KR102481996B1 - 로스팅 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 로스팅 삼백초 추출물의 피부개선 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 로스팅 삼백초 추출물은 삼백초 내 포함된 플라보노이드 및 폴리페놀의 함량이 유의적으로 증가하여 로스팅되지 않은 삼백초 추출물과 비교하여 미백, 주름개선, 보습 및 항염증 활성이 유의적으로 증가함으로써, 피부개선을 위한 기능성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

로스팅 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING OF SKIN COMPRISING ROASTING SAURURUS CHINENSIS EXTRACT AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 로스팅 삼백초 추출물의 피부개선 용도에 관한 것이다.

삼백초(Saururus chinensis)는 삼백초과에 속하는 다년생 초본으로, 잎은 녹색을 띠며 줄기 길이는 40 내지 80 ㎝ 정도로 자란다. 일반적으로 6월 하순경에 상위부 3 내지 4개의 잎이 백색으로 출현하며, 6 내지 8월에 백색 꽃과 줄기를 보여 삼백초라한다. 한국, 중국 및 일본 등지에 분포하고, 한국에서 남부지방과 제주도에서 자생 및 재배되고 있다.

삼백초의 전초나 뿌리를 건조한 것을 약용으로 사용하는데, 피부질환 및 내과질환에 전통적으로 사용되어 왔다. 삼백초에는 퀘르세틴(quercetin), 퀘르시트린(quercetrin), 이소퀘르시트린(isoquercetrin), 아비쿠라린(avicularin), 루틴(rutin) 등과 같은 페놀성 물질들이 다량 함유되어 있어, 항암 활성이 있다고 알려졌다. 이 중, 플라보노이드의 일종인 퀘르세틴 및 퀘르세트린은 식물계에 존재하는 천연 항산화제로서, 지방산화와 산화적 스트레스를 억제하고 활성산소를 제거함으로써 노화, 암, 심장병 등을 예방하는 효과를 나타내어 그 활용도가 높아지고 있다.

이와 같이 천연물에 존재하는 활성물질은 주로 배당체 형태로 존재하고 있으나, 배당체보다는 어글리콘(aglycone) 형태가 더 강력한 약리활성을 갖는 것으로 보고되었다. 이에, 배당체를 어글리콘으로 전환하기 위한 화학적 또는 효소적 방법이 많이 연구되고 있다. 그러나, 화학적 방법은 비환경적 요인 빛 부산물의 발생과 함께 낮은 수율이, 효소적 방법은 고비용의 발생이 문제로 대두되고 있다. 이에, 최근 미생물을 활용한 발효를 통해 어글리콘으로의 전환을 유도하는 방법이 보고되었으나, 공정중에 미생물을 제거하거나, 최종 단계에서 발효취를 제거하기 위한 탈취 공정등이 추가로 필요하다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-2020828호는 고압멸균추출된 삼백초 추출물을 누룩과 함께 발효시킨 뒤, 유기용매로 순차분획하여 수득된 부탄올 또는 물 분획물의 피부 미백용도를 개시하고 있다.

대한민국 등록특허 제10-2020828호

본 발명의 목적은 로스팅 삼백초 추출물의 피부개선 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 삼백초 내 플라보노이드 함량 증가 또는 생성 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로스팅 삼백초(Saururus chinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 로스팅 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 삼백초를 로스팅하는 단계를 포함하는 삼백초 내 플라보노이드 함량 증가 및 생성 방법을 제공한다.

