JP2021502098A - 微生物選択システム - Google Patents
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Abstract
Description
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために微小液滴へ両方の細胞を導入すること;
c. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
d. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する増強された増殖効果を示すことまたは阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために別個の微小液滴へ両方の細胞を導入すること;
c. インキュベーションのために微小液滴を融合させることによって第一の微生物を第二の微生物と直接接触させること;
d. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
e. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する増強された増殖効果を示すことまたは阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために微小液滴へ第一の微生物の導入すること;
c. インキュベーションのために第二の微生物を微小液滴にピコインジェクションすることによって第一の微生物を第二の微生物と直接接触させること;
d. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
e. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する増強された増殖効果を示すことまたは阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
本発明の第一の態様は、第一の微生物がエフェクター化合物を分泌する可能性があり、それによって(i)第二の微生物の細胞分裂活性に対する阻害効果または(ii)第二の微生物の細胞分裂活性に対する増強効果のいずれかを有する、前記第一の微生物を識別する方法であって、
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために微小液滴へ両方の細胞を導入すること;
c. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
d. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する増強された増殖効果を示すことまたは阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために微小液滴へ両方の細胞を導入すること;
c. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
d. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が細胞分裂活性を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために別個の微小液滴へ両方の細胞を導入すること;
c. インキュベーションのために微小液滴を融合させることによって第一の微生物を第二の微生物と直接接触させること;
d. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
e. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する増強された増殖効果を示すことまたは阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために微小液滴へ第一の微生物の導入すること;
c. インキュベーションのために第二の微生物を微小液滴にピコインジェクションすることによって第一の微生物を第二の微生物と直接接触させること;
d. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
e. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する増強された増殖効果を示すことまたは阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために微小液滴へ両方の細胞を導入すること;
c. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
d. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法に関する。
・植物の成長を促進する細菌株(生物肥料);
・病原体の増殖を阻害する細菌株(植物病原体、ヒト病原体、動物病原体-生物的殺菌剤、生物的殺虫剤、生物的除草剤、乳製品およびその他の食品用の生物学的防腐剤(株)、黄色ブドウ球菌のような特定の病原体の過剰増殖を防止する株);
・「バランスのとれた」微生物叢を促進する細菌株、すなわち、それらは他の微生物の増殖を完全には妨げないが、全ての株が健康な平衡状態にある環境(免疫健康、消化健康、スキンケアなどの領域)を作り出す;
・抗菌薬として作用する細菌株で、動物の家畜における治療/予防または増殖促進のための抗生物質の代わりに使用できるもの。
・cip/kipファミリーは、遺伝子p21、p27およびp57を含む。これらはサイクリン−CDK複合体に結合して不活性化することにより、G1期で細胞周期を停止させる。p21はp53によって活性化される(これは、次に、たとえば放射線によるDNA損傷によって引き起こされる)。p27は増殖阻害剤であるトランスフォーミング増殖因子β (TGF β)によって活性化される。
・INK4a/ARFファミリーには、CDK4に結合して細胞周期をG1期で停止させるp16INK4aと、p53の分解を妨げるp14ARFがある。
本発明はまた、本発明による方法によって同定された微生物またはエフェクター化合物に関する。
マイクロ流体エマルションを用いた微生物選択システムを実証するために、2つの異なる微生物を用いた。ある微生物が増殖し分裂できるためには、第二の微生物が産生する化合物が必要である。第一の微生物は、トリプトファン要求性出芽酵母(S. cerevisiae)株CLIB339である。この株はアミノ酸の完全な補完を含む増殖培地でよく増殖するが、トリプトファンなしでは増殖しない。第二の微生物は、トリプトファンを過剰産生するプラスミドを含む大腸菌株である。第一の微生物である栄養要求性出芽酵母(S. cerevisiae)が、トリプトファン産生大腸菌株の存在下で増殖するかどうかを試験した。出芽酵母の増殖を検出するために、mCherryタンパク質を発現する遺伝子を導入し、酵母を蛍光化した。蛍光はマイクロ流体プラットホーム上の液滴中で容易に検出可能であり、出芽酵母株のバイオマスの生産(すなわち、増殖および分裂)の指標として役立つことができる。
