KR102502087B1 - 혈액 샘플 내의 순환 종양 세포의 디지털 분석 - Google Patents

혈액 샘플 내의 순환 종양 세포의 디지털 분석 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 질환, 예를 들어, 암의 검출, 예를 들어 조기 검출, 및/또는 모니터링을 위한 혈액 샘플 내의 순환 종양 세포 (CTC)의 분석을 위한 새로운 검정 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 초고도의 민감도 및 특이도를 제공하고, CTC의 미세유체 단리 및 CTC로부터 유래된 RNA의 디지털 검출을 사용하는 것을 포함한다.

Description

혈액 샘플 내의 순환 종양 세포의 디지털 분석
본 발명은 혈액 샘플링 기술, 더욱 특히 혈액 샘플 내의 세포를 검출 및 분석하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
"액체 생검", 또는 간단한 혈액 테스트를 사용하여 희귀한 순환 종양 세포 (CTC)의 존재를 검출하는 능력은 침습적인 종양 생검을 필요로 하지 않으면서 종양 세포 수, 유전적 조성, 및 약물 반응 파라미터의 즉각적인 샘플링을 제공하여, 상피암의 모니터링을 크게 강화하는 잠재력이 있다. 따라서, 조기 암 검출을 위한 CTC 검출은 치유적 치료가 예상될 때인 전이되었기 전의 스테이지에 침습성 암의 진단을 가능하게 하여, 암 치료에 혁신을 일으키는 잠재력이 있다.
그러나, CTC는 매우 희귀하고, 심지어 공지된 미세유체 장치 또는 유사한 기술로의 부분적 정제 후에도, 정상 혈액 성분과 혼합된 이들 종양 세포를 식별, 가시화 및 채점하는 것은 여전히 상당한 난제이다. 예를 들어, 전혈 1 밀리리터당, 50억개를 초과하는 적색 혈액 세포 (RBC) 및 5백만개를 초과하는 백색 혈액 세포 (WBC) 중에 오직 1-10개의 CTC만 있다 (Plaks et al., "Cancer Circulating Tumor Cells", Science, 341:1186; 2013). 또한, 심지어 개별적인 환자 내에서도 암 세포 사이의 높은 비균질성, 뿐만 아니라 혈류 내에서 순환하는 다수의 종양 세포 (이들 중 다수에서 프로그래밍된 세포 사멸 또는 아노이키스가 진행되기 시작하였음)의 불량한 물리적 상태로 인해, 종양 세포의 항체 염색은 고도로 가변적이다. 또한, 항체로 염색된 종양 세포의 정확한 채점은 일부가 항체 시약에 비-특이적으로 결합하는 다수의 오염 백색 혈액 세포로부터의 구별을 필요로 한다. 따라서, 후보 종양 세포의 부분 집합만이 항체 염색에 의해 견실하게 식별될 수 있고, 많게는 테스트된 환자의 절반이 광범위하게 전이성인 암에 걸렸음에도 불구하고 검출가능한 세포가 없다.
따라서, CTC를 영상화하기 위한 현재의 프로토콜은 CTC 단리, 특히 다른 유핵 혈액 세포, 예컨대 백색 혈액 세포 (WBC)로부터의 단리에서 점점 더 높은 수준의 순도를 추구하고 있다.
본 개시내용은 극도로 높은 순도 수준의 CTC를 필요로 하는 것을 피하면서 표준 혈액 샘플 내의 희귀한 CTC에 관한 데이터를 가능한 최고 민감도로 수득하기 위한 방법, 용도 및 시스템에 관한 것이다. 특히, 새로운 방법은 CTC가 오염 WBC로부터 완전히 단리되는 것을 필요로 하지 않고, 그 대신, 예를 들어 10,000개 이상까지의 WBC를 함유하는 생성물 내의 적게는 1개의 CTC를 신뢰할 수 있게 검출할 수 있다. 새로운 검정 방법 및 시스템은 (1) 혈액으로부터 CTC를 무손상 전체 세포 (고품질의 리보핵산 (RNA)이 있음)로서 지속적으로 수득할 수 있는 단리 시스템과 (2) 건강한 환자의 혈액에 부재하는 각각의 종양 유형에 대한 특이적 암 계통의 리보핵산 RNA 마커에 초점을 맞춘 액적-기반 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 검정법을 조합한다.
본원에 기술된 바와 같이 조합되었을 때, 이들 2개의 개념은 CTC 디지털 액적 PCR 검정 방법 ("CTC ddPCR") 또는 간단히 언급되는 "디지털-CTC" 검정법 ("d-CTC")을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리 시스템은 미세유체 시스템, 예컨대 음성 고갈 미세유체 시스템 (예를 들어, 조혈 세포, 예를 들어, 적색 혈액 세포 (RBC), WBC, 및 혈소판의 음성 고갈을 사용하여 혈액 샘플 내의 태그가 부착되지 않은 비-조혈 세포 예컨대 CTC를 드러내는 소위 "CTC-칩")이다.
일반적으로, 본 개시내용은 순환 종양 세포 (CTC)의 미세유체 단리 및 CTC로부터 유래된 RNA의 디지털 검출을 사용하는 것을 포함하는, 민감도 및 특이도가 초고도인 암의 조기 검출 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, CTC-유래 RNA가 cDNA로 전환될 수 있고, CTC로부터의 cDNA에 특이적으로 결합하고 다른 세포로부터의 cDNA에는 결합하지 않도록 구성된 리포터 기의 존재 하에서의 증폭을 위해 개별적인 액적 내로 캡슐화될 수 있다. 리포터 기에 대해 양성인 액적을 카운팅하여 질환, 예를 들어, 다양한 유형의 암의 존재에 대해 평가할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 혈액 샘플 내의 순환 종양 세포 (CTC)를 분석하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 혈액 샘플로부터 CTC 및 혈액 내에 존재하는 다른 세포를 포함하는 생성물을 단리하는 단계; 생성물로부터 리보핵산 (RNA) 분자를 단리하는 단계; 단리된 RNA로부터 용액 내의 cDNA 분자를 생성시키는 단계; cDNA 분자를 개별적인 액적 내에 캡슐화시키는 단계; 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 CTC로부터의 cDNA에 특이적으로 결합하고 다른 세포로부터의 cDNA에는 결합하지 않도록 구성된 리포터 기의 존재 하에 증폭시키는 단계; 액적 내에 CTC로부터의 cDNA 분자가 존재하는 것의 지시자로서 리포터 기를 함유하는 액적을 검출하는 단계; 및 검출된 액적 내의 CTC를 분석하는 단계를 포함하거나 또는 이들 단계로 이루어진다.
본원에 기술된 방법은 RNA를 단리하기 전에 생성물의 부피를 감소시키는 단계 및/또는 cDNA 분자를 캡슐화시키기 전에 cDNA-함유 용액으로부터 오염물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
새로운 방법의 다양한 실행에서, 단리된 RNA로부터 cDNA 분자를 생성시키는 단계는 단리된 RNA 분자의 역전사 (RT) 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 것을 포함할 수 있고/있거나, 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 증폭시키는 단계가 각각의 액적에서 PCR을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 새로운 방법에서, 개별적인 cDNA 분자 및 PCR 시약을 개별적인 액적 내에 캡슐화시키는 단계는 비-수성 액체, 예컨대 하나 이상의 플루오로카본, 히드로플루오로카본, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 및 탄화수소 오일 및/또는 하나 이상의 계면활성제의 적어도 1000개의 액적을 형성시키는 것을 포함할 수 있다. 평균적으로, 각각의 액적은 CTC로부터 수득된 1개의 표적 cDNA 분자를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 기는 형광 표지일 수 있거나 또는 형광 표지를 포함할 수 있다.
새로운 방법은 고체상 가역적 고정(Solid Phase Reversible Immobilization: SPRI)을 사용함으로써, 예를 들어, 용액 내의 cDNA를 예를 들어 cDNA에 특이적으로 결합하도록 구성된 자기 비드로 고정하고; 용액으로부터 오염물을 제거하고; 정제된 cDNA를 용출시킴으로써, cDNA-함유 용액으로부터 오염물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실행에서, 본원에 기술된 방법은 본원의 표 1의 암-선택적 유전자 목록으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 상응하는 프로브 및 프라이머를 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 증폭시키는데 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 선택된 유전자는 전립선암-선택적 유전자, 예를 들어, AGR2, FOLH1, HOXDB13, KLK2, KLK3, SCHLAP1/SET4, SCHLAP1/SET5, AMACR, AR 변이체, UGT2B15/SET1, UGT2B15/SET5, 및 STEAP2 중 임의의 하나 이상 (표 1로부터 쉽게 결정될 수 있는 바와 같음)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, ALDH1A3, CDH11, EGFR, FAT1, MET, PKP3, RND3, S100A2, 및 STEAP2 중 임의의 하나 이상이 췌장암에 대해 선택적이다. 유사한 목록이 표 1에 열거된 다른 유형의 암에 대해 생성될 수 있다.
다른 예에서, 선택된 유전자는 표 1에 열거된 유방암-선택적 유전자 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 다른 예에서, 선택된 유전자는 폐, 간, 전립선, 췌장, 및 흑색종 암 중 하나 이상에 대해 선택적인 유전자를 포함한다. 예를 들어, 다중화 검정법이 특정 유형의 암, 예를 들어, 유방암, 폐암, 전립선암, 췌장암, 간암, 및 흑색종에 대해 선택적인 것으로 표 1에 열거된 선택된 유전자 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 심지어 모두를 포함할 수 있다. 전형적으로, 표 1로부터의 5 내지 12개의 암-선택적 유전자에 대한 일군의 프라이머 및 프로브가 특정 유형의 암에 대해 사용된다. 선택된 유전자 (이러한 유전자에 대한 마커)의 다른 구체적 조합이 하기 실시예에서 기술된다.
방법은 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상 또는 5종 이상의 상이한 유형의 암에 대해 선택적인 하나 이상의 유전자를 사용하는 것을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자가 유방암 및 폐암; 유방암, 폐암, 및 간암; 유방암, 폐암, 및 췌장암; 유방암, 폐암, 및 전립선암; 유방암, 간암, 및 흑색종; 유방암, 폐암, 및 흑색종; 유방암, 폐암, 간암, 및 전립선암; 유방암, 폐암, 간암, 및 흑색종; 유방암, 폐암, 간암, 및 췌장암; 유방암, 폐암, 전립선암, 및 췌장암; 유방암, 폐암, 간암, 흑색종, 및 췌장암; 또는 유방암, 폐암, 간암, 흑색종, 췌장암, 및 전립선암에 대해 선택적일 수 있다.
본원에 기술된 방법에서, CTC는 전이성 또는 원발성/국소화 암으로부터 발생할 수 있다. 새로운 방법에서, 검출된 액적 내의 CTC를 분석하는 단계는 예를 들어 기지의 암을 갖는 환자로부터 예를 들어 경시적으로 취득된 혈액 샘플로부터의 CTC를 모니터링하고, CTC를 (예를 들어, 표준 기술을 사용하여) 테스트 및/또는 영상화하여 환자에 대한 예후를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 검출된 액적 내의 CTC를 분석하는 단계는 환자로부터의 혈액 샘플로부터의 CTC를 (예를 들어, 표준 기술을 사용하여) 테스트 및/또는 영상화하여 치료적 개입에 대한 CTC에 의한 반응의 지시를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 검출된 액적 내의 CTC를 분석하는 단계는 환자로부터의 혈액 샘플의 단위 부피당 CTC의 수 또는 수준을 결정하여 환자 내의 종양 부담의 척도를 제공하는 것을 포함한다. 그 후, 방법이 환자 내의 종양 부담의 척도를 사용하여 요법을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 예를 들어, 종양 부담의 동적 모니터링을 위해, 경시적으로, 예를 들어, 치료적 개입에 대응하여 종양 부담을 모니터링하기 위해 제2 시점에 환자 내의 종양 부담의 척도를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 검정법은 광범위한 진단, 예후 및 치료진단 방법에서 CTC를 증폭시키고 검출하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "순환 종양 세포" (CTC)라는 구절은 환자의 혈류 내에 매우 희귀한 수 (예를 들어, 전혈 내의 약 10,000,000개의 WBC 중 약 1개의 CTC)로 존재하는 고형 종양 (비-혈행성 암)으로부터 유래된 암 세포를 지칭한다. CTC는 전이성 암, 뿐만 아니라 원발성/국소화 암 둘 다로부터 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "생성물"은 본원에 기술된 시스템을 예를 들어 사용하여 본원에 기술된 방법에서의 프로세싱으로부터 발생하는, 예를 들어, 일부 부류의 액체, 예를 들어, 완충제, 예컨대 플루로닉 완충제 내의 일군의 단리된 희귀 세포 및 다른 오염 혈액 세포, 예를 들어, 적색 혈액 세포, 백색 혈액 세포 (예를 들어, 백혈구)를 의미한다. 전형적인 생성물은 500 내지 2,500개 이상의 WBC와 혼합된 약 1개 내지 10개의 CTC, 예를 들어, 1000 내지 2000개의 WBC의 혼합물 내의 1 내지 10개의 CTC만을 함유할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법의 검출 한계는 10,000개의 WBC 내의 약 1개의 CTC일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법이 500개의 WBC 내의 약 1개의 CTC의 순도 수준을 달성할 수 있지만, 본 발명의 방법은 일부 공지된 CTC 분석 방법에서 요구되는 바와 같은 고도로 정제된 CTC를 요구하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 고체상 가역적 고정 (SPRI) 정화는 코팅된 자기 비드를 사용하여 생성물의 역전사 (RT)-PCR로부터 생성된 cDNA에 대한 크기 선별을 수행하는 기술이다. 본원에 기술된 새로운 검정 방법에서, 이는 (a) 정확한 크기의 cDNA만 선별하고, (b) 액적의 안정성과 비양립성인 너무 강한 용해 세제를 제거하는 2중 목적을 달성한다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 소형 올리고뉴클레오티드 프라이머의 일련의 어닐링 및 리어닐링에 의해 공지된 DNA 단편을 증폭시켜 검출가능한 분자 신호를 초래하는 프로세스이다.
역전사 (RT)-PCR은 역전사를 사용하여 RNA 주형으로부터 상보적인 c-DNA 분자를 생성시키고, 이에 의해 DNA 폴리머라제 연쇄 반응이 RNA 상에서 작동하게 하는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 새로운 방법의 중요한 측면은 RNA를 파괴하거나 분해시킬 수 있는 방식으로 용해 또는 처리되지 않은 전체 세포 CTC로부터 고품질 RNA를 입수할 수 있는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "양성 액적"은 태그가 부착된 프라이머로 수행된 PCR 반응이 PCR 증폭 생성물의 가시화를 허용하는 지질-캡슐화 분자이다. 따라서, 특정한 표적화된 유전자의 단일 주형 cDNA 분자를 함유한 액적은 형광 현미경검사를 사용하여 가시적이게 될 수 있는 한편, "빈" 또는 "음성" 액적은 표적화된 cDNA를 함유하지 않는 액적이다.
새로운 방법 및 시스템은 수많은 장점 및 이점을 제공한다. 예를 들어, 현행 방법 및 시스템은 단독으로 사용되었을 때의 종래의 공지된 시스템 중 어느 하나보다 훨씬 더 정확하고 견실한 결과를 제공한다. 단일 CTC로부터의 신호를 단일 cDNA 분자로부터 각각 유래된 수백 또는 수천 개의 선명하게 형광성인 액적으로 분할함으로써, 새로운 디지털-CTC 검정법은 극적인 신호 증폭을 가능하게 한다. 본원에 기술된 바이오마커 유전자를 선택 및 최적화하는 것에서의 엄격한 기준을 고려하여, 정상 혈액 세포로부터의 배경 신호를 d-CTC에서 무시할 수 있다. 따라서, d-CTC는 암이 진행된 환자 (전립선암, 폐암, 유방암 및 간암 환자의 거의 100%)로부터 크게 증폭된 신호를 가능하게 한다. 점수가 양성인 환자의 비율이 유의하게 증가될 뿐만 아니라, 높은 수준의 신호가 암 요법 후에 종양 부담이 하락함에 따른 동적 측정을 가능하게 한다. 또한, 신호 증폭은 종양 부하가 심지어 매우 낮은 환자에서도 CTC-유래 시그너처의 검출을 허용하여 (CTC 세포 영상화로 쉽게 달성되지 않음), 암의 유의하게 더 이른 검출을 가능하게 한다.
요약하면, 이러한 신규 미세유체 플랫폼은 간소화되고, 처리량이 초고도이며, 신속하고 (예를 들어, 실행당 3시간), 민감도가 극도로 높은, 환자 혈액 샘플 내의 CTC 강화, 검출 및 분석하는 방법을 제공한다. 이러한 플랫폼은 풍부하고 임상적으로 이용할 수 있는 정보를 제공하고, 추가적인 최적화로 암의 조기 검출을 가능하게 할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 하기에서 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시적일 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특색 및 장점이 하기의 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다.
도 1A는 백혈구와 혼합된 LNCaP 전립선암 세포의 총 RNA로부터 제조되고, 2개의 상이한 전립선 프라이머 세트를 사용하여 액적 PCR에 의해 분석된 cDNA 희석물을 제시하는 그래프이다. 결과는 여러 순도를 나타내고, 이러한 범위에 걸친 양성 액적 수의 양호한 반응을 제시한다.
도 1B는 건강한 공여자 (HD)의 혈액 샘플 내로 스파이킹되고, CTC-i칩에 실행되었으며, 액적 RT-PCR (KLK3 프라이머 세트)에 적용된, 수동으로 단리된 LNCaP 세포의 그래프이다. 결과는 적은 수의 표적 세포까지 우수한 민감도를 제시한다.
도 1C는 CTC-i칩을 통해 프로세싱되고, 3개의 전립선-특이적 바이오마커 및 1개의 상피-특이적 바이오마커 (KLK3, AMACR, FOLH1, EpCAM)를 사용하는 RT-PCR 및 액적 분석에 적용된, 건강한 대조군, 국소화 (절제가능) 전립선암에 걸린 환자 및 전이성 전립선암에 걸린 환자로부터의 혈액 샘플의 분석을 제시하는 그래프이다. 결과는 조합된 4개의 마커 모두에 대한 액적의 총수/ml에 대해 제시된다.
도 2는 혈액 내로 스파이킹되고 CTC-i칩을 사용하여 회수된 LNCAP 전립선암 세포로부터 유래된 KLK3 양성 액적을 제시하는 신호 강도 플롯이다.
도 3은 CTC-i칩을 통한 샘플 프로세싱 후의 실험 사본 사이의 최소 변동 및 신호 유지를 제시하는 막대 그래프이고, 본원에 기술된 새로운 검정법을 사용한 검출 민감도 증가를 제시한다.
도 4는 본원에 기술된 새로운 CTC 디지털 액적 PCR 검정 방법 ("CTC ddPCR" 검정법 또는 간단히 "d-CTC" 검정법)을 사용하여 건강한 공여자에서 4개의 상이한 암-특이적 마커-양성 액적이 부재하는 것을 나타내는 신호 강도 플롯이다.
도 5는 혈액 내로 스파이킹된 전립선암 세포주를 검출하기 위한 4개의 상이한 계통 특이적 전사체에 대해 다중화된 d-CTC 검정법을 제시하는 신호 강도 플롯이다.
도 6A 내지 7B는 반응당 4개의 상이한 전립선암-특이적 전사체에 대해 다중화된 d-CTC 검정법을 제시하는 신호 강도 플롯이다. 반응 1 및 2의 2개의 이같은 반응에 대해 제시된 이론적 모델 (도 6A 및 7A) 및 암 세포주 데이터 (도 6B 및 7B) 둘 다가 이론적 모델이 실험 데이터를 정확하게 예측한다는 것을 실연한다.
도 8A 내지 13B는 반응당 4개의 상이한 유방암 및 폐암 특이적 전사체에 대해 다중화된 d-CTC 검정법을 제시하는 신호 강도 플롯이다. 각각 마커 조합이 상이한 반응 1 내지 6의 6개의 이같은 반응에 대해 제시된 이론적 모델 (도 8A, 9A, 10A, 11A, 12A, 및 13A) 및 암 세포주 데이터 (도 8B, 9B, 10B, 11B, 12B, 및 13B) 둘 다가 이론적 모델이 실험 데이터를 정확하게 예측한다는 것을 실연한다.
도 14는 비-증폭된 세포주 cDNA 1 ng 및 10, 14, 및 18 사이클의 특이적 표적 증폭(Specific Target Amplification: STA) 예비-증폭 후의 예비-증폭된 생성물 1 μl로부터의 7개의 상이한 바이오마커 (PIP, PRAME, RND3, PKP3, FAT1, S100A2, 및 AGR2)에 대한 액적 PCR 신호를 제시하는 막대 그래프이고, STA 예비-증폭으로부터 액적 PCR 신호가 유의하게 강화된다는 것을 실연한다.
