KR102496176B1 - 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양용 최적화 배지 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양 방법 - Google Patents

락토바실러스 플란타룸 균주의 배양용 최적화 배지 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄소원으로서, 말토오스(maltose); 및 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양용 배지 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양 방법에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 플란타룸 균주의 배양용 최적화 배지 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양 방법{optimized medium for culturing Lactobacillus plantarum strain and method for culturing Lactobacillus plantarum strain using the same}
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양용 최적화 배지 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양 방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 적절한 양을 섭취하였을 때, 장내 미생물총을 개선시키고 숙주에게 이로운 영향을 주는 살아있는 미생물을 의미한다. 프로바이오틱스 상품의 소비가 증가함에 따라 유산균을 식품에 적용하는 기술 및 유산균의 대량생산과 생산 최적화 연구도 활발히 진행되고 있다. Lactobacillus 속은 Bifidobacterium 속과 더불어 프로바이오틱스로 간주되는 균으로 성장조건이 까다로운 미생물 중 하나이다. 락토바실러스의 높은 성장을 위해서는 아미노산, 펩타이드, 비타민, 핵산 등이 영양분이 포함된 배지가 필요하다. 배지성분 이외에도 pH, 온도 등의 배양조건 또한 락토바실러스의 성장에 상당한 영향을 끼친다. 따라서 균주에 따른 최적 배양조건을 찾는 것이 산업적으로 중요하다.
One-factor-at-a-time(OFAT) 실험은 다른 요인들은 일정한 수준으로 고정한 채 하나의 요인만 변화를 주는 것으로 간단한 실험 설계 방법이기에 다양한 최적화 실험에 많이 사용되었다. 하지만 OFAT는 상당한 시간과 노동력을 요구하며 요인들의 효과(effect)를 파악하기 어려운 단점이 있다. 이에 반해 반응표면분석법(Response surface methodology, RSM)은 완전요인 배치법과 회귀분석을 포함하는 통계적 분석 방법으로 실험계획, 모델구축, 요인들의 효과분석이 가능하다. 반응변수가 이루는 표면을 통계적으로 분석하기 때문에 회귀변수의 변화에 따른 반응량을 예측할 수 있다. 또한, 반응량의 최소, 최대, 최적이 되는 회귀변수의 값을 추정할 수 있다. 여러 실험 계획법 중 중심합성계획법(Central composite design, CCD)이 RSM을 통한 최적조건을 구축할 때 효과적인 방법으로서 사용이 되고 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 균주를 최적으로 배양을 위한 배지로서, 탄소원으로서, 말토오스(maltose); 및 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양용 배지 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 탄소원으로서, 말토오스(maltose); 및 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양용 배지를 제공한다.
상기 말토오스(maltose)의 농도는 3.0 내지 3.5%(w/v) 이고, 상기 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)의 농도는 각각 2.7 내지 3.2%(w/v) 및 3.7 내지 4.2%(w/v)일 수 있다.
상기 배지는 MnSO4, MgSO4, K2HPO4, KH2PO4 및 NaCl로 이루어진 군으로부터 선택된 미량 원소를 0.001 내지 1.0%(w/v) 농도로 추가로 포함할 수 있다.
상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655 균주(KCCM 12204P)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 배지에, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양 방법을 제공한다.
상기 배양은 초기 pH 4.5 내지 9.0 및 25 내지 35℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양용 배지는 탄소원으로서, 말토오스(maltose); 및 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 포함하는 것을 특징으로 하는바, 상기 배지에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(특히, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655 균주(KCCM 12204P))를 접종하여 배양하였을 때, 기존에 사용되는 MRS 배지와 같은 상업용 배지에서의 배양 효율보다 증가된 배양 효율을 나타낼 수 있으므로, 산업적인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양에서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 배지의 다양한 탄소원에 따른 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량 차이를 비교한 그래프이다.
도 2는 배지의 다양한 질소원에 따른 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량 차이를 비교한 그래프이다.
