KR102526744B1 - 박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물 및 이를 이용하여 제조된 항균 필름 - Google Patents

박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물 및 이를 이용하여 제조된 항균 필름 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물 및 이를 이용하여 제조된 항균 필름에 관한 것이다.
본 발명의 코팅 조성물은 살모넬라균에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지를 포함하므로 이를 이용하면 항균 활성을 갖는 코팅을 제조할 수 있으며, 코팅 형성 후에도 박테리오파지가 안정적으로 생존하여 우수한 항균 활성을 지속적으로 유지할 수 있다. 본 발명을 식품 포장용 코팅 또는 필름에 적용하는 경우, 살모넬라균에 의해 식품이 오염되는 것을 효과적으로 방지하여 식품의 안전성 및 저장성을 향상시킬 수 있다.

Description

박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물 및 이를 이용하여 제조된 항균 필름{Coating Composition Comprising Bacteriophage and Antibacterial Film Formed by Using Same}
본 발명은 박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물 및 이를 이용하여 제조된 항균 필름에 관한 것으로, 보다 상세하게는 살모넬라균에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지를 포함하며 박테리오파지의 안정성 및 항균 활성이 우수한 코팅을 제조할 수 있는 코팅 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 제조된 항균 필름에 관한 것이다.
식품은 제조, 유통 및 보관 과정에서 병원균에 의해 오염될 가능성이 높으며, 균에 오염되는 경우 품질이 저하될 뿐만 아니라 섭취 시 식중독을 일으킬 수 있다. 식품의약품안전처의 통계자료에 따르면 2017년부터 2020년까지의 기간 중 살모넬라(Salmonella) 감염으로 인한 식중독 환자 수는 총 식중독 환자의 33.5%에 해당하는 것으로 보고되었는바, 살모넬라균과 같은 병원균에 의한 식품 오염을 방지하는 것이 중요하다.
병원균에 의한 식품 오염을 방지하여 식품의 신선도 및 안전성을 확보하기 위한 일반적인 기술로는 항생제를 이용하여 병원균을 사멸시키는 방법이 있다. 그러나, 항생제의 경우 내성균 출현 문제로 인하여 장기적인 효과를 나타내기 어렵기 때문에 항생제를 대체할 수 있는 항균 소재에 대한 연구가 필요하였다.
항생제의 대안으로서, 천연 추출물 및 식물 정유(essential oil)와 같은 천연 항균 소재를 이용하는 기술이 개발된 바 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허공보 제10-1072883호에서는 겨자 정유를 이용한 항균 코팅 및 포장 소재를 기재하고 있다. 그러나, 천연 소재를 이용하는 경우 안정적인 항균 활성을 확보하기 어렵고 식품의 관능적인 특성 보존에 불리하며, 유익균까지 제거하여 마이크로바이옴(microbiome)의 균형을 무너뜨릴 가능성이 있었다.
상기 항생제, 천연 소재 등 기존의 항균 물질을 대체할 수 있는 물질로서 박테리오파지를 이용하는 기술이 주목받고 있다. 박테리오파지는 세균을 숙주로 하는 바이러스로서 숙주균에 결합하여 사멸을 유도하는 항균성 물질이다. 특히, 박테리오파지는 특정 범주의 균을 사멸시키고 그 이외의 균에는 영향을 주지 않는 특성을 갖는다. 일 예로서, 대한민국 공개특허 제10-2018-0100533호에서는 녹농균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 박테리오파지를 기재하고 있다. 이러한 균 특이적 특성에 따라, 박테리오파지를 이용하면 목적하는 병원균만을 사멸시킬 수 있으므로 유익균까지 사멸되는 문제가 나타나지 않는 장점이 있다.
박테리오파지는 2006년부터 미국식품의약품국(FDA)에 의해 일반적으로 안전하다고 간주되는 물질(generally recognized as safe,　GRAS)로 인정받은 안전한 생물소재로서, 병원균에 의한 식품 오염을 방지하기 위하여 식품첨가물에 적용되고 있다. 그러나, 박테리오파지를 코팅막에 적용하는 경우, 코팅 형성 공정 및 코팅에 사용되는 물질에 의해 코팅 내에서 박테리오파지의 생존율이 저하되므로, 코팅 형태로는 우수한 항균 활성을 발휘할 수 없다는 한계가 있다. 이에 따라 박테리오파지의 이용은 주로 용액상 또는 분말상으로 제한되고 있는바, 코팅 형성 후에도 박테리오파지의 안정성이 확보되고 살모넬라균에 대해 우수한 항균 활성이 유지되도록 조절할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 박테리오파지의 생존율 및 안정성이 우수한 항균 필름을 제조할 수 있는 코팅 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 코팅 조성물을 이용하여 제조된 항균 필름을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 속 균에 대해 특이적으로 사멸능을 갖는 박테리오파지를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지, 고분자 화합물 및 가소제를 포함하는 코팅 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 살모넬라 속 균은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 살모넬라 속 균은 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(S. Typhimurium), 살모넬라 파라티피(S. Paratyphi), 살모넬라 살라매(S. Salamae), 살모넬라 디아리조내(S. Diarizonae) 및 살모넬라 더블린(S. Dublin)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형(serotype)을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 박테리오파지는 시포비리대 과(Siphoviridae)에 속할 수 있다.
본 발명에서, 상기 박테리오파지는 살모넬라 속 균(Salmonella sp.)에 대해 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC14929BP의 박테리오파지일 수 있다.
본 발명에서, 상기 고분자 화합물은 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리부틸렌숙시네이트(polybutylene succinate, PBS), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutylene terephthalate, PBT), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride, PVC), 폴리아미드(polyamide, PA) 및 폴리우레탄(polyurethane, PU)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 고분자 화합물은 생분해성 고분자(biodegradable polymer)를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 가소제는 소르비톨(sorbitol), 글리세롤(glycerol), 트레할로즈(trehalose), 프럭토즈(fructose), 수크로즈(sucrose), 만니톨(mannitol), 프로필렌글리콜(propylene glycol) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 가소제는 고분자 화합물 중량을 기준으로 10 내지 30중량% 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 코팅 조성물은 용매를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 코팅 조성물 전체 부피를 기준으로, 상기 박테리오파지는 1 x 108 내지 1 x 1012 PFU/mL 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 코팅 조성물 전체 부피를 기준으로, 상기 고분자 화합물은 5 내지 20g/100mL 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 코팅 조성물 전체 부피를 기준으로, 상기 가소제는 1 내지 5g/100mL 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 코팅 조성물을 이용하여 제조된 항균 필름을 제공한다.
