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 18 為顯示給藥後四週，在野生型及Ids KO半合子小鼠肝臟中偵測到之I2S活性的圖。WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 2.2E+13係指以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 6.5E+13係指以6.5e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；且MPS II - 1.1E+14係指以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠。在圖18中，**指示p＜0.01的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 19A 及 19B 為顯示給藥後兩週（圖19A）及四週（圖19B），在野生型及Ids KO半合子小鼠中偵測到之相對於尿液中之肌酸酐水準標準化的總GAG水準的圖。圖 19C 及 19D 為顯示給藥後四週，野生型小鼠及Ids KO半合子小鼠中GAG硫酸乙醯肝素（GAG-HS；「HS」）（圖19C）及GAG硫酸皮膚素（GAG-DS；「DS」）（圖19D）之水準的圖。WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 2.2E+13係指以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 6.5E+13係指以6.5e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；且MPS II - 1.1E+14係指以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠。在圖19A-19D中，ns指示無統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 20A 、 20B 、 20C 、 20D 、 20E 及 20F 為顯示給藥後四週，野生型及Ids KO半合子小鼠之肝臟（圖20A）、心臟（圖20B）、肺（圖20C）、腦（圖20D）、腎臟（圖20E）及脾臟（圖20F）中偵測到的總GAG水準的圖。在圖20A、20B、20C、20D、20E及20F中，WT係指未經處理的野生型小鼠；MPS II係指未經處理的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 2.2E+13係指以2.2e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；MPS II - 6.5E+13係指以6.5e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠；且MPS II - 1.1E+14係指以1.1e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的Ids KO半合子小鼠。在圖20A-20F，*指示p＜0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，****指示p＜0.0001的統計顯著性。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 21A 、 21B 、 21C 及 21D. 圖 21A 為顯示給藥後四週，以如所指示之各種劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠之腦、心臟、腎臟、肝臟、肺及脾臟組織中每μg經轉導細胞之DNA之載體基因體數目的圖。圖 21B 為顯示給藥後四週，以各種指示劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠之腦、心臟、腎臟、肝臟、肺及脾臟組織中之標準化經緘默改變之hIDS轉錄本的圖。圖 21C 為顯示給藥後四週，在以各種指示劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠之腦、腎臟、心臟、肝臟、肺及脾臟組織中偵測到的硫酸乙醯肝素水準的圖。圖 21D 為顯示給藥後四週，在以各種指示劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠之腎臟、心臟、肝臟及肺組織中偵測到的硫酸皮膚素水準的圖。在圖21C及21D中，投與媒劑之野生型小鼠及MPS II小鼠用作對照。在圖21C及21D中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，****指示p＜0.000的統計顯著性，且ns指示不顯著。
圖 22A 、 22B 、 22C 及 22D 為顯示給藥後四週，在以各種指示劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠之腦組織特異性載體基因體水準（圖22A）、腦組織中標準化經緘默改變之hIDS轉錄本（圖22B）、腦組織hI2S活性（圖22C）及腦組織特異性硫酸乙醯肝素水準（圖22D）。投與媒劑之野生型小鼠及MPS II小鼠用作對照。在圖22C及22D中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且ns指示不顯著。
圖 23A 、 23B 及 23C 為顯示給藥後四週，在以各種指示劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠之小腦（圖23A）、脊髓（圖23B）及海馬體（圖23C）中藉由IHC偵測到之LAMP1蛋白之像素強度的圖。投與媒劑之野生型小鼠及MPS II小鼠用作對照。在圖23A-23C中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，****指示p≤0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。
圖 24 為顯示給藥後四週，在以各種指示劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠中量測之血清I2S活性的圖。投與媒劑之野生型小鼠及MPS II小鼠用作對照。在圖24中，**指示p≤0.01的統計顯著性，****指示p＜0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。
圖 25 為顯示給藥後四週，在以各種指示劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠中量測之肝臟組織I2S活性的圖。投與媒劑之野生型小鼠及MPS II小鼠用作對照。圖25中，**指示p≤0.01的統計顯著性，****指示p＜0.0001的統計顯著性。