도 3은 배지의 다양한 미량원소에 따른 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량 차이를 비교한 그래프이다.
도 4는 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량에 대한, 말토오스(maltose), 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone)의 교호작용을 나타낸 등고선도이다[(A) 말토오스(maltose) 및 소이톤(soytone)의 교호작용, (B) 말토오스(maltose) 및 효모 추출물(yeast extract)의 교호작용, (C) 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)의 교호작용].
도 5는 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량에 대한, 말토오스(maltose), 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone)의 교호작용을 나타낸 3차원 반응표면도이다[(A) 말토오스(maltose) 및 효모 추출물(yeast extract)의 교호작용, (B) 말토오스(maltose) 및 소이톤(soytone)의 교호작용, (C) 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)의 교호작용].
도 6은 RSM 최적화 배지 및 MRS 배지에서의 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량을 비교한 그래프이다.
도 7은 배양시 초기 pH에 따른 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량 차이를 비교한 그래프이다.
도 8은 배양시 온도에 따른 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 건조균체량 차이를 비교한 그래프이다.
본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 균주를 최적으로 배양을 위한 배지에 대해 연구하던 중, 반응표면분석법을 이용하여 건조균체량의 증량에 영향을 주는 인자들의 최적 농도를 예측하였다. 또한, 통계적 분석을 통하여 실험모델의 적합성을 확인하고, 실험모델에 의해 예측된 값을 실험으로 검증하여 실험모델의 신뢰성이 높음을 확인하였다. 배지의 최적화 후 초기 pH 및 온도에 따른 배양 조건을 확인하여 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양 조건을 최적화시킴으로써, 본 발명을 완성하였다.
먼저, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "건조균체량"은 배지 내에서 배양된 미생물 균주의 건조 중량(dry cell weight)과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 배지 내 에서 배양된 미생물의 생균수가 유사하다고 하더라도, "건조균체량"에 있어서 차이가 난다면, 이는 단일 미생물 당 성장된 크기가 달라 건조 중량의 차이를 나타낼 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 즉, 상이한 배지에서 각각 배양된 미생물 균주의 배양 결과에서 유사 또는 동일한 수준으로 생균수를 나타낸다고 하더라도, "건조균체량"에 차이가 있다면, 그 균체량이 높은 수준으로 나타나는 배양 조건에서 보다 배양 효율이 좋은 것으로 이해될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "배양 효율"은 배양 시간 대비 최대 균체 수득률을 의미한다. 배양 시간 중 최대의 건조균체량을 나타낼 수 있는 시간을 배양 최적 시간으로 설정하고, 상기 배양 최적 시간에 따른 건조균체량을 비율로 계산하여 배양 시간 대비 최대 균체 수득률을 구하여 이를 배양 효율로서 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 탄소원으로서, 말토오스(maltose); 및 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양용 배지를 제공한다.
본 발명에 따른 배지는 락토바실러스 플란타룸 균주를 최적으로 배양을 위한 것으로, 탄소원으로서, 말토오스(maltose); 및 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 포함하는데, 반응표면분석법을 수행한 결과를 토대로 그 최적 농도를 도출해낸 것을 특징으로 한다.
먼저, 상기 배지는 탄소원으로서, 말토오스(maltose)를 포함하는데, 상기 말토오스(maltose)의 농도는 3.0 내지 3.5%(w/v)인 것이 바람직하고, 상기 말토오스(maltose)의 농도는 3.0 내지 3.3%(w/v)인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 배지는 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)를 포함하는데, 상기 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)의 농도는 각각 2.7 내지 3.2%(w/v) 및 3.7 내지 4.2%(w/v)인 것이 바람직하고, 상기 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)의 농도는 각각 2.9 내지 3.1%(w/v) 및 3.85 내지 4.05%(w/v)인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 배지는 MnSO4, MgSO4, K2HPO4, KH2PO4 및 NaCl로 이루어진 군으로부터 선택된 미량 원소를 0.001 내지 1.0%(w/v) 농도로 추가로 포함할 수 있고, MnSO4 또는 MgSO4를 0.05 내지 0.5%(w/v) 농도로 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
그밖에, 상기 배지는 소듐 아세테이트(sodium acetate) 0.3 내지 0.8%(w/v), K2HPO4 0.1 내지 0.5%(w/v) 및 tween 80 0.05 내지 0.2%(w/v)를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655 균주(KCCM 12204P)일 수 있다.
