KR102518565B1 - 조류 괴사성 장염의 검출 방법 - Google Patents

조류 괴사성 장염의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세소포 기반의 조류 괴사성 장염의 검출 방법, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의한 조류 괴사성 장염 및/또는 조류 감염의 검출에 적합한 것으로서 확인된 신규한 마커에 관한 것이다.

Description

조류 괴사성 장염의 검출 방법 {METHOD OF DETECTING AVIAN NECROTIC ENTERITIS}
본 발명은 미세소포 기반의 조류 괴사성 장염의 검출 방법, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 가 관여하는 조류 괴사성 장염 및/또는 조류 감염의 검출에 적합한 것으로서 동정된 신규한 마커에 관한 것이다.
클로스트리디움 퍼프린젠스는 1961 년에 최초로 기재된 가금류의 장 질환인, 조류 괴사성 장염 (NE) 의 주요 원인 인자이다. 닭에서의 NE 는 급성 또는 만성 장독소혈증으로 나타난다. 급성 질환은 소화관 벽에서의 괴사성 병변의 발달로 인해 유의한 수준의 치사율을 초래하지만, 만성 질환은 생산성과 복지의 유의한 손실을 야기한다. 이러한 질환은 가금류 산업에서 연간 수십억 US 달러의 손실을 초래하는 것으로 추산된다.
C. 퍼프린젠스 (C. perfringens) 는 일반적으로 가금류의 위장관에서 발견되지만, 괴사성 장염의 발병은 산발적이다. C. 퍼프린젠스는 그람-양성, 막대모양, 포자 형성, 산소내성 혐기성이다. C. 퍼프린젠스 균주는 4 가지 의심되는 주요 독소 (알파, 베타, 엡실론 및 이오타) 의 생산을 기반으로, 5 가지 독소 유형 (A, B, C, D 및 E) 으로 분류된다. 유형 A 는 닭의 창자로부터 지속적으로 회수되지만, 다른 유형들은 덜 일반적이다.
NE 에 대한 초기 연구는 질환에 관여하는 주된 병독성 인자가 박테리아에 의해 분비된다는 것을 제안하여, 이것이 알파-독소로 불리는 포스포리파아제 C 효소가 발병에 관여하는 주요 독소라는 제안에 이르도록 하였다. 하지만 최근의 연구는, 알파 독소 돌연변이 균주가, 일반적으로 질환에서 알파-독소의 역할에 의문을 제기하는 NE 를 야기할 수 있기 때문에, 알파-독소가 필수 병독성 인자가 아닌 것으로 보인다고 제시되었다. 보다 최근의 연구에서는, 신규한 기공 형성 독소인 netB 가, 이러한 질환의 발달에 주요 핵심 역할을 담당하는 것으로 제안되었다.
NE 의 발병률에 대한 병독성 인자의 단순한 연관성 이외에, 조류 또는 가축에서의 질환의 확립에 대한 이러한 인자들 간의 역학적 관련성을 나타내는데 여전히 큰 부담이 존재한다. 나아가, 임의의 이러한 병독성 인자에 대하여 준임상 NE 감염을 관련시키는 것은, 조류에서 도축 전 검사를 받아야한다는 신호가 없기 때문에, 달성하기가 매우 곤란하다. 따라서, NE, 및 가장 중요하게는, NE 의 준임상 형태를 초기에 검출하는 방법에 대한 요구가 여전히 절실하게 요구된다.
전통적으로, 질환에 대한 바이오마커의 발견 및 타당성 검증은, 조직, 신선한 동결된, 또는 보다 일반적으로는, 포르말린-고정된, 파라핀-내장된 조직의 사용이 요구된다. 유리된 RNA 의 RNase 분해는, 조직 기반 바이오마커를 혈액 또는 대변/맹장변 샘플과 같은 생체유체로 번역하는데 큰 문제를 만들기 때문에, 이는 특히 mRNA 기반 바이오마커의 경우에 그러하다. 하지만, 조직 바이오마커의 모니터링은, 이의 침습적 성질로 인해, 가축의 경우와 같이 다수의 샘플이 관련되는 경우, 시간 소모적이며 비실용적이다.
혈액 파라미터의 측정과 같은 비(非)침습적 방법이 조류에서의 질환 검출에 대하여 기재되어 있다 (Chuku et al., 2012; Aade et al., 2012; Saleem, 2012). Gulbeena Saleem (2012) 은, 준임상 NE 의 확인을 위한 대안적인 접근법으로서, 닭의 혈청에서의 C. 퍼프린젠스 접종에 대한 반응으로 세룰로플라스민, PIT54 및 오보트랜스페린과 같은 급성기 단백질 수준의 측정을 제안하였다. 단지 세룰로플라스민만이 준임상 NE 의 발병과 상관관계가 있는 적합한 급성기 단백질인 것으로 판명되었다. 그럼에도 불구하고, 세룰로플라스민은 NE 에 대한 특이적 마커가 아니라 다른 박테리아 병원체에 의해 야기되는 질환에 대한 마커이기도 하기 때문에, 이는 문제로 볼 수 있다 (collibacillosis in chicken, Piercy, 1979; salmonella infection in commercial layers, Garcia et al., 2009).
하지만, 최근에는, 생체재료에서 확인된 엑소좀 및 기타 멤브레인 소포가, mRNA, miRNA 및 질환 병태에 대하여 높은 특이성을 갖는 기타 비(非)코딩 RNA 를 포함하여, 인간 공여자 세포로부터의 안정한 RNA 를 함유한다는 것을 발견하였다 (Skog et al., 2008; Nilsson et al., 2009; Li et al., 2009; Shao et al., 2012).
따라서, 본 출원의 발명자들은, 가금류의 체액 또는 배설물로부터 단리된 멤브레인 소포가 준임상 괴사성 장염을 나타내는 가금류를 확인하는 사용될 수 있는지 여부에 대하여 의문을 제기하였다. 이는, 특히 질환과의 상관관계를 나타내는 특정 숙주 miRNA 의 축적으로 인해 사실일 수 있다.
놀랍게도, 조류 체액 또는 조류 배설물로부터 단리된 미세소포가, 괴사성 장염의 존재에 따라 검출 가능한 RNA 함량에 있어서 변화를 나타낸다는 것을 발견하였다. C. 퍼프린젠스에 의한 감염으로 인한 미세소포에서의 특정 숙주-miRNA 의 증가 이외에, 놀랍게도 또한 C. 퍼프린젠스의 mRNA 서열이 미세소포 분획에서 검출될 수 있었기 때문에, 이는 질환 특이적 병독성 인자로서 및 따라서 괴사성 장염을 나타내는 적합한 바이오마커로서 분류된다.
미세소포 분획에서의 C. 퍼프린젠스 mRNA 의 존재는, 적용된 단리 절차가 가금류의 미세소포를 풍부하게 할 뿐 아니라, 감염성 박테리아의 미세소포도 풍부하게 한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 놀랍게도, netB 와 같은 공지된 추정되는 병독성 인자 이외에, 또한 이전에는 의심스럽게 여기지 않던 RNA 서열이 괴사성 장염과 상관관계가 있는 것으로서 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제 1 목적은, 바람직하게는 가금류, 더욱 바람직하게는 닭에서의 조류 괴사성 장염, 특히 준임상 조류 괴사성 장염의 확인하기 위한 및/또는 괴사성 장염을 앓고 있는 조류 대상을 식별하기 위한, 신속하고 신뢰할 만한, 바람직하게는 비침습적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은, 상기와 같은 방법에 이용될 수 있는 적합한 마커, 바람직하게는 질환-특이적 마커를 동정하는 것이다.
따라서, 본 발명의 제 1 주제는, 조류 샘플, 특히 조류 체액 또는 조류 배설물로부터 미세소포를 단리하고, 이어서 이러한 미세소포에서 괴사성 장염을 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 괴사성 장염, 특히 준임상 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비(非)감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 괴사성 장염을 나타내는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 괴사성 장염을 나타내는 마커는, 바람직하게는 하기의 클로스트리디움 퍼프린젠스의 서열 및 이의 동족체 및 단편: SAM 영역 (SEQ ID NO: 1), swim 아연 핑거 (finger) 영역 (SEQ ID NO: 3), scRNA (SEQ ID NO: 4), colA 영역 (SEQ ID NO: 5), CPE0956 영역 (SEQ ID NO: 7), netB 영역 (SEQ ID NO: 8), virX 영역 (SEQ ID NO: 9) 및 TpeL 영역 (SEQ ID NO: 16); 뿐 아니라 하기의 조류 서열 및 이의 동족체 및 단편: mir-16 (SEQ ID NO: 10), mir-24 (SEQ ID NO: 11), mir-155 (SEQ ID NO: 12), mir-206 (SEQ ID NO: 13) 으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 주제는, 조류 샘플, 특히 조류 체액 또는 조류 배설물로부터 미세소포를 단리하고, 이어서 이러한 미세소포에서 괴사성 장염을 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 괴사성 장염, 특히 준임상 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 괴사성 장염을 나타내고, 마커는 하기 군 ("목록 I") 으로부터 선택되는 방법이다:
a) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 4 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 8 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 9 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 16 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40, 60 또는 80 개의, SEQ ID NO: 10 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
j) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 11 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
k) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 12 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
l) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 13 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
m) (a) 내지 (l) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
n) (m) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
o) (a) 내지 (n) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 방법에서, 서열은 바람직하게는 하기 군 ("목록 II") 으로부터 선택된다:
a) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 1 내지 630, 특히 420 내지 630, 바람직하게는 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 600 내지 1000, 특히 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 4 의 위치 60 내지 240, 특히 80 내지 220 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 5 (로 표시되는 서열) 의 위치 1300 내지 1800, 특히 1400 내지 1700 에 따른 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 1 내지 591, 특히 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 8 의 위치 240 내지 540, 특히 300 내지 540 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 9 의 위치 12 내지 418, 특히 240 내지 400 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 16 의 위치 673 내지 5628 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12 개의, SEQ ID NO: 10 의 위치 14 내지 25 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
j) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 11 의 위치 44 내지 65 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
k) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 12 의 위치 3 내지 24 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
l) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 13 의 위치 45 내지 66 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
m) (a) 내지 (l) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
n) (m) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
o) (a) 내지 (n) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
더욱 바람직하게는, 서열은 하기 군 ("목록 III") 으로부터 선택된다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 4 의 위치 80 내지 220 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 5 의 위치 1400 내지 1700 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 8 의 위치 300 내지 540 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 9 의 위치 240 내지 400 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 16 의 위치 673 내지 5628 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12 개의, SEQ ID NO: 10 의 위치 14 내지 25 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
j) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 11 의 위치 44 내지 65 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
k) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 12 의 위치 3 내지 24 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
l) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 13 의 위치 45 내지 66 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
m) (a) 내지 (l) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
n) (m) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
o) (a) 내지 (n) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드/마커의 조합, 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 상기 마커의 조합이, 괴사성 장염의 검출에 사용된다.
본 발명의 또 다른 주제는, 조류 샘플로부터 미세소포를 단리하고, 이어서 이러한 미세소포에서 클로스트리디움 퍼프린젠스 관련 감염, 특히 클로스트리디움 퍼프린젠스 관련 괴사성 장염의 존재를 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 관련 감염, 특히 클로스트리디움 퍼프린젠스 관련 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 질환, 특히 괴사성 장염을 나타내는 방법이다. 이러한 방법에서, 하나 이상의 마커는 바람직하게는 목록 I, (a) 내지 (h) 의 폴리뉴클레오티드, 및 이들 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA) 로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 마커는 목록 II, (a) 내지 (h) 의 폴리뉴클레오티드, 및 이들 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA) 로부터 선택된다. 보다 더욱 바람직하게는, 마커는 목록 III, (a) 내지 (h) 의 폴리뉴클레오티드, 및 이들 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA) 로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 주제는, 조류 샘플로부터 미세소포를 단리하고, 이어서 이러한 미세소포에서 조류 miRNA 관련 감염, 특히 조류 miRNA 관련 괴사성 장염의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 miRNA 관련 감염, 특히 조류 miRNA 관련 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 질환, 특히 괴사성 장염을 나타내는 방법이다. 이러한 방법에서, 하나 이상의 마커는 바람직하게는 목록 I, (i) 내지 (l) 의 폴리뉴클레오티드, 및 이들 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA) 로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 마커는 목록 II, (i) 내지 (l) 의 폴리뉴클레오티드, 및 이들 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA) 로부터 선택된다. 보다 더욱 바람직하게는, 마커는 목록 III, (i) 내지 (l) 의 폴리뉴클레오티드, 및 이들 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA) 로부터 선택된다.
놀랍게도, SAM 영역 (SEQ ID NO: 1), swim 아연 핑거 영역 (SEQ ID NO: 3), scRNA (SEQ ID NO: 4), CPE0956 영역 (SEQ ID NO: 7), virX 영역 (SEQ ID NO: 9) 뿐 아니라, mir-16 (SEQ ID NO: 10), mir-24 (SEQ ID NO: 11), mir-155 (SEQ ID NO: 12), 및 mir-206 (SEQ ID NO: 13) 이 조류 괴사성 장염을 확인하는 마커로서 사용될 수 있기 때문에, 본 발명의 추가의 주제는, 조류 괴사성 장염, 특히 준임상 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 괴사성 장염의 검출이, 특히 감염되지 않은 조류의 대조군 샘플과 비교하여, 조류 샘플에서, 바람직하게는 조류 샘플의 미세소포에서 하기 서열 ("목록 IV") 중 하나 이상의 존재 및/또는 양을 검출함으로써 수행되며, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 이들 서열 중 하나 이상의 존재 및/또는 증가 수준이 괴사성 장염을 나타내는 방법이다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 4 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 9 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40, 60 또는 80 개의, SEQ ID NO: 10 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 11 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 12 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 13 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
j) (a) 내지 (i) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
k) (j) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
l) (a) 내지 (k) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 방법에서, 서열은 바람직하게는 하기 군 ("목록 V") 으로부터 선택된다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 1 내지 630, 특히 420 내지 630, 바람직하게는 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 600 내지 1000, 특히 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 4 의 위치 60 내지 240, 특히 80 내지 220 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 1 내지 591, 특히 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 9 의 위치 12 내지 418, 특히 240 내지 400 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12 개의, SEQ ID NO: 10 의 위치 14 내지 25 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 11 의 위치 44 내지 65 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 12 의 위치 3 내지 24 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 13 의 위치 45 내지 66 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
j) (a) 내지 (i) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
k) (j) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
l) (a) 내지 (k) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
더욱 바람직하게는, 서열은 하기 군 ("목록 VI") 으로부터 선택된다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 4 의 위치 80 내지 220 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 30 또는 40 개의, SEQ ID NO: 9 의 위치 240 내지 400 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12 개의, SEQ ID NO: 10 의 위치 14 내지 25 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 11 의 위치 44 내지 65 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 12 의 위치 3 내지 24 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 13 의 위치 45 내지 66 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
j) (a) 내지 (i) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
k) (j) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
l) (a) 내지 (k) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 조합, 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 상기 폴리뉴클레오티드의 조합이 괴사성 장염의 검출에 사용된다.
본 발명에 따른 조류 샘플은 조직 샘플, 바람직하게는 창자 샘플, 특히 십이지장 또는 공장 (jejunal) 샘플일 수 있다.
바람직하게는, 조류 샘플은 조류 체액 및 조류 배설물, 및 이의 용액 및 현탁액으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 조류 체액은 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장이다.
본 발명에 따른 조류 배설물은 바람직하게는 대변 및 맹장변으로부터 선택된다.
적합한 샘플 부피는, 예를 들어, 0.1 내지 20 ml, 특히 0.2 내지 10 ml, 바람직하게는 0.5 내지 5 ml 이다. 적합한 샘플 질량은, 예를 들어 0.1 내지 20 g, 특히 0.2 내지 10 g, 바람직하게는 0.5 내지 5 g 이다.
본 발명에 따른 조류 대상은 바람직하게는 가금류이다.
본 발명에 따른 바람직한 가금류는 닭, 칠면조, 오리 및 거위이다. 가금류는 어린 가축의 생산을 위해 최적화될 수 있다. 이러한 유형의 가금류는 또한 부모 동물 (parent animal) 로서 언급된다. 따라서, 바람직한 부모 동물은, 부모 육계 (broiler), 부모 오리, 부모 칠면조 및 부모 거위이다.
본 발명에 따른 가금류는 또한 화려한 가금류 및 엽조 (wild fowl) 로부터 선택될 수 있다.
바람직한 화려한 가금류 또는 엽조는, 공작새, 꿩, 자고새, 호로새, 메추라기, 큰뇌조, 뇌조, 비둘기 및 백조이다.
본 발명에 따른 보다 바람직한 가금류는 타조 및 앵무새이다.
본 발명에 따른 가장 바람직한 가금류는 닭이다.
본원에 사용된 바, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산" 은 DNA 및 RNA 를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
조류 배설물로부터의 미세소포의 단리, 및 조류 감염, 특히 조류 박테리아 감염, 더욱 특히 괴사성 장염의 확인을 위한 이의 후속 사용은, 이전에 개시된 적이 없었다.
따라서, 본 발명의 추가의 주제는, 조류 배설물, 특히 대변 또는 맹장변으로부터 단리된 미세소포에서 질환을 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 양을 측정하는 것을 포함하는, 조류 감염, 특히 준임상 조류 감염, 바람직하게는 조류 박테리아 감염, 특히 준임상 조류 박테리아 감염, 더욱 바람직하게는 괴사성 장염, 특히 준임상 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 질환을 나타내는 방법이다. 이러한 방법에서, 하나 이상의 마커는 바람직하게는 목록 I 에 개시된 바와 같은, 바람직하게는 목록 II 에 개시된 바와 같은, 더욱 바람직하게는 목록 III 에 개시된 바와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된다.