圖 26A 為pHM-05205載體的載體圖譜。圖 26B 、 26C 及 26D 為顯示給藥後四週，以6e13 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05205（包含野生型hIDS編碼序列）或pHM-05208（包含經緘默改變之hIDS編碼序列）的MPS II小鼠之血清I2S活性（圖26B）、肝臟組織I2S活性（圖26C）及腦中標準化hIDS轉錄本（圖26D）的圖。投與媒劑之野生型小鼠及MPS II（亦稱為「Hemi」）用作對照。在圖26B-26D中，****指示p≤0.0001的統計顯著性，且ns指示不顯著。
圖 27A 為pHM-05211載體的載體圖譜。圖 27B 及 27C. 圖 27B 為顯示在以2e13 vg/kg之劑量投與各自封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205或pHM-05211之MPS II小鼠中偵測到之血清I2S活性水準的圖。如所指示，血清I2S活性在給藥後6或8週量測。投與媒劑之MPS II小鼠用作對照。圖 27C 為顯示以2e13 vg/kg之劑量投與各自封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05205或pHM-05211之MPS II小鼠腦中標準化hIDS轉錄本之水準的圖。如所指示，在給藥後2或8週處死小鼠且量測腦hIDS轉錄本。在圖27B及27C中，ns指示不顯著。
圖 28A-28O 為顯示與以1.8e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之MPS II小鼠相關的各種資料的圖。圖 28A 為顯示直至給藥後52週，經處理之MPS II小鼠中使用螢光酶分析偵測到之血清I2S活性水準的圖。個別小鼠中的最小值、最大值及中值（n=每組3-5隻小鼠）顯示在帶有表示標準差之誤差槓的方框中。圖 28B 為顯示給藥後12、24、39及52週，經處理之MPS II小鼠之腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟及肺組織中每μg經轉導細胞之DNA之載體基因體數目的圖。圖 28C 為顯示給藥後12、24、39及52週，在經處理之MPS II小鼠的腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟及肺組織中偵測到的hIDS轉錄本數目的圖。圖 28D 為顯示給藥後52週，在經處理之MPS II小鼠的腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟及肺組織中偵測到的硫酸乙醯肝素水準的圖。圖 28E 及圖 28F 為顯示給藥後52週，在經處理之MPS II小鼠的脊髓（圖28E）及海馬體（圖28F）中藉由IHC偵測到的LAMP1蛋白之像素強度的圖。圖 28G 為顯示給藥後39週，經處理之MPS II之三叉神經節中每μg經轉導細胞之DNA之載體基因體數目的圖。圖 28H 為顯示給藥後12、24、39及52週，在經處理之MPS II小鼠之肝臟組織中偵測到的I2S活性水準的圖。圖 28I-28L 為顯示給藥後12週（圖28I）、24週（圖28J）、39週（圖28K）及52週（圖28L），在經處理之MPS II小鼠之腦組織中偵測到的I2S活性水準的圖。圖 28M 為顯示直至給藥後52週，投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠尿液中偵測到之GAG-HS水準的圖。圖 28N 為顯示給藥後52週，投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠中普金斯細胞層（Purkinje cell layer）細胞密度之定量的圖。圖 28O 為顯示給藥後52週，經處理之MPS II小鼠之顴骨弓厚度的圖。在圖28B-28D及28E-28M中之各者中，未經處理之MPS II及野生型小鼠用作對照。在圖28J-28L中，正常成人腦組織用作額外對照。在各種情況下，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p≤0.001的統計顯著性，且ns指示不顯著。未經處理之小鼠係指投與媒劑之小鼠。
圖 29A-29E .圖 29A 為顯示踝及爪深度及寬度量測位置的示意圖。圖 29B-29E 為顯示爪寬度（圖29B）、爪深度（圖29C）、踝寬度（圖29D）及踝深度（圖29E）的圖，在給藥後14、20、28、34、37、40、46及52週，在以1.8e14 vg/kg之劑量投與封裝於AAVHSC15中之pHM-05217的MPS II小鼠中量測。在各種情況下，投與媒劑之野生型小鼠及MPS II小鼠用作對照。
圖 30A-30E. 圖 30A 、 30D 及 30E 為顯示直至給藥後8週，在投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之MPS II小鼠血清（圖30A）、肝臟組織（圖30D）及腦組織（圖30F）中偵測到之I2S活性水準的圖。投與媒劑之MPS II小鼠用作對照。在圖30A中，*指示p≤0.05的統計顯著性，**指示p≤0.01的統計顯著性，***指示p≤0.001的統計顯著性，且ns指示不顯著。圖 30B 及 30C 為顯示如所指示，給藥後8天、2週及8週，在投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之MPS II小鼠腦、心臟、肝臟及脾臟組織中偵測到之載體基因體（圖30B）及經緘默改變之hIDS轉錄本（圖30C）水準的圖。
圖 31A 、 31B 及 31C 為顯示如所指示，給藥後8天（圖31A）、2週（圖31B）及8週（圖31C），投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之MPS II小鼠在腦、心臟、肝臟及脾臟組織中偵測到之GAG-HS水準的圖。圖 31D 為顯示在所指示之各種時間點，在投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217之MPS II小鼠尿液中偵測到之GAG-HS水準的圖。在各種情況下，投與媒劑之野生型及MPS II小鼠用作對照。
圖 32A 及 32B 為顯示如所指示，經媒劑處理之野生型（WT）小鼠、經媒劑處理之MPS II小鼠及以6e13 vg/kg（MPS II 6E+13）、1e14 vg/kg（MPS II 1E+14）或2e14 vg/kg（MPS II 2E+14）之劑量靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217處理之MPS II小鼠的腦脊髓液（CSF）（圖32A）或腦組織（圖32B）中藉由HPLC-MS/MS偵測到之GAG-HS水準的圖。圖 32C 為顯示如所指示，經媒劑處理之野生型（WT）小鼠、經媒劑處理之MPS II小鼠及以6e13 vg/kg（MPS II 6E+13）、1e14 vg/kg（MPS II 1E+14）或2e14 vg/kg（MPS II 2E+14）之劑量靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHM-05217處理之MPS II小鼠的腦組織中偵測到之I2S活性水準的圖。正常成人腦組織用作額外對照（「人類WT」）。在圖32A-32C中，*指示p＜0.05的統計顯著性，**指示p＜0.01的統計顯著性，***指示p＜0.001的統計顯著性，且****指示p＜0.0001的統計顯著性。