구체적으로, 상기 균주(KCCM 12204P)는 2018년 1월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 12204P를 부여받았다. 상기 균주(KCCM 12204P)는 락토바실러스 플란타룸의 아종인데, 락토바실러스 프란타룸은 그람양성의 간균으로 약간의 호기성을 띄는 균주로 자연계에서 가장 분포가 넓은 유산균 중 하나이다. 락토바실러스 프란타룸은 정상 유산 발효를 하며 대표적인 김치 유산균으로서 아라비노스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 슈크로스, 덱스트란 등을 발효하여 젖산을 생성한다. 주로 유제품이나 피클이나 김치와 같은 침채류, 토마토 등에서 분리되며 특히 김치의 발효 후기에 김치의 발효가 많이 되어 신맛이 날 때 주로 생장하여 우점하게 되면서 다른 종의 생육을 억제하는 균으로 통상적으로 내산성 및 내담즙성이 우수한 것으로 알려져 있다. 특히, 상기 균주(KCCM 12204P)는 면역 증강 효능, 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료 효능을 가지는바, 본 발명에 따른 배지를 이용하여 상기 균주(KCCM 12204P)를 최적으로 배양함으로써, 상기 효능을 극대화시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지에, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양 방법을 제공한다.
상기 배양은 정치 배양, 유가식 배양 및 회분식 배양 중 어느 하나의 배양 방법으로 수행할 수 있고, 구체적으로, 상기 배양은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주가 성장하기에 적합한 온도에서 수행되는 것이 바람직하므로, 초기 pH 4.5 내지 9.0(바람직하게는, 6.5 내지 7.5) 및 25 내지 35℃(바람직하게는, 27 내지 32℃의 온도에서 수행될 수 있다. 한편, 상기 초기 pH 범위나 온도 범위를 벗어나는 경우에는 배양 효율이 저하되는 문제점이 있다.
상기 검토한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양용 배지는 탄소원으로서, 말토오스(maltose); 및 질소원으로서, 효모 추출물(yeast extract) 및 소이톤(soytone)을 포함하는 것을 특징으로 하는바, 상기 배지에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(특히, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655 균주(KCCM 12204P))를 접종하여 배양하였을 때, 기존에 사용되는 MRS 배지와 같은 상업용 배지에서의 배양 효율보다 증가된 배양 효율을 나타낼 수 있으므로, 산업적인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양에서 효과적으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 준비 및 건조균체량 측정
본 발명에서 락토바실러스 플란타룸 균주로서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655 균주(KCCM 12204P)를 사용하였다. Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주는 김치 유래의 유산균으로 알려져 있으며, 한국미생물보존센터에서 제공받아 사용하였다. Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주는 MRS 배지에 접종하고, 37℃에서 정치 배양하면서 12 시간 간격으로 총 3회 계대 배양하였다. 600 ㎚ 흡광도에서 균주의 농도가 0.5±0.05가 되도록 맞춘 다음, 본배양(main culture)으로 옮겨 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주를 1%(w/v) 접종하여 32℃에서 24시간 정치배양하였다.
그 다음, 배양액 50 mL을 수거한 후 4,000Хg, 4℃에서 15분 동안 원심분리한 다음 멸균 증류수로 2번 세척하였다. 80℃로 유지된 건조기에서 항량에 도달할 때까지 건조한 후 질량을 측정하였다.