본 발명에서, 상기 항균 필름은 기판에 상기 코팅 조성물을 코팅한 후 20 내지 30℃의 온도에서 10 내지 20시간 동안 건조시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항균 필름은 코팅 대상체에 상기 코팅 조성물을 코팅한 후 20 내지 30℃의 온도에서 10 내지 180분 동안 건조시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항균 필름은 식품 포장용 코팅일 수 있다.
본 발명은 또한, 살모넬라 속 균(Salmonella sp.)에 대해 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC14929BP의 박테리오파지를 제공한다.
본 발명의 코팅 조성물은 살모넬라균에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지를 포함하여 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 코팅 형성 후에도 박테리오파지가 안정적으로 생존하여 우수한 항균 활성을 지속적으로 유지할 수 있다. 이에 따라, 본 발명을 식품 포장용 코팅 또는 필름에 적용하는 경우, 살모넬라균에 의해 식품이 오염되는 것을 효과적으로 방지하여 식품의 안전성 및 저장성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 박테리오파지 PBSE191의 투과전자현미경(TEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 PBSE191의 살모넬라균 성장 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 PBSE191의 흡착능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 PBSE191의 1단계 성장 곡선(one-step growth curve)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 PBSE191에 대해 -18 내지 80℃ 범위에서 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 PBSE191에 대해 pH 1 내지 9 범위에서 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 PBSE191의 수용체 분석을 위한 점적 검사 실험 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 규명한 박테리오파지 PBSE191의 유전체 지도를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 규명한 박테리오파지 PBSE191의 계통수를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 박테리오파지 PBSE191 함유 필름을 박테리오파지 미함유 필름과 비교하여 나타낸 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 박테리오파지 PBSE191 함유 필름에서 가소제의 종류 및 함량에 따른 박테리오파지의 생존율을 비교한 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 박테리오파지 PBSE191 함유 필름에서 박테리오파지의 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 박테리오파지 PBSE191 함유 필름에서 박테리오파지의 항균 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 박테리오파지 PBSE191 함유 코팅에서 코팅 전후의 항균 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구체적인 구현 형태에 대해서 보다 상세히 설명한다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 박테리오파지, 이를 포함하는 코팅 조성물 및 이를 이용하여 제조된 항균 필름에 관한 것이다.
본 발명의 코팅 조성물은 박테리오파지를 포함하여 항균 활성을 나타낼 수 있고, 이를 이용하여 코팅 또는 필름을 형성한 후에도 박테리오파지가 안정적으로 생존하여 지속적인 항균 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에서는 식품 병원균인 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균에 대한 사멸능이 우수하고 열 및 pH에 대해 안정성이 높은 박테리오파지를 이용함으로써, 식품 코팅이나 포장재로 유용하게 적용 가능한 항균 필름을 제공할 수 있다.
박테리오파지(bacteriophage)는 세균을 숙주로 하는 바이러스로서 "파지(phage)"로 약칭될 수 있다. 박테리오파지는 용균성 생활사(lytic cycle) 및/또는 용원성 생활사(lysogenic cycle)에 의해 숙주균을 사멸시킨다. 예를 들어 용균성 생활사에 따르면, 박테리오파지는 균을 감염시킨 후 균 세포 내부에서 증식하고, 증식 후 숙주균의 세포벽을 파괴하면서 방출되어 균을 사멸시킬 수 있다. 한 종류의 박테리오파지는 특정 범주의 숙주균에 대해서만 사멸능을 가지므로, 사멸 대상이 되는 균의 종류에 따라 박테리오파지를 선택하거나 신규한 박테리오파지를 발굴하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 박테리오파지는 대표적인 식품 병원균인 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균에 대해 사멸능을 가질 수 있다. 이에 따라, 상기 박테리오파지를 식품 포장재에 적용하는 경우 살모넬라균을 사멸시키고 번식을 억제하는 항균 활성을 나타내어, 식품이 살모넬라균에 의해 오염되는 것을 방지할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 사용되는 박테리오파지는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)에 특이적으로 사멸능을 가질 수 있으며, 그 중에서도 특히, 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(S. Typhimurium), 살모넬라 파라티피(S. Paratyphi), 살모넬라 살라매(S. Salamae), 살모넬라 디아리조내(S. Diarizonae) 및 살모넬라 더블린(S. Dublin)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형(serotype)에 대해 사멸능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 박테리오파지는 박테리오파지 PBSE191(이하, "파지 PBSE191"이라 함)일 수 있다. 상기 파지 PBSE191은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 기탁번호 KCTC14929BP(기탁일자: 2022년 3월 31일)로 기탁되어 있다.
상기 파지 PBSE191은 시포비리대(Siphoviridae) 과에 속하는 것으로, 본 발명의 실시예에서는 파지 PBSE191이 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균, 특히 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)에 특이적으로 항균 활성을 나타내고, 열안정성 및 pH 안정성이 우수하여 다양한 온도 및 pH 조건에서 적용이 가능함을 확인하였다. 이에 따라, 파지 PBSE191을 식품 포장재에 적용하면, 식품 병원균인 살모넬라균에 대해 우수한 사멸능을 나타내어 식품의 안전성 및 저장성을 향상시킬 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물, 보다 구체적으로는 박테리오파지를 포함하는 식품 포장용 항균 코팅 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 코팅 조성물을 이용하면 코팅 형성 후에도 박테리오파지의 생존율 및 안정성이 높아, 항균 활성이 우수한 필름을 제조할 수 있다.
본 발명의 코팅 조성물은 박테리오파지, 고분자 화합물 및 가소제를 포함할 수 있다.