圖 33 為顯示在存在或不存在甘露糖6-磷酸（M6P）之情況下，在與獲自投與1.8e14 vg/kg封裝於AAVHSC15中之pHM-05217 8天後之MPS II小鼠之血清一起培育之IDS KO HeLa細胞之細胞溶解產物中偵測到之I2S活性水準的圖。在圖33中，*指示p＜0.05的統計顯著性，且***指示p＜0.001的統計顯著性。
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Claims (64)

  1. 一種重組腺相關病毒（rAAV），其包含： （a）     AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白；及 （b）    rAAV基因體，其包含可操作地連接至包含內含子之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）內含子插入編碼序列的轉錄調控元件。
  2. 如請求項1之rAAV，其中該IDS內含子插入編碼序列編碼人類IDS蛋白。
  3. 如請求項1或2之rAAV，其中該IDS內含子插入編碼序列編碼SEQ ID NO: 23中所闡述之胺基酸序列。
  4. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該內含子係異源性內含子。
  5. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該內含子與SEQ ID NO: 33中所闡述之核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
  6. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該內含子位於該IDS內含子插入編碼序列中對應於SEQ ID NO: 24中所闡述之IDS編碼序列之位置708及709的核苷酸之間。
  7. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該IDS內含子插入編碼序列包含與SEQ ID NO: 25、59或60中所闡述之核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列。
  8. 如請求項1至5中任一項之rAAV，其中該內含子位於該IDS內含子插入編碼序列中對應於SEQ ID NO: 26中所闡述之IDS編碼序列之位置580及581的核苷酸之間。
  9. 如請求項8之rAAV，其中該IDS內含子插入編碼序列包含與SEQ ID NO: 27中所闡述之核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列。
  10. 如請求項1至5中任一項之rAAV，其中該IDS內含子插入編碼序列包含SEQ ID NO: 25、27、59或60中所闡述之核苷酸序列。
  11. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該轉錄調控元件包含選自由以下組成之群的元件中之一或多者：巨細胞病毒（CMV）增強子元件、巨細胞病毒（CMV）啟動子、雞β-肌動蛋白（CBA）啟動子、小型雞β-肌動蛋白（SmCBA）啟動子、甘油醛3-磷酸去氫酶（GAPDH）啟動子、β-葡萄糖醛酸苷酶（GUSB）啟動子、經修飾之人類EF-1α啟動子、CALM1啟動子、合成啟動子及其任何組合。
  12. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該轉錄調控元件包含與SEQ ID NO: 29、30、36、39、40、41、42、44、46、47、48或55中所闡述之核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列。
  13. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該轉錄調控元件包含SEQ ID NO: 29中所闡述之核苷酸序列。
  14. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該rAAV基因體進一步包含位於該IDS內含子插入編碼序列3'端之聚腺苷酸化序列。
  15. 如請求項14之rAAV，其中該聚腺苷酸化序列係外源性聚腺苷酸化序列。
  16. 如請求項15之rAAV，其中該外源性聚腺苷酸化序列係SV40聚腺苷酸化序列。
  17. 如請求項16之rAAV，其中該SV40聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 34、35或45中所闡述之核苷酸序列。
  18. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該rAAV基因體包含SEQ ID NO: 37、43、52、54、61、63、65、69、75或77中所闡述之核苷酸序列。
  19. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該rAAV基因體進一步包含5'反向末端重複（5' ITR）核苷酸序列及3'反向末端重複（3' ITR）核苷酸序列。
  20. 如請求項19之rAAV，其中該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18、20或49具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，及/或該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14、19、21或51具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