도 15A 내지 15C는 폐암 (도 15A), 유방암 (도 15B), 및 전립선암 (도 15C)에 걸린 3가지 상이한 환자 세트에 대해 새로운 d-CTC 검정 방법을 사용하여 환자에서 CTC를 검출하는 것의 결과를 제시하는 그래프이다. 각각에서, 건강한 환자는 CTC가 없었다.
도 16은 도면에 열거된 9개의 바이오마커 (AGR2, Dual, FAT1, FOLH1, HOXB13, KLK2, KLK3, STEAP2, 및 TMPRSS2)에 대해 테스트하는 본원에 기술된 다중화 d-CTC 검정 방법을 사용한 환자 전립선암 데이터의 결과를 제시하는 수평 막대 그래프이다. 암 환자의 91 퍼센트가 검출가능한 CTC가 있었고 (11명의 환자 중 10명), 28개의 샘플 중 24개가 검출가능한 CTC를 함유하였으며 (86%), 12개의 건강한 공여자 (HD) 혈액 샘플 중 0개 (0 퍼센트)가 CTC를 함유하였다.
도 17은 전이성 전립선암 환자 (윗줄), 국소화 전립선암 환자 (가운뎃줄), 및 건강한 공여자 대조군 샘플 (아랫줄)로부터의 혈액 샘플에 대한 2개의 상이한 반응 (반응 1 (TMPRSS2, FAT1, KLK2, 및 STEAP2), 왼쪽 칼럼, 및 반응 2 (KLK3, HOXB13, AGR2, 및 FOLH1), 오른쪽 칼럼)에 대해 다중화된 d-CTC 검정법을 제시하는 일련의 신호 강도 플롯이다. 각각의 경우에, 건강한 공여자 (HD) 샘플에는 CTC가 없었지만, 암 샘플에는 CTC의 명확한 증거가 있었다.
도 18은 아비라테론(Abiraterone)®으로 치료된 전립선암 환자에서의 약물 반응의 판독을 제공하도록 경시적으로 측정된 CTC 내의 안드로겐 수용체 신호전달 유전자의 상대적 비율을 도해하는 다중 막대 그래프이다.
도 19A 및 19B는 비-증폭 대 18 사이클의 SMARTer 예비-증폭을 제시하는 그래프이다. 도 19A는 3개의 사본 (WTA1, WTA2, WTA3) 사이에서 일관적인 상이한 표적 영역에 대한 앰플리콘 증폭 효율의 수준을 제시하는 막대 그래프이다. 도 19B는 18 사이클의 SMARTer 예비-증폭을 사용하는 것이 예비-증폭되지 않은 샘플에 비교하여 대략 4 자릿수의 신호 증가 (108 대 104)를 제공한다는 것을 제시하는 그래프이다.
도 20A 내지 20C는 다중화 간암 검정법에서 11개의 마커를 테스트하는 것의 결과를 제시하는 그래프이다. 도 20A 내지 20C는 21명의 간세포 암종 (HCC) 환자 (도 20A), 13명의 만성 간 질환 (CLD) 환자 (도 20B, 유의한 검출가능한 액적이 없음) 및 15명의 건강한 공여자 (HD)(도 20C, 유의한 검출가능한 액적이 없음)에서의 총 액적 수를 제시한다.
도 21A 및 21B는 14개 마커 다중화 폐암 검정법의 결과를 제시하는 그래프이다. 도 21A는 8명의 전이성 폐암 환자 및 8명의 건강한 공여자 (모두 음성)에 대한 검정법 결과를 제시한다. 도 21B는 암 환자 (8명 중 8명)에서의 혈액 1 ml당 액적 카운트 모두가 모든 건강한 공여자에서보다 높았고, 이는 이러한 검정법에서의 100%의 검출률을 제공한다는 것을 제시한다.
도 22는 9명의 전이성 유방암 환자, 5명의 국소화 유방암 환자, 및 15명의 건강한 공여자의 필드에서 사용된 다중화 11개 마커 검정법에 대한 유방암 검정법의 결과를 제시하는 그래프이다. 결과는 검정법이 9명의 전이성 유방암 환자 중 7명, 5명의 국소화 유방암 환자 중 2명에서 암을 검출하고, 건강한 공여자 샘플에서는 암을 검출하지 않는다는 것을 제시한다.
도 23A 및 23B는 전이성 유방암 환자에서의 ARv7 검출의 결과를 제시하는 그래프이다. 도 23A는 본원에 기술된 바와 같은 CTC-칩을 통해 프로세싱된 10명의 전이성 유방암 환자 및 7명의 건강한 공여자로부터의 샘플에 대한 결과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 23B는 10개의 암 환자 샘플 중 5개가 건강한 공여자 배경 수준을 초과하여 10 중 5 또는 50%의 검출률을 제공하였음을 나타낸다.
도 24A는 34명의 흑색종 환자에서의 개별적인 마커 (PMEL, MLANA, MAGEA6, PRAME, TFAP2C, 및 SOX10) 및 조합된 마커 칵테일 (SUM)의 검출률을 나타내는 막대 그래프이다.
도 24B는 15명의 건강한 공여자에 비교된 바와 같은 182개의 채혈 시점에 대한 34명의 흑색종 환자에서 검출된 액적 신호의 도트 플롯 분포이고, 81% (채혈 시점을 기초로 함)의 건강한 공여자 배경 신호를 초과하는 전체적인 검출 민감도 및 100% (채혈 시점 기준)의 특이도를 실연한다.
본 개시내용은 혈액 샘플 내의 희귀 암 세포로부터 정보를 수득하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 이들 방법 및 시스템은 초고도-처리량 미세유체 기술, 예를 들어, 음성 고갈 기술, 예를 들어, 조혈 세포의 음성 고갈을 사용하는 기술과 같은 단리 기술이 혈액 샘플 내의 태그가 부착되지 않은 CTC를 단리하는 능력을 특이적 암 계통의 리보핵산 (RNA) 마커에 초점을 맞춘 액적-기반 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 검정법과 같은 분석 기술과 조합한다. 이러한 전략은 세포의 부분적 정제를 제공하는 다른 CTC 단리 기술 (예를 들어, 여과, 양성 종양 세포 선별)에 또한 적용될 수 있지만, RNA의 품질 및 따라서 검정법의 민감도가 미세유체 기술보다 열등할 것이다. 유사하게, RNA에 적용되는 다른 디지털 PCR 기술이 계통-특이적 프라이머를 검출할 수 있지만, 액적-기반 검정법의 민감도가 가장 높을 것이다.
본원에 기술된 새로운 방법은 혈액 내의 CTC의 존재를 기초로 암의 조기 검출에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 종양 부담 정량화에, 뿐만 아니라 경시적으로 특정 종양으로부터의 CTC를 모니터링하는데, 예를 들어, CTC에 존재하는 특이적 종양 마커 유전자에서의 임의의 잠재적인 변화, 뿐만 아니라 특이적 요법의 결과로서의 종양에서의 변화, 예를 들어, 임상 시험 또는 특정 요법의 상황에서의 변화를 결정하는데 또한 사용될 수 있다.
검정 방법의 일반적인 개념
예를 들어, 국제 PCT 출원 WO 2015/058206 및 문헌 [Ozkumur et al., "Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells", Sci . Transl . Med ., 5:179ra47 (2013)]에 예를 들어 기술된 소위 "CTC-i칩"과 같은 초고도-처리량 미세유체 기술을 사용하여, 혈액 샘플로부터 CTC를 강화하도록 단리 기술이 사용된다. CTC-i칩은 혈액 샘플 내의 WBC가 자기 비드로 표지된 후, 샘플이 2개의 강화 스테이지를 통해 프로세싱되는 CTC 항원-비의존적 접근법을 사용한다. 제1 스테이지는 결정론적 측방 이동을 사용하여 소형 및 가요성 세포/입자 (RBC, 혈소판, 미결합 자기 비드, 및 혈장)을 제거하는 한편 더 큰 세포 세포 (CTC 및 WBC)는 유지시킨다. 제2 스테이지는 관성 포커싱을 사용하여 모든 세포를 협소한 유체 흐름 내로 이동시킨 후, 자기장을 사용하여 비드-표지 WBC를 포커싱된 흐름으로부터 잡아당겨서, 고도로 강화된 CTC를 남긴다. 10 ml의 전혈로부터의 CTC-i칩 생성물은 전형적으로 < 500,000개의 RBC, < 5,000개의 WBC, 및 가변적인 수의 CTC를 함유한다.
일부 분석 기술은, 예를 들어, 액적 미세유체 기술을 사용하여, 단리된 CTC, 예를 들어, CTC-i칩으로부터 수득된 바와 같은 것을 추가로 강화하고 분석한다. 액적 미세유체 기술에 관한 일부 기본적인 정보가 일반적으로 문헌 [Jeremy et al., "Ultrahigh-Throughput Screening in Drop-Based Microfluidics for Directed Evolution", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:4004 (2010)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 실행에서, 액적 미세유체 기술은 단일 세포, RT-PCR 시약, 및 용해 완충제를 예를 들어, 약 0.5 pL 내지 15 nL의 부피, 및 예를 들어, 10 내지 300 μm, 예를 들어, 20 내지 100 μm, 예를 들어, 30 내지 50 μm, 예를 들어, 35 μm의 직경의 크기 범위의 전형적으로 비-수성인 액체 (예를 들어, 플루오로카본, 히드로플루오로카본, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 및 탄화수소 오일; 계면활성제, 예를 들어, 스팬80, 모놀레인/올레산, 트윈20/80, SDS, n-부탄올, ABIL EM90, 및 인지질 또한 비-수성 액체 내에 포함될 수 있음)의 액적 내로 캡슐화하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 기술된 새로운 방법에서 사용된 바와 같이, 이들 기술은 형광 신호를 생산하도록 액적 내의 암-특이적 전사체를 증폭시키는 것, 및 증폭-양성 액적을 분류하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 접근법은 진단 및 개별화된 약물 요법의 목적을 위해 시퀀싱 및 분석될 수 있는 순수한 CTC가 단리되는 것을 초래한다. CTC의 고도의 비균질성으로 인해, 가능한 한 많은 CTC를 검출하도록 다중화 증폭을 사용하는 것이 유용하다. 따라서, PCR 혼합물에서 한쌍의 프라이머를 사용하는 대신, 종양 특이적 프라이머의 조합물을 사용하여 CTC를 검출 및 분류할 가능성을 증가시킬 수 있다. 암 세포를 분류하기 위해 PCR을 사용하는 것에 대한 추가적인 정보를 위해, 예를 들어, 문헌 [Eastburn et al., "Identification and genetic analysis of cancer cells with PCR-activated cell sorting", Nucleic Acids Research, 2014, Vol. 42, No. 16 e128]을 참조한다.
새로운 검정 방법에서, CTC가 용해되어, 암 세포에서 발현되는 유전자를 나타내는 RNA 분자가 방출된다. 대부분은 암 특이적이기보다는 "계통" 특이적이고, 예를 들어, 임의의 전립선 세포 (암성 여부와 관계 없음)가 이들 마커를 발현한다. 그러나, 정상 혈액 세포는 그렇지 않고, 혈류 내에 순환 중인 세포로부터 신호가 유래된다는 사실은 이를 비정상적인 신호로서 정의한다. RNA를 cDNA로 전환시킴으로써, 본 발명자들은 이제 이러한 계통 신호를 PCR로 증폭시킬 수 있다. 본 발명자들은 월등하게 민감한 액적 디지털 PCR을 사용하여, 단일 암 세포로부터의 신호 (즉, 영상화 검정법에서의 1개의 신호)를 수천개의 양성 면역형광 액적으로 전환시키는 것을 허용한다. 다수의 고도로 큐레이션된 유전자 전사체의 조합은 암에 대한 고도의 민감도 및 특이도를 보증하고, 또한 기능적 통찰을 허용한다 (전립선암 및 유방암에서의 호르몬 반응성 경로의 상태에서와 같음).
언급된 바와 같이, 새로운 검정 방법은 DNA보다는 고품질 RNA의 검출 및 분석에 초점을 맞춘다. 혈장 및 CTC에서의 DNA 돌연변이 검출에 대한 상당한 연구가 있었지만, 본 발명의 방법은 하기의 이유로 RNA 마커에 의존적이다:
1. DNA 돌연변이는 종양 특이적이지 않고, 건강한 개체의 혈액 내에 약간의 식별되지 않은 암 세포가 있다는 발견은 매우 어려운 임상 상황이다. 대조적으로, 종양-특이적 RNA (예를 들어, 전립선 대 폐)를 선택함으로써, 새로운 방법은 혈액 내의 암 세포의 출처를 식별할 수 있다.
2. DNA 돌연변이는 매우 비균질적이고, 다수의 암이 공유하는 약간의 재발성 돌연변이를 제외하고, 대부분의 혈액-기반 돌연변이 검출 전략은 원발성 종양에 존재하는 돌연변이에 대한 선재 지식을 필요로 한다 (즉, 미지의 암에 대한 스크리닝에 적합하지 않음). 대조적으로, 특정 기관으로부터 유래된 모든 종양 세포는 RNA 수준에서 공통적인 계통 마커를 발현한다. 따라서, 단일한 마커 칵테일이 각각의 개별적인 유형의 암에 대해 새로운 방법에서 사용된다.
3. 전이가 확립되기 전 (즉, 혈액-기반 검출에 대해 너무 늦지 않음)에 침습성 암에서 낮은 수준의 CTC가 떨어지지만, 혈액 내의 종양 세포의 존재는 혈관 침습 (즉, 느리게 진행되기보다는 침습성인 암)을 암시한다. 이는 혈장 DNA 또는 혈장 단백질 마커의 경우에는 그렇지 않고, 이들은 원발성 종양 내의 죽어 가는 세포로부터 유출되고, 반드시 혈관 침습을 지시하지는 않는다. 예를 들어, 혈액 내의 혈청 PSA 단백질은 양성 전립선 세포, 뿐만 아니라 원발성 전립선암 둘 다에서 떨어진다. 반면에, PSA를 발현하는 CTC는 침습성 전립선암에서만 떨어진다.
4. 본원에 기술된 신규 디지털 채점 기술을 사용하는 RNA 분석은 월등하게 민감하다. 그러나, 유리 RNA는 혈류에서 분해되고, 본원에 기술된 바와 같은 단리 시스템, 예컨대 미세유체 음성 고갈 시스템 (예를 들어, CTC-칩 시스템)의 사용은 태그가 부착되지 않은 종양 세포에 추출가능한 고품질 RNA가 있다는 점에서 독특하다.
DNA에 비해 cDNA를 표적 분자로서 선택하는 것은 각각의 종양 세포로부터 기원하는 신호를 증진시킬 뿐만 아니라, 백색 혈액 세포 (WBC) 전사체를 제외하고 종양 세포 전사체만 특이적으로 표적화하기 위해 이루어졌다. CTC를 매우 높은 순도 수준으로 단리할 필요를 없게 하기 때문에, 신호 증진은 상당히 유리하다. 즉, 이는 동일한 생성물 내의 수백개 또는 수천개의 오염 WBC, 예를 들어, 백혈구로 여전히 둘러싸인 하나 이상의 "단리된" CTC를 함유하는 생성물로 견실하고 반복가능한 결과를 가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 새로운 방법에서 사용된 바와 같이 RNA로부터 만들어진 cDNA를 표적화하는 전략은 새로운 검정 방법이 종래의 접근법에 비교하여 최소 수준의 CTC 순도로 최대 특이도에 정교하게 맞춰질 수 있게 한다.
CTC-i칩 기술은 항체 태그가 부착된 백혈구의 미세유체 고갈에 의해 비-조혈 세포를 단리하는 것에서 고도로 효율적이다. CTC-i칩의 이러한 특색은 손상되지 않은 종양-유래 RNA를 (다른 기술을 사용하여 수득되는 것을 훨씬 초과하는 수준으로) 제공하고, 이는 종양 세포 표면 에피토프 (암 사이에서, 그리고 개별적인 암 내의 상피 대 중간엽 세포 하위유형 사이에서 고도로 비균질적임)와 무관하다. 더욱이, 심지어 세포의 항체 염색 및 선별이 영상화 분석에 최적이지 않은 프리-아폽토시스 암 세포도 본원에 기술된 방법을 사용하여 채점될 수 있는 종양-특이적 RNA의 출처를 제공할 수 있다. 모든 이들 이유로, 희귀 CTC와 함께 샘플 내에서 발견되는 WBC가 적어도 약간 감소되면서 무손상 CTC로부터 고품질 RNA를 제공하는 단리 기술 또는 시스템, 예컨대 미세유체 음성 고갈 시스템, 예를 들어, CTC-i칩은 종양-특이적 디지털 판독이 생성물에 적용되기 전의 중요한 제1 단계 단리이다.
비균질 혼합물 내의 극도로 희귀한 분자의 액적-기반 디지털 검출은 처음에는 비균질 혼합물 내에 존재할 때는 검출 수준 미만이지만 PCR에 적용되기 전에 액체 액적 내에 격리되었을 때는 쉽게 식별되는 개별적인 DNA 분자의 PCR 증폭을 위해 개발되었다. 액적-기반 디지털 PCR ("액적 디지털 PCR (Droplet Digital PCR (ddPCR))")에 대한 기초 기술이 레인댄스(RainDance) 및 바이오-라드(Bio-Rad)에 의해 상업화되었고, 이는 표적 분자의 액체 캡슐화에 이어지는 PCR 분석을 위한 설비를 제공한다. 이를 가능하게 만든 중요한 과학적 진보는 하버드(Harvard)의 데이비드 웨이츠(David Weitz) 및 존스 홉킨스(Johns Hopkins)의 베르트 보겔슈타인(Bert Vogelstein)의 실험실에서의 연구를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,767,512; 7,074,367; 8,535, 889; 8,841,071; 9,074,242; 및 미국 공개 출원 번호 2014/0303005를 참조한다. 미국 특허 번호 9,068,181을 또한 참조한다.
그러나, 액적 디지털 PCR 자체는 본원에 기술된 새로운 방법의 핵심인, 물질의 생물학적 출처와 커플링되지 않는 한 생물학적으로 유의하지 않다. 예를 들어, 계통-특이적 RNA (본 발명자들의 검출 전략의 중추적인 초점)의 검출은 정상적인 전립선 상피 세포와 암성 전립선 세포를 구별하지 않는다. 따라서, 혈액에서 전립선-유래 전사체가 검출되는 것은 의미가 없다: 이들은 엑소솜 또는 정상적인 전립선 세포로부터의 잔해물 내에 존재한다. 전체 CTC (즉, 혈액 내의 무손상 CTC)의 단리와 커플링될 때만 ddPCR 검정법이 월등한 민감도 및 특이도 둘 다를 달성한다. 따라서, 이들 2개의 기술은 서로에 대해 이상적으로 적절한데, 단리 시스템은 고품질 RNA를 제공하고, 액적-기반 디지털 PCR 검정법은 새로운 방법에서 RNA 마커에 초점을 맞추기 때문이다.
한 추가적인 측면이 새로운 검정 방법의 전반적인 성공에 중요하다. 언급된 바와 같이, 본원에 기술된 새로운 검정 방법은 총 RNA로부터 제조된 cDNA를 사용하지만, 이러한 사용의 핵심은 각각의 유형의 암에 대해 종양 계통-특이적이지만, 정상 혈액 세포에는 (심지어 ddPCR 민감도로도) 완전히 부재하도록 독특한 적절한 바이오마커의 식별이다. 본원에 기술된 각각의 유형의 암에 대한 다중 표적 RNA 바이오마커의 선택, 테스트 및 검증이 새로운 검정 방법의 성공을 가능하게 한다.
검정 방법 단계
새로운 검정 방법은 부분적으로 순수한 CTC를 단리 시스템, 예컨대 미세유체 음성 고갈 시스템을 사용하여 단리하는 것에서 시작하여, 액적 디지털 PCR 기기로부터의 데이터를 분석하는 것까지에 이른다. 8개의 주요 검정법 단계가 있고, 이 중 일부는 더 양호한 결과를 일반적으로 제공하지만 임의적이다:
1. 예를 들어 환자 또는 대상체로부터, CTC 및 혈액 내에 존재하는 다른 세포를 포함하는 생성물을 혈액 샘플로부터 단리하는 단계;
2. 희귀 세포-함유 생성물의 부피를 감소시키는 단계 (임의적);
3. 예를 들어, 세포 용해에 의해, 생성물로부터 리보핵산 (RNA) 분자를 단리하고, 예를 들어, 생성물 내에 함유된 세포로부터 방출된 RNA의 RT-PCR에 의해, 단리된 RNA로부터 용액 내의 cDNA 분자를 생성시키는 단계;
4. RT-PCR 단계 동안 합성된 cDNA의 정화 단계 (임의적);
5. cDNA를 유전자-특이적 표적화 예비증폭 프로브 (예를 들어, 플루이다임(Fluidigm)의 바이오마크(BioMark)™ 네스티드 PCR 접근법을 사용함), 또는 비-특이적 전체-트랜스크립톰 증폭 (예를 들어, 클론테크(Clontech)의 SMARTer™ 접근법을 사용함)을 사용하여 예비-증폭시키는 단계 (임의적);
6. 예를 들어 PCR 시약과 함께, cDNA 분자를 개별적인 액적에 캡슐화하는 단계;
7. 예를 들어 PCR을 사용하여, 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 CTC로부터의 cDNA에 특이적으로 결합하고 다른 세포로부터의 cDNA에는 결합하지 않도록 구성된 리포터 기의 존재 하에 증폭시키는 단계;
8. 액적 내에 CTC로부터의 cDNA 분자가 존재하는 것의 지시자로서 리포터 기를 함유하는 액적 (예를 들어, "양성" 액적)을 검출하는 단계; 및
9. 예를 들어, 환자 또는 대상체 내의 특정 질환의 존재를 결정하기 위해, 검출된 액적 내의 CTC를 분석하는 단계.