상기 코팅 조성물에서 박테리오파지는 상술한 바와 같이 균에 대해 사멸능을 나타내므로, 이를 이용하여 항균 활성을 갖는 필름을 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 고분자 화합물은 코팅의 매트릭스가 되는 것으로, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리부틸렌숙시네이트(polybutylene succinate, PBS), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutylene terephthalate, PBT), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride, PVC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리우레탄(polyurethane, PU) 등일 수 있다. 그 중에서도, 폴리비닐알코올, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리부틸렌숙시네이트 등과 같은 생분해성 고분자(biodegradable polymer)를 이용할 수 있다. 특히, 폴리비닐알코올의 경우 인체에 무해하며 생분해가 가능하고 필름형성능 및 산소차단성이 우수하므로, 친환경 식품 포장재 제조에 바람직하게 이용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 폴리비닐알코올로는 중량평균분자량(Mw)이 5,000 내지 50,000, 구체적으로 10,000 내지 30,000, 예를 들어 13,000 내지 23,000인 것을 사용할 수 있으며, 검화도가 80 내지 95%, 바람직하게 82 내지 92%, 예를 들어 87 내지 89%인 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 가소제는 고분자 화합물에 배합되어 필름의 물성을 조절하는 첨가제로서, 소르비톨(sorbitol), 글리세롤(glycerol), 트레할로즈(trehalose), 프럭토즈(fructose), 수크로즈(sucrose), 만니톨(mannitol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 소르비톨을 포함할 수 있다. 소르비톨을 이용하는 경우, 다른 가소제들에 비해 필름 형성 후에도 박테리오파지의 생존율이 높아 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있고, 장기간 안정성이 확보되어 지속적으로 항균 활성을 유지할 수 있다.
본 발명에서, 상기 가소제는 고분자 화합물의 중량을 기준으로 10 내지 30중량%, 바람직하게는 15 내지 25중량%, 더 바람직하게는 18 내지 22중량% 포함될 수 있다. 상기 함량 범위에서 코팅 형성 후에도 박테리오파지가 안정적으로 생존하여 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 가소제의 함량이 너무 낮아지거나 높아지면 코팅 형성 과정 또는 코팅 형성 후에 사멸되는 박테리오파지의 양이 많아져 코팅의 항균 활성이 저하될 수 있다. 또한, 가소제의 함량이 너무 낮으면 코팅의 기계적 물성 및 산소차단성이 떨어질 수 있고, 가소제의 함량이 너무 높은 경우에도 코팅의 강도 저하 및 변색의 우려가 있으며, 용해도 및 투습성이 너무 높아져 식품 포장재로 이용하기에 부적합할 수 있다.
일반적인 고분자 코팅의 경우 목적하는 코팅의 물성을 바탕으로 가소제의 종류 및 함량을 결정하였으나, 본 발명에서는 박테리오파지를 코팅에 도입하는 경우 가소제의 종류 및 함량이 박테리오파지의 생존율 및 안정성에 기여함을 밝혔으며, 박테리오파지의 활성 및 안정성을 극대화할 수 있는 최적의 조성을 발견하였다는 점에서 우수한 기술적 의의를 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 박테리오파지를 포함하는 코팅 조성물에서 고분자 화합물로 폴리비닐알코올을 이용할 수 있으며, 가소제로 소르비톨을 이용할 수 있다. 이 경우, 코팅 형성 후 박테리오파지의 생존율, 장기간 안정성 및 항균 활성 측면에서 최적의 활성을 나타낼 수 있다.
박테리오파지의 생존율 및 안정성 측면에서, 상기 고분자 화합물의 함량은 본 발명의 코팅 조성물 전체 부피를 기준으로 5 내지 20g/100mL, 바람직하게 8 내지 15g/100mL일 수 있으며, 상기 가소제의 함량은 1 내지 5g/100mL, 바람직하게는 1.5 내지 2.5g/100mL일 수 있다. 이 때, 상기 박테리오파지는 용균반 형성단위(plaque forming unit, PFU) 기준 1 x 108 내지 1 x 1012 PFU/mL, 예를 들어 1 x 109 내지 1 x 1010 PFU/mL로 포함될 수 있고, 구체적으로 2 x 109 내지 8 x 109 PFU/mL로 포함될 수 있다.
본 발명의 코팅 조성물은 필요에 따라 습윤제, 보존제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 코팅을 위해 용매를 첨가하여 용액 형태로 이용할 수 있으며, 이 때 조성물의 부피는 용액 전체의 부피를 기준으로 할 수 있다. 상기 용매로는 물 또는 유기용매를 이용할 수 있으며, 고분자 화합물의 종류에 따라 적절한 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리비닐알코올을 이용하는 경우 물을 용매로 하여 코팅 용액을 제조할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 또한, 상기 코팅 조성물을 이용하여 형성된 항균 필름을 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항균 필름은 상기 코팅 조성물, 즉 박테리오파지, 고분자 화합물 및 가소제를 포함하는 코팅 조성물을 이용하여 제조될 수 있다. 이 때, 코팅 조성물은 코팅성을 위해 용매를 포함하는 용액 형태로 이용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 필름은 계란과 같은 식품 또는 식품 용기와 같은 코팅 대상체에 직접 코팅된 형태의 필름 및 단독 필름 형태를 모두 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
구체적으로, 상기 항균 필름은 고분자 화합물 및 가소제를 포함하는 용액에 박테리오파지를 첨가한 후, 대상체 또는 기판에 용액을 코팅한 후 건조시킴으로써 형성될 수 있다. 이 때 상기 용액은 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 항균 필름이 식품 또는 식품 용기에 직접 형성되는 경우 대상체에 용액을 분사하거나 대상체를 용액에 침지시키는 방법으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 대상체에 상기 코팅 조성물을 코팅한 후 20 내지 30℃의 온도에서 10 내지 180분 동안 건조시킴으로써 필름을 형성할 수 있다.
