KR102525493B1 - 장기 순환 물질이 없는 폴록사머 조성물 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

장기 순환 물질이 없는 폴록사머 조성물 및 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

장기 순환 물질이 없는(LCMF) 폴록사머 조성물 및 이의 용도가 본 명세서에서 제공된다. 특히, LCMF 폴록사머 188 조성물 및 이의 용도가 제공된다. 또한 폴록사머 조성물, 특히 LCMF 폴록사머 조성물을 제조하기 위한 초임계 유체 추출(SFE) 방법 및 고압 (아임계) 방법이 제공된다.

Description

장기 순환 물질이 없는 폴록사머 조성물 및 이의 제조 방법 및 용도{A POLOXAMER COMPOSITION FREE OF LONG CIRCULATING MATERIAL AND METHODS FOR PRODUCTION AND USES THEREOF}
관련 출원
2014년 7월 7일에 출원되고 제목이 "A POLOXAMER COMPOSITION FREE OF LONG CIRCULATING MATERIAL AND METHODS FOR PRODUCTION AND USES THEREOF"인 R. Martin Emanuele 및 Mannarsamy Balasubramanian의 미국 가출원 일련 번호 62/021,697에 대하여 우선권의 이익을 주장한다.
본 출원은 본 출원과 동일자로 출원되고 제목이 "A POLOXAMER COMPOSITION FREE OF LONG CIRCULATING MATERIAL AND METHODS FOR PRODUCTION AND USES THEREOF"인 Martin Emanuele 및 Mannarsamy Balasubramanian의 미국 출원 일련 번호(대리인 문서 번호 38645.04003.US02/4003)와 관련된다.
본 출원은 또한 2014년 7월 7일에 출원되고, 제목이 "POLOXAMER THERAPY FOR HEART FAILURE"인 R. Martin Emanuele, Santosh Vetticaden 및 Patrick Keran의 미국 가출원 일련 번호 62/021,691; 2015년 2월 27일에 출원되고 제목이 "POLOXAMER THERAPY FOR HEART FAILURE"인 Martin Emanuele, Santosh Vetticaden 및 Patrick Keran의 미국 가출원 일련 번호 62/126,400; 2014년 7월 7일에 출원되고 제목이 "POLOXAMER THERAPY FOR HEART FAILURE"인 R. Martin Emanuele, Santosh Vetticaden 및 Patrick Keran의 국제 PCT 출원 번호 PCT/US14/45627과 관련되고; 본 출원은 또한 국제 PCT 출원 번호(대리인 문서 번호 38645.04001.WO12/4001BPC) 및 미국 출원 일련 번호(대리인 문서 번호 38645.04001.US12/4001)(이들은 각각 본 출원과 동일자로 출원되고, 각각 제목이 "POLOXAMER THERAPY FOR HEART FAILURE"임)와 관련된다.
허용되는 경우, 각각의 출원의 주제는 전체가 참조로 포함되어 있다.
기술분야
장기 순환 물질이 없는(long circulating material free; LCMF) 폴록사머 조성물 및 이의 용도가 본 명세서에서 제공된다. 또한, LCMF 폴록사머 조성물을 제조하기 위한 초임계 유체 추출(supercritical fluid extraction; SFE) 방법 및 고압 (아임계) 방법이 제공된다.
폴록사머라고도 불리는 특정 폴리옥시프로필렌/폴리옥시에틸렌(POP/POE) 공중합체는 인간 또는 동물에게 투여될 때 유익한 생물학적 효과를 나타낸다. 이들 공중합체는 단독으로 또는, 예를 들어 항응고제, 자유라디칼 스캐빈저, 항염증제, 항생제, 막 안정화제 및 관류 매질을 포함한 기타 다른 화합물과 조합하여 순환계 질환을 치료하는 데 사용되어 왔다. 폴록사머 188(P188)(예를 들어, 미국 특허 번호 5,696,298 참조)은 인간 및 동물의 혈액 및 기타 다른 생물학적 유체에서 병리학적인 소수성 상호작용을 치료하는 데 유용하다. 폴록사머의 상업적으로 입수가능한 제조물은 구성 분자의 크기 및 배열이 광범위하게 다양한 매우 이질적인 분자 집단을 함유한다. 상업적으로 입수가능한 폴록사머에 존재하는 분자의 다양성은 생물학적 활성의 예측을 어렵게 만들고 원치않는 생물학적 활성을 초래할 수 있다. 따라서, 폴록사머의 대안적인 제조물에 대한 필요성이 존재한다.
대안적인 폴록사머 제조물 및 이의 제조 및 사용 방법이 본 명세서에서 제공된다. 장기 순환 물질이 없는(LCMF) 폴록사머, 특히 LCMF 폴록사머 188이 제공된다. 대상체, 예컨대 인간 대상체에게 투여될 때, LCMF 폴록사머는 대상체에서 주요 피크보다 반감기가 현저하게 더 긴 물질을 생성하지 않으므로, 대상체, 예컨대 인간에의 LCMF 폴록사머의 투여시, 공중합체의 분포에서 모든 성분의 순환 반감기가 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기보다 5.0 배 이하로 더 길다. 일반적으로 인간에서 LCMF 폴록사머 188의 모든 성분의 반감기는 12 시간 미만이다. 상업적으로 입수가능한 폴록사머의 종래 제조물, 예컨대 폴록사머 188은 인간에게 투여될 때 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기의 5.0 배 초과인 반감기를 가지는 장기 순환 물질(long circulating material; LCM)을 가진다. 또한, 저분자량 불순물의 제거를 포함하여, LCMF 폴록사머 및 기타 다른 폴록사머를 제조하는 방법이 제공된다.
LCMF 폴록사머 중에는 화학식 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지는 LCMF 폴록사머 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체가 있으며, 여기서 a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 대략 60 중량% 내지 90 중량% 또는 60 중량% 내지 90 중량%이도록 하는 정수이고; a 및 a'는 동일하거나 상이하며; b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 대략 1,300 달톤(Da) 내지 2,300 달톤(Da)이도록 하는 정수이고; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 4,500 Da 미만인 저분자량 성분이며; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 13,000 Da 초과인 고분자량 성분이고; 공중합체의 다분산도 값은 대략 1.07 미만 또는 1.07 미만, 예컨대 1.06, 1.05, 1.04, 1.03 및 l.02 이하이며; 인간 대상체에게 투여될 때 공중합체의 분포에서 모든 성분의 순환 반감기는 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기보다 5.0 배 이하로 더 길다. LCMF 폴록사머는 당업계에 공지된 폴록사머 188, 예컨대 미국 특허 번호 5,696,298에 기재된 폴록사머의 제조물, 및 이의 상업적으로 입수가능한 제조물보다 더 친수성이며, 이들 제조물은 장기 순환 물질(LCM)을 함유한다.
장기 순환 물질이 없는(LCMF) 폴록사머 188이 제공되며, 여기서 LCMF 폴록사머 188은 화학식 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체이고; a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 대략 60 중량% 내지 90 중량%이도록 하는 정수이며; a 및 a'는 동일하거나 상이하고; b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 대략 1,300 달톤 내지 2,300 달톤이도록 하는 정수이며; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 4,500 달톤 미만인 저분자량 성분이고; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 13,000 Da 초과인 고분자량 성분이며; 공중합체의 다분산도 값은 대략 1.07 미만 또는 1.07 미만, 예컨대 1.06, 1.05, 1.04, 또는 1.03, 또는 1.06, 1.05, 1.04 또는 1.03 미만이고; 대상체에의 정맥내 투여 후, 주요 피크를 포함하지 않는 임의의 성분의 순환 혈장 반감기는 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기보다 5.0 배 이하로 더 길다.
공중합체의 중합체 분포를 포함하는 모든 성분이, 대상체에의 정맥내 투여 후 공중합체의 주요 성분의 순환 반감기보다 5.0 배, 또는 4.0 배, 또는 3.0 배 이하로 더 긴, 대상체, 예컨대 인간 대상체의 혈장 중 순환 반감기를 가지는 구현예가 포함된다. 예를 들어, 인간 대상체에게 투여될 때, 공중합체의 분포에서 모든 성분은 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기보다 4 배 이하로 더 긴 대상체의 혈장 중 순환 반감기를 가진다. 인간 대상체에게 투여될 때, 공중합체의 분포에서 모든 성분이 30 시간, 25 시간, 20 시간, 15 시간, 12 시간, 10 시간, 9 시간, 8 시간 또는 7 시간 이하, 예컨대 10 시간 또는 12 시간인 대상체의 혈장 중 반감기를 가지는 구현예가 포함된다. 따라서, LCMF 폴록사머는 LCM을 포함하지 않는다.
장기 순환 물질이 없는(LCMF) 폴록사머 188이 본 명세서에서 제공되며, 여기서 LCMF 폴록사머 188은 화학식 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체이고; a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 대략 60 중량% 내지 90 중량%이도록 하는 정수이며; a 및 a'는 동일하거나 상이하고; b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 대략 1,300 달톤 내지 2,300 달톤이도록 하는 정수이며; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 4,500 달톤 미만인 저분자량 성분이고; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 13,000 Da 초과인 고분자량 성분이며; 공중합체의 다분산도 값은 대략 1.07 미만 또는 1.07 미만이고; LCMF 폴록사머는 장기 순환 물질(LCM)을 함유하는 정제된 폴록사머 188보다 더 친수성이어서, 이에 의하여 공중합체의 분포에서 모든 성분의 순환 반감기는 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기보다 5.0 배 이하로 더 길다.
장기 순환 물질이 없는(LCMF) 폴록사머 188이 제공되며, 여기서 LCMF 폴록사머 188은 화학식 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체이고; a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 대략 60 중량% 내지 90 중량%이도록 하는 정수이며; a 및 a'는 동일하거나 상이하고; b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 대략 1,300 달톤 내지 2,300 달톤이도록 하는 정수이며; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 4,500 달톤 미만인 저분자량 성분이고; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 13,000 Da 초과인 고분자량 성분이며; 공중합체의 다분산도 값은 대략 1.07 미만 또는 1.07 미만이고; LCMF는 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 평가되었을 때, 평균 보유 시간(tR)이 LCM을 함유하는 정제된 폴록사머 188보다 더 짧다. 일부 구현예에서, 예를 들어 RP-HPLC 조건은 LCM-함유 폴록사머 188의 평균 tR이 약 9.9 내지 10, 또는 9.9 내지 10이고; LCMF 폴록사머의 평균 tR이 약 8.7 내지 8.8, 또는 8.7 내지 8.8이도록 하는 것이다.
장기 순환 물질이 없는(LCMF) 폴록사머 188이 제공되며, 여기서 LCMF 폴록사머 188은 화학식 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체이고; a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 대략 60 중량% 내지 90 중량%이도록 하는 정수이며; a 및 a'는 동일하거나 상이하고; b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 대략 1,300 달톤 내지 2,300 달톤이도록 하는 정수이며; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 4,500 달톤 미만인 저분자량 성분이고; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 13,000 Da 초과인 고분자량 성분이며; 공중합체의 다분산도 값은 대략 1.07 미만 또는 1.07 미만이고; RP-HPLC에 의해 평가되었을 때 용량 인자(k')는 동일한 조건 하에서 정제된 LCM-함유 폴록사머 188에 대한 k'보다 작다. 예를 들어, RP-HPLC 조건은 LCMF 폴록사머의 평균 k'가 약 3.2 내지 3.3, 또는 3.2 내지 3.3이도록 하고, LCM-함유 폴록사머 188의 평균 k'가 약 3.6 내지 3.7, 또는 3.6 내지 3.7이 되도록 하는 것이다.
본 명세서의 구현예에서, LCMF 폴록사머는 분자량이 약 1,400 달톤(Da) 내지 2,000 달톤(Da) 또는 1,400 Da 내지 2,000 Da, 예컨대 1,750 Da인 소수기, 및 공중합체의 대략 70 중량% 내지 90 중량%, 또는 70 중량% 내지 90 중량%를 구성하는 친수기 부분을 가지는 폴록사머일 수 있다. LCMF 폴록사머는 평균 분자량이 7,680 달톤 내지 9,510 달톤, 예컨대 8,400 달톤 내지 8,800 달톤일 수 있다.
일부 구현예에서, 제조물 중 13,000 달톤 초과의 고분자량 성분의 백분율은 폴록사머 제조물의 성분의 전체 분포의 1% 미만을 구성한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체에의 정맥내 투여 후, LCMF 폴록사머는 주요 피크의 순환 혈장 반감기의 성분보다 4 배 초과의 순환 반감기를 갖는 성분을 생성하지 않는다. 일부 구현예에서, 제조물 중 13,000 달톤 초과의 고분자량 성분의 백분율은 폴록사머 제조물의 성분의 전체 분포의 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5% 이하를 구성한다.
LCMF 폴록사머는, 대상체에게 투여될 때, 본 명세서의 개시 내용 전반에 걸쳐 기재되고 나타낸 바와 같이 LCM-함유 폴록사머의 성분보다 더 짧은 시간 내에 모든 성분이 소거된다는 점에서, LCM-함유 폴록사머와 상이하다. RP-HPLC에 의해 특징지어질 때, 본 명세서에서 제공되는 LCMF 폴록사머는 평균 k' 및 평균 tR이 해당 LCM-함유 폴록사머보다 작은 것이다. LCMF 폴록사머는 해당 LCM-함유 폴록사머보다 더 친수성이다.
본 명세서에 기재된 것들을 포함하여, 초임계 유체 추출 방법에 의해 생성되는 LCMF 폴록사머가 제공된다. 예를 들어, a) 폴록사머 용액을 추출기 용기에 도입하며, 여기서 폴록사머는 제1 알칸올에 용해되어 용액을 형성하는 단계; b) 제1의 정해진 기간 동안, 상기 폴록사머 용액을 초임계 이산화탄소를 유지하는 온도 및 압력 하에서 제2 알칸올 및 초임계 이산화탄소를 포함하는 추출 용매와 혼합하는 단계로서, 상기 온도는 이산화탄소의 임계 온도를 초과하지만 40℃ 이하이고; 압력은 220 bar 내지 280 bar이며; 알칸올은 전체 추출 용매의 7 중량% 내지 8 중량%인 알칸올 농도로 제공되는 단계; 및 c) 추출 방법의 시간 경과에 따른 구배 단계로 단계 b)에서 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도를 복수 회 증가시키는 단계로서, 여기서 복수 회 각각은 추가로 정해진 기간 동안 일어나고; 각각의 연속 단계에서, 알칸올 농도는 제2 알칸올의 이전 농도에 비하여 1% 내지 2% 증가되는 단계; 및 d) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하여, 이에 의해 라피네이트 폴록사머 제조물로부터 추출된 물질을 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 LCMF 폴록사머가 제공된다.
일부 구현예에서, LCMF 폴록사머를 생성하기 위하여, a)에서, 폴록사머 대 제1 알칸올의 비율은 중량으로 약 2:1 내지 3:1, 또는 2:1 내지 3:1(이들을 포함함)이고; 및/또는 단계 c)에서 복수 회는 2 회, 3 회, 4 회 또는 5 회의 구배 단계로 일어나며; 및/또는 단계 c)는, i) 제2 정해진 기간 동안 약 7% 내지 8%로부터 약 8.2% 내지 9.5%로 제2 알칸올의 농도를 증가시키는 단계; 및 ii) 제3 정해진 기간 동안 약 8.2% 내지 9.5%로부터 약 9.6% 내지 11.5%로 제2 알칸올의 농도를 증가시키는 단계를 포함하는 2 개의 단계로 실행될 수 있다. 특정 구현예에서, LCMF 폴록사머는
단계 b)에서 알칸올 농도가 약 7.4 중량% 또는 7.4 중량%이고;
단계 i)에서 알칸올 농도가 약 9.1 중량% 또는 9.1 중량%이며;
단계 ii)에서 알칸올 농도가 약 10.7 중량% 또는 10.7 중량%
인 방법에 의해 생성된다.
제1 정해진 기간, 제2 정해진 기간 및 제3 정해진 기간 각각은 2 시간 내지 12 시간 동안 실행될 수 있고; 정해진 기간은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 정해진 기간은 2 시간 내지 6 시간; 제2 정해진 기간은 2 시간 내지 6시간; 제3 정해진 기간은 4 시간 내지 10 시간 동안 실행될 수 있다. LCMF 폴록사머가 생성되는 방법에서, 제1 및 제2 알칸올은 각각 독립적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 예를 들어, 제1 및 제2 알칸올은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예컨대 제1 알칸올은 메탄올이고 제2 알칸올은 메탄올 또는 상이한 알칸올이다. 추출된 물질이 제거되는 단계 d)는, 단계 b) 및 c) 전반에 걸쳐 일어날 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어 배치 방법 또는 연속 방법으로서 실시될 수 있다.
본 명세서의 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성되는 LCMF 폴록사머는 LCMF 폴록사머 188이다. 또한 상기 및 본 개시 내용의 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 LCMF 폴록사머 188을 포함하여, LCMF 폴록사머를 생성하는 방법이 제공된다.
본 명세서에서 제공되는 LCMF 폴록사머를 함유하는 조성물이 제공된다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 비히클 중에서 제형화되는 약학 조성물일 수 있다. 특히, 본 명세서에서 제공되는 LCMF 폴록사머를 함유 또는 포함하는 조성물, 및 약학 조성물이 제공된다. LCMF 폴록사머 188을 포함하는 조성물이 제공된다. 장기 순환이 없는(LCMF) 폴록사머 188을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화되고; 조성물은 5 gm 내지 50 gm의 LCMF 폴록사머를 포함한다. LCMF 폴록사머는 본 명세서에서 제공되는 임의의 것을 포함하는 임의의 LCMF 폴록사머일 수 있다. 폴록사머가 투여되는 임의의 질환 또는 장애 또는 병태의 치료 조성물의 용도 및 치료 방법이 제공된다. 예시적인 질환 및 병태는, 급성 심근경색증, 하지 허혈, 쇼크, 급성 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 당뇨망막병증, 출혈성 쇼크, 신경퇴행성 질환, 황반변성, 당뇨망막병증 및 울혈성 심부전을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는, 심부전, 심근경색증, 뇌졸중, 쇼크 및 겸상적혈구빈혈을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
LCMF 폴록사머 조성물은 기타 다른 장애, 병태, 질환, 및 막 재봉합 및 복구에 의해 치료되는 장애를 치료하는 것; 조직 허혈 및 재관류 손상을 치료하는 것; 염증 반응을 감소시키는 것; 혈액 점도를 감소시키는 것; 혈전용해를 용이하게 하는 것; 지혈을 촉진 또는 유지하는 것; 약물, 핵산 또는 단백질 전달용 비히클로서; 소수성 약물의 현탁액을 안정화시키는 유화제로서; 피부 상처를 닦아내는 것; 화장품의 제형 중 계면활성제로서; 약화된 혈액의 저장 장애를 치료하거나 혈액 및 혈액 제품 중 저장 장애를 방지하는 것; 개인 위생 용품 및 비누의 점도를 제어하는 것; 완하제로서의 용도 및 당업자에게 공지된 기타 다른 용도를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 용도에 사용될 수 있다.
LCMF 폴록사머를 함유하는 조성물은 혈액, 적혈구 및/또는 혈액 제품, 예컨대 농축 적혈구(packed red blood cell)로 제형화될 수 있거나 또는 이들을 함유할 수 있다. 이와 같은 조성물은 수혈에 사용될 수 있다. 수혈은 겸상적혈구빈혈, 급성 흉부 증후군, 말초 동맥 질환, 심부전, 뇌졸증, 말초 혈관 질환, 황반변성, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 복합 장기부전, 허혈, 쇼크, 산성혈증, 저체온증, 빈혈 분해, 수술, 외상, 실혈 및 혈액 장애; 및 수혈을 포함하는 임의의 치료를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 질환에 대한 치료에서 사용된다. 이들은 출혈성 쇼크, 패혈성 쇼크 및 급성 실혈을 포함한다. 따라서, 수혈을 위한 조성물의 용도, 및 겸상적혈구빈혈, 급성 흉부 증후군, 말초 동맥 질환, 심부전, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 황반변성, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 복합 장기부전, 허혈, 쇼크(출혈성 쇼크 및 패혈성 쇼크를 포함함), 산성혈증, 저체온증, 빈혈 분해, 수술, 외상, 급성 실혈 및 혈액 장애 중에서 선택되는 질환 또는 장애를 가지는 대상체에게 조성물을 투여함으로써 치료하는 방법으로서, 치료는 수혈을 포함하는 방법이 또한 제공된다.
LCMF 폴록사머는 LCM이 제거되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은, a) 폴록사머 188 용액을 추출기 용기에 도입하며, 여기서 폴록사머는 제1 알칸올에 용해되어 용액을 형성하는 단계; b) 폴록사머 용액을 초임계 액체를 유지하는 온도 및 압력 하에서 제2 알칸올 및 초임계 액체를 포함하는 추출 용매와 혼합하는 단계로서, 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라서 증가되는 단계; 및 c) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거함으로써 폴록사머 제조물로부터 추출된 물질을 제거하고, 이에 의하여 LCMF 폴록사머를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해, LCMF 폴록사머 188 또는 선택된 임의의 폴록사머, 예컨대 하기에 기재된 것을 제조하는 방법을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 LCMF 폴록사머 188 또는 선택된 임의의 폴록사머를 제조하는 기재된 방법을 포함한다.
방법은, a) 폴록사머 188 용액을 추출기 용기에 도입하며, 여기서 폴록사머는 제1 알칸올에 용해되어 용액을 형성하는 단계; b) 제1의 정해진 기간 동안, 상기 폴록사머 용액을 초임계 이산화탄소를 유지하는 온도 및 압력 하에서 제2 알칸올 및 초임계 이산화탄소를 포함하는 추출 용매와 혼합하는 단계로서, 상기 온도는 이산화탄소의 임계 온도를 초과하지만 40℃ 이하이고; 압력은 220 bar 내지 280 bar이며; 알칸올은 전체 추출 용매의 7 중량% 내지 8 중량%인 알칸올 농도로 제공되는 단계; 및 c) 추출 방법의 시간 경과에 따른 구배 단계로 단계 b)에서 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도를 복수 회 증가시키는 단계로서; 각각의 복수 회는 추가의 정해진 기간 동안 일어나고; 각각의 연속 단계에서, 알칸올 농도는 제2 알칸올의 이전 농도에 비하여 1% 내지 2% 증가되며; 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하여 라피네이트 폴록사머 제조물로부터 추출된 물질을 제거하고, 이에 의하여 LCMF 폴록사머를 생성하는 단계를 포함하는, 장기 순환이 없는(LCMF) 폴록사머를 제조하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 추출된 물질이 제거되는 단계 d)는 단계 b) 및 c) 전반에 걸쳐 실행될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 단계 a)에서, 폴록사머 대 제1 알칸올의 비율은 중량으로 약 2:1 내지 3:1, 또는 2:1 내지 3:1(이들을 포함함)이고/이거나; 단계 c)에서의 복수 회는 2 회, 3 회, 4 회, 또는 5 회의 구배 단계로 일어난다. 단계 c)는, i) 제2 정해진 기간 동안 약 7% 내지 8%로부터 약 8.1% 내지 9.5%로 제2 알칸올의 농도를 증가시키는 단계; 및 ii) 제3 정해진 기간 동안 약 8.2% 내지 9.5%로부터 약 9.6% 내지 11.5%로 제2 알칸올의 농도를 증가시키는 단계를 포함하는 2 개의 단계로 실행될 수 있다. 특정 구현예에서, 단계 b)에서 알칸올 농도는 약 7.4 중량% 또는 7.4 중량%이고; 단계 i)에서 알칸올 농도는 약 9.1 중량% 또는 9.1 중량%이며/이거나; 및/또는 단계 ii)에서 알칸올 농도는 약 10.7 중량% 또는 10.7 중량%이다. 제1 정해진 기간, 제2 정해진 기간 및 제3 정해진 기간 각각은 2 시간 내지 12 시간 동안 실행될 수 있고; 정해진 기간은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 정해진 기간은 2 시간 내지 6 시간 동안 수행될 수 있고; 제2 정해진 기간은 2 시간 내지 6 시간 동안 수행될 수 있으며; 제3 정해진 기간은 4 시간 내지 10 시간 동안 수행될 수 있다. 제1 알칸올 및 제2 알칸올 각각은 독립적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 각각은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어 제1 알칸올은 메탄올일 수 있고/있거나, 제2 알칸올은 메탄올일 수 있다.
LCMF 폴록사머를 제조하기 위한 추출 방법이 제공되며, 이는 a) 폴록사머를 추출기 용기에 장입하고, 폴록사머를 제1 알칸올에 용해시켜 용액을 형성하는 단계; b) 압력 하에서 제2 알칸올 및 초임계 액체를 포함하는 추출 용매를 용액과 혼합하여 추출 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되는 단계; 및 c) 추출 용기로부터 추출 용매를 제거하여, 이에 의해 폴록사머로부터 저분자량의 물질을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 a) 폴록사머를 추출 용기에 장입하고, 폴록사머를 제1 용매에 용해시켜 용액을 형성하는 단계로서, 여기서 제1 용매는 알코올, 지방족 케톤, 방향족 케톤, 아민, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; b) 추출 용매를 용액과 혼합하여 추출 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 추출 용매는 고압 이산화탄소 및 제1 용매를 포함하고, 추출 용매 중 용매의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되는 단계; 및 c) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하여, 이에 의해 폴록사머로부터 저분자량의 불순물을 제거하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 구현예에서, 단계 c 후, 방법은 단계 b 및 c를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 폴록사머는 폴록사머 188, 폴록사머 331 및 폴록사머 407을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 임의의 폴록사머일 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 모든 방법에 있어서, 제1 및 제2 알칸올은 각각 독립적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 예를 들어, 알칸올 하나 또는 둘 다는 메탄올일 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 모든 방법에서, 압력 하 초임계 액체는, 이산화탄소, 메탄, 에탄, 프로판, 암모니아 및 프레온과 같은 임의의 적합한 초임계 액체일 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 압력 하 초임계 액체는 이산화탄소이다. LCMF 폴록사머, 예컨대 LCMF 폴록사머 188을 제조하기 위한 방법의 구현예에서, 추출 용매는 메탄올 및 이산화탄소를 포함한다. 메탄올 대 이산화탄소의 예시적인 비율은 1:100 내지 약 15:100 또는 15:100, 예컨대 2:100 내지 약 10:100 또는 10:100이다. 메탄올 대 이산화탄소의 비율은 상기 방법을 실행하는 동안 증가될 수 있다. 본 명세서의 방법은 배치 방법 및 연속 방법을 포함한다. 상기 방법을 실시하는 예시적인 구현예에서, 추출기 용기는 125 bar 내지 500 bar의 범위, 예컨대 25 bar 내지 100 bar, 또는 200 bar 내지 400 bar, 또는 280 bar 내지 340 bar의 범위에서 가압될 수 있다. 반응기 용기의 온도는 10℃ 내지 80℃일 수 있다. 상기 방법의 구현예에서, 제2 알칸올은 3% 내지 20% 또는 3% 내지 15%인 전체 추출 용매의 백분율(w/w)로 제공될 수 있다.
상기 기재된 방법의 단계 b)에서, 추출 용매 중 단계 b)의 제2 알칸올의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라서 구배 단계에서 복수 회로 증가될 수 있으며, 여기서 각각의 복수 회는 추가의 정해진 기간 동안 일어나고; 각각의 연속 단계에서, 알칸올 농도는 제2 알칸올의 이전 농도에 비하여, 예를 들어 1% 내지 2% 만큼 증가되며; 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하여, 이에 의해 라피네이트 폴록사머 제조물로부터 추출된 물질을 제거한다.
다른 구현예에서, LCMF 폴록사머를 정제하기 위한 방법은, a) 폴록사머 용액을 추출기 용기에 도입하며, 여기서 폴록사머는 용매에 용해되어 용액을 형성하고, 용매는 알코올, 지방족 케톤, 방향족 케톤, 아민, 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 단계; b) 상기 폴록사머 용액을 용매 및 고압 이산화탄소를 포함하는 추출 용매와 혼합하는 단계로서, 여기서 추출 용매 중 용매의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되는 단계; 및 c) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하고, 이에 의해 폴록사머로부터 추출된 물질을 제거하여 LCMF 폴록사머를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 a)의 용매는 메탄올일 수 있다. 추출 용매는 메탄올 및 이산화탄소를 포함할 수 있다. 추출된 물질은 4,500 달톤 미만의 저분자량 불순물을 포함한다. 상기 기재된 것, 및 본 명세서에 예시된 것을 포함하여, 방법은 LCMF 폴록사머, 특히 본 명세서의 개시 내용 전반에 걸쳐 기재된 것과 같은 특성을 가지는 LCMF 폴록사머를 생성할 수 있으며, 상기 폴록사머는 화학식 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체인 폴록사머를 포함하며, 여기서 a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 대략 60 중량% 내지 90 중량%이도록 하는 정수이고; a 및 a'는 동일하거나 상이하며; b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 대략 1,300 달톤 내지 2,300 달톤이도록 하는 정수이다. 생성된 폴록사머는 본 명세서에 기재된 바와 같이 LCM 물질을 가지지 않는 LCMF 폴록사머, 예컨대 폴록사머 LCMF 188이며, 여기서 LCMF 폴록사머 188은 화학식 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체이며, 여기서 a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 대략 60 중량% 내지 90 중량%이도록 하는 정수이고; a 및 a'는 동일하거나 상이하며; b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 대략 1,300 달톤 내지 2,300 달톤이도록 하는 정수이고; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 4,500 Da 미만인 저분자량 성분이며; 공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 13,000 Da 초과인 고분자량 성분이고; 공중합체의 다분산도 값은 대략 1.07 미만 또는 1.07 미만이며; 폴록사머는 LCM 물질을 포함하지 않아서, 대상체, 예컨대 인간에게 투여될 때 공중합체의 분포에서 모든 성분의 순환 반감기는 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기보다 5.0 배 이하로 더 길다. 생성된 LCMF 폴록사머, 예컨대 LCMF 폴록사머 188은 해당 LCM-함유 폴록사머, 예컨대 정제된 LCM-함유 폴록사머 188보다 더 친수성이다. 생성된 LCMF 폴록사머는 RP-HPLC에 대한 동일한 적절한 조건 하에서 평가될 때 해당 LCM-함유 폴록사머, 예컨대 본 명세서에서 예시되고 기재된 것보다 평균 tR이 더 낮고, k'가 더 낮다.
또한 생성된 폴록사머가 LCMF 폴록사머임을 확인 또는 식별하는 방법이 제공된다. 이들 방법은, 예를 들어 RP-HPLC에서 LCMF 폴록사머를 시험하는 단계 및 상기 물질을 출발 물질 및/또는 LCM을 함유하는 것으로 공지된 표준 물질과 비교하는 단계, 또는 폴록사머의 친수성을 평가하는 단계 및 이를 출발 물질 및/또는 LCM 물질을 함유하는 것으로 공지된 표준 물질과 비교하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 도면은 모든 가능한 구현이 아닌 단지 선택된 구현예의 설명의 목적을 위한 것이고, 본 개시 내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1은 폴록사머의 초임계 유체 추출(SFE)에 대한 일반 공정(100)이다.
도 2는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 폴록사머, 예컨대 폴록사머 188을 제조하기 위한 구체적인 예시적 공정(100')이다.
도 3은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 폴록사머, 예컨대 폴록사머 188을 제조하기 위한 구체적인 예시적 공정(100")이다.
도 4는 본 명세서에 제공된 방법에서 유용한 추출 장치를 나타낸다.
도 5는 용매 분포 층에서 상이한 크기의 스테인리스 구체의 횡단면의 일 구현예를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 상업적으로 입수가능한 폴록사머 188(패널 A) 대 본 명세서에서 제공되는 구현예에 따라 정제된 물질(패널 B) 중 저분자량 물질의 함량의 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 비교결과를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 시간 경과에 따른 혈장 중 성분의 분자량 분포를 도시한 확대된 HPLC-GPC 크로마토그램을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 문헌[Grindel et al. (2002), Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103]에 기재된 바와 같은 정제된 폴록사머 188의 48 시간의 연속 IV 주입 동안 및 주입 후 건강한 인간에서 폴록사머 188(패널 A) 및 고분자량 성분(패널 B)의 개별 혈장 농도를 나타낸다.
도 9는 LCMF 188이 P188보다 더 친수성임을 나타내는 (상이한 소수성/친수성의) 기타 다른 폴록사머 및 중합체에 비하여, 15% LCMF 188의 조성물의 프로파일을 15% P188(상표명 Flocor®로 입수가능함)과 비교하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 크로마토그램을 나타낸다.
