KR102469700B1 - Her3에 대한 항원 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3)의 도메인 III & IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 및 결합에 대해 상기 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질 뿐만 아니라, 상기를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항원 결합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자, 핵산을 포함하는 벡터, 및 항원 결합 단백질, 융합 단백질, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 세포 및 제약을 제공한다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 항원 결합 단백질, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 제약을 제공한다. 본 발명은 치료 유효량의 항원 결합 단백질, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 제약을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장을 억제시키거나, 또는 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

HER3에 대한 항원 결합 단백질
본 발명은 인간 표피 성장 인자 수용체 3(human epidermal growth factor receptor 3: HER3)의 도메인 III & IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프(conformational epitope)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 및 그와 결합에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질 뿐만 아니라, 그를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항원 결합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자, 핵산을 포함하는 벡터, 및 항원 결합 단백질, 융합 단백질, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 세포 및 제약(pharmaceuticals)을 제공한다. 본 발명은 또한 의약(medicament)으로서 사용하기 위한 항원 결합 단백질, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 제약을 제공한다. 본 발명은 치료 유효량의 항원 결합 단백질, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 제약을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장을 억제시키거나, 또는 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
정상적인 인간 조직에서 ErbB 패밀리 구성원의 복잡한 신호전달(signaling) 네트워크는 엄격하게 조절된다. 그러나, 수용체 과다발현, 돌연변이 또는 리간드에 의한 비정상적인 자극에 의한 수용체 기능의 변경에 의한 ErbB 패밀리 구성원의 조절장애가 대개 암 발생 및 증식과 연관이 있다. EGFR은 빈번하게는 결장직장암, 난소암, 두부경부 편평 세포 암종 및 다른 암 유형에서 과다발현되고, EGFR 과다발현은 불량한 예후와 연관성을 가진다. HER2는 특히, 최대 30%까지 증폭 및/또는 과다발현이 이루어지는 인간 유방암과 연관이 있다. HER3 또한 결장암 및 위암 중 ~11%에서 돌연변이화되어 있고, 이는 HER2의 존재하에서 종양원성 신호전달을 촉진시킨다고 앞서 밝혀진 바 있다 (문헌 [Jaiswal et al., 2013, Oncogenic ErbB3 mutations in human cancers. Cancer Cell 23, 603-617]). 또한, HER3은 ErbB 표적화된 요법에 대한 내성 기전을 담당하는 것으로 보고된 PI3K/Akt 경로의 그의 강력한 활성화에 기인하여 특별한 관심을 얻었다 (문헌 [Holbro et al., 2003, The ErbB2/ErbB3 heterodimer functions as an oncogenic unit: ErbB2 requires ErbB3 to drive breast tumor cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8933-8938]). 암 발생에서 HER4의 역할은 논쟁적으로 논의되고 있지만, HER4는 특히 획득된 내성과 관련된 종양발생과 연관이 있다는 것이 점점 더 많은 연구를 통해 밝혀지고 있다 (문헌 [Canfield et al., 2014, Receptor tyrosine kinase ErbB4 mediates acquired resistance to ErbB2 inhibitors in breast cancer cells. Cell Cycle 14: 648-655]).
종양원성 돌연변이는 HER3에서 예컨대, 결장암 및 위암 중 약 11%인 것으로 확인되었다 (문헌 [Jaiswal et al., 2013]). 이들 돌연변이는 리간드 비의존적 방식으로 결장 및 유방 상피 세포를 형질전환시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Jaiswal et al., 2013, Oncogenic ErbB3 mutations in human cancers. Cancer Cell 23, 603-617]). 세포외 영역 중의 돌연변이는 도메인 I, II 및 III에 국재화되어 있으며, 다수의 핫 스폿은 도메인 II (A232V, P262H/S, G284R, D297Y, G325R)에, 하나는 도메인 I (V104M)에 및 하나는 도메인 III (T355A/I)에 있다 (문헌 [Gaborit et al. 2015, Emerging anti-cancer antibodies and combination therapies targeting HER3/ErbB3. Hum. Vaccin. Immunother. 12: 576-592]).
ErbB 패밀리 구성원은 항체로 표적화될 수 있다. 이는 리간드 결합 및/또는 수용체 이량체화를 억제시킬 수 있다. 추가로, 항체는 수용체 가교결합에 의해 수용체 내재화 및 분해를 유도할 수 있다 (문헌 [Friedman et al., 2005, Synergistic down-regulation of receptor tyrosine kinases by combinations of mAbs: implications for cancer therapy. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 102:1915-1920]; [Roepstorff et al., 2008, Endocytic downregulation of ErbB receptors: mechanims and relevance in cancer. Histochem Cell Biol. 129:563-578]; [Moody et al., 2015, receptor crosslinking: a general method to trigger internalization and lysosomal targeting of therapeutic receptor:ligand complexes. Mol. Therapy 23:1888-1898]). 추가로, Fc 파트를 함유하는 항체는 이펙터 기능, 예컨대, 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 통해 암 세포 사멸을 매개할 수 있다. 항체는 또한 세포독성제를 암 세포로 전달하기 위한 전달 시스템으로서도 사용될 수 있다. 종양발생과 요법에 대한 내성 발생을 전파시키는 데 관여하는 이종이량체화 파트너로서의 그의 신흥 역할에 기인하여, HER3은 항체 요법에 대한 표적이 되고 있다. HER3에 대한 각종 항체가 개발되고 있고 (문헌 [Gaborit et al. 2015, Emerging anti-cancer antibodies and combination therapies targeting HER3/ErbB3. Hum. Vaccin. Immunother. 12: 576-592]; [Dey et al. 2015, A critical role of HER3 in HER2-amplified and non-amplified breast cancers: function of a kinase-dead RTK. Am. J. Transl. Res. 7: 733-750]; [Aurisicchio et al. 2012, The promise of anti-ErbB3 monoclonals as new cancer therapeutics. Oncotarget 3, 744-758]; [Baselga & Swain 2009, Novel anticancer targets: revisiting ErbB2 and discovering ErbB3. Nat. Rev. Cancer 9: 463-475]; [Gala & Chandariapaty 2014, Molecular pathways: HER3 targeted therapy. Clin. Cancer Res. 20: 1410-1416]; [Kol et al. 2014, HER3, serious parnter in crime: therapeutic approaches and potential bomarkers for effect of HER3-targeting. Pharmacol. Ther. 143: 1-11]; [Zhang et al. 2016, HER3/ErbB3, an emering cancer therapeutic target. Acta Biochim. Biophys. Sin. 48: 39-48]), 그 중 일부 항체는 리간드 결합에 관여하는 도메인 I 또는 III에 대한 것이고, 다른 항체는 수용체 이량체화에 관여하는 도메인 II 및/또는 IV에 대한 것이다. KTN3379인 한 항체는 도메인 II와 III 사이에 결합하여 수용체를 불활성 입체형태 그대로 잠금화시키는 것으로 기술된 바 있다 (문헌 [Lee et al., 2015, Inhibition of ErbB3 by a monoclonal antibody that locks the extracellular domain in an inactive configuration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112: 13225-13230]).
그러나, 이들 항체에 의해 표적화되는 도메인은 하나 이상의 종양발생 돌연변이를 포함할 수 있기 때문에, 야생형 HER3에 대해서는, 또는 각 항체에 의해 표적화되는 것과 다른 또 다른 위치에서 돌연변이화된 것인 종양원성인 돌연변이화된 HER3에 대해서는 반응성을 띠지 않을 수도 있다. 따라서, 당업계에서는 야생형 HER3 및 돌연변이화된 HER3, 둘 모두와 반응성을 띠는 길항성 분자가 요구되고 있다. 추가로, 리간드 비의존적 및 리간드 의존적 HER3 활성화를 억제시키기 위해서는 이종이량체화를 억제시킬 뿐만 아니라, 리간드 결합도 억제시키는 방식으로 HER3에 결합하는 길항성 분자도 요구되고 있다.
상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 인간과 마우스 HER3 사이에서 보존되는 도메인 III 및 IV에 의해 형성되는 HER3 상의 독특한 에피토프를 인식하는 인간 항-HER3 (ErbB3) 항체, 3-43을 확인하였다. 이들 항체는 IgG 분자로서 HER3을 발현하는 종양 세포에 0.1 nM 미만의 EC50 값으로 결합하고, 리간드 비의존적 및 리간드 의존적 수용체 활성화 및 하류 신호전달을 효율적으로 억제시키고, 신속하고, 효율적인 수용체 내재화 및 분해를 유도한다.
제1 측면에서, 본 발명은 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3)의 도메인 III & IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 또는 제3 측면의 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 제4 측면의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 제3 측면의 융합 단백질, 제4 측면의 핵산, 또는 제5 측면의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 제3 측면의 융합 단백질, 제4 측면의 핵산, 또는 제5 측면의 벡터를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 제3 측면의 융합 단백질, 제4 측면의 핵산, 제5 측면의 벡터, 제6 측면의 세포, 또는 제7 측면의 제약을 제공한다.
제9 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의, 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 제3 측면의 융합 단백질, 제4 측면의 핵산, 제5 측면의 벡터, 제6 측면의 세포, 또는 제7 측면의 제약을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장을 억제시키거나, 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1: IgG 3-43의 생화학적 특징 규명 및 결합 연구. a) 환원 (R) 및 비환원 (NR) 조건하에서 SDS-PAGE 분석 (쿠마시(Coomassie) 염색). b) IgG 3-43의 HPLC 크기 배제 크로마토그래피. c) HER3에의 결합을 ELISA에 의해 분석하였다. HER3의 세포외 도메인의 Fc 융합 단백질을 항원으로서 사용하였다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± S.D.로서 제시되어 있다. d) 아타나(Attana) 시스템을 이용하여 수정 진동자 미량저울 실험을 수행하였다. IgG 3-43을 카르복실 칩 상에 고정화시키고, HER3의 his-태그부착된 세포외 도메인의 결합을 통한 중량 증가 또는 감소를 나타내는 빈도 변화를 측정하였다.
도 2: 에피토프 맵핑 및 마우스 HER3과의 교차 반응성. a) 에피토프 맵핑: HER3 세포외 도메인의 말단절단된 형태를 코딩하는 서열을 IgG1 Fc 파트 서열에 융합시켰다. 생성된 구축물을 형질감염시키고, HEK293 세포에서 발현시키고, 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 통해 상청액으로부터 정제하였다. Fc-융합 단백질을 ELISA 검정법에서 항원으로서 사용하였고, HRP-접합된 항-Fab 항체를 이용하여 IgG 3-43 결합을 검출하였다. b) 인간 Fc 영역에 융합된 인간 및 마우스 HER3의 세포외 영역을 이용한 인간 및 마우스 HER3과 3-43의 교차 반응성. 항-His-태그 항체를 이용하여 scFv 3-43의 고정화된 HER3-융합 단백질에의 결합을 검출하였다.
도 3: IgG 3-43의 HER3 발현 종양 세포주에의 결합. (명시된 바와 같은) 각종 종양 세포주를 다양한 농도의 IgG 3-43과 함께 인큐베이션시키고, PE 표지된 2차 항체로 항체를 검출하였다. 밀테니이 MACS콴트(Miltenyi MACSquant)를 이용하여 세포를 분석하였다. n = 1 내지 3의 실험으로부터 EC50 값을 계산하였다.
도 4: IgG 3-43은 HER3 발현 세포에의 결합에 대해 HRG와 경쟁한다. 그의 태그부착된 재조합 인간 헤레굴린-β1(human heregulin-β1)의 결합을 PE 접합된 항-His 항체를 통해 유세포 분석법에 의하여 측정하였다. 과량의 IgG 3-43과의 사전 인큐베이션을 통해 신호는 60% 초과만큼 감소된 반면, 항-EGFR 항체 세툭시맙(Cetuximab)은 동일한 효과를 보이지 않았다.
도 5: IgG 3-43은 HER3 및 하류 표적의 HRG 유도된 인산화를 억제시킨다. I명시된 세포를 실험 당일 반 전면생장이 되도록 6 웰 플레이트에 시딩하였다. 부착 후, 세포를 밤새도록 혈청 결핍하에 놓고, 100 nM IgG 3-43 또는 대조군 (리툭시맙(Rituximab)) IgG와 함께 (a, b, c) 또는 상이한 농도의 IgG 3-43 또는 IgG 3M6 (d, e)과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. IgG 처리된 세포 및 비처리 세포를 50 ng/ml 인간 헤레굴린-β1로 자극시켰다. 이어서, 세포를 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 완충제로 용해시키고, 세포 용해물을 명시된 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
도 6: IgG 3-43은 암 세포 내로 내재화되고, 세포 HER3 수준의 감소를 유도 한다. a) MCF-7 세포를 명시된 시점 동안 100 nM IgG 3-43과 인큐베이션시키고, 웨스턴 블롯에 의해 HER3 수준을 분석하였다. HER32 신호는 빠르게 감소되었고, 감소는 5분의 인큐베이션 이후에 이미 관찰되었다. b) Cy5 표지된 IgG 3-43을 37℃에서 명시된 시점 동안 MCF-7 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세포 막을 콘카나발린-A(Concanavalin-A)로 염색시키고, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 청색: Dapi 핵 염색; 녹색: Con A 막 염색; 보라색: Cy5-표지된 IgG 3-43.
도 7: IgG 3-43은 시험관내에서 HRG 매개 암 세포 증식을 감소시킨다. NCI-N87 (a), BT-474 (b) 및 MCF-7 (c) 세포를 96 웰 플레이트에 저밀도로 시딩하고, 밤새도록 부착되도록 하고, 낮은 (0,2%) 혈청 농도하에서 및 10 ng/ml 헤레굴린의 존재하에 10 ㎍ IgG 3-43 또는 대조군으로서 리툭시맙과 함께 인큐베이션시켰다. d) FaDu 세포는 자기분비 방식으로 헤레굴린을 생산하는 것으로 공지되어 있고, 상기 세포에 대해 동일한 증식 검정법이지만, 주변 헤레굴린 부재하에서 검정법을 수행하였다. IgG 3-43 적정 결과, 이는 심지어 낮은 나노몰 농도에서도 강력한 성장 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다.
도 8: IgG 3-43은 SCID 마우스에서 s.c. 이종이식편 FaDu 종양 모델의 성장을 억제시킨다. 종양 크기가 100 ㎣에 달하였을 때, 명시된 용량으로 대략 마우스를 처리하였다 (3주 동안 주 2회, 라인 참조). a) 생존의 카플란-마이어(Kaplan-Mayer) 블롯. b) 42일째의 종양 부피. c) - f) PBS (c), 30 ㎍의 IgG 3-43 (d), 100 ㎍ IgG 3-43 (e), 또는 300 ㎍ IgG 3-43 (f)로 처리된 마우스에서의 개별 종앙 성장.
도 9: scDb hu225x3 -43- Fc의 생화학적 특징 규명. a) scDb-Fc 융합 단백질 중의 가변 및 불변 도메인의 개략적 배열. b) 환원 (레인 1-3) 및 비환원 (레인 4-6) 조건하에서의 세툭시맙 (레인 1, 4), IgG 3-43 (레인 2, 5) 및 scDb hu225x3-43-Fc (레인 3, 6)의 SDS-PAGE 분석 (10% PAA, 쿠마시 염색). c) 이량체 scDb-Fc 융합 단백질의 개략적 구조. d) 세툭시맙, IgG 3-43 및 scDb hu225x3-43-Fc의 크기 배제 크로마토그래피.
도 10: scDb hu225x3 -43- Fc의 결합 연구. a) 세툭시맙 및 IgG 3-43과 비교하여 scDb hu225x3-43-Fc의 고정화된 수용체-ECD 단백질 (0.2 ㎍/웰)에의 결합을 ELISA에 의해 분석하였다. 항체를 HRP-접합된 항-인간 IgG (Fc 특이적) 항체로 검출하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± S.D.로서 제시되어 있다. b) FaDu 세포에의 결합을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 모든 항체를 PE-접합된 항-인간 Fc 항체로 검출하였다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± S.D.로서 제시되어 있다.
도 11: MCF -7 세포에서의 HER3 신호전달 억제. (RPMI 1640, 0.2% 혈청 중에서 성장된) 세포를 37℃에서 1 h 동안 조합 처리를 위해 75 nM의 모체 IgG 분자 또는 scDb-Fc 분자, 및 37.5 nM의 각 모체 항체로 처리하였다. 무관련 IgG1을 대조군으로서 사용하였다. 세포를 37℃에서 15 min 동안 헤레굴린 (50 ng/ml)으로 자극시킨 후, 4℃에서 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 (50 mM 트리스(Tris) pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.25% DOC, 0.1% SDS)를 이용하여 용해시켰다. HER3, 포스포-HER3 (Tyr1289), Akt, 포스포-Akt (Thr308), Erk1/2, 포스포-Erk1/2 (Thr202/204) 및 α-튜뷸린에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅에 의해 세포 용해물을 분석하였다. 제시된 데이터는 2회의 독립 실험의 대표값이다.
도 12: 상이한 ErbB 과다발현 세포주에서의 수용체 인산화 억제. 상이한 세포주 (a; MCF-7; b, A-431; c, NCI-N87; d, SK-BR-3; e, FaDu; f, A549)를 37℃에서 1 h 동안 50 nM 세툭시맙, IgG 3-43 또는 scDb hu225x3-43-Fc로 처리한 후, 15 min 동안 헤레굴린 (50 ng/ml) 또는 EGF (50 ng/ml)로 자극시켰다. 세포를 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.25% DOC, 0.1% SDS)를 이용하여 용해시키고, EGFR, 포스포-EGFR (Tyr1068), HER3, 포스포-HER3 (Tyr1289) 및 α-튜뷸린에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅에 의해 세포 용해물을 분석하였다.
도 13: FaDu 세포에서의 수용체 인산화 억제. 세포를 37℃에서 1 h 동안 세툭시맙과 조합된 scDb hu225x3-43-Fc 및 IgG 3-43의 일련된 희석액으로 처리한 후, 헤레굴린 (50 ng/ml)으로 자극시켰다. 세포를 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.25% DOC, 0.1% SDS)를 이용하여 용해시키고, HER3, 포스포-HER3 (Tyr1289) 및 α-튜뷸린에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅에 의해 용해물을 분석하였다. 로딩 대조군 α-튜뷸린 대비로 포스포-HER3의 수준을 정량화하고, 항체 부재의 대조군으로 정규화하였다. 제시된 데이터는 오차 막대와 함께 적어도 2회의 독립 실험의 대표값으로 제시된 것이며, 이는 평균 ± SD 값을 나타낸다. a, 정량화된 데이터. b, 대표 영상.
도 14: scDb 2-35x3-43- Fc의 생화학적 특징 규명. a) 환원 (R) 및 비환원 (NR) 조건하에서의 scDb 2-35x3-43-Fc의 SDS-PAGE 분석 (10% PAA, 쿠마시 염색). b) scDb 2-35x3-43-Fc의 크기 배제 크로마토그래피.
도 15: scDb 2-35x3-43- Fc의 결합 연구. IgG 2-35 및 IgG 3-43과 비교하여 scDb 2-35x3-43-Fc의 고정화된 수용체-ECD 단백질 (0.2 ㎍/웰)에의 결합을 ELISA에 의해 분석하였다. 항체를 HRP-접합된 항-인간 IgG (Fc 특이적) 항체로 검출하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± S.D.로서 제시되어 있다.
도 16: scFv3 -43- Fc - scTRAIL의 생화학적 특징 규명. a) 환원 (R) 및 비환원 (NR) 조건하에서의 SDS-PAGE 분석 (10% PAA, 쿠마시 염색). b) scFv-3-43-Fc-scTRAIL의 크기 배제 크로마토그래피.
도 17: scFv3 -43- Fc - scTRAIL의 결합 연구. HER3 (a) 및 인간 TRAIL-R2 (b)에의 결합을 ELISA에 의해 분석하였다. HER3 또는 인간 TRAIL-R2의 세포외 도메인의 Fc 융합 단백질을 항원으로서 사용하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. Colo205 (c) 및 HCT-116 세포 (d)에의 결합을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 데이터는 적어도 3회의 독립 실험의 평균 ± S.D.로서 제시되어 있다.
도 18: 비표적화된 구축물 대비 세포 사멸 유도. 상응하는 비표적화된 융합 단백질 Fc-scTRAIL과 비교하여 scFv3-43-Fc-scTRAIL의 세포 사멸 유도를 분석하였다. TRAIL 유도 아폽토시스에 대해 세포를 감작시키기 위해 배지 또는 보르테조밉 (650 nM)과함께 미리 인큐베이션시킨 후, Colo205에 미치는 효과를 조사하였다. scFv3-43-Fc-scTRAIL의 표적 효과를 확인하기 위해, 200배 몰 과량의 scFv3-43-Fc 존재하에서 실험을 추가로 수행하였다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균 ± S.D.로서 제시되어 있다. .
도 19: scDb 3- 43xCD3의 생화학적 특징 규명, 결합 및 IL-2 검정법. a) scDb 구축물 중의 가변 및 불변 도메인의 개략적 배열. b) scDb 구축물의 개략적 구조. c) 환원 (1) 및 비환원 (2) 조건하에서의 scDb 3-43xCD3의 SDS-PAGE 분석 (12% PAA, 쿠마시 염색). d) scDb 3-43xCD3의 크기 배제 크로마토그래피. e) 항원으로서 HER3의 세포외 도메인의 Fc 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 scDb 3-43xCD3의 결합을 분석하였다. HRP-접합된 항-His 항체로 단백질을 검출하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. f 및 g) HER3-발현 MCF-7 (f) 및 CD3-발현 주르카트(Jurkat) 세포 (g)에의 결합을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 결합된 단백질을 PE-접합된 항-His 항체로 검출하였다. h) HER3-발현 Colo205 세포에 결합한 scDb 3-43xCD3에 의한 활성화된 PBMC의 IL-2 방출. 제조사 (인간 IL-2 키트, R&D)에 의해 공급받은 사용 설명서에 따라 ELISA에 의해 상청액 중 IL-2의 농도를 측정하였다. 데이터는 평균 ± S.D.로 제시되어 있다.
도 20: 3가 , 이중특이적 scDb3 - 43xCD3 - scFv3 -43 융합 단백질의 생화학적 특징 규명 및 결합. a) scDb-scFv 구축물 중의 가변 도메인의 개략적 배열 및 구조. b) 환원 (1) 및 비환원 (2) 조건하에서의 scDb3-43xCD3-scFv3-43의 SDS-PAGE 분석 (10% PAA, 쿠마시 염색). c) scDb3-43xCD3-scFv3-43의 크기 배제 크로마토그래피. d) 항원으로서 HER3의 세포외 도메인의 Fc 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 scDb3-43xCD3-scFv3-43의 결합을 분석하였다. HRP-접합된 항-His 항체로 단백질을 검출하였다. scDb3-43xCD3의 결합을 (HER3에 대한) 1가 대조군으로서 사용하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. e) 및 f) HER3 발현 MCF-7 (e) 및 CD3 발현 주르카트 세포 (f)에의 결합을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 결합된 단백질을 PE-접합된 항-His 항체로 검출하였다. 데이터는 평균 ± S.D.로 제시되어 있다.