본 발명의 로스팅 삼백초 추출물은 삼백초 내 포함된 플라보노이드 및 폴리페놀의 함량이 유의적으로 증가하여 로스팅되지 않은 삼백초 추출물과 비교하여 미백, 주름개선, 보습 및 항염증 활성이 유의적으로 증가함으로써, 피부개선을 위한 기능성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서, 로스팅된 삼백초(A) 및 로스팅되지 않은 삼백초(B)와 그 분쇄물을 촬영한 결과 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 로스팅 삼백초 추출물의 HPLC를 분석한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 일반 삼백초 추출물의 HPLC를 분석한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 로스팅 삼백초 추출물의 총 폴리페놀 함량을 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 로스팅 삼백초 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 로스팅 삼백초 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 로스팅 삼백초 추출물의 AQP3 유전자 발현 촉진 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 로스팅 삼백초 추출물의 NO 생성 억제 활성을 확인한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 로스팅 삼백초(Saururus chinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 삼백초는 삼백초의 지상부 및 지하부로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서 상기 삼백초는 삼백초의 지상부일 수 있다. 상기 삼백초는 재배된 것 또는 시판된 것을 모두 사용할 수 있다.

상기 로스팅 삼백초 추출물은 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:

1) 삼백초를 로스팅하는 단계;

2) 로스팅 삼백초에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 추출물을 여과하는 단계; 및

4) 단계 3)의 여과된 여과물을 감압농축한 후 건조하는 단계.

본 명세서에서 사용된 용어, "로스팅(roasting)"은 건열을 사용하여 수분을 더하지 않고 가열하는 방법을 의미하는 것으로, 로스팅 방식으로 가열되면 표면에 마이야르 반응과 캐러멜화가 작용한다. 상기 로스팅은 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 적절히 수행될 수 있고, 필요에 따라 가열 온도 및 시간 등의 조건이 변형될 수 있다.

본 발명에 따른 로스팅 삼백초는 표면이 갈색으로 변할때까지 로스팅될 수 있다. 구체적으로, 상기 삼백초는 90 내지 200℃, 110 내지 200℃, 130 내지 200℃, 150 내지 200℃, 90 내지 190℃, 110 내지 190℃, 130 내지 190℃, 150 내지 190℃, 90 내지 180℃, 110 내지 180℃, 130 내지 180℃ 또는 150 내지 180℃의 온도에서 로스팅될 수 있다. 또한, 상기 로스팅은 1 내지 30분, 1 내지 25분, 1 내지 20분, 1 내지 15분, 5 내지 30분, 5 내지 25분, 5 내지 20분 또는 5 내지 15분 동안 수행될 수 있다.

또한, 상기 추출 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 수 있고, 구체적으로, 상기 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 주정일 수 있다. 상기 추출 용매는 로스팅 삼백초 질량의 1 내지 30배, 1 내지 25배, 1 내지 20배, 5 내지 30배, 5 내지 25배 또는 5 내지 20배의 양으로 첨가될 수 있다.

상기 추출방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 시간은 1 내지 70시간, 1 내지 50시간, 1 내지 30시간 또는 1 내지 10시간일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상 반복될 수 있다.

한편, 상기 단계 4)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있고, 구체적으로는 동결건조일 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 미백, 주름개선, 보습 또는 항염증 활성을 통해 피부를 개선할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 로스팅 삼백초 추출물을 0.1 내지 50 중량%, 구체적으로 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부 개선을 목적으로 피부에 직접 도포될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 크림, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이트, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.

또한, 본 발명은 로스팅 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피부외용제에 유효성분으로 포함되는 로스팅 삼백초 추출물은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 로스팅 삼백초 추출물은 상술한 바와 같이 로스팅된 삼백초에 추출 용매를 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 추출 용매는 물, C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 또는 이의 혼합물일 수 있고, 상기 C₁ 내지 C₂의 저급 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 주정일 수 있다.

상기 피부외용제 조성물은 미백, 주름개선, 보습 또는 항염증 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 피부외용제는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제는 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제 및 완충제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 부형제는 유당, 덱스트린, 전분, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 사카로스, 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 피부외용제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 적절히 제조될 수 있다. 상기 피부외용제는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 및 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다.