괴사성 장염을 나타내는 마커의 발생은 샘플-특이적이며, 즉 상이한 마커의 검출 가능한 양은 샘플 유형에 따라 달라진다고 판명되었다.
따라서, 대변에서, 가장 우수한 마커는 SAM 영역, 이어서 scRNA, netB 영역, virX 영역, colA 영역, swim 아연 핑거 영역 및 CPE0956 영역인 것으로 확인되었다.
반대로, 맹장변에서, 가장 우수한 마커는 또한 SAM 영역이나, 이어서 swim 아연 핑거 영역, scRNA, mir206, virX 영역, netB 영역, CPE0956 영역 및 colA 영역이다.
나아가, 혈액 샘플에서, 가장 우수한 마커는 mir16, 이어서 mir155 및 mir24 이다.
따라서, 본 출원의 바람직한 구현예는, 조류 대변, 바람직하게는 조류 대변에서 단리된 미세소포에서 괴사성 장염을 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 괴사성 장염, 특히 준임상 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 괴사성 장염을 나타내고, 마커는 바람직하게는 하기로부터 선택되는 것인 방법이다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 4 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 8 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 9 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) (a) 내지 (g) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
i) (h) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
j) (a) 내지 (i) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 방법에서, 서열은 바람직하게는 하기 군으로부터 선택된다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60 또는 100 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 1 내지 630, 특히 420 내지 630, 바람직하게는 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60 또는 90 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 600 내지 1000, 특히 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100 또는 140 개의, SEQ ID NO: 4 의 위치 60 내지 240, 특히 80 내지 220 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 5 의 위치 1300 내지 1800, 특히 1400 내지 1700 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150 또는 180 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 1 내지 591, 특히 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 8 의 위치 240 내지 540, 특히 300 내지 540 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150 또는 160 개의, SEQ ID NO: 9 의 위치 12 내지 418, 특히 240 내지 400 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) (a) 내지 (g) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
i) (h) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
j) (a) 내지 (i) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
따라서, 본 출원의 또 다른 바람직한 구현예는, 조류 맹장변에서, 특히 조류 맹장변에서 단리된 미세소포에서 괴사성 장염을 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 괴사성 장염, 특히 준임상 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 괴사성 장염을 나타내고, 마커는 바람직하게는 하기로부터 선택되는 것인 방법이다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 4 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 8 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 9 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 13 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) (a) 내지 (h) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
j) (i) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
k) (a) 내지 (j) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 방법에서, 서열은 바람직하게는 하기 군으로부터 선택된다:
a) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60 또는 100 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 1 내지 630, 특히 420 내지 630, 바람직하게는 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60 또는 90 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 600 내지 1000, 특히 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100 또는 140 개의, SEQ ID NO: 4 의 위치 60 내지 240, 특히 80 내지 220 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 5 의 위치 1300 내지 1800, 특히 1400 내지 1700 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150 또는 180 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 1 내지 591, 특히 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 8 의 위치 240 내지 540, 특히 300 내지 540 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150 또는 160 개의, SEQ ID NO: 9 의 위치 12 내지 418, 특히 240 내지 400 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
h) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 13 의 위치 45 내지 66 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
i) (a) 내지 (h) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
j) (i) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
k) (a) 내지 (j) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
따라서, 본 출원의 또 다른 바람직한 구현예는 조류 혈액에서, 특히 조류 혈액에서 단리된 미세소포에서 괴사성 장염을 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 괴사성 장염, 특히 준임상 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 괴사성 장염을 나타내고, 하나 이상의 마커는 바람직하게는 하기로부터 선택되는 것인 방법이다:
a) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40, 60 또는 80 개의, SEQ ID NO: 10 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 11 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 12 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) (a) 내지 (c) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
e) (d) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
f) (a) 내지 (e) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 방법에서, 서열은 바람직하게는 하기 군으로부터 선택된다:
a) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12 개의, SEQ ID NO: 10 의 위치 14 내지 25 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 11 의 위치 44 내지 65 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 12 의 위치 3 내지 24 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) (a) 내지 (c) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
e) (d) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
f) (a) 내지 (e) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 추가의 주제는, 괴사성 장염의 치료 방법으로서, 상기 기재된 바와 같은 괴사성 장염의 검출 방법을 수행하고, 이어서 괴사성 장염의 치료를 위한 치료제를 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
본 발명의 추가의 주제는 또한 조류 괴사성 장염의 검출을 위한 뉴클레오티드 어레이로서, 여기서 뉴클레오티드 어레이는, 목록 IV 에 도시된 바와 같은, 바람직하게는 목록 V 에 도시된 바와 같은, 더욱 바람직하게는 목록 VI 에 도시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는, 하나 이상의 마커, 바람직하게는 적어도 2, 3, 4 또는 5 개의 마커를 포함하는 어레이이다.
본 발명의 추가의 주제는 또한 괴사성 장염과 관련된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함하는 키트로서, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 목록 IV 에 도시된 바와 같은, 바람직하게는 목록 V 에 도시된 바와 같은, 더욱 바람직하게는 목록 VI 에 도시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 키트이다.
NetB 및 TpeL 은 이미 괴사성 장염의 발병에 관여하는 주요 독소인 것으로 논의되었다 (Keyburn et al, 2010; WO 2008/148166; Shojadoost et al.,2012).
ColA 는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 콜라게나아제 A 를 나타내며; 이러한 유전자는, 상기 박테리아의 이른바 주요 독소 중 하나인, 소위 카파-독소와의 유사성으로 인해 NE 의 발병과 관련이 있을 수 있다 (Obana et al., 2013).
그럼에도 불구하고, 미세소포에서 이러한 유전자의 발생 및 탈조절은 예상될 수가 없었다.
virX 유전자는 C. 퍼프린젠스에서 plx, colA, 및 pfoA 유전자를 조절하는 것으로 공지되어 있으나 (Ohtani et al., 2002), NE 의 발병에의 이의 관여는 이전에 보고된 적이 없었다.
클로스트리디움 퍼프린젠스의 포자형성 메카니즘에 관여하는 진화상 보존된 신호-인식-입자-유사 RNA 패밀리의 구성원인, 소 세포질 RNA (scRNA) (Nakamura et al., 1995) 또한 닭에서의 NE 와 직접적인 관련이 있다고 이전에 보고된 적이 없었다.
나아가, 괴사성 장염의 발병에서 SAM 도메인, swim 아연 핑거 도메인 및CPE0956 영역의 관여는, 이러한 서열이 이전에 공지되지 않은 기능을 갖는 서열이기 때문에, 이전에 개시되지 않았고, 또한 예상될 수 없었다.
따라서, 본 발명의 추가의 주제는, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 괴사성 장염에 관여하는 독소 활성 및/또는 병독성 인자를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다:
a) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) (a) 내지 (f) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
h) (a) 내지 (g) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
특히 바람직한 것은, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드이다:
a) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 1 내지 630, 특히 420 내지 630, 바람직하게는 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 1 의 위치 1 내지 630, 특히 420 내지 630, 바람직하게는 460 내지 560 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 600 내지 1000, 특히 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 3 의 위치 600 내지 1000, 특히 670 내지 760 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 1 내지 591, 특히 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
f) 적어도 20 개, 바람직하게는 적어도 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개의, SEQ ID NO: 7 의 위치 1 내지 591, 특히 100 내지 280 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 %, 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
g) (a) 내지 (f) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
h) (a) 내지 (g) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
따라서, 본 발명의 추가의 주제는 또한, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 괴사성 장염에 관여하는 독소 및/또는 병독성 인자인, 폴리펩티드이다:
a) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 2 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
b) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60 또는 70 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 14 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
c) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 190 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 15 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
d) (a) 내지 (c) 에 따른 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
특히 바람직한 것은, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드이다:
a) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 200 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 2 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
b) 적어도 40 개, 바람직하게는 적어도 60 또는 70 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 14 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
c) 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 150, 180 또는 190 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 15 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
d) (a) 내지 (c) 에 따른 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
따라서, 본 발명의 추가의 주제는 또한 동물에서 면역 반응을 상승시키는 방법으로서; 상기 방법은 상기 언급된 바와 같은, 특히 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 동물에 투여하는 것을 포함하는 방법이다:
a) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 200 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 2 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
b) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60 또는 70 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 14 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
c) 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 40, 60, 100, 150, 180 또는 190 개, 특히는 전체의, SEQ ID NO: 15 로 표시되는 아미노산 서열의 연속된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
d) (a) 내지 (c) 에 따른 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 바람직하게는 독소 활성을 나타내며, 바람직하게는 클로스트리디움 퍼프린젠스로부터 수득 가능하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 NE 관련 병독성 인자이다.
본 발명의 추가의 주제는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터, 특히 클로닝 및 발현 벡터 뿐 아니라 바이러스 및 플라스미드 벡터이다.
본 발명의 추가의 주제는, 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및/또는 벡터를 포함하는, 세포, 특히 박테리아 세포, 바람직하게는 대장균 세포이다.
본 발명의 추가의 주제는, 본 발명에 따른 독소 활성을 갖는 폴리펩티드, 특히 본 발명에 따른 NE 관련 병독성 인자에 특이적으로 결합하는, 다중클론 또는 단일클론 항체 또는 이의 단편이다.
본 발명의 추가의 주제는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 세포 또는 항체를 포함하는 조성물이다.
본 발명의 추가의 주제는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 포함하는 진단 키트이다. 키트는 나아가 하기에 보다 상세하게 설명되는 바와 같은, 원하지 않는 입자, 잔해물, 및 소분자로부터, 생물학적 샘플로부터의 미세소포를 분리하는데 적합한 포획 표면 장치를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 특히 미세소포의 임의적 단리 및 용해에서의 구성요소의 사용, 및 후속되는 본 발명에 따른 하나 이상의 마커의 존재의 정성적 또는 정량적 측정을 위한 이의 사용에 대한 지시사항을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 주제는, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 아쥬반트 및/또는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역성 조성물이다.
본 발명의 추가의 주제는 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 바람직하게는 아쥬반트 및/또는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신이다.
본 발명에 따른 미세소포는 박테리아, 특히 클로스트리디움 퍼프린젠스, 뿐 아니라 숙주, 특히 닭으로부터의 멤브레인 소포를 포함한다.
멤브레인 소포의 진핵생물 형태는 또한 엑소좀으로 불린다. 엑소좀은 전형적으로 30-200 nm 의 직경을 갖는다. 이는 RNAses 에 의한 분해로부터 보호되기 때문에, 모든 생체유체로 흘러들어가고, 다수의 온전한 단백질 및 올리고뉴클레오티드를 보유할 수 있다 (Koga et al., 2011).
엑소좀은 특히 암 및 면역 세포에서 연구되었다.
박테리아로부터의 미세소포는 또한 세포외 멤브레인 소포 (MV) 또는 외부 멤브레인 소포 (OMV) 로 불린다. 이는 전형적으로 20-500 nm 의 평균 직경을 갖는 구형 이중층 구조이다. 박테리아 미세소포는 처음에는 그람-음성 박테리아에 대하여 기재되었지만, 이후에 일부 그람-양성 박테리아에 대하여 기재되었다. 최근 연구에서, 미세소포가 C. 퍼프린젠스 유형 A 균주에 의해 생산 및 방출되어, 선천적 및 후천적 면역 반응을 유발한다고 보고되었다. 이러한 연구 중, 알파-독소 및 NetB 와 같은 중요한 병독성 인자는 멤브레인 소포에 존재하지 않지만, 베타2-독소는 멤브레인 소포에서 확인된다는 것을 추가로 발견하였다 (Jiang et al., (2014).
미세RNA (miRNA) 는, 통상적으로 18-23 개의 뉴클레오티드 크기를 갖는 작은, 비(非)-코딩 RNA 이며, 유전자 발현의 조절에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 제안되었다. 특히 면역 반응에 관련된 유전자는 miRNA 에 의해 고도로 표적화되는 것으로 보고되었다. 닭에서, miRNA 발현은 배아 발달 과정, 생식 세포 발달, 면역 기관 및 질환에 있어서 연구되었다.
최근 연구에서, C. 퍼프린젠스에 의해 감염된 2 종의 상이한 고도로 근친교배된 백색 레그혼 (White Leghorn) 닭 계통의 miRNA 프로파일을 조사하였다 (Dinh et al., 2014; Hong et al., 2014). RNA 분석은 비장 및 창자 점막으로부터의 조직을 이용하여 수행되었다. 결과는, 일부 miRNA 가 괴사성 장염에 반응하여 다르게 변형되는데, 이는 이의 표적 유전자의 발현을 조절한다는 것을 시사한다. 미세소포는 이러한 연구에서 조사되지 않았다.
본 발명에 따른 괴사성 장염에 상관관계가 있는 것으로 확인된 miRNA 는, 조류 인플루엔자 바이러스 감염된 육계와 관련되어, Wang 등에 의해 이전에 조사되었다 (Wang et al., 2012). Wang 등은, miR-155, miR-16-1 및 miR-24 의 miRNA 는 비(非)감염된 육계의 폐에서보다 감염된 육계의 폐에서 보다 강하게 발현되었으나, miR-206 은, 반대로, 감염된 것들에서 보다 비-감염된 것들에서 보다 강하게 발현되었다는 것을 발견하였다. 따라서, 박테리아 감염에 대한 마커로서 miR-206 의 사용은, 본 출원에서 최초로 개시된 것이다. 나아가, Wang 등의 연구와 대조적으로, 본 발명에 있어서, 모든 miRNA 는 조직이 아니라, 미세소포에서 검출되었다.
따라서, 본 발명의 추가의 주제는, 조류 샘플로부터 미세소포를 단리하고, 이어서 감염을 나타내는 하나 이상의 조류 마커의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 박테리아 감염, 특히 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 조류 마커의 증가 수준이 감염을 나타내고, 하나 이상의 조류 마커는 조류 miRNA 이며, 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법이다:
a) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40, 60 또는 80 개의, SEQ ID NO: 10 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 11 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 12 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 13 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) (a) 내지 (d) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
f) (e) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
g) (a) 내지 (f) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 방법에서, 서열은 바람직하게는 하기 군으로부터 선택된다:
a) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12 개의, SEQ ID NO: 10 의 위치 14 내지 25 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 11 의 위치 44 내지 65 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
c) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 12 의 위치 3 내지 24 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
d) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 13 의 위치 45 내지 66 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
e) (a) 내지 (d) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
f) (e) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
g) (a) 내지 (f) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
mir-206 이 최초로 조류 감염에 대한 마커로서 동정될 수 있었기 때문에, 본 발명의 추가의 주제는, 조류 감염, 바람직하게는 조류 박테리아 감염, 더욱 바람직하게는 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 하나 이상의 조류 마커의 증가 수준이 감염을 나타내고, 하나 이상의 조류 마커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법이다:
a) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 25, 40 또는 60 개의, SEQ ID NO: 13 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) (a) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
c) (a) 또는 (b) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이러한 방법에서, 서열은 바람직하게는 하기 군으로부터 선택된다:
a) 적어도 8 또는 10 개, 바람직하게는 적어도 12, 14, 16, 18 또는 20 개의, SEQ ID NO: 13 의 위치 45 내지 66 에 따른 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95 %, 가장 바람직하게는 100 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
b) (a) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
c) (a) 또는 (b) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명에 따른 방법의 적용은, 예를 들어 (i) 조류 괴사성 장염의 진단 및/또는 예후의 보조, (ii) 조류 괴사성 장염의 진행 또는 재발의 모니터링, 또는 (iii) 조류 대상 괴사성 장염을 앓고 있거나 이의 치료를 고려하고 있는 조류 대상에 대한 치료 효능의 평가에서의 보조이며; 여기서 상기 방법으로부터 수득된 핵산 추출물 중 상기 언급된 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 부재가 결정되고, 하나 이상의 바이오마커는, 각각, 괴사성 장염의 진단, 진행 또는 재발, 또는 치료 효능과 관련이 있다.
본 발명의 적용은 특히 중량 증가 및 사료 전환과 같은 조류 성능의 손실을 방지하는데 도움을 준다.
미세소포의 단리
핵산-함유 미세소포는 먼저 미세소포를 단리하지 않고 유체 샘플 또는 배설물로부터 직접 핵산을 추출함으로써 수득되는 수율/완전성 (integrity) 과 비교하여, 핵산 종을 유의하게 보다 높은 수율로 생산하기 때문에, 핵산의 추출 전 생물학적 샘플로부터의 미세소포의 단리는 유리하다. 나아가, 이는 또한 낮은 수준으로 발현되는 핵산을 검출하는 것도 가능하다. 미세소포의 단리는 또한 단백질, 지질, 세포 잔해물, 세포 및 잠재적인 오염물, 및 생물학적 샘플 내에서 자연적으로 발견되는 PCR 억제제의 배제를 가능하게 한다.
생물학적 샘플로부터의 멤브레인 소포의 단리 및 핵산의 후속 추출은, 예를 들어 10,000 g 초과에서 1-3 시간 동안 스피닝하는 초원심분리, 이어서 상청액의 제거, 펠렛의 세척, 펠렛의 용해 및 컬럼 상에서의 핵산의 정제에 의해 수행될 수 있다. 대안적인 방법은 초미세여과, 예를 들어 100 kD 필터를 사용하는 초미세여과, 중합체 침전 기술, 및/또는 크기 기반의 여과이다.
또 다른 대안적인 방법은, Raposo 등 (1996), Skog 등 (2008) 및 Nilsson 등 (2009) 에 의해 기재된 분별 원심분리; US 특허 제 6,899,863 호 및 제 6,812,023 호에 기재된 바와 같은 이온 교환 및/또는 겔 투과 크로마토그래피; U.S. 특허 제 7,198,923 호에 기재된 바와 같은 수크로오스 밀도 구배 또는 세포소기관 전기영동; Taylor 및 Gercel-Taylor (2008) 에 의해 기재된 자성 활성화 세포 선별 (MACS); Cheruvanky 등 (2007) 에 의해 기재된 바와 같은 나노멤브레인 초미세여과 농축; Miranda 등 (2010) 에 의해 기재된 바와 같은 Percoll 구배 단리; 및, Chen 등 (2010) 에 기재된 바와 같은 미세유체 장치에 의한 단리이다.