실시예 2: 균체 성장을 위한 탄소원, 질소원 및 미량 원소의 선별
Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 배양용 배지 최적화를 위하여 균체 성장에 가장 높은 영향력을 보이는 탄소원, 질소원 및 미량 원소를 선별하였다. 기본 배지 성분은 다음과 같다: 5 g/L sodium acetate(Sigma, USA), 2 g/L K2HPO4(Samchun, Korea) 0.1 g/L MgSO4 ·7 H2O(Shinyo pure chemicals Co, Japan), 0.05 g/L MnSO4·H2O(Samchun, Korea) 및 1 g/L tween 80(Yakuri pure chemicals Co. Ltd, Japan). 배지 100 mL를 제조하여 실험에 사용하였다. 배지 제조 후 1 M HCl 및 1 M NaCl을 이용하여 초기 pH를 6.5로 조정한 다음 오토클레이브(autoclave)로 121℃에서 15분 동안 멸균하였다.
탄소원의 종류는 API 50 CHL 배지 키트(medium kit)를 이용하여 균주의 탄소원 이용성을 알아본 다음 선정하였다. 탄소원으로는 글루코오스(glucose, Sigma, USA), 수크로오스(sucrose, Samchun, Korea), 말토오스(maltose, Junsei, Japan), 프럭토오스(fructose, Merck, German), 락토오스(lactose, Difco, USA), 갈락토오스(galactose, Difco, USA)를 사용하였다. 효모 추출물(yeast extract, Difco, USA) 0.5%(w/v)을 추가한 기본 배지에 탄소원 2%(w/v)을 첨가하여 배지를 제조하였고, 정치배양 후 건조균체량을 측정한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 탄소원으로 말토오스(maltose)를 사용한 배지에서의 건조균체량은 1.394±0.067 g/L로 가장 높은 값을 내었고, 그 다음으로는 수크로오스(sucrose), 갈락토오스(galactose), 락토오스(lactose), 글루코오스(glucose), 프럭토오스(fructose) 순으로 각각 1.349±0.062 g/L, 0.731±0.057 g/L. 0.501±0.086 g/L, 0.291±0.172 g/L, 0.084±0.043 g/L의 건조균체량이 측정되었다. 따라서, Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 배양용 최적화 배지에서 탄소원은 말토오스(maltose)인 것으로 결정하였다.
질소원으로는 트립톤(tryptone, Difco, USA), 소이톤(soytone, Difco, USA), 펩톤(peptone, Difco, USA), 효모 추출물(yeast extract, Difco, USA), 비프 추출물(beef extract, Difco, USA), 맥아 추출물(malt extract, Difco, USA)를 사용하였다. 말토오스(maltose) 2%(w/v)를 추가한 기본 배지에 질소원 1%(w/v)을 첨가하여 배지를 제조하였고, 정치배양 후 건조균체량을 측정한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 질소원으로 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone)를 사용한 배지에서의 건조균체량은 각각 1.551±0.106 g/L 및 1.069±0.022 g/L 로 높은 값을 내었고, 그 다음으로는 트립톤(tryptone), 비프 추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 맥아 추출물(malt extract) 순으로 각각 0.751±0.063 g/L, 0.682±0.064 g/L, 0.577±0.060 g/L, 0.181±0.075 g/L 의 건조균체량이 측정되었다. 따라서, Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 배양용 최적화 배지에서 질소원은 효모 추출물(yeast extract) 또는 소이톤(soytone)인 것으로 결정하였다.
미량 원소로는 MgSO4, MnSO4, K2HPO4, KH2PO4, NaCl을 사용하였다. 말토오스(maltose) 2%(w/v) 및 효모 추출물(yeast extract) 1%(w/v)를 추가한 기본 배지에 미량 원소 0.1%(w/v)을 첨가하여 배지를 제조하였고, 정치배양 후 건조균체량을 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 미량 원소로 MnSO4를 사용한 배지에서의 건조균체량은 0.807±0.032 g/L로 높은 값을 내었고, 다른 미량 원소인 MgSO4, K2HPO4, KH2PO4, NaCl에 비하여 1.77배, 1.69배, 1.68배, 1.74배 높은 값을 보였다. 따라서, Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 배양용 최적화 배지에서 미량 원소는 MnSO4인 것으로 결정하였다.