하기에 추가로 상세하게 기술되는 바와 같이, 새로운 d-CTC 검정 방법의 중요한 특색 중 하나는 우수한 민감도를 전달하면서 거의 완벽한 특이도를 동시에 유지하는 다수의 표적 유전자 바이오마커 (및 상응하는 프라이머)를 신중하게 선택하는 것이다. 공개적으로 입수가능한 데이터세트 및 사유 RNAseq CTC 데이터의 생물정보학 분석을 사용하여 본원에 기술된 표적 유전자 바이오마커의 독특한 목록 (하기 표 1)이 결정되었다. 어떠한 백혈구 하위집단에서도 발현되지 않지만 CTC에서는 충분히 높은 빈도 및 강도로 발현되어 합리적으로 광범위한 상이하고 별개인 환자들에서 신뢰할 수 있는 신호를 제공하는 마커를 매우 신중하게 선택하였다. 각각의 암 유형 (특히, 예를 들어 전립선암, 유방암, 흑색종, 폐암, 췌장암)에 대해 특정한 마커 세트를 선택하였다.
이제 검정 방법의 별개의 단계가 더욱 상세하게 기술될 것이다.
1. CTC 단리
환자 혈액을 CTC-i칩, 예를 들어, 버전 1.3M 또는 1.4.5T에 실행시키고, 샘플을 얼음 상의 15 mL 원뿔형 튜브에 수집한다. CTC-i칩은 기존에 기술된 바와 같이 디자인 및 제작되었다 (Ozkumur et al., "Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells", Science Translational Medicine, 5(179):179ra47 (DOI: 10.1126/scitranslmed.3005616) (2013)).
혈액 샘플 (암 환자당 ~ 20 ml)을 승인된 프로토콜을 사용하여 EDTA 튜브에 수집한다. 그 후, 이들 샘플을 CD45 (R&D 시스템즈(R&D Systems)) 및 CD66b (AbD 세로텍(AbD Serotec), 사내에서 비오틴화됨)에 대한 비오틴화 항체와 함께 인큐베이션하고 나서, 다이나비드(Dynabeads)® 마이원(MyOne)® 스트렙타비딘 T1 (인비트로젠(Invitrogen))과 함께 인큐베이션하여 백색 혈액 세포의 자기 표지를 달성한다 (Ozkumur et al., 2013).
그 후, 샘플을 CTC-i칩을 통해 프로세싱하고, 이는 혈액 성분 (적색 및 백색 혈액 세포 및 혈소판), 뿐만 아니라 미접합 비드를 CTC로부터 분리한다. CTC를 용액 내에 수집하는 한편, 적색 혈액 세포, 혈소판, 미접합 비드 및 태그가 부착된 백색 혈액 세포를 폐기 챔버에 수집한다. 이러한 프로세스는 자동화되고, 1시간에 10 ml의 혈액이 프로세싱된다.
2. 희귀 세포-함유 생성물의 부피 감소 및 보관
생성물 내에 단리된 모든 세포를 충분히 용해시키기 위해, 전형적인 수 밀리리터의 시작점으로부터 약 100 μl의 최종 부피로 생성물 부피를 감소시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 생성물을 원심분리하고, 세포 용해 및 cDNA 생성에 대비하여 플루로닉 완충제에 재현탁시킴으로써 이를 달성할 수 있다. 이러한 시점에, RNAlater™ (써모피셔(ThermoFisher))를 첨가한 후, 액체 질소에서 급속-동결시키고 -80℃에서 보관함으로써, 샘플을 장기 보관용으로 프로세싱할 수 있다.
3. 생성물 내의 세포로부터의 RNA 단리 및 cDNA 생성
RT-PCR에 대비하여 세포로부터 모든 RNA 분자를 충분히 방출시키기 위해 RNA 단리 단계가 프로세스에 중요하다. 1-단계의 튜브-내 반응을 사용하여 표준 전달 단계 동안 초래될 수 있는 세포 및 RNA 손실 위험을 최소화할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 마스터믹스를 펠릿화 생성물에 직접 첨가하고, 충분히 용해되도록 피펫팅하고, 1:1 RNA:cDNA 비를 표적화하는 키트 프로토콜에 따라 반응을 수행함으로써, qRT-PCR 키트용 수퍼스크립트(SuperScript) III® 퍼스트-스트랜드 신테시스 수퍼믹스(First-Strand Synthesis Supermix)® (인비트로젠)를 사용할 수 있다. cDNA가 합성되었으면, RNase H를 반응에 적용하여 임의의 잔존 RNA를 제거한다. 대안적으로, 이후 단계에서 샘플의 전체 트랜스크립톰 예비-증폭을 수행하는 것을 원하면, 사유 올리고뉴클레오티드 및 역전사효소를 사용하는 SMARTer™ 울트라 로우 인풋 RNA 키트(SMARTer™ Ultra Low Input RNA Kit) 프로토콜을 사용하여 cDNA를 합성할 수 있다.
4. RT- PCR 동안 합성된 cDNA의 정화
프로세스의 또 다른 유용한, 그러나 임의적인 단계는 cDNA-함유 용액으로부터 용해 시약을 제거하는 것을 수반한다. cDNA-함유 용액이 ddPCR 기기로 옮겨지면, 너무 강한 세제가 존재하는 것은 ddPCR 방법에서 사용되는 액적의 탈안정화를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 고체상 가역적 고정 (SPRI)을 사용하는 것을 통해, 세제 제거를 달성할 수 있다. 이러한 기술은 코팅된 자기 비드를 사용하여 특정 크기 범위의 cDNA에 먼저 결합시킨 후, 세제-함유 상청액을 제거할 수 있게 하고, 최종적으로, ddPCR 기기 내로 입력하기 위한 순수한 cDNA를 용출시킨다. RT-PCR의 정화에 더하여, SPRI 프로세스는 cDNA의 크기 선별을 또한 달성하고, 이는 프로세스의 ddPCR 단계에 진입하는 비-표적 cDNA 분자의 수를 감소시키며, 차례로 이는 배경 및 잡음을 감소시킨다.
5. 예비-증폭
cDNA의 예비-증폭은 액적 PCR 단계에서 검출될 수 있는 주형 분자의 수를 증가시키는 임의적 단계이고, 따라서 신호-대-잡음 비를 개선하고 양성 판독의 신뢰도를 증진시킨다. 이는 CTC에서 낮은 수준으로 발현되는 마커의 검출, 및 전이-전 질환의 조기 검출의 상황에서와 같이, 매우 적은 수의 아팝토시스성일 수 있는 CTC를 함유하는 샘플의 분석을 위한 매우 강력한 접근법일 수 있다. 이들 2개의 접근법이 d-CTC 검정법의 작업흐름에 적용되도록 변형되었다. 플루이다임 바이오마크™ 네스티드 PCR 프로토콜을 기초로 하는 특이적 표적화 증폭 (STA)은 액적 PCR 단계에서 사용되는 프로브가 표적화하는 영역을 증폭시키도록 특이적으로 디자인된 프라이머를 사용하는 것에 의존적이다 (표 2 참조). 이들 프라이머는 건강한 대조군에서의 잡음 증가 없이 효율적이고 특이적인 증폭을 확실히 하도록 이들의 각각의 형광 프로브와 함께 신중하게 디자인되고 테스트되었다. 대안적으로, SMARTer™ 울트라 로우 인풋 RNA 키트 프로토콜을 기초로 하는 전체 트랜스크립톰 증폭은 무작위 프라이머를 사용하여 WBC에서 발견되는 것 및 CTC에서 발견되는 것 둘 다를 포함하는 생성물 내의 모든 전사체를 증폭시키는 것에 의존적이다.
6. 액적 내의 cDNA 플러스 PCR 시약의 캡슐화
cDNA가 합성되고 오염 세제가 정제되었으면, 예를 들어, 액적 제조 기기, 예를 들어, 샘플당 20,000개의 액적을 생성시키는 바이오라드의 자동화 액적 생성기와 같은 액적 생성기에 의해, 용액 내의 cDNA 분자 + qPCR 시약의 전체 집합체를 다수의 구획화된 작은 반응으로 나눈다. 각각의 반응은 비-수성 유체, 예를 들어, 오일 (PCR 안정적이고, 예를 들어, 판매자로부터의 독점 제형)의 극소형 액적으로 이루어지고, 이는 유전자-특이적 프라이머 및 올리고뉴클레오티드 프로브가 있는 택맨(Taqman)-유형 PCR 시약, 및 소량의 샘플을 함유한다. 액적 생성이 완료되면, 샘플은 방대한 수의 개별적인 PCR-대비 반응을 함유하는 에멀션으로 이루어진다.
이러한 단계에 대해, 단일 또는 다중 반응에서, 종양 부하를 전반적으로 결정하기 위해, 예를 들어, 종양 진행 또는 요법에 대한 반응을 결정하기 위해 하기 표 1에 열거된 임의의 1개 또는 2개 이상의 상이한 표적 유전자에 대한 PCR 프로브 및 관련된 프라이머를 사용할 수 있다. 따라서, 일부 경우에 표 1로부터의 특정 유전자에 대한 단일 세트의 PCR 프라이머 및 프로브가 각각의 액적에 포함될 수 있지만, CTC에서의 유전자 발현의 비균질성을 고려하여, 종양 세포의 검출을 최대화하도록, 각각의 프라이머/프로브 세트에 대한 상이한 형광 프로브를 사용하여 각각의 액적에서 2개 이상의 상이한 유전자에 대해 PCR 프라이머 및 프로브를 다중화하는 것이 또한 가능하다. 각각의 액적에서 상이한 암 유형을 표적화하는 다중 유전자에 대해 PCR 프라이머 및 프로브를 다중화하고, 따라서 단일 검정법에서 다중 종양 유형을 광범위하게, 그러나 특이적으로 검출할 수 있게 하는 것이 또한 가능하다.
7. 액적에 캡슐화된 cDNA 분자의 PCR
qPCR 사이클링 조건을 사용하여 전제 에멀션 샘플에서 표준 PCR 사이클링을 수행한다. 대다수의 개별적인 액적-PCR 부피가 종점에 이르는 것을 보장하도록 반응을 45 사이클까지 수행한다. 이는 반응이 택맨-유형 qPCR 시약으로 수행되고 qPCR 조건 하에 사이클링되지만, 샘플의 형광 강도가 PCR 사이클링 동안에는 측정되지 않을 것이고 그보다는 다음 단계에서 측정될 것이기 때문이 중요하다.
8. 양성 액적 검출
임의의 형광 측정이 수행되기 전에 각각의 개별적인 구획화된 PCR이 충분히 종점에 이르기 때문에, 각각의 개별적인 액적은 충분히 형광성인 액적일 것이거나 또는 사실상 형광을 전혀 함유하지 않을 것이다. 이는 모든 양성 (형광) 및 음성 (비-형광) 액적을 간단하게 계수할 수 있게 한다.
9. 분석
상류 RT-PCR이 1:1 RNA:cDNA 비를 표적화하였기 때문에, 각각의 양성 액적은 단일한 기원 RNA 전사체를 나타내야 한다. 이러한 해석은 표적 cDNA 분자의 수를 훨씬 초과하는 개별적인 액적의 수에 의존적이다. 새로운 프로세스에서, 한 극한에서, 본 발명자들은 단일 CTC가 단리 및 용해되고, 몇개의 RNA 전사체가 방출된 후, 이것이 cDNA로 1:1 역전사되고, 구획화되고, PCR-증폭되고, 계수되는 가능성을 고려한다.
본 발명자들은 중등도로 발현되는 유전자, 예컨대 전립선암 세포에서의 KLK3 유전자의 경우에, 각각의 세포가 KLK3 mRNA의 대략 80-120개의 카피를 함유하는 것으로 추정한다. 바이오라드의 QX200 ddPCR 시스템은 20,000개의 액적을 생성시키고, 이는 적은 수의 단리된 CTC 및 중등도로 발현된 표적 유전자에 대해 결코 액적당 1개를 초과하는 표적 cDNA 분자가 존재하지 않을 것임을 보장한다. 반면에, CTC의 수가 수십개 또는 수백개에 도달하는 경우, 중등도로 발현되는 유전자에 대해, 액적당 다수의 표적 cDNA 카피가 있을 가능성이 있을 것이다. 이같은 경우에, 푸아송 통계를 사용하여 기원 전사체의 대략적인 수를 추정할 수 있다.
CTC의 계통-특이적 식별을 가능하게 하는 신규 유전자 패널
상기 논의된 바와 같이, 주변의 정상 혈액 세포의 상황에서 암 세포에 대해 고도로 특이적인 유전자 전사체를 식별하는 것이 새로운 방법에 중추적이다. 다수의 유전자가 암 세포에서 더욱 고도로 발현되는 것으로 공지되어 있는 한편, 또한 전형적으로 대다수의 이들 유전자는 혈액을 포함하는 정상 조직에서의 적어도 제한적으로 발현된다. 이러한 검정법에 요구되는 월등한 민감도를 고려하여, 신호가 정상 혈액 세포에서 완전히 부재하는 것이 혈류 내의 종양 세포를 높은 신뢰도로 식별하는데 필수적이다.
유방암, 전립선암, 폐암, 전립선암 및 간암 및 흑색종으로부터 유래된 공개적으로 입수가능한 유전자 발현 데이터 세트, 뿐만 아니라 유방암, 전립선암 및 췌장암 환자 및 이들 암의 마우스 모델로부터 단리된 CTC로부터의 본 발명자들의 실험실에서 생성된 단일 세포 RNASeq 데이터를 분석함으로써 혈액 내의 CTC를 검출하는데 사용되는 후보 종양-특이적 전사체를 먼저 선택한다. 전사체의 발현이 종양에 제한되고 혈액 성분에 부재하거나 혈액 성분에서 검출가능하지 않은 전사체를 추가적인 하류 분석용으로 선택한다. 정상 혈액 세포에서 발현의 총체적인 부재를 (최고 수준의 민감도로, 즉 디지털 PCR 검정법으로) 실연 및 검증하는 것이 중요하다. 일반적으로, 본 발명자들은 컴퓨터 모델 또는 RNA Seq 데이터를 기초로 예상된 후보 유전자의 오직 ~10%만이 인간 혈액 샘플에서 정말로 음성인 것을 발견하였다.
특히, 인간 유방암, 전립선암, 폐암, 전립선암, 간세포암 및 흑색종 암에 대해 기존에 유래된 유전자 발현 데이터 세트의 분석 (마이크로어레이 및 RNA-Seq)을 통해 CTC 검출을 위한 후보 종양-특이적 mRNA 전사체가 최초로 식별되었다. 이러한 분석에 사용된 구체적인 공개적으로 입수가능한 데이터 세트는 [The Cancer Genome Atlas] (TCGA) (더 캔서 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas), 온라인으로 tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp에서 입수가능함) 및 [Cancer Cell Line Encyclopedia] (CCLE) (온라인으로 broadinstitute.org/ccle/home에서 입수가능함; 문헌 [Barretina et al., The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity, Nature 483:603-607 (2012)]을 또한 참조함)를 포함한다. 추가적으로, 유방암, 전립선암 및 췌장암에 걸린 인간 환자로부터 단리된 CTC로부터의 단일-세포 RNA-seq 유전자 발현 데이터를 분석하였다 (GEO 등록 번호 GSE51827, GSE60407, 및 GSE67980) (문헌 [Aceto et al., Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis, Cell, 158:1110-1122 (2014)]; [Ting et al., Single-Cell RNA Sequencing Identifies Extracellular Matrix Gene Expression by Pancreatic Circulating Tumor Cells, Cell Rep, 8:1905-1918 (2014)]; 및 [Miyamoto et al., RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance, Science 349:1351-1356 (2015)]). 그 후, 이들 데이터베이스를 통해 식별된 종양 특이적 전사체를 인간 백혈구 RNA-Seq 유전자 발현 데이터 (GEO 등록 번호 GSE30811, GSE24759, GSE51808, GSE48060, GSE54514, 및 GSE67980)에 비교하였다. 그 후, 종양에서의 높은 발현 및 백혈구에서의 낮거나 검출가능하지 않은 발현으로 유의한 차별적 발현을 나타낸 전사체를 추가적인 하류 분석용으로 선택하였다. 또한, 문헌 검색을 수행하여 추가적인 후보 종양-특이적 전사체를 선택하였다. 인간 암의 각각의 유형에 대해 50 내지 100개의 후보 유전자가 선택되었다.
각각의 특이적 암 유형 내의 각각의 후보 유전자에 대해, 표적 전사체의 전역에 스패닝되도록 2 내지 4개의 PCR 프라이머 세트가 디자인되었다. IDT (인테그레이티드 DNA 테크놀러지즈(Integrated DNA Technologies))에 의해 프라이머를 합성하고, 프로브를 FAM 또는 HEX, ZEN, 및 IABkFQ로 표지하여 앰플리콘의 중앙부를 표적화하는 프로브를 생성시킨다. 인간 CTC에서의 디지털 PCR-기반 mRNA 전사체 검출의 성공적인 적용을 위한 본 발명자들의 PCR 프라이머 디자인 방법의 독특한 특색은 하기를 포함한다: 1) 특히 고정되지 않은 취약한 세포 예컨대 CTC에서, 5' 끝부분으로부터 분해되는 세포 mRNA 전사체의 성향을 고려하여, 각각의 mRNA 전사체의 3' 끝부분을 특이적으로 표적화함; 2) 예를 들어, 강화된 CTC 혼합물 내의 과도한 오염 백혈구로부터, 오염 게놈 DNA가 의도치 않게 증폭되는 것을 배제하기 위한, 인트론에 스패닝되는 앰플리콘을 생성시키는 프라이머의 디자인; 및 3) 특정 스플라이스 변이체의 임상적 타당성과 관련된 일부 경우의 불확실성을 고려한, 소정의 유전자의 다중 스플라이스 변이체를 포괄적으로 증폭시키는 프라이머의 디자인.
암 세포주 (유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 간암 및 흑색종을 나타냄)으로부터 유래된 cDNA를 사용하여 먼저 qRT-PCR에 의해 프라이머의 특이도를 테스트하였다. 인간 암의 각각의 유형에 대해, 2 내지 5개의 확립된 암 세포주를 배양하고, PCR 프라이머 성능을 평가하고 특정 암에서의 표적 전사체의 발현에 대해 평가하기 위한 초기 테스트에 사용하였다. 특이도의 초기 테스트를 제공하기 위해, 암이 진단되지 않은 건강한 개체로부터의 백혈구에서의 표적 전사체의 발현을 동일한 프라이머를 사용하여 평가하였다. 최소 5명의 상이한 건강한 개체로부터의 백혈구를 이러한 테스트 단계에서 테스트하였다 (혼합된 남성 및 여성 개체 - 이는 암 유형에 의존적이었다; 즉, 후보 전립선암 및 유방암 유전자는 각각 남성 또는 여성인 건강한 공여자만 이용하는 것을 요구하였음).
건강한 개체로부터의 백혈구를 제품에 삽입된 설명서에 따라 소듐 헤파린이 있는 세포 제조 튜브(Cell Preparation Tubes with Sodium Heparin: CPT) (벡톤, 디킨슨, 앤 캄파니(Becton, Dickinson, and Co.), 뉴저지)를 사용하여 전혈로부터 단리하였다. 암 세포주 및 단리된 백혈구에 대해 RNA 추출 및 제1 가닥 cDNA 합성을 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 각각의 유전자의 발현의 특이도 (각각의 유전자에 대해 2 내지 4개의 별개의 프라이머 세트를 사용함)을 qRT-PCR (양성 대조군으로서의 세포주 cDNA, 음성 대조군으로서의 건강한 공여자로부터의 백혈구 cDNA, 및 추가적인 음성 대조군으로서의 물)을 사용하여 테스트하였다. 그 후, qRT-PCR 테스트를 기초로 암 세포주에는 존재하지만 백혈구에는 부재하는 전사체를 액적 디지털 PCR에 의한 추가적인 검증용으로 선택하였다. 이러한 테스트 스테이지를 통과하는 선택 기준은 고도로 엄격하였고, qRT-PCR 신호가 적어도 하나의 암 세포주에 존재하고 테스트된 모든 건강한 공여자 백혈구 샘플에 부재할 것을 요구하였다.