도 10은 다양한 LCMF 폴록사머 188의 로트와 정제된 폴록사머 188을 비교하여 소수성에서의 차이를 확인하는 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
개요
A. 정의
B. 폴록사머, 폴록사머 188, LCM -함유 폴록사머 188 및 LCMF 폴록사머의 분자 다양성
1. 폴록사머
2. 폴록사머 188
3. 폴록사머 188의 분자 다양성
a. 저분자량 성분
b. 장기 순환 반감기를 일으키는 성분
C. 장기 순환 물질이 없는( LCMF ) 폴록사머
D. 폴록사머를 정제하기 위한 추출 방법
1. 추출 공정
a. 초임계 방법
b. 고압 방법
2. 추출 용기 및 시스템
3. 추출 및 추출용매의 제거
4. 정제된 폴록사머의 제조를 위한 예시적인 방법
a. 저분자량(LMW) 성분의 제거
b. 장기 순환 물질이 없는( LCMF ) 폴록사머의 제조
5. LCMF 폴록사머의 동일성을 확인하기 위한 방법
E. 약학 조성물 및 제형
1. 제형
2. 투여량
3. 투여량 및 투여
F. 폴록사머 188 및 LCMF P188의 방법 및 치료 용도
G. 실시예
A. 정의
다르게 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명(들)이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서의 전체 개시 내용 전반에 걸쳐 참조된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 간행물, 젠뱅크(Genbank) 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 기타 다른 공개된 자료는, 달리 언급되어 있지 않다면, 전체가 참고자료로 포함되어 있다. 본 명세서에서 용어에 대한 정의가 복수 개 존재하는 경우, 본 섹션의 정의가 우선한다. URL 또는 기타 다른 식별자 또는 주소가 언급되는 경우, 이와 같은 식별자는 변경될 수 있고 인터넷에 대한 특정 정보가 있다가 없다가 할 수 있지만, 동등한 정보를 인터넷 검색에 의해 찾을 수 있음이 이해된다. 이에 대한 참고자료는 이와 같은 정보의 가용성 및 공공 보급을 입증한다.
본 명세서에서 사용되는 폴록사머는 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 합성 블록 공중합체이다. "폴리옥시에틸렌/폴옥시프로필렌 공중합체," "PPC" 또는 "폴록사머"는 양 측면에 다음의 화학식을 가지는 폴리옥시에틸렌(POE)의 블록이 측접하는 폴리옥시프로필렌(POP)의 중앙 블록을 함유하는 블록 공중합체를 말하며,
HO(C2H4O)a ' ─[C3H6O]b─(C2H4O)aH
여기서, a' 및 a는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각은 (C2H4O)로 표현되는 친수기 부분(즉, 공중합체의 폴리옥시에틸렌 부분)이 공중합체의 대략 60 중량% 내지 90 중량%, 예컨대 공중합체의 70 중량% 내지 90 중량%를 구성하도록 하는 정수이며; b는 (C3H6O) b 로 표현되는 소수기(즉, 공중합체의 폴리옥시프로필렌 부분)가 분자량이 대략 950 달톤(Da) 내지 4,000 달톤(Da), 예컨대 약 1,200 Da 내지 3,500 Da, 예를 들어 1,200 Da 내지 2,300 Da, 1,500 Da 내지 2,100 Da, 1,400 Da 내지 2,000 Da 또는 1,700 Da 내지 1,900 Da이도록 하는 정수이다. 예를 들어, 친수기 부분의 분자량은 5,000 Da 내지 15,000 Da일 수 있다. 상기 기재된 일반 화학식을 가지는 예시적인 폴록사머는, a 또는 a'가 5 내지 150의 정수이고 b가 15 내지 75의 정수인 폴록사머, 예컨대 a가 70 내지 105의 정수이고 b가 15 내지 75의 정수인 폴록사머를 포함한다. 폴록사머는 폴록사머 188(예를 들어, 상표명 Pluronic® F-68, Flocor®, Kolliphor® 및 Lutrol®로 판매되는 것)을 포함한다.
폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체의 명명법은 이의 단량체 조성과 관련이 있다. 폴록사머 번호의 처음 두 자리의 숫자에 100을 곱한 값은 소수성 폴리옥시프로필렌 블록의 대략적인 분자량을 제공한다. 마지막 숫자에 10을 곱한 값은 친수성 폴리옥시에틸렌 함량의 대략적인 중량 백분율을 제공한다. 예를 들어, 폴록사머 188은 약 1,800　Da의 폴리옥시프로필렌 소수기를 함유하고 친수성 폴리옥시에틸렌 블록 함량이 전체 분자량의 약 80%인 중합체를 기재한다.
폴록사머는 2 단계, 즉 먼저 폴리옥시프로필렌 코어를 구축하는 단계, 그 다음 폴리옥시에틸렌을 폴리옥시프로필렌 코어의 말단에 첨가하는 단계로 합성될 수 있다. 2 가지 단계 동안 중합 속도의 변화 때문에, 폴록사머는 다양한 분자량의 이종 중합체 종을 함유할 수 있다. 중합체 종의 분포는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 표준 기법을 사용하여 특징지어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 폴록사머 188(또한 P-188 또는 P188로도 칭하여짐)은 다음의 화학식을 가지는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체를 말하며,
HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH
여기서, a' 및 a는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각은 (C2H4O)로 표현되는 친수기 부분(즉, 공중합체의 폴리옥시에틸렌 부분)이 대략 60% 내지 90%, 예컨대 대략 80% 또는 81%를 구성하도록 하는 정수이며; b는 (C3H6O)로 표현되는 소수기가 분자량이 대략 1,300 Da 내지 2,300 Da, 예컨대 1,400 Da 내지 2,000 Da, 예를 들어 대략 1,750 Da이도록 하는 정수이다. 예를 들어, a는 약 79이고 b는 대략 28이거나 28이다. 화합물의 평균 전체 분자량은 대략 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예컨대 일반적으로 8,400 Da 내지 8,800 Da, 예를 들어 약 8,400 Da 또는 8,400 Da이다. 폴록사머 188은 주로 중합체의 전체 사슬 길이가 변하는 중합체 종의 이종 분포를 포함할 수 있는 제조물이지만, 또한 불포화, 및 특정 저분자량의 글리콜을 포함하는 절단형 중합체 사슬을 포함한다. 폴록사머 188 중에는 양측에 저분자량(LMW) 중합체 종 및 고분자량(HMW) 중합체 종을 나타내는 주요 피크 및 "어깨" 피크를 포함하는 종 프로파일(예를 들어, GPC에 의해 결정됨)을 나타내는 것이 포함된다. 폴록사머 188은 또한 정제되어 주요 성분 이외의 종을 제거하거나 감소시킨 물질을 말한다.
폴록사머 188 제조물과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "주요 성분" 또는 "주요 피크"는 분자량이 약 13,000 Da 미만이고 약 4,500 Da 초과이며, 평균 분자량이 약 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예컨대 일반적으로 8,400 Da 내지 8,800 Da, 예를 들어 약 8,400 Da 또는 8,400 Da인 공중합체 분자의 종을 말한다. 주요 피크 종은 크로마토그래피 조건에 따라서 14 분 내지 15 분 사이에서 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 용리되는 것을 포함한다(미국 특허 번호 5,696,298 참조).
폴록사머 188 제조물의 종 또는 성분과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "저분자량" 또는 "LMW"는 분자량이 일반적으로 4,500 Da 미만인 성분을 말한다. LMW 종은 크로마토그래피 조건에 따라서 15 분 후에 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 용리되는 것을 포함한다. (미국 특허 번호 5,696,298 참조). 이와 같은 불순물은 저분자량 폴록사머, 폴록사머 분해 생성물(알코올, 알데히드, 케톤, 및 하이드로퍼옥사이드를 포함함), 이중블록 공중합체, 불포화 중합체, 및 올리고머 글리콜(올리고(에틸렌 글리콜) 및 올리고(프로필렌 글리콜)을 포함함)을 포함할 수 있다.
폴록사머 188 제조물의 종 또는 성분과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "고분자량" 또는 "HMW"는 분자량이 일반적으로 13,000 Da 초과, 예컨대 14,000 Da 초과, 15,000 Da 초과, 16,000 Da 초과, 또는 그 이상인 성분을 말한다. HMW 종은 크로마토그래피 조건에 따라서 13 분 내지 14 분 사이에서 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 용리되는 것을 포함한다(미국 특허 번호 5,696,298 참조).
본 명세서에서 사용되는 "다분산도" 또는 "D"는 중합체 조성의 분자량 분포의 폭을 말한다. 단분산 샘플은 모든 분자가 동일한 것으로 정의된다. 이와 같은 경우에, 다분산도(Mw/Mn)는 1이다. 좁은 분자량 표준 물질은 D 값이 1 근처이고, 통상적인 중합체는 2 내지 5의 범위이다. 일부 중합체는 다분산도가 20을 초과한다. 따라서, 높은 다분산도 값은 주어진 제조물 중 분자 집단에 대하여 크기의 폭넓은 변화를 나타내는 반면, 더 낮은 다분산도 값은 더 적은 변화를 나타낸다. 다분산도를 평가하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 5,696,298에 기재된 바와 같은 방법을 포함한다. 예를 들어, 다분산도는 크로마토그램으로부터 결정될 수 있다. 다분산도 값은 이용되는 특정 크로마토그램 조건, 분자량 표준물질 및 겔 투과 컬럼의 크기 배제 특징에 따라서 다를 수 있음이 이해된다. 본 명세서의 목적을 위하여, 다분산도에 대한 언급은 미국 특허 번호 5,696,298에서 이용된 바와 같이, 컬럼 히터 모듈이 장착된 모델 600E Powerline 크로마토그래피 시스템, Model 410 시차 굴절 검출기, Maxima 820 소프트웨어 패키지(이들 모두 Millipore의 Waters, Div. 제품, 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재), 연속된 2 개의 LiChrogel PS-40 컬럼 및 LiChrogel PS-20 컬럼(EM Science 제품, 미국 뉴저지주 깁스타운 소재), 및 폴리에틸렌 글리콜 분자량 표준물질(Polymer Laboratories, Inc. 제품, 미국 매사추세츠주 애머스트 소재)을 사용하여 얻어진 크로마토그램으로부터 결정된 것이다. 상이한 분리 방법을 사용하여 얻은 임의의 다분산도 값을, 단순히 2 가지 시스템에서 단일 샘플을 실행한 다음, 각각의 크로마토그램으로부터 다분산도 값을 비교함으로써 본 명세서에 기재된 값으로 전환하는 것은 당업자의 수준 이내에 있다.
본 명세서에서 사용되는 "정제된 폴록사머 188" 또는 "P188-P" 또는 "정제된 장기 순환 물질(LCM)-함유 폴록사머 188"은 폴록사머의 다분산도 값이 1.07 미만 또는 약 1.07, 예컨대 1.05 이하, 또는 1.03 이하인 폴록사머 188을 말하며, 감소된 양의 저분자량 성분을 가지지만, 더 오래 순환하는 물질을 함유하는 정제된 폴록사머 188이다. "저분자량 물질이 제거"되었거나 "저분자량 물질이 감소"된 폴록사머 188, 또는 이의 유사한 변형어는 저분자량 성분의 분포가 성분의 전체 분포의 3.0% 이하 또는 미만, 일반적으로 2.0% 이하 또는 미만, 또는 1.5% 이하 또는 미만인 정제된 폴록사머 188을 말한다. 통상적으로, 이와 같은 폴록사머 188은 더 높거나 많은 백분율의 저분자량 성분을 함유하는 폴록사머 188의 형태에 비하여 독성의 감소를 나타낸다. 폴록사머 188은 정제되어 저분자량 성분을 제거하거나 감소시킨다. 폴록사머의 상업적으로 입수가능한 종래의 제조물, 예컨대 폴록사머 188은, 인간에게 투여될 때 반감기가 공중합체의 분포에서 주요 성분의 순환 반감기의 5.0 배 초과인 장기 순환 물질(LCM)을 가진다.
예시적인 정제된 LCM-함유 폴록사머 188은 상표명 FLOCOR®로 입수가능한 폴록사머 188이다(또한 LCM-함유 폴록사머 188을 설명하는 미국 특허 번호 5,696,298을 참조). 정제된 LCM-함유 폴록사머 188이 포유동물, 특히 인간에게 정맥 주사로 투여될 때, 처리된 대상체로부터 얻어진 혈액의 GPC 분석결과는 2 개의 순환 피크, 즉 중합체 분포의 주요 성분을 포함하는 주요 피크로 지정된 피크, 및 주요 피크에 비하여 순환으로부터 실질적으로 더 느린 속도의 소거(clearance)(본 명세서에 나타낸 바와 같이, 주요 피크보다 5 배 초과로 더 느리며, 통상적으로 30 시간 초과, 70 시간 정도), 즉 장기 순환 물질(LCM)을 나타내는 더 높은 분자량의 피크를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 장기 순환 물질(LCM)은 대상체에게 투여시 대상체, 예컨대 인간에서 폴록사머 제조물의 주요 성분의 반감기보다 실질적으로 더 긴 반감기를 가지는 종래 폴록사머 제조물 중 물질을 말한다. 인간 대상체에게 투여될 때, 폴록사머 제조물 중 LCM 물질은 폴록사머 제조물의 주요 성분의 약 5 배 초과 또는 5 배 초과의 반감기를 가진다. 본 명세서에서 제공되는 LCMF 폴록사머는 이와 같은 더 오래 순환하는 물질이 생기게 하지 않는다. 주요 성분보다 5 배 더 긴 반감기를 가지는 성분은 없다. 폴록사머의 비교를 위하여, 해당 폴록사머의 성분이 비교되며, 여기서 해당 폴록사머는 동일한 화학식을 가진다. 예를 들어, LCMF 폴록사머 188은 폴록사머 188과 비교된다.
폴록사머 188과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "장기 순환 물질이 없는" 또는 "LCMF"는 정제된 폴록사머 188에 대하여 상기 기재된 바와 같은, 감소된 양의 저분자량 성분을 가지고, 대상체에의 정맥내 투여 후 중합체 분포의 성분이 보다 균일한 방식으로 순환으로부터 소거되어 임의의 장기 순환 물질이 주요 피크의 순환 반감기(t1/2 )보다 5 배 이하로 더 긴 반감기(인간 대상체에서)를 나타내는 정제된 폴록사머 188 제조물을 말한다. 따라서, LCMF는 본 명세서에 기재된 바와 같은 고분자량 성분 또는 저분자량 성분과 같은 성분을 함유하지 않고, 인간 대상체에게 투여될 때, 주요 성분의 t1/2보다 5.0 배 초과로 더 크고, 일반적으로 공중합체 분포에서 주요 성분의 반감기보다 4.0 배, 3.0 배, 2.0 배 또는 1.5 배 이하로 더 큰 t1/2을 가지는 순환 물질이거나 이러한 순환 물질이 생기게 하는 폴록사머 188이다. 통상적으로, LCMF 폴록사머는 중합체 분포의 모든 성분이 보다 균일한 속도로 순환에서 소거되는 폴록사머이다.
본 명세서에서 사용되는 "공중합체의 분포"는 폴록사머 제조물 중 중합체 분자의 분자량 분포를 말한다. 분자 질량의 분포는 총괄성 측정, 빛 산란 기법, 점도측정 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는, 당업자에게 공지된 다양한 기법에 의해 결정될 수 있다. 특히, 중합체의 유체 역학 부피를 기초로 한 분자량 분포를 결정하는 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 방법이 이용될 수 있다. 중합체의 분자량 또는 질량 분포는 다분산도에 의해 요약될 수 있다. 예를 들어, 폴록사머의 분자량 분포의 차이가 클수록, 다분산도는 더 높다.
본 명세서에서 사용되는 반감기, 생물학적 반감기, 혈장 반감기, 최종 반감기, 제거 반감기 또는 t1/ 2은 생체가 정상적인 제거 경로를 통하여 투여된 물질 양의 절반을 제거하는 데 필요한 시간을 말한다. 정상적인 제거 경로는 일반적으로, 신체로부터 물질을 제거하는 배설 기능에 추가적으로, 신장 및 간의 기능을 통한 신체의 정화를 포함한다. 반감기는 물질의 혈장 농도가 정상 상태 수준의 반이 되는 시간, 즉 혈장 반감기로 설명될 수 있다. 반감기는, 보통 정맥내로 약의 단일 용량을 제공함으로써 결정될 수 있으며, 그 다음 혈장 중 약물의 농도는 정기적인 간격으로 측정된다. 약물의 농도는 혈장에서 최고 값에 도달할 것이며, 약물이 분해되어 혈액으로부터 소거됨에 따라 떨어질 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "Cmax"는 투여 후 약물의 최고 또는 최대 혈장 농도를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "정상 상태의 약물 농도" 또는 "Css"는 약물 제거 및 약물 투여 속도가 동등한 약물의 농도를 말한다. 이는 일반적으로 균등한 간격으로 주어지는 동등한 용량의 무한수의 마지막 후에 달성된다. 정상 상태 농도를 달성하는 데 필요한 시간은 약물의 반감기에 따라 다르다. 반감기가 더 짧을수록, 정상 상태에 더 신속하게 도달한다. 통상적으로 최종 정상 상태 농도의 90% 초과로 축적되는 데 3 내지 5 반감기가 걸린다.
본 명세서에서 사용되는 "불순물"은 폴록사머 제조물 중 원치않는 성분을 말한다. 통상적으로 불순물은 4,500 달톤 미만의 LMW 성분 및 13,000 달톤 초과의 고분자량 성분을 포함한다.
제조물 중 폴록사머 성분과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "제거한다 또는 감소시킨다"는 성분의 초기 백분율에 비하여 폴록사머 제조물 중 성분의 중량 백분율이 줄어든 것을 말한다. 일반적으로, 성분의 전체 분포에 대한 성분의 중량 백분율이 적어도 1% 만큼, 통상적으로는 적어도 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 그 이상 감소되는 경우, 폴록사머 성분은 제거 또는 감소된다. 예를 들어, 폴록사머 188의 대부분의 상업적 제조물은 분포 중 전체 성분의 약 4 중량%인 LMW 성분(4,500 달톤 미만)을 함유한다. 성분의 3 중량% 미만, 예컨대 2% 또는 1% 미만으로 있다면, 정제된 생성물 중 LMW 성분은 감소된다.
본 명세서에서 사용되는 "용매"는 용질이 용해되어 용액을 형성하는 임의의 액체를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "극성 용매"는 분자 내에 양전하 및 음전하의 영구적인 분리가 있거나, 양전하 및 음전하의 중심이 일치하지 않는 용매를 말한다. 이들 용매는 높은 유전 상수를 가지며, 화학적으로 활성적이고, 배위 공유 결합을 형성한다. 극성 용매의 예는 알코올 및 케톤이다.
본 명세서에서 사용되는 "공급물"은 용매에 용해된 용질을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "추출 용매"는 폴록사머 제조물에 함유된 바람직하지 않은 물질을 가용화시키는 데 사용될 수 있는 임의의 액체 또는 초임계 유체를 말한다. 이는 가용성의 변화에 기초하여 물질을 하나 이상의 기타 다른 물질과 분리하기 위한 용매 추출을 이행할 수 있는 용매이다. 일반적으로 추출 용매는 관심이 있는 물질이 용해되는 용매와 비혼화성 또는 부분적 혼화성이다. 예를 들어, 추출 용매는 관심이 있는 물질이 용해되는 제1 용매와 혼합하지 않거나 단지 부분적으로 혼합하는 것이어서, 그대로 두면 2 개의 분리된 층이 형성된다. 예시적인 추출 용매는 초임계 액체 또는 고압 액체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초임계 액체" 및 "초임계 유체"는 임계 온도(Tc; 즉 화합물의 특징적인 온도로서, 상기 온도 초과에서는 화합물을 액화시킬 수 없음) 및 임계 압력(pc; 즉 화합물의 임계 온도에서 화합물을 액화시키는 데 충분할 최소 압력) 초과의 상태인 임의의 화합물, 예컨대 기체를 포함한다. 이 상태에서, 별개의 액체상 및 기체상은 통상적으로 존재하지 않는다. 초임계 액체는 통상적으로 압력, 온도, 또는 동시개질제(co-modifier) 용매의 존재에 있어서의 작은 변화로 용매 밀도의 변화를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "초임계 이산화탄소"는 임계 온도(약 31℃) 및 임계 압력(약 74 bar)에서 또는 임계 온도 및 임계 압력 초과에서 유지되는 이산화탄소의 유체 상태를 말한다. 이산화탄소의 임계 온도 및 임계 압력 미만에서, 이산화탄소는 보통 공기 중 기체로서, 또는 냉동될 경우 고체인 드라이아이스처럼 거동한다. 31℃ 초과인 온도 및 74 bar 초과의 압력에서, 이산화탄소는 기체와 액체 사이의 중간 특성을 취하므로, 기체처럼 팽창하여 용기를 채우지만 액체와 같은 밀도를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 "임계 온도" 또는 "임계점"은 증기-액체 임계점을 의미하는 온도를 말하며, 상기 온도 초과에서 별개의 액체상 및 기체상은 존재하지 않는다. 따라서, 이는 어느 정도의 압력이 적용되더라도 물질의 증기가 액화될 수 없는 온도 및 상기 온도 초과의 온도이다. 예를 들어, 이산화탄소의 임계 온도는 약 31℃이다.
본 명세서에서 사용되는 "임계 압력"은 임계 온도에서 기체를 액화시키는 데 필요한 압력을 말한다. 예를 들어, 이산화탄소의 임계 압력은 약 74 bar이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "고압 액체"는 실온 또는 그보다 높은 온도에서 압축성 기체를 액체로 가압함으로써 형성되는 액체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "동시개질제 용매"는 추출 용매(예를 들어, 초임계 유체 이산화탄소)의 용매 강도를 증가시키는 극성 유기 용매를 말한다. 이는 용질과 강하게 상호작용하고, 이에 의하여 실질적으로 추출 용매 중 용질의 가용성을 증가시킬 수 있다. 동시개질제 용매의 예는 알칸올을 포함한다. 통상적으로 5 중량% 내지 15 중량%의 동시개질제 용매가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알칸올"은 단순 지방족 유기 알코올을 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 것으로 의도된 알코올은 6 개 이하의 탄소 원자를 포함한다(즉, C1-C6 알칸올). 알칸올의 알칸 부분은 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 알칸올의 예는 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올(2-프로판올), 및 tert-부틸 알코올을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "초임계 추출"은 보통 정상적인 온도 및 압력에서 기체이지만, 더 높은 압력 및 더 낮은 온도에서 액체로 변환되는 유체 물질을 사용하는 공정을 말한다. 그 다음 압력 또는 온도는 정상화되고, 추출한 물질은 증발되어 추출물을 남긴다. 추출용매는 재사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "추출 용기" 또는 "추출기"는 최대 10,000 psig의 압력 및 최대 200℃의 온도를 견딜 수 있는 고압 용기를 말한다. 용기의 부피는 2 mL 내지 200 L의 범위일 수 있고, 일반적으로는 1 L 내지 200 L, 예컨대 5 L 내지 150 L이다. 추출 용기는 일반적으로 스테인리스강으로 만들어진다. 이와 같은 장치는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다.
본 명세서에서 사용되는 "등용매"는 추출 용매가 일정하거나 거의 일정한 농도로 사용되는 시스템을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "구배" 또는 "구배 단계"는 통상적으로 하나 이상의 성분의 농도에서의 변화에 의해, 성분의 조성이 상이한 2 가지 이상의 추출 용매가 사용되는 시스템을 말한다. 예를 들어, 알칸올 용매(예를 들어, 메탄올)의 농도는 추출 동안 연속적으로 증가된다. 따라서, 추출 용매는 일정하게 유지되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "복수"는 공정 또는 단계의 반복 횟수를 말한다. 반복 횟수는 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회 또는 그 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "추출된 물질"은 제거된 물질을 함유하는 생성물을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "라피네이트"는 성분 또는 성분들이 제거된 생성물을 말한다. 예를 들어, 정제된 폴록사머는 추출된 물질이 제거된 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "배치 방법" 또는 "배치 추출"은 평형에 도달할 때까지 2 개의 층을 흔들고, 그 후에 층이 샘플링 전에 침전되도록 함으로써 하나의 비혼화성 층으로부터 용질을 추출하는 공정을 말한다. 예를 들어, 배치 추출은 용질을 추출 용매의 배치와 혼합함으로써 실행될 수 있다. 용질은 2 개의 상 사이에 분포한다. 일단 평형이 이루어지면, 혼합을 중단하고, 추출물과 라피네이트 상을 분리시킨다. 이 방법에서, 사용된 용매는 증류에 의해 스트리핑되고 재순환될 수 있거나 새로운 용매가 저장소로부터 연속적으로 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "연속 방법" 또는 "연속 추출"은 용액 또는 2 가지 상의 연속적인 역류를 통한 비혼화성 용매의 연속 흐름이 있는 공정을 말한다. 예를 들어, 연속 추출 용매는 용질과 혼합된다. 혼합기에서 생성된 에멀젼은 상 분리가 일어나는 침강기 유닛으로 공급되고, 연속적인 라피네이트 및 추출물 스트림이 얻어진다.
본 명세서에서 사용되는 "약학 조성물"은 본 명세서에 기재된 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체를 포함하는 조성물, 예컨대 약학적으로 허용가능한 제형으로서 제형화되고/제형화되거나 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 LCMF 폴록사머를 포함한다. 특정 예에서, 약학 조성물은 적합한 완충제를 이용하여, 원하는 pH, 예컨대 6 내지 7, 또는 6, 또는 약 6으로 완충된 폴록사머의 주사가능한 수용액을 포함한다. 예시적인 완충제로는 생체적합성인 것으로 당업자에게 공지된 임의의 것, 예를 들어 시트르산나트륨/시트르산을 포함하여, 예컨대 시트르산염이 있다. 적합한 농도는 경험적으로 결정될 수 있으나, 통상적으로 등장액, 예컨대 식염수 중 0.005 M 내지 0.05 M, 특히 약 0.01 M의 범위이다. 특정 예에서, 폴록사머를 제형화하기 위한 본 명세서의 방법에서 유용한 약학 조성물은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 94/008596 및 여기에 기재된 기타 다른 참조문헌 및 간행물을 참조).
본 명세서에서 사용되는 "치료"는 질환 또는 병태와 연관된 증상을 완화 또는 감소시키는 것을 말한다. 치료는 병태, 장애 또는 질환의 증상이 완화되거나 다른 방식으로 유익하게 변경되는 임의의 방식을 의미한다. 따라서 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포괄한다. 치료는 또한 본 명세서의 조성물의 임의의 약학적 사용을 포괄한다.
본 명세서에서 사용되는, 질환 또는 병태가 있는 대상체를 "치료하는 것"은 본 명세서에서 제공되거나 기재된 조성물 또는 기타 다른 제품을 대상체에게 투여하고 이에 의하여 질환 또는 병태의 치료를 이행하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 치료에 의한, 예컨대 약학 조성물 또는 기타 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 완화는, 상기 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 상기 투여와 연관될 수 있는 증상의 영구적 또는 일시적이든, 지속적 또는 순간적이든 임의의 경감을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "방지" 또는 "예방"은 질환 또는 병태를 발전시킬 위험이 감소되는 방법을 말한다. 예방은 질환 또는 병태를 발전시킬 위험에서의 감소 및/또는 질환의 증상의 악화 또는 진행의 방지, 또는 질환의 증상의 악화 또는 진행의 위험의 감소를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 특정 질환을 치료하기 위한 화합물 또는 조성물의 "유효량"은 원하는 생리학적 효과를 달성하기 위해 증상을 완화시키거나 어떤 방식으로 감소시키기에 충분한 양이다. 이와 같은 양은 효과적인 단일 투여량으로 투여될 수 있거나 치료요법에 따라서 투여될 수 있다. 유효량은 일상적인 절차에 따라서 당업자에 의해 용이하게 결정되며, 조성물이 투여되는 특정 징후에 따라 다르다.
본 명세서에서 사용되는 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은 적어도 치료 효과를 발생시키는 데 충분한 제제, 화합물, 물질, 또는 화합물을 함유하는 조성물을 말한다. 유효량은 특정 질환 또는 장애를 치료, 예컨대 예방, 치유, 완화, 정지 또는 다르게는 치료하는 데 충분한 치료제의 양이다.
본 명세서에서 사용되는 "질환" 또는 "장애"는 감염, 후천적 병태, 및 유전 병태를 포함하지만 이로 제한되지는 않는 원인 또는 병태에 기인하며, 식별가능한 증상에 의해 특징지어지는 유기체 내 병리학적 병태를 말한다. 본 명세서에서 관심이 있는 질환 및 장애는 막 재봉합 및 복구를 필요로 하는 임의의 것, 조직 허혈 및 재관류 손상, 염증성 장애의 감소, 혈전용해 관련 장애, 및 지혈 관련 장애를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 질환 및 장애는 급성 심근경색증, 급성 하지 허혈, 쇼크, 급성 뇌졸중, 심부전, 겸상적혈구빈혈, 신경퇴행성 질환, 황반변성, 당뇨망막병증 및 울혈성 심부전을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "대상체"는 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 기타 다른 농장 동물, 동물원 동물 및 애완동물을 포함하여, 동물, 특히 인간 또는 가축을 말한다. 따라서, 치료될 "환자" 또는 "대상체"는 포유동물을 포함하여, 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 포유동물은 영장류, 예컨대 인간, 침팬지, 고릴라 및 원숭이; 가축, 예컨대 개, 말, 고양이, 돼지, 염소, 소; 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 게르빌루스쥐를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "조합"은 둘 또는 그 이상의 항목 중에서의 임의의 연관을 말한다. 연관은 키트와 같이 공간적일 수 있거나, 공통된 목적을 위하여 2 이상의 항목의 사용을 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "조성물"은 2 이상의 생성물 또는 화합물(예를 들어, 제제, 조절인자, 조절제 등)의 임의의 혼합물을 말한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성 또는 비수성 제형 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "제조품"은 제조되어 판매되는 제품이다. 이 용어는 포장 물품에 함유된 정제된 폴록사머를 포괄하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 유체는 유동할 수 있는 임의의 조성물을 말한다. 따라서 유체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 기타 다른 이와 같은 조성물의 형태인 조성물을 포괄한다.
본원에서 사용되는 "키트"는 조합 요소를 사용하여 방법을 실시하기 위하여 선택적으로 시약 및 기타 다른 생성물 및/또는 성분을 포함하는 포장된 조합물을 말한다. 예를 들어, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 특성의 평가를 포함하지만 이로 제한되지는 않는 목적을 위하여 본 명세서에서 제공되는 정제된 폴록사머 및 도 다른 물품을 함유하는 키트가 제공된다. 키트는 선택적으로 사용 지침을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 동물은 임의의 동물, 예컨대 영장류(인간, 고릴라 및 원숭이를 포함함); 설치류(예컨대, 마우스 및 래트); 가금류(예컨대, 닭); 반추동물(예컨대, 염소, 소, 사슴, 양); 오바인(ovine)(예컨대, 돼지 및 기타 다른 동물)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 비인간 동물은 고려하는 동물로서 인간을 제외한다.
본 명세서에서 사용되는 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 범위 및 양은 특정 값 또는 범위에 대해 "약" 또는 "대략"으로 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 0.05 mg/mL"은 "약 0.05 mg/mL" 및 또한 "0.05 mg/mL"를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기재되는 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않음을 의미하며, 상기 기재는 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 기는 기가 치환되지 않거나 치환된 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "보유 시간" 또는 "t R "은 샘플, 예컨대 LCMF 폴록사머 188 샘플을 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 위한 역상 컬럼 상에 주입한 때와 증기화 광산란 검출기에 의한 피크 반응 사이의 경과된 시간을 의미한다. 덜 소수성인 샘플에 비하여 더 소수성인 샘플에 있어서 보유 시간이 더 길다.
본 명세서에서 사용되는 "용량 인자" 또는 k´는 다음의 등식에 의해 결정되며, 식에서 t 0 는 공극 시간 또는 비보유 물질이 역상 HPLC 컬럼을 통과하는 시간과 동일하다(하기 실시예 7 참조):
Figure 112017012374582-pct00001
LCM-함유 정제된 폴록사머 188, 예컨대 상표명 FLOCOR®로 판매되는 폴록사머는 평균 보유 시간(tR)이 9.883이고 k'가 3.697인 반면; LCMF 폴록사머 188은 평균 보유 시간(tR)이 8.897이고 평균 k'가 3.202이다(실시예 7 참조).
본 명세서에서 사용되는, 임의의 보호기, 아미노산 및 기타 다른 화합물에 대한 약어는 달리 지시되지 않는 한, 통상적인 용법, 인정된 약어, 또는 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)와 일치한다(문헌[(1972) Biochem. 11:1726] 참조).
B. 폴록사머, 폴록사머 188, LCM -함유 폴록사머 188 및 LCMF 폴록사머의 분자 다양성
1. 폴록사머
폴록사머는, 폴리옥시에틸렌(EO 또는 POE)의 반복 단위의 사슬이 측접된 폴리옥시프로필렌(PO 또는 POP)의 반복 단위의 코어로 구성되는 합성의 선형 트리블록 공중합체의 패밀리이다. 모든 폴록사머는 이러한 EO-PO-EO 구조 모티프로 정의된다. 특정 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)는 반복 EO 및 PO 단위의 수에 의해 추가로 정의되며, 이는 상이한 화학적 및 물리적 특징뿐만 아니라 특유한 약력학적 특성을 가지는 특정 폴록사머를 제공한다.