WO 2014/107571 에 따른 미세소포의 포획 표면 기반 단리
바람직한 구현예에서, 미세소포 분획은 포획 표면, 특히 멤브레인, 필터, 또는 WO 2014/107571 에 기재된 바와 같은 표면 개질된 비드에 결합된다.
생물학적 샘플을 바람직하게는, 바람직하게는 pH 4-8, 더욱 바람직하게는 5-7 을 갖는, 로딩 완충액 중에 용해시킨다. 따라서, 포획 표면에의 결합은 바람직하게는 pH 4-8, 더욱 바람직하게는 5-7 에서 일어난다. 바람직하게는, 생물학적 샘플과 포획 표면의 접촉 후, 1 회 이상의 세정 단계가 수행된다.
본 발명에 따라 이용될 수 있는 로딩 및 세정 완충액은 이온 강도가 높거나 낮을 수 있다. 따라서, 염 농도, 예를 들어, NaCl 농도는, 0 내지 2.4M 일 수 있다. 바람직하게는, 완충액은 하기 성분 중 하나 이상을 포함한다: Tris, Bis-Tris, Bis-Tris-프로판, 이미다졸, 시트레이트, 메틸 말론산, 아세트산, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 (TEA) 및 소듐 포스페이트.
세정은 바람직하게는 250 mM Bis Tris 프로판을 포함하고, pH 6.5-7.0 을 나타내는 세정 완충액을 사용하여 수행된다.
세정 완충액에 세제를 첨가함으로써, 비특이적인 결합이 억제된다. 사용에 적합한 세제에는, 비제한적으로, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Brij-35, Brij-58, 옥틸 글루코시드, 옥틸 티오글루코시드, CHAPS 또는 CHAPSO 가 포함된다.
포획 표면의 세정 후, 고정된 미세소포를 용해시켜 핵산을 방출시킬 수 있다. 고정된 미세소포를 용해시키기 위하여, 바람직하게는 QIAzol® 용해 시약 (Qiagen, Germany) 과 같은 페놀계 용해 완충액이 사용된다. 이어서, 핵산의 정제가 PLG 튜브를 사용한 클로로포름 추출, 이어서 에탄올 컨디셔닝에 의해 수행될 수 있다. 이어서, 세정 및 용리 전, 핵산을 실리카 컬럼에 결합시킬 수 있다.
미세소포의 용해 및 핵산의 추출은 또한 시판용 Qiagen R easy Plus 키트, 시판용 Qiagen miR easy 키트의 사용에 의해, 또는 당업계에 공지된 표준 절차 및 기술에 따라 페놀클로로포름의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 또한 미세소포 내 함유된 핵산을 포획하기 위하여 핵산-결합 컬럼을 이용할 수 있다. 일단 결합되면, 이어서 핵산과 결합 컬럼 사이의 상호작용을 파괴하기에 적합한 완충액 또는 용액을 사용하여 핵산을 용리시킬 수 있다.
핵산 추출 방법은 또한 하기와 같은 추가의 제제의 사용을 포함할 수 있다: RNase 억제제, 예컨대 Superase-In (Ambion Inc. 에서 시판됨) 또는 RNaselNplus (Promega Corp. 에서 시판됨); 프로테아제 (이는 또한 RNase 억제제로서 기능할 수 있음); DNase; 환원제; 디코이 (decoy) 기질, 예컨대 합성 RNA 및/또는 캐리어 RNA; RNase 에 결합할 수 있는 가용성 수용체; 소 간섭 RNA (siRNA); RNA 결합 분자, 예컨대 항-RNA 항체, 염기성 단백질 또는 샤프론 (chaperone) 단백질; RNase 변성화 물질, 예컨대 고 삼투압몰농도 용액, 세제, 또는 이들의 조합.
핵산의 추출 전, RNAse 억제제 뿐 아니라 추가의 제제가 생물학적 샘플, 및/또는 단리된 미세소포 분획에 첨가될 수 있다.
이러한 추가의 제제는 다양한 방식으로, 예를 들어 RNase 활성의 억제를 통해 (예를 들어, RNase 억제제), 단백질의 유비쿼터스 분해를 통해 (예를 들어, 프로테아제), 또는 RNA 에 결합하여 이를 보호하는 샤프론 단백질을 통해 (예를 들어, RNA-결합 단백질), 이의 기능을 발휘할 수 있다. 모든 경우에, 이러한 추출 증진제는 단리된 입자로부터의 핵산의 고 품질 추출을 막거나 또는 간섭할 수 있는, 단리된 입자와 관련이 있거나 또는 생물학적 샘플 내 부정적인 인자의 일부 또는 전부를 제거 또는 적어도 완화시킨다.
추출된 18S 및 28S rRNA 의 정량화는 핵산 추출의 품질을 결정하는데 사용될 수 있다.
포획 표면은 중성, 음으로 하전되거나 또는 양으로 하전될 수 있다. 이는, 원칙적으로 임의의 유형의 포획 표면이 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 멤브레인 재료에 따라, 멤브레인의 기공 크기는 20 nm 내지 5 ㎛ 범위일 수 있다.
특히, 포획 표면은 하기 시판용 멤브레인일 수 있다: Mustang® Ion Exchange Membrane (PALL Corporation 사제); Vivapure ® Q, Vivapure® Q Maxi H; Sartobind ® D, Sartobind (S), Sartobind ® Q, Sartobind ® IDA 또는 Sartobind® Aldehyde (Sartorius AG 사제); Whatman® DE81 (Sigma 사제); Fast Trap Virus Purification 컬럼 (EMD Millipore 사제); 또는 Thermo Scientific* Pierce 강한 양이온 및 음이온 교환 스핀 컬럼.
멤브레인이 핵산을 고정하는데 사용되는 경우, 멤브레인은 각종 적합한 재료로 제조될 수 있으며, 예를 들어 폴리에테르술폰 (PES) (예를 들어, Millipore 또는 PALL Corp. 사제) 또는 재생 셀룰로오스 (RC) (예를 들어, Sartorius 또는 Pierce 사제) 일 수 있다.
음으로 하전된 멤브레인이 사용되는 경우, 포획 표면은 바람직하게는, 음으로 하전된 멤브레인이며 술폰산기를 갖는 양이온 교환기인, S 멤브레인이다. 바람직하게는, S 멤브레인은 술폰산, R-CH2-SO3 으로 관능화된다. 대안적으로, 음으로 하전된 포획 표면은, 디에틸아민기, R-CH2-NFT(C2H5)2 를 갖는 약 염기성 음이온 교환기인, D 멤브레인이다. 대안적으로, 포획 표면은 금속 킬레이트 멤브레인이다. 예를 들어, 멤브레인은 이미노디아세트산 -N(CH2COOH")2 으로 관능화된, IDA 멤브레인이다. 일부 구현예에서, 포획 표면은 알데히드기, -CHO 로 관능화된, 미공성 멤브레인이다. 다른 구현예에서, 멤브레인은 디에틸아미노 에틸 (DEAE) 셀룰로오스를 갖는 약 염기성 음이온 교환기이다.
중성 포획 표면이 사용되는 경우, 포획 표면은 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 필터이다: 20nm 중성 PES 시린지 여과 (Tisch and Exomir), 30nm 중성 PES 시린지 여과 (Sterlitech), 50nm 중성 PES 시린지 여과 (Sterlitech), 0.2um 중성 PES 홈메이드 스핀 컬럼 여과 (Pall), 0.8um 중성 PES 홈메이드 스핀 컬럼 여과 (Pall) 및 0.8um 중성 PES 시린지 여과 (Pall). 포획 표면이 중성인 구현예에서, 바람직하게는 중성 포획 표면은 시린지 필터 내 하우징되지 않는다.
하전된 표면은, 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 0.65um 양으로 하전된 Q PES 진공 여과, 3-5um 양으로 하전된 Q RC 스핀 컬럼 여과, 0.8um 양으로 하전된 Q PES 홈메이드 스핀 컬럼 여과, 0.8um 양으로 하전된 Q PES 시린지 여과, 0.8um 음으로 하전된 S PES 홈메이드 스핀 컬럼 여과, 0.8um 음으로 하전된 S PES 시린지 여과, 및 50nm 음으로 하전된 나일론 시린지 여과.
바람직한 구현예에서, 표면이 양으로 하전된 멤브레인인 경우, 양으로 하전된 멤브레인이며 4차 아민을 갖는 음이온 교환기인, Q 멤브레인이, 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, Q 멤브레인은 4차 암모늄, R-CH2-N+(CH3)3 으로 관능화된다.
매우 바람직한 구현예에서, 양으로 하전된 멤브레인은 4차 아민을 갖는 음이온 교환기인, 재생 셀룰로오스, 강 염기성 음이온 교환기 ("RC/SBAE") 멤브레인이다. 바람직한 구현예에서, RC/SBAE 멤브레인은 4차 암모늄, R-CH2-N+(CH3)3 으로 관능화된다. 멤브레인의 기공 크기는 바람직하게는 3 ㎛ 이상이다.
포획 표면, 예를 들어 멤브레인은, 원심분리 (예를 들어 스핀 컬럼), 또는 진공 적용 (예를 들어 진공 필터 홀더), 또는 압력을 이용한 여과 (예를 들어 시린지 필터) 에 사용되는 장치 내 하우징될 수 있다.
스핀-컬럼 기반 정제 방법에서, 바람직하게는 1 개 초과의 멤브레인, 바람직하게는 2 내지 5 개의 멤브레인이, 튜브 내 병렬로 사용되고, 여기서 멤브레인은 바람직하게는 모두 컬럼의 한쪽 끝에서 하나의 또 다른 멤브레인에 바로 인접해있다. 수집 튜브는, 50ml Falcon 튜브와 같이 시판되는 것일 수 있다. 컬럼은 바람직하게는 스피닝에 적합하며, 즉, 크기가 표준 원심분리기 및 미세원심분리기와 호환 가능하다.
멤브레인 대신, 동일한 표면 개질을 갖는 비드 또한 핵산의 포획에 사용될 수 있다. 비드가 사용되는 경우, 이는 자성 또는 비(非)자성일 수 있다.
혈액이 샘플로서 사용되는 경우, 혈액을, 예를 들어 K2 EDTA 튜브 내에 수집하여, 완전히 반전시켜 잘 혼합할 수 있다. 이어서, 튜브를 1300xg 에서 10 분 동안 원심분리하여, 혈액 세포와 혈장을 분리시킨다. 이어서, 혈장을 제거하고, 0.8 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 세포 잔해물 및 혈소판을 제거한다. 이어서, 모든 혈장 샘플을 1ml 크리오바이알 (cryovial) 내에 분취하고, 사용 시까지 -80℃ 에서 보관한다.
RNA 단리 전, 멤브레인을 바람직하게는 평형 완충액에 통과시킴으로써 컨디셔닝시킨다. 해동된 혈장 샘플을 로딩 완충액으로 희석한다. 희석된 혈장 샘플을 미세소포를 흡수하는 멤브레인에 서서히 통과시킨다. 이어서, 멤브레인을 세정 완충액으로 세정하여, 약하게 결합된 임의의 혈장 성분을 제거한다. 이어서, 용해 시약을 멤브레인에 통과시켜 미세소포를 용해시킨다. RNA 를 miRNeasy 키트 (Qiagen) 를 사용하여 단리한다.
RNA 는 RNA 6000 Pico Chip 을 사용하여 2100 Bioanalyzer (Agilent) 로 품질 및 농도에 대하여 평가될 수 있다. 추출된 RNA 의 상대적 양은 Applied Biosystems (Taqman Assay) 사의 선택된 인간 유전자 발현 검정을 사용하여 RT-qPCR 에 의해 측정된다.
바람직한 구현예에서, 특히 가용화된 대변 또는 맹장변 샘플이 사용되는 경우, 생물학적 샘플에 존재하는 원하지 않는 큰 입자, 세포 및/또는 세포 잔해물 및 기타 오염물을 제거하기 위하여, 미세소포의 단리, 정제 또는 농축 전, 전처리 단계가 수행된다. 전처리 단계는 1 회 이상의 원심분리 단계 (예를 들어, 분별 원심분리) 또는 1 회 이상의 여과 단계 (예를 들어, 초미세여과), 또는 이들의 조합을 통해 달성될 수 있다. 1 회 초과의 원심분리 전처리 단계가 수행되는 경우, 생물학적 샘플은 먼저 저속에서, 이어서 고속에서 원심분리할 수 있다. 목적하는 경우, 추가의 적합한 원심분리 전처리 단계가 수행될 수 있다. 1 회 이상의 원심분리 전처리 단계에 대안적으로 또는 이에 부가적으로, 생물학적 샘플을 여과할 수 있다. 원하지 않는 큰 입자를 제거하기 위하여, 예를 들어 생물학적 샘플은 먼저 약 100-500g, 바람직하게는 250-300g 의 저속에서, 그 후 약 2,000 내지 약 200,000 g, 바람직하게는 약 20,000g 의 고속에서, 10 분 내지 약 1 시간 동안, 바람직하게는 0-10℃ 의 온도에서 원심분리할 수 있고; 이어서 샘플을, 예를 들어, 배제 크기가 0.1 내지 1.0 ㎛ 인 필터를 사용하여 여과할 수 있다.
고속 원심분리에 의해 수득된 펠렛 내 미세소포는 공정의 후속 단계에 적합한 적은 부피의 완충액을 이용하여 재구성될 수 있다. 농축 단계는 또한 초미세여과에 의해 수행될 수 있다. 사실, 이러한 초미세여과는 생물학적 샘플을 농축시키고, 미세소포 분획의 부가적인 정제를 수행한다. 또 다른 구현예에서, 여과는 초미세여과, 바람직하게는 탄젠트 (tangential) 초미세여과이다. 탄젠트 초미세여과는 결정된 컷-오프 역치의 멤브레인에 의해 분리된 2 개의 구획 (여과액 및 보유액) 사이의 용액을 농축 및 분별하는 것으로 이루어진다. 분리는 보유액 구획에 유동, 및 이러한 구획과 여과액 구획 사이에 막전위 압력을 적용함으로써 수행된다. 초미세여과를 수행하는데 상이한 시스템, 예컨대 나선형 멤브레인 (Millipore, Amicon), 플랫 멤브레인 또는 중공 섬유 (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor) 가 사용될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, 1000 kDa 미만, 바람직하게는 100 kDa 내지 1000 kDa, 또는 보다 더욱 바람직하게는 100 kDa 내지 600 kDa 의 컷-오프 역치를 갖는 멤브레인을 사용하는 것이, 유리하다.
부가적인 또는 대안적인 전처리 단계로서, 생물학적 샘플을 포획 표면과 접촉시키기 전 또는 후에, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피가 수행될 수 있다.
겔 투과 크로마토그래피 단계를 수행하기 위하여, 실리카, 아크릴아미드, 아가로오스, 덱스트란, 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체 또는 이들의 혼합물, 예를 들어 아가로오스-덱스트란 혼합물로부터 선택되는 지지체가, 바람직하게는 사용된다. 예를 들어, 이러한 지지체에는, 비제한적으로 하기가 포함된다: SUPERDEX® 200HR (Pharmacia), TSK G6000 (TosoHaas) 또는 SEPHACRYL® S (Pharmacia).
친화성 크로마토그래피는, 예를 들어 상이한 지지체, 수지, 비드, 항체, 압타머, 압타머 유사체, 분자적으로 각인된 중합체, 또는 미세소포 상에서 특이적으로 표적으로 하는 목적하는 표면 분자인 당업계에 공지된 다른 분자를 사용함으로써 수행될 수 있다.
임의로, 미세소포 정제 및/또는 핵산 추출의 효율 또는 품질을 평가하기 위하여, 미세소포 단리 또는 핵산 추출 전, 내부 대조군으로서 간주되는 대조군 입자가 샘플에 첨가될 수 있다. 이러한 대조군 입자에는, Q-베타 박테리오파지, 바이러스 입자, 또는 자연 발생되거나 또는 재조합 DNA 기술에 의해 엔지니어링될 수 있는 대조군 핵산 (예를 들어, 하나 이상의 대조군 표적 유전자) 를 함유하는 임의의 기타 입자가 포함된다. 대조군 표적 유전자는 실시간 PCR 분석을 사용하여 정량화될 수 있다.
바람직하게는, 대조군 입자는 본원에서 "Q-베타 입자" 로서 지칭되는, Q-베타 박테리오파지이다. Q-베타 입자는 자연 발생 바이러스 입자일 수 있거나, 또는 바이러스 입자의 하나 이상의 성분 (예를 들어, 게놈 또는 코트 단백질의 일부) 이 재조합 DNA 또는 당업계에 공지된 분자 생물학 기술에 의해 합성된, 재조합 또는 엔지니어링된 바이러스일 수 있다. Q-베타는, 4 개의 바이러스 단백질: 코트 단백질, 성숙 단백질, 용해 단백질, 및 RNA 레플리카아제를 인코딩하는 3 개의 유전자로 이루어진, 선형, 단일-가닥 RNA 게놈인 것을 특징으로 하는, 레비비리다에 (leviviridae) 패밀리의 구성원이다. 보통의 미세소포와 이의 유사한 크기로 인해, Q-베타는 본원에 기재된 바와 같은 미세소포를 단리하는데 사용되는 동일한 정제 방법을 사용하여, 생물학적 샘플로부터 용이하게 정제될 수 있다. 또한, Q-베타 바이러스 단일-가닥 유전자 구조의 낮은 복잡성은 증폭-기반 핵산 검정에서 대조군으로서 사용하기에 유리하다. Q-베타 입자는 샘플에서의 Q-베타 입자의 양의 정량화를 위해 검출 또는 측정되어야 하는 대조군 표적 유전자 또는 대조군 표적 서열을 함유한다. 예를 들어, 대조군 표적 유전자는 Q-베타 코트 단백질 유전자이다. Q-베타 입자의 생물학적 샘플에의 첨가 후, Q-베타 입자로부터의 핵산을, 본원에 기재된 추출 방법 및/또는 키트를 사용하여, 생물학적 샘플로부터의 핵산과 함께 추출한다. Q-베타 대조군 표적 유전자의 검출은 RT-PCR 분석에 의해, 예를 들어 관심 바이오마커 (즉, BRAF) 와 동시에 측정될 수 있다. 대조군 표적 유전자의 10 배 희석액 중 적어도 2, 3, 또는 4 개의 공지된 농도의 표준 곡선을 사용하여, 카피수 (copy number) 를 측정할 수 있다. 검출된 카피수 및 첨가된 Q-베타 입자의 양을 비교하여, 단리 및/또는 추출 공정의 품질의 측정할 수 있다.