또는, 항균 필름이 단독 필름 형태로 제조되는 경우, 캐스팅(casting) 등의 방법으로 용액을 기판에 코팅하는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 30 내지 70RH%의 상대습도 조건 하에 기판에 상기 코팅 조성물을 코팅한 후 20 내지 30℃의 온도에서 10 내지 20시간 동안 건조시킴으로써 필름을 형성할 수 있다.
본 발명을 이용하면 박테리오파지가 필름 형태에서도 안정적으로 생존하여 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명을 식품 포장재에 적용하는 경우 병원균으로부터 식품이 오염되는 것을 효과적으로 방지하여, 식품의 안전성 및 저장성을 향상시킬 수 있다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 구성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실험 방법
실험에서, 숙주균으로는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella　Enteritidis) ATCC 13076를 이용하였으며, 배양배지로는 LB broth (MB-L4488; MB cell, Seoul, Korea), 0.5% (w/v) LB molten agar 및 1.5% (w/v) LB agar 배지(MB-L4487, MB cell)를 이용하였다.
파지 역가(phage titer)는 0.5% (w/v) LB molten agar 및 1.5% (w/v) LB agar를 각각 상부층 및 하부층으로 하는 이중층 한천 플레이트(double-layer agar plate)를 이용하여 측정하였다.
제조예 1: 박테리오파지의 정제, 증식 및 스톡 제조
생활하수 시료로부터 박테리오파지(이하, "파지"라 함)를 얻고 이중층 한천 검사법(double-layer agar assay) 및 용균반 검사법(plaque assay)을 통해 정제하였다. 하나의 용균반을 인산완충식염수(PBS)에 재부유(resuspend)시킨 후 15,000 x g로 1분 동안 4℃에서 원심분리하고, 기공 크기가 0.22㎛인 멸균 WhatmanTM PVDF 멤브레인 필터로 여과하였다. 상기 여과 공정을 5회 반복하였다.
분리된 파지를 증식시키기 위해, S. Enteritidis ATCC 13076를 숙주로 하여 파지를 LB broth에서 배양하였다. 구체적으로, S. Enteritidis ATCC 13076를 1% subinoculation한 다음 37℃에서 1.5시간 동안 배양시켰다. 그 후, 37℃에서 4시간 동안 호기성 조건에서 파지를 배양시켰다. 샘플을 15,000 x g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 기공 크기가 0.45㎛인 멸균 WhatmanTM PVDF 멤브레인 필터로 상층액을 여과하였다. 상기 단계를 세가지 부피 조건(배양균 3, 50 및 300mL)에 대해 연속적으로 수행하여 충분한 양의 파지 용해물(lysate)을 수득하였다.
더 높은 역가의 파지 스톡(stock)을 수득하기 위하여, 정제된 파지 용해물을 30,000 x g로 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 이에 대해, 이중층 한천 검사법을 이용하여 파지 농도(PFU/mL)를 측정하였다. 정제된 파지를 증폭시켜 1010 PFU/mL 이상의 역가를 갖는 용해물을 수득하고 사용시까지 4℃에서 보관하였으며, 장기간 보관 시 -80℃에서 35% 글리세롤에 보관하였다.
상기 방법에 따라 분리 정제된 파지를 "파지 PBSE191"이라 명명하였으며, 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 기탁하고 2022년 3월 31일자로 기탁번호 KCTC14929BP를 부여받았다.
실험예 1: 파지의 투과전자현미경(TEM) 분석
파지 PBSE191에 대해, 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 모폴로지를 분석하였다.
포름바르/카본(formvar/carbon) 코팅된 200메쉬의 copper grid를 방전가공장치(electrical discharge machine, US/91000, USA)로 전처리하였다. 상기 copper grid에 파지를 로딩한 후, 2%(v/v)의 우라닐 아세테이트(uranyl acetate, pH 4.5)로 네거티브 염색하였다. 상기 샘플을 에너지 여과형 Libra 120 투과전자현미경(energy-filtering Libra 120 transmission electron microscope, Carl Zeiss, Germany)으로 분석하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 TEM 이미지를 참조하면, 파지 PBSE191은 20면체의 머리와 수축성이 없는 유연성 꼬리를 갖는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 파지의 머리는 입경이 58.84 ± 1.78 nm (n=13)인 이십면체 형상이며, 꼬리의 길이는 115.06 ± 5.64 nm (n=13)이고, 너비는 10.13 ± 0.91 nm (n=13)였다.
파지 PBSE191의 파지는 구조 측면에서 파지 LPST94, BSPM4 및 CGG3-1과 유사하였으나, 상기 파지들에 비해 꼬리가 짧았다. 상기 결과로부터, 파지 PBSE191이 카우도비랄레스(Caudovirales) 목의 시포비리대(Siphoviridae) 과에 속함을 알 수 있었다.
실험예 2: 파지를 이용한 세균 시험 분석(bacterial challenge assay)
S. Enteritidis ATCC13076 및 파지 PBSE191을 이용하여 bacterial challenge assay를 수행하였다.
계대배양한 S. Enteritidis를 37℃에서 1.5시간 동안 호기성 조건 하에 배양시켰다. 그 후, 배양물에 각각 다중감염도(multiplicity of infection, MOI) 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 조건으로 파지 감염을 수행하였다. 37℃에서 9시간 동안 호기성 조건 하에 숙주를 성장시키면서, UV-visible spectrophotometer (SP-UV 300, Spectrum Instruments, Perkin Elmer, UK)를 이용하여 600nm에서의 흡광도를 측정하여 용해활성을 확인하고, 상기 실험을 3회 반복하였다.
도 2는 상기 파지의 존재 하에서 살모넬라균의 성장 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 성장 억제 활성으로부터, 상기 파지가 S. Enteritidis의 성장을 급격하게 저해할 수 있음을 확인하였다. 음성 대조군과 비교하면, 파지가 MOI 값 100, 10, 1, 0.1 및 0.01 조건에서 1시간 내에 숙주균 세포의 성장을 급격하게 저해하는 결과가 나타났다. 또한, 모든 실험군에서 이러한 성장 저해가 6시간 동안 지속되었으며, 높은 밀도에서 파지가 더 높은 용해활성을 나타내어 숙주균을 급격하게 용해시키고, 지속적인 성장을 저해하는 결과를 나타냈다.