테스트의 qRT-PCR 스테이지를 통과한 표적 전사체 및 특이적 프라이머 쌍을 액적 디지털 PCR을 사용하여 추가로 검증하였다. 이러한 테스트 스테이지를 위해, CTC-i칩 (예를 들어, 문헌 [Ozkumur et al., "Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells", Sci Transl Med, 5, 179ra147 (2013)] 참조)을 사용하여 건강한 개체가 헌혈한 전혈 샘플을 프로세싱하였다. CTC-i칩은 전혈로부터의 적색 혈액 세포, 혈소판, 및 백혈구의 음성 고갈을 수행하고, CTC (건강한 개체에 존재하지 않아야 함)를 포함하는, 백혈구 마커를 발현하지 않는 혈액 내의 세포에 대해 강화된 샘플 생성물을 생성시킨다. 각각의 혈액 샘플에 대해, CTC-i칩으로부터의 생성물에 RNA 안정화 용액 (RNAlater®, 라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))을 보충하고, 표준 방법을 사용하여 RNA 추출 및 cDNA 합성용으로 프로세싱하였다. 그 후, 액적 디지털 PCR (바이오라드, 캘리포니아주)을 사용하여, 테스트되는 특이적 프라이머 쌍을 기초로 각각의 샘플 내에 존재하는 전사체의 수를 정량화하였다. 이러한 테스트 단계 동안 액적 디지털 PCR로 평가된 샘플은 암 세포주로부터의 cDNA, CTC-i칩을 통해 프로세싱된 건강한 공여자로부터의 백혈구 cDNA (테스트되는 프라이머 쌍당 적어도 4명의 건강한 개체), 및 음성 대조군으로서의 물을 포함하였다.
액적 디지털 PCR 테스트를 통과하기 위한 기준은 엄격하였고, 하기를 포함하였다: 1) 암세포주에서 전사체 신호가 존재함 (적어도 하나의 세포주에 > 10개의 양성 액적이 있음); 2) 양성 액적과 음성 (빈) 액적 사이의 신호 분리로 표시되는 우수한 신호-대-잡음 비; 3) 건강한 공여자에서 액적 신호가 최소이거나 또는 부재함 (건강한 공여자당 < 3개의 액적); 및 4) 물에서 액적 신호가 부재함 (0개의 양성 액적).
그 후, 상기 액적 디지털 PCR 테스트에서 세포주에서 특이적으로 전사체를 증폭시키고 백혈구에서는 그렇지 않은 프라이머를 신호 민감도의 상세한 테스트에 적용하였다. 단일 세포 미세조작을 사용하여, 정확한 수의 암 세포 (1, 5, 10, 25, 및 50개의 세포)를 건강한 개체가 헌혈한 전혈 내로 스파이킹한 후, CTC-i칩을 통해 프로세싱하였다. 그 후, 각각의 샘플을 액적 디지털 PCR로 테스트하기 위해 상기와 같이 프로세싱하고, 신호가 원하는 임상 용도에 충분하였음을 보장하도록 민감도에 대해 평가하였다.
qRT-PCR 및 액적 디지털 PCR을 사용하여 후보 유전자 및 프라이머를 평가하는 상기의 엄격한 절차로 각각의 암 유형에 대한 50-100개의 후보 유전자 (총 대략 400개의 초기 후보 유전자)의 초기 목록의 대략 10%로 이루어진 최종 프라이머 목록이 초래되었다. 그 후, 이들 프라이머를 IRB-승인 임상 프로토콜 하에 수집된, MGH 암 센터(MGH Cancer Center)에서 암 치료를 받고 있는 암 환자가 헌혈한 혈액 샘플을 사용하여 환자 CTC에서의 신호에 대해 추가로 평가하였다. 평가의 이러한 부분의 핵심은 암이 진단되지 않은 건강한 개체로부터 수집된 혈액과의 비교이다. 하기 표 1은 액적 디지털 PCR을 사용하는 전립선암, 유방암, 간세포암, 췌장암, 폐암 및 흑색종 암에 걸린 환자로부터의 CTC의 특이적 검출을 위한 이들 방법을 사용하여 지금까지 개발된 프라이머 및 프로브를 열거한다.
각각의 암 유형에 대한 단일 유전자를 사용할 수 있지만, 각각의 패널 내에 다중 유전자가 존재하는 것이 민감도 (CTC는 심지어 개별적인 환자에서도 이의 발현 패턴 면에서 비균질적임) 및 특이도 (다중 유전자 신호의 검출은 이것이 진정한 암 세포 시그너처를 나타낸다는 부가적인 신뢰도를 부여함) 둘 다를 위해 유용하다.
하기 표 1에서 제공되는 유전자 목록은 특이적 유형의 암에 대해 독특한 전사체 (예를 들어, 전립선암 또는 유방암 또는 간암의 고도로 특이적인 마커), 뿐만 아니라 여러 암 유형, 예를 들어, 모든 상피암 유형이 공유하는 (따라서, 범-암 마커로서의 역할을 할 수 있는) 유전자, 및 특정 상태 (예를 들어, 전립선암에서의 활성 안드로겐 신호전달 또는 유방암에서의 활성 에스트로겐 신호전달)에서 유도되는 유전자를 포함한다. 따라서, 소정의 암 유형에 대한 최적의 민감도, 특이도 및 임상적으로 실행가능한 정보를 위해 디자인된 특이적 유전자 패널이 각각의 암 유형에 할당되었다.
추가적으로, 표 2에 기술된 프라이머는 표 1에 열거된 유전자 중 일부를 이들의 높은 특이도를 유지하면서 예비-증폭시키도록 디자인된다. STA가 선택 방법이면, 이들 네스티드 프라이머가 각각의 암 패널의 추가적인 성분이 된다.
상이한 유형의 암에 대한 유전자 목록
하기 표 1은 유전자 명칭 ((진뱅크(Genbank) ID) 및 서열 식별 번호 (SEQ ID NO)와 함께)의 목록을 이들이 선택적인 암 유형 (Br: 유방, Lu: 폐, Li: 간, Pr: 전립선, Panc: 췌장, Mel: 흑색종)과 함께 제공한다. 추가적으로, 디지털 PCR 생성물의 최적 가시화를 위한 형광 프라이머 프로브 (예를 들어, 태그가 부착된 프로브에 대한 6-FAM™ (청색 형광 표지) 또는 HEX™ (녹색 형광 표지), 및 ZEN-31ABkFQ 켄처)의 조성과 함께, 최적화된 프라이머 세트가 각각의 유전자에 대해 열거된다 (프라이머 1 및 2).
표 1
Figure 112017102947645-pct00001
Figure 112017102947645-pct00002
Figure 112017102947645-pct00003
Figure 112017102947645-pct00004
PRAME은 MAPE (종양에서 우선적으로 발현되는 흑색종 항원(Melanoma Antigen Preferentially Expressed In Tumors)), OIP4 (Opa-상호작용 단백질 OIP4(Opa-Interacting Protein OIP4)), 및 CT130 (암/고환 항원(Cancer/Testis Antigen) 130)으로도 명명된다는 것을 주지한다.
하기 표 2는 표 1에 열거된 프라이머가 표적화하는 영역을 특이적으로 예비-증폭시키도록 디자인된 네스티드 프라이머를 열거한다.
표 2
Figure 112017102947645-pct00005
Figure 112017102947645-pct00006
CTC -칩 생성물로부터의 유전자 전사체의 다중 디지털 분석
CTC로부터 유래된 최소량의 RNA로부터 종양-특이적 mRNA를 검출하는 것을 개선하기 위해, 본 발명자들은 미량의 CTC-칩 생성물로부터 다수의 상이한 유전자 전사체를 테스트할 수 있는 다중 검정법을 확립하였다. 이는 독립적인 다중 유전자를 사용하는 것의 더 높은 민감도/특이도를 입력 주형의 양이 제한된다 (따라서 다중 반응으로 희석되지 않아야 함)는 사실과 조합한다. 본 발명자들의 검정법은 반응당 4개의 유전자를 포함하고, 각각의 유전자는 상이한 비의 형광-접합 프라이머를 선택하는 것에 의해 2차원 공간에서 독자적으로 해상된다. 따라서, 단일 반응에서, 본 발명자들은 주형을 희석해야 하지 않으면서 4개의 유전자 전사체를 독립적으로 측정할 수 있다. 여러 암에 대해, 본 발명자들은 최대 4개까지의 상이한 반응 (즉, 20개까지의 상이한 유전자 전사체)에 도달하였고, 네스티드 RT-PCR 디지털 검정법의 적용으로, 수행될 수 있는 반응 수가 제한되지 않는다.
이러한 다중 전략은 다중 전사체를 분석하는 것 (따라서, 암 세포 발현 패턴에서의 비균질적인 변동에 대해 보장하는 것)과 그러나 독립적인 다중 PCR 반응을 수행함으로써 입력 물질을 희석하지 않는 것 사이의 이상적인 균형을 달성한다. 종양 유형 및 최적 신호에 요구되는 유전자의 수에 따라, 본 발명자들은 2-4개의 다중 반응 (각각의 다중 반응이 4-유전자에 대해 테스트함)의 범위에 이르는 검정법을 개발하였다. 따라서, 입력 주형의 과도한 희석 없이, 본 발명자들은 단일 CTC의 생성물을 8 내지 16개의 상이한 유전자 어느 곳의 발현에 대해 심문할 수 있다. 검정법이 이들 유전자 모두로부터의 신호 (즉, 누적 신호)를 합산할 수 있으면서, 또한 개별적인 유전자 결과가 있는 것 (개별적인 유전자 수준에서 신호/잡음을 최적화하고, 또한 각각의 유전자가 심문하는 특정 신호전달 경로 - 예를 들어 전립선 CTC에서의 안드로겐 신호전달 -로부터의 정보를 수집하기 위해)이 중요하다.
다중 반응의 결과를 단일 보기에서 디스플레이하기 위해 (따라서, 각각의 유전자의 증폭을 격리하여 구별하기 위해), 본 발명자들은 2개의 형광 프로브 (FAM (청색) 및 HEX (녹색))의 농도를 다르게 하였다. 이를 행함으로써, 각각의 개별적인 유전자 증폭 반응은 유전자-특이적 프라이머의 조성을 반영하는 FAM/HEX 신호의 독특한 조합을 갖고, 따라서 유전자-특이적 PCR 생성물을 식별한다. 2차원 공간에서, 본 발명자들은 단일한 다중 반응으로부터 생산된 4개의 상이한 유전자 증폭 생성물의 신호 위치를 도해할 수 있다. 각각의 PCR 반응을 캡슐화하는 액적을 사용하여 디지털 PCR에 적용됨에 따라, 이러한 방법은 양성 액적의 이진법 신호 진폭을 변형시키는 것에 의해 표적을 개별적인 클러스터 내로 분리하고, 이들이 정량적으로 디스플레이된다. 예상대로, 이러한 방법은 다중 유전자 (예를 들어, 총 4개의 반응에서의 16개의 마커)에 대한 총 신호의 누적 채점을 허용하면서, 또한 각각의 개별적인 유전자 표적으로부터의 신호를 정량화하는 능력도 유지한다.
구체적인 테스트 결과가 하기 실시예에서 상술된다.
d- CTC 검정 방법의 용도
수술로 절제될 수 있거나 또는 방사선이 조사될 수 있는 시기의 상피암의 조기 검출은 최상의 치유 기회를 제공하고, 암이 최소로 퍼진 환경에서 보조 화학요법을 투여하는 것은 확립된 전이성 질환의 치료보다 훨씬 더 효과적으로 치유를 달성한다. 그러나, 조기 암 검출에서의 현재의 노력은 특이도 결여의 문제가 있다. 예를 들어, 혈청 PSA 측정을 사용하여 전립선암에 대해 남성을 광범위하게 스크리닝하는 것은 조기 암을 밝히는데 효과적이지만, 훨씬 많은 수의 비-악성 전립선 상태 (예를 들어, 전립선의 양성 비대증) 또는 심지어 느리게 진행되고 결코 침습성이 될 예정이 없는 암을 또한 식별한다. 따라서, 공중 보건 기관이 폭넓은 PSA 스크리닝을 권장하지 않는데, 과다 진단으로부터의 합병증 (사망 포함)의 수가 조기 암 검출에서의 계산된 이점에 필적하거나 심지어 이를 능가하기 때문이다.
다른 암, 예컨대 유방암의 경우, 유방촬영술이 효과적인 것으로 간주되지만, 심지어 그렇다 하더라도 각각의 진정한 악성을 진단하기 위해 다수의 유방 생검이 수행된다. 폐암의 경우, 심한 담배 흡연 이력이 있는 개체를 최근에 권장되는 저선량 CT로 스캐닝하는 것은 각각의 진정한 악성에 대해 수백개의 무고한 방사선사진 이상을 검출할 수도 있다.
이러한 정황에서, 암 세포-유래 시그너처의 존재에 대한 혈액-기반 초고감도 판독을 추가하는 것은 요구되는 특이도를 제공할 것이다. 본원에 기술된 d-CTC 검정법은 초기 스크리닝용으로 및 또한 이후 시기의 더 이른 스크리닝의 입증으로서 둘 다로 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 검정법은 고도로 민감하지만 비특이적인 스크리닝 테스트 (예를 들어, 전립선암에서의 PSA)를 검증하기 위한 2선 테스트로서 사용될 수 있다. 암이 고도로 치사성이지만 현재 스크리닝 접근법이 존재하지 않는 다른 환경 (예를 들어, 췌장암)에서, 본원에 기술된 검정법을 사용하는 일상적인 주기적 혈액 스크리닝이 환자의 상태 또는 컨디션을 경시적으로 모니터링하는 기준이 될 수 있다.
새로운 d-CTC 판독은 환자, 예를 들어, 특정 암 유형의 가족력 및/또는 유전자 마커가 있는 겉보기에 건강한 환자, 또는 진행되거나 전이성인 암에 걸린 환자의 연속적인 모니터링에 또한 고도로 타당하다. 모든 요구되는 마커에 대해 적합하게 염색되는 무손상 세포가 단일 신호를 생산한다는 점에서 CTC 영상화는 비싸고 상대적으로 둔감하다. 각각의 CTC (얼마나 무손상이든 또는 프리-아팝토시스성이든)가 수백개의 분자성 신호를 발생시킬 수 있는 본원에 기술된 새로운 d-CTC 검정법을 사용하는 것은 공지된 암에 걸린 환자에서 CTC를 검출 및 모니터링하는 능력 및 치료적 개입에 대한 환자의 반응을 정량적으로 모니터링 및 분석하는 능력을 극적으로 강화한다. 분자 마커를 통해 세포 수를 채점하는 것을 넘어서, 돌연변이 또는 암-연관 재배열 (예를 들어, 폐암에서의 EML4-ALK)의 특이적인 심문이 유사한 민감도로 달성될 수 있다.
혈액 샘플 내에 존재하는 CTC의 디지털 (정량적) 측정을 제공하는 것에 더하여, 새로운 d-CTC 검정법은 혈액 내의 종양 세포에 독특한 특정 신호전달 경로의 분석을 또한 허용한다. 예를 들어, 전립선 계통-특이적 유전자의 한 하위집합이 안드로겐 신호전달에 의해 구동되는 한편 (예컨대 PSA), 또 다른 하위집합은 안드로겐 신호전달에 의해 억제된다 (예컨대 PSMA). 이들 유전자를 함께 분석함으로써, 본 발명자들은 CTC 내의 안드로겐 신호전달의 상태를 규명할 수 있다. 유사하게, 유방암에서, 에스트로겐-반응성 유전자 (예컨대 프로게스테론 수용체)의 발현이 CTC 내의 에스트로겐-반응성 경로의 상태의 척도를 제공한다. 이들 측정은 전립선암 및 유방암 둘 다에서의 치료적 개입이 각각 안드로겐 및 에스트로겐 수용체를 표적화하도록 유도된다는 점에서 특히 중요하다. 따라서, 결정적인 경로를 표적화하고 차단하는 것에서의 치료제의 유효성에 관한 정보와 동시에, 혈액 내의 CTC 신호의 총수를 정의하는 것이 치료적 모니터링에 중요하다.
하기 실시예에서 논의된 바와 같이, 항-안드로겐 작용제인 아비라테론 (예를 들어, 자이티가(ZYTIGA)®)이 암 진행을 억제하는데 효과적인 전립선암에서, 특히 안드로겐 경로에 여전히 의존적인 종양에서 본원에 기술된 새로운 방법이 설명된다.
실시예
본 발명이 하기 실시예에서 추가로 기술되고, 이는 청구항에 기술된 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 1 - 디지털 CTC 검정법의 예비 테스트 및 검증
CTC-칩-액적 검정법의 실행가능성을 테스트하기 위해, 먼저 본 발명자들은 전립선 종양 세포에서 특이적으로 발현되지만 오염 백혈구에는 부재하는 몇몇 전사체를 선택하였다. 이들은 전립선 계통 특이적 마커인 KLK3 (칼리크레인-관련 펩티다제; 일명 전립선 특이적 항원(Prostate Specific Antigen), 또는 PSA), FOLH1 (폴레이트 히드롤라제(Folate Hydrolase); 일명 전립선 특이적 막 항원(Prostate Specific Membrane Antigen), 또는 PSMA) 및 AMACR (알파-메틸아실-CoA 라세마제), 뿐만 아니라 EpCAM (상피 세포 부착 분자(Epithelial Cell Adhesion Molecule))이었다. 표준 qPCR 프로토콜에 따라 인테그레이티드 DNA 테크놀러지즈 (아이오와주 코랄빌)로부터의 인트론-스패닝 프라이머 및 ZEN 이중-켄칭 FAM-표지 프로브를 사용하여 PCR 조건을 최적화하였다. 시스템의 동적 범위를 조사하기 위해 이들 조건을 먼저 암 세포 및 백혈구의 혼합물로부터의 캡슐화된 cDNA로 테스트하였다. 다음으로, 개별적으로 세포를 선택하기 위한 수동 단리 기술을 사용하여, 0, 3, 6, 12, 25, 및 125개의 전립선암 LNCaP 세포를 개별적인 5 ml 분취량의 HD 혈액 내로 점진적으로 스파이킹한 후, CTC-i칩 프로세싱, RT-PCR 및 액적 캡슐화 (레인드롭(RainDrop) 시스템을 사용함)가 이어졌다. KLK3이 적당하게 풍부할 것으로 예측되기 때문에 본 발명자들은 이를 이러한 실험을 위한 표적 전사체로서 선택하였다. 5,000의 강도 역치를 사용하여, 본 발명자들은 KLK3 전사체의 값이 있는 적게는 3개의 세포가 대략 250개의 액적에서 쉽게 검출되었음을 발견하였다.
이들 예비 데이터를 기초로, 본 발명자들은 CTC-칩 액적 검정법을 전이성 및 국소화 전립선암에 걸린 환자 대 건강한 대조군에서 테스트하였다. 각각의 샘플을 i칩에 실행시킨 후, CTC-함유 생성물을 상기 언급된 4개의 전립선 마커인 KLK3, AMACR, FOLH1 및 EpCAM을 사용하여 액적 RT-PCR에 실행시켰다. 국소적 또는 전이성 전립선암에 걸린 환자에서 HD 대조군에 비교하여 유의하게 더 높은 양성 액적 카운트가 생산되었다.
도 1A는 백혈구와 혼합된 LNCaP 전립선암 세포의 총 RNA로부터 제조되고, 2개의 상이한 전립선 프라이머 세트를 사용하여 액적 PCR에 의해 분석된 cDNA 희석물을 제시한다. 결과는 여러 순도를 나타내고, 이러한 범위에 걸친 양성 액적 수의 양호한 반응을 제시한다.
도 1B는 HD 혈액 샘플 내로 스파이킹되고, i칩에 실행되었으며, 액적 RT-PCR (KLK3 프라이머 세트)에 적용된, 수동으로 단리된 LNCaP 세포를 제시한다. 결과는 적은 수의 표적 세포까지 우수한 민감도를 제시한다.
도 1C는 CTC-i칩을 통해 프로세싱되고, 3개의 전립선-특이적 바이오마커 및 1개의 상피-특이적 바이오마커 (KLK3, AMACR, FOLH1, EpCAM)를 사용하는 RT-PCR 및 액적 분석에 적용된, 건강한 대조군, 국소화 (절제가능) 전립선암에 걸린 환자 및 전이성 전립선암에 걸린 환자로부터의 혈액 샘플의 분석을 제시한다. 결과는 조합된 4개의 마커 모두에 대한 액적의 총수/ml에 대해 제시된다.