따라서, Q-베타 입자의 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1,000 또는 5,000 개의 카피가 체액 샘플에 첨가된다. 바람직한 구현예에서, Q-베타 입자의 100 개의 카피가 체액 샘플에 첨가된다. Q-베타 입자의 카피수는 표적 세포를 감염시키는 Q-베타 박테리오파지의 능력을 기반으로 산출될 수 있다. 따라서, Q-베타 입자의 카피수는 Q-베타 박테리오파지의 콜로니 형성 유닛과 상관관계가 있다.
핵산 바이오마커의 검출
RNA 의 검출을 위하여, RNA 는 바람직하게는 추가의 증폭 전 상보적인 DNA (cDNA) 내로 역전사 (reverse-transcribed) 된다. 이러한 역전사는 단독으로 또는 증폭 단계와 조합으로 수행될 수 있다. 역전사와 증폭 단계를 조합하는 방법의 하나의 예는, 정량적이 되도록 추가로 개질될 수 있는 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCT), 예를 들어 US 특허 제 5,639,606 호에 기재된 바와 같은 정량적 RT-PCT 이다. 방법의 또 다른 예는 2 개의 별개의 단계를 포함한다: RNA 를 cDNA 로 전환시키는 제 1 역전사, 및 정량적 PCR 을 사용하여 cDNA 의 양을 정량화하는 제 2 단계.
RT-PCR 분석은 각각의 반응에 대한 Ct (사이클 역치) 를 측정한다. RT-PCR 에서, 양성 반응은 형광 신호의 축적에 의해 검출된다. Ct 값은 형광 신호가 역치를 넘어서는데 (즉, 백그라운드 수준을 초과함) 요구되는 사이클의 수로서 정의된다. Ct 수준은 샘플에서 표적 핵산, 또는 대조군 핵산의 양에 반비례한다 (즉, 샘플에서 Ct 수준이 낮을수록, 대조군 핵산이 많음). 대안적으로, 대조군 핵산의 카피수는 당업계에서 인정된 또 다른 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
단리된 입자 중에 존재하는 핵산의 분석은 정량적 및/또는 정성적이다. 정량적 분석의 경우, 단리된 입자 내 특정한 관심 핵산의, 상대적 또는 절대적, 양 (발현 수준) 을, 당업계에 공지된 방법으로 측정한다. 정성적 분석의 경우, 단리된 미세소포 내 특정한 관심 핵산의 종을 당업계에 공지된 방법으로 동정한다.
실시예
접종 준비
netB 및 tpeL 에 대하여 양성인 클로스트리디움 퍼프린젠스 단리물을 -80℃ 보관에서 제거하고, 5% 양의 혈액 (TSA II) 을 함유한 트립티케이스 소이 아가 (trypticase soy agar) 플레이트 상에 무균 스트리킹하였다. 플레이트를 혐기성 조건 하에서 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 접종물 배양 개시 15 시간 전, 밤새 플레이트로부터 단리된 콜로니를 50ml 사전 환원된 BHI 브로쓰 내에 접종하고, 혐기성 조건 하에서 37℃ 에서 약 15 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 50㎕ 의 배양액을 2 x 100 ml 의 사전 환원된 BHI 브로쓰에 첨가하였다. 고 용량 및 저 용량이 동시에 이의 최종 농도 (각각 109 cfu/ml 및 106 cfu/ml) 에 이르도록, 수득되는 브로쓰-배양액에 시차를 두었다. 각각의 배양액의 분취액을 성장 기간의 종료 시에 취하고, TSA II 아가 +5% 양의 혈액 상에 연속적으로 플레이팅하여, 박테리아 농도를 확인하였다.
동물 실험
칠백이십 (720) 마리의 수컷 육계를 36 배터리 펜 (battery pen) 에서 30 일 동안 사육하였다. 새들을 균등하게 무작위적으로 4 가지 처리군 (음성 대조군, 가짜군 (sham), 저용량 위관영양법 및 고용량 위관영양법) 중 하나로 지정하였다 (각각 9 개의 펜). 새들에게 항균제가 없는 표준 옥수수/대두 사료를 공급하였다. 사육 13 일차에, 과 또는 저체중 새들을 모든 펜으로부터 제거하고, 실험에서 배제시켰다. 이어서, 정상 체중 범위의 새들에게, netB 플라스미드를 함유하고 Tpel 유전자에 대하여 양성인 C. 퍼프린젠스 균주 1 ml 를, 14, 15 및 16 일차에 연속적으로 경구로 접종하였다. 가짜군에는 1ml 의 PBS 를 접종한 반면, 음성 대조군에는 어떠한 스트레스 또는 병원균 접종을 적용하지 않았다. 첫 번째 접종 (14 일차) 전, 각각의 펜으로부터의 3 마리의 새를 무작위적으로 선택하여, 혈액 및 소화물 샘플의 수집을 위해 희생시켰다. 두 번째 접종 (15 일차) 12 시간 후, 각각의 펜으로부터의 3 마리의 새를 샘플 혈액 및 소화물을 위해 다시 희생시켰다. 모든 희생된 새의 소화관 내용물을 밤새 배양하여, 이전에 기재된 바와 같이 (Heikinheimo et al, 2004) 영양 (vegetative) 세포에 대한 포자형성된 C. 퍼프린젠스의 비율을 측정하였다. 접종이 성공적이었는지 여부를 평가하기 위하여, 소화관 내용물 중 NetB 및 TpeL 유전자의 PCR 을 수행하였다. 시험의 종결 시까지, 각각의 펜에 10 마리 이상의 새가 남아있었다. 연구가 20 일차에 종결될 때까지 (모든 새가 희생될 때), 배설물 샘플을 간격을 두고 수집하고, 각각의 군으로부터 3 개의 채혈된 혈액 샘플을 수득하였다. 새의 GIT 를 NE 의 전형적인 징후/병변에 대하여 검사하고, 위장관의 부검을 십이지장 및 공장으로부터 병리조직학적 분석을 위하여 행하였다. 치사율, 사료 소비 및 집단 병리와 같은 육계 성능 지표를 측정하였다 (표 3).
샘플 수집
1. 대변 및 맹장변 샘플 수집
두 번째 접종 (15 일차) 후 12 시간이 될 때까지, 첫 번째 접종 후 매 2 시간 마다 모여진 대변 및 모여진 맹장변 샘플을 수집하기 위하여 펜에 종이 시트를 놓았다. 이어서, 17 일차까지, 매 4 시간 마다 샘플을 수집하였다. 20 일차 시험의 종료 시, 대변 및 맹장변 샘플을 또한 수집하였다. 수집 기간 중, 펜 당 1 그램 이상의 대변 및 맹장변을 수집하였고, 샘플을 -80℃ 에서 보관하였다.
2. 혈액 수집
18 게이지 바늘을 사용하여 심장에서 직접 혈액을 수집하였다. 펜 당 무작위로 선택된 3 마리의 새로부터 약 5-6 ml 의 전혈을 수집하고, EDTA 함유 수집 튜브에 옮겼다. 냉장 원심분리기를 사용하여 1,000-2,000 x g 에서 10 분 동안 원심분리에 의해, 혈장에서 세포를 제거하였다. 원심분리 후, 액체 성분 (혈장) 을 즉시 깨끗한 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, -20℃ 에서 보관하였다.
3. 소화관 내용물 수집
길이 약 20 cm 의 소화관으로부터 소화관 내용물을 수집하였다. 소화관 내용물을 제거하고, PBS + 20% 글리세롤로 잘라내고, -20℃ 로 즉시 동결시켰다. 이어서, 샘플을 영양 (vegetative) 대 포자형성된 C. 퍼프린젠스의 정량화, 및 netB 및 tpeL 의 PCR 검출에 사용하였다.
닭 창자의 조직학
1. 조직 수집 및 처리
각각의 새에서 십이지장 루프를 따르는 5 cm 절편을 제거하여 10% 포르말린 중에 넣고, 컨테이너를 약하게 교반하여 사료를 밀어내고 포르말린이 소화관 내에 들어가도록 하였다. 고정 후, 조직을 수 회의 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 교환으로 잘 세정하고, 보관을 위해 70% 에탄올 중에 위치시켰다. 5 μM 절편을 제조하기 전 조직의 처리 및 조직에의 파라핀의 침투를 위하여, 2 분 동안 70% 및 95% 에탄올 용액으로 연속적으로 1 회, 이어서 2 분 동안 100% 에탄올 용액으로 2 회 세정하여 조직을 탈수시켰다. 최종적으로, 파라핀 중에 내장시기 전, 조직을 1 분 동안 자일렌으로 2 회 헹구었다. 이어서, 처리된 조직을 몰드 내에 배향시키고, 파라핀 블록에 내장시키고, 마이크로톰 (microtome) 으로 절단하여, 5 μM 의 절편을 생성하였다. 조직 슬라이스를 폴리-L-리신 (PLL) 개질된 슬라이드 상에 부유시켰다. 슬라이드를 건조시키고, 파라핀을 오븐에 넣어 "베이크" 하였다.
2. 해리스 헤마톡실린 (Harris Hematoxylin) 및 에오신 (Eosin) 을 이용한 조직 절편의 염색.
간략하게, 에탄올의 농도를 연속적으로 감소시킴으로써 절편을 재수화하였다: 각각 3 분 동안 100% 에탄올로 2 회, 각각 3 분 동안 95% 에탄올로 2 회 및 3 분 동안 70% 에탄올로 1 회. 이어서, 슬라이드를 5 분 동안 증류수로 헹구고, 헤마톡실린 용액 (해리스 헤마톡실린, Sigma, HHS-32) 으로 6 분 동안 염색하였다. 슬라이드를 흐르는 수돗물로 약 20 분 동안 헹구고, 산성 알코올 (95% 에탄올, 2578 ml dH2O, 950ml HCl, 9ml) 로 1-3 초 동안 탈색하였다. 슬라이드를 다시 흐르는 수돗물로 5 분 동안 헹구고, 탄산리튬 중에 3 초 동안 침지시킨 후, 수돗물로 5 분 동안 헹구었다. 조직을 에오신 작업 용액 (100ml 스톡 에오신 (1% 수성 에오신-Y 및 1% 수성 플록신 B (Phloxin B)), 10 ml 스톡 플록신 B, 780 ml 95% 에탄올, 4 ml 빙초산) 으로 15 초 동안 대비염색하고, 에탄올 용액 (각각 3 분 동안 95% 에탄올 용액으로 2 회 및 각각 3분 동안 100% 에탄올 용액으로 2 회) 중에서의 연속 인큐베이션에 의해 재수화하였다. 최종적으로, 조직을 자일렌 용액 중에서 5 분 동안 인큐베이션한 후, 분석을 위하여 시토실 (cytoseal) 로 고정시켰다.
PCR 에 의한 클로스트리디움 퍼프린젠스 netB 및 tpeL 유전자의 검출
Figure 112017071385297-pct00001
1. DNA 추출 및 DNA 농도 정량화
창자 내용물에서 단리된 C. 퍼프린젠스 균주로부터의 추출된 DNA 를, Qiagen, Hilden, Germany 사의 시판용 DNA 추출 키트를 이용하여, 제조업자의 지침에 따라 수행하였다.
2. DNA 증폭
PCR 증폭을 1 ng 의 DNA 템플레이트, 증폭시키거나 검출하기 위한 유전자에 대한 각각의 프라이머 0.2μM, 및 1.2 유닛/25 ㎕ 의 Taq DNA 폴리머라아제로 이루어진 1x PCR 마스터 믹스 12 ㎕ 를 함유하는 최종 부피 25 ㎕ 로 수행하였다. 증폭을 Gene 증폭 PCR 시스템, 9600 Thermocycler (Master cycler eppendorf, Germany) 으로 수행하였다. 초기 변성은 95℃ 에서 5 분 동안, 이어서 95℃ 에서 30 초 동안 40 회 사이클이었고, 55℃ 에서 30 초 동안 어닐링 및 72℃ 에서 30 초 동안 연장 (72℃ 에서 7 분의 최종 연장 포함), 및 40℃ 에서 유지하였다.
샘플 처리
총 36 개의 혈장 샘플, 96 개의 대변 샘플 및 87 개의 맹장변 샘플을, 미세소포 전체 RNA 의 단리 및 추출을 위하여 처리하였다. 혈장 부피는 상이한 동물에서 0.5 ml 내지 3 ml 로 가변적이었다.
혈장 준비
간략하게, 혈액을 K2 EDTA 튜브 내에 수집하고, 완전히 전복시켜 잘 혼합하였다. 이어서, 튜브를 1300 x g 에서 10 분 동안 원심분리하여, 혈액 세포와 혈장을 분리하였다. 이어서, 혈장을 제거하고, 0.8㎛ 필터를 통해 여과하여, 세포 잔해물 및 혈소판을 제거하였다. 이어서, 모든 혈장 샘플을 1ml 크리오바이알 내에 분취하고, 사용 시까지 -80℃ 에서 보관하였다.
미세소포의 단리 및 RNA 추출
생체재료, 예컨대 혈액, csf, 조직 및 세포 배양액으로부터 미세소포를 추출하고, 추가로 미세소포 (MV) 의 내용물을 정제하는 최신 방법은, US6899863B1 (Dhellin et al., 2005), EP 2 495 025 A1, WO 2014107571 A 및 20140178885A1 에 이미 기재되어 있다. 방법은, 세포 잔해물을 분리하기 위한 고속 초원심분리의 사용, 또는 저속 원심분리의 사용, 이어서 특정 멤브레인에 대한 크기 배제 또는 친화성 결합, 또는 여과를 포함한다 (Witwer & Colleagues, 2013 에 의한 리뷰 참조). 미세소포를 정제하는 몇몇의 면역학적 방법이 또한 기재되어 있다 (Thery, et al., 2016; Clayton et al., 2001; Wubbolts et al., 2003). 미세소포는, 목적하는 모집단을 분명하게 선택하기 위하여 미세소포의 표면 단백질에 결합하는 항체, 또는 이의 고갈을 위하여 다른 세포 성분의 표면 단백질에 결합하는 항체로 관능화된 매트릭스, 비드 또는 자성 입자를 사용하여 정제될 수 있다 (Kim et al., 2012 및 Mathivanan et al., 2010). 이용 가능한 미세소포의 신속한 단리 방법에는, 전문적인 실험실용 장비가 거의 또는 전혀 요구되지 않는, 미세유체역학 장치 (2010, Chen, et al., 2010; EP 2740536 A2) 및 시판용 키트 (예를 들어, SeraMirTM (System Biosciences), ExoSpinTM (Cell Guidance), ExoMirTM (Bioo Scientifics), miRCURYTM (Exiqon) 의 사용이 포함된다.
여기서, 혈장, 대변 및 맹장변 샘플로부터의 미세소포의 추출은, WO2014/107571A1 (Enderle, et al., 2014) 에 기재된 방법으로 수행하였다. 상기 방법에는, Q 관능화 멤브레인 필터 (Exo50, Exosome Diagnostics) 의 표면 상에 이를 포획함으로써 생물학적 유체로부터의 미세소포를 단리하는 것이 포함된다. 포획된 미세소포의 RNA 내용물을 Qiazol 을 이용한 용해에 의해 방출시킨 후, RNA 를 클로로포름 추출에 의해 또는 Qiagen 사의 시판용 RNAesay 키트를 사용하여 정제하였다. 간략하게, 혈장 샘플을 얼음 상에서 서서히 해동시키고, PBS 또는 0.9% NaOH 을 이용하여 1:1 로 희석하였으며; 혈장 용액을 300 g 에서 10 분 동안 원심분리하여, 세포 및 잔해물을 제거하였다. 상청액을 0.8㎛ 필터에 통과시킨 후, 흐름을 20,000 g 에서 4℃ 에서 30 분 동안 원심분리하여, 임의의 잔여 세포 잔해물을 제거하였다. 미세소포와 결합하는 친화성 멤브레인을 갖는 Exo50 컬럼에, 5 ml 로딩 완충액 (2X) (100 mM 포스페이트 완충액, 370mM NaCl) 이 흐르도록 함으로써, 사전 컨디셔닝하였다. 이어서, 제 2 원심분리 단계로부터 수득된 미세소포를 함유하는 상청액에 Q베타 입자의 1000 개의 카피를 스파이크하여, 사전 컨디셔닝된 스핀 컬럼 상에의 로딩 시 추출 및 회수 효율을 시험하였다. 컬럼을 짧게 스피닝하고, 유출물을 제거하였다. 컬럼을 2 ml 세정 완충액 (250mM Bis Tris 프로판, pH6.5-7 및 (IX) 50mM 포스페이트 완충액, 185mM NaCl) 으로 2 회 세정하고, 2차 세정 후, 컬럼을 짧게 스피닝하고, 유출물을 제거하였다. 5ml (2.25 ml) 의 용해 완충액 (Qiazol) 을 첨가함으로써 멤브레인에 결합된 미세소포를 용해시켜 내용물을 방출시키고, 스피닝하여 용해물을 수집하였다. RNA 를 RNeasy kit, Qiagen 를 이용하여, 제조업자의 지침에 따라 용해물로부터 추출하였다. RNase 미함유 물로 용리된 RNA 를 복제 샘플용으로 모아, 샘플 당 총 부피 46㎕ 를 수득하였다. 1 ㎕ RNA 를 Agilent RNA 6000 Nano Kit 상에 적용하여, RNA 의 품질 및 농도를 평가하고, 남아있는 RNA 를 추가 다운스트림 사용 (QPCR 또는 Sequencing) 을 위하여 -80℃ 에서 보관하였다. RNA 추출의 추출 효율 및 양은, RT-PCR 분석에 의해, 추출된 RNA 에서의 Q-베타 대조군 표적 유전자 (Q-베타 코트 단백질 유전자) 발현을 관심 표적 유전자의 발현과 비교하여 평가하였다. 대조군 표적 유전자의 10 배 희석액 중 적어도 2, 3, 또는 4 개의 공지된 농도의 표준 곡선을 사용하여, 카피수를 측정하였다. 검출된 카피수 및 첨가된 Q-베타 입자의 양을 비교하여, 단리 및/또는 추출 공정의 품질을 측정하였다.