폴록사머 188을 포함하여 특정 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체는 인간 또는 동물에게 투여될 때 여러 가지 장애에 대하여 유익한 생물학적 효과를 나타낸다. 이러한 활성은, 예를 들어 다수의 간행물 및 특허(예를 들어, 미국 특허 번호 4,801,452, 4,837,014, 4,873,083, 4,879,109, 4,897,263, 4,937,070, 4,997,644, 5,017,370, 5,028,599, 5,030,448, 5,032,394, 5,039,520, 5,041,288, 5,047,236, 5,064,643, 5,071,649, 5,078,995, 5,080,894, 5,089,260, RE 36,665(5,523,492의 재공고), 5,605,687, 5,696,298, 6,359,014, 6,747,064, 8,372,387, 8,580,245, 미국 특허 공개 번호 2011/0044935, 2011/0212047, 2013/0177524, 및 국제 출원 WO2006/037031(PCT/US2005/034790으로 출원됨), WO2009/023177(PCT/US2005/037157로 출원됨) 및 WO2006/091941(PCT/US2006/006862로 출원됨), 및 PCT/US2014/45627, 미국 가출원 일련 번호 62/021,691 및 62/021,676 참조)에 기재된 바 있다. 치료제로서 유용하게 만드는 폴록사머, 예컨대 폴록사머 188의 활성 중에는, 세포막에 통합되고, 이에 의하여 손상된 세포막을 복구하는 능력이 있다.
폴록사머는 다음의 화학식을 가지는 POP/POE 블록 공중합체를 포함하며,
HO(C2H4O)a'─(C3H6O)b─(C2H4O)aH
여기서 "a'" 및 "a"는 동일하거나 상이할 수 있고 각각은 C2H4O로 표현되는 친수기 부분이 화합물의 대략 50 중량% 내지 95 중량%, 예컨대 화합물의 60 중량% 내지 90 중량%, 예를 들어 70 중량% 내지 90 중량%를 구성하도록 하는 정수이며; b는 C3H6O로 표현되는 소수기의 분자량이 대략 950 Da 내지 4,000 Da, 예컨대 1,200 Da 내지 3,500 Da이도록 하는 정수이다. 예를 들어, 소수기는 분자량이 1,200 Da 내지 2,300 Da, 예컨대 일반적으로 1,500 Da 내지 2,100 Da이다. 공중합체의 평균 분자량은 5,000 Da 내지 15,000 Da, 예컨대 5,000 Da 내지 12,000 Da, 예를 들어 5,000 Da 내지 9,000 Da이다.
특정 예에서, b는 약 15 내지 약 70, 예컨대 약 15 내지 약 60, 또는 약 15 내지 약 30의 정수, 또는 이 사이 숫자의 임의의 것이다. 일부 예에서, b는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30이다. 특정 양태에서, 아래 첨자 "a'" 및 "a"가 있는 측접 단위에 있어서의 정수는 상이할 수 있거나 동일한 값이다. 일부 예에서, a 또는 a'는 약 45 내지 약 910, 예컨대 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900의 정수이다. 일부 다른 예에서, a 또는 a'는 약 10 내지 약 215, 예컨대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 125, 150, 175, 200 또는 215의 정수이다. 또 다른 예에서, a 또는 a'는 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 70이다. 당업자는 이들 값이 평균 값인 것을 인식할 것이다. a', a 및 b에 대한 값은 평균을 나타내고; 일반적으로 중합체 분자는 분자의 분포 또는 집단이다. 그러므로, 집단 내 a, a' 및 b의 실제 값은 값의 범위를 구성한다.
폴록사머의 명명법은 다양한 중합체 막의 조성과 관련이 있다. 폴록사머 번호의 처음 두 자리의 숫자에 100을 곱한 값은 소수기의 대략적인 분자량을 제공한다. 마지막 숫자에 10을 곱한 값은 계면활성제의 친수기(폴리옥시에틸렌) 함량의 대략적인 중량 백분율을 제공한다. 예를 들어, 폴록사머 407은 약 4,000 Da의 폴리옥시프로필렌 소수기를 함유하고 폴리옥시에틸렌 친수기가 전체 분자량의 약 70%를 차지하는 중합체를 기재한다. 폴록사머 188(P188)은 분자량이 약 1,800 Da인 소수기를 가지고 공중합체의 전체 분자량의 약 80%인 친수기를 가진다.
폴록사머는 ADEKA NOL, SynperonicTM, Pluronic® 및 Lutrol®을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는, 상품명 및 상표명으로 판매되며 이들로 지칭된다. 예시적인 폴록사머는 폴록사머 188(P188; 상표명 Pluronic® F-68, Kolliphor® P 188으로 판매됨, 80% POE), 폴록사머 407(P407; 상표명 Lutrol F-127, Kolliphor® P 188, Pluronic® F-127로 판매됨; 70% POE), 폴록사머 237(P237; 상표명 Pluronic® F87, Kolliphor® P 237로 판매됨; 70% POE), 폴록사머 338(P338; 상표명 Kolliphor® P 338, Pluronic® F-108로 판매됨; 80% POE) 및 폴록사머 331(Pluronic® L101; 10% POE)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
따라서, 비정제된 P188은 상기 기재된 바와 같은 다양한 명칭으로 상업적으로 입수가능하거나 공지되어 있다. 본 명세서의 방법을 사용하는 하기 참조문헌의 논의는 보다 균질한 (LCMF) 폴록사머 188을 생성하지만, 본 명세서의 방법은 공지된 폴록사머 중 임의의 것의 보다 균질한 제조물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
폴록사머는 표준 중합체 합성 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 폴록사머는 당업자에게 공지된 표준 기법을 사용하여 에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드 축합에 의해 형성된다(예를 들어, 미국 특허 번호 RE 36,665, RE 37,285, RE 38,558, 6,747,064, 6,761,824 및 6,977,045 참조; 또한 문헌[Reeve, L.E., The Poloxamers: Their Chemistry and Medical Applications, in Handbook of Biodegradable Polymers, Domb, A.J. et al. (eds.), Hardwood Academic Publishers, 1997] 참조). 폴록사머는 알칼리성 촉매, 예컨대 수산화나트륨 또는 수산화칼륨의 존재 하에서 POP 및 POE 모노머의 순차적인 첨가에 의해 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Schmolka, J. Am. Oil Chem. Soc. 54 (1977) 110-116] 참조). 반응은 POP 블록의 중합화에 의해 개시된 다음, POP 블록의 양 말단에서 POE 사슬의 성장이 일어난다. 중합체를 합성하는 방법은 또한 미국 특허 번호 5,696,298에 기재되어 있다.
2. 폴록사머 188
폴록사머 188(P188) 공중합체는 다음의 화학식을 가지며,
HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH
여기서 C3H6O로 표현되는 소수기의 분자량이 대략 1,750 달톤이고 폴록사머 188은 평균 분자량이 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예컨대 일반적으로 대략 8,400 달톤 내지 8,800 달톤이다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 중량 비율은 대략 4:2:4이다. 명세서에 따르면, P188은 옥시에틸렌의 중량 백분율이 81.8±1.9%이고, 불포화 수준이 0.026±0.008 mEq/g이다.
다양한 폴록사머, 특히 P188은 유착성의 소수성 단백질 또는 손상된 막의 존재로 인한 손상에 의하여 혈류에 대한 저항성이 병리학적으로 증가된 질환 및 병태의 치료에 사용된다. 이러한 유착은 병리학적 소수성 상호작용에 의해 생성되며, 특정 리간드와 이들의 수용체의 상호결합을 필요로 하지 않는다. 이와 같은 단백질 및/또는 손상된 막은 혈관의 유효 반경을 감소시키고 마찰을 증가시킴으로써 미소혈관계에서 저항성을 증가시킨다. 예를 들어, 폴록사머 188은 손상된 조직을 통한 혈류를 증가시키는 윤활제로서 작용한다고 여겨진다. 유리하게, 이는 소수성 표면끼리의 유착을 차단하고, 이에 의하여 마찰을 감소시키고 유동을 증가시킨다.
P188은 손상된 세포와 변성된 단백질에서 발전된 소수성 영역에 결합하고, 이에 의하여 수화 격자를 회복시킨다. 이와 같은 결합은 손상된 막의 봉합을 용이하게 하고, 세포를 파괴할 수 있는 염증 매개 인자의 캐스케이드를 중단시킨다. 이러한 중합체는 또한 혈액에서 형성된 요소의 유해한 응집을 야기하는 소수성의 유착 상호작용을 억제한다. P188의 유착방지 및 항염증 효과는 마찰을 감소시키고, 혈액에서 형성된 요소의 유착 및 응집을 방지하며, 적혈구의 변형성, 혈소판 및 과립구의 비유착성 및 혈액의 정상 점도를 유지하고, 아포토시스를 감소시킴으로써, 그리고 VEGF, 다양한 케모카인, 및 인터루킨을 포함한 다수의 염증 마커에 의해 손상된 조직 중 혈류를 향상시킴으로써 나타낸다.
3. 폴록사머 188의 분자 다양성
상업적으로 입수가능한 폴록사머 188 제조물은 분자량이 대략 8,400 달톤인 것으로 명시되어 있다. 그러나, 이와 같은 폴록사머 188은 분자량이 3,000 달톤 미만 내지 20,000 달톤 초과인 분자로 구성된다. 상업적인 폴록사머 188의 분자의 분자 다양성 및 분포는 겔 투과 크로마토그래피를 사용하여 검출되는 넓은 1차 및 2차 피크에서 볼 수 있다(예를 들어, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 94/08596 참조).
구조에서의 다양성은 생물학적 활성에 다양성이 있음을 의미한다. 예를 들어, 최적의 유변학적, 세포보호, 유착방지 및 항혈전 효과가 대략 8,400 달톤 내지 9,400 달톤인 P188 분자를 이용하여 관찰된다. 이와 같은 성분은 크기에 기초하여 성분을 분리하는 방법, 예컨대 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 사용하여 폴록사머 제조물 중 주요 또는 지배적인 성분으로서 확인될 수 있다. 그러나, 성분의 분포는 또한 통상적으로 저분자량(LMW, 즉 일반적으로 4,500 달톤 미만) 또는 고분자량(HMW, 즉 일반적으로 13,000 달톤 초과) 성분의 더 작은 분획을 나타낸다. 15,000 달톤 초과 그리고 4,500 달톤 미만의 P188 성분은 덜 효과적인 유변학적 또는 세포보호 제제이며, 원치않는 부작용을 나타낸다. 폴록사머 제조물, 예컨대 P188 제조물 중 기타 다른 물질 또는 성분은 2 가지 상이한 공급원, 즉 합성 및 분해로부터 기원한다.
분자 다양성에 기여하는 1차 메커니즘은 폴록사머가 합성되는 공정이다. 통상적인 제조 공정 동안, 제1 단계는 POP 블록을 형성하는 것이다. POP 블록은 프로필렌 글리콜 개시제와 프로필렌 옥사이드 모노머를 반응시킴으로써 형성된다. 이어서, 블록 공중합체를 형성하는 에틸렌 옥사이드 모노머를 양 말단에 첨가한다. 폴록사머의 합성은 PO 코어와 EO 말단을 구축하는 단계 동안 중합 속도의 변화를 초래할 수 있다.
POP의 합성 동안, 2 가지 상이한 반응 메커니즘은 POP 사슬 성장을 제한하고, 의도하지 않는 다이블록 중합체를 생성한다. 이 물질은 통상적으로 (P188의 중합체 분포에 비하여) 더 낮은 분자량을 가진다. 하나의 메커니즘에서, 불포화는 알칼리 촉매와 반응함으로써 프로필렌 옥사이드로부터 직접적으로 형성된다. 염기는 프로필렌 옥사이드의 알릴 알코올로의 재배열을 촉진하고, 그 다음 상기 알릴 알코올은 말단 불포화가 있는 모노 작용성 사슬을 개시한다. 이러한 유형의 부반응은 반응 시간 전반에 걸쳐 저분자량(LMW) 물질을 생성할 것이다. 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 상에서, 이러한 불순물의 분포는 주요 피크뿐만 아니라 LMW 어깨에 위치한다. 제2 메커니즘에서, 성장하는 중합체 사슬에서 음성 산소 원자에 의한, 6 개의 탄소 원자와 떨어져 위치한 수소 원자의 추출은 사슬을 종결 및 전달하여 알릴 말단기를 생성할 수 있다. 이러한 뒤물기(back-biting) 반응은 고분자량(HMW) POP 블록에서 우세하다. 이러한 물질의 분포는 대부분 LMW 어깨에 있다.
추가적으로, (P188의 중합체 분포에 비하여) 고분자량 물질은 통상적인 상업적 제조 캠페인 동안 폴록사머 188의 배치 사이에서 중합 반응기의 부적절한 세정으로 인하여 형성될 수 있다. 폴록사머, 예컨대 P188의 통상적인 배치를 제조한 후 잔류 생성물을 제거하기 위하여 반응기가 완전히 세정되지 않으면, 잔류 생성물은 후속 배치에서 개시제로서 작용하여 "다이머 유사" 폴록사머 분자를 형성할 것이다. 이러한 물질은 고분자량을 가지며, GPC 상에서 HMW 어깨로서 관찰되는 중합체 분포의 부분일 것이다.
폴록사머에 대한 분해 경로는 저분자량 알데히드 및 산을 초래하는 과산화 및 LMW 폴리에틸렌 글리콜을 초래하는 열 분해를 포함한다. 산화 분해는 폴록사머의 안정성에 영향을 미치는 주요 분해 경로이다. 이 공정은 중합체 사슬에 구조적 변화를 일으키고, 퍼옥사이드 및 카르보닐을 생성한다. 퍼옥사이드는 자연적으로는 일시적인 것으로서, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT)과 신속하게 결합하며, BHT는 통상적으로 산화방지제로서 상업적인 제조물에 첨가된다. 열 분해는 기타 다른 물질을 생성하는 또 다른 경로이다. 다양한 사슬 길이의 글리콜은 열 분해의 주요 분해 생성물이다. 강제 열 분해 연구로, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜 및 트리에틸렌 글리콜이 형성되는 것으로 나타났다.
따라서, 특정 폴록사머는 EO-PO-EO 구조 모티프를 가지지만, 반복 EO 및 PO 단위의 수는 다양한 다수의 화학적 실체로 구성된다. EO-PO 모티프 및 다양한 기타 다른 물질을 가지는 다양한 절단된 중합체는 의도된 폴록사머 화합물의 합성 동안 일어나는 부반응의 결과로서 형성될 수 있다. 이러한 기타 다른 물질은 전반적인 폴록사머 분포 내에 존재하고 상기 폴록사머 분포 내에서 발견된다. 결과는 불균일한 물질이다(즉, 다분산 물질임).
예를 들어, P188의 합성으로 인하여, PO 코어 및 EO 말단을 제조하는 단계 동안 중합 속도에 변화가 있을 수 있다. 따라서, P188의 대부분의 비정제 형태는, 주로 전체 사슬 길이가 변하는, 종-형상 분포의 중합체 종을 포함한다. 추가적으로, 불완전 중합에 의해 형성된 다양한 저분자량(LMW) 성분(예를 들어, 글리콜 및 절단된 중합체), 및 고분자량(HMW) 성분(예를 들어, 이량체화 중합체)이 존재할 수 있다. 통상적으로, 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의한 P188의 특성화는 의도하지 않은 LMW 및 HMW 성분을 나타내는 "어깨" 피크를 가지는 P188의 주요 피크를 확인한다(Emanuele and Balasubramanian (2014) Drugs R D, 14:73-83). 예를 들어, BASF(미국 뉴저지주 파시패니 소재)로부터 입수가능한 P188의 제조물은 분자량이 대략 1,750 Da인 소수성 블록으로 특징지어지며, POE 블록은 중합체의 80 중량%를 구성하고, 전체 분자량은 대략 8,400 Da이다. 실제 화합물은 의도된 POE-POP-POE 공중합체로 구성될 뿐만 아니라, 분자량이 1,000 Da 미만 내지 30,000 Da 초과의 범위인 기타 다른 분자를 포함한다. 상업적인 폴록사머 188의 분자 다양성 및 분자 분포는 겔 투과 크로마토그래피를 사용하여 검출되는 광범위의 1차 및 2차 피크에 의해 설명된다. 상업적으로 입수가능한 폴록사머를 포함하여, 비정제 폴록사머 제조물에 존재하는 분자의 다양성은 다양한 생물학적 활성을 초래할 수 있다. 관찰된 생물학적 활성의 많은 부분이 바람직하지 않거나/바람직하지 않고, 약물로서 폴록사머의 치료 효능을 제한하는 원치않는 부작용을 초래할 수 있다. 인공 혈액 제조물의 투여시 관찰되는 보체 활성화, 식세포 이동 마비, 및 세포 독성이 이들 제조물의 폴록사머 188 성분 중 불순물에 부분적으로 기인하였다. 추가적으로, 폴록사머 188의 주입은, 크레아티닌 상승(신장 손상을 나타냄), 및 독성 동물 연구에서 기관 중량(신장)의 증가를 초래하는 것으로 나타났다. 신장의 조직학적 평가는 근위 세뇨관 상피 세포의 용량 관련 세포질 액포화를 입증하였다.
더 낮은 분자량의 성분을 제거하기 위하여 정제된 폴록사머 188(예를 들어, 문헌[Grindel et al. (2002) Journal of Pharmaceutical Sciences, 90:1936-1947 (Grindel et al. 2002a)] 또는 [Grindel et al. (2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103 (Grindel et al. 2002b)] 참조)은, 대상체에게 투여될 때 상이한 약동학적 프로파일을 나타내는 성분을 포함한다. 주요 성분은 약 7 시간의 혈장 중 반감기(t1/2)를 나타내고, 더 높은 분자량의 성분(즉, 보유 시간이 더 긴 종)은 반감기에서 약 10 배 이상의 증가를 나타내어 t1/ 2이 대략 70 시간 이상이므로, 실질적으로 주요 성분보다 혈장 보유 시간이 더 길어 순환으로부터 더 느린 소거를 나타낸다. 이는 본 명세서에서 입증되어 있다(예를 들어, 도 8a 및 도 8b 참조).
a. 저분자량 성분
신장에 독성을 갖는 폴록사머 188 중 물질은 주요 성분 보다 더 낮은 분자량을 가지는 것으로 확인되었다. P188의 치료 잠재력에 대한 연구는 혈청 크레이티닌의 상승에 의해 입증된 바와 같이 임상 시험 평가 동안 관찰된 급성 신기능 장애로 인하여 부분적으로 치료 적용을 위하여 상표명 RheothRx®로 입수가능한 폴록사머의 중단을 초래하였다. 이러한 효과는 합성 공정 동안 형성된 다양한 저분자량(LMW) 물질의 존재로 인한 것으로 밝혀졌다(Emanuele and Balasubramanian (2014) Drugs R D, 14:73-83). LMW 물질은 신장에서 근위 세뇨관 상피 세포에 의해 축적되었다.
LMW 물질의 분자량은 수백 Da 내지 수천 Da의 범위일 수 있다. 넓은 용해도 특징을 가지는 이러한 불순물의 복잡한 특성은 모 분자로부터 불순물을 선택적으로 제거하는 것으로 어렵게 한다. 통상적인 정제 공정, 예컨대 증류, 결정화, 한외여과 등은 주요 성분으로부터 저분자량(LMW) 물질을 효과적으로 분리하지 못한다. 정제를 위한 크로마토그래피 기법, 예컨대 분취용 GPC의 사용은 비싸고, 특히 규모를 확대하기가 어렵다. 차별적으로 다양한 물질을 용해시키고 제거하기 위한 미세-조정 혼합 용매 시스템은 또한 어려운 일이며, 재순환에 비용이 많이 드는 다량의 용매를 사용하는 것을 필요로 한다.
P188에 존재하는 이러한 저분자량 물질의 수준을 감소시키는 초임계 유체 크로마토그래피가 보고되었다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,567,859 참조). 초임계 유체 추출은 이산화탄소를 사용하여 공중합체를 정제하는 것을 실행하여, 다분산도를 1.17 미만으로 감소시켰다. 그러나, 상기 방법은 본 명세서에 나타낸 바와 같이, LMW 성분을 충분히 제거하거나 감소시키지 못한다.
하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 방법은 이러한 LMW 성분이 실질적으로 없는 폴록사머 제조물을 생성한다. 예를 들어, LMW 성분이 감소된 정제된 P188은 약 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 LMW 성분을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 폴록사머 제조물, 특히 P188 폴록사머 제조물은 일반적으로 독성 감소를 나타내고, 투여될 때 크레아티닌 수준의 상승을 초래하지 않는다. 추가적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 생성된 LCMF P188 폴록사머 제조물은 투여시 장기 순환 물질의 감소를 포함하여, 기타 다른 유리한 특성을 가진다.
b. 장기 순환 반감기를 일으키는 성분
주요 또는 우세 폴록사머 종에 비하여 순환 반감기가 더 긴 혈장 또는 혈액 중의 물질이거나 이러한 물질을 생성하는 P188 중의 성분이 확인되었다. 순환 반감기가 더 긴 이러한 물질은 비임상 및 임상 연구에서 관찰된다. 고성능 액체 크로마토그래피-겔 투과 크로마토그래피(HPLC-GPC)에 의한 정제된 P188의 정맥내 투여 후 얻어진 혈장의 분석 결과는 순환에서 2 개의 뚜렷한 피크를 나타낸다(문헌[Grindel et al. (2002) Journal of Pharmaceutical Sciences, 90:1936-1947 (Grindel et al. 2002a)] 또는 [Grindel et al. (2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103 (Grindel et al. 2002b)]). 평균 피크 분자량이 약 8,600 달톤인 주요 피크와 평균 분자량이 약 16,000 달톤인 더 작은 피크가 존재한다. 2 개의 피크는, 더 높은 분자량 피크가 명백하게 혈장 보유 시간이 더 길어 순환으로부터 더 느린 소거를 나타내는, 명백하게 상이한 약동학적 프로파일을 나타낸다(도 8a 및 도 8b 참조). 유사한 관찰이 래트 및 개에서 보고되었다. 유사한 더 오래 순환하는 성분이 천연 또는 비정제 폴록사머 188로 관찰된다(국제 PCT 출원 공개 번호 WO 94/008596 참조).
예를 들어, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 정제된 P188을 건강한 지원자에게 1 시간 동안 100 mg/kg/시간의 부하 용량으로 정맥내 투여한 다음, 47 시간 동안 30 mg/kg/시간의 유지 용량으로 정맥내 투여한 후, 주요 또는 우세 피크는 1 시간의 로딩 주입 종료시 0.9 mg/mL의 평균 최대 농도(Cmax)에 도달하였다. 0.5 mg/mL의 평균 정상 상태 농도(Css)는 유지 주입의 시작과 본질적으로 일치하여 달성되었다. 유지 주입의 중단 후, 혈장 농도는 약 7 시간의 제거 반감기(t1/2)로 급속하게 감소하였다.
도 8b에 나타낸 바와 같이, 0.2 mg/mL의 Cmax를 나타낸 HMW 성분이 확인되었고, 이는 유지 주입의 종료때까지 달성되지 않았다. 주입 동안 농도가 계속 축적하기 때문에 정상 상태는 달성되지 않았다. 유지 주입의 중단 후, 고분자량 피크의 혈장 수준은 서서히 감소하여, 24 시간의 주입 후 모니터링 기간 동안 약 33%만 감소하였다. 이러한 제거율은 주요 피크의 대략 1/10이고 t1/ 2은 대략 70 시간이다. 또한, 문헌[Grindel et al. (2002) Journal of Pharmaceutical Sciences, 90:1936-1947 (Grindel et al. 2002a)] 및 [Grindel et al. (2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103 (Grindel et al. 2002b)]을 참조한다. 장기 순환 물질(또는 장기 보유 시간 물질)은 P188 분포의 HMW 분획에서 확인된다(Grindel et al. (2002a)). 이러한 HMW 성분은 블록 공중합체와 일치하는 단편화 패턴을 가지는 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 확인된 바와 같이, 대략 16,000 Da인 것으로 결정되었다(예를 들어, 문헌[Grindel et al. (2002a)] 참조).
대략 8,400 달톤 내지 9400 달톤이고 반감기가 약 7 시간인 분포의 우세 또는 주요 공중합체 내에서 P188의 유변학적, 세포보호, 유착방지 및 항혈전 효과가 최적이므로, 장기 순환 반감기를 나타내는 기타 다른 성분의 존재는 바람직하지 않다. 예를 들어, P188의 바람직한 활성 중에서는 혈액 점도를 감소시키고 적혈구(RBC) 응집을 억제하는 유변학적 효과가 있으며, 이는 손상된 조직에서 혈류를 개선시키는 능력을 설명한다. 반대로, 고분자량 폴록사머, 예컨대 P338(또한, Pluronic® F108이라고도 함) 및 P308(Pluronic® F98)은 혈액 점도 및 RBC 응집을 증가시킨다(Armstrong et al. (2001) Biorheology, 38:239-247). 이는 P188의 반대 효과이며, 더 높은 분자량의 폴록사머 종이 바람직하지 않은 생물학적 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.
하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 장기 순환 물질인 성분 또는 이러한 물질을 생성하는 성분, 즉 장기 순환 물질이 없는(LCMF) 성분이 실질적으로 감소된 폴록사머 제조물이 제공된다. 또한 LCMF 폴록사머의 생성을 위한 예시적인 방법(예를 들어, 실시예 7 참조)이 제공된다.
따라서, 본 명세서에서 제공되는 LCMF 폴록사머 제조물, 특히 LCMF 폴록사머 188 제조물은, 보다 균일한 약동학적 프로파일을 나타내며, 따라서 보다 일관된 치료 효과를 나타낸다. LCMF 폴록사머는 하기 섹션에서 보다 상세히 기재된다.
C. 장기 순환 물질이 없는( LCMF ) 폴록사머
다분산도 값이 1.07 미만; 4,500 달톤 미만의 저분자량(LMW) 성분이 1.5% 이하; 13,000 달톤 초과의 고분자량 성분이 1.5% 이하이고; 대상체에 투여될 때 공중합체의 분포에서 모든 성분의 반감기가 공중합체의 분포에서 주요 성분의 혈액 또는 혈장 중 반감기보다 5.0 배 이하로 더 긴 정제된 P-188인 장기 순환 물질이 없는(LCMF) 성분이 본 명세서에서 제공된다. 따라서, 투여될 때 LCMF 폴록사머 188은 주요 성분보다 상당히 더 긴 반감기를 가지는 성분을 생성하지 않는다. LCMF P-188은 다음의 화학식을 가지며,
HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH
여기서, a' 및 a는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각은 (C2H4O)로 표현되는 친수기 부분(즉, 공중합체의 폴리옥시에틸렌 부분)이 대략 60% 내지 90%, 예컨대 80% 또는 81%를 구성하도록 하는 정수이며; b는 (C3H6O) b 로 표현되는 소수기가 분자량이 대략 1,300 Da 내지 2,300 Da, 예컨대 대략 1,750 Da이도록 하는 정수이고; 화합물의 평균 전체 분자량은 대략 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예컨대 일반적으로 8,400 Da 내지 8,800 Da, 예를 들어 약 8,400 Da 또는 8,400 Da이며, 여기서 공중합체는 다분산도 값이 1.07 미만이도록, 저분자량 불순물 또는 기타 다른 불순물을 포함하여, 불순물을 제거하기 위해 정제되었다.
연구는, 인간 대상체에 투여될 때 정제된(LCM-함유) P-188 제조물의 주요 피크 성분이 (인간) 혈장 중 반감기(t1/2)가 약 7 시간임을 입증하였다(문헌[Grindel et al. (2002) Journal of Pharmaceutical Sciences, 90:1936-1947 (Grindel et al. (2002a))] 또는 [Grindel et al. (2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103 (Grindel et al. (2002b))]). 정제된 폴록사머는 또한 평균 분자량이 약 16,000 달톤인 더 높은 분자량의 성분을 함유하는 장기 순환 물질(LCM)을 생성하였으며, 상기 물질은 반감기에서 약 10 배 이상의 증가를 나타내어 t1/ 2이 대략 70 시간이다.
예를 들어, 문헌[Grindel et al., (2002a 및 2002b)]의 연구에서 특징지어진 정제된 P-188(LCM-함유)와 대조적으로, LCMF P-188로 명명된 정제된 폴록사머는 대상체에 투여될 때 중합체 분포의 모든 성분이 거의 동일한 비율로 순환으로부터 소거되는 것이다. 따라서, LCMF P-188은 기존의 LCM-함유 p188 폴록사머와 상이하다. LCM 함유 폴록사머와 마찬가지로, LCMF 폴록사머는 실질적으로 1.07 미만, 일반적을 1.05 또는 1.03 미만의 더 작은 다분산도 조성물을 함유하지만, 인간 대상체에 투여될 때, 공중합체의 분포에서 임의의 성분의 혈액 또는 혈장 중 반감기는 공중합체의 분포에서 주요 성분의 반감기보다 5.0 배 이하로 더 길고, 일반적으로 4.0 배, 3.0 배, 2.0 배, 1.5 배 이하로 더 길다. 통상적으로, LCMF는, 대상체에 투여될 때 공중합체의 분포에서 주요 성분보다 실질적으로 더 긴(5 배 초과) 또는 주요 성분보다 더 긴 혈액 또는 혈장 중 반감기를 나타내는 임의의 성분을 함유하지 않는다.
일부 예에서, 인간 대상체에 투여될 때, LCMF 폴록사머 중 모든 성분의 혈액 또는 혈장 중 반감기는 어떤 성분도 반감기가 30 시간 초과이지 않으며, 일반적으로 25 시간, 20 시간, 15 시간, 10 시간, 9 시간, 8 시간 또는 7 시간 이하이도록 한다.
이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 폴록사머 중합체 분포의 더 높은 분자량 성분, 예컨대 13,000 달톤 초과의 성분은 더 긴 순환 반감기 물질을 설명할 수 있다. 폴록사머 188 및 정제된 폴록사머 188과 같이 비하전 분자의 사구체 여과의 비율은 분자 크기에 크게 의존한다. 이는, 사구체 여과의 비율은 크기 임계값 초과에서 점차적으로 제한되기 때문에, 5,000 달톤 초과의 분자량을 가지는 폴록사머 188 중합체 분포의 성분에 대하여 관찰된다(Chang et al., (1975) Biophysic. J. 15:887 - 906). 따라서, 폴록사머 188 중합체 분포의 더 높은 분자량 성분(예컨대, 13,000 달톤 초과의 성분)은 더 작은 크기의 성분보다 더 느린 속도로 순환으로부터 소거될 가능성이 더 높을 것이다.
그러나, LCMF 제조물에 있어서, 분포 중 HMW 성분의 존재는 더 긴 순환 종(즉, 반감기가 주요 피크보다 5 배 초과로 더 긴 종)을 생성하지 않는다. 예를 들어, LCMF 제조물 중 13,000 달톤 초과의 HMW 불순물은 전체 성분의 1.5 중량% 이하를 구성한다. LCMF 제조물이 대상체에 투여될 때, 이러한 HMW 불순물은 분포에서 주요 성분의 반감기보다 5.0 배 초과로 더 긴, 일반적으로는 4.0 배, 3.0 배, 2.0 배, 1.5 배 이하로 더 긴 순환 반감기를 초래하지 않는다. LCMF 제조물이 대상체에 투여될 때, 상기 불순물은 분포에서 주요 성분보다 실질적으로 더 긴(즉, 5 배 초과) 또는 주요 성분보다 더 긴 순환 반감기를 가지는 어떠한 성분도 생성하지 않는다(예를 들어, 도 7a 및 7b 참조).
LCMF 제조물에서, HMW 성분은 기타 다른 기존의 정제된 P-188 제조물에 비하여 증가 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 LCMF 폴록사머는 13,000 달톤 초과의 고분자량 성분이 1.3% 이하, 예컨대 1.2%, 1.1%, 1.0% 또는 그 이하인 P-188 폴록사머를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 특정 예에서, 본 명세서에서 제공된 LCMF 폴록사머는 13,000 달톤 초과의 고분자량 성분이 1.0 중량% 미만, 일반적으로는 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5% 또는 그 이하인 P-188 폴록사머를 포함한다.