도 21: HER2 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 scDb 4D5x3 -43- Fc의 특징 규명. a) 환원 (1) 및 비환원 (2) 조건하에서의 scDb 4D5x3-43-Fc의 SDS-PAGE 분석 (10% PAA, 쿠마시 염색). b) scDb 4D5x3-43-Fc의 크기 배제 크로마토그래피. c) 항원으로서 HER2 또는 HER3의 세포외 도메인의 His-태그부착된 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 scDb 4D5x3-43-Fc의 결합을 분석하였다. 결합된 단백질을 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체로 검출하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. d) HER2 및 HER3 발현 FaDu 세포에의 결합을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 결합된 단백질을 PE-접합된 항-인간 Fc 항체로 검출하였다. 데이터는 평균 ± S.D.로 제시되어 있다.
도 22: IgG 3-43은 SKBR3 및 BT474의 리간드 비의존적 콜로니 형성을 억제 시킨다. a) IgG 3-43 (50 nM)과 함께 12일 동안 인큐베이션된 SKBR3 및 BT474를 이용한 콜로니 형성 검정법. 비처리된 세포 (con), 및 트라스투주맙으로 처리된 세포 (Tras., HER2에 대한 것)를 추가의 대조군으로서 포함하였다. 삼중으로 제시되어 있다. b) a)에 기술된 바와 같이 인큐베이션된 SKBR3 및 BT474 세포의 형성된 콜로니의 정량화.
도 23: Db3 - 43xhu225 -Ig의 생화학적 특징 규명 및 결합. a) Db3-43xhu225-Ig 융합 단백질의 경쇄 및 중쇄의 개략적 도시. b) Db3-43xhu225-Ig 융합 단백질 중의 도메인의 개략적 구조. c) 환원 (1) 및 비환원 (2) 조건하에서의 Db3-43xhu225-Ig 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 (10% PAA, 쿠마시 염색) (M: 마커). d) Db3-43xhu225-Ig 융합 단백질의 크기 배제 크로마토그래피. e) 항원으로서 EGFR 또는 HER3의 세포외 도메인의 His-태그부착된 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 이중특이적, 4가 Db3-43xhu225-Ig의 결합을 분석하였다. 결합된 단백질을 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체로 검출하였다. 모체 항체 (세툭시맙 및 3-43-IgG)를 대조군으로서 사용하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. f) 제1 항원으로서 EGFR의 세포외 도메인의 Fc 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 이중특이적 Db3-43xhu25-Ig 융합 단백질의 동시 결합을 분석하였다. Db3-43xhu225-Ig의 일련의 희석액을 웰에 첨가하였다. 마지막으로, 제2 항원인 HER3-His를 웰에 첨가하였다. HRP-접합된 항-His 항체를 사용하여 결합된 HER3-His를 검출하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. g) 유세포 분석법을 통해 Db3-43xhu225-Ig의 세포에의 결합을 분석하였다. 상이한 종양 세포주 (MCF-7, SKBR-3, 및 FaDu)를 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig 또는 모체 모노클로날 항체 (세툭시맙 및 3-43-IgG)의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. PE-표지된 항-인간 Fc 2차 항체를 통해 결합된 항체를 검출하였다. 밀테니이 MACS콴트를 이용하여 세포를 분석하였다.
도 24: SWISS 마우스에서의 Db3 - 43xhu225 -Ig의 약동학적 성질. 암컷 SWISS 마우스 (3마리 마우스)에서 Db3-43xhu225-Ig의 약동학적 프로파일을 측정하였다. 25 ㎍ 단백질을 꼬리 정맥내로 정맥내로 주사하였다. 명시된 시간 간격 후 수집된 혈청 샘플의 농도를 코팅된 항원으로서 EGFR-Fc 또는 HER3-Fc 융합 단백질을 사용하여 ELISA를 통해 측정하였다. HRP-접합된 항-인간 Fab 항체를 사용하여 결합된 Db3-43xhu225-Ig 분자를 검출하였다.
도 25: HER3을 표적화하는 scFv3 -43- Fc - scTRAIL 융합 단백질. a) 흑색종 세포의 HER3 발현을 유세포 분석법 분석을 통해 분석하고, QIFI키트를 통해 정량화하였다. b) scFv3-43-Fc-scTRAIL 폴리펩티드의 개략적 조성. c) 이량체 scFv-Fc-scTRAIL 융합 단백질의 개략적 조성. d) scFv3-43-Fc-scTRAIL 융합 단백질의 HER3 양성 세포주 HER3에의 결합을 유세포 분석법에 의해 평가하였다. 세포 결합 단백질을 항-인간 IgG (γ-쇄 특이적) R-PE에 의해 검출하였다. EC50 값은 점선으로 표시되어 있다. 각 세포주에 대한 Fc-scTRAIL의 것과 비교하여 EC50 값의 유의도를 계산하였다. e) 세포주 A375 상에서 scFv3-43-Fc (억제제)와의 경쟁적 억제를 수행하였다. 세포를 200x 몰 과량의 억제제로 처리한 후, 단백질 (10 nM)로 처리하였다. 세포 결합 단백질을 항-인간 TRAIL-PE를 통해 검출하였다.
도 26: 보르테조밉 ( BZB )의 존재 또는 부재하에서의, HER3을 표적화하는 scFv3-43-Fc-scTRAIL의 세포 사멸 유도, 및 세포 표면 상의 HER3 항원 밀도의 정량적 분석. 세포 사멸 유도 검정법을 위해, 세포를 30 min 동안 배지 또는 보르테조밉과 함께 미리 인큐베이션시킨 후, scFv3-43-Fc-scTRAIL의 일련의 희석액으로 16 h 동안 처리하였다. 크리스털 바이올렛 염색에 의해 세포 생존능을 분석하였다. 통계적 분석을 위해, scFv3-43-Fc-scTRAIL의 EC50 값을 Fc-scTRAIL과 비교하였다. 표적 효과가 유의적일 경우, EC50 값은 점선으로 표시되어 있다. QIFI키트를 사용하여 HER3의 항원 밀도를 측정하였다. 그러므로, 세포를 세포 사멸 유도 검정법에 사용된 것과 동일한 보르테조밉 농도를 이용하여 처리하였다. 독립 t 검정 (양측, p<0.05*, p<0.01**, p<0.001***, p>0.05 ns)을 이용하여 통계적 분석을 수행하였다.
도 27: scFv3 -43- Fc - scTRAIL 및 Fc - scTRAIL의 생체내 활성, 내약성 및 PK. a) Colo205 종양이 확립된 NMRI 누드 마우스 (군당 6마리의 마우스)를 3주 동안 주 2회로 (14, 18, 21, 25, 28, 32일째) 0.2 nmol 단백질 (0.4 nmol scTRAIL 유니트에 상응; i.v.), 또는 PBS로 처리하였다. 처리는 점선으로 표시되어 있다. b) 47일째 상이한 처리군들의 종양 부피에 관한 통계적 분석을 일원 ANOVA, 이어서, 터키 사후 검정 (Tukey's post hoc test) (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ns, P>0.05)에 의해 수행하였다. c) ALT 활성 및 d) 분자의 혈청 농도를 최종 처리 (32일째) 후 4 h 및 24 h 경과시에 측정하였다.
도 28: scDbhu225x3 -43- Fc의 생화학적 특징 규명 및 결합. a) scDbhu225x3-43-Fc 융합 단백질의 개략적 도시. b) scDbhu225x3-43-Fc 융합 단백질 중의 도메인의 개략적 구조. c) 환원 (1) 및 비환원 (2) 조건하에서의 scDbhu225x3-43-Fc 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 (10% PAA, 쿠마시 염색) (M: 마커). d) scDbhu225x3-43-Fc 융합 단백질의 크기 배제 크로마토그래피. e) 항원으로서 EGFR 또는 HER3의 세포외 도메인의 His-태그부착된 재조합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 이중특이적, 4가 scDbhu225x3-43-Fc 융합 단백질의 결합을 분석하였다. 결합된 단백질을 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체로 검출하였다. 모체 항체 (hu225-IgG 및 3-43-IgG)를 대조군으로서 사용하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다.
도 29: FaDu 세포에서의 수용체 신호전달 억제. 세포를 37℃에서 15 min 동안 헤레굴린 (50 ng/ml)으로 자극시키기 전에 1 h 동안 50 nM의 IgG hu225, IgG 3-43, IgG hu225와 IgG 3-43의 조합, scDbhu225x3-43-Fc (GGGGS), 또는 Db3-43xhu225-Ig로 처리하였다. 세포를 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.25% DOC, 0.1% SDS)를 이용하여 용해시키고, EGFR, 포스포르-EGFR (Tyr1068), 포스포-HER2 (Tyr1221/1222), HER3, 포스포-HER3 (Tyr1289), Akt, 포스포르-Akt (Thr308), Erk, 포스포르-Erk (Thr202/Tyr204) 및 α-튜뷸린에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅에 의해 용해물을 분석하였다. α튜뷸린1, pHER3, EGFR, Akt 및 Erk는 막 1 상에 있고, α튜뷸린2, HER3, pEGFR, pHER2, pAkt 및 pErk는 막 2 상에 있었다.
도 30: scDbhu225x3 -43- Fc 또는 Db3 - 43xhu225 -Ig를 이용한 증식 검정법. 2D (a) 및 3D (b) 증식 검정법을 위해 SW620, HCT116, 및 LoVo 세포를 이용하였다. 96 웰 플레이트 포맷 중 2,000개의 세포/웰로 10% FCS 함유 RPMI 배지 중에서 24시간 동안 배양하였다 (3D 배양을 위해서는 1:2 마트리겔(Matrigel):콜라겐(Kollagen) 혼합물, RPMI 또는 DMEM + 10% FCS + 2% 마트리겔). 이어서, 배지를 기아 배지 (0.2% FCS 및 1% P/S를 함유하는 RPMI 배지)로 교체하고, 24시간 배양 후, 세포를 MEK-억제제 (AZD6244, 셀루메티닙(Selumetinib); HRG 비자극시: SW620의 경우 5 nM, HCT116의 경우, 45 nM, LoVo의 경우, 35 nM; HRG 자극시: SW620의 경우, 1HCT116의 경우, 300 nM, LoVo의 경우, 250 nM)의 존재 또는 부재하에서 상이한 항체 (세툭시맙, 3-43-IgG: 단독으로 50 nM, 또는 각 조합으로 50 nM; scDbhu225x3-43-Fc, Db3-43xhu225-Ig: 50 nM)로 처리하였다. 1시간 인큐베이션 후, 세포를 헤레굴린 (6 ng/웰)으로 자극시키거나, 또는 비자극 상태로 유지시켰다. 세포 시딩 후 8일째, 셀타이터글로 2.0 키트(CelltiterGlo 2.0 2.0 Kit) (a) (웰당 25 ㎕의 셀타이터글로 2.0과 혼합된 25 ㎕의 기아 배지) 또는 셀타이터글로 3D 키트 (b) (웰당 25 ㎕의 셀타이터글로 3D와 혼합된 25 ㎕의 기아 배지)를 사용하여 발광을 측정함으로써 플레이트를 분석하였다. 비처리된 세포의 발광 (항체 부재, AZD62244 부재, HRG 부재)을 100%로 설정하였다; 평균±SD, n=2.
도 31: scDb4D5x3 -43- LL의 생화학적 특징 규명 및 생체활성. a) scDb4D5x3-43-LL 융합 단백질의 개략적 도시. b) scDb4D5x3-43-LL 융합 단백질 중의 도메인의 개략적 구조. c) 환원 (1) 및 비환원 (2) 조건하에서의 scDb4D5x3-43-LL 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 (12% PAA; 쿠마시 염색) (M: 마커). d) scDb4D5x3-43-LL 융합 단백질의 크기 배제 크로마토그래피. e) 항원으로서 EGFR 또는 HER3의 세포외 도메인의 Fc 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 이중특이적, 2가 scDb4D5x3-43-LL 융합 단백질의 결합을 분석하였다. 결합된 단백질을 HRP-접합된 항-His 항체로 검출하였다. 모체 항체 (트라스투주맙 및 3-43-IgG)를 대조군으로서 사용하였다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다.
도 32: MCF-7 세포에서의 수용체 신호전달 억제. 세포를 37℃에서 15 min 동안 헤레굴린 (50 ng/ml)으로 자극시키기 전에 1 h 동안 50 nM의 트라스투주맙, IgG 3-43, 트라스투주맙과 IgG 3-43의 조합, scDb 4D5x3-43-LL-Fc 또는 scDb 4D5x3-43-LL로 처리하였다. 세포를 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.25% DOC, 0.1% SDS)를 이용하여 용해시키고, EGFR, 포스포르-EGFR(Tyr1068), 포스포-HER2 (Tyr1221/1222), HER3, 포스포-HER3 (Tyr1289), Akt, 포스포르-Akt (Thr308), Erk, 포스포르-Erk (Thr202/Tyr204) 및 α-튜뷸린에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅에 의해 용해물을 분석하였다. α튜뷸린1, pHER3, HER2, Akt 및 Erk는 막 1 상에 있고, α튜뷸린2, HER3, pHER2, pAkt 및 pErk는 막 2 상에 있었다.
도 33: HER3 및 CD3에 대한 이중특이적 , 다가 항체의 생화학적 특징 규명 및 생체활성. (a+b) 이중특이적, 2가 (scDb3-43xhuU3), 3가 (scDb3-43xhuU3-scFv3-43), 또는 4가 (scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43) 융합 단백질의 개략적 도시 (a) 및 구조 (b). (c+d) 상이한 이중특이적 융합 단백질의 CD3 양성 세포주 주르카트 (c) 및 HER3 양성 세포주 MCF-7 (d)에의 결합을 유세포 분석법을 통해 분석하였다. 이중특이적 항체의 일련의 희석액을 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 항체를 PE-표지된 항-인간 Fc 2차 항체를 통해 검출하였다. 밀테니이 MACS콴트를 이용하여 세포를 분석하였다. e) HER3 발현 MCF-7 세포에 결합한 이중특이적, 다가 항체에 의해 활성화된 PBMC의 IL-2 방출. 24시간 후, 제조사 (인간 IL-2 키트, R&D)에 의해 공급받은 사용 설명서에 따라 ELISA에 의해 상청액 중 IL-2의 농도를 측정하였다. f) 이중특이적, 다가 항체를 적정하고, 표적 세포로서 MCF7과 함께 1시간 동안 인큐베이션 시킨 후, 인간 PBMC를 첨가하였다. 48시간 인큐베이션 후, MTT 검정법을 통해 세포 생존능을 측정하였다. 추가로, 이중특이적, 다가 항체를 적정하고, PBMC 첨가 없이, 표적 세포로서 MCF7 상에서 인큐베이션시켰다. 48시간 인큐베이션 후, MTT 검정법을 통해 세포 생존능을 측정하였고, 이는 각 단백질에 회색 기호 및 점선으로 표시되어 있다.
도 34: 돌연변이화된 HER3 - Fc 융합 단백질의 분석 및 3-43- IgG에의 결합 분석. a) 환원 조건하에, 정제된 HER3-Fc 돌연변이체 (1, T335A; 2, T389I; 3, M406K; 4, R453H; 5, Y464C; 6, D492H; 7, K498I)의 SDS-PAGE 분석. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. b) 100 nM의 IgG 3-43을 사용하여 IgG 3-43의 고정화된 야생형 HER3-Fc 및 HER3-Fc 돌연변이체에의 결합을 호스래디시 퍼옥시다제 접합된 항-인간 Fab 항체로 검출하고, 야생형 HER3-Fc 융합 단백질에 대하여 수득된 신호에 대해 정규화시켰다. SEC 분석에 의해 밝혀진 바와 같이, 응집체 형성으로 인해 돌연변이체 Y464C는 포함시키지 않았다. 인간 HER3의 도메인 I에 대한 3M6-IgG를 양성 대조군으로서 포함시켰다.
서열 목록 - 프리 텍스트 정보
서열 번호: 1 Her3의 아미노산 서열 (엑스파지 엔트리 번호(Expasy Entry No): P21860)
서열 번호: 2 IgG 3-43의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열
서열 번호: 3 IgG 3-43의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열
서열 번호: 4 IgG 3-43의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호: 5 IgG 3-43의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호: 6 scFv 3-43의 아미노산 서열
서열 번호: 7 PelB 리더 - scFv 3-43 - c-myc - his의 아미노산 서열
서열 번호: 8 IgK 리더 - scDb hu225x3-43-Fc의 아미노산 서열
서열 번호: 9 IgK 리더 - 2-35 x 3-43 scDb-Fc의 아미노산 서열
서열 번호: 10 IgK 리더 - scDb 4D5x3-43-LL-Fc의 아미노산 서열
서열 번호: 11 IgK 리더 - FLAG - 링커 - scFv3-43-Fc-scTRAIL의 아미노산 서열
서열 번호: 12 IgK 리더 - scDb 3-43xCD3 - His의 아미노산 서열
서열 번호: 13 IgK 리더 - scDb 3-43xCD3-scFv 3-43 - His의 아미노산 서열
서열 번호: 14 펩티드 링커 1의 아미노산 서열: GGGGS
서열 번호: 15 펩티드 링커 2의 아미노산 서열: GGGGSGGGGS
서열 번호: 16 펩티드 링커 3의 아미노산 서열: GGGGSGGGGSGGGGS
서열 번호: 17 펩티드 링커 4의 아미노산 서열: GSLGGSGG
서열 번호: 18 펩티드 링커 5의 아미노산 서열: GGGSGGGT
서열 번호: 19 펩티드 링커 6의 아미노산 서열: GGGSGGGTGS
서열 번호: 20 펩티드 링커 7의 아미노산 서열: GGGSGGGTGSGG
서열 번호: 21 펩티드 링커 8의 아미노산 서열: GGGGSGGRASGGGGSGGGGS
서열 번호: 22 펩티드 링커 9의 아미노산 서열: GGGSGGGS
서열 번호: 23 펩티드 링커 10의 아미노산 서열: EFTRG
서열 번호: 24 펩티드 링커 11의 아미노산 서열: AAA
서열 번호: 25 FLAG-태그의 아미노산 서열
서열 번호: 26 His-태그의 아미노산 서열
서열 번호: 27 Myc-태그의 아미노산 서열
서열 번호: 28 PelB 리더 서열의 아미노산 서열
서열 번호: 29 IgK 리더 서열의 아미노산 서열
서열 번호: 30 IL-2 리더 서열의 아미노산 서열
서열 번호: 31 VH3-43xVLhu225-CL의 아미노산 서열
서열 번호: 32 VHhu225xVLhu3-43-CH1-CH2-CH3의 아미노산 서열
서열 번호: 33 scDbhu225x3-43-Fc (GGGGS)의 아미노산 서열
서열 번호: 34 scDb4D5x3-43-LL의 아미노산 서열
서열 번호: 35 scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43의 아미노산 서열
본 발명을 하기에서 상세하게 설명하기에 앞서, 방법, 프로토콜 및 시약은 달라질 수 있는 바, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않는다는 점을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것도 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
바람직하게, 본원에서 사용되는 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 텍스트 전역에 걸쳐 수개의 문헌이 인용된다. 상기에서든 또는 하기에서든, 본원에서 인용된 각 문헌들은 (모든 특허, 특허 출원, 과학 공개문헌, 제조사의 설명서, 사용 설명서, 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession Number) 서열 제출 등 포함) 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 개시내용을 선행하는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
"포함하다(comprise)"라는 단어, 및 예컨대, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"이라는 것과 같은 파생어는 임의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 군을 배제시키는 것이 아니라, 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함함을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는다면, 복수의 지시대상을 포함한다.
농도, 양, 및 다른 수치 데이터는 본원에서 "범위" 포맷으로 표시되거나, 또는 제시될 수 있다. 상기와 같은 범위 포맷은 단지 편의 및 간결성을 위해 사용되는 것이며, 따라서, 범위의 한계로서 명백하게 언급된 수치 값 뿐만 아니라, 마치 각 수치 값 및 하위 범위가 명백하게 언급된 것과 같이, 상기 범위 내에 포함되는 모든 개별 수치 값 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 유연적으로 해석되어야 함을 이해하여야 한다. 예로서, "150 mg 내지 600 mg"이라는 수치 범위는 150 mg 내지 600 mg이라고 명백하게 언급된 갓을 포함할 뿐만 아니라, 명시된 범위 내의 개별 값 및 하위 범위도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 개별 값, 예컨대, 150, 160, 170, 180, 190, ... 580, 590, 600 mg 및 하위 범위, 예컨대, 150 내지 200, 150 내지 250, 250 내지 300, 350 내지 600 등이 상기 수치 범위에 포함된다. 이러한 동일한 원리는 단 하나의 수치 값만을 언급한 범위에도 적용된다. 추가로, 이러한 해석은 기술되는 범위의 폭 또는 특징의 범위와 상관없이 적용되어야 한다.
수치 값과 함께 연결되어 사용될 때 "약"이라는 용어는 명시된 수치 값보다 5% 더 작은 하한을 가지고, 명시된 수치 값보다 5% 더 큰 상한을 가지는 범위 내에 수치 값을 포함한다는 것을 의미한다.
"핵산" 및 "핵산 분자"라는 용어는 본원에서 동의어로 사용되며, 이는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기 또는 그 둘 모두의 단일 또는 이중 가닥 올리고머 또는 중합체로서 이해된다. 뉴클레오티드 단량체는 핵염기, 5탄당 (예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 리보스 또는 2'-데옥시리보스), 및 1 내지 3개의 포스페이트 기로 구성된다. 전형적으로, 핵산은 개별 뉴클레오티드 단량체 사이의 포스포디에스테르 결합을 통해 형성된다. 본 발명과 관련하여, 핵산이라는 용어는 제한하는 것은 아니지만, 리보핵산 (RNA) 및 데옥시리보핵산 (DNA) 분자를 포함할 뿐만 아니라, 다른 결합을 포함하는 합성 형태의 핵산 (예컨대, 문헌 [Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)]에 기술된 바와 같은 펩티드 핵산)도 포함한다. 전형적으로, 핵산은 단일 또는 이중 가닥 분자이고, 자연적으로 발생된 뉴클레오티드로 구성된다. 단일 가닥의 핵산이라고 기술하는 것은 또한 (적어도 부분적으로는) 상보성 가닥의 서열도 정의한다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 및 단일 가닥 서열, 둘 모두의 일부를 함유할 수도 있다. 예시된 이중 가닥 핵산 분자는 3' 또는 5' 오버행을 가질 수 있고, 따라서, 그의 전장에 걸쳐 완전하게 이중 가닥이어야 할 필요는 없거나, 또는 그러한 것으로 간주되지 않는다. 핵산은 생물학적, 생화학적, 또는 화학적 합성 방법 또는 증폭 방법, 및 RNA의 역전사 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 방법들 중 임의의 것에 의해 수득될 수 있다. 핵산이라는 용어는 염색체 또는 염색체 세그먼트, 벡터 (예컨대, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 프라이머, 프로브, cDNA, 게놈 DNA, 재조합 DNA, cRNA, mRNA, tRNA, 마이크로RNA (miRNA) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)를 포함한다. 핵산은 예컨대, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 삼중 가닥일 수 있고, 길이는 어느 특정 길이로 제한되지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명백하게 명시된 임의의 서열 이외에도, 상보적 서열을 포함하거나, 또는 그를 코딩한다.