상기 결과로부터, 파지 PBSE191이 우수하고 장기간 지속적인 세균 용해성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 파지의 숙주균 감염범위 확인(host range determination)
표 1의 균에 대해 점적검사법(spot test)을 수행하여, 파지 PBSE191의 숙주균 감염 범위를 확인하였다.
실험균 중 Pectobacterium caratovorum 및 Staphylococcus aureus를 제외한 실험균의 론(lawn)은 LB 배지를 이용하여 제조하였으며, P. caratovorum 및 S. aureus의 론(lawn)은 TSA 배지를 이용하여 제조하였다.
파지 용해물(2 Х 108 PFU)을 각 균주의 론(lawn)에 점적한 후 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 다만, P. caratovorum KACC 21701의 경우 30℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 살모넬라 균주 및 몇몇 그람-양성 및 그람-음성 균주에 대해 파지의 용균반 형성 효율을 측정하고 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다. 평판효율(efficiency of plating, EOP)은 아래 식에 따라 계산하였으며, EOP 기준으로 + + + 는 1 초과, + + 는 0.001 내지 1, + 는 0.001 미만을 나타내고, - 는 파지에 대한 감수성이 없는 것을 의미한다.
Figure 112022039924049-pat00001
Figure 112022039924049-pat00002
표 1의 결과를 참조하면, 파지 PBSE191은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 특이적으로 감염시켰으며, 다른 균주들에 대해서는 감염을 일으키지 않았다.
구체적으로, 상기 파지는 S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Paratyphi, S. Salamae, S. Diarizonae 및 S. Dublin의 6가지 혈청형(serotype)을 포함하는 넓은 범위의 살모넬라에 대해 활성이 있는 것으로 나타났다.
살모넬라 뿐만 아니라 Shigella 또는 E. coli에도 활성을 나타내는 기존의 파지 SS3e 및 BSP101과 비교하면, 파지 PBSE191은 살모넬라를 특이적으로 감염시키는 특징을 가지며, 또한 다양한 종류의 살모넬라를 사멸시킬 수 있는 특징을 나타낸다. 따라서, 파지 PBSE191은 살모넬라의 제어가 필요한 식품 산업에 유용하게 사용될 것으로 기대할 수 있다.
실험예 4: 파지의 흡착능 분석(phage adsorption analysis)
파지가 숙주균 표면에 흡착되는데 걸리는 시간을 이용하여, 파지 PBSE191의 흡착능을 평가하였다.
균주 S. Enteritidis ATCC 13076의 overnight culture을 LB broth에 1:100으로 희석시키고, 37℃에서 3시간 동안 호기성 조건 하에 배양시켰다. 배양된 균(4.7 x 108 CFU)을 15,000 x g로 1분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 즉시 신선한 LB broth 10mL에 재부유시켰다.
MOI 0.001 조건으로 셀에 파지를 감염시킨 다음, 표본으로 서스펜션을 1mL씩 취하고, 각각 37℃에서 정치시켜 배양하였다. 각각 0, 5, 10, 15, 20, 25 및 30분 후에 샘플을 취한 다음 각 샘플을 즉시 15,000 x g로 1분 동안 원심분리하고 여과한 후, 이중층 한천 검사법을 이용하여 plate하고 파지 역가를 결정하였다. 상기 실험을 3회 반복하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 파지 흡착능은 아래 식에 따라 계산할 수 있다.
Figure 112022039924049-pat00003
도 3을 참조하면, 10분 및 25분후 각각 초기 파지 개체군의 92.03% 및 99.85%가 숙주균 표면에 흡착된 결과가 나타났으며, 이를 통해 파지의 빠른 흡착능을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 파지의 1단계 성장 분석(one-step growth analysis)
파지 PBSE191에 대해 잠복기(latent period) 및 방출량(burst size)을 측정하기 위해 1단계 성장 분석(one-step growth analysis)을 수행하였다.
파지 및 균 현탁액을 37℃에서 25분 동안 정치 상태에서 배양하여 파지가 균 표면에 흡착되도록 하였다. 배양 후, 현탁액을 15,000 x g로 1분 동안 원심분리하고, 상등액으로 용균반 검사법을 수행하여 흡착되지 않은 파지의 역가를 측정하였다.
파지 감염된 숙주균을 함유하는 펠렛을 10mL의 LB broth에 즉시 재부유시킨 후, 37℃에서 배양하고 2시간 동안 100㎕의 샘플을 10분마다 수집하였다. 수집된 샘플을 LB agar에 plate하여, 이중층 한천 기법(double-layer agar technique)을 통한 파지 산출에 이용하였다.
잠복기(min)는 파지 역가의 상당한 증가 및 감염된 균이 용해되는 데 걸리는 시간으로 확인하였으며, 방출량은 아래 식을 이용하여 계산할 수 있다.
Figure 112022039924049-pat00004
도 4는 상기 파지의 one-step 성장 곡선을 나타낸 것으로, 이를 참조하면 S. Enteritidis를 감염시켰을 때 잠복기가 20분으로 짧고, 첫번째 및 두번째 방출 시점이 각각 30분 및 50분인 것으로 확인되었다. 또한, 초기 방출량은 265 PFU/infected cell이었으며, 두번째 방출량은 127 PFU/infected cell이었다. 종래 보고된 살모넬라 파지의 경우 평균 방출량이 112 ± 48 PFU/infected cell (n=15)이었다는 점을 고려할 때, 상기 결과로부터 파지가 우수한 방출량을 갖는 것을 확인할 수 있다.
실험예 6: 파지의 열안정성 및 pH 안정성 측정
-18에서 80℃에 이르는 넓은 온도 범위 및 1 내지 9의 pH 범위에서, 파지 PBSE191의 생존율을 측정하여 안정성을 평가하였다.
열안정성 측정을 위하여, 파지 용해물(108 PFU)을 -18 내지 80℃ 범위의 서로 다른 온도에서 30분 동안 배양시켰다. pH 안정성 측정을 위하여, 파지 용해물(2 x 108 PFU)을 다양한 pH의 버퍼(pH 2~9)에서 30분 배양시켰다. 남은 파지는 플레이팅으로 산출하고, 상기 실험을 3회 반복한 다음 실험 결과를 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다. 파지의 안정성은 아래 식에 따라 계산할 수 있다.