나아가, 본 발명은 삼백초를 로스팅하는 단계를 포함하는 삼백초 내 플라보노이드 함량 증가 및 생성 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법에서 로스팅은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 로스팅은 삼백초의 표면이 갈색으로 변할때까지 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 삼백초는 90 내지 200℃, 110 내지 200℃, 130 내지 200℃, 150 내지 200℃, 90 내지 190℃, 110 내지 190℃, 130 내지 190℃, 150 내지 190℃, 90 내지 180℃, 110 내지 180℃, 130 내지 180℃ 또는 150 내지 180℃의 온도에서 로스팅될 수 있다. 또한, 상기 로스팅은 1 내지 30분, 1 내지 25분, 1 내지 20분, 1 내지 15분, 5 내지 30분, 5 내지 25분, 5 내지 20분 또는 5 내지 15분 동안 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로 함량이 증가되거나 새롭게 생성되는 플라보이드는 퀘르세틴(quercetin), 퀘르시트린(quercetrin), 이소퀘르시트린(isoquercetrin), 아비쿠라린(avicularin) 및 루틴(rutin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 플라보이드는 퀘르시트린, 미퀘리아닌 및 퀘르세틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 로스팅에 의해 함량이 증가되는 플라보노이드는 퀘르시트린 및 미퀘리아닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, 새롭게 생성되는 플라보노이드는 퀘르세틴일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 플라보노이드의 함량을 증가시키는 동시에 폴리페놀의 함량도 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예 1. 삼백초의 로스팅 온도 확인

1-1. 로스팅 온도에 따른 퀘르세틴 함량 확인

500 g의 삼백초 지상부를 하기 표 1에 기재된 바와 같이 다양한 온도에서 10분 동안 로스팅(roasting)하고, 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 로스팅된 삼백초를 분쇄하고, 50 mesh 크기의 체를 통과시켜 삼백초 분쇄물을 수득하였다. 수득된 삼백초 분쇄물에 이의 10배 중량의 70% 에탄올 수용액을 첨가하고, 상온에서 3시간 동안 추출하였다. 상기 수득된 추출물을 여과하고 진공농축기로 농축시킨 후, 동결건조하여 최종적으로 로스팅 삼백초 추출물을 제조하였다. 제조된 삼백초를 이용하여 통상적인 방법으로 HPLC를 수행함으로써, 삼백초 내 퀘르세틴의 함량을 확인하였다. 그 결과, 로스팅 온도에 따른 퀘르세틴의 함량을 하기 표 1에 나타내었다.

온도(℃)	퀘르세틴 함량(㎎/g)
90 내지 100	0.050
100 내지 110	0.051
110 내지 120	0.051
120 내지 130	0.054
130 내지 140	0.278
140 내지 150	0.455
150 내지 160	0.695
160 내지 170	0.950
170 내지 180	0.756
180 내지 190	0.541
190 내지 200	0.458

표 1에 나타난 바와 같이, 삼백초를 130℃ 이상으로 로스팅한 경우에 유의적으로 퀘르세틴의 함량이 증가하다가 180℃를 초과하여 로스팅한 경우에 조금씩 감소하였다. 특히, 170 내지 180℃에서 로스팅한 경우에 가장 현저히 많은 퀘르세틴의 함량이 확인되었다.

1-2. 로스팅 온도에 따른 총 폴리페놀의 함량 확인

실시예 1-1에서 제조된 로스팅 삼백초 추출물을 이용하여 로스팅 온도에 따른 총 폴리페놀 함량을 확인하였다.

구체적으로, 구체적으로, 100 ㎕의 로스팅 삼백초 추출물(0.1 ㎎/㎖)에 20 ㎕의 50% Folin-Ciocalteu 시약(1 N)을 첨가하고 방치하였다. 5분 후, 100 ㎕의 5% Na₂CO를 더 첨가하고, 암실에서 60분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 상기 혼합액을 730 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 총 폴리페놀 함량은 갈릭산(gallic acid, 98%, Sigma Aldrich, 미국)을 표준물질로 사용하여 1 g의 추출물에 포함된 GAE(gallic acid equivalent)의 ㎎ 수로 표시하였다. 그 결과, 로스팅 온도에 따른 총 폴리페놀의 함량을 하기 표 2에 나타내었다.