이들 결과는 액적-기반 PCR 판독을 CTC-i칩에 적용하는 것이 생물학적 검체 내에 존재하는 사실상 모든 CTC를 검출하는 것에서 이의 민감도를 크게 강화한다는 것을 시사한다. 종합적으로, CTC-i칩 및 액적-PCR은 서로 고도로 양립성인 2개의 강력한 미세유체 기술을 나타내고, 고도로 민감하고 정확한 새로운 생물학적 검정법을 생성하도록 일렬로 통합될 수 있다.
실시예 2 - 디지털 CTC 검정법 프로토콜
본 실시예는 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있는 일반적인 디지털 CTC 검정법 프로토콜을 제공한다. 이러한 일반적인 프로토콜의 상이한 측면이 본원에 기술된 실시예 중 일부에서 사용되었다. 예를 들어, 하기 기술된 프로토콜의 단계 3 (RNA 정제에서 cDNA 합성까지에 관련됨)의 접근법 1은 도 15A 내지 15C의 데이터를 생성시키는데 사용되었다. 단계 3에서의 접근법 2는 도 19A 내지 24B에 대한 데이터를 생성시키는데 사용되었다.
1. 환자 혈액을 I-칩, 버전 1.3M 또는 1.4.5T에 실행시킨다. 샘플을 얼음 상의 15 mL 원뿔형 튜브에 수집한다.
2. 샘플을 4℃에서 스피닝으로 침강시킨다. 상청액을 경사분리하고, 수퍼라제™ 인(SUPERase™ In) (DTT 비의존적 RNAse 억제제) + RNALater® 안정화 용액 (RNAse를 억제함으로써 RNA 분해를 방지함)을 펠릿에 첨가한다. 샘플을 급속 동결시키고, 추가적인 프로세싱까지 -80에서 보관한다. 샘플은 -80에서 안정적이다.
3. 하기 기술된 실시예에서 사용된, RNA 정제에서 cDNA 합성까지를 위한 2가지 상이한 프로세싱 프로토콜이 있다.
접근법 1
a. 샘플을 얼음 상에서 해동시켰다.
b. 세제 (NP40, 트윈20)를 사용한 직접적인 샘플 용해.
c. 용해된 샘플을 바로 cDNA 합성 (수퍼스크립트 III)용으로 취했다.
d. cDNA 합성 후 - 샘플을 SPRI (에이젠코트(Agencourt) AMPure® XP 비드) 정화를 통해 정제하여, 세제 및 임의의 <100 bp의 뉴클레오티드를 정화하였다.
접근법 2
a. 샘플을 얼음 상에서 해동시켰다.
b. 샘플을 RNeasy 퀴아젠 마이크로 키트(RNeasy Qiagen Micro Kit) 상에서 프로세싱하였다. 전통적인 퀴아젠 권고에 비교하여 프로토콜에 약간의 근소한 변동이 있다. 더 높은 부피의 완충제 RLT (용해 완충제), 뿐만 아니라 더 높은 ETOH 농도를 사용하였다. 샘플에 RNALater®를 첨가하는 것으로 인해 이들 변형이 이루어졌다.
c. cDNA 합성 후 - 샘플을 SPRI (에이젠코트 AMPure XP 비드) 정화를 통해 정제하여, 세제 및 임의의 < 100 bp의 뉴클레오티드를 정화하였다.
4. cDNA (접근법 1 또는 2로부터 합성됨)를 2가지 상이한 방식으로 프로세싱할 수 있다:
a. cDNA를 ddPCR에 직접 사용하였다; 또는
b. cDNA를 플루이다임의 바이오마크™ 네스티드 PCR 접근법을 사용하여 증폭시켰다 (네스티드 PCR에 사용된 유전자로부터의 프라이머가 예비-검증되었음). 증폭된 cDNA를 희석하였다.
5. cDNA (단계 4a 또는 4b로부터의 것), 프로브에 대한 바이오라드의 수퍼믹스(Supermix)™, 프라이머 또는 프라이머들 (관심 유전자에 대해, 4개까지의 상이한 프라이머 (FAM 및 HEX)가 다중화될 수 있음)을 22 μl의 총 부피에 첨가하였다.
6. 액적이 생성되었다 (웰당 ~15,000-18,000개의 액적).
7. 액적 샘플을 PCR 기계에 놓았다. PCR 조건이 바이오라드의 권고와 상이하였다. 본 발명자들은 모든 액적이 동일한 온도에 도달하는 것을 보장하기 위해 완만한 경사로보다는 스텝-다운을 사용하였다. 이는 레인댄스 및 바이오라드 둘 다가 사용하는 것과 상이하다. 구배보다는 스텝-다운으로 더 양호한 결과 (즉, 더 많은 신호, 및 양성 액적과 음성 액적 사이의 더 많은 분리)가 수득될 수 있다.
8. PCR 후, ddPCR 기계에서 양성 액적을 카운팅하였다.
9. 데이터를 수집하고, 팁코(TIBCO)® 스팟파이어(Spotfire)® 분석 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
시약, 시약 농도, 및 반응 부피가 하기에서 제공된다:
시약:
Figure 112017102947645-pct00007
바이오라드의 프로브용 ddPCR™ 수퍼믹스 (dUTP 없음)
Figure 112017102947645-pct00008
IDT 프라이머/프로브 (20x 또는 40x)
Figure 112017102947645-pct00009
cDNA (세포주에 대해 1 ng/ul)
Figure 112017102947645-pct00010
뉴클레아제 무함유 물
Figure 112017102947645-pct00011
에펜도르프의 세미-스커트 96웰 플레이트 (이들 플레이트만 기계에서 작동됨)
관련 세포주 테스트
단일 반응 당:
ddPCR 수퍼믹스 11.0 μl
프라이머 (20x) 1.10 μl
cDNA (1 ng/ul) 1.10 μl
물 8.80 μl
총계 22.0 μl/웰
ddPCR 수퍼믹스, cDNA 및 물을 함유하는 마스터-믹스를 웰 내로 분취하고, 1.1 μl의 각각의 프라이머를 각각의 웰에 첨가하고, 잘 혼합하였다.
환자 샘플
개별적인 유전자에 대한 단일 반응당
ddPCR 수퍼믹스 11.0 μl
프라이머 (20x) 1.1 μl
cDNA ( 환자) 최대 9.9 μl (더 적으면 물로 균형을 맞춤)
총계 22.0 μl/웰
다중 유전자에 대한 단일한 다중화 반응당
ddPCR 수퍼믹스 11.0 μl
프라이머 1 (40x) .55 μl
프라이머 2 (40x) .55 μl
프라이머 3 (40x) .55 μl
프라이머 4 (40x) .55 μl
cDNA ( 환자) 8.8 μl
총계 22.0 μl/웰
유전자-특이적 프라이머 또는 다중 유전자에 대해 다중화 프라이머에 대해 다중 환자를 테스트할 때, ddPCR 수퍼믹스 및 프라이머를 포함하는 마스터-믹스를 웰 내로 분취한 후, 환자 cDNA를 각각의 웰에 첨가하고, 잘 혼합하였다.
실시예 3 - 유전자 검증용 프로토콜
하기 프로토콜을 표 1에 열거된 특이적 마커 유전자를 선택하는데 사용하였다.
1. CTC에 독특하고 백색 혈액 세포 (WBC), 백혈구 등에서는 발현되지 않는 전사체를 생물정보학적으로 마이닝하였다 - 원발성 종양 및 CTC 유전자 발현 데이터를 WBC 유전자 발현 데이터세트에 비교하여 원발성 종양 및/또는 CTC에만 존재하는 전사체를 단리하였다.
2. 역치 차단값을 통과한 전사체를 qPCR에 의해 검증하였다.
3. IDT에 의해 프라이머를 합성하였다. 프로브를 FAM/ZEN/IBFQ로 표지하였다.
4. qPCR 검증은 모든 전사체가 적어도 2개의 독립적인 프라이머 세트에 의해 2개의 상이한 세포주, 5명의 건강한 공여자의 WBC (CPT 칼럼을 통해 단리됨) 및 음성 대조군으로서의 물에서 검증되는 것을 요구하였다. 50 사이클의 qPCR을 사용하여, 전사체 발현이 세포주에만 존재하고 건강한 공여자에는 존재하지 않았음을 확증하였다.
5. qPCR 검증을 통과한 전사체를 (세포 스파이킹과 함께 또는 세포 스파이킹 없이) CTC-i칩에 통과된 건강한 공여자 및 세포주로 ddPCR에서 검증하였다.
6. 관심 질환에 따라 전사체의 패널을 다중화하였다 (반응당 4개까지의 상이한 유전자).
하기에서 이러한 전략의 타당도가 신중하게 측정된 수의 종양 세포 (LNCAP 전립선암 세포주로부터의 것)를 개별적으로 미세-조작하고, 대조군 혈액 검체에 첨가하고, CTC-i칩에 통과시킨 후, 상기와 같은 d-CTC 검정법으로 분석하는 스파이킹된 세포 실험에서 제시된다. 이러한 프로토콜의 능력을 도해하는 도 2에 제시된 바와 같이, 스파이킹된 세포 수의 증가가 디지털 신호 수의 증가를 제시한다. 도 2는 단일 유전자 전사체 (전립선암에 대한 KLK3, 일명 PSA)의 프로브로서의 용도를 실연한다 (검정법에서, 본 발명자들은 8-24개의 유전자 전사체를 사용하고, 이에 의해 민감도를 추가로 증가시킴). 여기에서, 본 발명자들은 계산된 수의 암 세포를 스파이킹한다 (각각의 세포를 미세-조작하고, 채집하고, 10 ml의 대조군 혈액 검체 내로 도입함). 그 후, 혈액을 CTC-칩을 통해 프로세싱하고, 상기 기술된 바와 같은 디지털 판독에 적용한다. 단일 암 세포가 스파이킹되지 않은 혈액에서는 신호가 관찰되지 않는다. 2개의 세포/10 ml의 혈액의 도입이 명확한 신호 (65개의 양성 액적)를 생성시킨다. 이러한 경우에, 10개의 CTC 생성물을 4개로 나누어 4중으로 실행시켰고, 따라서 64개의 액적은 실제로는 종양 세포의 ¼로부터 유래된 디지털 신호를 나타낸다.
이러한 검정법은 고도의 민감성 및 재현성 둘 다를 갖는다. 도 3에 제시된 바와 같이, 이들 스파이킹된 세포 실험에서의 디지털 신호는 고도의 재현성을 제시하고 (2개의 독립적인 사본이 제시됨), 세포가 (혈액보다는) 완충제 내로 스파이킹되고 직접적으로 (CTC-칩 프로세싱 없이) 분석된 경우에 동일한 양의 신호가 나타난다. 따라서, 종양 세포가 수십억개의 정상 혈액 세포 내로 희석된 후, 디지털 판독 전에 CTC-칩을 사용하여 "재-단리"될 때 사실상 신호 손실이 없다.
실시예 4 - CTC -칩 생성물로부터의 유전자 전사체의 다중 디지털 분석
본 발명자들은 미량의 CTC-칩 생성물로부터 많은 상이한 유전자 전사체를 테스트할 수 있는 다중 검정법을 확립하였다. 이는 독립적인 다중 유전자를 사용하는 것의 더 높은 민감도 및 특이도를 입력 주형의 양이 제한된다 (따라서 다중 반응으로 희석되지 않아야 함)는 사실과 조합한다. 새로운 검정법은 반응당 다수의 유전자, 예를 들어, 2, 3, 4, 6, 8, 10개 이상의 유전자를 포함하고, 각각의 유전자는 상이한 비의 형광-접합 프라이머를 선택하는 것에 의해 2차원 공간에서 독자적으로 해상된다. 따라서, 단일 반응에서, 주형을 희석해야 하지 않으면서 2, 3, 4개 이상의 유전자 전사체를 독립적으로 측정할 수 있다. 상이한 암에 대해, 상이한 다중 반응을 실행하여 분석할 수 있고 (예를 들어, 4회의 실행에서 20개까지의 상이한 유전자 전사체), 네스티드 RT-PCR 디지털 검정법의 적용으로, 수행될 수 있는 반응 수가 제한되지 않는다.
다중 반응의 결과를 단일 보기에서 디스플레이하기 위해 (따라서, 각각의 유전자의 증폭을 격리하여 구별하기 위해), 본 발명자들은 2개의 형광 프로브 (FAM 및 HEX)의 농도를 다르게 하였다. 이를 행함으로써, 각각의 개별적인 유전자 증폭 반응은 유전자-특이적 프라이머의 조성을 반영하는 FAM/HEX 신호의 독특한 조합이 있고, 따라서 유전자-특이적 PCR 생성물을 식별한다. 2차원 공간에서, 본 발명자들은 단일한 다중 반응으로부터 생산된 4개의 상이한 유전자 증폭 생성물의 신호 위치를 도해할 수 있다. 각각의 PCR 반응을 캡슐화하는 액적을 사용하여 디지털 PCR에 적용됨에 따라, 이러한 방법은 양성 액적의 이진법 신호 진폭을 변형시키는 것에 의해 표적을 개별적인 클러스터 내로 분리하고, 이들이 정량적으로 디스플레이된다. 예상대로, 이러한 방법은 다중 유전자 (예를 들어, 총 4개의 반응에서의 16개의 마커)에 대한 총 신호의 누적 채점을 허용하면서, 또한 각각의 개별적인 유전자 표적으로부터의 신호를 정량화하는 능력도 유지한다.
프로브 1: 100% FAM
프로브 2: 100% HEX
프로브 3: FAM 및 HEX의 혼합물 - 합계 100%
프로브 4: FAM 및 HEX의 혼합물 - 합계 100%
표 3 내지 7에 제시된 바와 같이, 하기 프로브 혼합물을 다중 반응에서 사용하였다:
표 3
반응당 4개의 유전자에 대한 다중화 프라이머 (흑색종)
Figure 112017102947645-pct00012
표 4
반응당 4개의 유전자에 대한 다중화 프라이머 (범- 암 /계통)
Figure 112017102947645-pct00013
표 5
반응당 다수의 유전자에 대한 다중화 프라이머 (전립선에서의 AR 상태)
반응당 4개의 유전자에 대한 다중화 프라이머 (전립선)
Figure 112017102947645-pct00014
표 6
반응당 4개의 유전자에 대한 다중화 프라이머
상피- 중간엽 이행 ( EMT )
Figure 112017102947645-pct00015
표 7
반응당 다수의 유전자에 대한 다중화 프라이머
Figure 112017102947645-pct00016
검증 및 테스트
이러한 다중 전략의 유효성을 검증 및 실연하기 위해, 본 발명자들은 개념 (스파이킹된 세포 실험을 사용함) 및 환자-유래 샘플 둘 다를 설명하였다. 도 4는 CTC-칩을 통해 건강한 공여자 (HD)로부터의 정상 대조군 혈액 샘플을 프로세싱하고 4개의 상이한 유전자 전사체에 대해 d-CTC 검정법에 적용한 것의 결과를 제시하고, 이들 모두는 음성이다 (즉, 빈 액적).
반면에, 도 5는 혈액 내로 도입되고, CTC-칩을 통해 프로세싱된 후, 디지털 검정법이 행해진 전립선암 세포주가 4개의 계통 전사체 각각에 대해 양성 신호 (형광 액적)을 나타냈다는 스파이킹된 세포 실험으로부터의 데이터를 제시한다. 2개의 프로브의 상이한 형광 (도면에 코딩된 색상)을 기초로, 이들은 2차원 플롯 내의 별개의 위치에서 나타났다. 샘플에 종양 세포가 과부하됨에 따라, 일부 액적은 1개를 초과하는 유전자 전사체로부터의 신호를 함유하였다 (액적당 다수의 유전자는 회색으로 제시됨).
특이적인 계통 마커를 각각의 종양 유형에 대해 대체하여, 각각의 반응 내에 4개의 상이한 유전자를 나타내는 전략이 여러 상이한 암에 적용될 수 있었다. 예를 들어, 전립선암에서, 본 발명자들은 2개의 반응 각각에 대한 4개의 4분체 (4분체당 1개의 유전자)가 있는 다중 반응 (총 8개의 유전자 마커)을 예상하였다 (이론적 모델). 스파이킹된 세포 실험 (대조군 혈액 내로 도입되고 CTC-i칩을 통해 프로세싱된 전립선암 세포)이 예상 결과를 정확하게 반복하였다.
또한, 도 6A-6B 및 도 7A-7B는, 함께 조합되었을 때, 본 발명자들의 분석 프로그램이 4분체 내의 모든 양성 신호를 통합하였음을 제시하고, 이는 모델링에서 예상된 그대로이고, 본 발명자들이 특이적 유전자 신호를 채점하는 방법을 개발하게 허용한다. 신호의 다차원 공간 분석이 자동 분석 및 높은 정확도 수준로 채점하는 것을 허용하였다. 도 6A 및 6B는 반응 1에 대한 전립선암 세포주에 대한 이론적 모델 및 실제 결과를 각각 제시하고, 도 7A 및 7B는 반응 2에 대한 동일한 전립선암 세포주에 대한 이론적 모델 및 실제 결과를 각각 제시한다.
도 8A-8B (유방암 및 폐암의 이론적 및 실제 결과, 반응 1), 9A-9B (유방암 및 폐암의 이론적 및 실제 결과, 반응 2), 10A-10B (동일, 반응 3), 11A-11B (동일, 반응 4), 12A-12B (동일, 반응 5), 및 13A-13B (동일, 반응 6)는 동일한 접근법이 유방암 및 폐암에 사용되었을 때의 결과를 도해한다. 본 발명자들은 하기에 제시된 바와 같이 (유방암 및 폐암 세포 둘 다의 스파이킹된 세포 실험을 사용하는 이론적 대 검증), 6개의 반응 (총 24개의 마커에 대해 각각의 반응 내의 4개의 유전자 마커)으로서, 대부분의 선암종 (즉, 유방암 및 폐암을 함께 분류함)이 공유하는 마커를 식별하는데 효과적인 다중-암 패널을 확립할 수 있다.
이들 도면은 다중 방식 (반응당 4개의 유전자)으로 다중 유전자 전사체를 테스트하는 동일한 접근법이 유방암에 적용되었을 때의 결과를 제시한다. 6개의 상이한 반응을 동일한 CTC 칩 생성물에서 수행하였고 (총 24개의 유전자 전사체가 독립적으로 테스트될 수 있게 함), 이때 각각이 지정된 신호 위치가 있고 (상부 패널에서 예상됨), 스파이킹된 세포 검증 실험에서 관찰된다 (하부 패널에서 관찰됨).
실시예 5 - 종양-특이적 mRNA의 검출을 개선하기 위한 표적-특이적 예비-증폭
종양 특이적 RNA의 검출을 개선하기 위해, 네스티드 PCR 전략을 각각의 유전자-특이적 증폭에 대해 최적화하였다. 이를 달성하기 위해, 먼저, CTC로부터 유래된 cDNA를 d-CTC 검정법에 사용되는 유전자-특이적 프라이머에 대해 수개의 염기쌍 바깥쪽에 위치하는 유전자-특이적 프라이머로 증폭시켰다. 각각의 유전자에 대해, 2개 내지 3개의 프라이머 세트를 테스트하였고, 유전자-특이적 d-CTC 검정법 프라이머와 양립성이고 HD 혈액에서 음성으로 테스트되는 프라이머 세트를 환자 샘플의 분석용으로 선택하였다.
상기 기술된 바와 같이, 먼저 표적 특이적 증폭 프로토콜을 상이한 암으로부터 유래된 세포주에서 테스트하였다. 그 후, 종양 세포에 대해 특이적인 (그리고 백혈구에는 부재하는) 프라이머 조합을 혈액 내로 혼합되고 CTC-i칩을 통해 강화된 암 세포주의 혼합물로 테스트하였다. CTC-i칩을 통해 프로세싱된 HD 혈액을 대조군으로서 사용하였다. 이러한 전략의 핵심은 정상 혈액 세포로부터의 최소 기준선 신호를 증가시키지 않으면서, 미량의 CTC-유래 cDNA로부터의 신호를 증강시키는 네스티드 PCR 조건을 디자인하는 것이다. PCR 프라이머 서열 및 검정법 조건을 신중하게 최적화하는 것, 뿐만 아니라 외부 및 내부 PCR에 대한 사이클 횟수를 균형잡는 것에 의해 이러한 선택성이 달성되었다. 모든 조건을 먼저 정제된 핵산으로, 그 후 대조군 혈액 샘플 내로 스파이킹되고 CTC-i칩을 통해 프로세싱된 개별적인 종양 세포로, 그 후 상이한 건강한 혈액 공여자의 대형 패널 (>10명)로, 그리고 궁극적으로 전립선, 유방, 흑색종, 간, 폐 또는 췌장의 전이성이거나 국소화된 암에 걸린 환자로부터의 환자-유래 혈액 샘플로 검증한다.