Figure 112022039924049-pat00005
도 5의 열안정성 시험 결과를 참조하면, -18℃ 내지 60℃에서 30분 배양한 결과 파지의 생존율이 크게 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 한편 70℃ 및 80℃의 온도에서는 영향이 나타났으나, 30분 처리 후에도 파지의 5 log PFU/mL 이상이 남아있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 LSE7621, LPST10 및 vB_SalP_TR2 파지와 유사한 수준이며, 80℃에서는 SE-P3, SE-P16, SE-P37 및 SE-P47 파지보다 생존율이 우수하였다.
도 6의 pH 안정성 시험 결과에 따르면, 파지는 pH 범위 5 내지 7에서 30분간 배양 후에도 안정적으로 생존하였다. pH 범위 4 내지 9에서 파지 감소량이 1 log PFU/mL 미만으로 최적의 안정성이 관찰되었으며, pH 1에서는 파지가 불활성화되었으나, pH 3에서는 30분 처리 후에도 3.5 log PFU/mL 이상이 생존하였다.
이러한 결과는 파지 SS3e와 견줄만한 것으로, 파지 PBSE191은 넓은 범위의 온도 및 pH 조건에서 안정성을 나타내었고, 이로부터 식품 및 식품 제조업에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 파지의 숙주균 수용체 분석
숙주균으로서 S. Typhimurium LT2C를 이용하여, 파지 PBSE191의 수용체 분석을 수행하였다.
ΔβrfbP/LT2C knock-out mutant와 이의 complemented strain (ΔrfbP complemented with pUHE::rfbP/LT2C plasmid)는 서울대학교 연구실에서 제공받아 사용하였다.
야생형 박테리아 및 knock-out mutant를 LB broth에서 overnight cultivation한 다음, 카르베니실린　(carbenicillin)을 함유하는 LB broth에서 complemented strain을 37℃, 호기성 조건 하에 배양시켰다. 파지의 수용체 확인을 위하여 야생형, ΔrfbP/LT2C mutant 및 ΔrfbP complemented strains으로 점적 검사(spotting assay)를 수행하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, S. Typhimurium ΔrfbP/LT2C mutant가 파지에 저항성을 나타내었으며, 균주를 rfbP로 complement한 결과 파지에 대한 민감성이 회복된 결과가 나타났다.
이러한 결과는 파지 PBSE191이 숙주균의 수용체로서 Salmonella 지질다당류(LPS)의 O-antigen을 인식하는 것을 의미한다.
실험예 8: 파지의 DNA 분석
파지 DNA 정제
표준 페놀-클로로포름 추출법(standard phenol-chloroform extraction method)을 이용하여, 파지 PBSE191의 DNA를 정제하였다.
정제 전, 파지 용해물 500㎕를 실온에서 DNase I 1㎕/mL 및 RNase I 1㎕/mL로 30분간 처리하여 박테리아성 DNA 및 RNA 오염물을 제거하였다. 그 다음, 파지 용해물을 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5M EDTA (pH 8.0), 50㎕/mL proteinase K를 함유하는 lysis buffer로 처리하고, 혼합물을 65℃에서 15분간 배양시켰다.
그 후, 페놀을 첨가하여 파지 DNA을 추출하고, 실온에서 혼합물을 5,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 다음으로, 수성층(aqueous layer)을 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1) 용액과 조심스럽게 혼합한 후, 5,000rpm에서 5분간 원심분리하여 다당류 및 단백질 성분과 같은 불필요한 성분들을 제거하였다. 그 후, 클로로포름으로 동일한 단계를 반복하였다.
3M 소듐 아세테이트(NaOAc, pH 5.2)로 수성층을 수집한 후, 에탄올 침전을 수행하였다. 마지막으로, 정제된 파지 유전 DNA를 TE buffer에 보관하고 실험에 사용하였다.
유전학적 서열 분석 및 생물학적 정보 분석
RAST (https://rast.nmpdr.org/), GeneMarkS (http://exon.gatech.edu/GeneMark/genemarks.cgi) 및 FgenesV(trained Pattern Markov chain-based viral gene prediction software) 프로그램을 이용하여 파지 유전체의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 규명하였다. 알려지지 않은 ORF는 BLASTP를 이용한 non-overlapping protein NCBI database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 및 기존의 다른 박테리오파지의 동종 ORF를 ORF 추론에 참고하였다.
상기 분석 결과를 기반으로, Genescene software (DNAstar, Madison, WI)를 이용하여 유전체 지도(genome map)을 작성하여 도 8에 나타내었다. 파지의 유전체 서열은 GenBank에 접근번호 OM291373으로 등록하였다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OM291373). 분석 결과, 파지 PBSE191의 유전체는 41,332bp로 구성되며, 이 중 GC 함량은 49.84%이고, 43개의 ORF를 암호화(encode)하는 것으로 추론되었다.
ORF 확인 결과, 상기 파지에는 cro, cI, integrase와 같은 용원성 모듈 유전자(lysogeny module genes)나 독성 유전자(toxic genes)가 없는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 파지의 안전성을 확인할 수 있었다.
상기 파지의 계통학적 확인을 위해, Molecular Evolutionary Genetics Analysis 11 (MEGA 11) software를 이용하여 부트스트랩(bootstrap)을 2,000번 반복한 인접 결합법(neighbor-joining method)으로 메이저 캡사이드 단백질(major capsid protein, ORF29)에 기반한 계통학적 분석을 수행하고, 계통수(phylogenetic tree)를 도 9에 나타내었다. 도 9에서, 계통수 상 밀접한 연관이 있는 것은 *로 표시하였다.
계통학적 분석 결과, 파지 PBSE191의 메이저 캡사이드 단백질은 L13, SS3e 및 TS3 파지의 메이저 캡사이드 단백질과 유사하였으며, 이를 통해 살모넬라 파지 과에 속한다는 것을 확인하였다.