온도(℃)	총 폴리페놀 함량(㎎ GAE/g)
90 내지 100	8.75
100 내지 110	8.67
110 내지 120	8.73
120 내지 130	8.64
130 내지 140	8.97
140 내지 150	9.45
150 내지 160	9.56
160 내지 170	10.98
170 내지 180	10.05
180 내지 190	8.25
190 내지 200	7.13

표 2에 나타난 바와 같이, 삼백초를 로스팅함으로써 삼백초 내 존재하는 총 폴리페놀의 함량이 증가하였다. 특히, 140 내지 180℃에서 로스팅된 삼백초에서 총 폴리페놀의 함량이 가장 현저히 높았고, 로스팅 온도가 180℃를 초과하면서 총 폴리페놀의 함량이 조금씩 감소하였다.

실시예 2. 삼백초의 로스팅 시간 확인

500 g의 삼백초 지상부를 160 내지 170℃의 온도에서 1, 5, 10, 15, 20 또는 30분 동안 로스팅 한 후, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법으로 추출물을 제조하였다. 제조된 추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 확인하였다. 구체적으로, 70% 에탄올 수용액에 100 μM 농도가 되도록 DPPH(Sigma-Aldrich Co. 미국)을 용해시켜 DPPH 라디칼 용액을 준비하였다. 준비된 DPPH 라디칼 용액에 0.1 ㎕의 삼백초 추출물(0.2 ㎎/㎖)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 상기 반응액을 마이크로플레이트 리더(microplate reader, BKMPR-1096A, Konvision Inc., 중국)를 이용하여 530 ㎚의 파장하에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 하기 수학식 1에 따라 계산하여 DPPH 라디칼 제거 활성을 백분율(%, inhibition)로서 하기 표 3에 나타내었다.

[수학식 1]

A: 시료 첨가군의 흡광도 변화

B: 시료 무첨가군의 흡광도 변화

시간(min)	DPPH 라디칼 소거능(%)
1	24
5	36
10	67
15	65
20	53
30	35

표 3에 나타난 바와 같이, 로스팅 시간에 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다. 그러나 30분 동안 로스팅한 삼백초는 DPPH 라디칼 소거능이 조금 감소하였다.

실험예 1. 로스팅 삼백초 추출물의 성분 확인

상기에서 가장 최적의 효과를 나타내는 조건인 160 내지 170℃에서 10분 동안 로스팅된 삼백초(도 1A)로부터 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방법으로 추출물을 제조하고, 이에 포함된 플라보노이드 및 총 폴리페놀의 함량을 확인하였다. 이때, 대조군으로서 로스팅되지 않은 일반 삼백초(도 1B)를 사용하였다.

구체적으로, 플라보노이드는 퀘르시트린(quercitrin), 미퀘리아닌(miquelianin) 및 퀘르세틴(quercetin)의 함량은 통상적인 방법으로 HPLC를 수행함으로써 확인하였다. 이때, 퀘르시트린, 미퀘리아닌 및 퀘르세틴의 표준품을 대조군으로서 사용하였다. 한편, 총 폴리페놀 함량은 상기 실시예 1-1에 기재된 바와 동일한 방법 및 조건으로 측정하였다. 그 결과, 로스팅 삼백초 추출물의 HPLC 결과를 도 2에, 삼백초 추출물의 HPLC 결과를 도 3에, 각각의 추출물에 함유된 플라보노이드의 함량을 표 4에 나타내었다. 또한, 로스팅 삼백초 추출물 및 삼백초 추출물에 포함된 총 폴리페놀의 함량은 도 4에 나타내었다.