시약
Figure 112017102947645-pct00017
DNA 현탁 완충제 (10 mM 트리스, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) (테크노바(TEKnova), PN T0221)
Figure 112017102947645-pct00018
0.5 EDTA, pH 8.0 (인비트로젠, PN Am9260G)
Figure 112017102947645-pct00019
택맨 프리앰프 마스터 믹스(TaqMan PreAmp Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), PN 4391128)
Figure 112017102947645-pct00020
뉴클레아제-무함유 물 (테크노바, PN W330)
10X 특이적 표적 증폭 ( STA ) 프라이머 믹스의 제조
1.) DNA-무함유 후드에서, 0.5 μl의 각각의 200 μM 프라이머 쌍 (0.5 μl 정방향 프라이머 및 0.5 μl 역방향 프라이머)을 혼합하였다.
2.) 각각의 프라이머를 1X DNA 현탁 완충제에 500 nM의 최종 농도로 희석하였다. (예: 풀링된 프라이머 부피가 8 mL와 같으면, 192 mL DNA 현탁 완충제를 첨가함)
3.) 믹스를 20초 동안 와동시키고, 30초 동안 스피닝으로 침강시켰다.
4.) 10X STA 프라이머 믹스를 반복 사용을 위해 6개월까지 4℃에서 보관할 수 있거나, 또는 장기 용법을 위해 -20℃에서 동결하여 보관할 수 있다.
STA 반응 믹스의 제조
1.) 96웰 PCR 플레이트의 각각의 웰에 대해, 하기의 믹스를 제조한다.
Figure 112017102947645-pct00021
2.) 6 μl cDNA를 9 μl STA 반응 믹스에 첨가하였다.
3.) 하기에 열거된 써모사이클링 조건을 20 사이클보다는 18 사이클의 변성 및 어닐링/연장 단계로 사용하였다. (주: TSA 예비-증폭 프로토콜을 전체 트랜스크립톰 증폭에 비교하기 위해 18 사이클을 사용하였음).
Figure 112017102947645-pct00022
1 μl의 예비-증폭 생성물을 각각의 액적 PCR 반응에 로딩한다.
도 14는 비-증폭된 세포주 cDNA 1 ng 및 10, 14, 및 18 사이클의 예비-증폭 후의 예비-증폭된 생성물 1 μl로부터의 7개의 마커 (PIP, PRAME, RND3, PKP3, FAT1, S100A2, 및 AGR2)에 대한 액적 PCR 신호를 제시한다. 추가적인 예비-증폭 사이클이 신호 증가를 초래한다. 흥미롭게, 이러한 세포주에서 매우 낮은 수준으로 발현되는 마커인 PRAME이 18 사이클의 예비-증폭 후에만 검출되고, 이는 이러한 기술의 유용성을 실연한다.
실시예 6 - 임상 데이터 및 검정법 검증
임상 연구로부터의 실제 환자 샘플을 사용하여 본원에 기술된 검정법을 검증하였다. 이들은 전이성 암 (폐, 유방, 전립선 및 흑색종)에 걸린 환자, 뿐만 아니라 국소화 암 (전립선)에 걸린 환자를 포함한다. 실시예 2 내지 5에 기술된 바와 같이 검정법을 수행한다.
도 15A, B, 및 C는 실제로 모든 환자가 양성 신호가 있는 반면, 건강한 대조군은 양성 신호가 없다는 것을 제시한 폐 (6명의 환자; 도 15A), 유방 (6명의 환자; 도 15B) 및 전립선 (10명의 환자; 도 15C)의 전이성 암에 걸린 환자로부터의 임상 검정법의 요약을 제시한다. 이러한 검정법에서, 모든 양성 점수가 합산되었다 (누적 점수). 그러나, 하기 기술된 바와 같이, 점수가 도 16에 제시된 바와 같이 개별적인 유전자로 분할될 수도 있다.
도 16은 다중 프로브로부터의 데이터의 누적 분석을 도해하고, 10/11명의 전이성 전립선암 환자 (환자당 기준으로 91%) 대 0/12명 (0%)의 건강한 대조군에서의 양성 신호를 제시한다. 샘플당 기준으로, 28개 중 24개의 샘플에 양성 신호가 있었고, 이는 86% 검출률을 가리킨다. 추가적으로, 일부 개별적인 마커, 예를 들어, AGR2 (전이성 암의 경우 9/10 검출, 및 국소화 암의 경우 0/3), TMPRSS2 (5/10 및 1/3), KLK2 (6/10 및 0/3), STEAP2 (1/10 및 1/3), FAT1 (2/10 및 1/3), 및 FOLH1 (3/10 및 1/3)도 꽤 효과적이었다.
상기 설명된 바와 같이, 상기 기술된 다중 형광 색상 체계를 사용하여, 개별적인 유전자 마커를 독립적인 검증 및 정량화를 위해 분할할 수도 있다. 하기의 이러한 예에서, 전이성 전립선암에 걸린 환자는 다중 양성 마커가 있었고, 국소화 전립선암에 걸린 환자는 더 적은 마커에서 더 적은 수의 양성 점수가 있으며, 건강한 대조군은 모든 마커에 대해 음성이다.
도 17은 3개의 대표적인 환자 샘플로부터의 임상 데이터를 제시한다. 각각 4개의 유전자 전사체가 있는 2회의 별개의 반응 (총 8개의 프로브)에서, 전이성 전립선암에 걸린 환자로부터의 혈액 샘플이 다중 신호를 제시하였다 (모든 신호가 다양한 정도로 양성임). 대조적으로, 국소화 (치유가능) 전립선암에 걸린 환자로부터의 혈액 샘플은 더 약한 (그러나 명확하게 검출가능한) 신호를 제시하였다. 프로브 1 (TMPRSS2), 5 (KLK3), 6 (HOXB13), 7 (AGR2)은 전이성 암 환자에서 가장 강한 신호가 있었던 반면, 프로브 2 (FAT1) 및 4 (STEAP2)는 국소화 암 환자에서 가장 양성이었다. 이러한 결과는 혈액 내의 암 세포 사이의 신호 비균질성, 및 검정법 내에서 차별적인 신호를 분석하는 것의 중요성을 명확하게 설명한다. HD 대조군으로부터의 혈액 (암 환자 샘플과 동일하게 프로세싱됨)은 신호가 완전히 부재하였다.
실시예 7 - CTC 내의 신호전달 경로의 측정
혈액 샘플 내에 존재하는 CTC의 디지털 (정량적) 측정을 제공하는 것에 더하여, 본 발명자들의 d-CTC 검정법은 혈액 내의 종양 세포에 대해 독특한 특정 신호전달 경로의 분석을 또한 허용하였다. 예를 들어, 전립선 계통-특이적 유전자의 한 하위집합이 안드로겐 신호전달에 의해 구동된 한편 (예컨대 PSA), 또 다른 하위집합은 안드로겐 신호전달에 의해 억제되었다 (예컨대 PSMA). 이들 유전자를 함께 분석함으로써, 본 발명자들은 CTC 내의 안드로겐 신호전달의 상태를 규명할 수 있다. 결정적인 경로를 표적화하고 차단하는 것에서의 치료제의 유효성에 관한 정보와 동시에, 혈액 내의 CTC 신호의 총수를 정의하는 것이 치료적 모니터링에 중요하다.
본 발명자들은 항-안드로겐 작용제인 아비라테론이 암 진행을 억제하는데 효과적인 전립선암에서, 특히 안드로겐 경로에 여전히 의존적인 종양에서 이러한 개념을 설명하였다. 하기에서, 본 발명자들은 더 이상 1선 류프롤리드에 반응하지 않고 아비라테론으로 치료된 "거세 저항성 전립선암 (CRPC)"에 걸린 환자의 결과를 제시하였다. 요법이 초기 효능을 제시함에 따라 안드로겐 반응 마커 (녹색)가 초기에는 요법에 의해 억제되었지만, 그 후, 종양이 저항성이 됨에 따라 되돌아 왔고, 환자가 이러한 약물 복용 중에 질환 진행을 경험한다.
도 18은 전이성 전립선암에 걸린 환자의 임상 연구의 결과를 제공한다. "안드로겐 수용체-유도 유전자 (AR-온)"로부터의 신호의 하위집합이 이러한 막대 그래프의 막대의 상부에서 녹색으로 제시되는 한편, "안드로겐-억제 유전자 (AR-오프)"로부터의 신호의 하위집합이 각각의 막대의 하부에서 적색으로 제시된다. 환자가 안드로게 경로 억제제인 아비라테론 (예를 들어, 자이티가® (아비라테론 아세테이트))로 치료됨에 따라, AR-온 신호가 크게 감소되고, 이는 혈액 내의 암 세포에서의 안드로겐 경로의 효과적인 억제를 가리킨다. 그러나, 약물 치료의 사이클 4에는, 안드로겐 경로가 암 세포에서 재활성화되는 것으로 보이고 (녹색 신호 증가), 이는 약물 내성을 가리킨다. 이들 시점에 취해진 혈청 PSA 측정치가 약물 치료의 실패와 일치한다.
실시예 8 - 종양-특이적 mRNA의 검출을 개선하기 위한 비-특이적 예비-증폭
실시예 5와 유사하게, 비-특이적 전체 트랜스크립톰 증폭 (WTA)을 사용하여 CTC-특이적 전사체의 검출률을 증가시킬 수 있다. 이러한 방법은 관심 표적뿐만 아니라 생성물에서 발견되는 모든 메시지를 또한 증폭시키는 무작위 프라이머를 사용하는 것에 의존한다. 이러한 방법에서, SMARTer™ 울트라 로우 RNA 키트 프로토콜 (클론테크)를 하기 기술된 바와 같이 사용하였다:
RNA를 PCR 튜브 또는 플레이트로 전달한다
1) 1 uL의 1:50,000 희석된 ERCC 스파이크-인 믹스(Spike-In Mix) 1을 각각의 샘플에 첨가한다
2) 각각의 샘플의 부피를 10 uL까지 증가시킨다
3) 1 uL의 3' SMART CDS 프라이머 IIA를 각각의 샘플에 첨가한다
4) "72C" 써모사이클러 프로그램을 실행한다:
72℃ 3분
계속 4℃
제1 가닥 cDNA 마스터 믹스 ( FSM ):
1x 4 uL 5x 제1 가닥 완충제
0.5 uL DTT
1 uL dNTP 믹스
1 uL SMARTer IIA 올리고뉴클레오티드
0.5 uL RNase 억제제
2 uL SMARTScribe RT
9 uL/샘플
5) 샘플 수에 대해 10% 과량의 FSM을 제조한 후, 9 uL의 FSM을 각각의 샘플에 첨가하고, 피펫팅하여 혼합한다.
6) "cDNA" 써모사이클러 프로그램을 실행한다:
42℃ 90분
70℃ 10분
계속 4℃
제2 가닥 합성 및 증폭 ( SSM ):
1x 25 uL 2x SeqAmp PCR 완충제
1 uL 프라이머 IIA - v3
1 uL SeqAmp DNA 폴리머라제
3 uL 뉴클레아제-무함유 물 30 uL/샘플
7) 샘플 수에 대해 10% 과량의 SSM을 제조한 후, 30 uL의 SSM을 각각의 샘플에 첨가하고, 피펫팅하여 혼합한다
8) "PCR" 써모사이클러 프로그램을 실행한다:
95℃ 1분
X 사이클
98℃ 10초
65℃ 30초
68℃ 3분
72℃ 10분
계속 4℃
RNA 입력에 따라 사이클 횟수를 조정할 수 있다 (예를 들어, 단일 세포의 경우 18 사이클 또는 10 ng의 RNA 입력의 경우 9 사이클). 추가적으로, 4도 정지점이 철야이다.
고체상 가역적 고정 ( SPRI ) 정제:
PCR 생성물을 로-바인드(lo-bind) 1.5 mL 에펜도르프로 옮기고, 제2 세트의 튜브를 샘플 ID로 표지한다; 최종 용출까지 RT에서 SPRI 프로토콜을 실행한다
9) AMPure™ XP 비드 [4도]를 RT에서 적어도 30분 동안 인큐베이션한다
10) 충분한 양의 용출 완충제를 해동시켜 확실하게 RT이게 한다
11) 80% 에탄올을 제조한다 (적어도 400 uL/샘플)
12) 비드를 잘 와동시킨 후, 50 uL의 비드를 각각의 샘플에 첨가하고, 상하로 5-10회 피펫팅하여 잘 혼합한다. 주: 비드를 피펫팅할 때, 첨가되는 부피가 더 양호하게 제어되고 비드가 더 적게 팁에 결합되어 남게 하기 위해 RPT 팁을 사용하는 것이 권장된다
13) 샘플을 RT에서 5분 동안 인큐베이션한다
14) 샘플을 자석 위에 놓고, 5분 동안 방치한다
15) 비드를 교란시키지 않으면서 (피펫 팁 내의 갈색을 점검하고, 유의한 양의 비드가 손실되면 다시 튜브에 넣음), 상청액 (~95 uL)을 피펫으로 제거한다
16) 200 uL의 80% 에탄올로 2회 세정한다 - 비드 펠릿을 혼합하거나 교란시키지 않는다. 간단하게 비드 펠릿을 에탄올 내에 30초 동안 함침시킨 후, 에탄올을 제거한다. 비드 펠릿이 에탄올 세정 사이에 건조되지 않게 한다.
17) 비드 펠릿이 더 이상 빛나지 않을 때까지, 그러나 균열되기 전까지 샘플을 자기 랙 상에서 공기 건조시킨다. 건조하는 동안 바닥에 고이는 임의의 잔류 에탄올을 피펫으로 제거한다 (주: 건조 시간은 증폭 후의 DNA 농도에 따라 크게 다를 수 있음). 단일 세포 수준의 RNA 입력은 일반적으로 건조시키는데 3-5분이 걸리는 한편, 다른 IFD 생성물 샘플은 1시간까지 걸린다.
18) 균열되기 시작할 때 펠릿을 17 uL의 용출 완충제 내에 용출시킨다. 샘플을 자석에서 제거하고, 모든 비드가 용액 내에 있을 때까지 완충제를 반복적으로 펠릿 위로 피펫팅한 후, 피펫으로 혼합하여, 비드를 완전히 재현탁시킨다 (이는 각각의 샘플에 대해 다양한 정도로 작업될 것임). 달성할 수 있는 용출 부피를 감소시키는 경향이 있는 많은 거품을 형성시키기 때문에, 격렬하게 혼합하지 않도록 한다.
19) 재현탁된 샘플을 RT에서 적어도 2분 동안 인큐베이션한 후, 모든 샘플을 빠르게 스피닝한다.
20) 샘플을 다시 자기 랙 상에 5분 동안 놓는다.
21) ~15 uL의 용출된 증폭된 cDNA를 피펫으로 제거하고, 피펫 팁 내의 비드를 점검한다. 비드가 존재하면, 용액을 다시 비드 펠릿 상에 피펫팅하고, ~1분 동안 방치한 후, 또 다른 용출을 시도한다. 그렇지 않으면, 새로운 로-바인드 1.5-mL 에펜도르프, PCR 튜브, 또는 96웰 PCR 플레이트 내에 보관한다. 주: 용출 생성물 내에 반복적으로 비드가 있으면, 유일한 해법은 흡인 부피를 14 uL 이하로 감소시키는 것일 수 있다.
이러한 전체 트랜스크립톰 증폭 (WTA) 접근법을 상이한 암으로부터 유래된 세포주에서 먼저 테스트하였다. 도 19A 및 19B는 간암 패널로부터의 12개의 프로브로 분석된 간암 세포주 (HEPG2)로부터의 SMARTer-예비증폭 cDNA (18 사이클)의 3개의 상이한 사본을 제시한다. 도 19A에 제시된 바와 같이, 각각의 표적 영역에 대한 증폭 효율이 상이하지만, 3개의 사본 (WTA1, WTA2, WTA3) 사이에서 일관적이이고, 이는 이러한 접근법의 재현성을 실연한다. 도 19B에 제시된 바와 같이, 18 사이클의 SMARTer 예비-증폭을 사용하는 이들 방법은 대략 4 자릿수의 신호 증가 (108 대 104)를 제공하고, 이는 검출에서의 우수한 상승을 제공한다.
실시예 9 - 간암에 대한 다중화 대 개별적 마커 검정법
각각의 샘플에 대해, 10-20 mL의 혈액을 각각의 환자로부터 수집하였다. 도착 3시간 이내에 혈액을 음성 고갈 방식으로 실행되는 CTC-i칩 상에서 프로세싱하였다. 생성물로부터 퀴아젠의 RNeasy™ 플러스 마이크로 키트를 사용하여 RNA를 추출하고, 입수가능한 17 uL 중 5 uL를 클론테크의 v3 SMARTer™ 전체 트랜스크립톰 증폭 (WTA) 전략을 사용하여 증폭시켰다. 그 후, WTA 생성물 중 1%를 디지털 PCR 플레이트의 각각의 웰 내로 로딩하고, 500 nM 택맨™ 프라이머/프로브 조합을 사용하여 각각의 관심 유전자에 대해 전사체 농도를 결정하였다. 전사체 카운트를 혈액 부피에 대해 정규화하고, HCC, HD, 및 CLD 환자 사이에서 비교하였다. HCC 환자는 생검으로 확인된 비-절제 간세포 암종으로서 정의되고, CLD 환자는 초음파/MRI가 음성인, 다양한 병인 (알콜-매개, HBV, HCV)의 간 질환이 있는 환자이다. HD는 10-20 mL의 혈액을 헌혈한, 실험실 외부의 건강한 공여자이다.
도 20A 내지 20C는 21명의 간세포 암종 (HCC) 환자 (도 20A), 13명의 만성 간 질환 (CLD) 환자 (도 20B) 및 15명의 건강한 공여자 (HD) (도 20C)에서의 총 액적 수를 제시한다. HCC 환자가 CLD 및 HD 둘 다와 비교하여 더 높은 수의 액적을 제시하고, 이는 패널이 고위험 CLD 군에서 매우 깨끗하고, 이들 환자를 간암 발달에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 간암에 대해 현재 임상에서 이용가능한 스크리닝 방법의 낮은 특이도를 고려하여 이는 중요한 결과이다. CLD 환자에서, 미국 간 질환 협회(American Association of Liver Disease)는 6개월마다 초음파 (US)를 권장하고, 상세한 알고리즘은 검출되는 간 병변의 크기에 좌우된다. 중국에서의 유망한 조합된 AFP 유전자 마커-초음파 스크리닝은, 심지어 스크리닝된 집단이 60%의 순응도만 유지한 경우에도, 스크리닝되지 않은 이들에 비해 스크리닝된 이들에 대한 37% 사망률 이익을 실연하였다.
각각의 검정법의 민감도 및 특이도는 "질환이 있음" 대 "질환이 없음"을 정의하도록 선택되는 역치에 의존적이지만, 20 ug/L를 사용하여, AFP 유전자 마커는 민감도가 50-80%이고 특이도가 80-90%이다. 20 ng/ml를 차단점으로서 사용하는 연구에서, 민감도는 78.9%로 상승하였지만, 특이도는 78.1%로 하락하였다 (Taketa, Alpha-fetoprotein, J. Med. Technol., 1989;33:1380). 반면에, 환자의 임상 병력을 고려하고 치유적 절제 또는 간 이식을 받은 이에 대해 100% 특이도로 수정했을 때, 본 발명의 검정법의 전반적인 검출률은 76%였다.
추가적으로, 본원에서 사용된 간암 검정법의 11개의 마커 모두는 76% 민감도에 기여한 한편, 상위 5개의 마커 (AHSG, ALB, APOH, FGB 및 FGG)는 독자적으로 민감도가 70%이고, 상위 3개의 마커 (ALB, FGB, FGG)만은 67% 민감도를 초래한다. ALB 단독은 사례의 56%를 검출하였다.
실시예 10 - 폐암에 대한 다중화 대 개별적 마커 검정법
8명의 전이성 폐 환자 및 8명의 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 앞서 기술된 바와 같이 CTC-칩을 통해 프로세싱하였다. 샘플을 스피닝으로 침강시키고, RNAlater™로 처리하고, -80℃에서 보관하였다. 기술된 바와 같이 RNA를 정제하고 cDNA를 합성하였다. 6 μl cDNA 및 도면에 열거된 프로브에 상응하는 네스티드 프라이머를 사용하여 각각의 샘플 상에서 STA를 수행하였다. 각각의 액적 PCR 반응당 1 μl의 STA 생성물을 로딩하였다.
액적 수를 혈액 부피에 대해 정규화하였다. 도 21A 및 21B에 제시된 바와 같이, 다중화 폐 유전자 마커 패널이 8명의 건강한 공여자의 배경을 초과하여 100% (8/8) 전이성 폐암 환자 샘플을 검출할 수 있었다. 폐 패널의 각각의 마커의 민감도를 또한 결정하였고, 결과는 SFRP는 검출률이 8/8이었고, FAT1 프로브 2는 검출률이 7/8이었고, TMPRSS4는 검출률이 6/8이었고, FOXF1 및 ARG2, 프로브 2는 검출률이 5/8이었고, FAT1은 검출률이 4/8이었고, FAT2 및 AGR2는 검출률이 3/8이었으며, FAT2, 프로브 2는 검출률이 2/8이었음을 제시한다.