핵산은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제, 특히, 세포에서 발견될 수 있는 DNase 및 RNase에 의해 분해될 수 있다. 그러므로, 핵산을 분해도록 안정화시킴으로써 고농도의 핵산이 세포 중에서 장기간 동안에 걸쳐 확실하게 유지될 수 있도록 하기 위해 핵산을 변형시키는 것이 유익할 수 있다. 전형적으로, 상기와 같은 안정화는 하나 이상의 뉴클레오티드간의 인 기를 도입함으로써, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드간의 인이 아닌 것을 도입함으로써 이루어질 수 있다. 따라서, 핵산은 비자연적으로 발생된 뉴클레오티드 및/또는 자연적으로 발생된 뉴클레오티드에 대한 변형, 및/또는 분자의 백본에의 변이로 구성될 수 있다. 핵산 중 변형된 뉴클레오티드간 포스페이트 라디칼 및/또는 인이 아닌 브릿지로는 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 포스포로디티오에이트 및/또는 포스페이트 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지 않는 반면, 인이 아닌 뉴클레오티드간 유사체로는 실록산 브릿지, 카르보네이트 브릿지, 카르복시메틸 에스테르, 아세트아미데이트 브릿지 및/또는 티오에테르 브릿지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드 변형에 관한 추가 예로는 각각 라이게이션, 또는 엑소뉴클레아제 분해/폴리머라제 연장 방지를 허용하기 위한 5' 또는 3' 뉴클레오티드의 인산화; 공유 부착 및 공유 부착에 가까운 부착을 위한 아미노, 티올, 알킨, 또는 비오티닐 변형; 형광단 및 소광제; 및 변형된 염기, 예컨대, 데옥시이노신 (dI), 5-브로모-데옥시우리딘 (5-브로모-dU), 데옥시우리딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 역위 dT, 역위 디데옥시-T, 디데옥시시티딘 (ddC 5-메틸 데옥시시티딘 (5-메틸 dC), 잠금 핵산 (LNA), 5-니트로인돌, 이소-dC 및 -dG 염기, 2'-O-메틸 RNA 염기, 히드록시메틸 dC, 5-히드록시부티닐-2'-데옥시우리딘, 8-아자-7-데아자구아노신 및 플루오린 변형 염기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 핵산은 또한 폴리아미드 또는 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산 (LNA) 뿐만 아니라, 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 인공 핵산일 수 있다.
핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있도록 배치되었을 때, 이는 "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 서열 전사에 영향을 준다면, 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진시키기 위해 배치되었다면, 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
본 발명과 관련하여, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 길이가 최대 약 50개의 뉴클레오티드, 예컨대, 2 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이인 핵산 서열을 지칭한다.
본 발명과 관련하여 사용될 때, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 길이가 약 50개의 뉴클레오티드 초과인 길이, 예컨대, 길이가 51개 이상의 뉴클레오티드 길이인 핵산을 지칭한다.
올리고뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 현존 또는 천연 서열의 단리, DNA 복제 또는 증폭, 역전사, 적절한 서열의 클로닝 및 제한 부해, 또는 예컨대, 문헌 [Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)]의 디에틸포스포라미다이트 방법; 문헌 [Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)]의 트리에스테르 방법; 자동 합성 방법; 또는 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 방법에 의해 제조된다.
본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 단백질 및/또는 그에 포함된 핵산을 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 도입할 수 있는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 혼합물을 지칭한다. 벡터의 예로는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 또는 인공 염색체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 벡터는 관심의 대상이 되는 유전자 생성물, 예컨대, 외래 또는 이종성 DNA를 적합한 숙주 세포 내로 수송하는 데 사용된다. 벡터는 숙주 세포에서의 벡터의 자율 복제를 촉진시키는 "레플리콘" 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 외래 DNA는 예를 들어, 벡터 분자를 복제하거나, 선별가능한 또는 스크리닝가능한 마커를 코딩하거나, 또는 트랜스진을 코딩하는, 숙주 세포에서는 자연적으로는 발견되지 않는 DNA인 이종성 DNA인 것으로 정의된다. 일단 숙주 세포에서 벡터는 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 또는 그와 동시에 복제될 수 있고, 벡터의 수개의 카피 및 그의 삽입된 DNA가 생성될 수 있다. 추가로, 벡터는 또한 삽입된 DNA의 mRNA 분자로의 전사를 허용하거나, 또는 다르게는 삽입된 DNA의 RNA의 다중 카피로의 복제를 일으키는 필수 요소를 함유할 수 있다. 벡터는 관심 유전자의 발현을 조절하는 "발현 제어 서열"을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 발현 제어 서열은 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 프로모터, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터 또는 리프레서와 같은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 관심의 대상이 되는 하나 이상의 유전자 생성물을 코딩하는 1개 초과의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에서, 발현은 하나 이상의 발현 제어 서열에 의해 함께 또는 별개로 제어될 수 있다. 더욱 구체적으로, 벡터 상에 포함되어 있는 각각의 폴리뉴클레오티드는 별개의 발현 제어 서열에 의해 제어될 수 있거나, 또는 벡터 상에 포함되어 있는 모든 폴리뉴클레오티드는 단일의 발현 제어 서열에 의해 제어될 수 있다. 단일의 발현 제어 서열에 의해 제어되는 단일의 벡터 상에 포함되어 있는 폴리뉴클레오티드는 오픈 리딩 프레임을 형성할 수 있다. 일부 발현 벡터는 삽입된 DNA에 인접한 위치에, 발현의 mRNA의 반감기를 증가시키고/거나, mRNA의 단백질 분자로의 번역을 허용하는 서열 요소를 추가로 함유한다. 따라서, 삽입된 DNA에 의해 코딩되는 다수의 mRNA 및 폴리펩티드 분자는 빠르게 합성될 수 있다.
"아미노산"이라는 용어는 일반적으로 치환된 또는 비치환된 아미노 기, 치환된 또는 비치환된 카르복시 기, 및 하나 이상의 측쇄 또는 기, 또는 상기 기들 중 임의의 것의 유사체를 포함하는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 예시적인 측쇄로는 예컨대, 티올, 셀레노, 술포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로사이클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 또는 상기 기들의 임의 조합을 포함한다. 다른 대표적인 아미노산으로는 광활성화 가교제를 포함하는 아미노산, 금속 결합 아미노산, 스핀 표지된 아미노산, 형광성 아미노산, 금속 함유 아미노산, 신규 작용기를 포함하는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이징된 및/또는 광이성화 아미노산, 방사성 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 다른 탄수화물 변형된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원소 치환된 아미노산, 화학적으로 절단가능한 및/또는 광절단가능한 아미노산, 탄소 연결된 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 모이어티(moiety)를 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, "아미노산"이라는 용어는 하기 20종의 천연 또는 유전적으로 코딩된 알파-아미노산: 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 리신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V)을 포함한다. "X" 잔기가 정의되지 않은 경우, 이는 "임의의 아미노산"으로서 정의되어야 한다. 상기 20종의 천연 아미노산의 구조는 예컨대, 문헌 [Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)]에 제시되어 있다. 추가의 아미노산, 예컨대, 셀레노시스테인 및 피로리신 또한 유전적으로 코딩될 수 있다 (문헌 [Stadtman (1996) "Selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100] 및 [Ibba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine," Curr Biol. 12(13):R464-R466]). "아미노산"이라는 용어는 또한 비천연 아미노산, 변형된 아미노산 (예컨대, 변형된 측쇄 및/또는 백본을 가지는 아미노산), 및 아미노산 유사체를 포함한다. 예컨대, 문헌 [Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887], [Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571], [Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706], [Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967], [James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991], [Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315], [Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425], [Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328], 및 [Budisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7):1281-1292]를 참조한다. 아미노산은 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 병합될 수 있다.
본 발명과 관련하여, "펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 짧은 중합체를 지칭한다. 이는 단백질과 동일한 화학적 (펩티드) 결합을 가지지만, 일반적으로 그의 길이는 더 짧다. 가장 짧은 펩티드는 단일 펩티드 결합에 의해 연결된 2개의 아미노산으로 구성된 디펩티드이다. 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드 등도 또한 존재할 수 있다. 전형적으로, 펩티드의 길이는 최대 8, 10, 12, 15, 18 또는 20개의 아미노산 길이이다. 펩티드가 사이클릭 펩티드가 아니라면, 이는 아미노 단부 및 카르복실 단부를 가진다.
본 발명과 관련하여, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어진 단일의 선형 쇄를 지칭하고, 전형적으로 적어도 약 21개의 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드는 1개 초과의 쇄로 구성된 하나의 단백질 쇄일 수 있거나, 또는 단백질이 하나의 쇄로 구성되었다면, 이는 단백질 그 자체일 수 있다.
본 발명과 관련하여, 단백질 또는 폴리펩티드의 "1차 구조"는 폴리펩티드 쇄 중의 아미노산의 서열이다. 단백질 중의 "2차 구조"는 단백질의 국소 세그먼트의 일반 3차원 형태이다. 그러나, 이는 3차 구조로 간주되는 3차원 공간상의 특정 원자 위치를 기술하는 것은 아니다. 단백질에서, 2차 구조는 백본 아미드와 카르복실 기 사이의 수소 결합의 패턴에 의해 정의된다. 단백질의 "3차 구조"는 원자 배위에 의해 결정되는 단백질의 3차원 구조이다. "4차 구조"는 다중 서브유니트 복합체에서 다중 폴딩된 또는 코일드 단백질 또는 폴리펩티드 분자들 분자들의 배열이다.
본원에서 사용되는 바, "폴딩" 또는 "단백질 폴딩"이라는 용어는 단백질이 그의 3차원 형상 또는 입체형태를 취하게 만들고, 즉, 단백질이 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 수소 결합, 금속 배위결합, 소수성 작용, 반데르발스 힘, pi-pi 상호작용, 및/또는 정전기 효과와 같은 비공유 상호작용을 통해 특이적인 3차원 형상을 형성하도록 유도하는 프로세스를 지칭한다. 따라서, "폴딩된 단백질"이라는 용어는 예컨대, 단백질의 3차원 형상, 예컨대, 그의 2차, 3차, 또는 4차 구조인 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "단편"이라는 용어는 자연적으로 발생된 단편 (예컨대, 스플라이스 변이체) 뿐만 아니라, 인공적으로 구축된 단편, 특히, 유전자 기술 수단에 의해 수득된 것을 지칭한다. 전형적으로, 단편은 모체 폴리펩티드와 비교하여 그의 N-말단에 및/또는 그의 C-말단에 및/또는 내부적으로, 바람직하게, 그의 N-말단에, 그의 N- 및 C-말단에, 또는 그의 C-말단에 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 300개의 아미노산의 결실을 가진다.
항원 결정기로도 또한 공지된 "에피토프"는 면역계, 구체적으로, 항체, B 세포, 또는 T 세포에 의해 인식되는 거대분자의 세그먼트이다. 상기 에피토프는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합할 수 있는 거대분자의 일부 또는 세그먼트이다. 이와 관련하여, "결합하는"이라는 용어는 바람직하게, 특이 결합에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여, "에피토프"라는 용어는 면역계에 의해 인식되는 단백질 또는 다단백질의 세그먼트를 지칭하는 것이 바람직하다. 에피토프는 일반적으로 예컨대, 아미노산 또는 단 측쇄와 같은, 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 구성되고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라, 특이적인 전하 특징을 가진다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변형 용매의 존재하에서 후자가 아닌 전자에의 결합이 상실된다는 점에서 구별된다.
본원에서 사용되는 바, "입체형태적 에피토프"란, 선형 거대분자 (예컨대, 폴리펩티드)의 3차원 구조에 의해 형성되는 상기 거대분자의 에피토프를 지칭한다. 본 출원과 관련하여, "입체형태적 에피토프"는 "불연속 에피토프," 즉, 거대분자의 1차 서열 (예컨대, 폴리펩티드의 아미노산 서열) 중의 적어도 2개의 별개의 영역으로부터 형성되는 입체형태적 에피토프이다. 다시 말해, 에피토프가 1차 서열 중에, 본 발명의 결합 모이어티 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편)가 동시에 결합하는 결합 대상이 되는 적어도 2개의 별개의 영역으로 구성되고, 이들 적어도 2개의 별개의 영역은 1차 서열 중에서 본 발명의 결합 모이어티의 결합 대상이 되지 않는 1개 초과의 영역에 의해 중단된다면, 에피토프는 본 발명과 관련하여 "입체형태적 에피토프"인 것으로 간주된다. 특히, 상기 "입체형태적 에피토프"는 폴리펩티드 상에 존재하고, 1차 서열 중의 2개의 별개의 영역은 본 발명의 결합 모이어티 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편)의 결합 대상이 되는 2개의 별개의 아미노산 서열이며, 여기서, 상기 적어도 2개의 별개의 아미노산 서열은 1차 서열 중에서 본 발명의 결합 모이어티의 결합 대상이 되지 않는 1개 초과의 아미노산 서열에 의해 중단된다. 특히, 중단 아미노산 서열은 결합 모이어티의 결합 대상이 되지 않는, 2개 이상의 아미노산을 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 본 발명의 결합 모이어티의 결합 대상이 되는 적어도 2개의 별개의 아미노산 서열은 그의 길이와 관련하여 특별히 제한되지 않는다. 상기 적어도 2개의 별개의 아미노산 서열 내의 아미노산의 총 개수가 결합 모이어티와 입체형태적 에피토프 사이의 특이적인 결합이 이루어질 수 있도록 하는 데 충분히 크다면, 상기 별개의 아미노산 서열은 단 하나의 아미노산으로도 구성될 수 있다.
"파라토프"는 에피토프를 인식하는 항체의 일부이다. 본 발명과 관련하여, "파라토프"는 에피토프를 인식하는, 본원에 기술된 결합 모이어티 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편)의 일부이다.
본 발명과 관련하여 "펩티드 링커"란, 복합체의 두 파트 또는 모이어티, 예컨대, 두 펩티드 또는 단백질를 입체적으로 이격시키는 아미노산 서열을 지칭한다. 전형적으로, 상기 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 아미노산인 최소 길이, 내지 적어도 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 또는 15개 이하의 아미노산인 최대 길이를 가지는 1 내지 100개의 아미노산으로 구성된다. 조합이 수학적으로 타당하다면, 본 발명에 따른 펩티드 링커의 명시된 바람직한 최소 및 최대 길이는 조합될 수 있고, 예컨대, 상기 링커는 1-15, 또는 12-40, 또는 25-75, 또는 1-100개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 펩티드 링커는 또한 함께 연결되는 두 모이어티 사이에 가요성을 제공한다. 상기 가요성은 일반적으로 아미노산이 작을 경우에 증가된다. 따라서, 가용성 펩티드 링커는 소형 아미노산, 특히, 글리신 및/또는 알라닌, 및/또는 친수성 아미노산, 예컨대, 세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민을 증가된 함량으로 포함한다. 바람직하게, 펩티드 링커 중 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 초과 또는 그 초과의 아미노산이 소형 아미노산이다.
본원에서 사용되는 바, "변이체"라는 용어는 그의 유래 기점이 된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 비교하였을 때, 그의 길이 또는 서열 중의 하나 이상의 변이에 의해 차이를 보이는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로서 이해되어야 한다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 변이체의 유래 기점이 되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 모체 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로서 공지되어 있다. "변이체"라는 용어는 모체 분자의 "단편" 또는 "유도체"를 포함한다. 전형적으로, "단편"은 모체 분자보다 길이 또는 크기가 더 작은 반면, "유도체"는 모체 분자와 비교하여 그의 서열에 있어 하나 이상의 차이를 보인다. 변형된 분자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 번역 후 변형된 단백질 (예컨대, 글리코실화된, 비오티닐화된, 인산화된, 유비퀴틴화된, 팔미토일화된, 또는 단백질 가수분해에 의해 절단된 단백질) 및 변형된 핵산, 예컨대, 메틸화된 DNA 또한 포함된다. 또한, 상이한 분자의 혼합물, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, RNA-DNA 하이브리드가 "변이체"에 포함된다. 전형적으로, 변이체는 인공적으로, 바람직하게, 유전자 기술 수단에 의해 구축되는 반면, 모체 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 야생형 단백질 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 공통 서열이다. 그러나, 또한 자연적으로 발생된 변이체는 본원에서 사용되는 "변이체"라는 용어에 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 추가로, 본 발명에서 사용될 수 있는 변이체는 또한 모체 분자의 호몰로그, 오솔로그, 또는 파라로그로부터, 또는 인공적으로 구축된 변이체로부터 유래될 수 있되, 단, 변이체가 모체 분자의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보이는 한, 즉, 기능적으로 활성인 경우에 그러하다.
특히, "펩티드 변이체," "폴리펩티드 변이체," "단백질 변이체"라는 용어는 그의 유래 기점이 된 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질과 비교하였을 때, 아미노산 서열 중의 하나 이상의 변이에 의해 차이를 보이는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로서 이해되어야 한다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 변이체의 유래 기점이 되는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 또한 모체 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로서 공지되어 있다. 추가로, 본 발명에서 사용될 수 있는 변이체는 또한 모체 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 호몰로그, 오솔로그, 또는 파라로그로부터, 또는 인공적으로 구축된 변이체로부터 유래될 수 있되, 단, 변이체가 모체 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 제제 활성을 보이는 경우에 그러하다. 아미노산 서열 중의 변이는 아미노산 치환, 삽입, 결실, N-말단 말단절단, 또는 C-말단 말단절단, 또는 상기 변이들의 임의 조합일 수 있고, 이는 한 부위 또는 여러 부위에서 발생할 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 변이체는 아미노산 서열 중에 총 개수 최대 200개 (최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200개)의 변이 (즉, 치환, 삽입, 결실, N-말단 말단절단, 및/또는 C-말단 말단절단)를 나타낼 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 및/또는 비-보존적일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에서 사용되는 바, "변이체"는 그의 유래 기점이 된 모체 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질와 특정 정도의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 정확하게, 본 발명과 관련하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 변이체는 그의 모체 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질과 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 변이체의 서열 동일성은 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 아미노산으로 이루어진 연속 스트레치에 걸쳐 존재한다.
"서열 동일성 백분율(%)"은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 측정되며, 여기서, 비교창 중 서열의 일부는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율(%)은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 얻고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 내 위치의 총 개수로 나누고, 그 값에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율(%)을 얻음으로써 계산된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 "동일한"이라는 용어는 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 동일하다, 즉, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한다는 것을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 바, 비교창, 또는 지정된 영역에 걸쳐 비교되고, 최대 상응하도록 정렬되었을 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 명시된 백분율(%) (예컨대, 명시된 영역에 걸쳐 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성)을 가진다면, 서열은 서로 "실질적으로 동일한" 것이다. 이들 정의는 또한 시험 서열의 상보체를 지칭한다. 따라서, "적어도 80%의 서열 동일성"이라는 용어는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열 비교와 관련하여 명세서 전역에 걸쳐 사용된다. 이러한 표현은 바람직하게 각 참조 폴리펩티드 또는 각 참조 폴리뉴클레오티드와의 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 지칭한다.
"서열 비교"라는 용어의 경우, 이는 한 서열이, 시험 서열의 비교 대상이 되는 참조 서열로서의 역할을 하는 프로세스를 지칭한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요할 경우, 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터가 일반적으로 사용되거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열 대비 시험 서열에 대한 서열 동일성(%) 또는 유사성(%)을 계산한다. 두 서열을 비교하고, 서열 동일성(%)을 계산하고자 하는 비교 대상인 참조 서열이 명시되지 않은 경우, 서열 동일성은 구체적으로 명시되지 않았다면, 비교하고자 하는 두 서열 중 더욱 긴 서열을 참조로 하여 계산된다. 참조 서열이 명시되었다면, 서열 동일성은 구체적으로 명시되지 않았다면, 서열 번호로 명시된 전장의 참조 서열에 기초하여 측정된다.
서열 정렬에서, "비교창"이라는 용어는 위치 개수가 동일한 서열의 인접한 위치로 이루어진 참조 스트레치와 비교되는 서열의 인접한 위치로 이루어진 스트레치를 지칭한다. 선택된 인접한 위치의 개수는 10 내지 1,000개 범위일 수 있고, 즉, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1,000개의 인전합 위치를 포함할 수 있다. 전형적으로, 인접한 위치의 개수는 범위가 약 20 내지 800개의 인접한 위치, 약 20 내지 600개의 인접한 위치, 약 50 내지 400개의 인접한 위치, 약 50 내지 약 200개의 인접한 위치, 약 100 내지 약 150개의 인접한 위치이다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, 스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman)의 국부 상동성 알고리즘에 의해 (문헌 [Adv. Appl. Math. 2:482, 1970]), 니들만(Needleman) 및 운치(Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해 (문헌 [J. Mol. Biol. 48:443, 1970]), 피어슨(Pearson) 및 립만(Lipman)의 유사성 검색 방법에 의해 (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]), 이들 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행에 의해 (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group: 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예컨대, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)에 수행될 수 있다. 서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%) 측정에 적합한 알고리즘은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌 [Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)] 및 [Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)]에 기술되어 있다. BLAST 분석 실행 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내 동일한 길이의 워드와 정렬했을 때 어떠한 양의 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 점수 역치로서 지칭된다 (문헌 [Altschul et al, 상기 문헌 동일]). 이들 초기 이웃 워드 히트는 그를 함유하는 더욱 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M (매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 점수화 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음으로 점수화된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 단부에 도달한 경우에, 각 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 3, 및 예상값 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예컨대, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993]). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 전형적으로, 약 0.01 미만, 더욱 전형적으로, 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
아미노산이 화학적으로 관련된 아미노산으로 치환되는, 반보존적 및 특히, 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 전형적인 치환은 지방족 아미노산 사이에, 지방족 히드록실 측쇄를 가지는 아미노산 사이에, 산성 잔기를 가지는 아미노산 사이에, 아미드 유도체 사이에, 염기성 잔기를 가지는 아미노산 사이에, 또는 방향족 잔기잔기를 가지는 아미노산 사이에 이루어진다. 전형적인 반보존적 및 보존적 치환은 하기와 같다:
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새 시스테인이 유리 티올로서 그대로 남아있다면, A, F, H, I, L, M, P, V, W 또는 Y로부터 C로의 변이는 반보존적인 것이다. 추가로, 입체적 노력이 요구되는 위치의 글리신은 치환되지 않아야 하고, P는 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 가지는 단백질의 일부분 내로 도입되지 않아야 함을 당업자는 이해할 것이다.