본 명세서에서 제공된 LCMF 폴록사머는 본 명세서의 하기 섹션 D, 특히 섹션 D.1.b에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 도 3 참조). LCMF 폴록사머의 특성의 설명 및 예시를 고려하여, 당업자는 LCMF 폴록사머를 생성하는 기타 다른 방법을 구상할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 LCMF 폴록사머는,
a) 폴록사머 용액을 추출기 용기에 도입하며, 여기서 폴록사머는 제1 알칸올에 용해되어 용액을 형성하는 단계;
b) 제1의 정해진 기간 동안, 상기 폴록사머 용액을 초임계 이산화탄소를 유지하는 온도 및 압력 하에서 제2 알칸올 및 초임계 이산화탄소를 포함하는 추출 용매와 접촉시키는 단계로서, 여기서
상기 온도는 이산화탄소의 임계 온도를 초과하지만 통상적으로 35℃ 내지 45℃의 범위일 수 있고;
압력은 220 bar 내지 280 bar이며;
알칸올은 전체 추출 용매의 7 중량% 내지 8 중량%인 알칸올 농도로 제공되는 것인 단계;
c) 추출 방법의 시간 경과에 따른 구배 단계로 단계 b)에서 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도를 복수 회 증가시키는 단계로서, 여기서
복수 회 각각은 추가로 정해진 기간 동안 일어나고;
각각의 연속 단계에서, 알칸올 농도는 제2 알칸올의 이전 농도에 비하여 1% 내지 2% 증가되는 단계; 및
d) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하여, 이에 의해 라피네이트 폴록사머 제조물로부터 추출된 물질을 제거하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
D. 폴록사머를 정제하기 위한 추출 방법
정제된 중합체가 구조(다이블록, 트리블록 등), 불포화가 없는 분자의 백분율, 고분자량의 분포, 및 소수기/친수기(HLB) 비율의 분포에 대하여 더 균질하도록 폴록사머를 정제하기 위한 초임계 유체 추출(SFE) 및 고압 절차가 본 명세서에서 제공된다. 공정의 조정 가능성은 무관한 성분을 효과적으로 제거하기 위해 활용될 수 있으며, 시간 경과에 따라 조정될 수 있어, 정제된 생성물의 수율을 증가시킬 수 있다. 본 명세서에서 제공된 방법은 다양한 물질을 선택적으로 제거하기 위하여 용매화 특징이 가변적인 용매 시스템을 사용한다. 본 방법은, 상기 특성을 가지는 LCMF 폴록사머 188 생성물을 생성하는 예시적인 방법을 제공한다.
본 명세서의 방법은 종래 방법에 의하여 생성된 것과 상이한 폴록사머 제조물을 제공한다. 이는 투여시 정제된 폴록사머 188에서 관찰되는 더 오래 순환하는 물질을 생성하지 않는 LCMF 폴록사머 188 제조물, 예컨대 미국 특허 번호 5,696,298에 기재된 것을 포함한다. LCMF 폴록사머 188은 분자 크기 분포가 정제된 폴록사머 188과 유사하지만, 성분 분자는 정제된 폴록사머보다 더 친수성인 제조물을 생성한다.
장기 순환 물질(LCM)의 부재는, 더 빠른 소거 및 더 오래 순환하는 물질의 제거에 의한 기타 다른 개선된 약리학적 특성을 포함하여, 폴록사머의 특성을 개선시킨다. 본 명세서에서 제공된 방법은 폴록사머 제조물에서 원치않는 성분을 제거하고, 이에 의하여, 원하지 않은 활성을 최소화하거나 감소시키면서 원하는 치료 활성을 나타내는 보다 균질하거나 균일한 폴록사머 제조물을 제조한다. 상업적으로 입수가능한 폴록사머는 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 생물학적 활성의 변화를 나타내는 것으로 보고되었기 때문에, 보다 균일하고 균질한 폴록사머 제조물은 독성이 감소되었지만 주요 공중합체 성분의 치료 효능은 유지한다.
이와 같은 폴록사머를 제조하기 위한 방법이 본 명세서에서 제공되며, LCMF 폴록사머 188을 포함하여 생성된 폴록사머가 제공된다. 저분자량(LMW) 성분이 감소되거나 제거된 폴록사머 제조물을 생성하는 것에 추가적으로, 본 명세서에서 제공된 방법은, 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 혈장 또는 혈액 중 순환 물질이거나 순환 물질을 생성하는 임의의 성분에 대하여 감소되거나 제거된 장기 순환 물질이 없는(LCMF) 제조물을 생성한다. 따라서, 폴록사머의 LCMF 제조물, 특히 LCMF 폴록사머 188이 또한 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에서 제공되는 LCMF 폴록사머 188은 폴록사머 188에 있어서 공지된 모든 용도에 대하여 사용될 수 있다.
주요 성분 이외의 성분을 제거하거나 감소시키고, 이에 의하여 제조물의 분자 다양성을 감소시키기 위하여, 폴록사머, 예컨대 P188을 정제하기 위한 추출 방법이 본 명세서에서 제공된다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 방법은 폴록사머 중 LMW 물질을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 또한, LMW 물질을 제거하거나 감소시키는 것에 추가적으로, 본 명세서에서 제공된 특정 방법은 또한 분포 중 주요 성분의 반감기보다 실질적으로 더 긴 반감기를 가지는 더 오래 순환하는 물질이거나 이러한 더 오래 순환하는 물질을 생성하는 폴록사머 제조물 중 성분을 제거하거나 감소시킬 수 있음이 본 명세서에서 확인된다. 추출 정도, 및 추출되는 성분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에서 이용되는 특정 온도, 압력 및 알칸올 농도에 의해 제어된다.
본 명세서에서 제공된 방법은 용해력이 조용매 개질제의 존재 하에서 온도, 압력의 조작에 의해 제어되는 초임계 또는 아임계 추출 용매를 이용한다. 이산화탄소는 폴록사머, 예컨대 P188의 특히 효율적인 추출 용매가 아니지만, 개질제로서 극성 조용매, 예컨대 알칸올의 존재가 추출 용매 중 CO2의 가용화 효율을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다. 특히, 본 명세서에서 제공된 방법은 극성 조용매, 예컨대 알칸올의 존재 하에서 실행되며, 상기 조용매의 농도는 추출 공정이 진행함에 따라 구배 방식(예를 들어, 단계적 구배 또는 연속적으로 증가하는 구배)으로 증가된다. 이러한 방식으로 농도가 증가되는 알칸올 조용매를 이용함으로써, 불순물의 제거가 이산화탄소가 단독으로 사용될 때보다 훨씬 더 높은 정도까지 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 예를 들어, 이산화탄소를 단독으로 사용하는 추출 방법은 원치않는 성분, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 LMW 성분 및 HMW 성분을 제공된 방법에 의해 달성되는 것과 동일한 정도까지 제거할 수 없다.
초임계 유체 추출을 사용하여 폴록사머를 정제하기 위한 본 명세서에서 제공된 방법에서, 폴록사머 분포의 LMW 성분 또는 불순물은 분포에서 기타 다른 HMW 성분보다 더 낮은 알칸올 농도(예를 들어, 메탄올) 및 더 높은 압력을 이용하여 선택적으로 제거될 수 있다. 하기에 추가로 기재되는 바와 같이, 추출 용매의 가용화능을 증가시킴으로써, 예를 들어 극성 용매, 예컨대 알칸올(예를 들어, 메탄올)의 압력 및 농도를 주의깊게 제어함으로써, 기타 다른 불순물을 제거하는 것이 또한 가능하다. 특히, 알칸올(예컨대, 메탄올)의 더 높은 농도의 구배를 단독으로, 또는 생성된 생성물이 대상체에 투여될 때 이전 P-188 생성물로 관찰된 혈장 중 더 오래 순환하는 물질을 생성하지 않도록 하는 폴록사머 분포 중 성분(예를 들어, HMW 성분)의 제거를 초래하는, 압력의 감소와 함께 이용하는 방법에 제공된다.
그러나, 폴록사머의 수율에 대하여 균형점이 있을 수 있다. 일반적으로, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 조용매의 농도가 증가함에 따라, 추출 용매의 용매화능이 증가하여 더 많은 화합물이 가용화되고 추출 정도가 증가한다. 구배 방식으로 추출 용매의 농도를 증가시킴으로써, 폴록사머 수율의 감소가 최소화되는 반면, 최종 생성물의 순도는 최대화된다. 통상적으로, 본 명세서에서 제공된 방법은 본 방법에 의해 얻어지는 추출 또는 정제된 중합체의 양이 방법의 실행 전 폴록사머의 출발 양의 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상이도록 하는 수율을 달성한다. 그러나, 생성된 폴록사머는, 독성 부작용을 나타내거나 투여될 때 혈장 중 더 오래 순환하는 물질을 생성할 수 있는 불순물 없이, 출발 물질보다 분포 중 주요 성분의 더 높은 백분율을 가지는 실질적으로 더 높은 순도를 나타낸다.
본 방법은, 예를 들어 중합체의 분포에서 원치않는 성분을 감소시키거나 저감시킴으로써 순도를 증가시키는 것이 요구되는 임의의 폴록사머에 대하여 실행될 수 있다. 이러한 방식에서 정제를 위하여 특정 폴록사머를 선택하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 원하지 않는 성분은 독성이거나 요구되는 활성에 상반되거나 반대되는 생물학적 활성을 가지는 물질이거나 이러한 물질을 생성하는 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 폴록사머는 폴록사머 중 LMW 성분, 예를 들어 급성 신장 부작용, 예컨대 투여될 때 크레아티닌의 상승을 초래하는 임의의 LMW 성분을 감소시키거나 제거하는 것이 요구되는 것일 수 있다. 폴록사머는 또한 투여될 때 중합체의 분포에서 주요 성분의 반감기와 상이한(예를 들어, 더 긴) 혈액 중 반감기를 가지는 물질이거나 이러한 물질을 생성하는 HMW 성분과 같은 임의의 성분을 함유하는 것일 수 있다. 이와 같은 성분은 혈액 점도 및 적혈구 응집을 증가시킬 수 있으며, 따라서 바람직하지 않다.
본 방법에서 사용하기 위한 폴록사머의 예는 폴록사머 188, 폴록사머 331 및 폴록사머 407을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 통상적으로, 폴록사머는 주요 성분의 평균 분자량이 약 4,700 Da 내지 12,800 Da, 예컨대 일반적으로 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예를 들어 8,400 내지 8,800 Da의 범위에 속하거나 약 4,700 Da 내지 12,800 Da, 에컨대 일반적으로 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예를 들어 8,400 내지 8,800 Da인 것이다. 특히, 폴록사머는 P188이다.
예를 들어, 본 명세서에서 제공된 추출 방법은 P188 제조물을 정제하는 데 이용될 수 있고, P188 제조물은 다음의 화학식을 가지며,
HO(CH2CH2O)a'─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH
여기서,
(C3H6O)로 표현되는 소수기는 분자량이 대략 1,750 달톤이고, 평균 분자량이 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예컨대 일반적으로 대략 8,400 달톤 내지 8,800 달톤이다. P188의 폴리옥시에틸렌:폴리옥시-프로필렌:폴리옥시에틸렌 중량 비율은 대략 4:2:4이다. P188은 옥시에틸렌의 중량 백분율이 81.8±1.9%이고, 불포화 수준이 0.026±0.008 mEq/g이다. 본 명세서에서 추출 방법에 사용하기 위한 P188 제조물은 상업적으로 입수가능한 제조물을 포함한다. 이는, Pluronic® F68(BASF, 미국 뉴저지주 플로햄팍 소재) 및 RheothRx®(Glaxo Wellcome Inc.에 의해 개발됨)를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 제공된 추출 방법을 실시함에 있어서, 방법은 a) 폴록사머(예를 들어, P188) 용액을 추출기 용기에 도입하며, 여기서 폴록사머 용액은 폴록사머를 제1 용매 중에 용해시켜 용액을 형성함으로써 제조되는 단계; b) 초임계 액체(예를 들어, 초임계 이산화탄소) 또는 아임계 유체(예를 들어, 고압 이산화탄소)를 함유하는 추출 용매 및 동시개질제 용매를 상기 용액과 혼합하여 추출 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 추출 용매 중 동시개질제 용매의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되는 단계; 및 c) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하고 이에 의하여 폴록사머로부터 불순물(예를 들어, LMW 및/또는 기타 다른 성분)을 제거하는 단계를 포함한다. 방법에서, 제1 용매 중에 폴록사머 용액을 용해시키는 단계는 추출 용기에 용액을 장입하기 전에 또는 추출 용기에 용액을 장입할 때 일어날 수 있다. 예를 들어, 폴록사머는 별개의 용기 중에서 용해된 다음, 상기 용액은 추출 용기에 첨가된다.
방법은 고압 또는 초임계 유체 추출 방법일 수 있다. 통상적으로, 방법은 추출 용매 중 초임계 액체를 사용하여 초임계 유체 추출(SFE)을 사용하여 실행된다. 초임계 액체는 임계 온도 초과로 가열되고 임계 압력 초과로 압축된 임의의 액체이다. 예를 들어, 이산화탄소는 임계 온도가 31.1℃이고, 임계 압력이 73.8 bar이다. 따라서, 초임계 이산화탄소에 대한 추출 조건은 임계 온도인 약 31℃ 및 임계 압력인 약 74 bar 초과이다. 대조적으로, 고압 추출은 압력이 임계 압력을 초과하고, 온도가 임계 온도를 초과하지 않는 아임계 조건 하에서 달성될 수 있다.
1. 추출 공정
a. 초임계 방법
특정 예에서, 본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 초임계 유체 추출 공정은 필수적으로 용매로서 초임계 유체를 사용하는 용매 추출 공정이다. 초임계 유체를 이용하여, 다성분 혼합물은 성분 휘발성에서의 차이, 및 성분 혼합물 및 초임계 유체 용매(용매 추출) 사이의 특정 상호작용에서의 차이를 활용함으로써 분리될 수 있다. 상 도표의 초임계 영역에서, 압축성 유체, 예컨대 이산화탄소는 액체와 유사한 밀도 및 압력 의존적인 훨씬 증가된 용매 용량을 나타낸다.
초임계 유체는 다수의 매우 유리한 특징을 나타내어 초임계 유체를 우수한 용매로 만든다. 예를 들어, 초임계 유체의 조정가능한 용해력은 특정 범위 내 임계 조건 주위에서 빠르게 변화한다. 초임계 유체의 용해력, 및 이에 따른 추출 동안 선택적으로 제거될 수 있는 성분의 성질은 초임계 유체 용매의 온도 및 압력을 변화시킴으로써 미세 조정될 수 있다.
다양한 초임계 유체의 다른 유익한 특성은 임계 온도 및 압력에서의 차이이다. 각각의 초임계 유체는 일정 범위의 용해력을 가진다. 조정가능한 용해력 범위는 적절한 초임계 유체를 선택함으로써 선택될 수 있다.
고유한 용해도 특징에 추가적으로, 초임계 유체는 특정 물리화학적 특성을 나타내어 초임계 유체를 보다 유용하게 만든다. 예를 들어, 초임계 유체는 액체와 유사한 밀도, 및 기체와 유사한 전달 특성, 예컨대 확산성 및 점도를 가진다. 이러한 특징은 또한 임계 영역 주위에서 빠르게 변화한다. 초임계 유체는 또한 표면 장력이 0이다. 유용한 초임계 유체의 대부분은 끓는점이 상온 주위 또는 미만이므로, 정제 후 용매 제거 단계가 간단하고, 에너지 효율적이며, 어떠한 잔류 용매도 남기지 않는다.
추출 동안 고체 매트릭스의 사용은 분획 파라미터에 대하여 추가적인 치수를 제공한다. 적합한 고체 매트릭스는 용질-용매 상호작용에 추가적으로 용매-매트릭스 및 용질-매트릭스 상호작용을 제공하여 분획 분해능을 향상시킨다. 초임계 유체의 바람직한 전달 특성은 제조에 있어서 공정을 용이하게 확장할 수 있게 한다. 초임계 유체 추출 공정을 이용한 공정 확장 시 열 전달 및 질량 전달 특징은 크게 변하지 않는다. 추출 공정 조건, 예컨대 압력, 온도, 및 유속은 정밀하게 제어될 수 있으므로, 정제 공정은 매우 조정가능한 것에 추가적으로 재현가능하다.
이와 같은 방법에서, 추출 용매는 추출에서 시간 경과에 따라 증가되는 초임계 액체(예를 들어, 초임계 이산화탄소)뿐만 아니라, 다른 동시개질제 용매, 일반적으로 알칸올을 함유할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 동시개질제 용매의 존재는 용질, 예컨대 보다 높은 분자량 또는 보다 비극성인 용질의 용해도를 개선시키고, 이에 의하여 방법에서 용질의 추출을 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 방법은 a) 폴록사머(예를 들어, P188) 용액을 추출기 용기에 제공 또는 도입하며, 여기서 폴록사머 용액은 폴록사머를 제1 알칸올 중에 용해시켜 용액을 형성함으로써 제조되는 단계; b) 초임계 액체 상태를 형성하기에 충분한 고압 및 고온 하에서, 제2 알칸올 및 초임계 액체를 함유하는 추출 용매를 상기 용액과 혼합하여 추출 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되는 단계; 및 c) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하고 이에 의하여 폴록사머 제조물로부터 불순물(예를 들어, LMW 성분 또는 기타 다른 성분)을 제거하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 알칸올은 동일하거나 상이할 수 있다. 방법에서, 제1 용매 중에 폴록사머 용액을 용해시키는 단계는 추출 용기에 용액을 장입하기 전에 또는 추출 용기에 용액을 장입할 때 일어날 수 있다. 예를 들어, 폴록사머는 별개의 용기 중에서 용해된 다음, 상기 용액은 추출 용기에 첨가된다.
예시적인 공정이 도 1에 상술되어 있다. 도 1은 폴록사머 제조물로부터 불순물(예를 들어, LMW 성분 또는 기타 다른 성분)을 제거하는 공정(100)을 나타낸다. 추출 시스템은, 통상적으로 단계(110)에 나타낸 바와 같이, 공급물 혼합 탱크 내로 제1 알칸올을 분배하기 전에, 단계(105)에 나타낸 바와 같이 가압된다. 시스템은 추출 공정에 적합한 온도까지 가열된다. 온도는 통상적으로 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)의 임계 온도 초과의 온도이다. 일반적으로, 온도는 대략 40℃이다.
임의의 적합한 알칸올 또는 알칸올의 조합은 본 명세서에서 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 적합한 알칸올의 예는, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 방법은 상기 기재된 바와 같은 추출 방법을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 알칸올은 각각 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 알칸올은 메탄올이다. 특정 예에서, 메탄올은 정제 용매로서 선택되고, 본 방법의 실시에서 제2 알칸올이다. 당업자는, 메탄올이 비교적 낮은 독성 특징을 가진다는 것을 이해할 것이다. 게다가, 메탄올은 폴록사머 188에 대하여 양호한 용해도를 가진다.
제1 알칸올(예를 들어, 메탄올)은 공정(100)에서 단계(115)에 따라서 폴록사머 용액을 형성하는 데 사용된다. 폴록사머, 예컨대 P188 제조물은, 공급 탱크 내로 분배되고, 제1 알칸올과 혼합될 때까지 교반된다. 공급 탱크에 첨가된 폴록사머의 양은 추출 방법의 확장성, 추출 용기의 크기, 달성되는 순도의 정도 및 당업자의 수준 내 기타 다른 요인의 함수이다. 예를 들어, 추출 용기의 mL 당 폴록사머(예를 들어, P188)의 비제한적인 양은 0.1 kg 내지 0.5 kg 또는 0.2 kg 내지 0.4 kg일 수 있다. 일부 예에서, 3 L 추출 용기를 사용하는 추출 방법에서, 폴록사머(예를 들어, P188)의 비제한적인 양은 0.6 kg 내지 1.2 kg, 예컨대 0.8 kg 내지 1.0 kg일 수 있다. 다른 예에서, 12 L 추출 용기를 사용하는 추출 방법에서, 폴록사머(예를 들어, P188)의 비제한적인 양은 1.5 kg 내지 5 kg, 예컨대 2 kg 내지 4 kg일 수 있다. 추가 예에서, 50 L 추출 용기를 사용하는 추출 방법에서, 폴록사머(예를 들어, P188)의 비제한적인 양은 8 kg 내지 20 kg, 예컨대 10 kg 내지 16 kg 또는 12 kg 내지 15 kg일 수 있다. 양의 변화는 특정 적용, 추출 용기, 추출 물질의 순도 및 당업자의 수준 내의 기타 다른 고려사항에 따라 고려된다.
폴록사머 및 알칸올의 임의의 적합한 비율은 본 명세서에 제공된 방법에서의 사용을 위해 고려된다. 폴록사머 대 알칸올의 중량 비율은, 예를 들어 약 4:1 내지 약 1:4, 예컨대 약 3:1 내지 약 1:3, 2:1 내지 약 1:2, 1:1 내지 4:1 또는 1:2 내지 1:4일 수 있다. 예를 들어, 폴록사머 대 알칸올의 중량 비율은, 약 4 내지 1, 또는 약 3 내지 1, 또는 약 2 내지 1, 또는 약 1 내지 1, 또는 약 1 내지 2, 또는 약 1 내지 3 또는 약 1 내지 4일 수 있다. 예를 들어, 일정량의 폴록사머, 예컨대 P188는 동일한 중량의 알칸올(예를 들어, 메탄올)과 혼합될 수 있다. 일정량의 폴록사머, 예컨대 P188은 더 적은 중량의 알칸올, 예컨대 절반 중량의 알칸올(예를 들어, 메탄올)과 혼합될 수 있다. 당업자는 폴록사머 대 알칸올의 적절한 비율이 주어진 알칸올에서 폴록사머 특성, 예컨대 용해도에 따라 다를 것임을 인식할 것이다.
폴록사머/알칸올 혼합물을 형성한 후, 혼합물의 전부 또는 일부는 단계(120)에 나타낸 바와 같이 추출기 내로 펌핑된다. 이와 같은 예에서, 폴록사머 용액을 제조하는 공정은 추출기와 별개의 용기에서 실행된다. 당업자는 폴록사머가 또한 제1 알칸올과 혼합하기 전에 고체로서 추출기 내로 도입될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴록사머 용액을 제조하는 공정은 추출기 용기에서 직접 이루어질 수 있다.
그 다음 추출기를 가압하고, 추출 용매는 공정(100)의 단계(125)에 나타낸 바와 같이 추출기 내로 도입된다. 추출 용매는 초임계 액체를 함유한다. 초임계 액체의 예는 이산화탄소, 메탄, 에탄, 프로판, 암모니아, 프레온(Freon)®, 물, 에틸렌, 프로필렌, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 압력 하 초임계 액체는 이산화탄소, 메탄, 에탄, 프로판, 암모니아 및 프레온으로 판매되는 냉매로부터 선택되는 구성원이다. 일부 구현예에서, 압력 하 초임계 액체는 이산화탄소(CO2)이다.
추출은 초임계 액체 상태(예를 들어, 초임계 이산화탄소)를 유지하는 고압 및 고온 하에서 일어난다. 통상적으로, 이들은 일정하게 유지된다. 이러한 압력 및 온도에서, 초임계 액체(예를 들어, 초임계 이산화탄소)는 실질적으로 일정한 유속으로 제공된다. 유속은 0.5 kg/h 내지 600 kg/h, 예컨대 1 kg/h 내지 400 kg/h, 1 kg/h 내지 250 kg/h, 1 kg/h 내지 100 kg/h, 1 kg/h 내지 50 kg/h, 1 kg/h 내지 20 kg/h, 1 kg/h 내지 10 kg/h, 10 kg/h 내지 400 kg/h, 10 kg/h 내지 250 kg/h, 10 kg/h 내지 100 kg/h, 10 kg/h 내지 50 kg/h, 10 kg/h 내지 20 kg/h, 20 kg/h 내지 400 kg/h, 20 kg/h 내지 250 kg/h, 20 kg/h 내지 100 kg/h, 20 kg/h 내지 50 kg/h, 50 kg/h 내지 400 kg/h, 50 kg/h 내지 250 kg/h, 50 kg/h 내지 100 kg/h, 100 kg/h 내지 400 kg/h, 100 kg/h 내지 200 kg/h 또는 200 kg/h 내지 400 kg/h(각각을 포함함)으로 변화될 수 있다. 예를 들어, 유속은 20 kg/h 내지 100 kg/h(이들을 포함함), 예컨대 일반적으로 약 100 kg/h 또는 100 kg/h이다.
초임계 상태로 초임계 액체를 유지하는 임의의 적합한 온도는 추출 공정을 수행하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이산화탄소의 임계 온도는 약 31℃이다. 따라서, 추출기 용기는 31℃ 초과의 온도로 유지된다. 일부 구현예에서, 추출기 용기는 온도가 32℃ 내지 80℃, 일반적으로 약 32℃ 내지 60℃ 또는 32℃ 내지 60℃(각각을 포함함)이다. 예를 들어, 온도는 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 50℃ 또는 60℃ 이하의 온도일 수 있다. 일반적으로 온도는 31℃ 초과이지만 40℃ 이하이다. 당업자는 온도가 부분적으로 추출 용매의 조성뿐만 아니라, 공정에서 이용되는 용매 중 주어진 폴록사머의 용해도에 따라서 변할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
임의의 적합한 압력이 방법에서 사용될 수 있다. 초임계 유체 추출이 이용될 때, 시스템은 초임계 액체가 임계 압력 초과의 압력에서 유지되는 것을 보장하는 수준으로 가압된다. 예를 들어, 이산화탄소의 임계 압력은 약 74 bar이다. 따라서, 추출기 용기는 74 bar 초과까지 가압된다. 특정 정도의 압력은 초임계 액체의 용해도 특징을 변경시킬 수 있다. 그러므로, 선택되는 특정 압력은 수율 및 불순물의 추출 정도에 영향을 미칠 수 있다. 통상적으로, 추출기 용기는 125 bar 내지 500 bar의 범위로 가압된다. 일부 구현예에서, 추출기 용기는 200 bar 내지 400 bar, 200 bar 내지 340 bar, 200 bar 내지 300 bar, 200 bar 내지 280 bar, 200 bar 내지 260 bar, 200 bar 내지 240 bar, 200 bar 내지 220 bar, 220 bar 내지 400 bar, 220 bar 내지 340 bar, 220 bar 내지 300 bar, 220 bar 내지 280 bar, 220 bar 내지 260 bar, 220 bar 내지 240 bar, 240 bar 내지 400 bar, 240 bar 내지 340 bar, 240 bar 내지 300 bar, 240 bar 내지 280 bar, 240 bar 내지 260 bar, 260 bar 내지 400 bar, 260 bar 내지 340 bar, 260 bar 내지 300 bar, 260 bar 내지 280 bar, 280 bar 내지 400 bar, 280 bar 내지 340 bar, 280 bar 내지 300 bar 또는 300 bar 내지 340 bar의 범위로 가압된다. 예를 들어, 추출 용기는 약 225 bar, 230 bar, 235 bar, 240 bar, 245 bar, 250 bar, 255 bar, 260 bar, 265 bar, 270 bar, 275 bar, 280 bar, 285 bar, 290 bar, 295 bar, 300 bar, 305 bar, 310 bar, 315 bar, 320 bar, 325 bar, 330 bar, 335 bar, 340 bar, 345 bar, 350 bar, 355 bar, 360 bar, 365 bar, 370 bar, 375 bar, 380 bar, 385 bar, 390 bar, 395 bar, 또는 400 bar, 또는 적어도 225 bar, 230 bar, 235 bar, 240 bar, 245 bar, 250 bar, 255 bar, 260 bar, 265 bar, 270 bar, 275 bar, 280 bar, 285 bar, 290 bar, 295 bar, 300 bar, 305 bar, 310 bar, 315 bar, 320 bar, 325 bar, 330 bar, 335 bar, 340 bar, 345 bar, 350 bar, 355 bar, 360 bar, 365 bar, 370 bar, 375 bar, 380 bar, 385 bar, 390 bar, 395 bar, 또는 400 bar에서, 그러나 일반적으로는 500 bar 이하에서 가압될 수 있다. 추출 용기는, 예를 들어 310 ± 15 bar에서 가압될 수 있다.
통상적으로, 본 명세서에서 제공되는 방법에서, 추출 용기로 도입되는 추출 용매는 또한 알칸올을 함유한다. 따라서, 추출 용매는 고압 및 고온 하에서 제2 알칸올 및 초임계 액체를 포함한다. 제2 알칸올은 초임계 액체의 조용매 개질제로서 작용하여 초임계 액체의 용매 특징을 변화시키고 방법에서 용질의 추출률을 개선시킨다. 상기 기재된 바와 같은 임의의 적합한 알칸올 또는 알칸올의 조합이 본 명세서에서 제공되는 방법에서 제2 알칸올로서 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 특정 예에서, 제2 알칸올은 메탄올이다.
제2 알칸올 및 초임계 액체, 예컨대 상기 기재된 임의의 것의 임의의 적합한 조합이 본 명세서에서 제공되는 방법에서 추출 용매에 사용될 수 있다. 일부 구현에에서, 추출 용매는 메탄올 및 이산화탄소를 포함한다. 제2 알칸올은 통상적으로 3% 내지 20%, 일반적으로는 3% 내지 15%, 예를 들어 5% 내지 12%, 5% 내지 10%, 5% 내지 9%, 5% 내지 8%, 5% 내지 7%, 7% 내지 15%, 7% 내지 12%, 7% 내지 10%, 7% 내지 9%, 7% 내지 8%, 8% 내지 15%, 8% 내지 12%, 8% 내지 10%, 8% 내지 9%, 9% 내지 15%, 9% 내지 12%, 9% 내지 10%, 10% 내지 15% 또는 10% 내지 12%(각각을 포함함)의 총 추출 용매의 백분율(w/w)로서 제공된다. 알칸올의 유속(kg/h)은 추출기로 도입된 알칸올의 양의 함수이다.
예를 들어, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 대 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)의 적합한 비율은 폴록사머 출발 물질의 동일성 및 순도에 기초하여, 또는 기타 다른 추출 매개변수, 예컨대 온도 또는 압력에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 대 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)의 비율은 약 1:100 내지 약 20:100일 수 있다. 일부 구현예에서, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 대 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)의 비율은 약 1:100 내지 약 15:100이다. 일부 구현예에서, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 대 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)의 비율은 약 2:100 내지 약 14:100이다. 알칸올(예를 들어, 메탄올) 대 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)의 비율은 약 3:100, 또는 약 4:100, 또는 약 5:100, 또는 약 6:100, 또는 약 7:100, 또는 약 8:100, 또는 약 9:100, 또는 약 10:100, 또는 약 11:100, 또는 약 12:100, 또는 약 13:100 또는 약 14:100일 수 있다.
특정 양태에서, 추출은, 추출 용매의 조성이 추출 절차 전반에 걸쳐 일정하게 유지되는 등용매 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소) 및 알칸올(예를 들어, 메탄올)의 양은, 예를 들어 초임계 액체 및 알칸올 각각의 유속을 일정하게 유지함으로써, 추출 시간에 따라 일정하다. 대안적으로, 추출 용매의 조성은, 통상적으로 추출 용매를 구성하는 초임계 액체 및/또는 알칸올 성분의 양을 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)시킴으로써 시간에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)는 일정하게 유지되는 반면, 추출 용매 중 알칸올(예를 들어, 메탄올)의 농도는 추출 시간에 따라 변한다(예를 들어, 증가 또는 감소된다). 성분의 농도는 유속을 조정함으로써 변경될 수 있다.
추출 용매의 조성이 시간에 따라 변할 수 있는 양태에서, 제2 알칸올이 단계적 구배 또는 연속적으로 증가하는 구배로서 추출 공정 진행에 따라서 증가되는 방법이 본 방법에 대하여 유리하다. 특정 예에서, 상업적 등급의 폴록사머는 주요 생성물 또는 성분과 함께 고분자량 성분과 저분자량 성분을 둘 다 가진다. 고압 이산화탄소 추출 유체 중 낮은 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 저분자량 성분을 선택적으로 제거할 수 있다. 그러나, 불순물이 풍부한 추출물의 용해도는 낮고 저분자량 성분을 상당히 감소시키는 데 시간이 걸리므로, 효율이 떨어진다. (단계적 구배 또는 연속적으로 증가하는 구배로서) 구배 방식에서 추출 용매의 알칸올 농도를 증가시킴으로써, 추출되는 저분자량 불순물의 양이 증가한다.
또한, 더 높은 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 더 높은 분자량 성분의 용해도를 증가시키고, 따라서 추출을 증가시킨다. 따라서, 추출 용매 중 연속적으로 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도가 더 높은 구배는 점차적으로 저분자량 성분뿐만 아니라, 결국 더 높은 분자량 성분, 또는 덜 가용성인 성분을 추출할 수 있다. 이를 설명하는 비제한적인 예로서, 6.6% w/w의 더 낮은 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도가 저분자량 성분을 제거할 수 있는 것으로 여겨진다. 알칸올의 농도를 1%에서 3%로 증가시키는 것은 저분자량 성분의 추출을 계속 이행하지만, 또한 더 높은 분자량 성분의 제거를 초래할 것이다. 1%에서 3%로 알칸올의 농도를 추가로 증가시키는 것은 이들 성분뿐만 아니라, 더 높은 분자량을 가지고/가지거나 이전 추출 용매 중에서 덜 가용성이었던 기타 다른 성분들을 추가로 제거할 것이다.
그러나, 더 높은 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도를 가지는 추출 용매는, 저분자량 성분에 대하여 더 높은 용해도를 제공할 뿐만 아니라, 주요 성분을 포함한 기타 다른 성분의 용해도를 증가시키기 때문에, 선택성이 없다. 그러므로, 정제된 생성물의 수율은 높은 메탄올 농도로 감소된다. 본 명세서의 방법에서 제공된 바와 같이, 구배 방식으로 추출 용매의 농도를 증가시킴으로써, 폴록사머 수율의 감소가 최소화되고, 최종 생성물의 순도가 최대화된다.