  21. 如請求項19之rAAV，其中： （a）     該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性； （b）     該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性； （c）     該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 51具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性； （d）     該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 49具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性； （e）     該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 49具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性； （f）     該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 49具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 51具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性；或 （g）     該5' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 20具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且該3' ITR核苷酸序列與SEQ ID NO: 21具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
  22. 如請求項19之rAAV，其中該5' ITR核苷酸序列及該3' ITR核苷酸分別包含SEQ ID NO: 18及14；18及19；18及51；49及14；49及19；49及51；或20及21之序列。
  23. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該rAAV基因體包含SEQ ID NO: 28、38、50、53、56、57、58、62、64、66、70、71、72、73或74中所闡述之核苷酸序列。
  24. 如請求項23之rAAV，其中該rAAV基因體包含SEQ ID NO: 72及74；72及28；73及74；或73及28中所闡述之核苷酸序列。
  25. 如請求項1至18中任一項之rAAV，其中該rAAV基因體自互補。
  26. 如請求項25之rAAV，其中該rAAV基因體包含SEQ ID NO: 38、50、62、64、66、70、76或78中所闡述之核苷酸序列。
  27. 如請求項1至18中任一項之rAAV，其中該rAAV基因體為單股。
  28. 如請求項27之rAAV，其中該rAAV基因體包含SEQ ID NO: 53或58中所闡述之核苷酸序列。
  29. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  30. 如請求項29之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。
  31. 如請求項30之rAAV，其中： （a）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G； （b）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M； （c）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R； （d）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；或 （e）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。
  32. 如請求項29之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸203-736的胺基酸序列。
  33. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  34. 如請求項33之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。
  35. 如請求項34之rAAV，其中： （a）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G； （b）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M； （c）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R； （d）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；或 （e）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。
  36. 如請求項33之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸138-736的胺基酸序列。
  37. 如前述請求項中任一項之rAAV，其中該AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  38. 如請求項37之rAAV，其中：該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2的胺基酸為T；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸68的胺基酸為V；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119的胺基酸為L；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸151的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸160的胺基酸為D；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸206的胺基酸為C；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸590的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G或Y；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K；該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C；或該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G。