EGF 수용체 패밀리는 4개의 구성원, EGFR (erbB1, HER1), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3), 및 ErbB4 (HER4)를 포함한다. 수용체는 4개의 도메인 (I - IV)으로 구성된 세포외 영역, 막횡단 영역, 및 티로신 키나제 도메인 및 티로신 잔기를 함유하는 카르복시 말단 테일로 이루어진 세포내 영역으로 구성된다 (문헌 [Baselga & Swain 2009, Novel anticancer targets: revisiting ErbB2 and discovering ErbB3. Nat. Rev. Cancer 9: 463-475]). 세포외 도메인 I 및 III은 리간드 결합에 관여하고, 도메인 II 및 IV는 수용체 이량체화에 관여한다. 도메인 II는 소위 이량체화 아암이라고 불리는 이량체화 루프를 통해 수용체-수용체 접촉을 매개한다 (문헌 [Garrett et al., 2002, Combination of antibody that inhibits ligand-independent HER3 dimerization and a p110 alpha inhibitor potently blocks PI3K signaling and growth of HER2+ breast cancers. Cancer Res. 73: 6013-6023]). EGF 리간드 패밀리에 속하는 다양한 리간드가 수용체에 결합할 수 있다. EGF, 형질전환 성장 인자-α (TGF-알파) 및 암피레굴린은 EGFR/ErbB1에 특이적으로 결합한다. 베타세룰린 (BTC), 헤파린 결합 EGF (HB-EGF) 및 에피레굴린 (EPR)은 EGFR/ErbB1 및 ErbB4, 둘 모두에 결합하는 이중 특이성을 보인다. 뉴레굴린 (NRG)은 ErbB3 및 ErbB4에 결합할 수 있거나 (NRG-1 및 NRG-2), 또는 오직 ErbB4에만 결합할 수 있는 (NRG-3 및 NRG-4) 그의 능력에 기초하여 2개의 하위군을 형성한다. 리간드 중 어느 것도 ErbB2에는 결합하지 않지만, ErbB2는 다른 모든 ErbB 수용체에 대해 바람직한 이량체화 파트너이다. ErbB3은 손상된 키나제 활성을 가지며, 오직 ErbB 수용체 패밀리의 또 다른 구성원과 이량체화되었을 때, 신호전달 잠재능을 획득하게 된다. ErbB 수용체에의 리간드 결합은 큰 입체형태적 변화를 유도하여 수용체 동종 및 이종이량체 형성 및 내재성 키나제 도메인의 활성화를 일으킴으로써 세포질 테일 내로의 특정 티로신 잔기를 인산화시킨다. 이들 인산화된 잔기는 세포내 신호전달 분자를 위한 도킹 부위로서 작용한다. 리간드가 인산화되는 티로신 잔기 및 동원되는 신호전달 분자를 결정한다. 모두가 세포 대사, 성장 및 생존 조절을 담당하는, 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK), 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)-AKT 및 야누스(Janus) 키나제 (JAK-STAT) 경로인, 3개의 주요 경로가 ErbB의 활성화시 자극을 받을 수 있다 (문헌 [Hervent & De Keulenaer, 2012, Molecular mechanisms of cardiotoxicity induced by ErbB receptor inhibitor cancer therapeutics. Int. J. Mol. Sci. 13: 12268-12286]).
태그 (또는 마커 또는 표지)는 또 다른 물질 또는 물질의 복합체의 존재를 표시할 수 있는 물질의 한 종류이다. 마커는 검출하고자 하는 물질에 연결되거나, 또는 그 물질에 도입되는 물질일 수 있다. 검출가능한 물질은 분자 생물학 및 생명공학에서 예컨대, 단백질, 효소 반응의 생성물, 2차 메신저, DNA, 분자의 상호작용 등을 검출하는 데 사용된다. 적합한 태그 또는 표지의 예로는 형광단, 발색단, 방사성표지, 금속 클로이드, 효소, 또는 화학발광성 또는 생물발광성 분자를 포함한다. 본 발명과 관련하여 적합한 태그는 바람직하게, 펩티드 서열이 재조합 단백질 내로 또는 그 위로 유전적으로 그래프팅된 단백질 태그이다. 단백질 태그는 예컨대, 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 태그, 또는 형광 태그를 포함할 수 있다.
"친화성 태그"는 단백질을 친화성 기술을 사용하여 그의 조 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있도록 단백질에 부가된다. 이는 키틴결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질 (MBP), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함한다. 폴리(His) 태그가 금속 매트릭스에 결합하는 널리 사용되는 단백질 태그이다.
"가용화 태그"는 특히, 단백질에서 적절한 폴딩을 지원하고, 그가 침전되지 못하게 하기 위해 샤페론 결핍 종에서 발현되는 재조합 단백질에 대해 사용된다. 이는 티오레독신 (TRX) 및 폴리(NANP)를 포함한다. 예컨대, MBP, 및 GST와 같은 일부 친화성 태그는 가용화제로서 이중 역할을 가진다.
"크로마토그래피 태그"는 특정 분리 기술 간의 상이한 분할을 얻기 위하여 단백질의 크로마토그래피 특성을 변경시키는 데 사용된다. 대개는, 이들은 폴리음이온성 아미노산, 예컨대, FLAG-태그로 구성된다.
"에피토프 태그"는, 고친화성 항체가 다수의 상이한 종에서 신뢰가능하게 제조될 수 있기 때문에 선택되는 짧은 펩티드 서열이다. 이는 일반적으로 바이러스 유전자로부터 유래되며, 이는 그의 높은 면역반응성을 설명하는 것이다. 에피토프 태그로는 V5-태그, Myc-태그, 및 HA-태그를 포함한다. 이들 태그는 항체 정제에서의 용도 또한 발견되지만, 이는 웨스턴 블롯팅, 면역형광 및 면역침전 실험에 특히 유용하다.
"형광 태그"는 단백질 상에서의 시각적 판독을 위해 사용된다. GFP 및 그의 변이체가 가장 일반적으로 사용되는 형광 태그이다. 더욱 진보된 GFP 적용은 폴딩 리포터로서 그를 사용하는 것을 포함한다 (폴딩시, 형광성을 띠고, 그렇지 않은 경우, 무색을 띤다). 형광단의 추가 예로는 플루오레세인, 로다민, 및 술포인도시아닌 염료 Cy5를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "항원 결합 단백질"이라는 용어는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학상 활성인 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위을 함유하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 파지 디스플레이를 비롯한, 기술을 통해 선택된 면역글로불린 유사 단백질 또한 포함된다. 항원 결합 단백질, 예컨대, 항체 또는 그의 면역학상 기능성 단편의 결합 및/또는 특이성 사정에서, 과량의 항체가 (예컨대, 시험관내 경쟁적 결합 검정법에서 측정된 바) 리간드에 결합한 결합 파트너의 양을 적어도 약 1-20, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% 이상만큼 감소시킬 때, 항체 또는 단편은 리간드의 그의 결합 파트너에의 결합을 실질적으로 억제시킬 수 있다. 중화 능력은 IC50 또는 EC50 값에 의해 기술될 수 있다.
"IC50" 값은 물질 반수 최대 억제 농도를 지칭하며, 따라서, 이는 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제시키는 데 있어서의 물질의 유효성의 척도이다. 값은 전형적으로 몰 농도로 표현된다. 약물(drug)의 IC50은 기능성 길항성 검정법에서 용량-반응 곡선을 작성하고, 상이한 농도에서 조사되는 물질의 억제 효과를 검사함으로써 측정될 수 있다. 대안적으로, 경쟁 결합 검정법은 IC50 값 측정을 위해 수행될 수 있다. 전형적으로, 억제성 항체의 IC50 값은 50 nM-1 pM, 즉, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 1 pM을 나타낸다.
"EC50" 값은 물질 반수 최대 유효 농도를 지칭하며, 따라서, 이는 명시된 노출 시간 경과 후 반응이 기준선과 최대 사이의 절반값에 이르도록 유도하는 상기 물질의 농도의 측정값이다. 이는 보통 약물 효능의 척도로서 사용된다. 그러므로, 등급화된 용량 반응 곡선의 EC50은 그의 최대 효과의 50%가 관찰되는 물질의 농도를 나타낸다. 양자 용량 반응 곡선의 EC50은 명시된 노출 지속 기간 경과 후, 집단 중 50%가 반응을 보이는 화합물의 농도를 나타낸다. 전형적으로, 억제성 항체의 EC50 값은 50 nM-1 pM, 즉, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 또는 1 pM을 나타낸다.
본 발명에 따른 "결합"이라는 용어는 바람직하게 특이적 결합에 관한 것이다. "결합 친화도"라는 용어는 일반적으로 분자 (예컨대, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예컨대, 표적 또는 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합산된 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "결합 친화도"란 결합쌍의 구성원 (예컨대, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있다. "특이적 결합"이란, 결합 모이어티 (예컨대, 항체)는, 또 다른 표적에의 결합과 비교하였을 때, 그가 특이성을 보이는 표적, 예컨대, 에피토프에 대하여 더욱 강력하게 결합한다는 것을 의미한다. 결합 모이어티가 제2 표적에 대한 해리 상수보다 더 낮은 해리 상수 (Kd)로 제1 표적에 결합한다면, 결합 모이어티는 제2 표적과 비교하여 제1 표적에 더욱 강력하게 결합하는 것이다. 결합 모이어티의 특이적 결합의 대상이 되는 표적에 대한 해리 상수 (Kd)는 결합 모이어티의 특이적 결합의 대상이 되지 않는 표적에 대한 해리 상수 (Kd)보다 10배 초과, 바람직하게, 20배 초과, 더욱 바람직하게, 50배 초과, 더욱더 바람직하게, 100배, 200배, 500배 또는 1,000배 초과로 더 낮다.
따라서, "Kd" ("mol/L" (이는 종종 "M"으로 약칭된다)로 측정)라는 용어는 결합 모이어티 (예컨대, 항체 또는 그의 단편)와 표적 분자 (예컨대, 항원 또는 그의 에피토프) 사이의 특정 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 친화도는 표면 플라스몬 공명 기반 검정법 (예컨대, BIA코어(BIAcore) 검정법); 수정 진동자 미량저울 검정법 (예컨대, 아타나 검정법); 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA); 및 경쟁 검정법 (예컨대, RIA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 일반 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도가 낮은 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 친화도가 높은 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고, 더 장기간 동안 결합된 상태 그대로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 그 중 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
전형적으로, 항체는 충분한 결합 친화도로, 예를 들어, 500 nM-1 pM, 즉, 500 nM, 450 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 또는 1 pM인 Kd 값으로 그의 표적에 결합한다.
동일한 에피토프에 대하여 경쟁하는 항원 결합 단백질 (예컨대, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)과 관련하여 사용될 때, "경쟁하다"라는 용어는, 시험되는 항원 결합 단백질 (예컨대, 항체 또는 그의 면역학상 기능성 단편)이 참조 항원 결합 단백질 (예컨대, 리간드, 또는 참조 항체)의 공통 항원에의 특이적 결합을 방해하거나, 또는 억제시키는 (예컨대, 감소시키는) 것인 검정법에 의해 측정되는 바와 같은, 항원 결합 단백질 사이의 경쟁을 의미한다. 한 항원 결합 단백질이 또 다른 것과 경쟁하는지 여부를 측정하는 데 예를 들어: 고체상 직접 또는 간접 방사성면역검정법 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정법 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정법 (예컨대, 문헌 [Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology .2:242-253] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (예컨대, 문헌 [Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조), 고체상 직접 표지된 검정법, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정법 (예컨대, 문헌 [Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 이용하는 고체상 직접 표지 RIA (예컨대, 문헌 [Morel et al., 1988, Molec. Jmmunol. 25:7-15] 참조); 고체상 직접 비오틴아비딘 EIA (예컨대, 문헌 [Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지된 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., 1990, Scand. J Immunol. 32:77-82])와 같은 여러 유형의 경쟁적 결합 검정법이 사용될 수 있다. 전형적으로, 상기 검정법은 고체 표면 또는 상기 중 어느 하나를 보유하는 세포에 결합된 정제된 항원, 비표지된 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 일반적으로, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정법에 의해 확인되는 항원 결합 단백질 (경쟁 항원 결합 단백질)로는 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 및 입체 장애가 발생하도록 참조 항원 결합 단백질의 결합 대상이 되는 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁 결합을 측정하는 방법에 관한 추가의 상세한 설명은 본원 실시예에서 제공된다. 일반적으로, 경쟁 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 참조 항원 결합 단백질의 공통 항원에의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 이상만큼 억제 (예컨대, 감소)시킬 것이다. 일부 경우에서, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 이상만큼 억제된다.
본원에서 사용되는 바, "면역글로불린 (Ig)"이라는 용어는 면역글로불린 슈퍼패밀리 중 면역 부여 당단백질을 지칭한다. "표면 면역글로불린"은 그의 막횡단 영역에 의해 이펙터 세포의 막에 부착되고, 분자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, B 세포 수용체, T 세포 수용체, 부류 I 및 II 주조직적합성 복합체 (MHC) 단백질, 베타-2 마이크로글로불린 (β2M), CD3, CD4 및 CD8을 포함한다.
전형적으로, 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 막횡단 영역이 없고, 따라서, 혈류 및 체강 내로 방출될 수 있는, 분비된 면역글로불린을 지칭한다. 인간 항체는 그가 가지고 있는 중쇄를 기초로 하여 상이한 이소타입으로 분류된다. 그리스 문자: α, γ, δ, ε, 및 μ로 표시되는 5가지 유형의 인간 Ig 중쇄가 존재한다. 존재하는 중쇄 유형이 항체 부류를 정의되며, 즉, 상기 쇄들은 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체에서 발견되는데, 이들은 각각 상이한 역할을 수행하고, 상이한 유형의 항원에 대하여 적절한 면역 반응을 지시한다. 상이한 중쇄는 크기 및 조성이 상이하며; 대략 450개의 아미노산을 포함할 수 있다 (문헌 [Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science]). IgA는 점막 부위, 예컨대, 장관, 기도 및 비뇨생식관에서 뿐만 아니라, 타액, 눈물 및 모유에서 발견되며, 이는 병원체에 의한 콜로니화를 막는다 (문헌 [Underdown & Schiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417]). IgD는 주로 항원에 노출되지 않고, 호염기구 및 비만 세포를 활성화시켜 항미생물 인자를 생산하는 데 관여하는 B 세포 상의 항원 수용체로서 작용한다 (문헌 [Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437]; [Chen et al. (2009) Nat. Immunol. 10:889-898]). IgE는 비만 세포 및 호염기구로부터의 히스타민의 방출을 유발하는 알레르겐에의 그의 결합을 통해 알레르기 반응에 관여한다. IgE는 또한 기생충으로부터 보호하는 데 관여한다 (문헌 [Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press]). IgG는 침입 병원체에 대한 대부분의 항체 기반 면역을 제공하고, 태반을 통과하여 태아에 수동 면역을 제공할 수 있는 유일한 항체 이소타입이다 (문헌 [Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press]). 인간에는 혈청 중의 그의 존재비 순서대로 명명이 되는 4종의 상이한 IgG 하위부류 (IgG1, 2, 3, 및 4)가 존재하며, 여기서, IgG1이 가장 존재비가 높고 (~66%), 그 다음으로 IgG2 (~23%), IgG3 (~7%) 및 IgG (~4%) 순으로 존재하다. 상이한 IgG 부류의 생물학적 프로파일은 각 힌지 영역의 구조에 의해 측정된다. IgM은 단량체 형태로 및 결합력이 매우 높은 분비된 오량체 형태로 B 세포의 표면 상에서 발현된다. IgM은 충분한 IgG 생산되기 이전에 B 세포 매개 (체액성) 면역의 조기 단계에서 병원체를 제거하는 데 관여한다 (문헌 [Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437]). 항체는 단량체로서 발견될 뿐만 아니라, 2개의 Ig 단위로 이루어진 이량체 (예컨대, IgA), 4개의 Ig 단위로 이루어진 사량체 (예컨대, 경골 어류의 IgM), 또는 5개의 Ig 단위로 이루어진 오량체 (예컨대, 포유동물의 IgM)를 형성하는 것으로 알려져 있다. 항체는 전형적으로 이황화 결합을 통해 연결되고, "Y"자 형상의 거대분자와 유사한, 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는, 4개의 폴리펩티드 쇄로 제조된다. 각 쇄는 다수의 면역글로불린 도메인을 포함하며, 그 중 일부는 불변 도메인이고, 나머지는 가변 도메인이다. 면역글로불린 도메인은 2개의 ~-시트로 배열된 7 내지 9개의 역평행 ~-가닥으로 이루어진 2층 샌드위치로 구성된다. 전형적으로, 항체의 중쇄는 4개의 Ig 도메인을 포함하며, 그 중 3개는 불변 (CH 도메인: CH1. CH2. CH3) 도메인이고, 그 중 하나는 가변 도메인 (VH)이다. 경쇄는 전형적으로 1개의 불변 Ig 도메인 (CL) 및 1개의 가변 Ig 도메인 (VL)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)으로 명명되는, 더욱 보존되는 영역이 사이에 배치되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명되는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분 (C1q)을 비롯한, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 항체의 "항원 결합 단편" (또는 간단하게 "결합부")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것으로 나타났다.
본원에서 사용되는 바, "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대, 시험관내에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발법에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어, 구철라파티(Kucherlapati) & 야코비츠(Jakobovits)에 의한 미국 특허 번호 5,939,598에 기술된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 트랜스제닉 동물로부터 단리된 항체를 포함하고, 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 단일 분자 조성물로 이루어진 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체는 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 한 실시양태에서, 모노클로날 항체는 무한증식 세포에 융합된, 인간이 아닌 동물, 예컨대, 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에서 사용되는 바, "재조합 항체"라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체, 예컨대, (a) 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마와 관련하여 트랜스제닉 또는 트랜스염색체인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예컨대, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다.
"키메라 항체"라는 용어는 각 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 중 일부는 특정 종으로부터 유래되거나, 또는 특정 부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 상동성인 반면, 쇄의 남은 세그먼트는 또 다른 종 또는 부류 중의 상응하는 서열과 상동성인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄, 둘 모두의 가변 영역은 한 포유동물 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변부는 또 다른 것으로부터 유래된 항체의 서열에 상동성이다. 상기 키메라 형태의 한가지 명백한 이점은 가변 영역은 예를 들어, 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합하여 인간이 아닌 숙주 유기체로부터의 쉽게 이용가능한 B 세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현 공지된 공급원으로부터 알맞게 유래될 수 있다는 점이다. 가변 영역은 제조가 용이하고, 특이성이 공급원에 의해 영향을 받지 않는다는 이점을 가지지만, 불변 영역은 항체가 주사되었을 때, 인간이 아닌 공급원으로부터의 불변 영역보다는 인간 대상체로부터 면역 반응을 유도할 가능성은 더 적다. 그러나, 본 정의는 상기 특정 예로 제한되지 않는다.
"인간화 항체"라는 용어는 실질적으로, 인간이 아닌 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래된 항원 결합 부위를 가지는 분자로서, 여기서, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반하는 것인 분자를 지칭한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에서 융합된 완전한 가변 도메인, 또는 오직 가변 도메인 중의 적절한 프레임워크 영역에 그래프팅된 상보성 결정 영역 (CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나, 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있고, 예컨대, 인간 면역글로불린에 더 가깝게 유사하도록 변형될 수 있다. 인간화 항체 중 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다 (예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화 마우스 항체). 다른 형태는 원래의 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR을 형성한다.
항체를 인간화하는 상이한 방법은 문헌 [Almagro & Fransson, 2008] (상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 리뷰되어 있는 바와 같이, 당업자에게 공지되어 있다. 알마그로(Almagro) & 프란손(Fransson)에 의한 리뉴 논문은 하기에서 간략하여 요약된다. 알마그로 & 프란손은 합리적인 접근법과 경험적 접근법을 구별한다. 합리적인 접근법은 조작된 항체의 소수의 변이체를 생성하고, 그의 결합 또는 관심의 대상이 되는 임의이 다른 특성을 사정하는 것을 특징으로 한다. 디자인된 변이체가 예상 결과를 일으키지 못한다면, 디자인 및 결합 사정으로 이루어진 새 사이클을 개시한다. 합리적인 접근법은 CDR 그래프팅, 리서페이싱(Resurfacing), 초인간화(Superhumanization) 및 인간 스트링 함량 최적화(Human string content optimization)를 포함한다. 그에 반해, 경험적 접근법은 인간화 변이체 큰 라이브러리 생성 및 강화 기술 또는 고처리량 스크리닝을 이용한 최선의 클론 선별을 기초로 한다. 따라서, 경험적 접근법은 신뢰할만한 선별 및/또는 광활한 항체 변이체 공간을 탐색할 수 있는 스크리닝 시스템에 의존한다. 예컨대, 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이와 같은 시험관내 디스플레이 기술은 상기 요구 조건을 충족하며, 당업자에게 널리 공지되어 있다. 경험적 접근법은 FR 라이브러리, 가이드된 선별, 프레임워크 셔플링 및 인간공학(Humaneering)을 포함한다.
"2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 2가 항체는 단일특이적 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 2가 항체가 단일특이적 항체인 경우, 항체의 두 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 가진다. "이중특이적" 또는 "이작용성" 항원 결합 단백질 또는 항체는 각각 2개의 상이한 항원 결합 부위를 가지는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 두 결합 부위는 동일한 항원 상에, 또는 상이한 항원 상에 존재하는 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 이중특이적 항원 결합 단백질 및 항체는 다중특이적 항원 결합 단백질 항체의 한 종류이며, 이는 하이브리도마의 융합, IgG 또는 IgG 단편, 예컨대, Fab'의 화학적 연결을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해, 또는 유전적 수단에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. lmmunol. 79:315-321]; [Kostelny et al., 1992, J. lmmunol. 148:1547-1553]; [Kontermann, 2014, MAbs 4:182-197]을 참조할 수 있다.