대변 및 맹장변 샘플
혈장 및 맹장변 샘플은 큰 거친 재료를 함유하고 있기 때문에, 미세소포 단리 및 RNA 추출을 수행하기 전, 혈장 샘플에 대하여 상기 기재된 바와 같은 Exo50 키트 및 관련 방법을 사용하여 부가적인 전처리 단계에 적용하였다. 예를 들어, 200 mg 의 대변 샘플을 서서히 해동시키고; 이어서 1ml 의 냉각된 PBS 또는 0.9% 멸균 NaOH 를 첨가하여 대변 / 맹장변 샘플을 균질화한 후, 약 1 분 동안 볼텍싱하였다. 수득한 현탁액을 PBS 를 이용하여 1:1 로 희석한 후, 20,000g 에서 4℃ 에서 30 분 동안 원심분리하여, 원하지 않는 큰 입자를 제거하였다. 상청액을 0.8 ㎛ 혼합 셀룰로오스 에스테르 필터 (예를 들어, Millipore 필터) 를 통해 여과하고, 여과액을 추가 사용 시까지 4℃ 에서 보관하거나, 상기 혈장 샘플에 대하여 기재된 바와 같이 처리하였다.
Figure 112017071385297-pct00002
대변 / 맹장변 유래 RNA 의 QRT-PCR
대변 및 맹장변 RNA 의 역전사를 SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit 를 이용하여, 제조업자의 지침 및 하기 변경 사항에 따라 수행하였다: RT 반응은 11㎕ (5x VILO Reaction Mix), 5.5㎕ (10x SS Enzyme Mix), 5.5㎕ (뉴클라아제 미함유 H20) 및 33㎕ (RNA) 로 이루어짐. RT 사이클 프로파일은 25℃ 에서 10 분 동안, 42℃ 에서 60 분 동안, 85℃ 에서 5 분 동안의 4 회의 순차적인 인큐베이션 사이클 / 보유 및 4℃ 에서의 최종 보유로 이루어져 있었다.
혈장 및 대변/맹장변 유래 miRNA 에 대한 QRT-PCR:
miRNA 의 역전사를, RT 마스터 믹스 레시피 및 하기 사이클링 프로파일에 따라 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 를 사용하는 RNA 의 역전사를 사용하여, 각각의 샘플에 대하여 삼중으로 수행하였다: RT 반응은 6㎕ (RT 프라이머 풀), 0.3㎕ (dNTP 100mM), 1.5㎕ (10x RT 완충액), 0.2㎕ RNase 억제제, 3.0㎕ MultiScribe RT 및 4㎕ (대변 및 맹장변 샘플의 경우 4 ㎕ RNA, 및 혈장 샘플의 경우 2㎕ RNA + 2㎕ TE 완충액) 로 이루어져 있음. RT 사이클 프로파일은 16℃ 에서 30 분 동안, 42℃ 에서 30 분 동안, 85℃ 에서 5 분 동안의 4 회의 순차적인 인큐베이션 사이클 / 보유 및 4℃ 에서의 최종 보유 단계로 이루어져 있었다. RT 프라이머 풀을 각각의 RT 프라이머 10 ㎕ 에 의해 유도하고, 모으고, TE 완충액을 이용하여 1 ml 로 희석하여, 각각의 RT 프라이머의 최종 농도를 0.05X 로 만들었다. 5 배 (5x) 의 맞춤화 miRNA 검정 (miR-16, miR-21, miR-24, miR- 155 및 miR-206) 을 각각의 RT 프라이머 풀에 첨가하였다.
대변 / 맹장변 RNA 의 QPCR
RNA 유전자의 프로프-기반 검정을 위하여, Qiagen Rotor-Gene Q 를 사용하여, 제조업자의 지침에 따라 qPCR 을 수행하였다. virX, colA 및 netB 검정의 어닐링 온도는 57℃ 였으나, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 16s rRNA 의 분석을 위한 어닐링 온도는 60℃ 였다. 검정을 위한 마스터 믹스 반응은 5.5㎕ (뉴클라아제 미함유 물), 10 ㎕ (AmpErase UNG 미함유 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix), 0.5㎕ 정방향 프라이머 (20uM), 1.5 ㎕ 역방향 프라이머 (20μM), 0.25㎕ 프로브 (20μM), 0.25㎕ UNG (우라실-N-글리코실라아제), 및 2㎕ cDNA 로 이루어져 있었다. 16s RNA 의 증폭을 위하여, 각각 1㎕ 의 정방향 및 역방향을 사용하였다.
작은 비코딩 (non coding) RNA 인 VR-RNA, e45nt 및 scRNA 에 대하여, Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit 를 수행하였다. 검정을 위한 마스터 믹스 반응은 5.75㎕ (뉴클라아제 미함유 물), 10 ㎕ (Rotor Gene SYBR 2x Master Mix), 0.5㎕ 정방향 프라이머 (20uM), 1.5 ㎕ 역방향 프라이머 (20μM), 0.25㎕ 프로브 (20μM), 0.25㎕ UNG (우라실-N-글리코실라아제), 및 2㎕ cDNA 로 이루어져 있었다. 증폭은 하기 조건으로 수행하였다: 50℃ 에서 2 분 동안의 제 1 보유 단계, 이어서 95℃ 에서 10 동안의 보유, 그 후 95℃ 에서 2 초, 60℃ 에서 15 초, 72℃ 에서 20 초로 이루어진 40 회 사이클.
통계 분석
통계 소프트웨어 R 을 사용하여 모든 통계 계산을 수행하였다. 분석 프로토콜의 전반적인 효율 및 검정의 화학량론의 결과로서, 40 회 증폭 사이클로의 qPCR 에서 가장 높은 가능한 CT 값인 40 으로 정규화하기 전, 누락 값 (신호 없음) 의 대체를 부가하였다. 처리군의 쌍별 비교를 위한 적당한 통계를 패키지 림마 (package limma) 의 ImFit 기능으로 산출하고 (림마: 마이크로어레이 데이터에 대한 선형 모델, [Smyth G.K. In: Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, Springer, New York, pp 397-420], R 패키지 버전 2.16.5), 수득한 p 값을 Benjamini 및 Hochberg (1995) 의 방법에 따라 조정하여, q 값 (거짓 발견률) 을 수득하였다.
다변량 분석 (ANOVA)
시간, 처리 및 샘플 유형 간의 의존성을 정성적으로 조사하였다. 가능한 연관성의 공식적인 정량적 평가를, 이원 ANOVA 및 비모수 (non-parametric) Kruskal-Wallis 시험을 실행하여 수행하였다. 두 가지 방법 모두 miRNA 및 박테리아 RNA 데이터에 대하여 독립적으로 적용하였다. 2 가지 주요 영향 및 상호작용을 시험하기 위하여 이원 ANOVA 를 사용하였다. 제 1 주요 효과는 처리 후 시간 (시간 (hour)) 이었고, 제 2 주요 효과는 처리의 유형 (대조군, 가짜군, 고용량, 저용량) 이었다. Kruskal-Wallis 시험을 시간 및 처리에 대하여 개별적으로 적용하여, 이러한 인자와 유전자 발현의 관련성을 시험하였다. 이러한 방법으로 다중변수 상호작용을 평가하지는 않았다. 3 종의 유형 (맹장변, 배설물 및 혈장) 을 4 종의 miRNA (miR-16, miR-24, miR-155 및 miR-206) 에 대하여 분석하였고, 총 216 개의 복제 데이터를 이용할 수 있었다. 또한 6 종의 박테리아 표적을 2 종의 샘플 유형 (맹장변 및 배설물) 에서 분석하였고, 총 108 개의 복제 데이터를 이용할 수 있었다. 복제 데이터의 평균 (각각의 샘플의 평균 Ct 값) 을 추가적인 통계 분석에 사용하였다. 미가공 (raw) 데이터 및 정규화된 데이터 둘 모두에 대하여 분석을 수행하였다. MiR-191 을 마이크로RNA 분석을 위한 정규화군으로서 사용하였고, C. 퍼프린젠스의 16S rRNA 의 Ct 값을 박테리아 표적에 대한 정규화군으로 사용하였다. anova 선형 모델 (Anova (lm(expression~time+treatment+time*treatment)) 로 생성된 정규화된 및 미가공 데이터에 대하여 3 가지 인자 (시간 효과, 처리 효과, 상호작용) 에 대한 p 값을 생성하였고, 2 p 값 (시간 효과 및 처리 효과) 은 정규화된 및 미가공 데이터에 대하여 Kruskal-Wallis 시험을 이용한 분석으로부터 생성하였다.
결과:
Figure 112017071385297-pct00003
Figure 112022040120364-pct00011
Figure 112022040120364-pct00012
Figure 112017071385297-pct00006
Figure 112017071385297-pct00007
Figure 112017071385297-pct00008
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Figure 112017071385297-pct00010
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Method of detecting avian necrotic enteritis <130> 201500092 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1884 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <220> <221> CDS <222> (631)..(1884) <223> SAM gene <400> 1 cataaaaaat cactcctttt atatttttaa aaacattatc acttttttat taattatttt 60 caatataatt agtataactg gtcaaaaatt atacataatt ggactgcagc acttatctta 120 tatttaatac caagtttatc ttcttctatt atattaaaaa tattttctat ataattatat 180 ttattattta cttaagtatt tagtaaatga attactatac ttctcttcat gattaagctt 240 tatttaaatt tttatatata ttaattaact aaatttaata ctttatttta ctaaaaaaat 300 tatatttgta tttaaataaa aaactactat tttttagtaa aataaagtat ttataaaaat 360 attaatatac atttagttta tttttgatat atcaaaaact tttttatttt taaaaaaagt 420 tgataattta atatagttga attttgctat aatatactaa agtttaaata aggagttgat 480 aaacatgaaa tttaaagttt tagaaaaaaa ctttttaact atgtgtgagc caaatttttg 540 ttgttcacca gtaacaaatt tataaaatat tatactaaaa aaactaactc tgatttcatc 600 agggttagtt ttctatatgg aggttttaaa atg aaa aaa tca atg tat aat att 654 Met Lys Lys Ser Met Tyr Asn Ile 1 5 tat ata caa gga aaa aaa gaa acc gca att ttc aac cta tta aca aga 702 Tyr Ile Gln Gly Lys Lys Glu Thr Ala Ile Phe Asn Leu Leu Thr Arg 10 15 20 aat ata att gtt att tca aac aat gaa tat cta aat ttt gat aaa tta 750 Asn Ile Ile Val Ile Ser Asn Asn Glu Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Leu 25 30 35 40 ata aat gat gaa gaa tgt aaa gaa caa aaa tct atg ggt ttt tct tta 798 Ile Asn Asp Glu Glu Cys Lys Glu Gln Lys Ser Met Gly Phe Ser Leu 45 50 55 gaa aat aat att aat gaa att gaa tta atg aaa tat act tta aat aaa 846 Glu Asn Asn Ile Asn Glu Ile Glu Leu Met Lys Tyr Thr Leu Asn Lys 60 65 70 ggt aaa ttt tcc gaa aaa tca atg aca tta ttt tta tca ctc aca aga 894 Gly Lys Phe Ser Glu Lys Ser Met Thr Leu Phe Leu Ser Leu Thr Arg 75 80 85 caa tgt aat tta aat tgc att tat tgc tat caa gat aga cga aaa aca 942 Gln Cys Asn Leu Asn Cys Ile Tyr Cys Tyr Gln Asp Arg Arg Lys Thr 90 95 100 ttt gat gaa gga aat aat ttt tta aat aaa act gct tgg tta aaa att 990 Phe Asp Glu Gly Asn Asn Phe Leu Asn Lys Thr Ala Trp Leu Lys Ile 105 110 115 120 ttt gaa ttt tta aag aaa aaa tct att aat tta aat gaa tta cat ata 1038 Phe Glu Phe Leu Lys Lys Lys Ser Ile Asn Leu Asn Glu Leu His Ile 125 130 135 act tta ttt ggt gga gaa cct tta cta aat aaa tca att att tta caa 1086 Thr Leu Phe Gly Gly Glu Pro Leu Leu Asn Lys Ser Ile Ile Leu Gln 140 145 150 att att gat gat tta aat tct tta aaa aat caa act cta aaa ata tat 1134 Ile Ile Asp Asp Leu Asn Ser Leu Lys Asn Gln Thr Leu Lys Ile Tyr 155 160 165 ata aat tta ata act aat gga gtt ctt tta gat aaa aat ttt tgc gaa 1182 Ile Asn Leu Ile Thr Asn Gly Val Leu Leu Asp Lys Asn Phe Cys Glu 170 175 180 aaa ata tat aaa tct ata aat tat att caa att aca ata gat ggt aat 1230 Lys Ile Tyr Lys Ser Ile Asn Tyr Ile Gln Ile Thr Ile Asp Gly Asn 185 190 195 200 aaa tca act cat aat caa tta aga gtt ttt cca gat ggt tct gga agc 1278 Lys Ser Thr His Asn Gln Leu Arg Val Phe Pro Asp Gly Ser Gly Ser 205 210 215 ttt gat att att tat aat aat tta aag gaa gta att aat cta ttt gaa 1326 Phe Asp Ile Ile Tyr Asn Asn Leu Lys Glu Val Ile Asn Leu Phe Glu 220 225 230 aat aaa ata gaa tta aga att aat gta aat aaa gaa ata ata tta aat 1374 Asn Lys Ile Glu Leu Arg Ile Asn Val Asn Lys Glu Ile Ile Leu Asn 235 240 245 tgc ttt tct tta ttt aaa aaa tta aag gaa gat tct tta aat aaa agt 1422 Cys Phe Ser Leu Phe Lys Lys Leu Lys Glu Asp Ser Leu Asn Lys Ser 250 255 260 ata gcc ata aat tta cat cca att ttt gaa aat caa agc tct ttc gaa 1470 Ile Ala Ile Asn Leu His Pro Ile Phe Glu Asn Gln Ser Ser Phe Glu 265 270 275 280 tat ggc tgt aaa aag aat aca gac aaa gac ctt ata tta caa att aat 1518 Tyr Gly Cys Lys Lys Asn Thr Asp Lys Asp Leu Ile Leu Gln Ile Asn 285 290 295 gat tta tat aat tat tta tct aaa cat aat ttt aaa ttt aga aaa aac 1566 Asp Leu Tyr Asn Tyr Leu Ser Lys His Asn Phe Lys Phe Arg Lys Asn 300 305 310 ttc ata gag ggt cca tgt ata gct aaa cat ata aat agt ttt gct ata 1614 Phe Ile Glu Gly Pro Cys Ile Ala Lys His Ile Asn Ser Phe Ala Ile 315 320 325 gat gaa aat cta aat att tat aaa tgt cca ggc ttt tta tat tct aag 1662 Asp Glu Asn Leu Asn Ile Tyr Lys Cys Pro Gly Phe Leu Tyr Ser Lys 330 335 340 tct aat gga ttt ata aat gat att gga gaa ata aac ttt tta gac tct 1710 Ser Asn Gly Phe Ile Asn Asp Ile Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp Ser 345 350 355 360 gat ttc ttt aaa gaa gta aat tct gaa caa aaa tgt att aat tct tgt 1758 Asp Phe Phe Lys Glu Val Asn Ser Glu Gln Lys Cys Ile Asn Ser Cys 365 370 375 ata tat gct cct att tgt tat ggt gga tgt act tgg caa aat aaa tgt 1806 Ile Tyr Ala Pro Ile Cys Tyr Gly Gly Cys Thr Trp Gln Asn Lys Cys 380 385 390 aat aaa gag att tta gat tta act tta gaa tca caa tta aaa tct tat 1854 Asn Lys Glu Ile Leu Asp Leu Thr Leu Glu Ser Gln Leu Lys Ser Tyr 395 400 405 tta ata tct aga tat aat ttt gaa ata taa 1884 Leu Ile Ser Arg Tyr Asn Phe Glu Ile 410 415 <210> 2 <211> 417 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 2 Met Lys Lys Ser Met Tyr Asn Ile Tyr Ile Gln Gly Lys Lys Glu Thr 1 5 10 15 Ala Ile Phe Asn Leu Leu Thr Arg Asn Ile Ile Val Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Glu 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Ile Ile Leu Asn Cys Phe Ser Leu Phe Lys Lys Leu 245 250 255 Lys Glu Asp Ser Leu Asn Lys Ser Ile Ala Ile Asn Leu His Pro Ile 260 265 270 Phe Glu Asn Gln Ser Ser Phe Glu Tyr Gly Cys Lys Lys Asn Thr Asp 275 280 285 Lys Asp Leu Ile Leu Gln Ile Asn Asp Leu Tyr Asn Tyr Leu Ser Lys 290 295 300 His Asn Phe Lys Phe Arg Lys Asn Phe Ile Glu Gly Pro Cys Ile Ala 305 310 315 320 Lys His Ile Asn Ser Phe Ala Ile Asp Glu Asn Leu Asn Ile Tyr Lys 325 330 335 Cys Pro Gly Phe Leu Tyr Ser Lys Ser Asn Gly Phe Ile Asn Asp Ile 340 345 350 Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp Ser Asp Phe Phe Lys Glu Val Asn Ser 355 360 365 Glu Gln Lys Cys Ile Asn Ser Cys Ile Tyr Ala Pro Ile Cys Tyr Gly 370 375 380 Gly Cys Thr Trp Gln Asn Lys Cys Asn Lys Glu Ile Leu Asp Leu Thr 385 390 395 400 Leu Glu Ser Gln Leu Lys Ser Tyr Leu Ile Ser Arg Tyr Asn Phe Glu 405 410 415 Ile <210> 3 <211> 1679 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 3 ttaaaaatag gttctaacaa ccatttctgt aaacatacca gtaggatttt ttctttggct 60 taaaaagtat tcctttttat ctttaatctt ttcttttgac catctcatat aatcactctc 120 ctaaaatatt atggttatta taataaaaag aaagtatcta aaatagatac tttcttagtt 180 ataagttgaa atgtgaaaag ctataattat gatataaaaa ctcttaaaag atacacctta 240 attataactt taaatttaat aaataaacag tatattactc tttatttttc ttaaaaaaat 300 ttagtattgc atttttatct tttctacgtg gaaatgttaa atctaagaac tccatcattt 360 tctttttagt ttgggttcat cctagtattg aagtattctt tagaatattt cctctctttt 420 tgaaaatttc atcttcagta tctctaaatc ttgctttttc tgcagcattt attatacccg 480 cagccatttt tatattatcc tggatttgtt tctcgtttaa tgaaccgtta aaattcctaa 540 attcaactgt aggagctcta tctcttgcta tattagttaa gttaatacca taatatataa 600 tttccttcag aaatttttgc tgccctcctt cttacatcct catcattatc catgttgaat 660 cggatatatt tactttcatc ggccctagga ctaaatggag tggcataatg tctggcatta 720 cttcttactc ttcctaaatc tccacctgca gctctataaa tacaatcctc atatacttct 780 atagtcttaa aaaatcttct ccatctttgt cttgcagtat ctagtttatc catgtttata 840 tgaacatggc caccgcacct ttgatctact ctagccccat gtcttttagc aacatcacat 900 attattttta tttgttccca cgtttctgga gtatctttaa gaatagggga aactatttct 960 ccgctggcat ctccatcgga tacggaccca tctctctcga gtttccactt acctggctca 1020 cttcttgaat gataacttaa tcttctagga gagcttacta tacctagctc