실시예 3: 반응표면분석법을 이용한 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 배양용 배지의 최적화
실시예 2에서 선별된 탄소원, 질소원 및 미량 원소의 최적 농도를 결정하기 위해서 중심합성계획법(Central composite design, CCD)을 이용하여 반응표면분석법(Response surface methodology, RSM)을 진행하였다. 실시예 2에서 말토오스(maltose), 효모 추출물(yeast extract), MnSO4가 영향력이 높은 요인으로 선별되었으나, MnSO4는 다른 요인들에 비해 상대적으로 영향력이 낮았으며, 균주가 요구하는 효모 추출물(yeast extract)의 양이 상당했기 때문에 MnSO4를 소이톤(soytone)으로 변경하여 실험을 진행하였다. 독립변수로는 말토오스(maltose)(g/L, X1), 효모 추출물(yeast extract)(g/L, X2), 소이톤(soytone)(g/L, X3) 3가지 요인을 -α, -1, 0, 1, α로 5단계 수준으로 부호화하였다. 실험계획은 중심합성계획법에 따라 8개의 꼭짓점, 6개의 축점, 6개의 중심점을 포함하는 20개의 실험구로 하였다. 독립변수에 따른 종속변수(Y)는 건조균체량으로 하여 설정된 조건에 따라 배지를 제작하여 실험하였다. 회귀분석 모델식은 다음과 같다.
Figure 112020114357793-pat00001
Y는 종속변수,
Figure 112020114357793-pat00002
Figure 112020114357793-pat00003
와
Figure 112020114357793-pat00004
Figure 112020114357793-pat00005
는 독립변수,
Figure 112020114357793-pat00006
Figure 112020114357793-pat00007
은 절편,
Figure 112020114357793-pat00008
Figure 112020114357793-pat00009
는 회계계수이다. Minitab 18 program을 이용하여 실험 계획 수립과 통계 분석하였고 회귀방정식 모델을 도출하였다. 이 방정식을 바탕으로 최대 균체량 생산이 가능한 각 요인들의 최적 농도를 결정하였으며, 실험 모델의 유의성 또한 확인하였다.
앞서 선발된 말토오스(maltose), 효모 추출물(yeast extract) 및 MnSO4 3가지 요인을 대상으로 반응표면분석법을 진행하였다. 이때, 각 요인들의 중앙점은 25 g/L, 55 g/L, 0.15 g/L로 설정하여 실험구 20개의 중심합성계획법을 이용하여 실험을 진행하였다. 실험 결과, 각 요인들은 모두 건조균체량에 대하여 양의 영향을 끼침을 확인하였다. 그러나, MnSO4의 p-value 0.05 이상으로 유의하지 않게 나왔으며 영향 계수 또한 0.0083으로 매우 낮게 측정되어 제외하였다. 또한, 효모 추출물(yeast extract)의 경우 71.33 g/L 이상의 높은 농도를 요구하였기 때문에 산업적으로 용이한 최적 배지 제작 목표와 맞지 않아 실험을 수정하여 진행하였다. 따라서 MnSO4는 0.05 g/L의 농도로 하여 기본 배지성분으로 첨가하였고, 질소원을 보완할 목적으로 소이톤(soytone)을 추가하였다.
말토오스(maltose)(X1), 효모 추출물(yeast extract)(X2), 소이톤(soytone) (X3) 3가지 요인을 독립변수로 하여 중심합성계획법을 이용하여 실험계획을 수립하였다. 각 독립변수는 예비 실험을 진행하여 각각 25 g/L, 25 g/L, 30 g/L의 농도로 중심점을 설정하였다. 이를 바탕으로 -1.68, -1, 0, 1, 1.68 5개 수준으로 부호화하였다. 중심점 6개를 포함한 20개의 실험구를 실행하여 반응값(Y, 건조균체량)을 측정하였다(표 1).