"삼작용성 항체"는 상이한 항원을 표적화하는 2개의 결합 부위 뿐만 아니라, 보조 세포 (예컨대, 단핵구/대식세포, 자연살 세포, 수지상 세포 등) 상의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 무손상 Fc 파트를 포함하는 이중특이적 항체의 한 유형이다. 예를 들어, 삼작용성 항체는 암 세포 표면 상의 에피토프를 표적화하는 결합 부위를 포함할 수 있고, 제2 결합 부위는 T 세포 표면 상의 에피토프 (예컨대, CD3)를 표적화할 수 있고, Fc 파트는 대식세포 표면 상의 Fc 수용체에 결합할 수 있다. 따라서, 상기 삼작용성 항체는 T 세포 및 대식세포를 종양 세포에 연결시킴으로써 그의 파괴를 유도할 수 있다.
항체의 파파인 분해를 통해, 각각 단일 항원 결합 부위를 가지며, "Fab 단편" (이는 또한 "Fab 부분" 또는 "Fab 영역"으로도 지칭된다)으로 명명되는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fe 단편" (이는 또한 "Fe 부분" 또는 "Fe 영역"으로도 지칭된다)이 생성되는데, 상기 명칭은 쉽게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영하는 것이다. 인간 IgG Fe 영역의 결정 구조는 측정된 바 있다 (문헌 [Deisenhofer (1981) Biochemistry 20:2361-2370]). IgG, IgA 및 IgD 이소타입에서, Fe 영역은 항체의 두 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인으로부터 유래된, 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성되고; IgM 및 IgE 이소타입에서, Fe 영역은 각 폴리펩티드 쇄 중에 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH2-4)을 함유한다. 추가로, 더 작은 면역글로불린 분자가 천연적으로 존재하거나, 또는 인공적으로 구축될 수 있다. "Fab' 단편"이라는 용어는 Fab 단편이 Ig 분자의 힌지 영역을 추가로 포함한다는 것을 지칭하는 반면, "F(ab')2 단편"은 화학적으로 연결되거나, 또는 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 것으로 이해된다. "단일 도메인 항체 (sdAb)" (문헌 [Desmyter et al. (1996) Nat. Structure Biol. 3:803-811]) 및 "나노바디"가 오직 단일 VH 도메인만을 포함하는 반면, "단일 쇄 Fv (scFv)" 단편은 짧은 링커 펩티드를 통해 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함한다 (문헌 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883]). 2가 단일 쇄 가변 단편 (디-scFv)은 2개의 scFv (scFvA-scFvB)를 연결시킴으로써 조작될 수 있다. 이는 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 이용하여 단일 펩티드 쇄를 제조하여 "텐덤 scFv" (VHA-VLA-VHB-VLB)를 수득함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 가능성은, scFv가 이량체화되도록 하면서, 너무 짧은 링커에 기인하여 두 가변 영역이 함께 폴딩되지 못하게 되는 링커를 포함하는 scFv를 생성하는 것이다. 일반적으로, 상기 이량체를 생성하는 데 길이가 5개의 잔기 길이인 링커가 사용된다. 이러한 유형은 "디아바디"로 공지되어 있다. VH 도메인과 VL 도메인 사이의 더욱더 짧은 링커 (하나 또는 2개의 아미노산)를 통해 소위 "트리아바디" 또는 "트리바디"로 명명되는 단일특이적 삼량체가 형성된다. 이중특이적 디아바디는 각각 VHA-VLB 및 VHB-VLA 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA 배열을 가지는 쇄로 발현시킴으로써 형성된다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 12-20개의 아미노산, 바람직하게, 14개의 아미노산, (VHA-VLB-P-VHB-VLA)의 링커 펩티드 (P)에 연결된 VHA-VLB 및 VHB-VLA 단편을 포함한다. "이중특이적 T 세포 관여 항체 (BiTE)"는 scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 나머지 다른 하나는 종양 특이적 분자를 통해 종양 세포에 결합하는, 상이한 항체의 두 scFv로 구성된 융합 단백질이다 (문헌 [Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244]). 이중 친화성 재표적화 분자 ("DART" 분자)는 C-말단 이황화 브릿지를 통해 추가로 안정화된 디아바디이다. 2가 단일 쇄 가변 단편은 하나 이상의 동종 또는 이종이량체화 도메인에 연결됨으로써 4가, 6가, 8가 분자, 또는 더욱더 높은 결합가의 분자를 생성할 수 있다. 하나 이상의 동종 또는 이종이량체화 도메인을 통해 연결된 단일 쇄 가변 단편의 각 특이성에 의존하여, 생성된 이량체 또는 다량체 단백질은 2, 3, 4개 이상의 특이성을 가지게 될 것이다.
본원에 기술된 항체는 바람직하게는 단리된 것이다. 본원에서 사용되는 바, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체는 실질적으로 함유하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질은 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, "단리된" 모노클로날 항체의 조합은 상이한 특이성을 가지고, 잘 정의된 조성으로 조합된 항체에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바, "항체 유사 단백질"이라는 용어는 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 (예컨대, 루프의 돌연변이유발법에 의해) 조작된 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 상기 항체 유사 단백질은 양측 단부에 단백질 스캐폴드에 부착된 적어도 하나의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 제약이 항체 유사 단백질의 결합 친화도를 항체의 것과 유사한 수준으로까지 크게 증가시킨다. 가변 펩티드 루프의 길이는 전형적으로 10 내지 20개의 아미노산으로 구성된다. 스캐폴드 단백질은 가용성 특성이 우수한 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게, 스캐폴드 단백질은 작은 구형 단백질이다. 항체 유사 단백질은 제한 없이, 어피바디, 안티칼린, 및 디자인된 안키린 반복 단백질을 포함한다 (리뷰를 위해, 문헌 [Binz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10):1257-1268] 참조). 항체 유사 단백질은 돌연변이체의 큰 라이브러리로부터 유래될 수 있고, 예컨대, 큰 파지 디스플레이 라이브러리로부터 패닝될 수 있고, 일반 항체와 유사하게 단리될 수 있다. 또한, 항체 유사 결합 단백질은 구형 단백질에서 표면 노출된 잔기의 조합 돌연변이유발법에 의해 수득될 수 있다. 항체 유사 단백질은 종종 "펩티드 압타머"로 지칭된다.
본원에서 사용되는 바, "펩티도미메틱(peptidomimetic)"은 펩티드를 모방하도록 디자인된 소형 단백질 유사 쇄이다. 펩티도미메틱은 전형적으로 분자의 특성을 변경시키기 위해 현 펩티드의 변형으로부터 생성된 것이다. 예를 들어, 이는 분자의 안정성 또는 생물학적 활성을 바꾸기 위해 변형으로부터 생성될 수 있다. 이는 현 펩티드로부터의 약물 유사 화합물 개발에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 변형은 천연적으로 존재하지 않는 펩티드로의 변이를 포함한다 (예컨대, 백본 변경 및 비천연 아미노산 도입).
"표적"이라는 용어는 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적은 항원이다. "항원 결합 단백질"이라는 어구에서 "항원" 사용은 간단하게 항원을 포함하는 단백질 서열이 항체에 의해 결합될 수 있다는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 단백질이 외래 단백질이어야 하거나, 또는 면역 반응을 유도할 수 있어야 하거나 할 필요는 없다.
"재조합"이라는 용어는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 재조합 방법에 의해 의도적으로 변형되었음을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "재조합 핵산"이라는 용어는 시험관내에서 형성되고, 임의적으로, 보통은 자연상에서 발견되지 않는 핵산 분자를 형성하기 위해 엔도뉴클레아제에 의해 추가로 조작된 핵산을 지칭한다. 예시화된, 재조합 핵산으로는 선형 형태의 cDNA 뿐만 아니라, 보통은 연결되지 않는 DNA 분자를 시험관내에서 라이게이션시킴으로써 형성된 벡터를 포함한다. 일단 재조합 핵산이 제조되고, 숙주 세포 내로 도입되고 나면, 이는 비-재조합적으로, 즉, 시험관내 조작보다는 숙주 세포의 생체내 세포 기구를 사용함으로써 복제될 것이라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 재조합적으로 제조된 핵산은 후속하여 비-재조합적으로 복제될 수 있다. "재조합 단백질"은 재조합 기술을 사용하여, 예컨대, 상기 예시된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 본원에서 사용되는 바, "재조합 벡터"라는 용어는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대, 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스 벡터, 또는 인공 염색체 벡터, 예컨대, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 또는 P1 인공 염색체 (PAC)를 비롯한, 당업자에게 공지된 임의의 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 벡터 뿐만 아니라, 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드 뿐만 아니라, 바이러스 벡터를 포함하고, 일반적으로 원하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체 (예컨대, 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유동물)에서 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 적절한 DNA 서열을 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 특정의 원하는 DNA 단편을 조작하고, 증폭시키는 데 사용되고, 원하는 DNA 단편의 발현을 위해 요구되는 기능성 서열은 포함하지 않을 수도 있다.
"숙주 세포"라는 용어는 벡터를 보유하는 세포 (예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)를 지칭한다. 상기 숙주 세포는 원핵 (예컨대, 박테리아 세포) 또는 진핵 세포 (예컨대, 진균, 식물 또는 동물 세포)일 수 있다. 숙주 세포는 단일 세포 원핵생물 및 진핵생물 유기체 (예컨대, 박테리아, 효모, 및 악티노마이세테스(actinomycetes)), 두 유기체 모두를 포함할 뿐만 아니라, 세포 배양물 중에서의 성장시 고등 목 식물 또는 동물로부터 유래된 단일 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "재조합 숙주 세포"란, 관심 폴리펩티드 단편, 즉, 본 발명에 따른 바이러스 PA 서브유니트의 단편, 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 지칭한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 (i) 그 자체로서 자유롭게 분산된 상태로, (ii) 재조합 벡터에서 도입된 상태로, 또는 (iii) 숙주 세포 게놈 내로 또는 미토콘드리아 DNA 내로 통합된 상태로 숙주 세포 내부에서 발견될 수 있다. 재조합 세포는 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터의 증폭을 위해 사용될 수 있다. "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 재조합 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이(E. coli) 세포, 효모 세포, 예컨대, 사카로마이세스 세레 비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 식물 세포, 곤충 세포, 예컨대, SF9 또는 하이 파이브(High Five) 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포의 바람직한 예로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 녹색 아프리카 원숭이 신장 (COS) 세포, 인간 배아 신장 (HEK293) 세포, HELA 세포 등이 있다.
"개체," "대상체", 또는 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 본 발명이 도움이 될 수 있는 임의의 포유동물, 파충류 또는 조류를 지칭한다. 특히, 개체는 실험용 동물 (예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼), 가축 (예컨대, 기니아 피그, 토끼, 말, 당나귀, 소, 양, 염소, 돼지, 닭, 오리, 낙타, 고양이, 개, 바다 거북, 육지 거북, 뱀, 또는 도마뱀 포함), 또는 침팬지, 보노보, 고릴라 및 인간을 비롯한 영장류로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, "개체"는 인간이다.
"질환" 및 "장애"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 조직, 기관 또는 개체가 더 이상은 그의 기능을 효율적으로 이행할 수 없는, 비정상적인 병태, 특히, 비정상적인 의학적 병태, 예컨대, 질병 또는 손상을 지칭한다. 전형적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 질환은 상기 질환의 존재를 나타내는 특정 증상 또는 징후와 연관이 있다. 따라서, 상기 증상 또는 징후의 존재가 조직, 기관 또는 개체가 질환을 앓는다는 것을 암시할 수 있다. 이러한 증상 또는 징후의 변경이 상기 질환의 진행을 암시할 수 있다. 질환의 진행은 전형적으로 질환의 "악화" 또는 "호전"을 암시할 수 있는 상기 증상 또는 징후의 증가 또는 감소를 특징으로 한다. 질환의 "악화"는 조직, 기관 또는 개체가 그의 기능을 효율적으로 이해할 수 있는 능력의 감소를 특징으로 하는 반면, 질환의 "호전"은 전형적으로 조직, 기관 또는 개체가 그의 기능을 효율적으로 이해할 수 있는 능력의 증가를 특징으로 한다. 질환이 "발생할 위험"이 있는 조직, 기관 또는 개체는 건강한 상태이지만, 질환이 발생할 잠재성은 나타낸다. 전형적으로, 질환이 발생할 위험은 상기 질환의 조기 또는 약한 징후 또는 증상과 연관이 있다. 그러한 경우, 질환 발병 역시 치료에 의해 예방될 수 있다. 질환의 예로는 감염성 질환, 외상성 질환, 염증성 질환, 피부 병태, 내분비성 질환, 장 질환, 신경 장애, 관절 질환, 유전적 장애, 자가면역 질환, 및 각종 유형의 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"종양"이란, 빠르고, 제어되지 않는 세포 증식으로 성장하고, 새로운 성장을 개시한 자극이 중단된 이후에도 계속해서 성장을 하는 비정상적인 세포 또는 조직 군을 의미한다. 종양은 구조적 조직화 및 정상 조직과의 기능적 조정의 부분적 또는 완전한 결여를 보이고, 일반적으로는, 양성 또는 악성일 수 있는, 뚜렷한 조직 매스를 형성한다.
"전이"란, 암 세포의 그의 원래 부위에서부터 신체의 다른 부분으로의 확산을 의미한다. 전이 형성은 매우 복잡합 프로세스이고, 이는 악성 세포의 원발성 종양으로부터의 박리, 세포외 기질의 침습, 내피 기저막을 침투하여 체강 및 혈관 내로의 진입, 및 이어서, 혈액에 의한 수송 후, 표적 기관의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 표적 부위에서 새 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 세포 또는 성분은 그대로 남아있을 수 있고, 전이성 잠재능이 발생할 수 있기 때문에, 종양 전이는 대개 심지어 원발성 종양 제거 이후에도 발생한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 원발성 종양 및 국부 림프절 시스템으로부터 원거리에 있는 전이에 관한 것인 "원위부 전이"에 관한 것이다.
질환 또는 장애의 "증상"은 상기 질환 또는 장애를 앓는 조직, 기관 또는 유기체에 의해 뚜렷이 나타나는 질환 또는 장애의 영향이고, 이는 조직, 기관 또는 유기체의 통증, 약화, 압통, 염좌, 경직, 및 연축 뿐만 아니라, 특정 지표, 예컨대, 바이오마커 또는 분자 마커의 존재, 부재, 증가, 감소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, "질환" 및 "장애"라는 용어는 조직, 기관 또는 개체가 더 이상은 그의 기능을 효율적으로 이행할 수 없는, 비정상적인 병태, 특히, 비정상적인 의학적 병태, 예컨대, 질병 또는 손상을 지칭한다. 전형적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 질환 또는 장애는 상기 질환 또는 장애의 존재를 나타내는 특정 증상 또는 징후와 연관이 있다. 질환 또는 장애로는 자가면역 질환, 알레르기 질환, 암 유형 질환, 피부 병태, 내분비성 질환, 혈액 질환 및 장애, 안구 질환 및 장애, 유전적 장애, 염증성 질환, 감염성 질환, 장 질환, 신경 장애, 및 정신병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시화된, 암 유형 질환으로는 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌 종양, 유방암, 버킷 림프종, 자궁경부암, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 식도암, 망막모세포종, 위암(Gastric cancer)(위암(Stomach cancer)), 위장관 기질 종양, 신경교종, 호지킨 림프종, 카포시 육종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 구인두암, 난소암, 췌장암, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 인후암, 갑상선암, 및 요도암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 질환 또는 장애를 "치료하다," "치료하는," 질환 또는 장애의 "치료" 또는 "요법"이라는 것은 하기: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상을 발생을 제한하거나, 또는 예방하는 것; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 억제시키는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 개체에서 장애(들)의 재발을 제한하거나, 또는 예방하는 것; 및 (e) 이전에 장애(들)의 증상을 보였던 개체에서 증상을 재발을 제한하거나, 또는 예방하는 것 중 하나 이상의 것을 달성하는 것을 의미한다. 따라서, 치료 효과를 가지는 모이어티가 상기 지정된 효과 (a)-(e) 중 하나 이상의 것을 달성함으로써 질환 또는 장애의 증상을 치료한다.
본원에서 사용되는 바, 질환 또는 장애를 "예방하다," "예방하는," 질환 또는 장애의 "방지" 또는 "예방"이란, 환자에서 상기 질환 또는 장애가 발생하는 막는 것을 의미한다.
"제약상 허용되는"이라는 것은 동물에서, 및 더욱 특히, 인간에서 사용하기 위한 것으로서 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관의 승인을 받았거나, 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 다른 일반적으로 승인을 받은 약전에 열거되어 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 활성인 모이어티"라는 용어는 예방적, 치료적 및/또는 진단적 효과를 포함하나, 이에 제한되지 않는 제약 효과를 매개하는, 거대분자 또는 복합체, 즉, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 그의 복합체의 일부 또는 모이어티를 지칭하는 것으로 이해된다. 제약상 활성인 모이어티는 전형적으로 생물학적 및/또는 화학적 제약, 예컨대, 리간드, 이펙터 분자, 반감기 연장 모듈 및 영상화 분자를 포함한다. "리간드"라는 용어는 또 다른 분자와 복합체를 형성하여 특이적인 생물학적 기능을 이행하는 화학적 또는 생물학적 물질을 지칭한다. 리간드는 기질, 억제제, 및 활성제, 예컨대, 항원 결합 분자, 스캐폴드 단백질, 천연 리간드, 리간드 결합 수용체 단편, 및 압타머를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "이펙터 분자"라는 용어는 전형적으로 단백질에 결합함으로써 상기 단백질의 활성을 변경시키는 소분자, 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 이는 사이토카인, 케모카인, 면역(공동)-자극성 분자, 면역억제성 분자, 사멸 리간드, 아폽토시스 유도 단백질, 키나제, 프로드럭-전환 효소, RNase, 효능작용 항체 또는 항체 단편, 길항성 항체 또는 항체 단편, 독소, 성장 인자, 호르몬, 응고 인자, 피브린 용해 단백질, 상기의 것을 모방하는 펩티드, 및 그의 단편, 융합 단백질 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "반감기 연장 모듈"은 화학적 또는 생물학적 물질의 반감기, 예컨대, "혈장 반감기" 또는 "혈청 반감기"를 연장시킨다. 영상화 분자는 특이적 표적 분자에 결합하여 상기 분자의 위치가 시각화될 수 있도록 하는 것이다.
"제약," "의약" 및 "약물"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 질환 또는 장애의 확인, 예방 또는 치료를 위해 사용되는 물질 및/또는 물질의 조합을 지칭한다.
"제제" 및 "조성물"이라는 용어는, 다른 담체와 함께 또는 그를 포함하지 않는 활성 성분이 캐리어에 의해 둘러싸여져 있고, 이로써, 활성 화합물과 회합되어 있는 캡슐을 제공하는, 캐리어로서 캡슐화 물질과 함께 활성 화합물로 이루어진 제제를 포함하는 것으로 의도된다.
"화학 제약"은 전형적으로 장애 또는 질환의 예방, 치료 또는 진단에서 효과적인, 인공적으로 합성된 화학 화합물을 지칭하는 것으로 이해된다.
"생물학적 제제(biologicals)"는 전형적으로 생명 공학 수단을 사용하여 제조된 의학적 약물을 지칭하는 것으로 이해되며, 이는 예방적, 치료적, 및/또는 생체내 진단 목적으로 사용된다. 생물학적 제제로는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 핵산 (예컨대, DNA, RNA, 또는 그의 하이브리드)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 승인받은 치료용 생물학적 제제로는 호르몬 (예컨대, 인슐린, hGH, FSH, 글루카곤 유사 펩티드 1, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 루트로핀, 글루카곤), 성장 인자 (예컨대, 에리트로포이에틴, G-CSF/GM-CSF, IGF-1), 인터페론 (예컨대, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 인터류킨 (예컨대, IL-2, IL-11, IL-1Ra), 응고 인자 (예컨대, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VIIa, 트롬빈), 혈전용해제 및 항응고제 (예컨대, t-PA, 히루딘, 활성화된 단백질 C), 효소 (예컨대, α-글루코시다제, 글루코세레브로시다제, 이두로네이트-2-술파타제, 갈락토시다제, 우레이트 옥시다제, DNase), 항원 결합 분자, 예컨대, 항체 및 항체 단편 (예컨대, IgG, Fab), 및 그의 융합 단백질 (예컨대, TNFR2-Fc, TMP-Fc, CTLA-4-Fc, IL-1R-Fc, LFA-3-Fc, IL-2-DT)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"활성 성분"이라는 용어는 생물학적으로 활성인, 즉, 제약 가치를 제공하는 제약 조성물 또는 제제 중의 물질을 지칭한다. 제약 조성물은 서로 함께 또는 독립적으로 작용할 수 있는 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 활성 성분은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은, 유리 아미노 기와 형성된 것, 및 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은, 유리 카르복실 기와 형성된 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "담체"라는 용어는, 치료적 활성 성분과 함께 투여되는, 약리적으로 불활성인 물질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 희석제, 부형제, 계면활성제, 안정제, 생리적 완충 용액 또는 비히클을 지칭한다. 상기 제약 담체는 액체 또는 고체일 수 있다. 액체 담체로는 멸균 액체, 예컨대, 물, 및 페트롤륨, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 오일 중의 염수 용액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 또한 액체 담체로서, 특히, 주사액용으로 사용될 수 있다. 염수 용액은 제약 조성물이 정맥내로 투여될 때에 바람직한 담체이다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기술되어 있다.
적합한 제약 "부형제"로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
"계면활성제"는 음이온성, 양이온성, 및 비이온성 계면활성제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 도데실술페이트, 트리톤(Triton) X-100, 및 폴리소르베이트, 예컨대, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65 및 폴리소르베이트 80. 을 포함한다.
"안정제"로는 만닛톨, 수크로스, 트레할로스, 알부민 뿐만 아니라, 프로테아제 및/또는 뉴클레아제 길항제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"생리적 완충 용액"으로는 염화나트륨 용액, 탈염수 뿐만 아니라, 적합한 유기 또는 무기 완충 용액s,예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제, 트리스 완충제 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), HEPES 완충제 ([4 (2 히드록시에틸)피페라지노]에탄술폰산) 또는 MOPS 완충제 (3 모르폴리노-1 프로판술폰산)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 각 완충제의 선택은 일반적으로 원하는 완충제 몰농도에 의존한다. 예를 들어, 주사액 및 주입액용으로는 포스페이트 완충제가 적합하다.