단계적으로 메탄올 농도를 증가시키는 것은 추출기의 로딩 용량을 증가시키고, 이에 의하여 주어진 추출 시스템의 처리량을 증가시키는 것이 밝혀졌다. 추출기 내부에 2상 시스템이 형성된다. 더 낮은 상은 주로 폴록사머 및 이산화탄소가 일부 용해된 메탄올의 혼합물로 이루어진다. 추출 용매(더 낮은 메탄올 조용매 분획을 가지는 이산화탄소)는 하부 상을 통해 침투한다. 상부 상은 주로 추출 용매 및 폴록사머로부터 추출된 성분으로 이루어진다. 2 가지 상의 상대적인 양은 용매 흐름 중 메탄올 농도에 따라 다르다. 통상적인 추출 시스템에서, 상부 상의 적절한 상 분리를 위해 적절한 헤드 공간이 있다. 추출 공정 동안 단계적으로 메탄올 조용매 농도를 증가시키면, 추출기 내로 더 많은 공급원료의 장입이 초래된다.
예를 들어, 공정(100)으로 돌아가서, 추출 용매의 조성은 단계(130 내지 140)에 나타낸 바와 같이 변화될 수 있다. 일부 구현예에서, 추출 용매의 중량을 기준으로 알칸올(예를 들어, 메탄올)의 백분율은 방법 과정 동안 증가된다. 메탄올/이산화탄소 혼합물 중 메탄올 함량은 추출 공정 진행에 따라서 단계적 방식 또는 연속 방식으로 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 폴록사머(예를 들어, P188)에 대한 추출 공정은 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)를 예컨대 약 5% 내지 약 10%, 예컨대 6% 내지 8%(예를 들어, 약 6.6% 또는 7.4%) 포함하는 추출 용매 중 약 3 중량% 내지 약 10 중량%(w/w)의 알칸올(예를 들어, 메탄올)을 사용하여 시작된다. 규정된 기간 후, 추출 용매의 알칸올(예를 들어, 메탄올) 함량은 약 1% 내지 3%, 예컨대 1% 내지 2%(예를 들어, 각각 7.6% 또는 9.1%로) 증가된다. 후속적으로 알칸올(예를 들어, 메탄올) 함량은 다시 최종 기간 동안 약 1% 내지 3%, 예컨대 1% 내지 2%(예를 들어, 각각 8.6% 또는 10.7%로) 상승된다. 임의의 적합한 용매 구배가 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소) 중 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 추출 절차 동안 약 5% 내지 약 20% 증가될 수 있다. 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소) 중 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 10% 증가될 수 있다. 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소) 중 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 약 6% 내지 약 18%, 또는 약 6% 내지 약 12%, 또는 약 6% 내지 약 10% 증가될 수 있다. 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소) 중 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 약 7% 내지 약 18%, 또는 약 7% 내지 약 12%, 또는 약 7% 내지 약 10% 증가될 수 있다. 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 임의의 적합한 수의 단계로 증가될 수 있다. 예를 들어, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도는 추출 절차 동안 2 단계, 또는 3 단계, 또는 4 단계, 또는 5 단계에 걸쳐서 증가될 수 있다. 당업자는 기타 다른 용매 비율 및 용매 구배가 추출 공정에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
본 명세서에서 제공되는 공정의 추출 시간은 폴록사머 수율의 감소를 최소화하고 순도를 최대화하면서, 제조물에 있어서 물질의 적합한 추출을 초래하는 임의의 정해진 기간 동안일 수 있다. 시간은 압력, 온도, 제2 알칸올 농도, 및 (예를 들어, 등용매 또는 상기 기재된 바와 같이 알칸올 농도를 증가시키는 구배로서) 추출 용매를 제공하는 공정의 함수이다. 일반적으로, 추출은 5 시간 내지 50 시간, 일반적으로 10 시간 내지 30 시간, 또는 15 시간 내지 25 시간(각각을 포함함), 예컨대 또는 약 15 시간 또는 24 시간 동안 진행된다. 방법에서 이용되는 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도가 더 높을수록, 통상적으로 추출 시간은 더 짧아진다. 또한 알칸올의 구배가 방법에서 이용되는 실시예에서, 추출의 전체 시간은 절차에서 구배 단계의 수의 함수로서 나누어진다는 것이 이해된다. 각 구배 단계에서의 추출은 동일한 양의 시간 동안 또는 상이한 시간 동안일 수 있다. 이용될 추출 시간을 경험적으로 결정하는 것은 당업자의 수준 내에 있다.
물질의 제거를 모니터링하거나 추출 매개변수, 예컨대 온도 또는 추출 용매의 조성의 조정이 필요한지 여부를 결정하기 위하여 추출 공정 동안 샘플을 수집할 수 있다.
특히, 상기 방법은 P188을 정제하는 데 사용될 수 있다. 상기 공정은 또한 기타 다른 중합체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 정제된 폴리옥시프로필렌/폴리옥시에틸렌 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은,
a) 폴리옥시프로필렌/폴리옥시에틸렌 블록 공중합체 용액을, 제1 용매에 용해되는 추출기 용기에 제공 또는 도입하여 공중합체 용액을 형성하며, 여기서 제1 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 또는 이들의 조합이고, 조성물은
i) 화학식이 HO(CH2CH2O)a '─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH인 폴리옥시프로필렌/폴리옥시에틸렌 블록 공중합체(상기 공중합체의 평균(mean 또는 average) 분자량은 약 4,000 내지 약 10,000 Da임); 및
ii) 분자량이 4,500 Da 미만인 복수의 저분자량 물질(여기서, 복수의 저분자량 물질은 조성물의 총 중량의 4% 초과를 구성함)
을 포함하는 단계;
b) 제2 용매를 첨가하여 추출 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 제2 용매는 고압 및 고온 하의 초임계 액체, 및 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 또는 이들의 조합인 알칸올을 함유하고, 추출 용매 중 제2 용매의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라서 증가되는 단계; 및
c) 추출 혼합물을 분리시켜 라피네이트 상과 추출 상을 포함하는 복수의 상을 형성하는 단계로서, 여기서 라피네이트 상과 추출 상은 개별적으로 제거되거나 분리되는 단계
를 포함한다.
상기 방법의 일부 경우에서, 공중합체의 평균 분자량은 약 7,680 Da 내지 9,510 Da, 일반적으로 8,400 Da 내지 8,800 Da, 예를 들어 약 8,400 Da 또는 8,400 Da이다. 방법에서, 공중합체 용액은 공중합체의 첨가에 의해 그리고 공중합체의 용액 또는 현탁액을 형성하는 제1 용매를 첨가함으로써 추출기 용기에서 형성될 수 있으며, 여기서 제1 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칸올을 포함한다. 대안적으로, 공중합체에 제1 용매를 첨가하여 공중합체 용액을 형성하는 것은 별도의 용기에서 수행될 수 있으며, 제1 용매에 용해되는 공중합체 용액은 추출기 용기에 제공 또는 도입(즉, 장입)된다. 일부 경우에서, 단계 c) 전에, 방법은 고압 및 고온 하에서 추출 혼합물을 교반하여 공중합체 조성물로부터 불순물(예를 들어, 저분자량의 추출가능한 성분 및 기타 다른 성분)을 추출하는 단계를 포함한다.
b. 고압 방법
본 명세서에서 제공된 폴록사머(예를 들어, P188)를 정제하는 방법은 혼합 용매 시스템을 이용하는 고압 유체 추출 방법일 수 있다. 혼합 시스템에서 용매 중 하나는 적당한 압력에서 액체로 압축될 수 있는 기체 용매, 예컨대 이산화탄소이다. 예를 들어, 메탄올 또는 에탄올의 용해력은 고압 이산화탄소로 변형되어(필수적으로 초임계 이산화탄소인 것은 아님, 즉 아임계) 폴록사머의 상이한 분획을 선택적으로 제거하는 데 필요한 정확한 용매화력을 제공할 수 있다.
이와 같은 방법에서, 추출 용매는 아임계 조건 하에서 제공되는 이산화탄소뿐만 아니라, 추출시 시간 경과에 따라 증가되는 다른 용매를 함유한다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 방법의 일부 구현예는 폴록사머 제조물 중 불순물(예를 들어, 저분자량 성분)을 제거하기 위한 추출 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 폴록사머를 제1 용매에 용해되는 추출기 용기에 제공 또는 도입하여 용액을 형성하며, 여기서 제1 용매는 알코올, 지방족 케톤, 방향족 케톤, 아민, 및 이들의 조합 중에서 선택되는 단계;
b) 추출 용매를 용액과 혼합하여 추출 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 추출 용매는 고압 이산화탄소 및 용매를 포함하고, 추출 용매 중 용매의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되는 단계; 및
c) 추출기 용기로부터 추출 용매를 제거하고, 이에 의하여 폴록사머로부터 저분자량 불순물을 제거하는 단계
를 포함한다.
제1 및 제2 용매는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 방법에서, 제1 용매에 폴록사머 용액을 용해시키는 단계는 용액을 추출 용기에 제공 또는 도입하기 전 또는 용액을 추출 용기에 제공 또는 도입할 때 일어날 수 있다. 예를 들어, 폴록사머는 별도의 용기에서 용해되고, 그 다음 용액은 추출 용기에 첨가된다.
상기 방법의 양태에서, 추출 용매는 아임계 조건 하에 있다. 이 공정에서, 용매 중 하나는 바람직하게 고압에서 액체로 압축될 수 있는 실온에서(또는 실온 근처에서) 기체이다. 액체로 압축될 수 있는 적합한 기체는 이산화탄소, 메탄, 에탄, 프로판, 암모니아, 및 프레온®으로 판매되는 냉매이다. 통상적인 용매 쌍은 하나가 추출에 의해 제거된 성분에 대한 용매인 반면, 다른 액체는 비용매이거나, 또는 그 반대인 방법으로 선택된다. 용매 쌍의 용매화 능력은 주로 혼합물 중 용매의 비에 의해 제어된다. 물질을 함유하는 생성물을 통하여 용매 쌍을 통과시킴으로써, 상대적으로 더 가용성인 성분이 추출될 수 있다. 기체 용매는 임의의 적합한 아임계 압력에서 가압될 수 있다. 예를 들어, 이산화탄소는 약 25 bar 내지 약 100 bar의 압력에서 이용될 수 있다. 압력은 약 25 bar, 30 bar, 35 bar, 40 bar, 45 bar, 50 bar, 55 bar, 60 bar, 65 bar, 70 bar, 75 bar, 80 bar, 85 bar, 90 bar, 95 bar, 또는 100 bar일 수 있다. 일부 구현예에서, 압력은 약 60 내지 약 85 bar이다. 일부 구현예에서, 압력은 약 75 bar이다.
임의의 적합한 온도가 추출 공정을 수행하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 추출기 용기는 온도가 10℃ 내지 80℃이다. 온도는, 예를 들어 약 10℃, 또는 약 15℃, 또는 약 20℃, 또는 약 25℃, 또는 약 30℃, 또는 약 35℃, 또는 약 40℃, 또는 약 45℃, 또는 약 50℃, 또는 약 55℃, 또는 약 60℃, 또는 약 65℃, 또는 약 70℃, 또는 약 75℃, 또는 약 80℃일 수 있다. 일부 구현예에서, 추출기 용기는 온도가 약 20℃ 내지 50℃이다. 예를 들어 폴록사머 188을 정제할 때, 추출기 용기는 온도가 약 20℃ 내지 약 60℃(예를 들어, 약 40℃)일 수 있다. 추출 장치 및 선택되는 추출 매개변수에 따라서 기타 다른 온도가 폴록사머 188의 정제에 적합할 수 있다. 당업자는, 부분적으로 추출 용매의 조성뿐만 아니라 공정에서 이용되는 용매 중 주어진 폴록사머의 용해도에 따라서 온도가 변할 수 있음을 인식할 것이다.
상기에서 논의된 초임계 유체 추출 방법과 유사하게, 추출은 등용매 방식으로 수행될 수 있으며, 여기서 추출 용매의 조성은 추출 절차 전체에 걸쳐 일정하게 유지된다. 예를 들어, 추출 용매 중 이산화탄소 및 용매(예를 들어, 메탄올)의 양은, 예를 들어 각각의 유속을 일정하게 유지함으로써, 추출 시간 경과에 따라 일정하다. 대안적으로, 추출 용매의 조성은, 통상적으로 추출 용매를 구성하는 이산화탄소 및/또는 기타 다른 용매(예를 들어, 메탄올)의 양을 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)함으로써, 시간 경과에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 이산화탄소는 일정하게 유지되는 반면, 추출 용매 중 기타 다른 용매(예를 들어, 메탄올)의 농도는 추출 시간 경과에 따라 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)된다. 성분의 농도는 유속을 조정함으로써 변경될 수 있다. 용매의 특정 농도, 및 이용되는 농도의 구배는 초임계 추출 방법에 대하여 상기 논의된 것과 유사할 수 있다. 원하는 순도 또는 수율을 달성하기 위해 농도 및 추출 시간을 적절하게 조정하는 것은 당업자의 수준 내에 있다.
물질의 제거를 모니터링하거나 추출 매개변수, 예컨대 온도 또는 추출 용매의 조성의 조정이 필요한지 여부를 결정하기 위하여 추출 공정 동안 샘플을 수집할 수 있다.
특히, 상기 방법은 P188을 정제하는 데 사용될 수 있다. 상기 공정은 또한 기타 다른 중합체에 적용될 수 있다. 혼합 용매 시스템의 이익은 혼합 시스템을 사용하여 고분자량(HMW) 물질 및/또는 저분자량(LMW) 물질의 효과적인 제거를 포함한다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 정제된 폴리옥시프로필렌/조성물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은
a) 폴리옥시프로필렌/폴리옥시에틸렌 블록 공중합체 조성물을, 제1 용매에 용해되는 추출기 용기에 제공 또는 도입하여 공중합체 용액을 형성하며, 여기서 제1 용매는 알코올, 지방족 케톤, 방향족 케톤, 아민 및 이들의 혼합물이고, 조성물은
i) 폴리옥시프로필렌/폴리옥시에틸렌 블록 공중합체(여기서, 상기 공중합체의 평균 분자량은 약 4,000 내지 약 10,000 Da임); 및
ii) 분자량이 4,000 Da 미만인 복수의 저분자량 물질(여기서, 복수의 저분자량 물질은 조성물의 총 중량의 4% 초과를 구성함)
을 포함하는 단계;
b) 제2 용매를 첨가하여 추출 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서 제2 용매는 고압 이산화탄소 및 제1 용매를 포함하고, 추출 용매 중 제1 용매의 농도는 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되는 것인 단계; 및
c) 추출 혼합물을 분리시켜 라피네이트 상과 추출 상을 포함하는 복수의 상을 형성하고, 라피네이트 상과 추출 상은 개별적으로 제거되거나 분리되는 단계
를 포함한다.
폴록사머가 정제된 폴록사머 188일 때, 공중합체의 평균 분자량은 약 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예컨대 일반적으로 8,400 Da 내지 8,800 Da, 예를 들어 약 8,400 Da 또는 8,400 Da이다. 방법에서, 공중합체 용액은 공중합체의 첨가에 의해 그리고 공중합체의 용액 또는 현탁액을 형성하는 제1 용매를 첨가함으로써 추출기 용기에서 형성될 수 있으며, 여기서 제1 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칸올을 포함한다. 대안적으로, 공중합체에 제1 용매를 첨가하여 공중합체 용액을 형성하는 것은 별도의 용기에서 수행될 수 있으며, 제1 용매에 용해되는 공중합체 용액은 추출기 용기에 제공 또는 도입(즉, 장입)된다. 일부 경우에서, 단계 c) 전에, 방법은 고압 및 고온 하에서 추출 혼합물을 교반하여 공중합체 조성물로부터 불순물(예를 들어, 저분자량의 추출가능한 성분 및 기타 다른 성분)을 추출하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 이러한 접근법은 초임계 유체 추출 공정의 밀도 변화 및 투과성 특징을 가지지 않는다. 용매 재순환은 용이하고 에너지 효율적이다. 통상적인 고압 추출에서, 추출된 성분을 함유하는 배출 스트림에 기체로서 더 휘발성인 용매의 분리 및 상 분리를 야기하는 더 낮은 압력을 가한다. 이는 추출된 성분이 풍부한 기타 다른 용매를 남긴다. 추출 공정은 추출가능한 성분이 실질적으로 혼합물로부터 제거될 때까지 계속된다. 기체 용매는 액체로 다시 압축되고 계속되는 추출에서 이용될 수 있다. 최소한의 압력 변화로 용매 혼합물로부터 완전히 분리되는 압축성 용매가 선택되기 때문에, 이러한 용매 재순환 공정은 효율적이다.
2. 추출 용기 및 시스템
본 명세서에서 제공된 방법 중 임의의 것에 대하여, 도 4의 시스템(200)은 제공된 방법의 실시를 위한 하나의 구현예를 나타낸다. 시스템(200)은 초임계 유체 또는 아-초임계 방법을 사용하여 폴록사머로부터 불순물(예를 들어, LMW 물질 및/또는 기타 다른 성분)을 추출하는 데 사용될 수 있는 하나의 시스템이다. 중합체 공급 펌프(201)는 정제될 폴록사머(예를 들어, P188)로 장입된다. 폴록사머는 밸브(205)를 통해 중합체 공급 탱크(207)로 전달된다. 추출기 용기(215)는 샘플로부터 추출된 불순물, 예컨대 폴록사머로부터 LMW 물질 또는 기타 다른 성분을 제거하는 데 사용된다. 이산화탄소(또는 기타 다른 초임계 액체 또는 아-초임계 액체) 펌프(208)는 밸브(243) 및 예비 냉각기(203)을 통해 외부 이산화탄소 공급물(250) 유래의 이산화탄소로 장입된다. 이산화탄소는 펌프(208)로부터 열교환기(210)으로 펌핑된 다음, 추출기(215)로 펌핑된다. 메탄올(또는 기타 다른 적합한 용매)는 펌프(209)를 통해 추출기(215)로 펌핑된다. 이와 같은 구현예에서, 메탄올 및 이산화탄소는 추출기(215) 내 폴록사머로부터, 불순물, 예컨대 LMW 물질 또는 기타 다른 성분을 추출한다. 추출 후, 정제된 폴록사머 혼합물은 신속한 감압 처리를 통해 배출되고 수집된다. 추출된 성분은 수집기(225), 감압 용기(227), 및 사이클론 분리기(231)를 사용하여 용매 스트림으로부터 분리된다. 수집기(225)에서 수집 동안 방출된 이산화탄소 증기는 응축기(232)를 사용하여 액화되고 재순환될 수 있다.
일부 구현예에서, 추출 장치는 추출 용기의 하부에서 "유동" 층을 형성하는 특정 형상의 입자를 함유하는 용매 분포 시스템을 포함할 수 있다. 상기 층은 스크린 또는 스트레이너 또는 소결 금속 디스크에 의해 지지될 수 있다. 상기 층에 사용되는 입자는 완벽한 형상의 구체 또는 불규칙한 형상의 입자, 예컨대 자갈의 형상일 수 있다. 다공도가 더 적거나 표면 거칠기가 더 적은 매끄러운 표면을 갖는 것이 세정을 용이하게 하는 데 바람직하다. 이러한 이점은 제약 제조 공정에서 검증될 수 있다.
상기 층을 형성하는 입자의 밀도는 용매 밀도보다 더 크도록 선택되어 상기 층이 추출 공정 동안 유입 용매 흐름에 의해 방해받지 않은 상태로 유지된다. 입자의 크기는 균일하거나 상이한 크기의 분포를 가져서 층의 충전 밀도 및 다공도를 제어할 수 있다. 충전 분포 배열은 추출 용기를 나가기 전에 용매 입자의 균형잡힌, 최적의 추출 및 후속 합체를 제공하도록 설계된다. 이는 폴록사머가 장입된 추출기의 최대 로딩을 용이하게 한다. 이는 또한 추출 효율을 최대화시키고, 추출 시간을 최소화하며, 추출 용기로부터 정제된 생성물의 바람직하지 않은 캐리-오버(carry-over)를 최소화할 수 있다.
상기 층 내의 구체 크기는 추출 용기의 치수, 추출 용기 내 용매 액적의 체류 시간, 및 합체하는 용매 액적의 능력을 포함하여 하나 이상의 시스템 특성에 기초하여 선택된다. 구체의 직경은 약 5 mm 내지 약 25 mm의 범위일 수 있다. 직경은 평균 직경일 수 있고, 여기서 상기 층은 상이한 크기의 구체를 함유한다. 대안적으로, 상기 층 내 모든 구체는 동일한 직경을 가질 수 있다. 용매 분포 층에서 상이한 크기의 스테인리스강 구체의 단면의 예는 도 5에 나타내어져 있다.
따라서, 효율적인 용매 추출 장치가 제공된다. 상기 장치는
a) 추출기 하부의 분배 시스템(여기서, 분포 시스템은 복수의 구체를 포함함); 및
b) 추출기 상부의 입자 합체 시스템
을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 구체는 금속 구체, 세라믹 구체, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 구체는 동일한 크기이다. 일부 구현예에서, 복수의 구체는 상이한 크기의 구체를 포함한다. 일부 구현예에서, 입자 합체 시스템은 데미스터 패드(demister pad), 스태틱 미스터(static mister), 및 온도 구역으로부터 선택되는 하나 이상의 부재를 포함한다.
3. 추출 및 추출용매의 제거
본 명세서에서 제공된 방법 중 임의의 것은 배치 방법으로서 또는 연속 방법으로서 실행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 배치 방법이다. 배치 방법은 상기 기재된 바와 같은 다양한 치수 및 크기의 추출 용기를 이용하여 실행될 수 있다. 예를 들어, 장비 트레인은 120 L의 고압 추출기를 포함할 수 있다. 적절한 용매(예를 들어, 알칸올 용매, 예컨대 메탄올)에 용해된 폴록사머인 폴록사머(예를 들어, P188) 용액은 추출 용기 내로 제공 또는 도입된다. 추출 용매, 예컨대 상기 방법에 기재된 임의의 것(예를 들어, 초임계 또는 고압 이산화탄소 및 메탄올)은 제어된 온도, 흐름 및 압력으로 유지된 추출 용기 내로 독립적으로 그리고 연속적으로 펌핑된다. 물질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 추출 용매 조성을 변화시킴으로써 제거된다. 대안적으로, 추출 공정 조건, 예컨대 온도 및 압력은 또한 독립적으로 또는 조합하여 변화될 수 있다. 하기 기재된 바와 같이, 물질이 제거된 후, 정제된 생성물을 적합하게 설계된 사이클론 분리기 내로 배출하여 이산화탄소 기체로부터 정제된 생성물을 분리한다. 생성물을 건조하여 잔류 알칸올 용매를 제거한다.
일부 구현예에서, 추출 방법은 연속 방법이다. 통상적인 연속 추출에서, 적절한 용매(예를 들어, 알칸올 용매, 예컨대 메탄올)에 용해된 폴록사머인 폴록사머(예를 들어, P188) 용액은 적합한 충전 물질로 충전된 고압 추출 컬럼의 중간 지점에 로딩된다. 추출 용매는 역류 방식으로 하부로부터 추출 컬럼을 통해 펌핑된다. 추출 물질, 예컨대 LMW 물질 또는 기타 다른 성분은 컬럼의 상부에서 제거되는 반면, 정제된 생성물은 컬럼의 하부로부터 제거된다. 정제된 생성물은 추출기 컬럼의 하부에서 연속적으로 수집되고 주기적으로 제거되며, 특별히 설계된 사이클론 분리기로 배출된다. 후속적으로 잔류 메탄올을 함유하는 정제된 중합체 입자는 진공 하에서 건조된다.
정제된 폴록사머 생성물에서 요구되는 순도 수준에 따라, 추출 단계는 주어진 배치에 대해 반복될 수 있다. 즉, 추출 용매의 추가적인 부분이 추출기 용기 내로 도입될 수 있고, 충분한 수준의 폴록사머 순도가 얻어질 때까지 제거된다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 방법의 일부 구현예는 상기 기재된 바와 같은 추출 방법을 제공하며, 여기서 단계 c) 후 상기 방법은 단계 b) 및 c)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 단계 b) 및 c)는 폴록사머가 충분히 순수할 때까지 반복될 수 있다. 예를 들어, 단계 b) 및 c)는 1 회, 2 회, 또는 3 회, 또는 4 회, 또는 5 회, 또는 반복적인 방식으로 반복될 수 있다.
폴록사머 물질이 충분히 순수할 때, 생성물은 추가 가공을 위해 준비된다. 일부 구현예에서, 생성물은 도 1에 요약된 바와 같은 공정(100)에 따라서 처리된다. 단계(145)에 나타낸 바와 같이, 생성물은 추출기 용기로부터 방출되고 적절한 수용기에서 수집될 수 있다. 습윤 생성물은 단계(150)에 나타낸 바와 같이 순도, 화학적 안정성, 또는 기타 다른 특성에 대하여 시험하기 위해 샘플링될 수 있다. 생성물은 진공 하에서 잔류 용매를 제거함으로써 건조될 수 있다. 진공 수준은 건조 속도를 제어하도록 조정될 수 있다. 건조는 상온, 또는 필요하다면 고온에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 건조 온도는 폴록사머의 융점 미만으로 유지된다. 습윤 생성물은 단일 로트 또는 하위 로트로서 더 작은 부분으로 건조될 수 있다. 단계(160 내지 170)에 나타낸 바와 같이, 생성물의 건조는, 예를 들어 진공 하 상온에서 하위 로트 상에서 개시될 수 있다. 그 다음, 건조는 공정이 진행됨에 따라 더 높은 온도 및 더 낮은 압력에서 계속될 수 있다. 필요하다면, 예를 들어 하위 로트에서 수집이 이루어진다면, 습윤 생성물의 임의의 잔여 부분은 공정(100)의 단계(175)에 나타낸 바와 같이 유사한 방식으로 처리될 수 있다. 생성된 생성물, 예컨대 합해진 다양한 하위 로트는 단계(180)에 나타낸 바와 같이 적합한 용기에서 혼합되고, 생성된 생성물은 특성화되거나, 저장되거나, 운반되거나, 제형화될 수 있다.
유리하게, 본 명세서에 개시된 방법은 효과적으로 이산화탄소를 재순환시킨다. 특히, 초임계 이산화탄소 또는 고압 이산화탄소는 추출 상에 온도와 압력의 변화를 가함으로써 회수될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 이용되는 방법은 재순환 효율이 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과이다.
본 명세서에서 제공되는 방법에서(예를 들어, 상기 단계 a) 내지 c) 참조), 추출 상은 추가로 처리될 수 있다. 방법은, 추출 상을 여러 개의 분리 용기로 이루어진 시스템에 통과시키는 단계; 불순물(예를 들어, 저분자량 불순물)을 분리하는 단계; 정제된 물질 또는 라피네이트를 처리하는 단계; 및 재사용을 위해 압축된 이산화탄소를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법 중 임의의 것에서, 방법 및 생성된 생성물을 평가함에 있어서 다양한 매개변수가 평가될 수 있다. 예를 들어, 메탄올 농도, 구배 프로파일, 온도, 및 압력과 같은 매개변수가 공정 최적화를 위해 평가될 수 있다. 습윤 라피네이트를 건조시키기 위한 공정 및 적합한 조건, 예컨대 진공 수준, 혼합 방식, 시간, 및 온도가 또한 평가될 수 있다.
4. 정제된 폴록사머의 제조를 위한 예시적인 방법
본 명세서에서 상기에 제공된 방법은 특정한 정제된 폴록사머 제조물, 특히 LCMF P188 제조물의 생성을 초래한다. 특히, 본 명세서에서 제공된 방법은 화학식 HO(CH2CH2O)a'-(CH2CH(CH3)O)b-(CH2CH2O)aH를 가지고, 공중합체의 평균 분자량이 7,680 Da 내지 9,510 Da, 예컨대 일반적으로는 본 명세서에 제공된 바와 같은 P188 공중합체를 정제하는 데 사용될 수 있고, 8,400 Da 내지 8,800 Da, 예를 들어 약 8,400　Da 또는 8,400　Da이고, 분자량이 4,000 Da 미만인 복수의 저분자량 물질을 함유하는 P188 공중합체를 정제하는 데 사용될 수 있으며, 복수의 저분자량 물질은 조성물의 총 중량의 4% 초과를 구성한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 약 4% 미만, 예컨대 약 3%, 2% 또는 1%의 저분자량 성분을 포함하는 정제된 폴록사머를 생성한다. 통상적으로, 저분자량 성분은 글리콜, 및 휘발성 분해 불순물, 예컨대 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 아세톤, 메탄올, 및 과산화물을 포함한다. 특정 예에서, 본 명세서의 공정은 저분자량 성분이 실질적으로 없는, 즉 상기 성분을 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만으로 포함하는 폴록사머를 생성한다. 상기 방법은 또한 장기 순환 물질이 없는 폴록사머를 생성할 수 있으므로, 정제된 폴록사머가 대상체에 투여될 때, 혈액 또는 혈장 중에서 반감기가 폴록사머 분포 중 주요 성분의 반감기가 5.0 배 초과로 더 긴 물질이거나 이러한 물질을 생성하는 폴록사머 중 성분은 없으며, 예컨대 일반적으로 4.0 배, 3.0 배, 2.0 배, 또는 1.5 배 이하이다. 하기 논의는 이와 같은 정제된 폴록사머를 생성하는 방법의 예시를 상술한다.
a. 저분자량(LMW) 성분의 제거
도 2는 폴록사머에서 LMW 물질을 제거하는 데 유용한 공정(100')을 제공하는 본 명세서의 방법의 특정 구현예를 도시한다. 추출 시스템은 단계(110')에 나타낸 바와 같이, 제1 알칸올(예를 들어, 메탄올)을 공급 혼합물 탱크에 분배하기 전에, 단계(105')에 나타낸 바와 같이 가압된다. 시스템은 추출 공정에 적합한 온도까지 가열되며, 상기 온도는 약 31℃인 공정에서 사용되는 이산화탄소의 임계 온도 초과의 온도이다. 통상적으로, 온도는 40℃ 이하이다. 온도는 일반적으로 공정을 통해 일정하게 유지된다.
제1 알칸올(예를 들어, 메탄올)은 공정(100')에서 단계(115')에 따라서 폴록사머 용액을 형성하는 데 사용된다. 이 공정에서, P188 폴록사머를 알칸올(예를 들어, 메탄올)을 포함하는 공급 탱크에 분배하면 알칸올(예를 들어, 메탄올)에 용해된 P188 폴록사머 용액이 생성된다. 상기 방법에서의 사용을 위한 폴록사머의 양은 임의의 양, 예컨대 본 명세서에서 상기 기재된 임의의 양일 수 있다. 폴록사머/알칸올 혼합물을 형성한 후, 혼합물의 전부 또는 부분은 단계(120')에 나타낸 바와 같은 추출기 내로 펌핑된다. 일부 경우에서, 폴록사머 용액은 알칸올과 혼합하기 전에 고체인 폴록사머를 추출기 내로 도입함으로써 추출 용기에서 형성될 수 있다.
그 다음, 추출기는 가압되고 추출 용매는 공정(100')의 단계(125')에 나타낸 바와 같이 추출기 내로 도입된다. 추출 용매는 통상적으로 이산화탄소를 함유하고, 추출은 상기 기재된 바와 같은 31℃의 임계 온도 초과의 온도에서 그리고 74 bar의 임계 압력 초과의 고압 하에서 실행된다. 예를 들어, 예시적인 방법에서, 추출 용기는 약 310 ± 15 bar으로 가압되고, 이산화탄소는 20 kg/h 내지 50 kg/h, 예컨대 일반적으로 약 24 kg/h(즉, 390 g/분) 또는 24 kg/h인 유속으로 제공된다.
그 다음, 추출은 이산화탄소의 조용매 개질제로서 작용하는 제2 알칸올의 존재 하에 수행된다. 제2 알칸올, 예컨대 메탄올은, 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도가 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되도록 구배 단계 방식으로 첨가된다. 예를 들어, 추출 용매의 조성은 단계(130' 내지 140')에 나타낸 바와 같이 변할 수 있다. 예를 들어, 단계(130')에 나타낸 바와 같이,폴록사머(예를 들어, P188)에 대한 추출 공정은 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)를 포함한 추출 용매 중 알칸올(예를 들어, 메탄올)의 약 5 중량% 내지 7 중량%(예를 들어, 약 6.6%)를 사용하여 시작한다. 정해진 기간 동안, 추출 용매의 알칸올(예를 들어, 메탄올) 함량은 약 1% 내지 3%, 예컨대 1% 상승된다(예를 들어, 7.6%로 상승). 후속적으로, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 함량은 최종 기간 동안 약 1% 내지 3%, 예컨대 1% 다시 상승된다(예를 들어, 8.6%로 상승). 추출 방법의 총 시간은 15 시간 내지 25 시간일 수 있다. 각각의 구배는 총 시간의 일부 동안 실행된다.