샘플	퀘르시트린(㎎/g)	미퀘리아닌(㎎/g)	퀘르세틴(㎎/g)
로스팅 삼백초	1.874	4.631	0.948
일반 삼백초	1.145	2.860	N.D

도 2 및 3, 및 표 4에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물은 일반 삼백초 추출물에 비해 퀘르시트린 및 미퀘아닌의 함량이 1.5 내지 2배 정도 증가하였다. 특히, 로스팅 삼백초 추출물에는 일반 삼백초 추출물에서 검출되지 않은 퀘르세틴이 생성되었다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물은 일반 삼백초 추출물과 비교하여 총 폴리페놀 함량이 유의적으로 증가하였다.

따라서, 상기 결과로부터 삼백초를 로스팅함으로써, 삼백초 내 존재하는 플라보노이드 및 총 폴리페놀의 함량을 증가시키거나, 신규 플라보노이드를 생성시킬 수 있음을 확인하였다.

실험예 2. 항산화 활성 확인

2-1. DPPH 라디칼 소거능

상기 제조된 로스팅 삼백초 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 실시예 2에 기재된 바와 동일한 방법 및 조건으로 측정하였다. 이때, 대조군으로서 일반 삼백초 추출물을 사용하였고, 그 결과 수득된 DPPH 라디칼 제거 활성을 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물은 일반 삼백초 추출물과 비교하여 DPPH 라디칼 소거능이 약 2배 이상 증가하였다.

2-2 ABTS 라디칼 소거능

상기 제조된 로스팅 삼백초 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

먼저, 7.4 mM 농도의 ABTS 및 2.45 mM 농도의 과황산칼륨(potassium persulfate)를 제조하고, 동일한 부피비로 혼합하여 혼합액을 수득하였다. 수득된 혼합액을 암실에서 24시간 동안 반응시켜 푸른색을 띄는 ABTS 라디칼 용액을 제조하였다. 제조된 ABTS 라디칼 용액을 증류수를 이용하여 20배 희석하고, 로스팅 삼백초 추출물을 250 또는 500 rpm의 농도로 준비하였다. 10 ㎕의 로스팅 삼백초 추출물에 190 ㎕의 희석된 ABTS 라디칼 용액을 첨가하고 이를 암실에서 10분 동안 두었다. 반응이 끝난 후, 상기 반응액을 마이크로플레이트 리더(microplate reader, BKMPR-1096A, Konvision Inc., 중국)를 이용하여 530 ㎚의 파장하에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로 L-아스코르브산(L-ascorbic acid, A.A)를 25, 50 또는 100 ppm의 농도로 사용하였고, 대조군으로서 일반 삼백초 추출물을 사용하였다. 측정된 흡광도 값을 하기 수학식 2에 따라 계산하여 ABTS 라디칼 제거 활성을 백분율(%, inhibition)로서 도 6 나타내었다.

[수학식 2]

A: 시료 첨가군의 흡광도 변화

B: 시료 무첨가군의 흡광도 변화

도 6에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물은 일반 삼백초 추출물과 비교하여 DPPH 라디칼 소거능이 약 2배 이상 증가하였다.

실험예 3. 미백 활성 확인

상기 제조된 로스팅 삼백초 추출물의 미백 활성을 멜라닌 생성 억제 효과를 통해 확인하였다.

먼저, C57BL/6 마우스 유래의 색소세포인 Melan-a 세포주(St George's Hospital, 영국)는 10% 우태반 혈청, 100 nM 12-O-테트라데카노일포르빌-13-아세테이트(12-O-tetradecanoyphorbol-13-acetate) 및 1 nM 콜레라 독소(cholera toxin)이 포함된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles media) 배양배지를 이용하여 배양하여 준비하였다. 배양은 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 수행되었다. 0.25%의 트립신-EDTA를 처리하여 배양된 Melan-a 세포주를 떼어내고, 24-웰 플레이트에 웰당 10⁵개의 세포가 되도록 분주 및 배양하였다. 배양 이틀째부터 3일 연속으로 50 ppm의 로스팅 삼백초 추출물을 처리하면서 세포를 배양하였다. 5일 후, 배양배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후, 1 N 수산화나트륨 용액으로 세포를 녹여 400 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로 10 ppm 농도의 코지산을, 대조군으로서 일반 삼백초 추출물을 사용하였다. 측정된 흡광도 값을 하기 수학식 3에 따라 계산하여 멜라닌 생성 억제율로서 표 5에 나타내었다.