  39. 如請求項38之rAAV，其中： （a）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸2的胺基酸為T，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸312的胺基酸為Q； （b）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸65的胺基酸為I，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為Y； （c）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸77的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸690的胺基酸為K； （d）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸119的胺基酸為L，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸468的胺基酸為S； （e）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸626的胺基酸為G，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸718的胺基酸為G； （f）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸296的胺基酸為H，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸464的胺基酸為N，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸681的胺基酸為M； （g）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸687的胺基酸為R； （h）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸346的胺基酸為A，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R；或 （i）該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸501的胺基酸為I，該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸505的胺基酸為R，且該衣殼蛋白中對應於SEQ ID NO: 16之胺基酸706的胺基酸為C。
  40. 如請求項37之rAAV，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17之胺基酸1-736的胺基酸序列。
  41. 一種用於在細胞中表現艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）多肽之方法，該方法包含用如前述請求項中任一項之重組腺相關病毒（rAAV）轉導該細胞。
  42. 如請求項41之方法，其中該細胞係中樞神經系統之細胞。
  43. 如請求項41之方法，其中該細胞係選自由以下組成之群的中樞神經系統區域之細胞：脊髓；運動皮質；感覺皮質；海馬體；殼核；小腦，視情況小腦核；及其任何組合。
  44. 如請求項41之方法，其中該細胞係神經元或神經膠細胞，視情況其中該細胞係中樞神經系統或周邊神經系統之神經元或神經膠細胞。
  45. 如請求項41之方法，其中該細胞係選自由以下組成之群的細胞：運動神經元、星狀細胞、寡樹突神經膠細胞、中樞神經系統中之大腦皮質的細胞、周邊神經系統之感覺神經元、許旺氏細胞及其任何組合。
  46. 如請求項41之方法，其中該細胞係肝臟、心臟、肺、腎臟或脾臟之細胞。
  47. 如請求項41至46中任一項之方法，其中該細胞在哺乳動物個體中且該rAAV以有效轉導該個體中之細胞的量向該個體投與。
  48. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至40中任一項之rAAV。
  49. 一種用於治療患有韓特氏症候群（HS）之個體的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至40中任一項之rAAV或如請求項48之醫藥組成物。
  50. 如請求項49之方法，其中該rAAV或醫藥組成物係經靜脈內投與。
  51. 如請求項49或50之方法，其中韓特氏症候群（HS）與艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）基因突變相關。
  52. 如請求項49至51中任一項之方法，其中該個體係人類個體。
  53. 一種用於製備rAAV之封裝系統，其中該封裝系統包含： （a）第一核苷酸序列，其編碼一或多種AAV Rep蛋白； （b）第二核苷酸序列，其編碼如請求項1至40中任一項之rAAV的衣殼蛋白；及 （c）第三核苷酸序列，其包含如請求項1至40中任一項之rAAV的rAAV基因體序列。
  54. 如請求項53之封裝系統，其中該封裝系統包含有包含該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列之第一載體，及包含該第三核苷酸序列之第二載體。
  55. 如請求項53或54之封裝系統，其進一步包含第四核苷酸序列，該第四核苷酸序列包含一或多種輔助病毒基因。
  56. 如請求項55之封裝系統，其中該第四核苷酸序列包含在第三載體內。
  57. 如請求項55或56之封裝系統，其中該第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群的病毒的基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒及巨細胞病毒（CMV）。
  58. 如請求項53至57中任一項之封裝系統，其中該第一載體、第二載體及/或該第三載體係質體。
  59. 一種用於重組製備rAAV之方法，該方法包含在產生該rAAV之條件下將如請求項53至58中任一項之封裝系統引入至細胞中。
  60. 一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所闡述之核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列，視情況其中該多核苷酸包含在病毒載體或質體載體內。
  61. 一種重組細胞，其包含如請求項60之多核苷酸。
  62. 如請求項1至40中任一項之rAAV、如請求項48之醫藥組成物、如請求項60之多核苷酸或如請求項61之重組細胞，其用作藥劑。
  63. 如請求項1至40中任一項之rAAV、如請求項48之醫藥組成物、如請求項60之多核苷酸或如請求項61之重組細胞，其用於治療韓特氏症候群（HS）。
  64. 如請求項1至40中任一項之rAAV、如請求項48之醫藥組成物、如請求項60之多核苷酸或如請求項61之重組細胞，其用於治療患有韓特氏症候群（HS）之個體的方法，該方法包含向該個體投與有效量之該rAAV、該醫藥組成物、該多核苷酸或該細胞。
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