독립변수 부호
(unit)		 암호화된 변수 수준
- α 1 0 1 α
Maltose X1 (g/L) 8.18 15 25 35 41.82
Yeast extract X2 (g/L) 8.18 15 25 35 41.82
Soytone X3 (g/L) 4.77 15 30 45 55.23
횟수 변수 Y(g/L)
X1 X2 X3
1 -1 -1 -1 2.484
2 1 -1 -1 3.216
3 -1 1 -1 2.620
4 1 1 -1 3.486
5 -1 -1 1 2.896
6 1 -1 1 3.714
7 -1 1 1 3.196
8 1 1 1 3.892
9 -1.682 0 0 2.348
10 1.682 0 0 3.570
11 0 -1.682 0 3.354
12 0 1.682 0 3.650
13 0 0 -1.682 3.232
14 0 0 1.682 3.546
15 0 0 0 3.846
16 0 0 0 3.684
17 0 0 0 3.610
18 0 0 0 3.794
19 0 0 0 3.810
20 0 0 0 3.728
Minitab 18 program을 사용하여 데이터 분석을 진행하였으며 건조균체량에 대한 회귀방정식은 다음과 같다:
Figure 112020114357793-pat00010
Figure 112020114357793-pat00011
Figure 112020114357793-pat00012
분산분석 결과 모델의 p-value 값은 0.0001 이하로 높은 유의성을 보였으며, 결정계수
Figure 112020114357793-pat00013
Figure 112020114357793-pat00014
의 값 또한 0.9676으로 1에 가까워 모형의 적합함을 확인하였다. 회귀방정식의 독립변수와 종속변수의 관계의 적합성을 확인하는 적합성 결여의 p-value는 0.1774로 나타났다. 이는 유의성 판단 기준인 0.05보다 높은 값으로 적합성 결여가 유의하지 않음을 의미하며 이는 회귀모델을 설명하는데 적합함을 의미한다(표 2).
소스 계수 예측 DF
(Degree of freedom)		 Adj SS
(Adjusted sum of square)		 Adj MS
(Adjusted mean square)		 F-value p-value
모델 3.7475 9 3.9906 0.4434 33.22 <0.0001***
X1 0.3784 1 1.9550 1.9550 146.46 <0.0001***
X2 0.1012 1 0.1398 0.1398 10.47 0.0089***
X3 0.1772 1 0.4289 0.4289 32.13 0.0002***
X1X2 0.0015 1 0.0000 0.0000 0.00 0.9714
X1X3 -0.0105 1 0.0009 0.0009 0.07 0.8024
X2X3 0.0090 1 0.0006 0.0006 0.05 0.8301
X1 2 -0.2922 1 1.2306 1.2306 92.18 <0.0001***
X2 2 -0.1002 1 0.1448 0.1448 10.85 0.0081***
X3 2 -0.1402 1 0.2832 0.2832 21.22 0.0010***
잔류물 10 0.1335
적합 결여 5 0.0944 2.42 0.1774
순수 오차(Pure error) 5 0.0391
총합 19 4.1241
건조균체량에 대하여 각 독립변수에 따른 교호작용을 알아보기 위하여 하나의 독립변수를 최적점에 고정한 뒤, 나머지 2개의 독립변수에 대하여 등고선도 및 3차원 반응표면도를 살펴보았고, 그 결과를 도 4 및 5에 각각 나타내었다.
반응표면분석법을 통하여 Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 최대 건조균체량은 3.9514 g/L로 예측되었으며, 이때 각 변수의 최적 농도는 말토오스(maltose) 31.6252 g/L, 효모 추출물(yeast extract) 29.9265 g/L 및 소이톤(soytone) 39.4284 g/L였다.