ataaagttct 1080 atggctatag cattaacatc accaccaaca aactcaagtt caactccgaa tgtactattg 1140 tttccgttta gtacgttttc gtactcatat tctatagaat cgtcattaat ttctgcaaaa 1200 tcgttattga aatcagcttc attgtctgta taaaagtgat tatcgtcttg ttcttcccca 1260 cgaatatttc tatttatttc atctcttata tttctagctc ttctagtagc ttctacattg 1320 tttatagtat ctacttctgc aacttcgcct aaagcttttc tgaccgctat taagtgtctg 1380 cagcattcat ttctataaac atatttgcca cattcacagc tattttcatt catatcaaca 1440 atgtaagttc cttcttcagt tgaacttact tcatatcgat tattacccaa ggaaactata 1500 tttatatctt caattctgtt tctggttcta gataaccctt gaacagttac aatgttatct 1560 aatctaccat taacagcatt aactaaatct tctattattc cttcagaaag attagatcct 1620 gagccatcaa ttaatccttc cgttgtattt gcaatagtat tgcttcttct tttaggcat 1679 <210> 4 <211> 268 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 4 gccgtgctag atggggagtt agcggtgccc tgtaacctgc aatccgctac 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cct 240 Glu Leu Asn Asn Glu Val Ala Thr Asp Asn Asn Arg Pro Leu Gly Pro 65 70 75 80 agt att gct cca tca aga gca aga aac aac aag atc tat aca ttc gat 288 Ser Ile Ala Pro Ser Arg Ala Arg Asn Asn Lys Ile Tyr Thr Phe Asp 85 90 95 gaa ctt aac aga atg aat tat agt gat cta gtt gaa tta ata aaa aca 336 Glu Leu Asn Arg Met Asn Tyr Ser Asp Leu Val Glu Leu Ile Lys Thr 100 105 110 ata agt tat gaa aac gta cca gac tta ttt aat ttt aat gat ggt tca 384 Ile Ser Tyr Glu Asn Val Pro Asp Leu Phe Asn Phe Asn Asp Gly Ser 115 120 125 tat act ttc ttt agt aat aga gat cgt gta caa gct ata ata tat ggt 432 Tyr Thr Phe Phe Ser Asn Arg Asp Arg Val Gln Ala Ile Ile Tyr Gly 130 135 140 cta gag gat agt gga aga act tat aca gca gat gat gat aag gga att 480 Leu Glu Asp Ser Gly Arg Thr Tyr Thr Ala Asp Asp Asp Lys Gly Ile 145 150 155 160 cca act tta gtt gag ttt tta aga gct gga tat tat tta gga ttt tat 528 Pro Thr Leu Val Glu Phe Leu Arg Ala Gly Tyr Tyr Leu Gly Phe Tyr 165 170 175 aat aaa caa tta tca tac cta aat aca cca cag tta aaa aat gag tgt 576 Asn Lys Gln Leu Ser Tyr Leu Asn Thr Pro Gln Leu Lys Asn Glu Cys 180 185 190 tta cca gct atg aaa gcg att caa tat aat agt aat ttt aga tta gga 624 Leu Pro Ala Met Lys Ala Ile Gln Tyr Asn Ser Asn Phe Arg Leu Gly 195 200 205 aca aag gcg caa gat gga gtt gtt gag gct tta gga aga ctt ata ggt 672 Thr Lys Ala Gln Asp Gly Val Val Glu Ala Leu Gly Arg Leu Ile Gly 210 215 220 aat gct tca gca gat cca gaa gtt att aat aat tgc ata tat gtt tta 720 Asn Ala Ser Ala Asp Pro Glu Val Ile Asn Asn Cys Ile Tyr Val Leu 225 230 235 240 agt gat ttt aaa gat aat ata gat aag tat ggt tct aac tat agc aag 768 Ser Asp Phe Lys Asp Asn Ile Asp Lys Tyr Gly Ser Asn Tyr Ser Lys 245 250 255 gga aat gca gta ttc aac ctt atg aaa ggt att gat tat tat act aat 816 Gly Asn Ala Val Phe Asn Leu Met Lys Gly Ile Asp Tyr Tyr Thr Asn 260 265 270 tca gta ata tac aat act aag gga tat gat gct aaa aac act gag ttc 864 Ser Val Ile Tyr Asn Thr Lys Gly Tyr Asp Ala Lys Asn Thr Glu Phe 275 280 285 tat aat aga ata gat cca tat atg gaa aga tta gaa agt tta tgt aca 912 Tyr Asn Arg Ile Asp Pro Tyr Met Glu Arg Leu Glu Ser Leu Cys Thr 290 295 300 ata ggt gat aag tta aat aat gat aat gct tgg ctt gta aat aat gcc 960 Ile Gly Asp Lys Leu Asn Asn Asp Asn Ala Trp Leu Val Asn Asn Ala 305 310 315 320 tta tat tac aca ggt aga atg ggt aag ttt aga gaa gac cca tca ata 1008 Leu Tyr Tyr Thr Gly Arg Met Gly Lys Phe Arg Glu Asp Pro Ser Ile 325 330 335 tct caa aga gct tta gaa aga gct atg aag gag tat cct tat tta tca 1056 Ser Gln Arg Ala Leu Glu Arg Ala Met Lys Glu Tyr Pro Tyr Leu Ser 340 345 350 tat caa tat att gaa gct gcc aat gat tta gat tta aat ttt ggt ggc 1104 Tyr Gln Tyr Ile Glu Ala Ala Asn Asp Leu Asp Leu Asn Phe Gly Gly 355 360 365 aaa aat tca tca gga aat gat ata gat ttc aat aag ata aaa gca gat 1152 Lys Asn Ser Ser Gly Asn Asp Ile Asp Phe Asn Lys Ile Lys Ala Asp 370 375 380 gca agg gaa aaa tat ctt cca aaa aca tat act ttt gat gat ggt aaa 1200 Ala Arg Glu Lys Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Asp Gly Lys 385 390 395 400 ttt gta gta aaa gct ggt gat aaa gta aca gaa gag aag ata aaa aga 1248 Phe Val Val Lys Ala Gly Asp Lys Val Thr Glu Glu Lys Ile Lys Arg 405 410 415 tta tat tgg gct tca aag gaa gtt aag gct caa ttc atg aga gta gtt 1296 Leu Tyr Trp Ala Ser Lys Glu Val Lys Ala Gln Phe Met Arg Val Val 420 425 430 caa aat gat aag gct tta gaa gag gga aat cca gat gat att tta act 1344 Gln Asn Asp Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Pro Asp Asp Ile Leu Thr 435 440 445 gtt gtt att tat aac tca cca gaa gag tat aag tta aat cgt ata ata 1392 Val Val Ile Tyr Asn Ser Pro Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Arg Ile Ile 450 455 460 aat gga ttt agt act gat aat ggt ggt ata tat att gaa aac ata gga 1440 Asn Gly Phe Ser Thr Asp Asn Gly Gly Ile Tyr Ile Glu Asn Ile Gly 465 470 475 480 act ttc ttt act tat gaa aga aca cca gag gaa agt ata tat aca tta 1488 Thr Phe Phe Thr Tyr Glu Arg Thr Pro Glu Glu Ser Ile Tyr Thr Leu 485 490 495 gaa gaa tta ttc cgt cat gaa ttt act cac tat ctt caa ggt aga tat 1536 Glu Glu Leu Phe Arg His Glu Phe Thr His Tyr Leu Gln Gly Arg Tyr 500 505 510 gta gtt cct gga atg tgg ggg caa gga gaa ttc tat caa gag gga gtt 1584 Val Val Pro Gly Met Trp Gly Gln Gly Glu Phe Tyr Gln Glu Gly Val 515 520 525 tta act tgg tat gaa gaa gga aca gca gag ttc ttt gca ggt tca act 1632 Leu Thr Trp Tyr Glu Glu Gly Thr Ala Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr 530 535 540 aga act gat gga ata aaa cca aga aaa tca gtt aca caa ggg tta gct 1680 Arg Thr Asp Gly Ile Lys Pro Arg Lys Ser Val Thr Gln Gly Leu Ala 545 550 555 560 tac gat aga aat aat aga atg tct tta tat ggt gta tta cat gct aaa 1728 Tyr Asp Arg Asn Asn Arg Met Ser Leu Tyr Gly Val Leu His Ala Lys 565 570 575 tat ggc tca tgg gat ttc tat aat tat gga ttt gct cta tca aac tac 1776 Tyr Gly Ser Trp Asp Phe Tyr Asn Tyr Gly Phe Ala Leu Ser Asn Tyr 580 585 590 atg tac aac aat aac atg gga atg ttt aat aag atg aca aat tac ata 1824 Met Tyr Asn Asn Asn Met Gly Met Phe Asn Lys Met Thr Asn Tyr Ile 595 600 605 aag aat aat gat gta tct ggt tat aaa gat tat att gca tca atg agt 1872 Lys Asn Asn Asp Val Ser Gly Tyr Lys Asp Tyr Ile Ala Ser Met Ser 610 615 620 agt gat tac gga tta aat gat aaa tat caa gac tat atg gat tct tta 1920 Ser Asp Tyr Gly Leu Asn Asp Lys Tyr Gln Asp Tyr Met Asp Ser Leu 625 630 635 640 tta aac aat att gat aac tta gat gtt cct tta gtt tca gat gag tat 1968 Leu Asn Asn Ile Asp Asn Leu Asp Val Pro Leu Val Ser Asp Glu Tyr 645 650 655 gta aat gga cat gaa gct aag gat ata aat gaa ata act aat gac ata 2016 Val Asn Gly His Glu Ala Lys Asp Ile Asn Glu Ile Thr Asn Asp Ile 660 665 670 aaa gaa gtt tca aat ata aaa gat ctt tct agt aat gtt gaa aag tct 2064 Lys Glu Val Ser Asn Ile Lys Asp Leu Ser Ser Asn Val Glu Lys Ser 675 680 685 caa ttc ttt act act tac gat atg aga gga aca tat gta ggg gga aga 2112 Gln Phe Phe Thr Thr Tyr Asp Met Arg Gly Thr Tyr Val Gly Gly Arg 690 695 700 agt caa ggg gaa gaa aat gac tgg aaa gat atg aat tct aag tta aat 2160 Ser Gln Gly Glu Glu Asn Asp Trp Lys Asp Met Asn Ser Lys Leu Asn 705 710 715 720 gat atg tta aaa gaa tta tct aaa aag agc tgg aat ggt tat aaa act 2208 Asp Met Leu Lys Glu Leu Ser Lys Lys Ser Trp Asn Gly Tyr Lys Thr 725 730 735 gtt act gca tac ttt gta aac cat aaa gta gat gaa aat ggt aac tat 2256 Val Thr Ala Tyr Phe Val Asn His Lys Val Asp Glu Asn Gly Asn Tyr 740 745 750 gtt tat gat gtt gta ttc cat gga atg aat aca gat aca aat act gat 2304 Val Tyr Asp Val Val Phe His Gly Met Asn Thr Asp Thr Asn Thr Asp 755 760 765 gtt cat gtt aat aaa gag cct aag gct gtt ata aaa tct gat tct tca 2352 Val His Val Asn Lys Glu Pro Lys Ala Val Ile Lys Ser Asp Ser Ser 770 775 780 gta ata gtt gaa gaa gaa att aat ttt gat gga aca gag tca aag gat 2400 Val Ile Val Glu Glu Glu Ile Asn Phe Asp Gly Thr Glu Ser Lys Asp 785 790 795 800 gaa gat ggt gaa atc aaa gct tat gaa tgg gac ttt gga gat gga gaa 2448 Glu Asp Gly Glu Ile Lys Ala Tyr Glu Trp Asp Phe Gly Asp Gly Glu 805 810 815 aaa tct aat gag gct aaa gcc act cat aag tat aat aaa act gga gaa 2496 Lys Ser Asn Glu Ala Lys Ala Thr His Lys Tyr Asn Lys Thr Gly Glu 820 825 830 tat gaa gta aaa tta aca gtt aca gat aat aac ggt gga ata aat act 2544 Tyr Glu Val Lys Leu Thr Val Thr Asp Asn Asn Gly Gly Ile Asn Thr 835 840 845 gaa agt aaa aag ata aaa gta gta gaa gat aaa cct gtt gaa gtt ata 2592 Glu Ser Lys Lys Ile Lys Val Val Glu Asp Lys Pro Val Glu Val Ile 850 855 860 aat gaa agc gag cca aac aat gat ttt gaa aag gct aac caa ata gct 2640 Asn Glu Ser Glu Pro Asn Asn Asp Phe Glu Lys Ala Asn Gln Ile Ala 865 870 875 880 aaa tct aat atg tta gtt aag ggt act tta tca gaa gag gat tat tca 2688 Lys Ser Asn Met Leu Val Lys Gly Thr Leu Ser Glu Glu Asp Tyr Ser 885 890 895 gat aaa tat tat ttt gat gta gct aaa aaa ggc aat gtt aaa atc act 2736 Asp Lys Tyr Tyr Phe Asp Val Ala Lys Lys Gly Asn Val Lys Ile Thr 900 905 910 ctt aat aat tta aat tca gta gga ata act tgg aca ctt tat aaa gag 2784 Leu Asn Asn Leu Asn Ser Val Gly Ile Thr Trp Thr Leu Tyr Lys Glu 915 920 925 gga gac cta aac aat tat gtt tta tat gca act gga aat gat gga aca 2832 Gly Asp Leu Asn Asn Tyr Val Leu Tyr Ala Thr Gly Asn Asp Gly Thr 930 935 940 gaa tta aag ggt gaa aag act tta gag cct gga aga tac tac tta 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120 tatcttttca gtttttgatc cagttttaat tttggctatt ttaaagttag ttttccaagg 180 atagaaaagt tctattcctt ctgaagttaa aaaatctaaa actaagtggg atatatatcc 240 agctataaat cctattgaaa ttattaataa tattatgttg aagttactaa catttaaaat 300 aatatataag gttaatacta ttaaagatag acatagtaaa ctatgagtaa agccacgatg 360 tctacattta ctacctatat gctttgaaag aaaaggatac atttgactaa ttgaagattt 420 tctttgatct atatcaggaa atagagatcc tatataagaa aaatgaaaaa ataatgctat 480 taataaaatt ttataagcta tatcatatgg aaataagaac aggcttaaaa ttgtatttaa 540 cattattaaa gaaatgcata cgcctccagt tgaatgagtt tcttttgtca taaaatctcc 600 tttaaaaata attatcatta gtttatatta aaaatattat cataatattc attttacata 660 aagaagaaaa aaataaaaat cctaaaaata gagtggacag ttctatttct aggatcaata 720 gttatggtgg taattttatg taaggttttt tactaaatta aagtaaaatc attaataagt 780 aattatttat ttttaattac aattatggaa tatgcaattg aaaatattga tattaaagca 840 agtatgggac ttataatatt tgaaacaact tctaaagatg taaaataaga tactctttgt 900 tcaatatata aagctatgct atttttaagt attaagggag aaaaaagagt tattaatgta 960 attaaaattg cacttgttaa aatccttttt gtatgtttca a 1001 <210> 8 <211> 960 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <220> <221> misc_feature <222> (527)..