제조예 2: 파지를 이용한 PVA 필름 제조
파지 PBSE191을 이용하여, 파지를 함유하는 폴리비닐알코올(PVA) 필름을 제조하였다. PVA로는 시그마 알드리치에서 구입한 것을 이용하였으며, 상기 PVA의 중량평균분자량은 13,000 내지 23,000이고, 검화도는 87 내지 89%였다.
증류수를 이용하여 11g/100mL의 PVA 용액을 제조한 다음, 상기 11% PVA 용액에 가소제(plasticizer) 및 습윤제(moisturizer)로 사용되는 소르비톨(D-sorbitol 97%), 글리세롤(99%) 또는 트레할로즈(D-(+)-trehalose dihydrate)를 PVA 중량에 대하여 0%, 10% 및 20%(w/w)의 농도로 첨가한 후, 60분 동안 교반하며 80℃로 가열하였다.
완전히 용해되면, 용액을 121℃에서 15분간 오토클레이브(autoclave)하여 멸균시켰다. 오토클레이브한 용액을 실온으로 냉각시키고, PBS계 파지 용해물(1010 PFU)을 제조된 용액에 부피 기준 9:1의 비율로 첨가한 후 균일하게 혼합하고 탈기(degas)하였다. 대조군의 필름 용액은 11% 오토클레이브 PVA 용액을 멸균된 PBS buffer와 9:1의 부피비로 혼합하여 제조하였다.
각 용액 1mL를 페트리 접시에 붓고, hygro-thermostat에서 25℃, 50RH% 조건 하에 15시간 동안 건조시켰다. 건조된 필름을 캐스팅 표면에서 박리하고 실험에 사용하였다.
도 10은 PVA 10% 및 소르비톨 2% (w/w)를 포함하는 필름에 대하여, 파지 미함유 필름(좌측) 및 파지 함유 필름(우측)의 사진을 나타낸 것이다. 도면을 참조하면, 파지 함유 여부에 따라 외관에 큰 차이가 없는 것을 확인할 수 있다.
실험예 9: 필름에서 파지의 생존능 분석
가소제로서 글리세롤(G), 소르비톨(S) 또는 트레할로즈(T)를 포함하는 PVA 필름에서 파지의 생존율을 확인하기 위하여, 제조예 2의 방법에 따라 상기 물질을 PVA 중량에 대해 10 또는 20중량% 첨가하여 PVA 필름을 제조하였다. 각 필름 용액의 초기 파지 역가(initial phage titer)는 4 x 109 PFU/mL로 설정하였다.
제조된 필름을 10mL의 PBS buffer에 20℃, 200rpm에서 30분 동안 용해시키고, 이중층 용균반 검사법을 이용하여 파지의 생존율을 평가하였다. 생존한 파지를 계수하고, 각 가소제를 포함하는 파지 함유 PVA 필름에서의 파지 생존능 측정 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11의 결과에 따르면, 가소제가 없는 10% (w/v) PVA 필름에서는 2 log PFU 이상의 파지가 불활성화된 반면, 소르비톨, 글리세롤 또는 트레할로즈를 포함하는 필름에서는 파지의 생존능이 향상된 것을 확인할 수 있으며, 특히 소르비톨이 다른 습윤제들에 비해 파지 보호 측면에서 뛰어난 활성을 나타내었다.
구체적으로, 20% 소르비톨에서 대부분의 파지 입자가 살아남았고, 불활성화된 파지는 0.5 log PFU 미만이었다. 한편, 10% 소르비톨, 20% 글리세롤, 10% 글리세롤, 20% 트레할로즈 및 10% 트레할로즈에서는 각각 1.1, 1.1, 1.3, 1.1 및 1.2 log PFU의 파지가 불활성화되었다. 이로부터, 10%(w/v) PVA 필름에 20%의 소르비톨을 이용한 필름(PVAS20)에서 파지 생존율이 가장 우수한 것을 확인하였다.
실험예 10: PVA 필름에서 파지의 안정성 확인
파지 함유 PVAS20 필름에 대하여, 30일 동안 파지의 안정성을 확인하였다.
파지 함유 PVAS20 필름을 10mL의 PBS buffer에 20℃, 200rpm에서 30분 동안 용해시키고, 이중층 용균반 검사법을 이용하여 파지의 생존율을 평가하였다. 상기 방법으로, 30일 동안 1, 3, 10, 20 및 30일마다 필름에서 파지의 안정성을 시험하였다. 플레이팅(plating)으로 생존한 파지를 계수하였으며, 실험을 3회 반복하였다.
도 12는 PVA 필름에서 파지의 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 12를 참조하면, 건조 조건에서 30일 동안 파지가 우수한 생존율을 나타내는 놀라운 결과를 확인할 수 있으며, 이를 통해 파지가 PVA 고분자 매트릭스에서 성공적으로 보호 및 보존되는 것을 알 수 있었다.
실험예 11: 파지를 함유하는 PVA 필름의 항균 활성 확인
파지 함유 PVAS20 필름에 대하여, 살모넬라균에 대한 항균 활성을 시험하였다.
항균 활성을 측정하기 위해, LB broth에서 S. Enteritidis ATCC 13076 셀 현탁액(약 105 CFU/mL, early-exponential phase) 10mL를 제조하였다. 그 후, 상기 현탁액에 37℃에서 4시간 동안 200rpm으로 shaking하며 필름을 침지시켰다. 필름에서 파지의 양은 약 108 PFU/film으로 하고, 대조군으로는 파지가 없는 필름을 이용하였다. 0.5, 1, 2 및 4시간 경과 시점에서 항균 활성을 측정하고 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 따르면, 필름에서 파지 입자가 4시간 동안 S. Enteritidis에 대한 숙주 용해 활성을 유지하는 결과가 나타났다. 이를 통해, 파지 함유 PVAS20 필름에서 파지가 지속적으로 항균 활성을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 12: 파지 함유 PVA 코팅의 항균 활성 측정
파지 함유 코팅의 항균 활성을 평가하기 위하여, egg opener (Guangzhou Le Tian Pen Co., Ltd., China)를 이용하여 2.5cm 입경의 난각 샘플(0.46 ± 0.05 g, n=125)을 준비하고, 121℃에서 15분간 오토클레이빙하여 멸균시켰다. 다음으로, 54개의 깨끗한 난각을 무작위로 3개의 그룹(대조군, 파지 미함유 PVAS20 코팅 그룹 및 파지 함유 PVAS20 코팅 그룹)으로 나누었다.