상업적으로 효과적인 정제 공정을 위하여, 프로파일이 저분자량 성분의 대부분을 선택적으로 제거하도록 적합하게 개질되는 경우 연속적으로 메탄올 농도를 증가시키는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 후속적으로 잔류 저분자량 성분은 단기간에 높은 메탄올 농도를 이용하여 제거될 수 있다. 그러므로 약 5% 내지 10%(예를 들어, 6.6%)의 메탄올이 12 시간 동안 사용되고, 더 높은 농도의 메탄올이 10 시간 동안 사용되며, 최종적으로 훨씬 더 높은 농도의 메탄올이 4 시간 동안 사용되는 단계식 메탄올 농도 프로파일이 현저하게 전반적인 수율을 감소시키지 않고 고분자량 성분을 풍부하게 하지 않으면서 고수율로 정제된 생성물을 생성하는 데 사용된다.
폴록사머 물질이 충분히 순수한 경우, 생성물은 공정(100')에 나타낸 바와같이 추가 처리를 위해 준비된다. 단계(145')에 나타낸 바와 같이, 생성물은 추출기 용기로부터 방출되고 적절한 수용기에서 수집될 수 있다. 단계(150')에 나타낸 바와 같이, 습윤 생성물은 순도, 화학적 안정성, 또는 기타 다른 특성에 대하여 시험하기 위해 샘플링될 수 있다. 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 진공 하에서 잔류 용매를 제거함으로써 건조될 수 있다. 예시적인 방법에서, 단계(160' 내지 170')에 나타낸 바와 같이, 건조는 진공 하 상온에서 하위 로트로 개시될 수 있고, 그 다음 건조는 공정이 진행됨에 따라 더 높은 온도 및 더 낮은 압력에서 계속될 수 있다. 잔류 하위 로트는 공정(100)의 단계(175')에 나타낸 바와 같이 유사한 방식으로 처리될 수 있다. 하위 로트는 단계(180')에 나타낸 바와 같이 적합한 용기에서 합해지고 혼합되며, 생성된 생성물은 특성화되거나, 저장되거나, 운반되거나, 제형화될 수 있다.
b. 장기 순환 물질이 없는( LCMF ) 폴록사머의 제조
도 3은 LCMF 폴록사머의 제조에 대한 구현예를 도시한다. 본 명세서의 방법의 특정 구현예는 대상체에 투여한 후, 본 명세서에 기재된 바와 같이 혈장 또는 혈액에서 장기 순환 물질을 생성하는 임의의 성분을 함유하지 않는 폴록사머를 생성하는 공정(100")을 제공한다. 단계(105")에 나타낸 바와 같이, 폴록사머 및 제1 알칸올(예를 들어, 메탄올)은 추출기 용기 내로 분배되고, 폴록사머 용액을 형성한다. 이 공정에서, 알칸올(예를 들어, 메탄올)을 포함하는 추출 용기 내로의 P188 폴록사머의 분배는 알칸올(예를 들어, 메탄올)에 용해된 P188 폴록사머 용액을 생성한다. 상기 방법에서의 사용을 위한 폴록사머의 양은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 양일 수 있다. 일부 경우에, 폴록사머 용액은 별도의 용기에서 형성될 수 있고, 폴록사머 용액은 추출기 용기로 운반될 수 있다.
추출 시스템은 단계(110")에 나타낸 바와 같이, 제1 알칸올(예를 들어, 메탄올) 및 폴록사머를 분배한 후에 가압된다. 단계(115")에 나타낸 바와 같이, 시스템은 추출 공정에 적합한 온도까지 가열되고, 상기 온도는 공정에서 사용되는 이산화탄소의 임계 온도, 즉 약 31℃ 초과의 온도이다. 통상적으로, 상기 온도는 35℃ 내지 45℃이다. 온도는 일반적으로 공정을 통해 일정하게 유지된다. 폴록사머 용액은 정해진 기간 동안, 일반적으로 몇 시간 미만 동안 약 49 bar의 가압 이산화탄소 및 약 35℃ 내지 약 45℃ 또는 45℃의 온도 하에서 형성된다.
그 다음, 추출기는 가압되고 추출 용매는 공정(100")의 단계(120")에 나타낸 바와 같이 추출기 내로 도입된다. 추출 용매는 통상적으로 이산화탄소 및 제2 알칸올을 함유하고, 추출은 상기 기재된 바와 같이 31℃인 임계 온도 초과의 온도 및 74 bar인 임계 압력 초과의 고압 하에서 실행된다. 예를 들어, 예시적인 방법에서, 추출 용기는 약 247 ± 15 atm bar(240 bar 내지 260의 범위)로 가압되고, 이산화탄소는 50 kg/h 내지 120 kg/h(이들을 포함함), 예컨대 일반적으로 약 또는 대략적으로 100 kg/h인 유속으로 제공된다.
추출은 이산화탄소의 조용매 개질제로서 작용하는 제2 알칸올의 존재 하에서 수행된다. 단계(125" 내지 135")에 나타낸 바와 같이, 제2 알칸올, 예컨대 메탄올은 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도가 추출 방법의 시간 경과에 따라 증가되도록 구배 단계 방식으로 첨가된다. 예를 들어, 추출 용매의 조성은 단계(125" 내지 135")에 나타낸 바와 같이 변할 수 있다. 예를 들어, 단계(125")에 나타낸 바와 같이, 폴록사머(예를 들어, P188)에 대한 추출 공정은 초임계 액체(예를 들어, 이산화탄소)를 포함한 추출 용매 중 알칸올(예를 들어, 메탄올)의 약 7 중량% 내지 8 중량%(예를 들어, 약 7.4% 또는 7.4%)를 사용하여 시작한다. 정해진 기간 후, 추출 용매의 알칸올(예를 들어, 메탄올) 함량은 약 1% 내지 3%, 예컨대 2% 상승된다(예를 들어, 9.1%로 상승). 후속적으로, 알칸올(예를 들어, 메탄올) 함량은 최종 기간 동안 약 1% 내지 3%, 예컨대 2% 다시 상승된다(예를 들어, 10.7%로 상승). 추출 방법의 총 시간은 15 시간 내지 25 시간(이들을 포함함)일 수 있다. 각각의 구배는 총 시간의 일부 동안 실행된다.
투여될 때, 보다 장기의 순환 형태를 생성하는 성분을 포함하여, 저분자량 성분 이외의 성분을 제거하는 추출 공정에 있어서, 수율 감소를 최소화하면서 순도 및 이들 성분의 제거를 최대화하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로 7 중량% 내지 8 중량%에서 시작하는 기타 다른 방법에서보다 알칸올(예를 들어, 메탄올)의 더 높은 농도로부터 시잘할 때 알칸올(예를 들어, 메탄올) 농도를 연속적으로 증가시키면, 수율 감소를 최소화하면서 프로파일이 이들 성분 및 저분자량 성분을 선택적으로 제거하도록 적합하게 변형된다. 예를 들어, 이와 같은 예시적인 방법은 55% 초과, 일반적으로 60% 또는 65% 초과의 수율로 생성할 수 있다. 후속적으로 잔류 저분자량 성분은 단기간에 높은 메탄올 농도를 이용하여 제거될 수 있다. 그러므로 약 7% 내지 8%(예를 들어, 7.4%)의 메탄올이 3 시간 동안 사용되고, 더 높은 농도의 메탄올(예를 들어, 9.1%)이 약 4 시간 동안 사용되며, 최종적으로 훨씬 더 높은 농도의 메탄올(예를 들어, 10.7%)이 약 8 시간 동안 사용되는 단계식 메탄올 농도 프로파일이 현저하게 전반적인 수율을 감소시키지 않으면서 고수율로 정제된 생성물을 생성한다.
폴록사머 물질이 충분히 순수한 경우, 생성물은 공정(100")에 나타낸 바와같이 추가 처리를 위해 준비된다. 단계(140")에 나타낸 바와 같이, 생성물은 추출기 용기로부터 방출되고 적절한 수용기에서 수집될 수 있다. 단계(145")에 나타낸 바와 같이, 생성물은 기체 포화 용액으로부터의 입자(particles from gas saturated solutions; PGSS) 기법을 통해 감압 하에서 침전될 수 있다. 생성물은 본 명세서에 기재된 바와같이 진공 하에서 잔류 용매를 제거함으로써 건조될 수 있다. 예시적인 방법에서, 단계(150" 내지 165")에 나타낸 바와 같이, 건조는 진공 하 35℃ 내지 45℃의 고온에서 개시될 수 있다. 건조된 생성물은 단계(160")에 나타낸 바와 같이 수집될 수 있다. 생성된 생성물은 단계(165")에 나타낸 바와 같이 특성화되거나, 저장되거나, 운반되거나, 제형화될 수 있다.
5. LCMF 폴록사머의 동일성을 확인하기 위한 방법
본 명세서의 방법 또는 기타 다른 방법에 의해 제조된 폴록사머 188 제조물이 LCMF 폴록사머 188임을 확인하기 위하여, 폴록사머의 특성이 평가될 수 있다. 특성은 인간 또는 동물 모델에 투여시 더 오래 순환하는 물질의 부재, LCM 물질을 함유하는 폴록사머의 제조물에 비하여 역상(RP)-HPLC에서 폴록사머, 예컨대 미국 특서 번호 5,696,298에 기재된 폴록사머 및 상업적으로 입수가능한 폴록사머 188(예를 들어, 상표명 Pluronic® F-68, Flocor®, Kolliphor® 및 Lutrol®로 판매되는 것)의 거동, 및 본 명세서에 예시된 조건 하에서 RP-HPLC에서의 거동을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다(즉, 실시예 7 참조). 제조물에 LCM 물질이 없다는 것을 확인하는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
E. 약학 조성물 및 제형
폴록사머 P188, 예컨대 본 명세서에서 제공되는 방법에 의해 제조되는 임의의 것을 함유하는 조성물이 제공된다. 특히, LCMF 폴록사머, 특히 LCMF 폴록사머 P188을 함유하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 조성물은 P188이 공지되어 있거나 치료할 수 있는 임의의 질환 또는 병태, 예컨대 섹션 F에 기재된 임의의 것을 치료하는 데 사용되거나 상기 질환 또는 병태를 치료하는 방법에서 사용된다.
1. 제형
P188, 예컨대 LCMF P188을 함유하는 약학 조성물은 선택된 양의 폴록사머를 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합함으로써 임의의 통상적인 방식으로 제형화되어 제형을 생성할 수 있다. 제형, 담체 및/또는 부형제의 선택은 투여 전문가의 기량에 속하며, 다수의 매개변수에 따라 달라질 수 있다. 이는, 예를 들어 투여 방식(즉, 전신, 구강, 비강, 폐, 국소, 국부, 또는 임의의 기타 다른 방식) 및 치료될 증상, 장애, 또는 질환을 포함한다.
효과적인 농도의 P188, 예컨대 LCMF P188은, 전신, 국부 또는 국소 투여에 적합한 약학적 담체 또는 비히클과 혼합된다. 공중합체의 투여에 적합한 약학적 담체 또는 비히클은 특정 방식의 투여에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 담체를 포함한다. 치료학적 유효량의 P188, 예컨대 LCMF P188을 포함하는 약학 조성물은 또한 투여 전에 즉시 재구성되는, 예컨대 멸균수를 이용하여 재구성되는 동결 건조 분말로서 제공될 수 있다.
화합물은 미분화된 상태 또는 기타 다른 적합한 형태로 현택될 수 있거나 유도체화되어 보다 가용성인 활성 생성물을 생성할 수 있다. 생성된 혼합물의 형태는 의도된 투여 방식, 및 선택된 담체 또는 비히클 중 P188, 예컨대 LCMF P188의 용해도를 포함하여, 다수의 인자에 따라 다르다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 및 기타 다른 이와 같은 혼합물이고, 비수성 또는 수성 혼합물, 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 포말, 에어로졸, 관주제, 스프레이, 좌제, 붕대, 또는 전신, 국부 또는 국소 투여에 적합한 임의의 기타 다른 제형으로 제형화될 수 있다. 국소 내부 투여, 예컨대 근육내, 비경구 또는 관절내 투여에 있어서, 폴록사머는 등장성 완충 식염수와 같은 수성-기반 매질 중 용액 현탁액으로서 제형화될 수 있거나 내부 투여용으로 의도된 생체적합성 지지체 또는 생체접착제와 조합될 수 있다.
일반적으로, 약학적으로 허용가능한 조성물은 관리 기관에 대한 승인을 고려하여 제조되거나 동물 및 인간에서의 사용을 위하여 일반적으로 인정되는 약전에 따라서 제조된다. 약학 조성물은 이형체(isoform)가 같이 투여되는, 담체, 예컨대 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있다. 이와 같은 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일(석유, 동물, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함함), 예컨대 땅콩기름, 대두유, 광유, 및 참기름일 수 있다. 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때, 물은 통상적인 담체이다. 염류 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주사가능한 용액을 위한, 액체 담체로서 이용될 수 있다. 조성물은 활성 성분, 즉 희석제, 예컨대 락토스, 수크로스, 인산이칼슘, 또는 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 고무, 예컨대 아카시아 검 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 공지된 기타 다른 이와 같은 결합제와 함께 함유될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 및 에탄올을 포함한다. 원한다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트르산나트륨, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 및 기타 다른 이와 같은 제제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 및 지효성 제형의 형태를 취할 수 있다. 흡읍기 또는 취입기에서의 사용을 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴)은 치료 화합물 및 적합한 분말 기재, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다. 이와 같은 조성물은, LCMF 형태를 포함하여 본 명세서에 기재된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께 치료적 유효량의 P188을 함유하여 대상체 또는 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공할 것이다.
제형은 투여 방식에 적합하도록 선택된다. 예를 들어, P188, 예컨대 LCMF P188을 함유하는 조성물은 주사에 의한(예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한) 비경구 투여용으로 제형화된다. 주사가능한 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있다. 완충제, 보존제, 산화방지제, 및 적합한 성분이 필요에 따라 혼입될 수 있거나, 대안적으로 제형을 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은, 제형이 투여의 의도된 경로와 양립할 수 있게 하는 산화방지제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 별균 주사 용액을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 제형은 단위 용량 또는 다회 용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알, 프리필드 시린지 또는 기타 다른 전달 장치로 제공될 수 있으며, 수용액, 건조 또는 냉동건조(동결건조) 조건에서 저장되어, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 할 수 있다.
P188, 예컨대 LCMF P188은 조성물 중 유일한 약학 활성 성분으로서 제형화될 수 있거나 기타 다른 활성 성분과 조합될 수 있다. 조직-표적 리포좀을 포함하여 리포좀 현탁액은 또한 약학적으로 허용가능한 담체로서 적합할 수 있다. 상기 현탁액은 당업자에게 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형은 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 리포좀 전달은 또한, 약학 매트릭스, 예컨대 콜라게 겔 및 피브로넥틴으로 개질된 리포좀을 포함하여 지효성 제형을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Weiner et al. (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-925] 참조). 본 명세서에서 제공되는 조성물은, 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 보조제, 예컨대 불활성 담체, 또는 콜로이드성 분산 시스템(이로 제한되지는 않음)를 추가로 함유할 수 있다. 이와 같은 불활성 담체의 대표적이면서 비제한적인 예는 물, 이소프로필 알코올, 기체 플루오로카본, 에틸 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 프로필렌 글리콜, 겔-생성 물질, 스테아릴 알코올, 스테아르산, 스펌아세티, 소르비탄 모노올리에이트, 메틸셀룰로스뿐만 아니라, 이들 중 둘 이상의 적합한 조합으로부터 선택될 수 있다.
P188, 예컨대 LCMF P188은 치료되는 대상에 대하여 바람직하지 않은 부작용의 부재 하에서 치료적으로 유용한 효과를 발휘하는 데 충분한 양으로 약학적으로 허용가능한 담체 중에 포함된다. 치료적으로 유효한 농도는 공지된 시험관내 및 생체내 시스템, 예컨대 본 명세서에서 제공되는 분석법으로 화합물을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.
2. 투여량
본 명세서에서 제공되는 P188, 예컨대 LCMF P188을 함유하는 약학 조성물은 단일 투여량 (직접) 투여, 다회 투여량 투여용으로 또는 희석 또는 기타 다른 변형을 위하여 제형화될 수 있다. 제형 중 화합물의 농도는 투여시 의도된 처리에 효과적인 양의 전달에 효과적이다. 당업자는 본 명세서의 방법에 따라 투여하기 위하여 조성물을 용이하게 제형화할 수 있다. 예를 들어, 조성물을 제형화하기 위하여, 화합물 또는 이의 혼합물의 중량 분율은 의도된 효과가 관찰되도록 효과적인 농도로 선택된 비히클 중에서 용해되거나, 현탁되거나, 분산되거나 또는 달리 혼합된다.
투여되는 치료제의 정확한 양 또는 용량은 치료될 병태, 투여 경로, 및 기타 다른 고려사항, 예컨대 대상체의 중량 및 생리학적 상태 및 대상체에 따라 다르다.
필요하다면, 특정 투여량 및 기간 및 처리 프로토콜은 경험상으로 결정되거나 추론될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 P188, 예컨대 LCMF P188의 예시적인 용량은, 필요하다면, 특정 대상체 및 병태에 적절한 투여량을 결정하기 위한 출발점으로서 사용될 수 있다. 치료 기간 및 주사 간의 간격은 질환 또는 병태의 중증도, 및 치료에 대한 대상체의 반응에 따라 달라질 것이며, 이에 따라서 조정될 수 있다. P188, 예컨대 LCMF P188의 활성 수준 및 반감기와 같은 요인은 투여량을 결정할 때 고려될 수 있다. 특정 투여량 및 요법은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
특히, 폴록사머는 10.0 mg/mL 내지 약 300.0 mg/mL 범위의 농도 mg/mL, 예컨대 10.0 mg/mL, 15.0 mg/mL, 20.0 mg/mL, 25.0 mg/mL, 30.0 mg/mL, 35.0 mg/mL, 40.0 mg/mL, 45.0 mg/mL, 50.0 mg/mL, 55.0 mg/mL, 60.0 mg/mL, 65.0 mg/mL, 70.0 mg/mL, 75.0 mg/mL, 80.0 mg/mL, 85.0 mg/mL, 90.0 mg/mL, 95.0 mg/mL, 100.0 mg/mL, 105.0 mg/mL, 110.0 mg/mL, 115.0 mg/mL, 120.0 mg/mL,125.0 mg/mL, 130.0 mg/mL, 135.0 mg/mL, 140.0 mg/mL, 145.0 mg/mL, 150.0 mg/mL, 155.0 mg/mL, 160.0 mg/mL, 165.0 mg/mL, 170.0 mg/mL, 175.0 mg/mL, 180.0 mg/mL, 185.0 mg/mL, 190.0 mg/mL, 195.0 mg/mL, 200.0 mg/mL, 205.0 mg/mL, 210.0 mg/mL, 215.0 mg/mL, 220.0 225.0 mg/mL, 230.0 mg/mL, 235.0 mg/mL, 240.0 mg/mL, 245.0 mg/mL, 250.0 mg/mL, 255.0 mg/mL, 260.0 mg/mL, 265.0 mg/mL, 270.0 mg/mL, 275.0 mg/mL, 280.0 mg/mL, 285.0 mg/mL, 290.0 mg/mL, 295.0 mg/mL 또는 300.0 mg/mL에서 제형화될 수 있다. 통상적으로, 농도는 22.5%, 즉 225 mg/mL를 초과하지 않는다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 약학 조성물의 성분으로서 또는 개별적으로 투여될 때, 폴록사머는 일반적으로 약 0.5% 내지 25.0%, 예컨대 0.5% 내지 20% 또는 25%의 농도로 투여되지만, 보다 희석되거나 더 높은 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴록사머는 중량/부피로 약 0.5% 내지 약 25%, 예컨대 중량/부피로 적어도 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10.0%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 15%, 15.5%, 16%, 16.5%, 17%, 17.5%, 18%, 18.5%, 19%, 19.5%, 20%, 20.5%, 21.0%, 21.5%, 22.0%, 22.5%, 23.0%, 23.5%, 24.0%, 24.5% 또는 25.0%의 농도로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 폴록사머는 중량/부피로 약 0.5% 내지 약 10%, 예컨대 중량/부피로 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10.0%의 농도로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 폴록사머는 중량/부피로 약 5% 내지 약 15%, 예컨대 중량/부피로 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10.0%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 또는 15%의 농도로 투여된다. 다른 구현예에서, 폴록사머는 중량/부피로 16% 내지 25%, 예컨대 22.5%의 농도로 투여된다. 예를 들어, 농도는 10% 내지 22.5%, 에컨대 10% 내지 20% 또는 15% 내지 20%이다.
하나의 예에서, 폴록사머는 희석되거나 희석되지 않으면서 투여용으로 의도된 멸균의 비발열성 용액으로서 제형화될 수 있다. 최종 투여형은 100 mL의 바이알로 제조될 수 있으며, 이 경우 100 mL는 15 g(150 mg/mL)의 정제된 폴록사머 188, 예컨대 LCMF P188, 308 mg의 염화나트륨 USP, 238 mg의 시트르산나트륨 USP, 36.6 mg의 시트르산 USP 및 주사용수 USP 적량 내지 100 mL를 함유한다. 용액의 pH는 대략 6.0이고, 삼투압몰농도는 약 312　mOsm/L이다. 기타 다른 적용에 있어서, 적어도 500 mls가 폴록사머 제조물의 중량/조성물의 부피로 10% 내지 20%, 예컨대 약 15% 또는 15%의 농도로 제조된다. 예를 들어, 정맥내 투여에 있어서, 조성물은 조성물이 1 시간 동안 100 mg/kg의 로딩 용량을 사용하여 주입된 다음, 48 시간 동안 30 mg/kg/hr로 유지 주입되는 경우, 목표 Css를 달성하도록 제형화된다. 숙련된 의사 또는 약사 또는 기타 다른 숙련자는 치료될 특정 대상체, 병태 및 표적 순환 농도에 적절한 농도를 선택할 수 있다.
3. 투여량 및 투여
본 명세서의 방법에서, 본 명세서에 기재된 폴록사머 188, 예컨대 LCMF P188은 섹션 F에 기재된 바와 같은 임의의 질환 또는 병태를 포함하여, 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 폴록사머 188, 예컨대 정제된 폴록사머 188은 기타 다른 P188 조성물이 치료를 위해 사용될 수 있거나 사용된 치료 방법에서의 사용을 위한 것으로 의도된다.
질환 및 병태, 예컨대 섹션 F에 기재된 임의의 것의, 본 명세서에 기재된 폴록사머 188, 예컨대 정제된 폴록사머 188을 이용한 치료는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적합한 제형을 사용하여, 정맥내 및 동맥내(카테터 유도 투여 또는 기타 다른 경로)를 포함하는 비경구 투여, 폐내, 경구 또는 경피 투여를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 이행될 수 있다. 치료는 통상적으로 정맥내 투여에 의해 이행된다.
활성제, 예를 들어 폴록사머 188, 예컨대 LCMF P188은 치료된 환자에 대하여 바람직하지 않은 부작용의 부재시 활성제가 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 포함된다. 임의의 질환 또는 병태에 대하여 투여되는 P188, 예컨대 LCMF P188의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 추가적으로, 시험관내 분석법 및 동물 모델이 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕는 데 이용될 수 있다. 경험적으로 결정될 수 있는 정확한 투여량은 특정 조성물, 투여 경로, 요구되는 투여 기간, 치료될 질환의 유형 및 질환의 심각성에 따라 다를 수 있다.
현실적인 한계는, 초기 임상 시험에 등록한 환자의 일부에서의 신장 기능 장애로 인하여, 국가의약품집(National Formulary) 설명서에 따라서 제조된 폴록사머 188(P188-NF)의 임상적 사용을 제한한다(Emanuele and Balasubramanian, Drugs R D 14(2):73-83 (2014)). 추가적으로, 동물 연구는, P188-NF가 혈청 크레아티닌의 수준을 증가시키며, 크레아티닌이 약물 주입의 종료시 신장으로부터 효율적으로 소거되지 않는다는 것을 밝힌다. 본 명세서에 기재된 정제된 폴록사머 188은 P188-NF의 한계에 대처하기 위해 개질되었다. 크레아티닌 수준 및 신장 독성의 상승을 막기 위하여, 폴록사머 188은 정제되어 저분자량 및 고분자량 종 오염물질을 제거하였다. 임상 연구, 예를 들어 C97-1248 연구에서, 연구자는, P188-P의 정맥내 투여가 플라세보의 수준을 초과하여 혈청 크레아티닌의 상당한 증가를 유도하지 않았다는 것을 발견하였다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 평가를 기반으로, 저분자량 및 고분자량 종의 감소는 정제되지 않은 형태(P188-NF) 처리와 연관된 신장 위험을 감소시키거나 제거한다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 정제된 폴록사머 188, 예컨대 LCMF 폴록사머 188은 앞서 평가된, 정제되지 않은 형태에 존재하는 현실적인 한계를 나타내지 않는다.
필요하다면, 특정 투여량 및 기간 및 치료 프로토콜이 경험적으로 결정되거나 추론될 수 있다. 앞서 인간 대상체에 투여되고 임상 시험에서 사용된 폴록사머 188에 대한 투여량은 본 명세서에 기재된 폴록사머 188, 예컨대 정제된 폴록사머 188에 대한 투여량을 결정하기 위한 지침으로 사용될 수 있다. 폴록사머 188에 대한 투여량은 또한 관련 동물 연구로부터 결정되거나 추론될 수 있다. 폴록사머 188의 활성 수준 및 반감기와 같은 요인은 이와 같은 결정을 하는 데 사용될 수 있다. 특정 투여량 및 요법이 다양한 요인을 기반으로 경험적으로 결정될 수 있다. 이와 같은 요인은 개체의 체중, 전반적인 건강, 연령, 이용되는 특정 화합물의 활성, 성별, 식이, 투여 시간, 배설률, 약물 조합, 질환의 중증도 및 경과, 질환에 대한 환자의 소인, 및 치료 의사의 판단을 포함한다. 활성 성분, 즉 폴록사머 188은 통상적으로 약학적으로 효과적인 담체와 조합된다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여형 또는 다회 투여형을 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 변할 수 있다.
특정 예에서, 폴록사머, 예컨대 P188(예를 들어, LCMF P188)은, 치료될 병태에 따라서 약 100 mg/kg 또는 100 mg/kg 내지 2000 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여하도록 제형화된다. 용량은, 예를 들어 환자 체중 kg 당 100 mg 내지 500 mg, 예를 들어 환자 체중 kg 당 100 mg 내지 450 mg, 환자 체중 kg 당 100 mg 내지 400 mg, 환자 체중 kg 당 100 mg 내지 300 mg, 환자 체중 kg 당 100 mg 내지 200 mg, 환자 체중 kg 당 200 mg 내지 500 mg, 환자 체중 kg 당 200 mg 내지 450 mg, 환자 체중 kg 당 200 mg 내지 400 mg, 환자 체중 kg 당 200 mg 내지 300 mg, 환자 체중 kg 당 300 mg 내지 500 mg, 환자 체중 kg 당 300 mg 내지 450 mg, 환자 체중 kg 당 300 mg 내지 400 mg, 환자 체중 kg 당 400 mg 내지 500 mg, 환자 체중 kg 당 400 mg 내지 450 mg 또는 환자 체중 kg 당 450 mg 내지 500 mg, 예컨대 환자 체중 kg 당 적어도 100 mg, 125 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1000 mg, 1100 mg, 1200 mg, 1300 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1700 mg, 1800 mg, 1900 mg 및 2000 mg 또는 적어도 약 100 mg, 125 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1000 mg, 1100 mg, 1200 mg, 1300 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1700 mg, 1800 mg, 1900 mg 및 2000 mg을 포함한다.
폴록사머의 용량은 투여 방식 및 환자의 생리학적 필요에 적합한 농도 및 유체 부피로 투여된다. 일반적으로, 보다 장기의 주입에 있어서(12 시간, 24 시간, 또는 48 시간 연속 주입), 투여되는 부피는 통상적으로 약 5.0 mL/kg/hr을 초과하지 않으며, 예컨대 4.5 ml/kg/hr, 4.0 ml/kg/hr, 3.5 ml/kg/hr, 3.0 ml/kg/hr, 2.5 ml/kg/hr, 2.0 ml/kg/hr, 1.5 ml/kg/hr, 1.0 ml/kg/hr, 0.5 ml/kg/hr, 0.25 ml/kg/hr 또는 0.125 ml/kg/hr이다. 보다 단기의 투여에 있어서(예컨대, 볼루스 투여 또는 단기 주입), 폴록사머의 용량은 환자의 필요에 따라서 5.0 ml/kg/hr을 초과하는 부피로, 예컨대 7.5 ml/kg/hr 또는 10.0 ml/kg/hr 또는 12.5 ml/kg/hr 또는 15 ml/kg/hr 또는 훨씬 더 높은 용량으로 투여될 수있다. 폴록사머는 단일 용량으로서 또는 시간, 일, 주, 월 또는 그 이상과 같은 다양한 간격에 걸쳐 반복되는 다회 용량으로 투여될 수 있다. 주입의 경우, 주입은 통상적으로 1 시간 내지 72 시간, 예컨대 12 시간, 24 시간 또는 48 시간의 기간에 걸쳐 대상체에게 적절한 투여량을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법에서 사용되는 제형은 이의의 적절한 경로에 의해, 예를 들어 경구, 비강, 폐, 비경구, 정맥내, 피내, 피하, 관절내, 낭내, 안구내, 심실내, 척추강내, 근육내, 복강내, 기관내 또는 국부로, 뿐만 아니라 이들의 임의의 둘 이상의 임의의 조합에 의해, 액체, 반액체, 또는 고체 형태로 투여될 수 있고, 각각의 투여 경로에 적합한 방식으로 제형화된다. 다중 투여, 예컨대 본 명세서에 기재된 반복 투여는 임의의 경로 또는 경로의 조합을 통해 이행될 수 있다. 투여에 가장 적합한 경로는 치료될 질환 상태에 따라서 변할 것이다. 통상적으로, 조성물은 정맥내 주입용으로 제형화된다.
폴록사머, 예컨대 P188 및 특히 본 명세서에서 제공되는 LCMF P188의 유효량은 단독으로 또는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 기타 다른 제제와 조합하여 전달될 수 있다. LCMF P188을 이용하는 치료 요법과 함께 투여하는 추가의 추가적인 치료를 선택하는 것은 숙련된 기술자의 수준 내에 있다. 이와 같은 결정은 치료될 특정 질환 또는 병태,치료될 특정 대상체, 대상체의 연령, 질환 또는 병태의 중증도, 및 기타 다른 요인에 따라 다를 것이다.
F. 폴록사머 188 및 LCMF P188의 방법 및 치료 용도
폴록사머 188(P188) 및 이의 조성물, 예컨대 LCMF P188 및 이의 조성물은, 급성 심근경색증, 급성 하지 허혈, 쇼크, 급성 뇌졸중, 심부전, 겸상적혈구빈혈, 및 신경퇴행성 질환을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 다양한 질환에서의 임상 유용성이 있는, 세포보호, 혈유변학적, 항염증, 항혈전/전섬유소용해성 적용을 포함하여 광범위하게 다양한 적용에서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 P188, 예컨대 LCMF P188 또는 본 명세서에서 제공되는 방법에 의해 생성된 임의의 P188은 P188이 앞서 사용되었거나 효과적이라고 공지된 임의의 질환 또는 병태 또는 적용분야를 치료하는 데 사용될 수 있다. P188에 대한 여러 가지 용도는, 예를 들어 문헌[Moloughney et al., (2012) Recent Pat Biotechnol. 6(3):200-211 and Karmarker, "poloxamers and their applications" Pharmainfo.net 공개 2008년 10월 27일, 2008(여기서, URL은 pharmainfo.net/pharma-student-magazine/poloxamers-and-their-applications-0임]에서 검토되었다. P188에 대한 예시적인 용도는, 막 재봉합 및 복구, 조직 허혈 및 재관류 손상의 치료, 염증 반응의 감소, 혈액 점도의 감소, 혈전 용해의 촉진, 지혈 촉진을 필요로 하는 적용에서의 용도, 약물, 핵산 또는 단백질 전달용 비히클로서의 용도, 유화제로서의 용도, 소수성 약물을 위한 약제 현탁액 안정화제로서의 용도, 피부 상처용 클렌징, 화장료의 제형에서 계면활성제로서의 용도, 개인 위생 용품 및 비누의 점도를 제어하는 용도, 및 완하제로서의 약학적 용도(예를 들어, 유럽 공개 번호 EP 0682946 참조)를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
P188, 예컨대 LCMF P188은 막 재봉합, 안정성, 및/또는 복구를 필요로 하는 적용에서 사용될 수 있다. 이와 같은 용도는 세포를 아포토시스 및 괴사로부터 보호함으로써, 조직, 예컨대 손상된 조직에서의 세포 손실을 막는다. 예를 들어, P188은 전기 손상 또는 유리 라디칼 손상 후 세포 막을 복구하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,605,687, 미국 특허 공개 번호 2006/0121016, 및 문헌[Lee et al., (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:4524-4528] 참조). P188은 또한 연골 손상 후, 예컨대 외상성 관절 손상 후 세포사를 감소시키는 데(예를 들어 문헌[Isaac et al., (2010) J Orthop Res. (4):553-558] 참조), 예를 들어 골관절염을 예방하는 것을 돕는 데 사용될 수 있다. P188은 또한 흥분독성, 예컨대 글루타메이트 독성에 반응하여 신경 보호에 사용되어 왔다(Frim et al., (2004) Neuro Report. 15: 171-174). P188은 또한, 잘못 접힌 단백질에 의해 손상된 막을 복구함으로써, 퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병의 치료에 대한 시약으로서 사용되어 왔다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20100316590 참조).