[수학식 3]

샘플	멜라닌 생성 억제율(%)
로스팅 삼백초	41.2
일반 삼백초	20.6
양성 대조군	32.6

표 5에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물은 일반 삼백초 추출물과 비교하여 멜라닌 생성 억제율이 현저히 우수하였다. 뿐만 아니라, 로스팅 삼백초 추출물은 양성 대조군인 코지산과 비교하여도 더욱 현저한 효과를 나타내었다.

따라서, 상기 결과로부터 로스팅 삼백초가 우수한 미백 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 4. 주름개선 활성 확인

상기 제조된 로스팅 삼백초 추출물의 주름개선 활성을 콜라겐 생합성 촉진 효과를 통해 확인하였다.

먼저, 인간 섬유아세포(PromoCell, 독일)를 24웰 플레이트에 웰당 10⁵개가 되도록 분주하고 통상적인 방법으로 배양하였다. 플레이트의 90% 정도까지 세포가 배양된 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양배지로 배지를 교체하고, 50 ppm의 로스팅 삼백초 추출물을 처리하였다. 24시간 후, 세포 배양액을 일부 취하여 프로콜라겐 I형 ELISA 키트(procollagen type I ELISA kit)를 이용하여 프로콜라겐의 함량을 제조사의 프로토콜에 따라 확인하였다. 이때, 양성 대조군은 동일한 농도의 토코페롤 및 EGCG(epigallocatechin gallate)를, 음성 대조군은 무처리군을 사용하였다. 또한, 대조군으로 일반 삼백초 추출물을 사용하였다. 그 결과, 측정된 프로콜라겐의 함량을 비처리군을 100으로 하여 계산하여 콜라겐 합성능(%)으로 하기 표 6에 나타내었다.

샘플	콜라겐 합성능(%)
음성 대조군	100
토코페롤	118
EGCG	125
로스팅 삼백초	127
일반 삼백초	102

표 6에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물이 일반 삼백초 추출물과 비교하여 콜라겐 생합성량을 증가시켰다. 이는 양성대조군인 토코페롤 및 EGCG과 비교하여도 더 우수하였다.

따라서, 상기 결과로부터 로스팅 삼백초 추출물이 현저히 우수한 주름개선 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 5. 보습활성 확인

상기 제조된 로스팅 삼백초 추출물의 보습활성을 아쿠아포린 3(aquaporins 3, AQP3) 단백질의 생성 증가 효과를 통해 확인하였다. AQP3 단백질은 세포와 세포 사이의 수분 및 글리세롤의 이동을 조절하는 단백질로서, AQP3 유전자의 발현이 억제된 동물모델에서 표피층의 수분 유지 과정에 문제가 발생하는 것이 보고된 바 있다.

구체적으로, 각질형성세포(human epidermal keratinocyte neonatal)인 HEKn 세포주(C-001-5C, invitrogen, 미국)를 10% FBS(fetal bovine serum, Lonza, 스위스), 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배양배지에서 배양하였다. 배양된 HEKn 세포주에 100 ppm의 로스팅 삼백초 추출물을 처리하고, 12시간을 더 배양하였다. 배양 후, 트리졸(TRIzol™, invitrogen, 미국)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA의 농도는 분광광도법으로, 무결성(integrity)은 바이오아날라이저 2100(BioAnalyzer 2100, Agilent Technologies, 미국)을 이용하여 측정하였다. 4 ㎍의 분리된 RNA를 주형으로 슈퍼스크립트^® III(SuperScript^® III, invitrogen, 미국) 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 정량적 실시간 택맨 RT-PCR(TaqMan RT-PCR, 7500Fast, Applied Biosystems, 미국) 기기를 이용하여 통상적인 방법으로 RT-PCR을 수행함으로써 AQP3 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 증폭은 95℃에서 10분, 95℃에서 15분(50회), 및 60℃에서 1분의 조건으로 수행되었다. 그 결과, AQP3 유전자의 발현량 대조군인 RPLPO 유전자의 발현량과 비교하여 상대적 값으로 계산하여 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물은 일반 삼백초 추출물과 비교하여 각질형성세포에서 AQP3 유전자의 발현을 촉진시킴으로써, 피부보습 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.