계대배양한 S. Enteritidis를 37℃에서 1.5시간(early exponential phase) 동안 호기성 조건 하에 배양시켰다. 배양물을 15,000 x g로 1분간 원심분리하고, LB broth 100㎕에 박테리아 펠렛을 재부유시켰다. 2.4 x 108 CFU/mL의 박테리아 셀 10㎕를 난각 표면에 점접종(spot inoculation)하고, 실온에서 30분간 공기 중에서 건조시켰다.
파지 코팅 그룹의 경우, 접종된 난각을 파지 함유 PVAS20 코팅 용액(4.0 Х 109 PFU/mL)에 3초 동안 담근 후 실온에서 40분 동안 건조시켰다. 대조군의 경우, 난각을 코팅하지 않거나, 파지를 함유하지 않는 PVAS20 코팅 용액에 담그고 40분 동안 건조시켰다. 각 그룹 당 6개의 난각 샘플을 선택하고, 5℃, 상대습도 50% 조건에서 24시간 동안 보관한 후 살모넬라에 대한 항균 활성을 시험하였다.
항균 활성 시험을 위해, Pulsifier II (Microgen Bioproducts Ltd., UK)를 이용하여 샘플을 30초 동안 10ml의 멸균 PBS buffer로 균질화하였다. 샘플은 모두 10-2로 희석하고, XLD agar (MB-X1060; MB cell, Seoul, Korea)에 플레이트한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 플레이팅으로 검정색 콜로니의 개수를 세고, 코팅된 난각에 남은 파지의 역가를 이중층 한천 검사법으로 측정하였다.
도 14는 코팅 전, 코팅 직후, 코팅 24시간 경과 후의 S. Enteritidis 셀 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 14를 참조하면, 난각에 파지를 함유하는 PVAS20 코팅을 형성한 직후 실온에서 상당량의 살모넬라균(약 1 log CFU)이 사멸되는 것을 확인할 수 있다. 파지 함유된 PVAS20 코팅의 경우 24시간 후 초기 접종량에 비해 약 2 log CFU의 셀 감소를 유도한 반면, 대조군의 경우 약 1 log CFU 정도로 감소한 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 파지 함유된 PVAS20 코팅의 경우 코팅 후 건조 단계(40분) 동안 파지가 균과 접촉하고 사멸을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한, PVAS20 코팅에서 파지가 장기간 생존하여 지속적으로 효과를 나타냄으로써, 균수의 감소가 24시간 이후에도 지속됨을 확인하였다.
이에 따라, 파지를 함유하는 PVA 코팅이 난각에 적용되었을 때 우수한 안정성 및 항균 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이상 본 발명의 일부 구현 형태에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 바와 같은 구현형태에 대해서만 한정되는 것이 아니라 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 수정 및 변형하여 실시할 수 있으며, 그러한 수정 및 변형이 가해진 형태 또한 본 발명의 기술적 사상에 속하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (18)

  1. 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지, 고분자 화합물 및 가소제를 포함하며, 상기 가소제가 소르비톨(sorbitol)을 포함하는, 코팅 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 살모넬라 속 균이 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 포함하는, 코팅 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 살모넬라 속 균이 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(S. Typhimurium), 살모넬라 파라티피(S. Paratyphi), 살모넬라 살라매(S. Salamae), 살모넬라 디아리조내(S. Diarizonae) 및 살모넬라 더블린(S. Dublin)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형(serotype)을 포함하는, 코팅 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 박테리오파지가 시포비리대 과(Siphoviridae)에 속하는, 코팅 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 박테리오파지가 살모넬라 속 균(Salmonella sp.)에 대해 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC14929BP의 박테리오파지인, 코팅 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 고분자 화합물이 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리부틸렌숙시네이트(polybutylene succinate, PBS), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutylene terephthalate, PBT), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride, PVC), 폴리아미드(polyamide, PA) 및 폴리우레탄(polyurethane, PU)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 코팅 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 고분자 화합물이 생분해성 고분자(biodegradable polymer)를 포함하는, 코팅 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 가소제가 글리세롤(glycerol), 트레할로즈(trehalose), 프럭토즈(fructose), 수크로즈(sucrose), 만니톨(mannitol), 프로필렌글리콜(propylene glycol) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 코팅 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 가소제가 고분자 화합물 중량을 기준으로 10 내지 30중량% 포함되는, 코팅 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 코팅 조성물이 용매를 더 포함하는, 코팅 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 코팅 조성물 전체 부피를 기준으로, 상기 박테리오파지가 1 x 108 내지 1 x 1012 PFU/mL 포함되는, 코팅 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 코팅 조성물 전체 부피를 기준으로, 상기 고분자 화합물이 5 내지 20g/100mL 포함되는, 코팅 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 코팅 조성물 전체 부피를 기준으로, 상기 가소제가 1 내지 5g/100mL 포함되는, 코팅 조성물.
  14. 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지, 고분자 화합물 및 가소제를 포함하는 코팅 조성물로서 상기 가소제가 소르비톨(sorbitol)을 포함하는 코팅 조성물을 이용하여 제조된 항균 필름.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 항균 필름이 기판에 상기 코팅 조성물을 코팅한 후 20 내지 30℃의 온도에서 10 내지 20시간 동안 건조시켜 제조된, 항균 필름.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 항균 필름이 코팅 대상체에 상기 코팅 조성물을 코팅한 후 20 내지 30℃의 온도에서 10 내지 180분 동안 건조시켜 제조된, 항균 필름.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 항균 필름이 식품 포장용 필름인, 항균 필름.
  18. 살모넬라 속 균(Salmonella sp.)에 대해 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC14929BP의 박테리오파지.
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