P188은 또한 디스트로핀의 발현 감소와 연관된 심근증 및 심장질환을 치료 및 예방하는 데(예를 들어, 미국 특허 번호 7,846,426 및 8,580,245 참조), 디스트로핀의 손실 이외의 메커니즘에 의해 유발된 만성 심부전을 치료하는 데(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2009/0246162 참조) 사용되어 왔다. P188을 함유하는 조성물은 또한 혈전증을 억제하고, 심근 경색 크기를 감소시키며, 혈액 점도를 감소시키고, 심근경색증 후 손상된 조직의 관류를 개선시키는 데 사용될 수 있다(Justicz et al., (1991) Am Heart J. 122(3 Pt 1):671-680; O'Keefe et al., (1996) Am. J. Cardiol. 78:747-750).
P188은 또한 절차 동안 이식되는 세포의 세포막에 대한 손상을 최소화하기 위해 세포 이식 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, P188을 함유하는 조성물은 지방 조직, 지방 세포, 줄기 세포 및 지방 조직으로부터 유래된 기타 다른 세포의 이식 동안 지방세포의 생존을 개선시키는 데(예를 들어, 미국 특허 번호 8,512,695 및 미국 특허 공개 번호 2010/0104542 참조), 예컨대 연조직 재구성 또는 증가의 적용에서 사용될 수 있다. P188은 또한 파킨슨병 치료법을 위해 이식된 도파민성 세포의 생존 및 신경재분포를 개선시키는 데 사용되어 왔다(Quinn et al., (2008) Eur J Neurosci. 27(1):43-52).
P188은 또한 만성 미세 혈관 질환, 예컨대 황반변성, 당뇨망막병증 및 울혈성 심부전(이로 제한되지는 않음)을 치료하는 치료제로서 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US2011/0212047 참조). 예컨대 상 장간막 동맥 폐색증(superior mesenteric artery occlusion; SMAO)의 모델에서, 조직 허혈 및 재관류 손상의 치료에 있어서의 P188의 용도가 또한 기재되었다(예를 들어, 문헌[Hunter et al., (2010) Ann Clin Lab Sci. 40(2):115-125] 참조). P188을 함유하는 조성물은 또한 골격근 장애, 예컨대 듀켄씨근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD) 및 관련 장애를 치료하는 데 사용되어 왔다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2011/0033412 참조).
P188은 또한, 예를 들어 혈액 점도를 감소시킴으로써, 예를 들어 혈액에서 접착성 상호작용을 방지함으로써 혈류를 향상시키는 데 사용되어 왔다(예를 들어, 비룰 공개 번호 2010/0183519 참조). 이와 같은 용도는 혈류 감소와 연관된 문제, 예컨대 지방색전증의 생성(예를 들어, 문헌[Adams et al., (1960) Surg. Forum 10:585] 및 [Danielson et al., (1970) J Thorac Cardiovasc Surg. 59(2):178-184] 참조), 및 적혈구침강(Hoppensteadt et al., (2014) FASEB J.28(1):suppl. 1139.6)을 감소시키는 데 사용될 수 있다. P188은 또한 출혈성 쇼크를 치료하는 데 사용되어 왔다(Mayer et al., (1994) Ann Clin Lab Sci. 24(4):302-311).
P188은 또한 동형접합성 겸상 적혈구 빈혈증(SS)뿐만 아니라, 혼합 이형접합성 상태, 예컨대 SC, SD, 및 S-β 탈라세미아를 지칭하는, 겸상적혈구빈혈(SD)을 치료하는 데 사용되어 왔다(예를 들어, 문헌[Adams-Graves et al., (1997) Blood 90:2041-2046]; [Ballas et al., Hemoglobin 2004, 28(2):85-102]; [Gibbs and Hagemann, (2004) Ann. Pharmacother. 38:320-324]; [Orringer JAMA. 2001;286(17):2099-2106] 참조).
염증 반응은 또한, 예를 들어 식세포 이동을 억제하고, 예를 들어 호중구의 유입 및 점착을 감소시킴으로써, P188의 사용에 의해 감소될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lane et al., (1984) Blood. 64:400-405]; [Schaer et al., (1994) Circulation. 90(6):2964-2975] 참조).
P188은 또한 상처 치유 및 봉합을 위한 치료법에서 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 가출원 번호 62/021,676, 미국 특허 번호 8,758,738, 및 미국 특허 공개 번호 20140056839 참조).
P188의 추가적인 용도는, 저온 저장 배지에 있어서의 첨가제(예를 들어, 문헌[Kerleta et al., (2010) ALTEX. 27(3):191-197] 참조)를 포함하여 조직 배양 배지 첨가제, 및 저장 병변이 약화된 혈액을 방지하거나 감소시키기 위해 혈액 및 혈액 제품, 예컨대 포장된 적혈구에 대한 첨가제로서의 용도를 포함한다.
P188은 또한 다양한 화장품 및 약품의 제형에서 사용되어 왔다. P188은 액학 조성물(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20040258718, 20090214685, 20100087501, 20100249240, 20110008266, 20120277199, 및 미국 특허 번호 8,133,918, 8,460,644 및 8,709,385 참조), 핵산(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20030206910 및 20060013883 참조), 항미생물제(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20060078616 참조), 및 단백질(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20100310669 및 2012/0141619, 미국 특허 번호 8,137,677, 및 문헌[Jeong B., et al., (2002) Adv Drug Del Rev, 54(1); 37-51] 참조)의 용해도 및 생체이용가능성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. P188은 약제의 전달을 위해, 예를 들어 안구 전달(Qi et al. (2007) Int . J. Pharm. 337:178-187), 점막점착 전달(Chang et al., (2002) J. Controlled Rel. 82:39-50), 직장 전달(Choi et al. (1998) Int. J. Pharm. 165:23-32; Yong et al, (2006) Int. J. Pharm. 321:56-61; ElHady et al., (2003) Saudi Pharmaceutical Journal. 11:159-171; Yong et al., (2004) Eur. J. Pharm. Sci. 23:347-353; Yun et al, (1999) Int. J. Pharm. 189:137-145; 및 Paek et al., (2006) Biological & Pharmaceutical Bulletin. 29:1060-1063), 및 경피 전달(Cappel et al., (1991) Int. J. Pharm. 69:155-167)로서 사용될 수 있다. P188은 또한 액체 구강, 비경구 및 국부 투여형 중 유화제, 현탁액 안정화제로서, 그리고 또한 소수성 약물에 대한 가용화제로서 사용될 수 있다. 고체 투여형에서, P188은 습윤제, 가소제, 또는 정제 윤활제로서 사용될 수 있으며, 열-가역적 겔화 거동으로 인하여 겔의 제형화에 있어서 광범위하게 적용된다(예를 들어, 문헌[Desai et al, (2007) Drug Deliv. 14(7):413-426[ 및 [Muzikovaa et al., (2013) Acta Pol Pharm. 70(6):1087-1096] 참조).
G. 실시예
하기 실시예는 단지 설명의 목적으로 포함된 것이고, 본 명세서에서 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
메탄올/ 초임계 CO 2 조용매를 이용한 추출에 의한 폴록사머 188의 연속 정제 공정
메탄올/초임계 CO2 조용매를 이용한 추출에 의한 폴록사머 188의 연속 정제 공정을 평가하였다. 연속 공정은 높은 처리량을 가능하게 한다. 메탄올 중 폴록사머 188(Asahi Denka Kogyo, 일본 소재)의 공급 용액을 적합한 충전 물질로 채워진 고압 추출 컬럼의 중간 지점에서 펌핑하였다. 메탄올과 혼합한 초임계 CO2(Carboxyque, 프랑스)를 역류 방식으로 하부로부터 추출 컬럼을 통해 펌핑하였다(유속 = 30 kg/h 내지 40 kg/h). 메탄올의 평균 농도는 13%이었고, 9 중량%에서 13.2 중량%의 구배로 제공하였다. 구배는 컬럼의 중간의 공급 포트에서 메탄올, CO2 및 폴록사머 유속, 및 컬럼의 하부에서 도입되는 CO2/메탄올 유속을 제어함으로써 제어하였다. 컬럼 압력은 200 ± 15 bar이었다. 공급 용액 및 초임계 CO2/메탄올 용매의 온도는 36℃ 내지 44℃의 구배이었다. 컬럼 자켓 온도와 추출 온도는 36℃ 내지 54℃의 구배이었다.
저분자량(LMW) 중합체는 컬럼의 상부에서 제거된 반면, 메탄올을 함유하는 정제된 생성물은 추출 컬럼의 하부에서 제거되었다. 정제된 생성물은 매시간마다 수집하고, 기체 포화 용액으로부터의 입자(PGSS) 기법을 통해 감압 하에서 침전시켰다. 정제된 생성물은 진공 하 40℃ 이하에서 건조시켜 잔류 메탄올을 제거하였다.
공급물 당 정제된 폴록사머의 대략적인 수율은 대략 60%이었다. 피크 평균 분자량은 대략 9,000 달톤이었다. 저분자량 성분(4,500 달톤 미만)은 대략 1.0%이었다. 다분산도는 대략 1.0이었다.
실시예 2
메탄올의 평형 농도 및 생성물 방출에 대한 영향 평가
정제 후 개방 환경에서 정제된 폴록사머 188의 취급을 최소화하기 위하여, 개방 없이 추출기로부터 생성물을 부드럽게 압출하기에 적합한 정제된 폴록사머 188 생성물 중 메탄올의 농도를 결정하였다. 폴록사머 188(대략 8,000 Da 및 9,000 Da)의 2 개 배치를 평가하여 추출 용기 중 폴록사머 188/메탄올/CO2의 평형 농도를 확인하였다. 3,000 psig(208 bar) 및 4,500 psig(311 bar)에서 추출 용기를 추출 세포 용량의 mL 당 0.25 그램의 폴록사머 188로 장입하였다. 추출 용기 내 장입된 중합체 188 생성물 중 메탄올의 평형 농도를 26 시간 실행 동안 전용 실험으로 측정하였다. 결과는, 6.6% 내지 8.6% 메탄올/CO2에서 추출 용기 중 장입된 폴록사머 188 생성물 중 메탄올의 평형 농도가 대략 25% 내지 35% 메탄올인 것을 나타내었다.
뚜껑을 개방하지 않고 추출기로부터의 생성물의 방출에 적합한 정제된 생성물 중 농도를 평가하기 위해, 12 L 추출 용기 중에 남아있는 라피네이트의 농도를 25% 내지 35%의 다양한 수준으로 조정하였다. 생성물은 신속한 감압 시스템을 통해 방출되었다. 건조 특징과 방출 조건의 상관 관계를 평가하였다. 결과는, 더 높은 메탄올 농도에서, 25% 내지 35% 농도 범위의 더 높은 쪽에서, 대략 2600 그램의 습윤 생성물이 10 분 미만 내에 방출되어 미세한 자유 유동 분말을 제공한다는 것으로 나타내었다. 헤드 압력에서 4500 psi 내지 1000 psi(311 bar 내지 70 bar)로 변화하면서 생성물 외관은 변하지 않았다. 더 느린 방출 속도와 더 낮은 메탄올 농도는 거친 입자를 생성하였다.
실시예 3
초임계 유체 추출( SFE )에 대한 용매 분배 시스템의 영향
메탄올/초임계 CO2 조용매를 사용하여 초임계 유체 추출(SFE)에 대한 용매 분배 시스템의 영향을 결정하였다. 분배 시스템은 하부에 채워진 다양한 크기의 금속 또는 세라믹 구체를 포함할 수 있다. 이 층의 다공도는 상이한 크기의 구체를 선택하거나 다양한 크기 구체의 혼합물을 사용함으로써 정확하게 제어될 수 있다. 이 시스템의 다공도는 버블 크기와 추출 효율을 제어한다. 이러한 구체는 용이하게 제거되고 세정될 수 있다. 다양한 분배 시스템을 SFE 공정에 대한 이들 시스템의 영향 및 저분자량(LMW) 물질을 추출함에 있어 추출된 총 물질과 비교하여 이들 분배 시스템의 효율에 대하여 비교하였다. 효율은 통상적으로 특정 표적 저분자량 종에 대한 수율 및 처리량에 의해 결정된다(4,500 달톤 미만의 LMW 성분의 %).
A. 방법
SFE 공정은 다음 조건 하에서 3.08 L 세포를 이용하여 수행되었다: T=40℃, 압력 = 300 bar, 메탄올 유속 = 전체 유속의 6.6%(95 g/분 내지 100 g/분 CO2 유속에 대해 6.5 g/분 내지 7 g/분 메탄올 유속; 140 g/분 내지 148 g/분 CO2 유속에 대해 10 g/분 내지 10.5 g/분 메탄올 유속), 세포 길이 = 5', 및 ID = 2". 다음과 같은 상이한 용매 분배 시스템을 사용하여 공정을 실행함으로써 일련의 실험을 실행하였다: 시스템 없음; 세포의 하부에 스테인리스강(SS) 구체; SS-구체가 있는 알루미늄 흡입 스트레이너; SS-구체가 있는 흡입 스크린(40 메쉬); 6 개의 홀이 있는 구부러진 튜브(직경 1/16"); 또는 12 개의 홀이 있는 구부러진 튜브(직경 1/16").
추출 1 시간, 2 시간, 3 시간 및 4 시간 동안 수집된 추출물 샘플을 GPC 및 중량 분석법으로 분석하였다. 중량평균 분자량(Mw), 최고 피크의 분자량(Mp) 및 다분산도(PD)(Mw / 수평균 분자량으로 정의됨)을 계산하였다.
B. 결과
시험된 각각의 분배 시스템에 대하여, 각각의 실험에 대한 실행 조건 및 매개변수가 요약되어 있으며, GPC 결과 및 중량분석결과도 마찬가지이다.
1. 분배 시스템 - 없음
실험 #1 실행 조건
세포 길이 = 5', ID = 2"
세포 온도 40℃
추출 압력 300 bar
CO2 유속 95 g/분 내지 100 g/분
MeOH 유속 6.5 g/분 내지 7 g/분(총 유속의 6.6%)
체류 시간 25.86 분
계산된 선속도 5.88 cm/분
추출기로 로딩된 원료의 양 599 g
실험 #1 겔 투과 크로마토그래피( GPC ) 및 중량 분석 결과
샘플 설명 양(g) GPC - Mp GPC -Mw PD 저분자량 성분 %
1 시간 동안 수집된 건조 추출물 18.39 8801 7768 1.15 13.96
2 시간 동안 수집된 건조 추출물 24.45 8934 7616 1.24 17.69
3 시간 동안 수집된 건조 추출물 24.40 9075 7785 1.23 16.62
4 시간 동안 수집된 건조 추출물 25.52 8999 7839 1.20 15.04
수집된 총 건조 추출물 = 92.76 g(로딩량의 15.26%) 추출된 총 저분자량 성분 = 14.8 g
방출 후 습윤 생성물 중량: 630 g 습윤 생성물 중 메탄올 % = 23.52%
생성물 수율 = 481.8 g(79.2%)
2. 분배 시스템 - 세포의 하부에 1000 개의 스테인리스강 구체
실험 #2 실행 조건
세포 길이 = 5', ID = 2"
세포 온도 40℃
추출 압력 300 bar
CO2 유속 95 g/분 내지 100 g/분
MeOH 유속 6.5 g/분 내지 7 g/분(총 유속의 6.6%)
체류 시간 25.86 분
계산된 선속도 5.88 cm/분
추출기로 로딩된 원료의 양 605 g
실험 #2 겔 투과 크로마토그래피( GPC ) 및 중량 분석 결과
샘플 설명 양(g) GPC - Mp GPC -Mw PD 저분자량 성분 %
1 시간 동안 수집된 건조 추출물 7.69 9320 5682 1.55 46.88
2 시간 동안 수집된 건조 추출물 10.39 9459 6441 1.48 37.48
3 시간 동안 수집된 건조 추출물 9.85 9453 6749 1.42 33.48
4 시간 동안 수집된 건조 추출물 11.2 9408 6900 1.37 31.08
수집된 총 건조 추출물 = 39.05 g(로딩량의 6.45%) 추출된 총 저분자량 성분 = 14.28 g
방출 후 습윤 생성물 중량: 684.6 g 습윤 생성물 중 메탄올 % = 25%
생성물 수율 = 513 g(84.9%)
결과는, 더 양호한 CO2 및 메탄올 분배를 위해 세포의 하부에 1000 개의 SS 구체를 첨가하면 주요 생성물의 캐리오버를 감소시키고, 공정의 효율을 59%만큼 증가시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 결과는, 시스템이 추출기의 하부에 스테인리스강 SS 구체를 사용하여 효과적인 CO2/MeOH 용매 분배를 제공한다는 것을 나타낸다.
3. 분배 시스템 - 더 높은 CO 2 유속 및 선속도를 가지는 세포의 하부 에 1000 개의 스테인리스강 구체
실험 #3 실행 조건
세포 길이 = 5', ID = 2"
세포 온도 40℃
추출 압력 300 bar
CO2 유속 140 g/분 내지 148 g/분
MeOH 유속 10 g/분 내지 10.5 g/분(총 유속의 6.6%)
체류 시간 17.5 분
계산된 선속도 8.69 cm/분
추출기로 로딩된 원료의 양 599 g
실험 #3 겔 투과 크로마토그래피( GPC ) 및 중량 분석 결과
샘플 설명 양(g) GPC - Mp GPC -Mw PD 저분자량 성분 %
1 시간 동안 수집된 건조 추출물 25.89 8969 7601 1.29 19.35
2 시간 동안 수집된 건조 추출물 31.97 8970 7505 1.28 20.97
3 시간 동안 수집된 건조 추출물 32.67 9085 7658 1.25 19.61
4 시간 동안 수집된 건조 추출물 30.35 9345 8050 1.22 16.39
수집된 총 건조 추출물 = 120.88 g(로딩량의 20.18%) 추출된 총 저분자량 성분 = 23.09 g
방출 후 습윤 생성물 중량: 559.2 g 습윤 생성물 중 메탄올 % = 21.09%
생성물 수율 = 441.3 g(73.7%)
결과는, 이 공정은 더 낮은 CO2 유속 및 선속도를 사용하여 앞선 실험에 기재된 공정만큼 효율적이지 않았다는 것을 나타낸다.
4. 분배 시스템 - SS-구체를 포함하는 알루미늄 흡입 스트레이너
실험 #4 실행 조건
세포 길이 = 5', ID = 2"
세포 온도 40℃
추출 압력 300 bar
CO2 유속 140 g/분 내지 148 g/분
MeOH 유속 10 g/분 내지 10.5 g/분(총 유속의 6.6%)
체류 시간 17.5 분
계산된 선속도 8.69 cm/분
추출기로 로딩된 원료의 양 608 g
실험 #4 겔 투과 크로마토그래피( GPC ) 및 중량 분석 결과
샘플 설명 양(g) GPC - Mp GPC -Mw PD 저분자량 성분 %
1 시간 동안 수집된 건조 추출물 5.95 3801 4006 1.53 69.54
2 시간 동안 수집된 건조 추출물 8.32 3873 4884 1.37 57.21
3 시간 동안 수집된 건조 추출물 8.8 3925 5363 1.31 50.05
4 시간 동안 수집된 건조 추출물 8.02 3947 5539 1.29 47.37
수집된 총 건조 추출물 = 31.09 g(로딩량의 5.11%) 추출된 총 저분자량 성분 = 17.1 g
결과는 하부에 단지 1000개의 SS 구형 대신에 분배 시스템으로서 알루미늄 흡입 스트레이너 내에 SS-구체를 포함하는 알루미늄 흡입 스트레이너의 사용은 더 높은 선속도에서조차 공정을 4 배 더 효율적으로 만든다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 여전히 LMW 분획의 유사한 수준을 제거하면서, 상기 방법은 덜 추출된 물질을 제거하였으며, 즉 추출된 물질이 각각 이 실시예에서는 31.09 그램 대 앞선 실시예에서는 120.88 그램이었고, 추출된 LMW 분획이 이 실시예에서는 17.1 그램이었고, 앞선 실시예에서는 23.09 그램이었다. 따라서, 결과는 시스템이 추출기의 하부에 알루미늄 흡입 스트레이너를 사용하여 효과적인 CO2/MeOH 용매 분배를 제공하였음을 나타낸다.
5. 분배 시스템 - SS-구체를 포함하는 흡입 스크린 40 메쉬
실험 #5 실행 조건
세포 길이 = 5', ID = 2"
세포 온도 40℃
추출 압력 300 bar
CO2 유속 140 g/분 내지 148 g/분
MeOH 유속 10 g/분 내지 10.5 g/분(총 유속의 6.6%)
체류 시간 17.5 분
계산된 선속도 8.69 cm/분
추출기로 로딩된 원료의 양 601 g
실험 #5 겔 투과 크로마토그래피( GPC ) 및 중량 분석 결과
샘플 설명 양(g) GPC - Mp GPC -Mw PD 저분자량 성분 %
1 시간 동안 수집된 건조 추출물 6.56 3747 4081 1.47 68.13
2 시간 동안 수집된 건조 추출물 9.85 3723 4736 1.37 58.78
3 시간 동안 수집된 건조 추출물 10.04 3741 5163 1.32 52.36
4 시간 동안 수집된 건조 추출물 7.35 3806 5280 1.3 50.36
수집된 총 건조 추출물 = 33.8 g(로딩량의 5.62%) 추출된 총 저분자량 성분 = 19.22 g
방출 후 습윤 생성물 중량: 671.8 g 습윤 생성물 중 메탄올 % = 23.68%
생성물 수율 = 512.7 g(85.31%)
결과는 흡입 스크린 40 메쉬를 사용하는 분배 시스템에서 추출 효율이 앞선 실시예에 기재된 바와 같은 SS-구체를 포함하는 알루미늄 흡입 스트레이너와 유사하였음을 나타낸다.
6. 분배 시스템 - 1/16" 홀 6 개를 가지는 구부러진 튜브
실험 #6 실행 조건
세포 길이 = 5', ID = 2"
세포 온도 40℃
추출 압력 300 bar
CO2 유속 140 g/분 내지 148 g/분
MeOH 유속 10 g/분 내지 10.5 g/분(총 유속의 6.6%)
체류 시간 17.5 분
계산된 선속도 8.69 cm/분
추출기로 로딩된 원료의 양 607 g
실험 #6 겔 투과 크로마토그래피( GPC ) 및 중량 분석 결과
샘플 설명 양(g) GPC - Mp GPC -Mw PD 저분자량 성분 %
1 시간 동안 수집된 건조 추출물 6.48 8781 6155 1.49 39.76
2 시간 동안 수집된 건조 추출물 9.63 8701 6519 1.36 33.63
3 시간 동안 수집된 건조 추출물 9.74 8690 6786 1.29 29.41
4 시간 동안 수집된 건조 추출물 9.7 8704 7003 1.26 25.95
수집된 총 건조 추출물 = 35.55 g(로딩량의 5.86%) 추출된 총 저분자량 성분 = 11.2 g
방출 후 습윤 생성물 중량: 647 g 습윤 생성물 중 메탄올 % = 28.33%
생성물 수율 = 460.5 g(75.9%)
결과는 1/16" 직경 홀 6 개를 가지는 구부러진 튜브가 앞선 분배 시스템보다 덜 효율적이라는 것을 나타낸다.
7. 분배 시스템 - 1/16" 직경 홀 12 개를 가지는 구부러진 튜브
실험 #7 실행 조건
세포 길이 = 5', ID = 2"
세포 온도 40℃
추출 압력 300 bar
CO2 유속 140 g/분 내지 148 g/분
MeOH 유속 10 g/분 내지 10.5 g/분(총 유속의 6.6%)
체류 시간 17.5 분
계산된 선속도 8.69 cm/분
추출기로 로딩된 원료의 양 607 g
실험 #7 겔 투과 크로마토그래피( GPC ) 및 중량 분석 결과
샘플 설명 양(g) GPC - Mp GPC -Mw PD 저분자량 성분 %
1 시간 동안 수집된 건조 추출물 6.79 9162 5988 1.550 44.25
2 시간 동안 수집된 건조 추출물 8.11 9208 6535 1.431 36.49
3 시간 동안 수집된 건조 추출물 8.28 9223 6721 1.364 34.17
4 시간 동안 수집된 건조 추출물 8.45 9341 7226 1.294 27.22
수집된 총 건조 추출물 = 31.63 g(로딩량의 5.41%) 추출된 총 저분자량 성분 = 11.09 g
방출 후 습윤 생성물 중량: 684.1 g 습윤 생성물 중 메탄올 % = 24.91%
생성물 수율 = 512 g(84.3%)
결과는 1/16" 직경 홀 12 개를 가지는 구부러진 튜브가 6 개의 홀을 가지는 분배 시스템을 사용하는 앞선 실험보다 약간 더 효율적이지만, 흡입 스크린 및 스테인리스강 구체보다 덜 효율적이라는 것을 나타낸다.
C. 요약
가장 높은 효율의 정제는, 분배 시스템이 스테인리스강 구체 또는 스테인리스강 구체를 포함하는 흡입 스크린 메쉬인 방법에서 관찰되었다(예를 들어, 실험 4 및 5 참조). 구부러진 튜브 분배 시스템 내 홀의 개수가 또한 어느 정도 정제 효율을 증가시켰다(예를 들어, 실험 7 참조). 따라서, 결과는, 분배 시스템이 SFE 장치에서 역할을 하며, 이의 설계는 공정을 더 또는 덜 효율적으로 만든다는 것을 나타낸다. 적합한 설계는 스테인리스강 구체를 포함하는 흡입 스크린 또는 흡입 스트레이너이다. 구부러진 튜브는 또한 분배 시스템으로서 사용될 수 있지만, 가능한한 많은 홀을 포함한다. 기재된 기타 다른 실험의 대부분에 있어서, 실험은 흡입 스크린 분배 시스템을 이용하여 실행되었다.
실시예 4
12-L 규모의 이중 단계 추출 배치 폴록사머 188의 정제 공정
고분자량 성분(13,000 달톤 초과)을 풍부화하도록 공정을 설계한다. 통상적인 추출 프로파일에서, 정제 후 고분자량 성분의 증가는 충분하지 않다. 폴록사머 188의 이중 단계 배치 정제 공정은 메탄올 농도를 제어함으로써 12-L 규모 상에서 실행된다. 추출 전 폴록사머 188은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정하였을 때 대략 1%의 고분자량 성분과 5%의 저분자량 성분을 함유한다.
교반 추출 용기, 사이클론 분리기, CO2 용매 순환 및 메탄올 조용매 시스템을 포함하는 12-L 추출 시스템을 누출 여부에 대하여 시험한다. 추출 시스템을 캠페인 시작시 310 ± 15 bar까지 CO2를 이용하여 가압하였다. 메탄올(2 kg)을 라이너를 이용하여 공급 혼합 탱크 내로 분배하고, 40℃까지 가온한다. 대략 3700 그램의 폴록사머 188을 공급 탱크에 첨가하고, 완전히 혼합될 때까지 교반한다. 5100 그램의 혼합 용액을 추출기 내로 펌핑한다. CO2 유속은 390 gm/분에서 유지한다. 메탄올 농도를 조정함으로써 두(2) 번의 연속 추출을 실행한다. 추출을 12 시간 ± 30 분 동안 7.6% MeOH/CO2에서 메탄올 유속 27.6 ± 1.0 gm/분으로 수행한다. 추출을 12 시간 ± 15 분 동안 8.6% MeOH/CO2에서 메탄올 유속 36.6 ± 1.0 gm/분으로 계속한다.
24 시간의 정제 후, 추출기는 급속 감압 시스템(PGSS(기체 포화 용액으로부터의 입자))을 통해 방출되고, 습윤 생성물은 라이너에서 수집된다. 습윤 생성물의 샘플(약 600 gm)을 플라스크로 옮기고, 실온 및 적당한 진공 하에서 대략 3 시간 동안 회전 증발기를 사용하여 건조시킨 다음, 실온 및 고진공 하에서 30 분 동안, 35℃에서 추가 30 분 동안 건조시킨다. 건조된 생성물을 수집하고, 분자량 분포에 대하여 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 시험한다. 정제된 생성물에서는 어떠한 저분자량(LMW) 성분이 검출되지 않는다. 정제된 생성물은 대략 4.5%의 고분자량(HMW) 성분을 함유하였다.
실시예 5
메탄올/ 초임계 CO 2 조용매를 이용한 추출에 의한 폴록사머 188의 배치 정제 공정
메탄올/초임계 CO2 조용매를 이용한 추출에 의한 폴록사머 188의 배치 정제 공정을 평가하였다. 폴록사머 188(Asahi Denka Kogyo, 일본)을 추출 용매 온도, 압력 및 메탄올 조용매 함량을 제어함으로써 용매 특징을 조정함으로써 정제하였다. 공정은 압력과 조용매 함량이 상이하였다.
폴록사머 188(13 kg 내지 14 kg)을 고압 추출 용기 내에서 메탄올 용매와 혼합하였다. 메탄올 및 초임계 CO2(BOC 가스, USA)의 조용매를 혼합하고 추출 용기를 통해 펌핑하였다. 추출 동안 제거되는 분획의 조성을 모니터링하면서, 보다 낮은 메탄올 농도로 추출을 시작하였으며, 메탄올 농도는 연속적으로 증가되었다. 평균 메탄올 농도는 7.3 중량%이었다. 농도는 6.6%에서 7.6%, 그 다음 8.6%로 단계적으로 증가하였다. 추출 용기 압력은 300 ± 15 bar이었다. 메탄올/초임계 CO2 용매 온도 및 추출기 자켓 온도는 40　±　5℃이었다. 추출 온도는 35℃ 내지 45℃로 조정하였다. 용출된 분획은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 분석하였다. 추출 용기로부터 회수된 정제된 폴록사머 188의 분자량 분포는 출발 물질에 대한 것보다 더 좁았다.
얻어진 수율은 대략 75%이었다. 피크 평균 분자량은 대략 9,000 달톤이었다. 저분자량 성분(4,500 달톤 미만)은 대략 1.0%이었다. 다분산도는 대략 1.0이었다.
실시예 6
12-L 규모의 다단계 추출 배치 폴록사머 188의 정제 공정 및 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의한 분석
A. 초임계 유체 추출( SFE ) 방법
폴록사머 188의 4 개의 배치를 12 리터 추출 용기에서 SFE 배치 공정에 의해 정제하였다. 각각의 배치를 하기 기재한 바와 같이 정제하였다. 시스템을 CO2를 이용하여 가압하고 배치 사이에서 압력을 900 psig(63 bar) 초과로 유지하였다. 메탄올(2000 ± 20　gm)을 라이너를 이용하여 공급 혼합 탱크 내로 분배하고, 40℃까지 가온하였다. 폴록사머 188(3696 ± 20 gm)을 공급 탱크 내로 분배하고, 완전히 혼합될 때까지 교반하였다. 폴록사머 188 용액의 구십 퍼센트(90%)를 추출기 내로 펌핑하고, 시스템을 310 ± 15 bar까지 가압하였다. CO2 유속은 390 gm/분에서 유지하였다. 6.6 중량%, 7.6 중량% 또는 8.6 중량%를 통해 제어된 단계식 증가로 메탄올 농도를 조정함으로써 세(3) 번의 연속 추출을 실행하였다. 각각의 메탄올 농도에서, 추출은 표 15에 기재된 바와 같은 정해진 시간 동안 수행하였다. 각각의 추출 동안 지정된 시간 후에 공정 중 샘플을 추출기의 하부로부터 수집하였다.
폴록사머 188의 다단계 정제를 위한 추출 조건
추출 시간(시간) 공정 중 샘플 수집 시간(시간) CO 2 유속 (gm/분) 메탄올 유속 (gm/분) CO 2 중 메탄올 백분율
1 12 (±0.5) 4, 8 및 12 390 27.6 (±1.0) 6.6 %
2 10 (±0.5) 3, 6 및 10 390 32.1 (±1.0) 7.6 %
3 4 (±0.25) 2 및 4 390 36.6 (±1.0) 8.6 %
26 시간의 정제 공정 종료시, 추출기는 급속 감압 시스템을 통해 방출되고, 습윤 생성물은 라이너에서 수집하였다. 습윤 생성물의 하위 로트(약 600 g)를 플라스크로 옮기고, 실온 및 적당한 진공 하에서 대략 3 시간 동안 회전 증발기를 사용하여 건조시킨 다음, 실온 및 고진공 하에서 30 분 동안, 35℃ 및 고진공 하에서 추가 30 분 동안 건조시켰다. 건조된 생성물을 하위 로트로서 수집하였다. 이 건조 공정을 나머지 습윤 생성물과 함께 반복하여 건조 생성물의 하위 로트 3 개를 만들었다. 3 개의 하위 로트를 10 L 드럼에서 합하고, 30 분 동안 혼합하여 정제된 폴록사머 188을 생성하였다. 공급물 당 수율은 대략 55%이었다.