"애주번트"라는 용어는 세포 또는 체액 수준에서 조성물의 활성 성분에 대한 면역 반응을 증강, 자극, 활성화, 강화 또는 조정하는 작용제를 지칭하며, 예컨대, 면역학적 애주번트는 실제 항원에 대한 면역계의 반응을 자극시키지만, 그 자체가 면역학적 효과는 없다. 상기 애주번트의 예로는 무기 애주번트 (예컨대, 무기 금속 염, 예컨대, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄), 유기 애주번트 (예컨대, 사포닌 또는 스쿠알렌), 오일 기반 애주번트 (예컨대, 프로인트 완전 애주번트 및 프로인트 불완전 애주번트), 사이토카인 (예컨대, IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, 및 INF-γ) 미립자 애주번트 (예컨대, 면역-자극성 복합체 (ISCOMS), 리포솜, 또는 생분해성 미소구체), 비로좀, 박테리아 애주번트 (예컨대, 모노포스포릴 지질 A, 또는 무라밀 펩티드), 합성 애주번트 (예컨대, 비이온성 블록 공중합체, 무라밀 펩티드 유사체, 또는 합성 지질 A), 또는 합성 폴리뉴클레오티드 애주번트 (예컨대, 폴리아르기닌 또는 폴리리신)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 의도되는 목적을 달성하는 데 충분한 치료제의 양이다. 주어진 치료제의 유효량은 인자, 예컨대, 치료제의 성질, 투여 경로, 치료제를 받는 동물의 크기 및 종, 및 투여 목적에 따라 달라질 것이다. 각 개별 사례에서의 유효량은 당업계의 확립된 방법에 따라 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
실시양태
제1 측면에서, 본 발명은 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3)의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. "도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프"라는 어구는 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산 및 도메인 IV의 적어도 하나의 아미노산에 대해 항원 결합 단백질이 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, 도메인 III 및 IV의 모든 아미노산이 입체형태적 에피토프의 일부분이라는 것을 암시하는 것은 아니라, 두 도메인 모두 그 중의 아미노산(들)에 대해 결합이 이루어진다는 것을 암시한다. 전형적으로, 항체의 에피토프는 12 내지 20개의 아미노산을 포함하고, 따라서, 특정 실시양태에서, 도메인 III의 1 내지 19개의 아미노산 및 도메인 IV의 1 내지 19개의 아미노산에 대해 항원 결합 단백질이 결합하고, 바람직하게, 도메인 III의 3 내지 17개의 아미노산 및 도메인 IV의 3 내지 17개의 아미노산에 대해 항원 결합 단백질이 결합한다. 각 경우에서, 결합이 이루어지는 에피토프는 12 내지 20개의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 완전한 도메인 III 및 완전한 도메인 IV에 의해 형성된다. 대안적 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 완전한 도메인 III 및 도메인 IV의 단편에 의해 형성된다. 대안적 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 III의 단편 및 완전한 도메인 IV에 의해 형성된다. 대안적 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 III의 단편 및 도메인 IV의 단편에 의해 형성된다.
특정 실시양태에서, 도메인 III은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 329 내지 531로 구성된다.
특정 실시양태에서, 도메인 IV의 단편은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532-587을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 도메인 IV는 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532-643으로 구성된다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 HER3의 도메인 III & IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서, 여기서, 도메인 III은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 329 내지 531로 구성되고, 여기서, 도메인 IV의 단편은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532-587을 포함하거나, 또는 그로 구성된 것인 항원 결합 단백질을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 HER3의 도메인 III & IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서, 여기서, 도메인 III은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 329 내지 531로 구성되고, 여기서, 도메인 IV의 단편은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532 내지 643으로 구성된 것인 항원 결합 단백질을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 HER3에의 결합에 대해 본 발명의 제1 측면의 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3)의 도메인 III & IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 완전한 도메인 III 및 완전한 도메인 IV에 의해 형성된다. 대안적 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 완전한 도메인 III 및 도메인 IV의 단편에 의해 형성된다. 대안적 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 III의 단편 및 완전한 도메인 IV에 의해 형성된다. 대안적 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 III의 단편 및 도메인 IV의 단편에 의해 형성된다.
특정 실시양태에서, 도메인 III은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 329 내지 531로 구성된다.
특정 실시양태에서, 도메인 IV의 단편은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532-587을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 도메인 IV는 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532-643으로 구성된다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 HER3의 도메인 III & IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질로서, 여기서, 도메인 III은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 329 내지 531로 구성되고, 여기서, 도메인 IV의 단편은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532-587을 포함하거나, 또는 그로 구성된 것인 항원 결합 단백질을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질로서, 여기서, 도메인 III은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 329 내지 531로 구성되고, 여기서, 도메인 IV의 단편은 서열 번호: 1에 따른 HER3의 아미노산 532 내지 643으로 구성된 것인 항원 결합 단백질을 제공한다.
특정 실시양태에서, 제2 측면의 상기 항원 결합 단백질은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 그의 결합에 대하여 제1 측면의 항원 결합 단백질과 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 제2 측면의 항원 결합 단백질은 에피토프에 대하여 제1 측면의 항원 결합 단백질보다 더욱 큰 친화도를 나타냄으로써 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁한다.
추가 실시양태에서, 제2 측면의 항원 결합 단백질은 제1 측면의 항원 결합 단백질의 결합을 입체적으로 방해함으로써 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에의 결합과 경쟁한다. 실시양태에서, 제2 측면의 항원 결합 단백질은 제1 측면의 항원 결합 단백질이 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 결합할 수 없도록 동일한 에피토프에 결합함으로써, 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 제1 측면의 항원 결합 단백질과의 결합을 입체적으로 방해한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 하기 특징들 중 하나 이상의 특징을 나타낸다:
(a) 항원 결합 단백질은 (특히 유세포 분석법에 의해 HER3 발현 세포 상에서 분석된 바) 15 nM 미만의 EC50 값으로 HER3에 결합한다. 특히, 항원 결합 단백질은 10 nM 미만, 5 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 미만, 또는 30 pM 미만의 EC50 값으로 HER3에 결합한다.
(b) 항원 결합 단백질은 (특히 수정 진동자 미량저울 측정, 표면 플라스몬 공명, 광학 간섭계법 (옥텟(Octet)), 또는 경쟁적 ELISA에 의해 분석된 바) 100 nM 미만의 KD로 단량체 HER3에 결합한다. 특히, 항원 결합 단백질은 50 nM 미만, 30 nM 미만, 또는 20 nM 미만의 KD로 단량체 HER3에 결합한다.
(c) 항원 결합 단백질은 10 nM 미만의 IC50 값으로 헤레굴린 유도된 HER3(heregulin-induced HER3) 인산화를 억제시킨다. 특히, 항원 결합 단백질은 5 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 또는 100 pM 미만의 IC50 값으로 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제시킨다. 특히, 항원 결합 단백질은 80 pM의 IC50 값으로 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제시킨다.
따라서, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은
(a) (유세포 분석법에 의해 HER3 발현 세포 상에서 분석된 바) 15 nM 미만의 EC50 값으로, 특히, 0 nM 미만, 5 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 미만, 또는 30 pM 미만의 EC50 값으로 HER3에 결합하고/거나;
(b) (수정 진동자 미량저울 측에 의해 분석된 바) 100 nM 미만의 KD로, 특히, 50 nM 미만, 30 nM 미만, 또는 20 nM 미만의 KD로 단량체 HER3에 결합하고/거나;
(c) 10 nM 미만의 IC50 값으로, 특히, 5 nM 미만, 1 nM 미만, 500 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 또는 100 pM 미만의 IC50 값으로, 특히, 80 pM의 IC50 값으로 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제시킨다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 하기 중 하나 이상의 것:
(i) HER3의 그의 리간드에의 결합,
(ii) 수용체 활성화 및/또는 신호전달을 억제시키고/거나,
(iii) HER3 내재화를 유도하고/거나,
(iv) 세포 증식을 억제시키고/거나,
(v) 종양 성장을 억제시킨다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은
a) 항체 또는 그의 항원 결합 단편,
b) 항체 유사 단백질, 및
c) 펩티도미메틱으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 1가 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 다중특이적 항체, 탈면역화된 항체 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체 (특히, 인간 IgG1 항체)로 구성된 군으로부터 선택되는 항체이다.
특정 실시양태에서, 항체의 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 이황화 결합된 Fv (dsFv), 단일 도메인 항체, 단일 쇄 Fv (scFv) 항체, 및 단일 도메인 항체 (VH, VL, VHH, 나노바디, VNAR)로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 항체 유사 단백질은 지질단백질 연관 응고 억제제 (LACI-D1); 어필린, 예컨대, 인간-γ B 결정질 또는 인간 유비퀴틴; 시스타틴; 술포로부스 액시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)로부터의 Sac7D; 리포칼린 및 리포칼린으로부터 유도된 안티칼린; 디자인된 안키린 반복 도메인 (DARPin); Fyn의 SH3 도메인; 프로테아제 억제제의 쿠니츠(Kunits) 도메인; 모노바디, 예컨대, 피브로넥틴의 10번째 타입 III 도메인; 애드넥틴; 시스테인 노트 미니단백질; 아트리머; 에비바디, 예컨대, CTLA4-기반 결합제, 어피바디, 예컨대, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A의 Z-도메인으로부터의 3 나선 번들; 트랜스바디, 예컨대, 인간 트랜스페린; 테트라넥틴, 예컨대, 단량체 또는 삼량체 인간 C형 렉틴 도메인; 마이크로바디, 예컨대, 트립신-억제제-II; 어필린; 아르마딜로 반복 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항원 결합 단백질은 제2 세포 표적에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 제2 세포 표적은 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질, 바람직하게 CD3, 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질, 특히, 성장 수용체, 특히 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER4), 인슐린 유사 성장 인자 1-수용체 (IGF-1R), 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR, c-MET), 및 그의 유도체, 특히 EGFR 또는 HER2의 세포외 영역으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 3가 또는 4가이다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 특히 Fc 수용체, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 또는 보체계가 결합하는 이펙터 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 감마 수용체, 특히, CD 16, CD32, 및/또는 CD64가 결합하는 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 특히, 보체계의 C1q에의 결합에 의해 보체계를 활성화시키는 도메인이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 2가이다. 달리 명시되지 않는다면, 하기 항원 결합 단백질 실시양태의 배열은 좌측 N-말단에서 우측 C-말단으로 기재된다. 2가 및 이중특이적 항원 결합 단백질이 디아바디인 것인 추가로 바람직하다. 이중특이적 디아바디는 각각이 상이한 항체로부터의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 것인 2개의 쇄를 포함한다. 두 가변 도메인 VH 및 VL은 바람직하게 3 내지 5개의 잔기로 이루어진 짧은 링커에 의해 연결된다.
디아바디는 2개의 쇄 디아바디 (Db) 또는 단일 쇄 디아바디 (scDb)일 수 있다. 2개의 쇄 디아바디인 경우, 2개의 쇄는 배열 VHA-VLB 및 VHB-VLA 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA를 가질 수 있고, 여기서, A 및 B는 2개의 상이한 특이성을 나타낸다. 단일 쇄 디아바디인 경우, 제1 쇄인 VHA-VLB 또는 VLA-VHB, 및 제2 쇄인 VHB-VLA 또는 VLB-VHA는 공유적으로 연결되어 있다. 바람직하게, 제1 및 제2 쇄는 길이가 10 내지 15개의 아미노산 길이인 펩티드 링커에 의해 연결된다. 바람직하게, 이중특이적 디아바디는 scDb이다. 바람직하게, 항원 결합 단백질은 배열 (VHA-VLB-VHB-VLA)scDb를 가진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 12의 또는 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 scFv에, 바람직하게, 하나 또는 2개의 scFv에 연결된, 이중특이적 Db 또는 이중특이적 scDb, 바람직하게, 이중특이적 scDb이다. 2개 이상의 scFv가 일렬로 나란히 연결될 수 있다. scFv는 바람직하게, 약 10 내지 25개의 아미노산의 펩티드 링커로 연결된, 동일한 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. scFv는 배열 VH-VL 또는 VL-VH를 가질 수 있다. 바람직하게, 하나 이상의 scFv는 이중특이적 Db 또는 이중특이적 scDb의 하나의 특이성 또는 그 둘 모두를 가질 수 있다. 따라서, scFv는 바람직하게 배열 VHA-VLA 또는 VLA-VHA를 가지거나, 또는 바람직하게 배열 VHB-VLB 또는 VLB-VHB를 가진다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 scFv는 이중특이적 Db 또는 이중특이적 scDb의 특이성과 상이한 특이성을 가질 수 있다. 따라서, 하나 이상의 scFv는 배열 VHC-VLC 또는 VLC-VHC, 또는 VHD-VLD 또는 VLD-VHD 등을 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 이중특이적 3가 항원 결합 단백질이다. 바람직하게, 항원 결합 단백질은 배열 (VHA-VLB-VHB-VLA)scDb-(VHA-VLA)scFv를 가진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 이중특이적 4가 항원 결합 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 배열 (VHA-VLA)scFv-(VHA-VLB-VHB-VLA)scDb-(VHA-VLA)scFv를 가진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은, 각각이 동종이량체화 도메인으로서의 작용을 하는 Fc 영역에 연결된 것인 2개의 이중특이적 Db 또는 이중특이적 scDb, 바람직하게 이중특이적 scDb로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 배열 (VHA-VLB-VHB-VLA)scDb-Fc의 2개의 모이어티를 포함한다. 2개의 모이어티는 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 또는 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 2개의 모이어티를 포함한다.
이중특이적 항원 결합 단백질의 추가의 바람직한 실시양태에서, 제2 특이성의 추가의 VH 도메인 및 VL 도메인은 각각 경쇄 및 중쇄에 연결되고, 여기서, 중쇄의 Fc 영역이 이량체화 도메인으로서 작용을 한다. 상이한 특이성의 두 VH 도메인 및 두 VL 도메인은 각각 다양한 조합으로 경쇄 및 중쇄에 연결되어 상이한 배열을 생성한다. 항원 결합 단백질의 바람직한 실시양태에서, 경쇄는 배열 VHA-VHB-CLk를 가지고, 중쇄는 배열 VLA-VLB-CH1-CH2-CH3을 가진다. 특정 배열을 통해 VH 및 VL 도메인의 교차 쌍 형성이 이루어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 경쇄는 배열 VHA-VLB-CLk를 가지고, 중쇄는 배열 VHB-VLA-CH1-CH2-CH3을 가진다. 바람직한 실시양태에서, 경쇄는 배열 VLA-VLB-CLk를 가지고, 중쇄는 배열 VHB-VHA-CH1-CH2-CH3을 가진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 31의 쇄 및 서열 번호: 32의 쇄를 포함한다.
각각의 상기 예에서, 문자 "A," "B," "C" 및 "D"는 본 발명의 항원 결합 단백질의 항원 특이성을 나타내는 것이다. 본 발명의 각 항원 결합 단백질 내의 "A," "B," "C" 및 "D" 중 적어도 하나는 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3)의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합한다. 나머지 다른 특이성은 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 바람직한 제2 및 추가의 특이성은 하기에서 개요된다.
이중특이적 항체에 대한 추가 예는 문헌 [Brinkmann U & Kontermann RE, MABS, 2017, 9(2), 182-212]에 기술되어 있고, 이는 구체적으로 본원에 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 다량체화 도메인을 포함한다. 바람직한 예로는 이량체화 도메인, 삼량체화 도메인 또는 사량체화 도메인이 있다. 두 단백질 쇄가 서로에 결합한다면, 각각은 나머지 다른 한 단백질 중의 적어도 하나의 이량체화 도메인에 결합할 수 있는 적어도 하나의 이량체화 도메인을 포함한다. 따라서, 항원 결합 단백질이 3개의 단백질 쇄를 포함한다면, 각각은 각각의 다른 삼량체화 도메인과 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 삼량체화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 IgM (MHD2) 또는 IgE (EHD2)의 중쇄 도메인 2 (CH2), 면역글로불린 Fc 영역, IgG 또는 IgA의 중쇄 도메인 3 (CH3), IgM 또는 IgE의 중쇄 도메인 4 (CH4), Fab, Fab2, 류신 지퍼 모티프, 바르나제-바르스타 이량체, 미니항체, 및 ZIP 미니항체로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 삼량체화 도메인은 테나신 C (TNC), 콜라겐 XVIII의 C-말단 비콜라겐성 도메인 (NC1)의 삼량체화 영역, Fab3 유사 분자, 및 TriBi-미니바디로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 사량체화 도메인은 p53의 사량체화 도메인, 일반 조절 단백질 4 (GCN4)의 사량체화 도메인, VASP (혈관확장제 자극 인단백질)의 사량체화 도메인, 텐덤 디아바디, 및 디-디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이종이량체화 도메인의 사용이 바람직하게, 특히, 항원 특이성이 상이한 두 단백질을 사용하고자 하는 경우에 그러하다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 ADCC 개선된 중쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은
(a) 서열 번호: 2에 따른 아미노산 32-37을 포함하는 CDRH1 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 서열 번호: 2에 따른 아미노산 52-69를 포함하는 CDRH2 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 및 서열 번호: 2에 따른 아미노산 102-112를 포함하는 CDRH3 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 및/또는
(b) 서열 번호: 3에 따른 아미노산 23-33을 포함하는 CDRL1 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 49-55를 포함하는 CDRL2 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 및 서열 번호: 3에 따른 아미노산 88-98을 포함하는 CDR3L 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은
(a) 서열 번호: 2에 따른 아미노산 1-31을 포함하는 FRH1, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 아미노산 38-51을 포함하는 FRH2, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 아미노산 70-101을 포함하는 FRH3, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 및 아미노산 113-123을 포함하는 FRH4, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 및/또는
(b) 서열 번호: 3에 따른 아미노산 1-22를 포함하는 FRL1, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 34-48을 포함하는 FRL2, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 56-87을 포함하는 FRL3, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 및 서열 번호: 3에 따른 아미노산 99-109를 포함하는 FRL4, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은
(a) 서열 번호: 2에 따른 아미노산 32-37로 구성된 CDRH1 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 서열 번호: 2에 따른 아미노산 52-69로 구성된 CDRH2 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 및 서열 번호: 2에 따른 아미노산 102-112로 구성된 CDRH3 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 서열 번호: 2에 따른 아미노산 1-31로 구성된 FRH1, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 아미노산 38-51을 포함하는 FRH2, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 아미노산 70-101을 포함하는 FRH3, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 및 아미노산 113-123을 포함하는 FRH4, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄,
(b) 서열 번호: 3에 따른 아미노산 23-33으로 구성된 CDRL1 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 49-55를 포함하는 CDRL2 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 및 서열 번호: 3에 따른 아미노산 88-98을 포함하는 CDR3L 및 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그의 변이체, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 1-22를 포함하는 FRL1, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 34-48을 포함하는 FRL2, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 56-87을 포함하는 FRL3, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체, 및 서열 번호: 3에 따른 아미노산 99-109를 포함하는 FRL4, 및 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 2에 따른 아미노산 1-123에 따른 중쇄, 또는 서열 번호: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 동일성을 가지는 그의 변이체를 포함하는 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 3에 따른 아미노산 1-109에 따른 경쇄, 또는 서열 번호: 3에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 동일성을 가지는 그의 변이체를 포함하는 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 2에 따른 아미노산 1-123을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 3에 따른 아미노산 1-109를 포함하는 경쇄, 또는 서열 번호: 3에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 동일성을 가지는 그의 변이체를 포함하는 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 4에 따른 아미노산 1-453을 포함하거나, 또는 그로 구성된 중쇄, 또는 서열 번호: 4에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 동일성을 가지는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 5에 따른 아미노산 1-215를 포함하거나, 또는 그로 구성된 경쇄, 또는 서열 번호: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 동일성을 가지는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 4에 따른 아미노산 1-453을 포함하거나, 또는 그로 구성된 중쇄, 또는 서열 번호: 4에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 동일성을 가지는 그의 변이체, 및 서열 번호: 5에 따른 아미노산 1-215를 포함하거나, 또는 그로 구성된 경쇄, 또는 서열 번호: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%의 동일성을 가지는 그의 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 링커, 특히, 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 펩티드 링커의 길이는 5 내지 40개의 아미노산 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 35, 36, 37, 38, 39, 40개의 아미노산), 특히, 5 내지 20개의 아미노산 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 아미노산), 특히, 8 내지 15개의 아미노산 (즉, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 아미노산) 길이이다.