RSM 최적화 배지에서 건조균체량을 검증하기 위해, 각 배지성분들을 최적 농도에 맞춰서 배지를 제작하였다. Lactobacillus plantarum KCCM 200655를 1%(w/v) 접종하여 32℃에서 24시간 배양한 후 건조균체량을 측정하였다. 최적화 배지와의 비교를 위한 대조군으로는 유산균의 배양에 일반적으로 사용되는 MRS 배지를 사용하였다. 배지성분 이외에 온도, 배양시간, 접종비는 모두 동일하게 하여 실험을 진행하였고, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, RSM 최적화 배지에서 배양한 결과 건조균체량은 3.8453±0.0595 g/L이였다. 이는 실험 모델을 통해 예측된 3.9514 g/L와 유사한 값으로 실험 모델의 예측값이 유효하며 신뢰할 수 있는 수준인 것으로 확인된다. 또한, 대조군인 MRS 배지에서의 건조균체량 2.4287±0.0420 g/L와 비교하여 균체 생산이 58.33%(w/v) 증가한 것으로 확인된다.
실시예 3: Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 배양 조건 최적화
Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주의 배양에 있어서, 초기 pH와 온도에 따른 최적 생산 조건을 확립하기 위해 RSM 최적화 배지를 제조하여 실험을 진행하였다.
RSM 최적화 배지의 초기 pH를 pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0으로 설정한 후, Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주를 1%(w/v) 접종하여 32℃에서 24시간 정치배양한 다음 건조균체량을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. pH 조정에는 1M HCl 및 1M NaCl을 사용하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 초기 pH 4.0에서 건조균체량은 1.124±0.119 g/L로 가장 낮은 값을 보였다. 초기 pH 4.5에서 초기 pH 7.0까지 건조균체량은 점차 증가하여 pH 7.0에서 4.304±0.118 g/L로 가장 높은 값을 보였다. 이후, 초기 pH 7.5에서 초기 pH 9.0까지는 다소 감소하는 양상을 보였다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 KCCM 200655 균주는 초기 pH 4.5 내지 9.0(바람직하게는, 6.5 내지 7.5)에서 최적으로 배양될 수 있는 것으로 확인된다.
한편, RSM 최적화 배지의 pH를 7.0으로 조정한 후 배양 온도 22℃, 25℃, 27℃, 30℃, 32℃, 35℃로 설정한 후, Lactobacillus plantarum KCCM 200655 균주를 1%(w/v) 접종하여 32℃에서 24시간 정치배양한 다음 건조균체량을 측정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 기존 온도 조건인 32℃에서 건조균체량은 4.373±0.080 g/L를 보인 반면, 22℃에서 건조균체량은 3.156±0.048 g/L로 가장 낮은 값을 보였다. 22℃에서 30℃까지 건조균체량은 점차 증가하여 30℃에서 4.544±0.083 g/L로 가장 높은 값을 보였다. 이후, 30℃에서 35℃까지는 다소 감소하는 양상을 보였다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 KCCM 200655 균주는 25℃ 내지 35℃(바람직하게는, 27℃에서 32℃)에서 최적으로 배양될 수 있는 것으로 확인된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12204P 20180117

Claims (6)

  1. 탄소원으로서, 3.0 내지 3.5%(w/v) 농도의 말토오스(maltose); 및
    질소원으로서, 2.7 내지 3.2%(w/v) 농도의 효모 추출물(yeast extract) 및 3.7 내지 4.2%(w/v) 농도의 소이톤(soytone)을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655(KCCM 12204P) 균주의 배양용 배지.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배지는 MnSO4, MgSO4, K2HPO4, KH2PO4 및 NaCl로 이루어진 군으로부터 선택된 미량 원소를 0.001 내지 1.0%(w/v) 농도로 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655(KCCM 12204P) 균주의 배양용 배지.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제3항 중 어느 한 항에 따른 배지에, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655(KCCM 12204P) 균주를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655 (KCCM 12204P) 균주의 배양 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배양은 초기 pH 4.5 내지 9.0 및 25 내지 35℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCCM 200655 (KCCM 12204P) 균주의 배양 방법.
KR1020200140743A 2020-10-27 2020-10-27 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양용 최적화 배지 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양 방법 KR102496176B1 (ko)

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