(527) <223> n is a, c, g, t or u <400> 8 ttacagataa tattctattt tatgatcttg ccaatttatt ttaaacataa attcgttata 60 ttcacttgtt gacgaaagtt tgtttgttcc tcgccattga gtagtttccc aatttaaaat 120 atagtcatta tcaaatcttt gatattcaac tattattaca gattctttag catttttagg 180 tgctgttaat gctaaagcca tattgggtga aaatccacca gaaattaatg ttgataaatc 240 tctatcatct gtgaaatttt tatcaccatt attatacaat cttgatttca tgaataattg 300 atttccataa atagcatgat aagaatctat attataaccg tccttagtct caacaaattt 360 tatatcccat gatgctaaat ttgcatcatc ttttctttga attgttctaa aatcaggttg 420 ttcatagctt atagtatttt ggacattata tgaagcattt attccagcac cagcagtttt 480 tccttcaaca gatatattac cgcctataga ataaccaatt gaattanata catctttttt 540 atctatagtt ttaggaatag aatttgctat attattattt acatcagcac tttttacatt 600 aattctataa gtttcaggcc atttcatttt tccgtaatat ttagaaccaa aaatctgttt 660 atcagaaggt ataaatcctt ctaaatttaa taaagcagtt ttcttatcag aatgaggatc 720 ttcaataaat gttccactta aagttgcctt ccaaccttta tgtgaagcgg tatcactaga 780 agtatattta atagcttcct ttccattttc ttttattatt tctccactta gatttttcaa 840 ctcaattttg tttatgtcat ttaattcact tgcaaaaact tgagtttgag ttgaaaaaag 900 gcttgtacta attacacttg taagaactag tgtaattgaa ataattttta atcttttcaa 960 <210> 9 <211> 562 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 9 tgtttatcat cccttttctc tcatttttat atactcataa atatatcata aaaagcaaaa 60 tctatccata atatatttaa aaaatgagta tatagttttt aataaaatta tatttaatta 120 tgtataaaaa tcataagtta aattgctcta tataatattt ccaaataaga ttaattttat 180 gaaatagaaa tgaaaaaagt tctgcaaagt gcagaacttt taatttatga ataaacttgc 240 gttaattatc aattatctat tcattttttg agcttttctt gcttttctgc aagctgggca 300 tctaactgga tcgttttcaa atcctttttc tttgaagaat tcttgttctc ctacagtgaa 360 tacgaattct tttccacagt ctttacaaac taaattttta tcttccattt cttttacctc 420 ctgtaaaatt tactaggtac gtttgagatc tatactataa aactaataaa ataaatttta 480 caggacagaa ataaagtaca tatctactaa attttatttt atatattgat tatatcatat 540 agaaaaaaga 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Ile Ile Leu Ala 1 5 10 aaa aat tca agt cca aaa gaa gga gaa tat aaa aaa att tta gaa tta 759 Lys Asn Ser Ser Pro Lys Glu Gly Glu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Leu 15 20 25 cta gat gaa tat aat tta tta aat aat tct gtt gaa aaa aat agt ata 807 Leu Asp Glu Tyr Asn Leu Leu Asn Asn Ser Val Glu Lys Asn Ser Ile 30 35 40 45 gat tta tat tta aaa ctt aat gaa tta tct aaa tca att gat att tat 855 Asp Leu Tyr Leu Lys Leu Asn Glu Leu Ser Lys Ser Ile Asp Ile Tyr 50 55 60 tta aaa aaa tat aag aat tca aag aga aat aat gca tta tat caa tta 903 Leu Lys Lys Tyr Lys Asn Ser Lys Arg Asn Asn Ala Leu Tyr Gln Leu 65 70 75 aaa tct gat tta aca aag gaa gtt att gaa ata aaa gat act aat tta 951 Lys Ser Asp Leu Thr Lys Glu Val Ile Glu Ile Lys Asp Thr Asn Leu 80 85 90 aaa cct ttg gaa aaa aat att cat ttt gtt tgg gtt gga gga atg ata 999 Lys Pro Leu Glu Lys Asn Ile His Phe Val Trp Val Gly Gly Met Ile 95 100 105 aat aat ata tct att gat tat ata aat caa tgg aaa gat att aat agc 1047 Asn Asn Ile Ser Ile Asp Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Ile Asn Ser 110 115 120 125 gat tat gaa act att ata tgg tat gat agt gaa gct ttg tta gta aat 1095 Asp Tyr Glu Thr Ile Ile Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Leu Leu Val Asn 130 135 140 ata tta aaa aaa gct ata ata gac tca tca aat aaa gaa gtt tta act 1143 Ile Leu Lys Lys Ala Ile Ile Asp Ser Ser Asn Lys Glu Val Leu Thr 145 150 155 aaa tat gaa tca gta tta aat gat aat agc ttt gat tca aat aaa ttt 1191 Lys Tyr Glu Ser Val Leu Asn Asp Asn Ser Phe Asp Ser Asn Lys Phe 160 165 170 tat aga gaa aga atg gaa gtt att ttt aga aag caa aaa gag ttt aat 1239 Tyr Arg Glu Arg Met Glu Val Ile Phe Arg Lys Gln Lys Glu Phe Asn 175 180 185 aat tat tat aat aca aat gat aac tat act aaa tct tta aat gat gta 1287 Asn Tyr Tyr Asn Thr Asn Asp Asn Tyr Thr Lys Ser Leu Asn Asp Val 190 195 200 205 att aaa gtt tat tta ata gaa aaa tat tta aaa act gat gaa gaa tta 1335 Ile Lys Val Tyr Leu Ile Glu Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Glu Glu Leu 210 215 220 gaa aaa tat att aat gaa agt aaa gaa gtt ttt aag gct aat gga gct 1383 Glu Lys Tyr Ile Asn Glu Ser Lys Glu Val Phe Lys Ala Asn Gly Ala 225 230 235 aaa gat ata aga gaa tac gat ata cta gat gat gtt gaa tta aaa tca 1431 Lys Asp Ile Arg Glu Tyr Asp Ile Leu Asp Asp Val Glu Leu Lys Ser 240 245 250 ata tat gag caa gag tta tta atg aga ttt aat tta gca tct gca tca 1479 Ile Tyr Glu Gln Glu Leu Leu Met Arg Phe Asn Leu Ala Ser Ala Ser 255 260 265 gat att att aga gtg att gta tta aat aaa tta ggt ggg att tat tta 1527 Asp Ile Ile Arg Val Ile Val Leu Asn Lys Leu Gly Gly Ile Tyr Leu 270 275 280 285 gat gta gat gtg ctt cct gga ata aaa aaa cat att ttt aaa gat att 1575 Asp Val Asp Val Leu Pro Gly Ile Lys Lys His Ile Phe Lys Asp Ile 290 295 300 aat aaa cct aca aat att tct gaa aat aaa tgg caa atg att caa tta 1623 Asn Lys Pro Thr Asn Ile Ser Glu Asn Lys Trp Gln Met Ile Gln Leu 305 310 315 gaa act att atg aaa tat aaa caa tat ata aaa gga tat aca gaa aat 1671 Glu Thr Ile Met Lys Tyr Lys Gln Tyr Ile Lys Gly Tyr Thr Glu Asn 320 325 330 tca ttt aaa aat tta cca agt gat ttg cag gaa atg tta caa gaa aaa 1719 Ser Phe Lys Asn Leu Pro Ser Asp Leu Gln Glu Met Leu Gln Glu Lys 335 340 345 gtt gtt gaa aaa aat ctt aaa agt gat ata ttt cag aga tta ggg gat 1767 Val Val Glu Lys Asn Leu Lys Ser Asp Ile Phe Gln Arg Leu Gly Asp 350 355 360 365 ata ttt att tca gaa tta gat aca aaa ata gct ttt atg ttt ggg aaa 1815 Ile Phe Ile Ser Glu Leu Asp Thr Lys Ile Ala Phe Met Phe Gly Lys 370 375 380 att gct aat caa gta tta ata tct aaa aaa aat tca tac tca tta aat 1863 Ile Ala Asn Gln Val Leu Ile Ser Lys Lys Asn Ser Tyr Ser Leu Asn 385 390 395 tta ata att aat caa atc aag aat aga tat aat att att aat aaa tgt 1911 Leu Ile Ile Asn Gln Ile Lys Asn Arg Tyr Asn Ile Ile Asn Lys Cys 400 405 410 tta tct tcg gct att gaa aaa gga tca aat ttt aat aat aca gtt gat 1959 Leu Ser Ser Ala Ile Glu Lys Gly Ser Asn Phe Asn Asn Thr Val Asp 415 420 425 ata ttc att caa caa tta aat gaa ttc tat gtt aat gaa ggc ttt ttt 2007 Ile Phe Ile Gln Gln Leu Asn Glu Phe Tyr Val Asn Glu Gly Phe Phe 430 435 440 445 gtt agt aaa gta atg gga tat tta ggt gat gga tat atg cct gat atg 2055 Val Ser Lys Val Met Gly Tyr Leu Gly Asp Gly Tyr Met Pro Asp Met 450 455 460 aga gcg aca ctt aat ata agt ggt cca gga ata tat aca gct gct tat 2103 Arg Ala Thr Leu Asn Ile Ser Gly Pro Gly Ile Tyr Thr Ala Ala Tyr 465 470 475 tat gat tta tta tat ttt aat gag agg tca tta aat cct caa att tta 2151 Tyr Asp Leu Leu Tyr Phe Asn Glu Arg Ser Leu Asn Pro Gln Ile Leu 480 485 490 caa gaa gat ttg aaa tat ttt gaa gtt cca caa gct cta ata tca caa 2199 Gln Glu Asp Leu Lys Tyr Phe Glu Val Pro Gln Ala Leu Ile Ser Gln 495 500 505 caa aca gaa caa gaa ata aat agt tca tgg aca ttt aat caa gtt aaa 2247 Gln Thr Glu Gln Glu Ile Asn Ser Ser Trp Thr Phe Asn Gln Val Lys 510 515 520 525 tca caa ata gaa tat aaa aag cta gta gaa aaa tat act aat aaa tca 2295 Ser Gln Ile Glu Tyr Lys Lys Leu Val Glu Lys Tyr Thr Asn Lys Ser 530 535 540 tta agt gaa aat gat aaa cta aat ttt aat gag aat aaa atc att gat 2343 Leu Ser Glu Asn Asp Lys Leu Asn Phe Asn Glu Asn Lys Ile Ile Asp 545 550 555 aaa gta gaa tta cta aat cga att aat agt aat aat tta att aat ttt 2391 Lys Val Glu Leu Leu Asn Arg Ile Asn Ser Asn Asn Leu Ile Asn Phe 560 565 570 gat gat aaa gaa tac tta aga tat ata att caa tta caa ggt gat aaa 2439 Asp Asp Lys Glu Tyr Leu Arg Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Lys 575 580 585 gta agt tat gag gct gca ata aat tta ttt att aaa aat cct tca aat 2487 Val Ser Tyr Glu Ala Ala Ile Asn Leu Phe Ile Lys Asn Pro Ser Asn 590 595 600 605 tca ata cta gtt caa gaa att aat aat ata agc tac tat ttt aat tca 2535 Ser Ile Leu Val Gln Glu Ile Asn Asn Ile Ser Tyr Tyr Phe Asn Ser 610 615 620 gaa tat aaa tca ata gat tct ata caa ttt gat aat att cct gaa ata 2583 Glu Tyr Lys Ser Ile Asp Ser Ile Gln Phe Asp Asn Ile Pro Glu Ile 625 630 635 tta aaa ggt aaa aat aaa att aaa tta aca ttt ata ggt cat gga gaa 2631 Leu Lys Gly Lys Asn Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Glu 640 645 650 gaa gaa ttt aat aca gag aga ttt gct tca tta aca gta aag gag ttt 2679 Glu Glu Phe Asn Thr Glu Arg Phe Ala Ser Leu Thr Val Lys Glu Phe 655 660 665 tca aaa aaa ata tat aaa gtt tta gat atg ata aag agc aat acg aat 2727 Ser Lys Lys Ile Tyr Lys Val Leu Asp Met Ile Lys Ser Asn Thr Asn 670 675 680 685 gtt aaa gaa att caa ata gat ttg tta gga tgt aat atg ttt tca tat 2775 Val Lys Glu Ile Gln Ile Asp Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr 690 695 700 aat ata aat gta gaa gaa aca tat cct ggg aaa tta tta aaa gta gta 2823 Asn Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Lys Val Val 705 710 715 tta gat tat gta gat aaa att tat aat gca gat att aaa cca gaa ata 2871 Leu Asp Tyr Val Asp Lys Ile Tyr Asn Ala Asp Ile Lys Pro Glu Ile 720 725 730 aaa ata agt gcc aat caa tat gaa gtc aga ata aat aaa gat ggg aaa 2919 Lys Ile Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Lys Asp Gly Lys 735 740 745 aaa gaa tta cta tct cat tca gga gag tgg ctt tct aaa gaa gaa gct 2967 Lys Glu Leu Leu Ser His Ser Gly Glu Trp Leu Ser Lys Glu Glu Ala 750 755 760 765 ata ata aaa gat att gcg agt aaa gaa att att tat ttt gat aca aga 3015 Ile Ile Lys Asp Ile Ala Ser Lys Glu Ile Ile Tyr Phe Asp Thr Arg 770 775 780 gaa aat act att aaa gca gaa gct aaa aat att atg gag ttg ata act 3063 Glu Asn Thr Ile Lys Ala Glu Ala Lys Asn Ile Met Glu Leu Ile Thr 785 790 795 ttt aga aat agt cta gat aaa aaa tta aat gat tta gaa agt tta att 3111 Phe Arg Asn Ser Leu Asp Lys Lys Leu Asn Asp Leu Glu Ser Leu Ile 800 805 810 aat aat aat ttt att gta aat gaa gta tat gaa caa tta aca tca aat 3159 Asn Asn Asn Phe Ile Val Asn Glu Val Tyr Glu Gln Leu Thr Ser Asn 815 820 825 aat tta tat aga aca agt ttt aga aat tct ttt tta gat act ata aat 3207 Asn Leu Tyr Arg Thr Ser Phe Arg Asn Ser Phe Leu Asp Thr Ile Asn 830 835 840 845 ttt ata gaa gat gtt tct caa gag tta tat gaa ata aag ata aaa aat 3255 Phe Ile Glu Asp Val Ser Gln Glu Leu Tyr Glu Ile Lys Ile Lys Asn 850 855 860 aat ata aac gat gat tat atc atg gca tta gat gaa ata aag caa gat 3303 Asn Ile Asn Asp Asp Tyr Ile Met Ala Leu Asp Glu Ile Lys Gln Asp 865 870 875 aat aat att tca gaa att aaa ttt att aat att aat tca gga gaa ttt 3351 Asn Asn Ile Ser Glu Ile Lys Phe Ile Asn Ile Asn 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Lys Ile Ile Ala Glu Ala Asn Glu Ile 990 995 1000 1005 gaa ata aat tta ata cca aca tta gca aat gct ata cca tta ata 3732 Glu Ile Asn Leu Ile Pro Thr Leu Ala Asn Ala Ile Pro Leu Ile 1010 1015 1020 aca aca ata gtt gat gga ata aat ttg att gca aat ata gat gaa 3777 Thr Thr Ile Val Asp Gly Ile Asn Leu Ile Ala Asn Ile Asp Glu 1025 1030 1035 tta ata aat act aaa gat gaa tta cta aga aag gaa tta gca gct 3822 Leu Ile Asn Thr Lys Asp Glu Leu Leu Arg Lys Glu Leu Ala Ala 1040 1045 1050 aga att gga att att tca tct aat atg aca gca gct att agt tct 3867 Arg Ile Gly Ile Ile Ser Ser Asn Met Thr Ala Ala Ile Ser Ser 1055 1060 1065 tat att tta tat ttt act gaa ttt gga gaa gta ttt aat cct tta 3912 Tyr Ile Leu Tyr Phe Thr Glu Phe Gly Glu Val Phe Asn Pro Leu 1070 1075 1080 tta gtg cca att gca ggt ata tca agt ggt att cct act tta gta 3957 Leu Val Pro Ile Ala Gly Ile Ser Ser Gly Ile Pro Thr Leu Val 1085 1090 1095 aat aat att tta att tta gag gaa aaa tct aaa gaa ata aca gaa 4002 Asn Asn Ile Leu Ile Leu Glu Glu Lys Ser Lys Glu Ile Thr Glu 1100 1105 1110 tat ttt tca cat ata agt aaa gta gaa agt gat gga tta ttt aaa 4047 Tyr Phe Ser His Ile Ser Lys Val Glu Ser Asp Gly Leu Phe Lys 1115 1120 1125 gtg tct gat aat aac agt ata ttg att cca ctt gat gat att gca 4092 Val Ser Asp Asn Asn Ser Ile Leu Ile Pro Leu Asp Asp Ile Ala 1130 1135 1140 att tct aag att gat ttt aat aaa aga gaa gtt atc tta gat aaa 4137 Ile Ser Lys Ile Asp Phe Asn Lys Arg Glu Val Ile Leu Asp Lys 1145 1150 1155 tta gat ata tgg gca atg gaa gga gga tca gga tta agt ggt aaa 4182 Leu Asp Ile Trp Ala Met Glu Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Lys 1160 1165 1170 gaa act ttt ttt tct gct ccg tat ata aat gaa aat ctt cct aaa 4227 Glu Thr Phe Phe Ser Ala Pro Tyr Ile Asn Glu Asn Leu Pro Lys 1175 1180 1185 tta tct att gat aat ttg ctt aag ata gat ata aat aaa ata gat 4272 Leu Ser Ile Asp Asn Leu Leu Lys Ile Asp Ile Asn Lys Ile Asp 1190 1195 1200 ttt tca att aaa ggt atg atg cta cct aat ggc gtt agt aaa aca 4317 Phe Ser Ile Lys Gly Met Met Leu Pro Asn Gly Val Ser Lys Thr 1205 1210 1215 tta ggt tat gag ttc aat aca gtt gcc aat ata tat gaa tta gaa 4362 Leu Gly Tyr Glu Phe Asn Thr Val Ala Asn Ile Tyr Glu Leu Glu 1220 1225 1230 aat gat ggt gta aat tta tta aat aga att aga gat aat tat cca 4407 Asn Asp Gly Val Asn Leu Leu Asn Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Pro 1235 1240 1245 gga cag ttt tat tgg aga tat tat gct act cta ttt aat tat ggt 4452 Gly Gln Phe Tyr Trp Arg Tyr Tyr Ala Thr Leu Phe Asn Tyr Gly 1250 1255 1260 atg gta aat tta aaa att aat tat cat gac aca gat gta aaa ata 4497 Met Val Asn Leu Lys Ile Asn Tyr His Asp Thr Asp Val Lys Ile 1265 1270 1275 aat tta gat aat gtt gat cgt atg ttt ata gta ccg aca tta aca 4542 Asn Leu Asp