가요성 펩티드 링커가 특히 바람직하다. 가요성 링커는 아미노산 쇄의 회전 또는 벤딩을 방해하는 벌키한 측쇄가 없는 아미노산으로 구성된다. 가요성 링커는 바람직하게 G, S, T, 및 A 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 가요성 링커 펩티드의 아미노산 중 적어도 50%는 G, S, T, 및 A로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 링커의 아미노산 중 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%는 G, S, T, 및 A로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 구성된다. 다수의 펩티드 링커가 당업계에 기술되어 있다 (문헌 [Robinson & Sauer, 1998]; [Volkel et al., 2001]; [Kavoosi et al., 2007]; [Watanabe et al., 2011]). 특정 실시양태에서, 펩티드 링커로는 링커 펩티드 1: GGGGS (서열 번호: 14), 링커 펩티드 2: GGGGSGGGGS (서열 번호: 15), 링커 펩티드 3: GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 16), 링커 펩티드 4: GSLGGSGG (서열 번호: 17), 링커 펩티드 5: GGGSGGGT (서열 번호: 18), 링커 펩티드 6: GGGSGGGTGS (서열 번호: 19), 링커 펩티드 7: GGGSGGGTGSGG (서열 번호: 20), 링커 펩티드 8: GGGGSGGRASGGGGSGGGGS (서열 번호: 21), 링커 펩티드 9: GGGSGGGS (서열 번호: 22), 링커 펩티드 10: EFTRG (서열 번호: 23), 및 링커 펩티드 11: AAA (서열 번호: 24), 또는 그의 다량체, 유도체 및 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 2에 따른 아미노산 1-123에 따른 중쇄, 서열 번호: 3에 따른 아미노산 1-109에 따른 경쇄, 또는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 가지는 그의 변이체 및 펩티드 링커, 특히, 서열 번호: 16에 따른 펩티드 링커를 포함하는 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 가변 도메인의 중쇄와 경쇄 사이에 위치한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 6에 따른 scFv를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 링커 서열이 하나 이상의 펩티드 결합의 분할에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 절단될 수 있는, 하나 이상의 절단 부위, 즉, 하나 이상의 서열 부위를 포함한다. 효소적 절단은 제한 엔도뉴클레아제 (예컨대, 타입 I, 타입 II, 타입 II, 타입 IV 또는 인공 제한 효소) 및 엔도- 또는 엑소-펩티다제 또는 -프로테아제 (예컨대, 세린-프로테아제, 시스테인-프로테아제, 메탈로-프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제)포함하나, 이에 제한되지 않는, 단백질분해 효소에 의해 달성될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 절단 부위는 하나 이상의 엔도펩티다제 절단 부위를 포함하고, 즉, 서열은 엔도펩티다제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 트립신, 펩신, 엘라스타제, 트롬빈, 콜라게나제, 퓨린, 써모리신, 엔도펩티다제 V8, 및/또는 카텝신에 의해 절단되거나, 또는 그에 의해 절단가능하다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 태그를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 태그는 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 에피토프 태그, 및 형광 태그로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 태그는 FLAG-태그 (서열 번호: 25), His-태그 (서열 번호: 26) 및 Myc-태그 (서열 번호: 27)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 리더 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 리더 서열은 박테리아 발현을 위해 PelB 리더 서열 (특히, 서열 번호: 28에 따른 것), 포유동물 세포에서의 발현을 위해 IgK 리더 서열 (특히, 서열 번호: 29에 따른 것) 또는 IL-2 리더 서열 (서열 번호: 30)일 수 있다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 6에 따른 scFv, Myc-태그 및 His-태그를 포함한다. 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 7에 따른 아미노산 23-310을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 6에 따른 scFv, Myc-태그 및 His-태그 및 리더 서열, 특히, PelB, IgGK, 또는 IL-2 리더 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 7에 따른 아미노산 1-310을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프 및 EGFR에 대한 이중특이적 항원 결합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은, 한 항원 결합 부위는 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 대한 것이고, 제2 항원 결합 부위는 EGFR에 대한 것인, 단일 쇄 디아바디이다. 특정 실시양태에서, EGFR에 대한 제2 항원 결합 부위는 EGFR 특이적 인간화 항체 hu225, 즉, 인간화 버전의 C225 (세툭시맙, 얼비툭스(Erbitux))로부터 유래된 것이다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 삼작용성이고, Fc 도메인, 특히, Fc 감마 수용체, 특히, CD16, CD32, 및/또는 CD64에 의해 인식되는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 8의 아미노산 23-738에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 리더 서열, 특히, IgK 리더 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 8의 아미노산 1-738에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프 및 HER2에 대한 이중특이적 항원 결합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은, 한 항원 결합 부위는 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 대한 것이고, 제2 항원 결합 부위는 HER2에 대한 것인, 단일 쇄 디아바디이다. 특정 실시양태에서, 제2 항원 결합 부위는 HER2 특이적 항체 2-35로부터의 것이다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 삼작용성이고, Fc 도메인, 특히, Fc 감마 수용체, 특히, CD16, CD32, 및/또는 CD64에 의해 인식되는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 9의 아미노산 23-744에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 리더 서열, 특히, IgK 리더 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 9의 아미노산 1-744에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프 및 HER2에 대한 이중특이적 항원 결합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은, 한 항원 결합 부위는 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 대한 것이고, 제2 항원 결합 부위는 HER2에 대한 것인, 단일 쇄 디아바디이다. 특정 실시양태에서, HER2에 대한 제2 항원 결합 부위는 HER2 특이적 항체 4D5 (트라스투주맙, 허셉틴(Herceptin))로부터 유래된 것이다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 삼작용성이고, Fc 도메인, 특히, Fc 감마 수용체, 특히, CD16, CD32, 및/또는 CD64에 의해 인식되는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 10의 아미노산 23-477에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 리더 서열, 특히, IgK 리더 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 10의 아미노산 1-477에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 포함하고, 단일 쇄 TRAIL (scTRAIL) 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 scFv 3-43, 특히, 서열 번호: 6에 따른 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 Flag-태그를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 11의 아미노산 23-1020에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 리더 서열, 특히, IgK 리더 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 11의 아미노산 1-1020에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프 및 CD3에 대한 이중특이적 항원 결합 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은, 한 항원 결합 부위는 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 HER3의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 대한 것이고, 제2 항원 결합 부위는 CD3에 대한 것인, 단일 쇄 디아바디이다. 특정 실시양태에서, CD3에 대한 제2 항원 결합 부위는 CD3 특이적 인간화 버전의 UCHT1로부터 유래된 것이다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 His-태그를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 12의 아미노산 23-515에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 리더 서열, 특히, IgK 리더 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 12의 아미노산 1-515에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 scFv 3-43, 특히, 서열 번호: 6에 따른 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 13의 아미노산 23-776 에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 리더 서열, 특히, IgK 리더 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 13의 아미노산 1-776에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 6, 서열 번호: 7의 아미노산 23-310, 서열 번호: 8의 아미노산 23-738, 서열 번호: 9의 아미노산 23-724, 서열 번호: 10의 아미노산 23-744, 서열 번호: 11의 아미노산 23-1020, 서열 번호: 12의 아미노산 23-515, 및 서열 번호: 13의 아미노산 23-776으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 및 서열 번호: 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특히, CDR, 초가변 및 가변 영역의 서열은 HER3에 결합할 수 있는 능력을 상실하지 않으면서 변형될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 본원에서 언급된 영역과 동일하거나, 또는 고도로 상동성일 것이다. "고도로 상동성"이라는 것은 CDR 중에서 1 내지 5개, 바람직하게, 1 내지 4개, 예컨대, 1 내지 3개 또는 1 또는 2개의 치환, 결실, 또는 부가가 이루어질 수 있다는 것으로 고려된다. 추가로, 초가변 및 가변 영역은 본원에 구체적으로 개시된 영역과 실질적인 상동성을 보이도록 변형될 수 있다.
추가로, 본원에 기술된 아미노산 서열, 특히, 인간 중쇄 불변 영역의 것을 서열이 원하는 알로타입, 예컨대, 백인 집단에서 발견되는 알로타입에 맞게 적합하도록 변형시키는 것이 본 발명에 따라 요구될 수 있다.
본 발명은 항체의 기능적 또는 약동학적 특성을 바꾸기 위해 Fc 영역이 변경된 항체를 추가로 포함한다. 상기와 같은 변경을 통해 C1q 결합 및 CDC, 또는 FcγR 결합 및 ADCC가 감소 또는 증가될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역의 아미노산 잔지 중 하나 이상의 것에서 치환이 이루어질 수 있고, 이로써, 변형된 항체와 비교하였을 때, 항원에의 결합 능력은 그대로 유지되면서, 이펙터 기능은 변경될 수 있다 (미국 특허 번호 5,624,821 및 미국 특허 번호 5,648,260 참조).
분자가 무손상 CH2 도메인 또는 무손상 Ig Fc 영역을 포함하지 않도록 Ig 불변 도메인 또는 Ig 유사 불변 도메인의 구제 수용체 에피토프(salvage receptor epitope)를 변형시킴으로써 항체의 생체내 반감기는 개선될 수 있다 (미국 특허 번호 6,121,022 및 미국 특허 번호 6,194,551 참조). 생체내 반감기는 Fc 영역에서 돌연변이화시킴으로써, 예컨대, 252번 위치의 류신을 트레오닌으로 치환함으로써, 254번 위치의 세린을 트레오닌으로 치환함으로써, 256번 위치의 페닐알라닌을 트레오닌으로 치환함으로써 추가로 연장될 수 있다 (미국 특허 번호 6,277,375 참조).
추가로, 항체의 이펙터 기능을 바꾸기 위해 항체의 글리코실화 패턴이 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체는 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화성 증진을 위해 보통은 Fc 영역의 297번 위치의 Asn에 부착되는 푸코스 단위를 첨가하지 않는 트랜스펙토마에서 발현될 수 있고, 이로써, NK 세포의 존재하에서 항체의 ADCC는 증가될 것이다 (문헌 [Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733] 참조). 추가로, CDC를 변형시키기 위해 갈락토실화가 변형될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시양태에서, 변이체는 주어진 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 변이체는 주어진 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 또는 98%의 서열 동일성을 나타낸다.
제3 측면에서, 본 발명은 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 본 발명의 제1 및/또는 제2 측면에 따른 항원 결합 단백질을 포함하고, 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티를 추가로 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티는 화학적 제약 또는 생물학적 제제이다. 실시양태에서, 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티가 생물학적 제제인 경우, 상기 생물학적 제제는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및/또는 핵산 (예컨대, DNA, RNA, 또는 그의 하이브리드)인 것인 바람직하다. 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 제제는 호르몬 (예컨대, 인슐린, hGH, FSH, 글루카곤 유사 펩티드 1, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 루트로핀, 글루카곤); 성장 인자 (예컨대, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, G-CSF/GM-CSF, IGF-1); 사이토카인 (예컨대, TNF, TRAIL, FasL, TGF-β) 예컨대, 인터페론 (예컨대, IFN-α, IFN-β, IFN-γ) 및 인터류킨 (예컨대, IL-2, IL-11, IL-1Ra); 공동자극성 및 면역자극성 리간드 (예컨대, 4-1BBL, CD40L, CD27L, OX40L, GITRL, LIGHT); 응고 인자 (예컨대, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VIIa, 트롬빈); 혈전용해제 및 항응고제 (예컨대, t-PA, 히루딘, 활성화된 단백질 C); 효소 (예컨대, α-글루코시다제, 글루코세레브로시다제, 이두로네이트-2-술파타제, 갈락토시다제, 우레이트 옥시다제, DNase); 항원 결합 분자, 예컨대, 항체 및 항체 단편 (예컨대, IgG, Fab, Fc); 및 그의 융합 단백질 (예컨대, TNFR2-Fc, TMP-Fc, CTLA-4-Fc, IL-1R-Fc, LFA-3-Fc, IL-2-DT)로 구성된 군으로부터 선택된다
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티는 리간드, 이펙터 분자, 반감기 연장 모듈, 및 영상화 분자로 구성된 군으로부터 선택된다
특정 실시양태에서, 리간드는 또 다른 분자와 복합체를 형성하여 특이적인 생물학적 기능을 이행하는 임의의 화학적 또는 생물학적 물질, 예컨대, 기질, 억제제, 및 활성제이다. 특히, 리간드는 항원 결합 분자, 스캐폴드 단백질, 천연 리간드 (예컨대, EGF, VEGF, PDGF, FGF, EPO, TPO, TGF-β, TNF, TRAIL), 리간드 결합 수용체 단편 (예컨대, TNFR1, TNFR2, VEGFR, CTLA-4, LFA-3, BR3, CD95R, IL-1R, FGFR1), 및 압타머 (예컨대, 항-트롬빈, 항-FIXa, 항-C3b, 항-VEGF, 항-CD40L)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 스캐폴드 단백질은 KSR, MEKK1, BCL-10, MAPK, AHNAK-1, HOMER, Pellino, NLRP, DLG1, 스피노필린(Spinophilin), 식물 FLU 조절 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 중요한 신호전달 경로의 조절인자이다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 분자는 항체 단편, Fab 단편 (IgM 또는 IgE로부터의 것 배제), Fab' 단편 (IgM 또는 IgE로부터의 것 배제), 중쇄 항체, 단일 도메인 항체 (sdAb), 중쇄 항체의 가변 도메인, VHH, 나노바디, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 텐덤 scFv, 이중특이적 T 세포 관여 항체 (BITE), 디아바디, 단일 쇄 디아바디, DART 분자, 삼중 바디, 나노항체, 대안적 스캐폴드 단백질 (예컨대, DARPin, 안티칼린, 어피바디 분자, 마이크로바디, 모노바디, 피노머, 애드네틴(Adnetin), 테트라넥틴, 쿠니츠 도메인, 어필린, 아비머), 및 그의 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 항원 결합 분자는 제약상 관련된, 질환, 또는 질환 또는 장애의 증상을 예방, 진단 및/또는 치료하는 데 적합한 항원에 결합하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 질환은 암 유형 질환이다. 바람직하게, 항원 결합 분자는 종양 연관 항원, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, EGFR, HER2, HER4, 암배아 항원 (CEA), 알파태아단백질 (AFP), CA-125, 상피 종양 항원 (ETA), 티로시나제, 흑색종 연관 항원 (MAGE), 및 ras 및 p53의 비정상적인 생성물, 에스트로겐 수용체, 5-알파-리덕타제, 프로스타글란딘-엔도퍼옥시드 신타제 2, VEGFR, 인테그린 수용체 패밀리, 섬유모세포 활성화 단백질, 갈렉틴, EpCAM, CEA, CD44, CD44v, CD2, CD5, CD7, CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD25, CD30, CD33, CD38, CD40, CD52, CD56, CD71, CD72, CD73, CD105, CD117, CD123, 클라우딘, c-Met, PDGFR, IGF1-R, HMW-MAA, TAG-72, GD2, GD3, GM2, 폴레이트 수용체, Ley, MUC-1, MUC-2, PSMA, PSCA 및 uPAR을 인식한다. 바람직한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 IgM 또는 IgE로부터의 Fab 또는 Fc 단편은 아닌 것으로 구상된다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 분자는 scFv, 바람직하게, 항-HER2 scFv 또는 항-EGFR scFv이다.
특정 실시양태에서, 이펙터 분자, 즉, 단백질에 결합함으로써 상기 단백질의 활성을 변경시키는 소분자, 펩티드 또는 폴리펩티드로는 사이토카인, 케모카인, 면역(공동)-자극성 분자, 면역억제성 분자, 사멸 리간드, 아폽토시스 유도 단백질, 효소 (예컨대, 키나제) 프로드럭-전환 효소, RNase, 효능작용 항체 또는 항체 단편, 길항성 항체 또는 항체 단편, 독소, 성장 인자, 호르몬, 응고 인자, 피브린 용해 단백질, 상기의 것을 모방하는 펩티드, 및 그의 단편, 융합 단백질 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 사이토카인은 인터류킨 및/또는 인터페론이다. 인터류킨 (IL)으로는 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨 12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-15, 인터류킨-16, 인터류킨-17, 인터류킨-18, 인터류킨-19, 인터류킨-20, 인터류킨-21, 인터류킨-22, 인터류킨-23, 인터류킨-24, 인터류킨-25, 인터류킨-26 인터류킨-27, 인터류킨-28, 인터류킨-29, 인터류킨-30, 인터류킨-31, 인터류킨-32, 인터류킨-33, 인터류킨-34 및 인터류킨-35를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인터페론 (IFN)으로는 인터페론 타입 I (예컨대, IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω), 인터페론 타입 II (예컨대, IFN-γ), 및 인터페론 타입 III을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 인터페론 A1, 인터페론 A2, 인터페론 A4, 인터페론 A5, 인터페론 A6, 인터페론 A7, 인터페론 A8, 인터페론 A10, 인터페론 A13, 인터페론 A14, 인터페론 A16, 인터페론 A17, 인터페론 A21, 인터페론 B1, TNF, TRAIL, 및 FasL이 포함된다.
특정 실시양태에서, 케모카인으로는 CC 케모카인, CXC 케모카인, C 케모카인, 및 CX3C 케모카인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 케모카인으로는 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, 및 CX3CL1을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 면역-(공동)자극성 단백질로는 B7.1, B7.2, 4-1BBL, LIGHT, ICOSL, GITRL, CD40L, OX40L, 및 CD70을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
면역-억제성 단백질은 IL1-Ra, IL-10, CTLA-4, PD-L1, 및 PD-L2로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 독소는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A, 디프테리아(Diphtheria) 독소 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 아폽토시스 유도 단백질은 Bid, Bik, Puma, 및 Bim, 및 아폽토시스 유발성 사이토카인 (사멸 리간드), 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, TNF, scTNF, TRAIL, scTRAIL, 및 FasL로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 TNF이다. 추가 실시양태에서, 사이토카인은 TRAIL 또는 scTRAIL이다.
특정 실시양태에서, 효소는 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 히드롤라제, 리아제, 이소머라제, 리가제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 키나제로는 AGC 키나제, 예컨대, PKA, PKC 및 PKG, CaM 키나제, 예컨대, 칼슘/칼모듈린 의존적 단백질 키나제 및 세린/트레오닌 단백질 키나제 (예컨대, DAPK2), CK1, 예컨대, 카제인 키나제 1 그룹, CMGC, 예컨대, CDK, MAPK, GSK3 및 CLK 키나제, STE, 예컨대, 효모 스테라일(Sterile) 7, 스테라일 11, 및 스테라일 20 키나제의 동족체, 티로신 키나제 (TK), 키나제의 티로신-키나제 유사 그룹 (TKL), 수용체 연관 티로신 키나제, MAP 키나제, 및 히스티딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
프로드럭-전환 효소는 에스터라제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 아세틸에스터라제, 티올에스테르 히드롤라제, 포스포릭 모노에스테르 히드롤라제, 포스포릭 디에스테르 히드롤라제, 트리포스포릭 모노에스테르 히드롤라제, 술푸릭 에스테르 히드롤라제 (술파타제), 디포스포릭 모노에스테르 히드롤라제, 및 포스포릭 트리에스테르 히드롤라제; 포스파타제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 티로신 특이적 포스파타제, 세린/트레오닌 특이적 포스파타제, 이중 특이성 포스파타제, 히스티딘 포스파타제, 및 지질 포스파타제; 및 리덕타제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 5-알파 리덕타제, 디히드로폴레이트 리덕타제, HMG-CoA 리덕타제, 메테모글로빈 리덕타제, 리보뉴클레오티드 리덕타제, 티오레독신 리덕타제, E. 콜라이 니트로리덕타제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 및 카르복시펩티다제 G2, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 티미딘 키나제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
RNAse로는 엔도리보뉴클레아제, 특히, RNase A, RNase H, RNase I, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V1, 및 RNase V로 구성된 군으로부터 선택되는 것, 및 엑소리보뉴클레아제 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase), RNase PH, RNase II, RNase R, RNase D, RNase T, 올리고리보뉴클레아제 엑소리보뉴클레아제 I, 및 엑소리보뉴클레아제 II를 포함한다.
효능작용 항체 또는 항체 단편은 조직, 기관 또는 개체에서 예컨대, TRAIL 수용체, 항-글루코코르티코이드-유도성 종양 괴사 인자 패밀리 수용체 (GITR), 및 CD40에 대하여 유도되는 것과 같은, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 수용체-신호전달, 유전자 발현, 단백질 합성, 및 단백질 분해와 같은 작용을 유발하는 것을 포함한다. 효능작용 항체 또는 항체 단편은 수용체 분자의 활성 부위 또는 알로스테릭 부위에 결합하여 특이적 반응을 일으킴으로써 작용한다.
길항성 항체 또는 항체 단편은 효능제의 작용을 차단하는 것을 포함한다. 전형적으로, 길항성 항체 또는 항체 단편은 수용체 분자의 활성 부위 또는 알로스테릭 부위에 결합하여 작용하거나, 또는 보통은 수용체, 예컨대, 항-CTLA-4, 항-TNFR1, 항-VEGFR, 항-PDGFR, 항-EGFR, 항-Her2의 활성 조절에 관여하지 않는 독특한 결합 부위와 상호작용한다. 전형적으로, 길항성 항체 또는 항체 단편은 구조적으로 정의된 결합 부위에서 효능제와 경쟁하거나, 또는 보통은 효능제가 그의 결합에 기인하여 유발하게 되는 작용을 유발하지 못하게 하는 방식으로 효능제의 결합 부위를 변경시킨다.
특정 실시양태에서 성장 인자는 아드레노메둘린 (AM), 안지오포이에틴 (Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형성 단백질 (BMP), 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 표피 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자 (GDNF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 성장 분화 인자-9 (GDF9), 간세포 성장 인자 (HGF), 간암 유래 성장 인자 (HDGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 이동 자극 인자 마이오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF) 및 다른 뉴로트로핀, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), Wnt 신호전달 경로, 및 태반 성장 인자 (PlGF)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 응고 인자는 트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII 및 인자 XIII, 및 그의 활성 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 피브린 용해 단백질은 플라스민, 유로키나제, 플라스미노겐, α2-항플라스민, 조직-플라스미노겐 활성인자 (t-PA), 및 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 (PAI-1)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
모방성 펩티드 및 단백질로는 다른 펩티드 또는 단백질, 특히, 본원 상기 또는 하기에서 지명된 펩티드 또는 단백질의 활성을 모방하는 펩티드 및 단백질, 특히 트롬보포이에틴 모방 펩티드, 에리트로포이에틴 모방 펩티드를 포함한다.
추가 실시양태에서, 반감기 연장 모듈은 본 발명의 폴리펩티드의 반감기, 예컨대, "혈장 반감기" 또는 "혈청 반감기"를 변경시키는 화학적 또는 생물학적 물질이다. 특히, 반감기 연장 모듈은 면역글로불린 결합 도메인 (IgBD), 알부민, 알부민 결합 도메인 (ABD), 펩티드, 소분자, 지방산, 항체 단편, 단일 도메인 항체, VHH, 스캐폴드 단백질, 및 장기 순환성 혈장 단백질에 대하여 친화성을 보이는 천연 리간드로 구성된 군으로부터 선택되며, 이들 중 어느 하나의 것은 임의적으로 PEG화된, HES화된, 폴리시아릴화된, N-글리코실화된, O-글리코실화된, 또는 PEG 모방성 폴리펩티드이다. 바람직하게, IgBD는 Ig 분자의 도메인 중 임의의 것에, 즉, Ig 분자의 가변 도메인 VH 또는 VL에, 및/또는 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 CH4 및/또는 CL에 결합할 수 있다. IGBD는 스타필로코쿠스 아우레우스의 단백질 A (SpA), 스트렙토코쿠스(Streptococcus)의 단백질 G (SpG), 펩토스트렙토코쿠스 마그누스(peptostreptococcus magnus)로부터의 단백질 L (PpL), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 단백질 Eib, 스타필로코쿠스(Staphylococcus)로부터의 단백질 Sbi, 및 스트렙토코쿠스의 단백질 MAG, MIG, H, M 및 ZAG로부터 유래된 도메인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
추가 실시양태에서, 영상화 분자는 특이적인 표적 분자에 결합함으로써 상기 표적 분자의 위치가 시각화될 수 있도록 하는 분자이다. 특히, 영상화 분자는 생물발광성 시약, 화학발광성 시약, 형광성 영상화 시약, 광감작제, 킬레이팅 시약, 및 방사성 모이어티으로 구성된 군으로부터 선택된다.
영상화 분자는 생물발광성, 화학발광성 및 형광성 영상화 시약, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 및/또는 메트리디아 론가(Metridia Longa)로부터의 루시페라제, 퍼옥살레이트, 폴리메틴 (예컨대, 시아닌 염료, 예컨대, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7) 수쿠아레인 유도체, 프탈로시아닌, 포르피린 유도체, 및 BODIPY 유사체 (BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TR, BODIPY TMR, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665) 뿐만 아니라, 형광성 단백질 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, GFP, EGPF, CFP, BFP, YFP, DsRED를 포함한다 (문헌 [Chudakov et al. (2010) Physiol. Rev. 90:1103-1163]).