B. 정제된 생성물의 특성화
출발 및 정제된 폴록사머 188 생성물을 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 평가하였다. 결과는 도 6a 및 6b에 제시되어 있다.
도 6a는 출발 폴록사머 188의 GPC 프로파일을 나타낸다. GPC 추적에서, 보유 시간이 상이한 분자량 종의 상대량에 대하여 플롯팅되어 있다. x축 상에서 보유 시간이 증가하는 것은 분자량의 감소에 해당한다. 출발 폴록사머 188의 GPC 추적은 저분자량측에서 작은 추가 피크가 있는 좁은 분자량 분포를 나타낸다. 평균 분자량이 4,500 달톤 미만인 저분자량 성분에 대한 곡선 하 면적은 대략 4% 내지 7%이다.
도 6b는 정제된 폴록사머 188에 대한 GPC 프로파일을 나타낸다. 정제된 폴록사머 188은 상업적으로 입수가능한 폴록사머 188보다 더 좁은 분자량 분포를 가진다. 비교하여, 저분자량 피크의 상당히 더 적은 양을 포함하는 정제된 폴록사머 188의 GPC 추적은 좁은 분자량 분포를 나타낸다(주요 피크의 1.5% 미만).
실시예 7
장기 순환 물질이 없는( LCMF ) 폴록사머 188의 제조 및 투여
A. 초임계 유체 추출( SFE ) 공정
폴록사머 188의 다단계 추출 배치 공정을 247 ± 15 atm의 압력(대략 200 bar 내지 260 bar)에서 수행되는 추출 및 7.4 중량%, 9.1 중량% 및 10.7 중량%의 메탄올의 제어된 단계식 증가를 이용하여 실행된다. 정제 전, 폴록사머 188 원료(BASF Corporation, 미국 뉴저지주 워싱턴 소재)는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 특징지어진다. 분자량 분석은 원료가 주요 피크의 평균 분자량이 약 8,500 ± 750 Da이고, 4,500 Da 미만의 저분자량(LMW) 종이 6.0% 이하이며, 13,000 Da 초과의 고분자량 종(HMW)이 1% 이하임을 입증하였다. 추가적으로, 다분산도는 1.2 이하였다.
50-L의 고압, 스테인리스강 추출기 용기를 14 kg의 상용 등급 폴록사머 188(BASF Corporation, 미국 뉴저지주 워싱턴 소재) 및 7 kg의 메탄올로 장입하고, CO2(49 ± 10 atm, 즉 720 ± 147 psi)(Messer France, S.A.S., 프랑스 라베라 소재)로 가압하였으며, 균질한 용액이 얻어질 때까지 35℃ 내지 50℃까지 40 분 내지 80 분 동안 가열하였다. CO2(주 공급 탱크로부터 또는 추출 시스템을 통한 재순환을 통해 공급됨)를 열 교환기에서 냉각시키고, 온도가 제어되는, 고압의 스테인리스강 용매 저장소로 공급한다. 고압 펌프는 액체 CO2의 압력을 원하는 추출 압력까지 증가시킨다. 고압 CO2 증기를 제2 열 교환기에 의해 공정 온도까지 가열시킨다. 메탄올(Merck KGaA, 독일 다름슈타트 소재)을 주 공급 탱크로부터 CO2 용매 스트림으로 공급하여 추출 메탄올/CO2 조용매를 생성하며, 상기 조용매는 유입 시스템을 통해 미세 미스트로서 247 ± 15 atm(3600 ± psi) 또는 240 bar 내지 260 bar의 압력 및 40℃의 온도에서 추출기 용기로 공급되었다.
7.4% 메탄올/CO2 추출 조용매를 폴록사머 용액을 통해 3 시간 동안 통상적으로 8 kg/hr(6.8 kg/hr 내지 9.2 kg/hr의 범위; 108 kg/hr 총 유속)의 메탄올 유속으로 퍼콜레이션하였다. 추출은 9.1% 메탄올/CO2 조용매를 이용하여 10 kg/시간(8.5 kg/hr 내지 11.5 kg/hr의 범위; 110 kg/hr 총 유속)의 메탄올 유속으로 추가 4 시간 동안 계속하였다. 추출은 10.7% 메탄올/CO2 조용매를 이용하여 12 kg/시간(10.2 kg/hr 내지 13.8 kg/hr의 범위; 112 kg/hr 총 유속)의 메탄올 유속으로 추가 8 시간 동안 추가로 계속하였다. 추출 공정 전반에 걸쳐, 가용성 종의 추출은 추출기의 상부로부터 지속적으로 추출되었다. 추출 용매는 추출기의 상부로부터 제거되었고, 일렬로 배열된 2 개의 고압 스테인리스강 사이클론 분리기를 통과하여 시스템 압력을 247　atm(3600 psi)에서 59　atm(870 psi)으로 감소시킨 다음, 59 atm에서 49 atm(720 psi)으로 감소시키고, 메탄올 스트림으로부터 CO2를 분리하였다. 분리된 CO2를 응축시키고, 열 교환기를 통과시킨 다음, 용매 저장소에 저장하였다. 메탄올 폐스트림의 압력은 다른 사이클론 분리기를 통과시킴으로써 추가로 감소시켰다. 정제된 폴록사머 188은 추출기에 남아있었다.
추출 후, 정제된 폴록사머 188 용액을 추출기의 하부로부터 교반기가 장착된 혼합기/건조기로 방출하였다. 폴록사머 188 생성물을 감압 하에서 기체 포화 용액으로부터의 입자(PGSS) 기법을 통해 침전시켰다. 침전물은 대략 20% 내지 35%의 메탄올을 함유하였다. 정제된 폴록사머 188은 진공 하 40℃ 또는 45℃ 이하에서 건조시켜 잔류 메탄올을 제거하였다. 생성물의 공급 수율은 65%의 평균 수율을 제공하였다.
GPC에 의해 측정하였을 때 정제된 생성물의 분자량 분석은, 정제된 생성물이 수용 사양을 충족하였음을 입증하였다. 주요 피크의 평균 분자량은 약 8,500 ± 750 Da이었고, 평균 분자량 평균은 8,500 ± 750 Da이었으며, 4,500 Da 미만의 저분자량(LMW) 종은 1.5% 이하이었고, 13,000 Da 초과의 고분자량 종(HMW)은 1.5% 이하이었다. 추가적으로 다분산도는 1.05 이하이었다. 따라서, 결과는, 상기 절차가 LMW 종에서 측정가능한 감소, 및 정제된 생성물의 다분산도의 개선을 초래하였음을 나타내었다.
생성된 정제된 폴록사머 188은 주사용 수 중에 정제된 폴록사머 150　mg/ml, 염화나트륨 3.08 mg/ml, 시트르산나트륨(이수화물) 2.38 mg/ml, 및 시트르산 무수물 0.366 mg/ml를 함유하는 투명하고 무색이며 멸균의 비발열성 수용액으로 제형화하였다. 용액을 멸균 여과하고, 100 ml의 유리 바이알 내로 충전하였으며, 질소 블랭킷으로 덮고, 부틸 고무 마개 및 알루미늄 덮개로 밀폐시켰다. 생성된 용액의 삼투압몰농도는 대략 312 mOsm/L이었다. LCMF 폴록사머-188 조성물은 어떠한 정균제나 방부제를 함유하지 않았다.
B. HPLC - GPC를 사용하여 정제된 ( LCMF ) 폴록사머 188의 정맥내 투여 후 혈장 농도 시간 경과의 특성화(방법 1)
상기 기재된 바와 같이 생성된 정제된 LCMF 폴록사머 188을 QT/QTc 간격에 대한 영향을 결정하기 위한 평가의 일환으로 62 명의 건강한 지원자에게 정맥내 투여하였다. 62 명의 대상체 중 8 명은 HPLC-GPC 방법을 사용하여 혈장 폴록사머 수준의 정량 분석을 위해 무작위로 선택하였다. 투여 후, 혈액 샘플을 기준선, 약물 투여 동안(1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 및 6 시간) 및 투여 후 1 시간, 1.5 시간, 2 시간, 2.5 시간, 5 시간, 6 시간, 및 18 시간째에 헤파린 항응고 튜브 내로 정맥천자에 의해 수득하였다. 혈장을 원심분리에 의해 분리하고, 분석할 때까지 냉동보관하였다. 정제된 폴록사머 188을 1 시간 동안 300 mg/kg/hr의 로딩 용량의 고용량으로 투여한 다음, 5 시간 동안 200 mg/kg/hr의 유지 용량을 투여하거나, 1 시간 동안 100 mg/kg의 보다 낮은 용량을 투여한 다음 5 시간 동안 30 mg/kg/hr을 투여하였다. 투여된 0.9 mg/mL의 정제된 폴록사머 188의 평균 최대 농도(Cmax)는 1 시간 로딩 주입 종료시까지 달성되었다. 정상 상태에서의 평균 농도(Css)는 약 0.4 mg/ml이었고, 유지 주입 동안 달성되었다. 혈장 농도는 유지 주입의 중단 후 급속히 감소하였다. 상기 기재된 바와 같은 정제된 LCMF 생성물은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 혈장 중에서 이전의 폴록사머 188과 함께 관찰된 보다 고분자량의 장기 순환 물질을 입증하지 못하였다.
혈장 내에서 이와 같은 장기 순환 물질의 부재를 확인하기 위하여, 보다 높은 용량을 투여받은 대상체로부터의 혈장을 HPLC-GPC를 사용하여 유사하게 연구하였다. 도 7a 및 7b는, 단일 대상체에 대하여 정제된 LCMF 폴록사머 188의 투여 후 다양한 시점에 얻은 혈장의 일련의 HPLC-GPC를 나타낸다. 도 7a는 모든 시점에서의 크로마토그램을 나타내는 반면, 도 7b는 비교를 위하여 선택된 시점을 나타낸다. 두 개의 도면에서, 크로마토그램은 중합체 분포의 고분자량 부분(19.8 K 달톤 내지 12.4 K 달톤)을 나타내기 위해 확대되어 있다. 또한 주요 피크 부분(12.8 K 달톤 내지 4.7 K Da) 및 더 낮은 분자량 부분(4.7 K Da 내지 2.5 K Da)이 나타내어져 있다. HPLC-GPC 방법은 공지된 농도의 표준물질에 대한 용리 피크의 높이에 기반한 혈장 수준을 정량화한다(즉, 용리 피크가 더 높을수록, 혈장 수준이 더 높음). GPC 방법은 또한 공지된 분자량의 표준물질의 용리 시간에 대하여 샘플 용리 시간의 비교에 의한 분자량 범위를 확인한다.
크로마토그램은 시간 경과에 따라 주요 피크 및 보다 낮은 분자량 성분에 대한 상대적인 비율로 폴록사머 188 중합체 분포의 고분자량 부분이 감소함을 나타낸다. 따라서, 중합체 분포는, 고분자량 부분이 실질적으로 균일한 방식으로 순환으로부터 소거됨을 나타낸다. 결과는 또한 보다 높은 분자량 종이 보다 긴 순환 반감기(기타 다른 중합체 성분에 비하여)를 나타내지 않으며, 정맥내 투여 후 순환에서 축적되지 않는다는 것을 나타낸다.
C. HPLC - GPC에 의한 정제된 LCMF 폴록사머 188 및 정제된 LCM -함유 폴록사머 188의 정맥내 투여 후의 혈장 농도 시간 경과 비교
1. 장기 순환 물질( LCM )-함유 폴록사머 188의 투여
안전성 및 약동학적 연구의 일환으로 (LCM-함유) 정제된 폴록사머 188을 1 시간 동안 100 mg/kg/hr의 정맥내 로딩 용량으로 6 명의 건강한 지원자에게 투여한 다음, 48 시간 동안 30 mg/kg/hr을 투여하였다(Grindel et al). 약물 투여 전(기준선), 투여 동안(1 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 및 48 시간) 및 약물 투여 후 30 분, 1 시간, 1.5 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 14 시간, 20 시간 및 24 시간째에 EDTA 항응고 튜브 내로 정맥천자에 의해 수득하였다. 혈장을 분리하고, HPLC-GPC 방법을 사용하여 분석할 때까지 냉동보관하였다.혈장 샘플의 분석은, (LCM-함유) 정제된 폴록사머 188에 대한 주요 피크 및 HMW 피크의 소거 동역학을 나타내었다.
HMW 피크(장기 순환 물질)
상기 용량에서의 투여 후, HMW 성분(대략 16,000 달톤의 피크로서 HPLC-GPC 분석법에서 검출됨)은 약물 투여 기간 동안 축적하였고, 약물 투여 종료 후 2 시간까지 225 μg/ml(n = 6)의 평균 Cmax 농도에 도달하지 않았다. 주입 중단 후 6 시간까지, 평균 혈장 수준은 Cmax 값으로부터 단지 약 10%만큼 감소한 농도인 202 ug/ml으로 유지되었다. 주입 후 24 시간의 혈액 수집 기간 동안, 평균 혈장 수준은 165 μg/ml의 혈장 농도에 대하여 단지 22.5%만큼 감소하였다. 혈장 농도 시간 경과에서의 이러한 변화에 기초하여, 48 시간 초과의 제거 반감기가 추정된다.
주요 피크
상기 용량으로 투여한 다음, 주요 피크는 약물 주입 동안 유지된 522 μg/ml(n=6)의 명백한 평균 정상 상태 농도를 달성하였다. 주입 중단 1 시간 후, 혈장 농도는 255　μg/ml로 정상 상태 농도로부터 52%만큼 떨어졌다. 중단 후 6 시간까지, 혈장 수준은 81 μg/ml로 85%만큼 떨어졌다. 주입 후 24 시간까지, 혈장 수준은 약 19 μg/ml(n=6)의 혈장 농도까지 96%만큼 감소하였다. 혈장 농도 시간 경과에서의 이러한 변화에 기초하여, 반감기는 약 5 시간인 것으로 추정된다.
2. LCMF 폴록사머 188(상기 기재된 바와 같이 제조)
앞서 기재된 바와 같이 LCMF 폴록사머의 QT/QTc 간격에 대한 영향을 결정하기 위한 평가의 일환으로 62 명의 건강한 지원자에게 300 mg/kg의 용량으로 투여한 다음 5 시간 동안 200 mg/kg/hr의 용량으로 투여하였다. 62 명의 대상체 중 8 명은 상기 파트 (B)에 기재된 바와 같이 유사하지만 더 낮은 혈장 수준에서 선형성이 개선된 HPLC-GPC 방법을 사용하여 혈장 폴록사머 수준의 정량 분석을 위해 무작위로 선택하였다.
HMW 피크
상기 용량에서의 투여 후, HMW 성분(대략 16,000 달톤의 피크로서 HPLC-GPC 분석법에서 검출됨)은 약물 투여 기간 동안 소량으로 축적하였고, 주입 종료까지 Cmax(평균 값 117 μg/ml, n = 8)에 도달하였다. 약물 투여 중단 후 1 시간까지, 혈장 수준은 86　μg/ml까지 Cmax 값으로부터 27%만큼 감소하였다. 약물 투여 종료 후 6 시간까지, 평균 혈장 수준은 34 μg/ml까지 Cmax 값으로부터 71%만큼 감소하였다. 주입 종료 후 18 시간까지, 평균 혈장 수준은 19 μg/ml(n = 8)의 농도까지 82%만큼 감소하였다. 시간 경과에 따른 혈장 농도에서의 이러한 변화에 기초하여, HMW 성분에 대한 제거 반감기가 6 시간 내지 9 시간인 것으로 추정하였다.
주요 피크
상기 용량으로 투여한 다음, 주요 피크는 약물 주입 6 시간 동안 유지된 2,637 μg/ml의 명백한 평균 정상 상태 농도를 달성하였다(n=8). 주입 중단 1 시간 후, 평균 혈장 농도는 872 μg/ml로 정상 상태 농도로부터 67%만큼 감소하였고, 중단 후 6 시간까지, 평균 혈장 수준은 (정상상태 농도로부터) 184 μg/ml로 93%만큼 감소하였다. 주입 중단 후 18 시간까지, 평균 혈장 수준은 약 34　μg/ml(n=6)의 혈장 농도까지 (정상상태 농도로부터) 98% 초과만큼 감소하였다. 혈장 농도 시간 경과에서의 이러한 변화에 기초하여, 제거 반감기는 약 3 시간인 것으로 추정된다.
c. 요약 비교 표
투여 후 유사한 시점에서 혈장으로부터 소거의 상대 속도의 비교가 하기 표 1에 나타내어져 있다. 데이터는 (LCM-함유) 정제된 폴록사머 188과 LCMF 폴록사머 188 사이의 혈장 농도 감소의 속도에서 현저한 차이를 입증하며, 이는 LCMF 폴록사머 188이 더 빠르게 소거된다는 것을 입증한다. 차이점은 HMW 피크에 대한 것과 주요 피크에 대한 것에서 명백하다. 차이점은 HMW 피크에 대하여 가장 명백하다. 이는 LCMF 폴록사머가 종래 기술의 LCM-함유 폴록사머와 상이하다는 것을 나타낸다.
[표 1]
Figure 112017012374582-pct00002
D. 정제된 LCMF 폴록사머 188이 LCM을 함유하는 정제된 폴록사머 188과 상이함을 확인하는 분석 데이터
1. 다양한 폴록사머와 비교하는 분석 시험(RP- HPLC 분석법)
역상 크로마토그래피에는, 소수성 고정상(컬럼)과 보다 극성인 이동상이 있다. 이러한 "역"상 조건으로 인하여, RP-HPLC는 보통 상대적인 소수성에 기초하여 화합물을 분리하는 데 사용된다. 보다 소수성인 화합물은 보다 친수성인 화합물에 비하여 더 긴 컬럼 보유 시간을 나타낸다.
다음의 HPLC 조건을 사용하여 LCM을 함유하는 정제된 폴록사머 188 및 LCMF 폴록사머 188과 함께, 친수성/친유성 균형(HLB)에서 공지된 차이를 가지는 다양한 폴록사머에 대한 컬럼 보유 시간을 비교하였다.
Figure 112017012374582-pct00003
*ELS = 증기화 광산란
결과
결과는 LCMF 폴록사머 188이 선행 기술의 정제된 폴록사머 188과 상이하다는 것을 나타낸다. 이는 상이한 약동학 특성을 가지며, 이는 보다 장기 순환 물질을 함유하는 선행 기술 물질보다 더 친수성이라는 것을 반영한다.
도 9는 매우 친수성인 중합체(PEG 8000), LCMF 폴록사머 188, LCM-함유 정제된 폴록사머 188, 및 HLB 값이 감소(소수성이 증가)하는 2 가지 폴록사머, 즉 폴록사머 338 및 폴록사머 407 각각에 대한 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 가장 친수성이 큰 중합체인 PEG 8000은 매우 친수성인 성질과 일치하여 컬럼 상에서 거의 머무르지 않는 것으로 나타난다. 폴록사머 338(HLB 24 초과) 및 폴록사머 407(HLB 18 내지 23)은 이들의 공지된 HLB 값에 따라서 훨씬 더 긴 보유 시간(t R 및 k´ 값을 더함)을 나타낸다. LCMF 정제된 폴록사머 188은 LCM-함유 정제된 폴록사머 188보다 훨씬 더 빠르게 용리하며, (LCMF 정제된 폴록사머에 대한 평균 t R 및 k´는 각각, LCM 함유 정제된 폴록사머에 대한 값이 약 10.0(9.883) 및 3.7(3.697)인 것에 비하여, 약 8.8(8.807) 및 약 3.2(3.202)임) 이는 LCMF 폴록사머 188이 LCM 함유 정제된 폴록사머 188보다 상대적으로 보다 친수성인 것을 나타낸다.
도 10은 3 가지의 상이한 로트의 정제된 LCMF 폴록사머 188 및 두(2) 가지의 상이한 로트의 정제된 (LCM-함유) 폴록사머 188에 대한 크로마토그램을 나타낸다. 이들 결과는 상이한 로트의 물질에 대한 강력한 재현가능성을 입증하며, 2 가지 물질 사이의 차이점이 분석 가변성에 의해 설명될 수 없음을 나타낸다. 이러한 결과는, LCMF 폴록사머 188의 중합체 분포가 정제된 폴록사머 188보다 더 친수성임을 입증한다.
2. LCMF 정제된 폴록사머 및 LCM -함유 폴록사머의 상이한 약동학적 거동은 이들의 친수성에서의 차이와 상관관계가 있다
본 명세서에 기재된 바와 같이(예를 들어, 상기 실시예 7B, 도 9 및 10, 및 표 1 참조), LCMF 폴록사머 188은, 생체내 투여 후 보다 장기의 순환 물질(LCM)을 함유하는 정제된 폴록사머 188에 비교할 때, 인간 대상체에의 투여 후 현저하게 상이한 약동학적 거동을 나타낸다. 이 실시예에서 제공된 데이터는, LCMF 폴록사머 188이 장기 순환 물질을 생성하는 정제된 폴록사머 188에 비하여 보다 친수성임을 나타낸다.
폴록사머 188의 정제된 변형체(정제된 LCM-함유 폴록사머 188, 및 LCMF 폴록사머 188)의 중합체 크기 분포는 HPLC-GPC에 의해 나타낸 바와 같이 크기에 대하여 유사하다. 둘 다 하기 기준을 충족한다:
Figure 112017012374582-pct00004
* NMT= 이하
HPLC-GPC에 의해 나타낸 바와 같이 2 가지 정제된 폴록사머의 중합체 크기 분포는, 본 명세서에서 RP-HPLC에 의해 입증된 바와 같이 유사한 반면, LCMF 폴록사머 188의 중합체 분포를 포함하는 분자는 보다 친수성이다.
동물에게 주입할 때, 보다 친수성인 중합체 분포는 더 빠른 속도로 순환으로부터 소거된다. 이는 LCMF 폴록사머 188 제조물 중 보다 장기 순환 물질의 존재의 감소를 설명한다. 이 결과는 또한, 상기에서 관찰되고 기재된 바와 같이, 중합체 분포의 주요 피크가 더 빠르게 소거한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 임상 시험으로부터 혈장 농도 시간 경과 데이터는, LCM 함유 정제된 폴록사머 188에 비하여 LCMF 폴록사머 188의 주요 피크 및 고분자량 피크에 대하여 더 짧은 제거 반감기를 나타낸다.
P188의 유변학적, 세포보호, 유착방지 및 항혈전 효과가, 대략 8,400 달톤 내지 9,400 달톤(이는 순환 반감기가 약 4 시간 내지 7 시간임)인 분포의 우세하거나 주요 공중합체 내에서 최적이므로, 폴록사머 188의 더 크고, 보다 소수성이며, 보다 장기의 순환 반감기 성분의 존재는 바람직하지 않다. 예를 들어, P188의 원하는 활성 중에서는 혈액 점도를 감소시키고 적혈구(RBC) 응집을 억제하는 유변학적 효과가 있으며, 이는 손상된 조직에서 혈류를 개선시키는 능력을 설명한다. 반대로, 보다 소수성이고, 보다 높은 분자량의 폴록사머, 예컨대 P338(또한 Pluronic® F108로 불림) 및 P308(Pluronic® F98)은 혈액 점도 및 RBC 응집을 증가시킨다(Armstrong et al. (2001) Biorheology, 38:239-247). 이는 P188의 반대 효과이며, 보다 높은 분자량의 소수성 폴록사머 종이 바람직하지 않은 생물학적 효과를 나타낼 수 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 결과는, 정제된 (LCM-함유) 폴록사머 188의 고분자량 피크에 함유된 소수성 성분이 원치않는 불순불이라는 것을 나타낸다. 따라서, 폴록사머 188, 예컨대 이러한 성분의 양이 감소된 LCMF 폴록사머가 바람직하다.
실시예 8
메탄올의 제어된 단계식 증가를 이용하는 다단계 추출 배치 공정에서 메탄올 농도를 조정하는 효과
하기와 같이 메탄올의 제어된 단계식 증가로 메탄올 농도를 변경함으로써 수행된 추출로 폴록사머 188의 다단계 추출 배치 공정을 실행하는 것을 제외하고는, 실질적으로 상기 실시예에 기재된 바와 같은 방법을 실행하였다. 실현가능한 최대 압력은 통상적으로 250 atm이다. 따라서, 메탄올 농도 및 추출 시간을 조정하는 공정이 압력 제한을 수용하기 위해 이용될 수 있다.
A. 제어된 단계식 증가: 6.3 중량% , 7.1 중량% 및 8.1 중량% 메탄올
107 kg/hr의 메탄올 유속으로 3 시간 동안 폴록사머 용액을 통해 6.3% 메탄올/CO2 추출 조용매를 퍼콜레이션하는 것을 제외하고, 폴록사머 188(14 kg)을 실시예 8에 기재된 바와 같이 정제하였다. 108 kg/hr의 메탄올 유속에서 초과 8 시간 동안 7.1% 메탄올/CO2 조용매를 이용하여 추출을 계속하였다. 109 kg/hr의 메탄올 유속으로 추가 7 시간 동안 8.1% 메탄올/CO2 조용매를 이용하여 추출을 추가로 계속하였다. 공정 종료시, 추출기 내용물을 방출하고 건조하여 파트 A에 기재된 바와 같이 잔류 메탄올을 제거하였다. 정제된 폴록사머 188의 수율은 66%였다. 결과는 또한, 공정이 LMW 종에서 측정가능한 감소를 초래하였다는 것을 입증하였다.
B. 제어된 단계식 증가: 3.8 중량% , 9.1 중량% 및 10.7 중량% 메탄올
104 kg/hr의 메탄올 유속으로 4 시간 동안 폴록사머 용액을 통해 3.8% 메탄올/CO2 추출 조용매를 퍼콜레이션하는 것을 제외하고, 폴록사머 188(14 kg)을 실시예 8에 기재된 바와 같이 정제하였다. 108 kg/hr의 메탄올 유속에서 초과 3 시간 동안 9.1% 메탄올/CO2 조용매를 이용하여 추출을 계속하였다. 112 kg/hr의 메탄올 유속으로 추가 8 시간 동안 10.7% 메탄올/CO2 조용매를 이용하여 추출을 추가로 계속하였다. 공정 종료시, 추출기 내용물을 방출하고 건조하여 파트 A에 기재된 바와 같이 잔류 메탄올을 제거하였다. 정제된 폴록사머 188의 수율은 57%였다. 결과는 또한, 공정이 LMW 종에서 측정가능한 감소를 초래하였다는 것을 입증하였다.
실시예 9
메탄올/고압 CO 2 조용매를 이용한 추출에 의한 폴록사머 188의 배치 정제 공정
메탄올/고압 CO2 조용매를 이용한 추출에 의한 폴록사머 188의 배치 정제 공정을 평가하였다. 폴록사머 188(13 kg 내지 14 kg)을 메탄올/고압 CO2 용매를 이용한 추출에 의해 정제하였다. 폴록사머 188을 혼합할 때까지 고압 추출 용기 중에서 메탄올과 함께 교반한다. 메탄올 및 고압 CO2의 조용매를 추출 용기를 통해 펌핑한다. 추출 용매의 용매 특징은 추출 용매 온도, 압력 및 메탄올 조용매의 양을 제어함으로써 조정된다. 구체적으로, 이들 3 가지 매개변수의 조합은 상용 등급 폴록사머 188로부터 저분자량(LMW) 및 고분자량(HMW) 성분의 제거를 위해 선택된다. 메탄올의 시작 농도는 대략 2.5 중량%이고, 25 중량%까지 연속적으로 증가된다. 추출 용기 압력은 75 ± 10 bar이고, 추출 온도, 메탄올/CO2 조용매 온도 및 추출기 자켓 온도는 20℃ 내지 25℃이다. 추출 공정은 순차적 방식으로 수행되어 추출기로부터 다양한 성분을 연속적으로 제거한다.
추출 용매를 제거하고, 용리된 분획을 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 분석하였다. 정제 후, 정제된 폴록사머 188을 추출 용기로부터 회수하고 GPC에 의해 분석한다. 초기에, 저분자량(LMW) 성분은 추출 동안 제거되고, 주요 분획은 메탄올의 더 높은 농도에서 제거된다. 고분자량 성분은 추출 공정의 후기 단계에서 제거된다. 정제된 폴록사머 188의 분자량 분포는 출발 물질에 대한 것보다 더 좁다.
중합체의 수율은 60% 내지 80%이고, 저분자량 성분(4,500 달톤 미만)이 1.5% 미만인 것으로 추정된다. 피크 평균 분자량은 약 8,500 ± 750 달톤이다.
변형은 당업자에게 명백할 것이므로, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.

Claims (80)

  1. a) 폴록사머 188 용액을 추출기 용기에 도입하며, 여기서 폴록사머 188은 제1 알칸올에 용해되어 용액을 형성하는 단계;
    b) 제1 정해진 기간 동안, 상기 폴록사머 188 용액을 초임계 이산화탄소를 유지하는 온도 및 압력 하에서 제2 알칸올 및 초임계 이산화탄소를 포함하는 추출 용매와 혼합하는 단계로서,
    상기 온도는 이산화탄소의 임계 온도를 초과하지만 40℃ 이하이고;
    상기 압력은 220 bar 내지 260 bar이며;
    상기 알칸올은 전체 추출 용매의 7 중량% 내지 8 중량%인 알칸올 농도로 제공되는 단계; 및
    c) 추출 방법의 시간 경과에 따른 구배 단계에서, 단계 b)에서 추출 용매 중 제2 알칸올의 농도를 복수 회 증가시키는 단계로서, 여기서
    복수 회 각각은 추가로 정해진 기간 동안 일어나고;
    각각의 연속 단계에서, 상기 알칸올 농도는 제2 알칸올의 이전 농도에 비하여 1% 내지 2% 증가되는 단계; 및
    d) 추출 용기로부터 추출 용매를 제거하여, 이에 의해 라피네이트 폴록사머 188 제조물로부터 추출된 물질을 제거하여 장기 순환이 없는(LCMF) 폴록사머 188을 생성하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 알칸올 및 제2 알칸올은 메탄올인,
    장기 순환이 없는(LCMF) 폴록사머 188을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하기 I), Ⅱ), Ⅲ), 및 IV)로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나를 만족하는 것인 방법:
    I) 단계 a)에서 상기 폴록사머 188 대 제1 알칸올의 비율은 중량으로 2:1 내지 3:1 이고;
    II) 단계 c)에서 상기 복수 회는 2 회, 3 회, 4 회 또는 5 회의 구배 단계로 일어나거나, 또는
    단계 c)는
    i) 제2 정해진 기간 동안 7% 내지 8%로부터 8.1% 내지 9.5%로 제2 알칸올의 농도를 증가시키는 단계; 및
    ii) 제3 정해진 기간 동안 8.2% 내지 9.5%로부터 9.6% 내지 11.5%로 제2 알칸올의 농도를 증가시키는 단계
    를 포함하는 2 개의 단계로 일어나고;
    Ⅲ) 제1 정해진 기간, 제2 정해진 기간, 및 제3 정해진 기간 각각은 2 시간 내지 12 시간 동안 수행되고; 및
    Ⅳ) 추출된 물질을 제거하는 단계 d)는 단계 b) 및 c) 전반에 걸쳐 일어난다.
  3. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 알칸올 농도는 7.4 중량% 인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제1 정해진 기간, 제2 정해진 기간 및 제3 정해진 기간 각각은 동일 또는 상이하거나, 제1 정해진 기간은 2 시간 내지 6 시간 동안 수행되거나, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 제2 정해진 기간은 2 시간 내지 6 시간동안 수행되는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 제3 정해진 기간은 4 시간 내지 10 시간 동안 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하기 I), Ⅱ), Ⅲ), 및 IV)로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나를 만족하는 것인 방법:
    I) 상기 추출된 물질은 4,500 달톤 미만의 저분자량 불순물을 포함하고;
    Ⅱ) 상기 LCMF 폴록사머 188은 화학식:
    HO(CH2CH2O)a'─[CH(CH3)CH2O]b─(CH2CH2O)aH를 가지며,
    a 및 a' 각각은 친수기(C2H4O)의 백분율이 공중합체의 전체 분자량의 60 중량% 내지 90 중량% 가 되도록 하는 정수이고;
    a 및 a'는 동일하거나 상이하며;
    b는 소수기(C3H6O)의 분자량이 1,300 달톤 내지 2,300 달톤이도록 하는 정수이고;
    공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 4,500 달톤 미만인 저분자량 성분이며;
    공중합체의 분포에서 전체 성분의 1.5% 이하는 평균 분자량이 13,000 달톤 초과인 고분자량 성분이고;
    공중합체의 다분산도 값은 1.07 미만이고;
    Ⅲ) 상기 방법은 배치 방법이고; 및
    Ⅳ) 상기 방법은 연속 방법인 방법.
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