SERPINA3 및 SFRP2에 대한 검정법은 SFRP2는 폐암 및 유방암 검출 둘 다에 효과적인 반면, 전자는 유방암 검출에 대해 더욱 특이적인 것으로 보이지만, 일부 폐암 샘플을 또한 검출한다는 것을 가리켰다.
실시예 11 - 유방암에 대한 다중화 대 개별적 마커 검정법
9명의 전이성 유방암 환자, 5명의 국소화 유방암 환자, 및 15명의 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 CTC-칩을 통해 프로세싱하였다. 생성물을 펠릿으로 만들고, RNAlater™로 처리하고, -80℃에서 보관하였다. 앞서 기술된 바와 같이 각각의 샘플로부터의 RNA 및 cDNA를 제조하였다. 각각의 샘플로부터의 6 μl cDNA를 도 22에 열거된 프로브 (FAT2, SCGB2A1, PGR, PRAME, TFAP2C, S100A2, FAT1, AGR2, PKP3, RND3, 및 PIP)에 상응하는 네스티드 프라이머를 사용하여 STA 증폭시켰다. 액적 수를 혈액 부피에 대해 정규화하고, 각각의 마커에 대한 가장 높은 건강한 공여자 값을 환자 샘플 값으로부터 차감하였다.
도 22는 각각의 환자에 대한 배경 신호를 초과하는 신호를 제시한다. 이들 방법은 전이성 샘플의 7/9 (78%) 및 국소화 샘플의 2/5 (40%)를 검출하였다. 각각의 마커 단독의 민감도는 1/14 내지 6/14로 다양하였고, 2개의 가장 적절한 마커는 AGR2 (6/14) 및 FAT1 (5/14)였고, 다음 4개의 가장 적절한 마커는 RND3, PKP3, PRAME, 및 SCGB2A1였다 (각각 3/14).
실시예 12 - 전이성 유방암에서의 AVR7 검출
10명의 전이성 유방암 환자 및 7명의 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 CTC-칩을 통해 프로세싱하였다. 생성물을 펠릿으로 만들고, RNAlater™로 처리하고, -80℃에서 보관하였다. 앞서 기술된 바와 같이 각각의 샘플로부터의 RNA 및 cDNA를 제조하였다. 6 μl의 비-증폭된 cDNA를 각각의 액적 PCR 반응 내로 로딩하였다. 샘플을 v7 이소형의 안드로겐 수용체 (ARv7, 표 1의 서열)에 대한 프로브로 분석하였다. 액적 수를 혈액 부피에 대해 정규화하였다.
도 23A에 제시된 바와 같이, ARv7이 5/10명의 환자 (50%)에서 배경 (HD)을 초과하는 수준으로 검출되었고, 이는 검정법이 액체 생검으로부터 ARv7을 검출하는데 성공적임을 시사한다. 환자 중 1명은 삼중 음성 유방암이었고, 이는 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환경 (예를 들어, 3개의 가장 통상적인 유방암 마커인 에스트로겐 수용체 (ER), HER2/neu, 및 프로게스테론 수용체 (PR) 마커 중 어느 것에 대해서도 유전자를 발현하지 않는 환자)에서도 ARv7이 마커로서 유용함을 시사한다.
실시예 13 - 흑색종에 대한 다중화 대 개별적 마커 검정법
34명의 전이성 또는 절제불능성 흑색종 환자 (각각 다중 채혈 시점 (총 채혈 시점: 182개)이 있음), 및 15명의 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 CTC-칩을 통해 프로세싱하였다. 생성물을 펠릿으로 만들고, RNAlater™로 처리하고, -80℃에서 급속 동결시켰다. 앞서 기술된 바와 같이 각각의 샘플로부터의 RNA 및 cDNA를 제조하였다. 각각의 샘플로부터의 12 μl cDNA을 도 24A의 그래프의 하단에 열거된 프로브 (개별적인 마커 PMEL, MLANA, MAGEA6, PRAME, TFAP2C, 및 SOX10)에 상응하는 네스티드 프라이머를 사용하여 특이적 표적 증폭 (10 사이클)에 의해 증폭시켰다. 액적 수를 혈액 부피에 대해 정규화하였다. 도 24B는 건강한 공여자에 비교된 바와 같은 흑색종 환자에서 검출된 액적 신호의 도트 플롯 분포를 제시한다. 검출 민감도는 모든 환자 채혈 시점에 대해 81%였다 (6개의 마커 중 임의의 1개가 이러한 특정 마커에 대한 HD에서의 가장 높은 배경 신호를 초과하는 액적 신호를 제시하면 환자 채혈물을 양성으로 채점함). 개별적인 마커 중에서, PMEL 및 MLANA가 가장 높은 검출률을 제시하였다.
다른 실시양태
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기의 설명은 첨부된 청구항의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하려는 의도이고, 이를 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형이 하기의 청구항의 범주 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION <120> DIGITAL ANALYSIS OF CIRCULATING TUMOR CELLS IN BLOOD SAMPLES <130> 28970-0854WO1 <140> PCT/US2016/024367 <141> 2016-03-25 <150> 62/253,619 <151> 2015-11-10 <150> 62/219,339 <151> 2015-09-16 <150> 62/137,891 <151> 2015-03-25 <160> 330 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 ctgacagtta gagccgatat cac 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 caattcagtc ttcagcaact tgag 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 3 aacctgcaga tacagctc 18 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ggtggcttta aaatgtcagg aa 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 gcggacattg tcatagtaag ga 22 <210> 78 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 78 tttgaaatcg acacac 16 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 ctgccttgct ctccttcc 18 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 cttactcagc ttgaacttgt cg 22 <210> 81 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 81 gccacagatc catg 14 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 acttccttga tccctgcca 19 <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 gtcttttcaa ccatgtcctc ca 22 <210> 84 <211> 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Synthetic probe <400> 90 tgcgggtact gg 12 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 tccttggatg actctcccta c 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 agataccacc tccctgaaga a 21 <210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 93 aggagcggga tggag 15 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 agaggtttaa tgggctcaca g 21 <210> 95 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 ctctggtctg tcgtcatgta ag 22 <210> 96 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 96 tcaccttctc cacca 15 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> 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Synthetic primer <400> 103 gaggcaagtc agcctttct 19 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 tgtccatctt gtcgtcttcg 20 <210> 105 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 105 gatgactctg ggaga 15 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 gctcaccatg tgtgacttga 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 107 tgggagagag acagcttgta 20 <210> 108 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 108 gagagctgca tcagt 15 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 109 gaaagtccac gctcaccat 19 <210> 110 <211> 18 <212> DNA 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Synthetic primer <400> 116 gtgagctact ggctgaacta tt 22 <210> 117 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 117 atttgagaag aatggtgga 19 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 118 aggagatgtg ctggattgtc 20 <210> 119 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 119 tctgcatgaa ttatacattg accac 25 <210> 120 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 120 aactgaccac gctg 14 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 121 actgcagaga taagtttagc tgac 24 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 122 tcaccatttt gcttacttcc ttg 23 <210> 123 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of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 129 tcaactcatt tcggc 15 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 130 gatcagacag tcattcgcaa ag 22 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 131 gacaatcttc cagggactga g 21 <210> 132 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 132 gttcagaggg ttctt 15 <210> 133 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 133 cccaacccag gcatgatg 18 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 134 tcaatgagaa gcaccttggc 20 <210> 135 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 135 tccagcagag ct 12 <210> 136 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of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 142 ggaccaggga aagataaagc c 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 143 gcaaggtaga ttcgtgacag a 21 <210> 144 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 144 aatcccaacc acaaa 15 <210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 145 cattttgtgg ttgggattct gg 22 <210> 146 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 146 gatgctgtgg atgtggct 18 <210> 147 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 147 atctaccttg ctgctca 17 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 148 gccttgcact tccattatga c 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 155 ccactatgtc accatgtacc tg 22 <210> 156 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 156 agaaccagca gc 12 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 157 tgctctgaca acccttatgc 20 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 158 ggctgaggat cactttgtag a 21 <210> 159 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 159 gtctttgctg acatt 15 <210> 160 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 160 catcagcagg accagtagc 19 <210> 161 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 161 tgtctgtgct 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Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 168 atgctgtatt ttgcac 16 <210> 169 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 169 gtgactctcc tgacatcctt ag 22 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 170 ccatctcatt tcgtcctcca a 21 <210> 171 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 171 acagacatag gcaaagt 17 <210> 172 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 172 actctgaaaa actttggact gatg 24 <210> 173 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 tctagcaatc aacagatgag ttct 24 <210> 174 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 174 gagccaaacg cc 12 <210> 175 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 175 agctccttcc agtccgaat 19 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 176 gtctgctcat caatcacctc a 21 <210> 177 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 177 atacccattg tcatcgc 17 <210> 178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 178 ggacagagag aacaaggatg aac 23 <210> 179 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 179 tgtgggagaa tataggtgga ttg 23 <210> 180 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 180 ctgtgctgga caatg 15 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 181 gctttgacat cagtagacca gag 23 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 182 ctgtccgcag atcagacttg 20 <210> 183 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 183 tcaaaaagtg gaaaggtga 19 <210> 184 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 184 cctggaaaat ggcctcctt 19 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 185 cattgcctac aggaagtctg g 21 <210> 186 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 186 tatgccaaga gtgtgag 17 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 187 ccagaggtaa aggtgccaac 20 <210> 188 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 188 tcccagataa ctgtcatgaa gc 22 <210> 189 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 189 gcagagtaac tacaaaggc 19 <210> 190 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 190 cctcaaatac atcaagcaca gc 22 <210> 191 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 191 ggaagccttc accagcaa 18 <210> 192 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 192 cccaggtggt cca 13 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 193 ttgcaggctt cacatacctt 20 <210> 194 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 194 gcccgacatg cttgagt 17 <210> 195 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 195 ggacaacgac cttt 14 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 196 ctcttgcagc cattcctctt 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 197 cccttacccc agtcacttct 20 <210> 198 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 198 cctcttctct cctcccct 18 <210> 199 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 199 tggacagaag acatactcat aaagg 25 <210> 200 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 200 ggtgccagca tgaatccc 18 <210> 201 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 201 tggacctgca gttatca 17 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 202 atcttccctc cattctgctt c 21 <210> 203 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 203 cagttcccac tcactttctc ag 22 <210> 204 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 204 gccaccccac tc 12 <210> 205 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 205 ttttgcacca gtctcgctt 19 <210> 206 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 206 gccgcactga cagtatgag 19 <210> 207 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 207 tgggagccct g 11 <210> 208 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 208 cgactgcgag tgataccg 18 <210> 209 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 209 ctctccacgc actccct 17 <210> 210 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 210 aacagccaca acg 13 <210> 211 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 211 tgccgctcat gttcatgc 18 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 212 caggacacca tgaggaacag 20 <210> 213 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 213 tcccgcttca 10 <210> 214 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 214 aagatgtcag acactgagaa cg 22 <210> 215 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 215 cgaagcccga tgtggtc 17 <210> 216 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 216 agtccaaagc acacga 16 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 217 aggagatgtg ctggattgtc 20 <210> 218 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 218 tctgcatgaa ttatacattg accac 25 <210> 219 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 219 aactgaccac gctg 14 <210> 220 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 220 atgtggagtt tacagtgtct gg 22 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 221 agcttctcac tgagtgttgc 20 <210> 222 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 222 cagccaagtg taacc 15 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 223 gagatctgct tgaatgtgct g 21 <210> 224 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 224 caacagaggt ttttcacagc at 22 <210> 225 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 225 tggcaaggtc cgccc 15 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 226 catggtaggc 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 233 cctgaatctt tactctctct ccttg 25 <210> 234 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 234 cagtttggta cattctattt cttcc 25 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 235 gcacttcaag ttcaccatca c 21 <210> 236 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 236 accagtttat tgtcaccttc ca 22 <210> 237 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 237 cttgactttc tcccctg 17 <210> 238 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 238 acatctatta ttgctactat tgtgtgtt 28 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 239 tgggagcctc ttctctcttc 20 <210> 240 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 240 attgtcgttg acacc 15 <210> 241 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 241 ttcatttgat aagcacacag tctg 24 <210> 242 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 242 accttgaaca tggcatagtc tg 22 <210> 243 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 243 agtcttccag ttccac 16 <210> 244 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 244 aatcagctcc gcttccttg 19 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 245 tgcttatctc gttgtccttc g 21 <210> 246 <211> 14 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Synthetic probe <400> 252 gccccaggac g 11 <210> 253 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 253 cagatggagg aggaagattc tg 22 <210> 254 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 254 gtatactgcc tggagttctc tg 22 <210> 255 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 255 ctggttcagg tctccattac ag 22 <210> 256 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 256 gctgtgactc tgagcaagta 20 <210> 257 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 257 tgtcctcctc aatctggttt atg 23 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 258 gacagaaggg cttggagatt t 21 <210> 259 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of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 265 gggcccacat ataaatcctc ac 22 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 266 ctgctggtca ctgttctcat c 21 <210> 267 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 267 cttcgcggtg tggtgaa 17 <210> 268 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 268 gctgtgtctc ccgtcaaa 18 <210> 269 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 269 ctgggacaca ttgccttct 19 <210> 270 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 270 ccaccatgca ttctttcaat tct 23 <210> 271 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 271 aaacccagtt 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 284 tcgtagcctc cagggtaata g 21 <210> 285 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 285 gttacaggtc tcctatctac agc 23 <210> 286 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 286 gctcagcctc tctggaag 18 <210> 287 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 287 ctctcttacc ctgattcgga tg 22 <210> 288 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 288 ggcgtctgcc tgtgatt 17 <210> 289 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 289 cctgagttct ggtgccaaag 20 <210> 290 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 290 gggcatgagc agcttcaa 18 <210> 291 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 291 ccactggctt ggtggattt 19 <210> 292 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 292 tcaacagaaa tgcccagagt t 21 <210> 293 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 293 cttctccagc tgggcatt 18 <210> 294 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 294 tgctgtggca gcagatg 17 <210> 295 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 295 cggtcatgtc cgccttc 17 <210> 296 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 296 gcgtttccat tatgtcgttg tc 22 <210> 297 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Claims (28)

  1. 대상체로부터의 혈액 샘플로부터 순환 종양 세포 (CTC)를 단리하는 단계;
    CTC-유래 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
    cDNA를 개별적인 액적 내로 캡슐화시키는 단계;
    CTC의 공급원인 특정 유형의 암으로부터의 종양 계통 특이적 RNA에 상응하는 cDNA에 특이적으로 결합하고 혈액 내의 정상 세포로부터의 cDNA에는 결합하지 않도록 구성된 리포터 기의 존재 하에 각각의 액적 내의 cDNA를 증폭시키는 단계; 및
    리포터 기에 대해 양성인 액적의 총수를 결정하여 대상체에서의 암의 존재를 지시하는 CTC의 존재를 결정하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 증폭시키는 단계는 각각의 액적에서 PCR을 수행하는 것을 포함하고,
    각각의 유형의 암에 대한 적어도 5개의 프라이머 세트가 액적 내의 cDNA 분자를 증폭시키는데 사용되고, 적어도 5개의 프라이머 세트의 각각의 프라이머 세트는 선택된 암 유전자에 상응하고,
    선택된 암 유전자는 전립선암, 유방암, 폐암, 췌장암, 간암, 및 흑색종 중 하나 이상에 대해 선택적인 유전자를 포함하고,
    전립선암-선택적 유전자는 FAT1, TMPRSS2, AGR2, FOLH1, HOXDB13, KLK2, KLK3, SCHLAP1/세트4, SCHLAP1/세트5, AMACR, AR 변이체, UGT2B15/세트1, UGT2B15/세트5, 및 STEAP2 중 5종 이상을 포함하고, 전립선암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),
    TMPRSS2 (프라이머 1 서열식별번호: 134, 프라이머 2 서열식별번호: 133),
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1),
    FOLH1 (프라이머 1 서열식별번호: 29, 프라이머 2 서열식별번호: 28),
    HOXDB13 (프라이머 1 서열식별번호: 32, 프라이머 2 서열식별번호: 31),
    KLK2 (프라이머 1 서열식별번호: 35, 프라이머 2 서열식별번호: 34),
    KLK3 (프라이머 1 서열식별번호: 38, 프라이머 2 서열식별번호: 37),
    SCHLAP1/세트4 (프라이머 1 서열식별번호: 92, 프라이머 2 서열식별번호: 91),
    SCHLAP1/세트5 (프라이머 1 서열식별번호: 95, 프라이머 2 서열식별번호: 94),
    AMACR (프라이머 1 서열식별번호: 98, 프라이머 2 서열식별번호: 97),
    AR 변이체 7/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 101, 프라이머 2 서열식별번호: 100),
    AR 변이체 7/세트3 (프라이머 1 서열식별번호: 104, 프라이머 2 서열식별번호: 103),
    AR 변이체 12/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 107, 프라이머 2 서열식별번호: 106),
    AR 변이체 12/세트4 (프라이머 1 서열식별번호: 110, 프라이머 2 서열식별번호: 109),
    UGT2B15/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 113, 프라이머 2 서열식별번호: 112),
    UGT2B15/세트5 (프라이머 1 서열식별번호: 116, 프라이머 2 서열식별번호: 115), 및
    STEAP2 (프라이머 1 서열식별번호: 125, 프라이머 2 서열식별번호: 124)
    으로부터 선택되고,
    유방암-선택적 유전자는 PGR, PIP, FAT2, TMPRSS4, AGR2, FAT1, RND3, PKP3, PRAME 및 SCGB2A1 중 5종 이상을 포함하고, 유방암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    PGR (프라이머 1 서열식별번호: 62, 프라이머 2 서열식별번호: 61),
    PIP (프라이머 1 서열식별번호: 164, 프라이머 2 서열식별번호: 163),
    FAT2 (프라이머 1 서열식별번호: 26, 프라이머 2 서열식별번호: 25),
    TMPRSS4 (프라이머 1 서열식별번호: 203, 프라이머 2 서열식별번호: 202),
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1),
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),
    RND3 (프라이머 1 서열식별번호: 77, 프라이머 2 서열식별번호: 76),
    PKP3 (프라이머 1 서열식별번호: 65, 프라이머 2 서열식별번호: 64),
    PRAME (프라이머 1 서열식별번호: 149, 프라이머 2 서열식별번호: 148),　
    AR 변이체 7/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 101, 프라이머 2 서열식별번호: 100),
    AR 변이체 7/세트3 (프라이머 1 서열식별번호: 104, 프라이머 2 서열식별번호: 103), 및
    SCGB2A1 (프라이머 1 서열식별번호: 83, 프라이머 2 서열식별번호: 82)
    으로부터 선택되고,
    폐암-선택적 유전자는 SFRP2, FAT1, TMPRSS4, FOXF1, ARG2 및 FAT2 중 5종 이상을 포함하고, 폐암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    SFRP2 (프라이머 1 서열식별번호: 194, 프라이머 2 서열식별번호: 193),　
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),　
    TMPRSS4 (프라이머 1 서열식별번호: 203, 프라이머 2 서열식별번호: 202),　
    FOXF1 (프라이머 1 서열식별번호: 209, 프라이머 2 서열식별번호: 208),　
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1), 및
    FAT2 (프라이머 1 서열식별번호: 26, 프라이머 2 서열식별번호: 25)
    으로부터 선택되고,
    췌장암-선택적 유전자는 ALDH1A3, CDH11, EGFR, FAT1, MET, PKP3, RND3, S100A2 및 STEAP2 중 5종 이상을 포함하고, 췌장암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    ALDH1A3 (프라이머 1 서열식별번호: 5, 프라이머 2 서열식별번호: 4),　
    CDH11 (프라이머 1 서열식별번호: 11, 프라이머 2 서열식별번호: 10),　
    EGFR (프라이머 1 서열식별번호: 20, 프라이머 2 서열식별번호: 19),　
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),　
    MET (프라이머 1 서열식별번호: 47, 프라이머 2 서열식별번호: 46),　
    PKP3 (프라이머 1 서열식별번호: 65, 프라이머 2 서열식별번호: 64),　
    RND3 (프라이머 1 서열식별번호: 77, 프라이머 2 서열식별번호: 76),　
    S100A2 (프라이머 1 서열식별번호: 80, 프라이머 2 서열식별번호: 79), 및　
    STEAP2 (프라이머 1 서열식별번호: 125, 프라이머 2 서열식별번호: 124)
    으로부터 선택되고,
    간암-선택적 유전자는 AHSG, ALB, APOH, FGB 및 FGG이고, 간암-선택적 유전자에 상응하는 프라이머 세트는:
    AHSG (프라이머 1 서열식별번호: 152, 프라이머 2 서열식별번호: 151),　
    ALB (프라이머 1 서열식별번호: 140, 프라이머 2 서열식별번호: 139),　
    APOH (프라이머 1 서열식별번호: 233, 프라이머 2 서열식별번호: 232),　
    FGB (프라이머 1 서열식별번호: 239, 프라이머 2 서열식별번호: 238), 및　
    FGG (프라이머 1 서열식별번호: 242, 프라이머 2 서열식별번호: 241)
    이고,
    흑색종-선택적 유전자는 PMEL, MLANA, MAGEA6, PRAME, TFAP2C 및 SOX10 중 5종 이상을 포함하고, 흑색종 암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    PMEL (프라이머 1 서열식별번호: 68, 프라이머 2 서열식별번호: 67),
    MLANA (프라이머 1 서열식별번호: 50, 프라이머 2 서열식별번호: 49),
    MAGEA6 (프라이머 1 서열식별번호: 44, 프라이머 2 서열식별번호: 43),
    PRAME (프라이머 1 서열식별번호: 149, 프라이머 2 서열식별번호: 148),
    TFAP2C (프라이머 1 서열식별번호: 131, 프라이머 2 서열식별번호: 130), 및
    SOX10 (프라이머 1 서열식별번호: 89, 프라이머 2 서열식별번호: 88)
    으로부터 선택되는 것인,
    대상체에서 초고도의 민감도 및 특이도로 암을 검출하는 방법.