실험예 6. 항염증 활성 확인

상기 제조된 로스팅 삼백초 추출물의 항염증 활성을 NO 생성 억제 효과를 통해 확인하였다.

먼저, RAW 264.7 세포주를 96웰 플레이트에 웰당 4×10⁴개가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 100 ppm의 로스팅 삼백초 추출물을 처리하고, 1시간 후에 2 ㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 염증반응을 유도하였다. 18시간 후, 세포 배양액을 일부 취하여 NO 디텍션 키트(NO detection kit, Intron)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NO 수준을 측정하였다. 구체적으로, 100 ㎕의 세포 배양액을 96웰 플레이트에 넣고, 50 ㎕의 N1 완충액(sulfanilamide)을 첨가하고 10분 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 50 ㎕의 N2 완충액(naphthylethylenediamine)을 첨가하고 10분 동안 실온에서 반응시키고, 540 ㎚의 파장하에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로서 동일한 농도의 퀘르세틴(quercetin)을, 음성 대조군으로서 무처리군을 사용하였다. 또한, 대조군으로 일반 삼백초 추출물을 사용하였다. NO 생성량은 아질산염 기준(nitrite standard)를 이용하여 얻은 표준검량곡선을 이용하여 산출하였다. 각각의 결과는 t-테스트(paired t-test, 양측검증) 기능을 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다. 그 결과, NO 생성량을 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 로스팅 삼백초 추출물이 일반 삼백초 추출물과 비교하여 LPS로 유도된 NO의 생성을 효과적으로 억제시킴으로써, 항염증 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.

Claims (11)

1. 로스팅 삼백초(Saururus chinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물로서,
   상기 로스팅은 130 내지 190℃에서 5분 내지 25분 동안 수행되고,
   상기 삼백초 추출물은 퀘르시트린(quercitrin) 및 미퀘리아닌(miquelianin)의 함량이 증가하며, 퀘르세틴(quercetin)이 생성된 피부개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 로스팅은 160 내지 180℃의 온도에서 수행되는, 피부개선용 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 삼백초는 지상부 및 지하부로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 피부개선용 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 또는 이의 혼합물로 추출된, 피부개선용 화장료 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 C₁ 내지 C₂의 저급 알코올이 에탄올, 메탄올 또는 주정인, 피부개선용 화장료 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백, 주름개선, 보습 또는 항염증 활성을 나타내는, 피부개선용 화장료 조성물.
   
7. 로스팅 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 피부외용제 조성물로서,
   상기 로스팅은 130 내지 190℃에서 5분 내지 25분 동안 수행되고,
   상기 삼백초 추출물은 퀘르시트린 및 미퀘리아닌의 함량이 증가하며, 퀘르세틴이 생성된 피부개선용 피부외용제 조성물.
   
8. 삼백초를 로스팅하는 단계를 포함하는 삼백초 내 플라보노이드 함량 증가 및 생성 방법으로서,
   상기 로스팅은 130 내지 190℃에서 5분 내지 25분 동안 수행되고,
   상기 삼백초는 퀘르시트린 및 미퀘리아닌의 함량이 증가하며, 퀘르세틴이 생성된 삼백초 내 플라보노이드 함량 증가 및 생성 방법.
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