Asn Val Asp Arg Met Phe Ile Val Pro Thr Leu Thr 1280 1285 1290 ata gat caa gct aga gaa aaa ctt tca tat aat ttt aat gga gca 4587 Ile Asp Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Asn Phe Asn Gly Ala 1295 1300 1305 gga gct aat tat tat ata tac ctt tcg tct caa cca ata aaa ata 4632 Gly Ala Asn Tyr Tyr Ile Tyr Leu Ser Ser Gln Pro Ile Lys Ile 1310 1315 1320 ttt att aat ggg act aaa gaa gat aat tgg att ctt aat ata gat 4677 Phe Ile Asn Gly Thr Lys Glu Asp Asn Trp Ile Leu Asn Ile Asp 1325 1330 1335 gat att gtt aaa gaa gtt aca att gtt aat aat agt ata gta aga 4722 Asp Ile Val Lys Glu Val Thr Ile Val Asn Asn Ser Ile Val Arg 1340 1345 1350 gga aag ttt att gaa aat ata ttt aaa aaa tta act att gag gat 4767 Gly Lys Phe Ile Glu Asn Ile Phe Lys Lys Leu Thr Ile Glu Asp 1355 1360 1365 aat aaa ata att ata gga aat caa aaa ata tat tta aaa aat aac 4812 Asn Lys Ile Ile Ile Gly Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Lys Asn Asn 1370 1375 1380 aaa aca aat ata cat ttt tct gta tct att tta gat gga gtg aat 4857 Lys Thr Asn Ile His Phe Ser Val Ser Ile Leu Asp Gly Val Asn 1385 1390 1395 tta atg gta gaa gta gac ttt aat aat aaa atg tat cat tta tca 4902 Leu Met Val Glu Val Asp Phe Asn Asn Lys Met Tyr His Leu Ser 1400 1405 1410 ctt caa gga aac gaa aaa aca ata tgt aat aat atg aat att ata 4947 Leu Gln Gly Asn Glu Lys Thr Ile Cys Asn Asn Met Asn Ile Ile 1415 1420 1425 caa aat aac ata aat aaa tta ttt ggc tct tca aat ata aaa tca 4992 Gln Asn Asn Ile Asn Lys Leu Phe Gly Ser Ser Asn Ile Lys Ser 1430 1435 1440 ata cca tat ttc tat aaa aat aat gga tta gag aat tgt att gga 5037 Ile Pro Tyr Phe Tyr Lys Asn Asn Gly Leu Glu Asn Cys Ile Gly 1445 1450 1455 gta ttc tca ata aaa aac aat gaa ttt att tat atg tta aaa tat 5082 Val Phe Ser Ile Lys Asn Asn Glu Phe Ile Tyr Met Leu Lys Tyr 1460 1465 1470 gat gat aaa aat aaa ata tat aaa tat aaa gat aat aat tta gta 5127 Asp Asp Lys Asn Lys Ile Tyr Lys Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Val 1475 1480 1485 tgt ggt ttt aat tta ttt gat ata tct tat gta gat ata att tct 5172 Cys Gly Phe Asn Leu Phe Asp Ile Ser Tyr Val Asp Ile Ile Ser 1490 1495 1500 aat gga gat aag aat tat ttg aaa gga att tgg aat aca tca gtt 5217 Asn Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Trp Asn Thr Ser Val 1505 1510 1515 aat aat tca gaa tat aaa att gaa ttt tta gtt gaa tta ata gac 5262 Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Ile Glu Phe Leu Val Glu Leu Ile Asp 1520 1525 1530 caa aat act att gaa atc att aaa ttg aat tta agt gat gga tta 5307 Gln Asn Thr Ile Glu Ile Ile Lys Leu Asn Leu Ser Asp Gly Leu 1535 1540 1545 ata aaa tca ttt tta act ata tta gat aat tta gaa agt tta gat 5352 Ile Lys Ser Phe Leu Thr Ile Leu Asp Asn Leu Glu Ser Leu Asp 1550 1555 1560 gta aaa att tca aca ata tat gat ttt tta aaa aat att ctt ttt 5397 Val Lys Ile Ser Thr Ile Tyr Asp Phe Leu Lys Asn Ile Leu Phe 1565 1570 1575 agg gat gta ttt tta gaa aat gag tca tta aat ttt att gta agt 5442 Arg Asp Val Phe Leu Glu Asn Glu Ser Leu Asn Phe Ile Val Ser 1580 1585 1590 aaa ggc ttt gtt ttg aca ggg aat aat tca aaa aat aaa tac gag 5487 Lys Gly Phe Val Leu Thr Gly Asn Asn Ser Lys Asn Lys Tyr Glu 1595 1600 1605 ttt ata tgt aat agt gaa aat ata caa tta tat att act gaa ctt 5532 Phe Ile Cys Asn Ser Glu Asn Ile Gln Leu Tyr Ile Thr Glu Leu 1610 1615 1620 tac act aat ggt act aaa ttt agg aat tgg ctt gac aat ggt aag 5577 Tyr Thr Asn Gly Thr Lys Phe Arg Asn Trp Leu Asp Asn Gly Lys 1625 1630 1635 ata tta gta tca tca aca ggt gaa agt tca aat aat tta att gac 5622 Ile Leu Val Ser Ser Thr Gly Glu Ser Ser Asn Asn Leu Ile Asp 1640 1645 1650 ata taa 5628 Ile <210> 17 <211> 1651 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 17 Met Gly Leu Met Ser Lys Glu Gln Leu Ile Ile Leu Ala Lys Asn Ser 1 5 10 15 Ser Pro Lys Glu Gly Glu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Leu Leu Asp Glu 20 25 30 Tyr Asn Leu Leu Asn Asn Ser Val Glu Lys Asn Ser Ile Asp Leu Tyr 35 40 45 Leu Lys Leu Asn Glu Leu Ser Lys Ser Ile Asp Ile Tyr Leu Lys Lys 50 55 60 Tyr Lys Asn Ser Lys Arg Asn Asn Ala Leu Tyr Gln Leu Lys Ser Asp 65 70 75 80 Leu Thr Lys Glu Val Ile Glu Ile Lys Asp Thr Asn Leu Lys Pro Leu 85 90 95 Glu Lys Asn Ile His Phe Val Trp Val Gly Gly Met Ile Asn Asn Ile 100 105 110 Ser Ile Asp Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Ile Asn Ser Asp Tyr Glu 115 120 125 Thr Ile Ile Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Leu Leu Val Asn Ile Leu Lys 130 135 140 Lys Ala Ile Ile Asp Ser Ser Asn Lys Glu Val Leu Thr Lys Tyr Glu 145 150 155 160 Ser Val Leu Asn Asp Asn Ser Phe Asp Ser Asn Lys Phe Tyr Arg Glu 165 170 175 Arg Met Glu Val Ile Phe Arg Lys Gln Lys Glu Phe Asn Asn Tyr Tyr 180 185 190 Asn Thr Asn Asp Asn Tyr Thr Lys Ser Leu Asn Asp Val Ile Lys Val 195 200 205 Tyr Leu Ile Glu Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Glu Glu Leu Glu Lys Tyr 210 215 220 Ile Asn Glu Ser Lys Glu Val Phe Lys Ala Asn Gly Ala Lys Asp Ile 225 230 235 240 Arg Glu Tyr Asp Ile Leu Asp Asp Val Glu Leu Lys Ser Ile Tyr Glu 245 250 255 Gln Glu Leu Leu Met Arg Phe Asn Leu Ala Ser Ala Ser Asp Ile Ile 260 265 270 Arg Val Ile Val Leu Asn Lys Leu Gly Gly Ile Tyr Leu Asp Val Asp 275 280 285 Val Leu Pro Gly Ile Lys Lys His Ile Phe Lys Asp Ile Asn Lys Pro 290 295 300 Thr Asn Ile Ser Glu Asn Lys Trp Gln Met Ile Gln Leu Glu Thr Ile 305 310 315 320 Met Lys Tyr Lys Gln Tyr Ile Lys Gly Tyr Thr Glu Asn Ser Phe Lys 325 330 335 Asn Leu Pro Ser Asp Leu Gln Glu Met Leu Gln Glu Lys Val Val Glu 340 345 350 Lys Asn Leu Lys Ser Asp Ile Phe Gln Arg Leu Gly Asp Ile Phe Ile 355 360 365 Ser Glu Leu Asp Thr Lys Ile Ala Phe Met Phe Gly Lys Ile Ala Asn 370 375 380 Gln Val Leu Ile Ser Lys Lys Asn Ser Tyr Ser Leu Asn Leu Ile Ile 385 390 395 400 Asn Gln Ile Lys Asn Arg Tyr Asn Ile Ile Asn Lys Cys Leu Ser Ser 405 410 415 Ala Ile Glu Lys Gly Ser Asn Phe Asn Asn Thr Val Asp Ile Phe Ile 420 425 430 Gln Gln Leu Asn Glu Phe Tyr Val Asn Glu Gly Phe Phe Val Ser Lys 435 440 445 Val Met Gly Tyr Leu Gly Asp Gly Tyr Met Pro Asp Met Arg Ala Thr 450 455 460 Leu Asn Ile Ser Gly Pro Gly Ile Tyr Thr Ala Ala Tyr Tyr Asp Leu 465 470 475 480 Leu Tyr Phe Asn Glu Arg Ser Leu Asn Pro Gln Ile Leu Gln Glu Asp 485 490 495 Leu Lys Tyr Phe Glu Val Pro Gln Ala Leu Ile Ser Gln Gln Thr Glu 500 505 510 Gln Glu Ile Asn Ser Ser Trp Thr Phe Asn Gln Val Lys Ser Gln Ile 515 520 525 Glu Tyr Lys Lys Leu Val Glu Lys Tyr Thr Asn Lys Ser Leu Ser Glu 530 535 540 Asn Asp Lys Leu Asn Phe Asn Glu Asn Lys Ile Ile Asp Lys Val Glu 545 550 555 560 Leu Leu Asn Arg Ile Asn Ser Asn Asn Leu Ile Asn Phe Asp Asp Lys 565 570 575 Glu Tyr Leu Arg Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Lys Val Ser Tyr 580 585 590 Glu Ala Ala Ile 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Leu Ala Asn Ala Ile Pro Leu Ile Thr Thr Ile 1010 1015 1020 Val Asp Gly Ile Asn Leu Ile Ala Asn Ile Asp Glu Leu Ile Asn 1025 1030 1035 Thr Lys Asp Glu Leu Leu Arg Lys Glu Leu Ala Ala Arg Ile Gly 1040 1045 1050 Ile Ile Ser Ser Asn Met Thr Ala Ala Ile Ser Ser Tyr Ile Leu 1055 1060 1065 Tyr Phe Thr Glu Phe Gly Glu Val Phe Asn Pro Leu Leu Val Pro 1070 1075 1080 Ile Ala Gly Ile Ser Ser Gly Ile Pro Thr Leu Val Asn Asn Ile 1085 1090 1095 Leu Ile Leu Glu Glu Lys Ser Lys Glu Ile Thr Glu Tyr Phe Ser 1100 1105 1110 His Ile Ser Lys Val Glu Ser Asp Gly Leu Phe Lys Val Ser Asp 1115 1120 1125 Asn Asn Ser Ile Leu Ile Pro Leu Asp Asp Ile Ala Ile Ser Lys 1130 1135 1140 Ile Asp Phe Asn Lys Arg Glu Val Ile Leu Asp Lys Leu Asp Ile 1145 1150 1155 Trp Ala Met Glu Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Lys Glu Thr Phe 1160 1165 1170 Phe Ser Ala Pro Tyr Ile Asn Glu Asn Leu Pro Lys Leu Ser Ile 1175 1180 1185 Asp Asn Leu Leu Lys Ile Asp Ile Asn Lys Ile Asp Phe Ser Ile 1190 1195 1200 Lys Gly Met Met Leu Pro Asn Gly Val Ser Lys Thr Leu Gly Tyr 1205 1210 1215 Glu Phe Asn Thr Val Ala Asn Ile Tyr Glu Leu Glu Asn Asp Gly 1220 1225 1230 Val Asn Leu Leu Asn Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Pro Gly Gln Phe 1235 1240 1245 Tyr Trp Arg Tyr Tyr Ala Thr Leu Phe Asn Tyr Gly Met Val Asn 1250 1255 1260 Leu Lys Ile Asn Tyr His Asp Thr Asp Val Lys Ile Asn Leu Asp 1265 1270 1275 Asn Val Asp Arg Met Phe Ile Val Pro Thr Leu Thr Ile Asp Gln 1280 1285 1290 Ala Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Asn Phe Asn Gly Ala Gly Ala Asn 1295 1300 1305 Tyr Tyr Ile Tyr Leu Ser Ser Gln Pro Ile Lys Ile Phe Ile Asn 1310 1315 1320 Gly Thr Lys Glu Asp Asn Trp Ile Leu Asn Ile Asp Asp Ile Val 1325 1330 1335 Lys Glu Val Thr Ile Val Asn Asn Ser Ile Val Arg Gly Lys Phe 1340 1345 1350 Ile Glu Asn Ile Phe Lys Lys Leu Thr Ile Glu Asp Asn Lys Ile 1355 1360 1365 Ile Ile Gly Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Lys Asn Asn Lys Thr Asn 1370 1375 1380 Ile His Phe Ser Val Ser Ile Leu Asp Gly Val Asn Leu Met Val 1385 1390 1395 Glu Val Asp Phe Asn Asn Lys Met Tyr His Leu Ser Leu Gln Gly 1400 1405 1410 Asn Glu Lys Thr Ile Cys Asn Asn Met Asn Ile Ile Gln Asn Asn 1415 1420 1425 Ile Asn Lys Leu Phe Gly Ser Ser Asn Ile Lys Ser Ile Pro Tyr 1430 1435 1440 Phe Tyr Lys Asn Asn Gly Leu Glu Asn Cys Ile Gly Val Phe Ser 1445 1450 1455 Ile Lys Asn Asn Glu Phe Ile Tyr Met Leu Lys Tyr Asp Asp Lys 1460 1465 1470 Asn Lys Ile Tyr Lys Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Val Cys Gly Phe 1475 1480 1485 Asn Leu Phe Asp Ile Ser Tyr Val Asp Ile Ile Ser Asn Gly Asp 1490 1495 1500 Lys Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Trp Asn Thr Ser Val Asn Asn Ser 1505 1510 1515 Glu Tyr Lys Ile Glu Phe Leu Val Glu Leu Ile Asp Gln Asn Thr 1520 1525 1530 Ile Glu Ile Ile Lys Leu Asn Leu Ser Asp Gly Leu Ile Lys Ser 1535 1540 1545 Phe Leu Thr Ile Leu Asp Asn Leu Glu Ser Leu Asp Val Lys Ile 1550 1555 1560 Ser Thr Ile Tyr Asp Phe Leu Lys Asn Ile Leu Phe Arg Asp Val 1565 1570 1575 Phe Leu Glu Asn Glu Ser Leu Asn Phe Ile Val Ser Lys Gly Phe 1580 1585 1590 Val Leu Thr Gly Asn Asn Ser Lys Asn Lys Tyr Glu Phe Ile Cys 1595 1600 1605 Asn Ser Glu Asn Ile Gln Leu Tyr Ile Thr Glu Leu Tyr Thr Asn 1610 1615 1620 Gly Thr Lys Phe Arg Asn Trp Leu Asp Asn Gly Lys Ile Leu Val 1625 1630 1635 Ser Ser Thr Gly Glu Ser Ser Asn Asn Leu Ile Asp Ile 1640 1645 1650

Claims (15)

  1. 삭제
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  3. 삭제
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  6. 조류 대변에서, 괴사성 장염을 나타내는 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 수준을 측정하는 것을 포함하는, 조류 괴사성 장염의 검출 방법으로서, 여기서 비감염 대조군과 비교했을 때 상기 하나 이상의 마커의 존재 및/또는 증가 수준이 괴사성 장염을 나타내고, 마커는 하기로부터 선택되는 것인 검출 방법:
    a) 적어도 20 개의, SEQ ID NO: 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    b) 적어도 20 개의, SEQ ID NO: 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    c) 적어도 20 개의, SEQ ID NO: 4 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    d) 적어도 20 개의, SEQ ID NO: 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    e) 적어도 20 개의, SEQ ID NO: 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    f) 적어도 20 개의, SEQ ID NO: 8 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    g) 적어도 20 개의, SEQ ID NO: 9 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 적어도 90 % 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드;
    h) (a) 내지 (g) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
    i) (h) 에 따른 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 (DNA 및 RNA);
    j) (a) 내지 (i) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 6 항에 기재된 방법을 실시하는 단계와, 괴사성 장염 감염의 치료를 위한 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 조류를 대상으로 괴사성 장염의 치료 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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  15. 삭제
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