  2. 혈액 샘플로부터 혈액 내에 존재하는 순환 종양 세포 (CTC)를 단리하는 단계;
    CTC로부터 리보핵산 (RNA) 분자를 단리하는 단계;
    단리된 RNA로부터 용액 내의 cDNA 분자를 생성시키는 단계;
    cDNA 분자를 개별적인 액적 내에 캡슐화시키는 단계;
    CTC의 공급원인 특정 유형의 조직으로부터의 종양 계통 특이적 RNA에 상응하는 cDNA에 특이적으로 결합하고 혈액 내의 정상 세포로부터의 cDNA에는 결합하지 않도록 구성된 하나 이상의 리포터 기의 존재 하에 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 증폭시키는 단계;
    액적 내에 CTC로부터의 증폭된 cDNA 분자가 존재하는 것의 지시자로서 리포터 기를 함유하는 액적을 검출하는 단계; 및
    검출된 액적 내의 CTC로부터의 cDNA 분자를 분석하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 증폭시키는 단계는 각각의 액적에서 PCR을 수행하는 것을 포함하고,
    각각의 유형의 암에 대한 적어도 5개의 프라이머 세트가 각각의 액적 내의 cDNA 분자를 증폭시키는데 사용되고, 적어도 5개의 프라이머 세트의 각각의 프라이머 세트는 선택된 암 유전자에 상응하고,
    선택된 암 유전자는 전립선암, 유방암, 폐암, 췌장암, 간암, 및 흑색종 중 하나 이상에 대해 선택적인 유전자를 포함하고,
    전립선암-선택적 유전자는 FAT1, TMPRSS2, AGR2, FOLH1, HOXDB13, KLK2, KLK3, SCHLAP1/세트4, SCHLAP1/세트5, AMACR, AR 변이체, UGT2B15/세트1, UGT2B15/세트5, 및 STEAP2 중 5종 이상을 포함하고, 전립선암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),
    TMPRSS2 (프라이머 1 서열식별번호: 134, 프라이머 2 서열식별번호: 133),
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1),
    FOLH1 (프라이머 1 서열식별번호: 29, 프라이머 2 서열식별번호: 28),
    HOXDB13 (프라이머 1 서열식별번호: 32, 프라이머 2 서열식별번호: 31),
    KLK2 (프라이머 1 서열식별번호: 35, 프라이머 2 서열식별번호: 34),
    KLK3 (프라이머 1 서열식별번호: 38, 프라이머 2 서열식별번호: 37),
    SCHLAP1/세트4 (프라이머 1 서열식별번호: 92, 프라이머 2 서열식별번호: 91),
    SCHLAP1/세트5 (프라이머 1 서열식별번호: 95, 프라이머 2 서열식별번호: 94),
    AMACR (프라이머 1 서열식별번호: 98, 프라이머 2 서열식별번호: 97),
    AR 변이체 7/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 101, 프라이머 2 서열식별번호: 100),
    AR 변이체 7/세트3 (프라이머 1 서열식별번호: 104, 프라이머 2 서열식별번호: 103),
    AR 변이체 12/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 107, 프라이머 2 서열식별번호: 106),
    AR 변이체 12/세트4 (프라이머 1 서열식별번호: 110, 프라이머 2 서열식별번호: 109),
    UGT2B15/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 113, 프라이머 2 서열식별번호: 112),
    UGT2B15/세트5 (프라이머 1 서열식별번호: 116, 프라이머 2 서열식별번호: 115), 및
    STEAP2 (프라이머 1 서열식별번호: 125, 프라이머 2 서열식별번호: 124)
    으로부터 선택되고,
    유방암-선택적 유전자는 PGR, PIP, FAT2, TMPRSS4, AGR2, FAT1, RND3, PKP3, PRAME 및 SCGB2A1 중 5종 이상을 포함하고, 유방암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    PGR (프라이머 1 서열식별번호: 62, 프라이머 2 서열식별번호: 61),
    PIP (프라이머 1 서열식별번호: 164, 프라이머 2 서열식별번호: 163),
    FAT2 (프라이머 1 서열식별번호: 26, 프라이머 2 서열식별번호: 25),
    TMPRSS4 (프라이머 1 서열식별번호: 203, 프라이머 2 서열식별번호: 202),
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1),
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),
    RND3 (프라이머 1 서열식별번호: 77, 프라이머 2 서열식별번호: 76),
    PKP3 (프라이머 1 서열식별번호: 65, 프라이머 2 서열식별번호: 64),
    PRAME (프라이머 1 서열식별번호: 149, 프라이머 2 서열식별번호: 148),　
    AR 변이체 7/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 101, 프라이머 2 서열식별번호: 100),
    AR 변이체 7/세트3 (프라이머 1 서열식별번호: 104, 프라이머 2 서열식별번호: 103), 및
    SCGB2A1 (프라이머 1 서열식별번호: 83, 프라이머 2 서열식별번호: 82)
    으로부터 선택되고,
    폐암-선택적 유전자는 SFRP2, FAT1, TMPRSS4, FOXF1, ARG2 및 FAT2 중 5종 이상을 포함하고, 폐암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    SFRP2 (프라이머 1 서열식별번호: 194, 프라이머 2 서열식별번호: 193),　
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),　
    TMPRSS4 (프라이머 1 서열식별번호: 203, 프라이머 2 서열식별번호: 202),　
    FOXF1 (프라이머 1 서열식별번호: 209, 프라이머 2 서열식별번호: 208),　
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1), 및
    FAT2 (프라이머 1 서열식별번호: 26, 프라이머 2 서열식별번호: 25)
    으로부터 선택되고,
    췌장암-선택적 유전자는 ALDH1A3, CDH11, EGFR, FAT1, MET, PKP3, RND3, S100A2 및 STEAP2 중 5종 이상을 포함하고, 췌장암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    ALDH1A3 (프라이머 1 서열식별번호: 5, 프라이머 2 서열식별번호: 4),　
    CDH11 (프라이머 1 서열식별번호: 11, 프라이머 2 서열식별번호: 10),　
    EGFR (프라이머 1 서열식별번호: 20, 프라이머 2 서열식별번호: 19),　
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),　
    MET (프라이머 1 서열식별번호: 47, 프라이머 2 서열식별번호: 46),　
    PKP3 (프라이머 1 서열식별번호: 65, 프라이머 2 서열식별번호: 64),　
    RND3 (프라이머 1 서열식별번호: 77, 프라이머 2 서열식별번호: 76),　
    S100A2 (프라이머 1 서열식별번호: 80, 프라이머 2 서열식별번호: 79), 및　
    STEAP2 (프라이머 1 서열식별번호: 125, 프라이머 2 서열식별번호: 124)
    으로부터 선택되고,
    간암-선택적 유전자는 AHSG, ALB, APOH, FGB 및 FGG이고, 간암-선택적 유전자에 상응하는 프라이머 세트는:
    AHSG (프라이머 1 서열식별번호: 152, 프라이머 2 서열식별번호: 151),　
    ALB (프라이머 1 서열식별번호: 140, 프라이머 2 서열식별번호: 139),　
    APOH (프라이머 1 서열식별번호: 233, 프라이머 2 서열식별번호: 232),　
    FGB (프라이머 1 서열식별번호: 239, 프라이머 2 서열식별번호: 238), 및　
    FGG (프라이머 1 서열식별번호: 242, 프라이머 2 서열식별번호: 241)
    이고,
    흑색종-선택적 유전자는 PMEL, MLANA, MAGEA6, PRAME, TFAP2C 및 SOX10 중 5종 이상을 포함하고, 흑색종 암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    PMEL (프라이머 1 서열식별번호: 68, 프라이머 2 서열식별번호: 67),
    MLANA (프라이머 1 서열식별번호: 50, 프라이머 2 서열식별번호: 49),
    MAGEA6 (프라이머 1 서열식별번호: 44, 프라이머 2 서열식별번호: 43),
    PRAME (프라이머 1 서열식별번호: 149, 프라이머 2 서열식별번호: 148),
    TFAP2C (프라이머 1 서열식별번호: 131, 프라이머 2 서열식별번호: 130), 및
    SOX10 (프라이머 1 서열식별번호: 89, 프라이머 2 서열식별번호: 88)
    으로부터 선택되는 것인,
    혈액 샘플 내의 CTC를 분석하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, RNA를 단리하기 전에 혈액 샘플의 부피를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, cDNA 분자를 캡슐화시키기 전에 cDNA-함유 용액으로부터 오염물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 단리된 RNA로부터 cDNA 분자를 생성시키는 단계가 단리된 RNA 분자의 역전사 (RT) 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 개별적인 cDNA 분자를 캡슐화시키는 단계가 PCR 시약을 개별적인 액적 내에 cDNA 분자와 함께 캡슐화시키고, 비-수성 액체의 적어도 1000개의 액적을 형성시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 기가 형광 표지를 포함하는 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서, cDNA-함유 용액으로부터 오염물을 제거하는 단계가 고체상 가역적 고정(Solid Phase Reversible Immobilization: SPRI)을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, SPRI가
    용액 내의 cDNA를 cDNA에 특이적으로 결합하도록 구성된 자기 비드로 고정하는 단계;
    용액으로부터 오염물을 제거하는 단계; 및
    정제된 cDNA를 용출시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 비-수성 액체가 하나 이상의 플루오로카본, 히드로플루오로카본, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 및 탄화수소 오일을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 선택된 암 유전자가 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종 이상의 상이한 유형의 암에 대해 선택적인 유전자를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 유전자가 유방암 및 폐암; 유방암, 폐암, 및 간암; 유방암, 폐암, 및 췌장암; 유방암, 폐암, 및 전립선암; 유방암, 간암, 및 흑색종; 유방암, 폐암, 및 흑색종; 유방암, 폐암, 간암, 및 전립선암; 유방암, 폐암, 간암, 및 흑색종; 유방암, 폐암, 간암, 및 췌장암; 유방암, 폐암, 전립선암, 및 췌장암; 유방암, 폐암, 간암, 흑색종, 및 췌장암; 또는 유방암, 폐암, 간암, 흑색종, 췌장암, 및 전립선암에 대해 선택적인 것인 방법.
  13. 제2항에 있어서, 검출된 액적 내의 CTC로부터의 cDNA 분자를 분석하는 단계가 기지의 암을 갖는 환자로부터 경시적으로 취득된 혈액 샘플로부터의 CTC로부터의 cDNA 분자를 모니터링하고, CTC로부터의 cDNA 분자를 테스트하거나, 영상화하거나, 또는 테스트 및 영상화 둘 다를 하여 환자에 대한 예후를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제2항 또는 제3항에 있어서, 검출된 액적 내의 CTC로부터의 cDNA 분자를 분석하는 단계가 환자로부터의 혈액 샘플로부터의 CTC로부터의 cDNA 분자를 테스트하거나, 영상화하거나, 또는 테스트 및 영상화하여 치료적 개입에 대한 CTC에 의한 반응의 지시를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제2항 또는 제3항에 있어서, 검출된 액적 내의 CTC로부터의 cDNA 분자를 분석하는 단계가 환자로부터의 혈액 샘플의 단위 부피당 CTC의 수 또는 수준을 결정하여 환자 내의 종양 부담의 척도를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 환자 내의 종양 부담의 척도를 사용하여 요법을 선택하는 것 및 경시적으로 종양 부담을 모니터링하기 위해 제2 시점에 환자 내의 종양 부담의 척도를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 혈액 샘플 내의 순환 종양 세포 (CTC)로부터 수득된 cDNA 분자를 증폭시키고 검출하기 위한, 암-선택적 유전자에 특이적인 프로브 및 프라이머를 포함하는 조성물이며;
    여기서 적어도 5개의 세트의 프로브 및 프라이머가 cDNA 분자를 증폭하는데 사용되고, 적어도 5개의 프라이머 세트의 각각의 프라이머 세트는 선택된 암 유전자에 상응하고,
    선택된 암 유전자는 전립선암, 유방암, 폐암, 췌장암, 간암, 및 흑색종 중 하나 이상에 대해 선택적인 유전자를 포함하고,
    전립선암-선택적 유전자는 FAT1, TMPRSS2, AGR2, FOLH1, HOXDB13, KLK2, KLK3, SCHLAP1/세트4, SCHLAP1/세트5, AMACR, AR 변이체, UGT2B15/세트1, UGT2B15/세트5, 및 STEAP2 중 5종 이상을 포함하고, 전립선암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),
    TMPRSS2 (프라이머 1 서열식별번호: 134, 프라이머 2 서열식별번호: 133),
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1),
    FOLH1 (프라이머 1 서열식별번호: 29, 프라이머 2 서열식별번호: 28),
    HOXDB13 (프라이머 1 서열식별번호: 32, 프라이머 2 서열식별번호: 31),
    KLK2 (프라이머 1 서열식별번호: 35, 프라이머 2 서열식별번호: 34),
    KLK3 (프라이머 1 서열식별번호: 38, 프라이머 2 서열식별번호: 37),
    SCHLAP1/세트4 (프라이머 1 서열식별번호: 92, 프라이머 2 서열식별번호: 91),
    SCHLAP1/세트5 (프라이머 1 서열식별번호: 95, 프라이머 2 서열식별번호: 94),
    AMACR (프라이머 1 서열식별번호: 98, 프라이머 2 서열식별번호: 97),
    AR 변이체 7/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 101, 프라이머 2 서열식별번호: 100),
    AR 변이체 7/세트3 (프라이머 1 서열식별번호: 104, 프라이머 2 서열식별번호: 103),
    AR 변이체 12/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 107, 프라이머 2 서열식별번호: 106),
    AR 변이체 12/세트4 (프라이머 1 서열식별번호: 110, 프라이머 2 서열식별번호: 109),
    UGT2B15/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 113, 프라이머 2 서열식별번호: 112),
    UGT2B15/세트5 (프라이머 1 서열식별번호: 116, 프라이머 2 서열식별번호: 115), 및
    STEAP2 (프라이머 1 서열식별번호: 125, 프라이머 2 서열식별번호: 124)
    으로부터 선택되고,
    유방암-선택적 유전자는 PGR, PIP, FAT2, TMPRSS4, AGR2, FAT1, RND3, PKP3, PRAME 및 SCGB2A1 중 5종 이상을 포함하고, 유방암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    PGR (프라이머 1 서열식별번호: 62, 프라이머 2 서열식별번호: 61),
    PIP (프라이머 1 서열식별번호: 164, 프라이머 2 서열식별번호: 163),
    FAT2 (프라이머 1 서열식별번호: 26, 프라이머 2 서열식별번호: 25),
    TMPRSS4 (프라이머 1 서열식별번호: 203, 프라이머 2 서열식별번호: 202),
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1),
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),
    RND3 (프라이머 1 서열식별번호: 77, 프라이머 2 서열식별번호: 76),
    PKP3 (프라이머 1 서열식별번호: 65, 프라이머 2 서열식별번호: 64),
    PRAME (프라이머 1 서열식별번호: 149, 프라이머 2 서열식별번호: 148),　
    AR 변이체 7/세트1 (프라이머 1 서열식별번호: 101, 프라이머 2 서열식별번호: 100),
    AR 변이체 7/세트3 (프라이머 1 서열식별번호: 104, 프라이머 2 서열식별번호: 103), 및
    SCGB2A1 (프라이머 1 서열식별번호: 83, 프라이머 2 서열식별번호: 82)
    으로부터 선택되고,
    폐암-선택적 유전자는 SFRP2, FAT1, TMPRSS4, FOXF1, ARG2 및 FAT2 중 5종 이상을 포함하고, 폐암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    SFRP2 (프라이머 1 서열식별번호: 194, 프라이머 2 서열식별번호: 193),　
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),　
    TMPRSS4 (프라이머 1 서열식별번호: 203, 프라이머 2 서열식별번호: 202),　
    FOXF1 (프라이머 1 서열식별번호: 209, 프라이머 2 서열식별번호: 208),　
    AGR2 (프라이머 1 서열식별번호: 2, 프라이머 2 서열식별번호: 1), 및
    FAT2 (프라이머 1 서열식별번호: 26, 프라이머 2 서열식별번호: 25)
    으로부터 선택되고,
    췌장암-선택적 유전자는 ALDH1A3, CDH11, EGFR, FAT1, MET, PKP3, RND3, S100A2 및 STEAP2 중 5종 이상을 포함하고, 췌장암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    ALDH1A3 (프라이머 1 서열식별번호: 5, 프라이머 2 서열식별번호: 4),　
    CDH11 (프라이머 1 서열식별번호: 11, 프라이머 2 서열식별번호: 10),　
    EGFR (프라이머 1 서열식별번호: 20, 프라이머 2 서열식별번호: 19),　
    FAT1 (프라이머 1 서열식별번호: 23, 프라이머 2 서열식별번호: 22),　
    MET (프라이머 1 서열식별번호: 47, 프라이머 2 서열식별번호: 46),　
    PKP3 (프라이머 1 서열식별번호: 65, 프라이머 2 서열식별번호: 64),　
    RND3 (프라이머 1 서열식별번호: 77, 프라이머 2 서열식별번호: 76),　
    S100A2 (프라이머 1 서열식별번호: 80, 프라이머 2 서열식별번호: 79), 및　
    STEAP2 (프라이머 1 서열식별번호: 125, 프라이머 2 서열식별번호: 124)
    으로부터 선택되고,
    간암-선택적 유전자는 AHSG, ALB, APOH, FGB 및 FGG이고, 간암-선택적 유전자에 상응하는 프라이머 세트는:
    AHSG (프라이머 1 서열식별번호: 152, 프라이머 2 서열식별번호: 151),　
    ALB (프라이머 1 서열식별번호: 140, 프라이머 2 서열식별번호: 139),　
    APOH (프라이머 1 서열식별번호: 233, 프라이머 2 서열식별번호: 232),　
    FGB (프라이머 1 서열식별번호: 239, 프라이머 2 서열식별번호: 238), 및　
    FGG (프라이머 1 서열식별번호: 242, 프라이머 2 서열식별번호: 241)
    이고,
    흑색종-선택적 유전자는 PMEL, MLANA, MAGEA6, PRAME, TFAP2C 및 SOX10 중 5종 이상을 포함하고, 흑색종 암-선택적 유전자에 상응하는 적어도 5개의 프라이머 세트는 하기로 이루어진 군:
    PMEL (프라이머 1 서열식별번호: 68, 프라이머 2 서열식별번호: 67),
    MLANA (프라이머 1 서열식별번호: 50, 프라이머 2 서열식별번호: 49),
    MAGEA6 (프라이머 1 서열식별번호: 44, 프라이머 2 서열식별번호: 43),
    PRAME (프라이머 1 서열식별번호: 149, 프라이머 2 서열식별번호: 148),
    TFAP2C (프라이머 1 서열식별번호: 131, 프라이머 2 서열식별번호: 130), 및
    SOX10 (프라이머 1 서열식별번호: 89, 프라이머 2 서열식별번호: 88)
    으로부터 선택되는 것인,
    조성물.
  18. 제17항에 있어서, 증폭된 CTC가 기지의 암을 갖는 환자로부터 경시적으로 수득된 다중 혈액 샘플에서 분석되고, CTC를 테스트하거나, 영상화하거나, 또는 테스트 및 영상화 둘 다를 하여 환자에 대한 예후를 제공하는 것인 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 증폭된 CTC가 치료적 개입에 대한 CTC에 의한 반응의 지시를 제공하기 위해 분석되는 것인 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 증폭된 CTC가 혈액 샘플이 수득된 환자 내의 종양 부담의 척도를 제공하기 위해 분석되는 것인 조성물.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
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  28. 삭제
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