プラスミドpD1217へのmCherryのクローニングと出芽酵母の形質転換
mCherryの発現を担う遺伝子をpRFSD-mCherryから増幅し(表1参照)、アンプリコンの末端にSapI制限部位を加えた。次に、PCR産物とpD1217(表1参照)をSapIで消化し、一緒に連結した。次にライゲーションを大腸菌DH5αに形質転換し、33μg/mLのカナマイシンを添加したルリア−ベルターニ (LB)寒天プレート上で37℃で一晩増殖させた。プラスミド構築物を制限消化により検証した。得られたpD1217-mCherryと命名されたプラスミドはその後、出芽酵母 CLIB339(表1参照)に形質転換され、CLIB339(pD1217-mCherry)とした。
大腸菌株DH5αをプラスミドpSC101-trp.l15で形質転換し(表1参照)、10μLg/mLテトラサイクリンを含む培地で形質転換体を選択した。
フローフォーカシングデバイス(FFD)
ポリ‐(ジメチルシロキサン) (PDMS)マイクロ流体FFDの作製を21または30μmの型枠から作製した。フォトリソグラフィー技術により型枠(モールド)を作製した。FFDはAutoCadを用いて設計し、フォトマスク上に印刷した。フォトマスクは、ネガティブフォトレジストSU8-2015またはSU8-2025を用いて、それぞれ高さ21および30μmのマスターモールドを製造することにより、コーティングされたガラスウエハ上に移した。
3M HFE7500中のチップ疎水性1% w/wトリクロロ(1H,1H,2H,2H‐ペルフルオロオクチル)シランをPDMSチップの出口チャンネルにフラッシュして全チャンネルを充填した。次に、N2ガスを使用して溶液を除去した。
大腸菌(pSC101-trp.l15)および出芽酵母 CLIB339(pD1217-mCherry)を、それぞれ20μL/mLのテトラサイクリンを添加したDOMT培地で、37℃で、および20μL/mLのテトラサイクリンと76μg/mLのトリプトファンを添加したDOMT培地で、37℃で、2日間別々に増殖させた。出芽酵母 CLIB339(pD1217-mCherry)2mLを回収し、PBS pH 7.2で洗浄し、3000gで3回、3分間遠心分離した。細胞を20μL/mLテトラサイクリンでDMOTに再懸濁した。
1) 陽性対照-20μL/mLのテトラサイクリンと76μg/mLのトリプトファンを添加したDMOT中の出芽酵母 CLIB339(pD1217-mCherry)1mL、
2) 陰性対照-20μL/mLのテトラサイクリンを添加したDMOT中の出芽酵母CLIB339(pD1217-mCherry)1mL、および
3) 試験試料-20μL/mLのテトラサイクリンを添加したDMOT中の共培養中の大腸菌(pSC101-trp.l15)と出芽酵母 CLIB339(pD1217-mCherry)1mL。
上記の酵母および共培養懸濁液を別々のFFDに流し(図9)、HFE7500、2.5% w/w界面活性剤(RANバイオテクノロジー)からなる油相によって切断し、油滴中に20pLの水を生成した。すべての液滴を同じバイアルに採取し、37℃で一晩インキュベートした。各懸濁液について400万液滴を採取した。
データ収集プログラムを用いて約370万個の液滴を処理した。PMT3陽性液滴は、陽性mCherry蛍光および液滴内部の出芽酵母CLIB339(pD1217-mCherry)の存在を表す。これは図10のy軸上に表されている。長方形で区切られ、「試験」で印をつけた液滴は、出芽酵母CLIB339(pD1217-mCherry)と大腸菌(pSC101-trp.l15)の両方を含む液滴である。一方、「-」記号で印をつけた長方形で区切られた液滴は、トリプトファンを含まない培地で出芽酵母CLIB339(pD1217-mCherry)のみを含んでいた。
Claims (7)
- 第一の微生物がエフェクター化合物を分泌する可能性があり、それによって(i)第二の微生物の細胞分裂活性に対する阻害効果または(ii)第二の微生物の細胞分裂活性に対する増強効果のいずれかを有する、前記第一の微生物を識別する方法であって、
a. 目的のエフェクター化合物を産生する可能性がある第一の微生物由来の細胞および第二のディテクター微生物由来の細胞を提供すること;
b. インキュベーションのために微小液滴へ両方の細胞を導入すること;
c. マイクロ流体システムへ微小液滴を導入すること;
d. 前記マイクロ流体システムにおいて、第二の微生物の細胞が、前記エフェクター化合物に起因する増強された増殖効果を示すことまたは阻害された増殖効果を示すことを分析すること、を含む方法。 - ステップc)の後にエフェクター物質を単離するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の微生物および/または第二の微生物が、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、真核細胞または原核細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第一の微生物が、所望のエフェクター物質を産生する微生物を含むことが疑われる天然試料由来であるか、または前記試料がランダム突然変異誘発によって生成された変異株プール由来である、請求項1から3に記載の方法。
- インキュベーションがマイクロ流体システムで行われる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エフェクター化合物が、エフェクター化合物が、L-およびD-アミノ酸;L-アラビノース、N-アセチル-D-グルコサミン、N-アセチル-D-マンノサミン、N-アセチルノイラミン酸、ラクトース、D-グルコサミン、D-グルコース-6-リン酸、D-キシロース、D-ガラクトース、グリセロール、マルトース、マルトトリオース、およびメリビオースなどの糖類および炭素源;シチジン、グアニン、アデニン、チミジン、グアノシン、アデノシンなどのヌクレオシド;ヘキサデカン酸や3-リン酸グリセロールなどの脂質;インドール、マルトヘキソース、マルトペントース、プトレシン、スペルミジン、オルニチン、テトラデカン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含むがこれらに限定されない一次代謝産物、または二次代謝産物である、請求項1から5に記載の方法。
- 請求項1から6のいずれかによって同定された微生物またはエフェクター化合物。
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