킬레이팅 시약은 킬레이트화에 의해 적어도 하나의 금속 이온, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 칼슘, 마그네슘, 철, 알루미늄, 아연, 구리, 비소, 납, 탈륨 및 수은 이온에 결합할 수 있다. 상기 킬레이팅 시약은 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌디아민 테트라아세트산 (칼슘 디소듐 베르산테) (CaNa2-EDTA), 디메르카프롤 (BAL), 디메르캅토숙신산 (DMSA), 디메르캅토-프로판 술포네이트 (DMPS), 페리틴, 데페록사민 및 데페라시록스, 데페리프론 (1,2-디메틸-3-히드록실-4-피리디논), DOTA, DTPA, DADT, DADS, DO3A, N2S2MAMA, 트리아미드티올, 포스포네이트, 유기 가돌리늄 착체, 페니실라민, 및 테트라사이클린 패밀리의 항생제 약물을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 방사성 모이어티는 방사성핵종을 포함한다. 방사성 모이어티는 F, Br, Mn, Co, Ga, As, Zr, P, C, S, H, I, In, Lu, Cu, Rh, Bi, At, Y, Re, Ac, Tc, 또는 Hg 원자의 동위원소일 수 있다. 방사성 모이어티는 본 발명의 폴리펩티드를 표지하여 예컨대, 인체에서 그가 방사성 방식으로 검출될 수 있도록 함으로써 폴리펩티드가 진단 접근법 (방사성면역검출: RAID)에 유용한 것으로 만들 뿐만 아니라, 치료적 적용 (방사성면역요법: RAIT)에서 적합한 것으로 만든다.
광감작제는 발광이 가능하거나, 또는 특정 파장 광에 의한 여기 이후에 자유 라디칼 및 1중항 산소를 형성할 수 있는 화학 화합물이다. 광감작제는 예컨대, 광역학적 요법을 위해 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 광감작제로는 포르피린 패밀리, 텍사피린 패밀리, 클로린 패밀리 및 프탈로시아닌 패밀리의 화합물를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 특히, HpD, ALA, M-ALA, 베르티포르핀(Vertiporfin), 루텍사피린(Lutexaphyrin), 테모포르핀(Temoporfin), 탈라포르핀(Talaporfin), HPPH, 프탈로시아닌, 및 나프탈로시아닌(Napthalocyanine)을 포함한다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 및/또는 본 발명의 제3 측면의 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 DNA 및/또는 RNA 분자를 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제4 측면의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 및/또는 인공 염색체로 구성된 군으로부터 선택된다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 본 발명의 제3 측면의 융합 단백질, 본 발명의 제4 측면의 핵산, 및/또는 본 발명의 제5 측면의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 HEK293, CHO, BHK, 또는 PerC6 세포이다.
제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 본 발명의 제3 측면의 융합 단백질, 본 발명의 제4 측면의 핵산, 및/또는 본 발명의 제5 측면의 벡터를 포함하고, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제, 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 제7 측면의 조성물은 환자에게로의 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위하여 적합한 양의 담체 및/또는 부형제와 함께, 치료 유효량의 활성 성분, 즉, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 본 발명의 제3 측면의 융합 단백질, 본 발명의 제4 측면의 핵산, 및/또는 본 발명의 제5 측면의 벡터를 바람직하게, 정제된 형태로 함유한다. 제제는 투여 모드에 적합하여야 한다.
제약 조성물은 액제, 현탁제, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 지속 방출형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 제약 조성물은 종래 결합제 및 담체, 예컨대, 트리글리세리드와 함께 좌제로서 제제화될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 제조를 위해, 제약상 허용되는 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태 조성물은 분제, 정제, 환제, 캡슐제, 로젠지, 카세제, 좌제, 및 분산가능한 과립제를 포함한다. 고체 부형제는, 희석제, 향미제, 결합제, 보존제, 정제, 붕해제, 또는 캡슐화 물질로서도 작용할 수 있는, 하나 이상의 물질일 수 있다. 분제에서, 부형제는 바람직하게, 미분된 고체이며, 이는 본 발명의 미분된 억제제와의 혼합물로 존재한다. 정제에서, 활성 성분은 필요한 결합 특성을 가지는 담체와 함께 적합한 비율로 혼합되고, 원하는 형상 및 크기로 압착된다. 적합한 부형제는 탄산마그네슘, 스테아르산 마그네슘, 활석, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이다. 좌제 제조를 위해, 저융점 왁스, 예컨대, 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물을 먼저 용융시키고, 그 안에 활성 성분을 예컨대, 교반시킴으로써 균일하게 분산시킨다. 이어서, 용융된 균질 혼합물을 알맞은 크기의 몰드 내에 붓고, 냉각시킴으로써 고형화시킨다. 정제, 분제, 캡슐제, 환제, 카세제, 및 로젠지가 경구 투여용으로 적합한 고체 투여 형태로서 사용될 수 있다.
액체 형태 조성물은 용액, 현탁액, 및 에멀젼, 예를 들어, 물, 염수 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 용액 또는 물/프로필렌 글리콜 용액을 포함한다. 비경구적 주사 (예컨대, 정맥내, 동맥내, 골내 주입, 근육내, 피하, 복강내, 진피내, 및 경막내 주사)를 위해, 액체 제제는 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 수용액 중의 액제로서 제제화될 수 있다. 제약 조성물이 정맥내로 투여될 때, 염수 용액이 바람직한 담체이다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 단위 투여 형태를 띤다. 상기 형태에서, 조성물은 적절한 정량의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 세분화될 수 있다. 단위 투여 형태는 예컨대, 바이알 또는 앰플 중 패키징된 정제, 캡슐제, 및 분제와 같은, 개별 정량의 조성물을 함유하는 패키지인, 패키징된 조성물일 수 있다. 또한, 단위 투여 형태는 캡슐제, 주사용 바이알, 정제, 카세제, 또는 로젠지 그 자체일 수 있거나, 또는 상기 중 임의의 것으로, 적절한 개수로 이루어진 패키징된 형태의 것일 수 있다.
조성물은 원하는 경우에는 또한 소량의 습윤화제 또는 유화제, 또는 pH 완충화제를 함유할 수 있다.
추가로, 상기 제약 조성물은 또한 다른 약리학상 활성 물질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 애주번트 및/또는 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명과 관련하여 애주번트로는 무기 애주번트, 유기 애주번트, 오일 기재 애주번트, 사이토카인, 미립자 애주번트, 비로좀, 박테리아 애주번트, 합성 애주번트, 또는 합성 폴리뉴클레오티드 애주번트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
제8 측면에서, 본 발명은 의약에서 사용하기 위한, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 본 발명의 제3 측면의 융합 단백질, 본 발명의 제4 측면의 핵산, 본 발명의 제5 측면의 벡터, 또는 본 발명의 제7 측면의 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 의약에서의 사용은 장애 또는 질환의 예방, 치료 또는 진단에서, 특히, 증식성 장애 또는 질환의 예방, 치료 또는 진단에서의 사용이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 본 발명의 제3 측면의 융합 단백질, 본 발명의 제4 측면의 핵산, 본 발명의 제5 측면의 벡터, 또는 본 발명의 제7 측면의 제약 조성물은 종양 성장을 억제시키는 데 또는 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
증식성 장애 또는 장애로는 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌 종양, 유방암, 버킷 림프종, 자궁경부암, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 식도암, 망막모세포종, 위암 (위암), 위장관 기질 종양, 신경교종, 호지킨 림프종, 카포시 육종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 구인두암, 난소암, 췌장암, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 인후암, 갑상선암, 및 요도암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
제9 측면에서, 본 발명은 종양 성장 억제, 또는 암 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 항원 결합 단백질, 본 발명의 제3 측면의 융합 단백질, 본 발명의 제4 측면의 핵산, 본 발명의 제5 측면의 벡터, 또는 본 발명의 제7 측면의 제약을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장을 억제시키거나, 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 임의 측면의 실시에서, 상기 기술된 바와 같은 제약 조성물 또는 결합 모이어티 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편)는 환자에서 충분한 수준의 결합 모이어티를 제공하는, 당업계에 확립된 임의 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 비경구적으로, 경점막으로, 예컨대, 경구적으로, 비강으로, 직장으로, 질내로, 설하로, 점막하로, 경피적으로, 또는 흡입에 의해 이루어진다. 바람직하게, 투여는 비경구적, 예컨대, 정맥내 또는 복강내 주사에 의해 이루어지고, 이는 또한, 동맥내, 근육내, 진피내 및 피하 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 제약 조성물이 국부적으로 투여된다면, 이는 치료하고자 하는 기관 또는 조직 내로, 예컨대, 종양에 의해 이환된 기관 내로 직접 주사될 수 있다.
경구 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 캡슐제 또는 정제로서; 분제 또는 과립제로서; 액제, 시럽제 또는 현탁제로서 (수성 또는 비-수성 액체 중의 것으로서); 식용가능한 폼 또는 휩으로서; 또는 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐제는 락토스, 전분 또는 그의 유도체, 스테아르산 마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐제는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체, 또는 액체 폴리올을 포함할 수 있다. 액제 및 시럽제는 물, 폴리올 및 당을 포함할 수 있다.
경구 투여용으로 의도되는 활성제는 위장관에서의 활성제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질로 코팅되거나, 또는 그와 혼합될 수 있다 (예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있다). 따라서, 활성제의 지속 방출은 수시간에 걸쳐 달성될 수 있고, 필요할 경우, 활성제는 위 내에서 분해되지 못하게 보호될 수 있다. 경구 투여용 제약 조성물은 특정 pH 또는 효소적 조건에 기인하여 특정 위장 위치에서 활성제의 방출을 촉진시키도록 제제화될 수 있다.
경피 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 장시간 동안 수용자의 표피와 밀착 상태 그대로 유지되도록 의도되는 분리 패치로서 제공될 수 있다. 국소 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 연고, 크림, 현탁제, 로션, 분제, 액제, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제공될 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직으로의 국소 투여를 위해, 바람직하게는 국소용 연고 또는 크림이 사용된다. 연고로 제제화되는 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 수-혼화성 연고 기제와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 수중유 기제 또는 유중수 기제를 사용하여 크림으로 제제화될 수 있다. 눈으로의 국소 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 점안제를 포함한다. 상기 조성물에서, 활성 성분은 적합한 담체 중에, 예컨대, 수성 용매 중에 용해되거나, 또는 현탁될 수 있다. 구강에서의 국소 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 로젠지, 향정, 및 구강 세정제를 포함한다.
비강 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 고체 캐리어, 예컨대, 분제 (바람직하게, 입자 크기가 20 내지 500 ㎛ 범위인 분말)을 포함할 수 있다. 분제는 코로 들이쉬는 방식으로, 즉, 코에 가깝게 놓여진 분제 용기로부터 코를 통해 이루어지는 신속한 흡입에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 비강 투여용으로 적합화된 조성물은 액체 캐리어, 예컨대, 비강용 스프레이 또는 비강용 점적제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 활성 성분의 수용액 또는 오일 용액을 포함할 수 있다. 흡입 투여용 조성물은 미리 결정된 투여량으로 활성 성분을 제공할 수 있도록 구축될 수 있는, 가압식 에어로졸, 네뷸라이저 또는 취입기를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 특별히 적합화된 장치로 공급될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비강을 통해 폐로 투여된다.
직장 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 좌제 또는 관장제로서 제공될 수 있다. 질 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 페서리(pessary), 탐폰(tampon), 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분말 제제로 제공될 수 있다.
비경구적 투여용으로 적합화된 제약 조성물은 수성 및 비-수성 멸균 주사용 액제 또는 현탁제를 포함할 수 있으며, 이는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 조성물을 의도되는 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성이 되도록 만드는 용질을 함유할 수 있다. 상기 조성물 중에 존재할 수 있는 다른 성분으로는 예를 들어, 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 비경구적 투여용으로 적합화된 조성물은 단일 투약 또는 다회 투약 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예컨대, 예컨대, 멸균 염수 주사액 첨가만이 요구되는 냉동 건조된 (동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사용 액제 및 현탁제는 멸균 분제, 과립제 및 정제로부터 제조될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 통상의 방법에 따라 인간에게 정맥내 투여하기 위한 용도의 것으로 적합화된 제약 조성물로서 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용의 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 용액이다. 필요할 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증 완화를 위해 예컨대, 리도카인과 같은 국부 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 활성 성분의 정량이 명시되어 있는 기밀하게 밀봉된 용기, 예컨대, 앰플 또는 사쉐 중의 건식 동결건조된 분제 또는 무수 농축물로서 별개로 공급되거나, 단위 투여 형태로 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 이전에 혼합될 수 있도록 멸균 염수 앰플로 제공될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 주화인자 작용의 억제제는 방출 조절형 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 억제제는 정맥내 주입, 이식가능한 삼투 펌프, 경피용 패취, 리포솜 또는 다른 투여 모드를 이용하여 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌 [Sefton (1987) CRC Crit . Ref. Biomed. Eng. 14: 201]; [Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507]; [Saudek et al. (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574] 참조). 또 다른 실시양태에서, 화합물은 소포체, 특히, 리포솜으로 전달될 수 있다 (문헌 [Langer (1990) Science 249:1527-1533]; [Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365]; WO 91/04014; U.S. 4,704,355 참조). 또 다른 실시양태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다 (문헌 [Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.]; [Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61] 참조; 또한 문헌 [Levy et al. (1985) Science 228:190]; [During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351]; [Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105] 참조).
추가의 또 다른 실시양태에서, 방출 조절형 시스템은 치료 표적, 즉, 표적 세포, 조직 또는 기관의 인접부에 배치될 수 있고, 따라서, 오직 전신 용량의 소분량만을 필요로 할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2] 참조). 다른 방출 조절형 시스템은 랭거(Langer)에 의한 리뷰 (문헌 [1990, Science 249: 1527-1533])에서 논의되고 있다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 부위에 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는 예를 들어, 및 제한 없이, 수술 동안 국부 주입에 의해, 예컨대, 수술 후 상처 드레싱과 함께 진행되는 국소 적용에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 막, 예컨대, 실라스틱 막, 또는 섬유와 같은 막을 비롯한, 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질로 이루어진 임플란트에 의해 달성될 수 있다.
바람직한 유효 용량의 선택은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있는 여러 인자들을 고려하여 그에 기초하여 당업자에 의해 결정될 것이다. 상기 인자로는, 제약 조성물의 특정 형태, 예컨대, 폴리펩티드 또는 벡터, 및 전형적으로는 제약 화합물에 대한 규제 승인을 받는 데 사용되는 통상의 개발 절차 동안에 확립되게 되는, 그의 약동학적 파라미터, 예컨대, 생체이용률, 대사, 반감기 등을 포함한다. 용량 고려시 추가 인자로는 예방 및/또는 치료하고자 하는 병태 또는 질환, 또는 정상적인 개체에서 달성하고자 하는 이익, 환자의 신체 질량, 투여 경로, 투여가 급성인지 또는 만성인지 여부, 공동 약물, 및 투여되는 제약 제제의 효능에 영향을 주는 것으로 널리 알려져 있는 다른 인자를 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라, 예컨대, 개별 환자의 병태 및 면역 상태에 의존하여, 및 표준 임상적 기술에 따라 결정되어야 한다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이며, 어느 방식으로든, 첨부된 특허청구범위에 의해 명시되는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 항- HER3 항체 3-43의 결합 및 에피토프 특이성
진핵성 발현을 위해 최적화된 3-43 가변 도메인 서열을 포함하는 완전한 인간 IgG1 분자 (IgG 3-43)를 클로닝하고, 현탁 배양 적합화된 HEK 293-6E 세포에서 발현시켰다. 일시적으로 형질감염된 세포의 상청액으로부터 단백질을 단백질-A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. SDS-PAGE 분석 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단백질의 무결성을 확인하였다. 정제된 IgG 3-43의 SDS-PAGE 분석 결과, 비환원 조건하에서 무손상 IgG의 분자 질량 (대략 150 kDa)을 가지는 단일 밴드, 및 비환원 조건하에서 중쇄 (50 kDa) 및 경쇄 (25 kDa)에 상응하는 2개의 밴드가 나타났다 (도 1a). 크기 배제 크로마토그래피를 통해 IgG 3-43의 순도를 확인하였다 (도 1b). 인간 HER3의 세포외 도메인 (aa 27-599)을 포함하는 고정화된 HER3-Fc 융합물을 이용하여 ELISA로 IgG 3-43의 항원 결합을 분석하였다. HER3-Fc 융합 단백질을 PBS 중 3 ㎍/ml로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중 IgG 3-43의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. IgG 3-43은 HER3에 대하여 특이적인, 농도 의존적 결합을 보였고, 여기서, EC50 값은 나노몰 이하의 범위 (0.4 ± 0.2 nM)를 나타내었다 (도 1c). 아타나 200 세포 장치를 이용하여 수정 진동자 미량저울 측정을 통해 단량체 수용체 HER3에 대한 IgG 3-43의 친화도를 측정하였다. IgG 3-43을 약 90 Hz의 빈도 변화를 일으키는 밀도로 아민 커플링에 의해 낮은 비특이적인 결합 카르복실 칩의 표면 상에 고정화시켰다. 25℃에서 유속 25 ㎕/min의 PBST (0.1% 트윈(Tween)) (pH 7.4)를 이용하여 측정을 수행하였다. 15 sec 동안 3 M MgCl2를 이용하여 2회에 걸쳐 결합 재생을 수행하였다. 매 2차 측정 후에는 완충제 주사를 수행하여 기준선을 측정한 후, 이어서, 이웃 측정으로부터 감산하였다. 가용성 His-태그부착된 HER3을 2.5 내지 20 nM 농도로 무작위 순으로 PBST 중 2배 희석된 희석액 시리즈로 주사하였다 (도 1d). Kd 값은 11 nM인 것으로 측정되었다 (하기 표 1).
실시예 2: 항- HER3 항체 3-43의 에피토프 맵핑 및 교차 반응성
항체의 에피토프의 위치를 알아내기 위해, 전장 (aa 20-643) 및 말단절단된 형태의 인간 HER3 세포외 도메인 (DII-DIV aa 208-643, DIII-DIV aa 329-643, DIV aa 532-643)을 클로닝하고, 형질감염된 HEK293 세포에서 Fc 융합 단백질로서 제조하였다. 비환원 및 환원 조건하에서 단백질-A 크로마토그래피-정제된 융합 단백질의 SDS-PAGE를 통해 융합 단백질의 정확한 크기 및 이량체 어셈블리를 확인하였다. ELISA 및 면역블롯팅 실험에서 비환원 조건하에서 상이한 도메인-결실된 HER3 융합 단백질에의 IgG 3-43의 결합 능력을 사정하였다 (도 2a에 요약). ELISA를 위해, HER3-Fc 융합 단백질을 PBS 중 10 ㎍/ml로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중 IgG 3-43의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. 전장의 HER3-Fc 융합 단백질 (aa 20-643) 뿐만 아니라, DII-DIV (aa 208-643) Fc 및 DIII-DIV (aa 329-643) Fc 융합 단백질에 대해서는 결합이 검출되었지만, DIV-Fc (aa 532-643) 경우에는 검출되지 않았다. 이러한 관찰 결과는 IgG 3-43의 에피토프는 HER3의 도메인 III에 있다는 것을 시사하는 것이다. DIII의 일부 및 전체 DIV를 포함하는 단편 (aa 359-643, 395-643, aa 458-643)은 어떤 결합도 보이지 않았으며, 이는 항체 결합을 위해서는 전체 DIII 도메인이 요구된다는 것을 시사하는 것이다. 놀랍게도, DI-DIII (aa 20-531; DIV 결여) 또는 DI-DII 및 DIII의 짧은 일부분 (aa 20-358)을 함유하는 Fc 융합 단백질을 시험하였을 때, 어떤 결합도 관찰되지 않았다. 이러한 관찰 결과는 항체 결합을 위해서는 DIV 역시 요구된다는 것을 시사하는 것이다. DI-III + DIV의 일부 (aa 20-587, 20-550)를 포함하는 단편 시험 결과, 3-43이 20-587에는 결합하였지만, 20-550에는 결합하지 않는 것으로 나타났고, 이는 에피토프가 적어도 aa 328-587에 있으며, 그를 필요로 한다는 것을 시사하는 것이다. 이는 ELISA에서 결합을 보인, aa 329-587로 구성된 단편을 사용함으로써 확인되었다. 그에 반해, aa 359-587 또는 aa 329-550으로 구성된 단편은 어떤 결합도 보이지 않았으며, 이로써, 에피토프는 aa 329-587에 있으며, 그를 필요로 한다는 것을 확인할 수 있었다.
IgG 3-43은 면역블롯팅 실험에서 변성 및 환원된 HER3-Fc 융합 단백질을 검출하지 못한 반면, 변성되었지만, 비환원된 단편에서는 결합이 관찰되었으며, 이는 IgG 3-43에 대한 에피토프가 환원에 대해 감수성이라는 것, 즉, 이황화 결합에 의해 안정화된다는 것을 시사하는 것이다. 추가로, 본 발명자들은 ELISA로 인간 및 마우스 HER3-Fc 융합 단백질에의 결합에 대해 분석하였다 (도 2b). 두 HER3-Fc 융합 단백질 모두에 대해 결합이 검출되었으며, 이는 IgG 3-43이 HER3과 교차 반응성을 가지며, 따라서, IgG 3-43의 에피토프가 상기 두 종에서 보존된다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 3: 항- HER3 항체 3-43의 HER3 발현 종양 세포주에의 결합
HER3 발현 MCF-7, FaDu, BT474, A431, NCI-N87, 및 A549 세포를 이용하여 유세포 분석법 연구를 수행하였다 (도 3). 세포를 37℃에서 간단히 트립신으로 처리하였다. FCS 함유 배지로 트립신을 ??칭하고, 원심분리에 의해 제거하고, 프로브당 200,000개의 세포를 시딩하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 적어도 1시간 동안 다양한 농도의 IgG 3-43과 함께 인큐베이션시켰다. PBA (1 x PBS 중 2% (v/v) FCS, 0.02% (w/v) NaN3)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 결합된 항체 분자를 시각화하기 위해 마우스로부터의 PE-표지된 항-인간 Fc 항체를 추가로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 2회에 걸친 추가의 세척 단계 후, MACS콴트® 아날라이저 10(MACSQuant® Analyzer 10)을 이용하여 형광을 측정하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 비염색된 세포 대비 중간 형광 강도를 계산하였다. 본 실험 결과, IgG 3-43이 놀랍게도 26 내지 74 pM 범위의 낮은 EC50 값으로 세포 수용체에 결합하는 것으로 입증되었다.
실시예 4: IgG 3-43이 헤레굴린 리간드 결합을 억제시킨다 .
재조합 his-태그부착된 인간 HRG-β1을 MCF-7 세포와 함께 인큐베이션시키고, 결합된 단백질을 PE 접합된 항-his 항체를 이용하여 검출하였다. 과량의 IgG 3-43 (3 μM)과 미리 인큐베이션시킨 결과, 세포의 형광 강도는 크게 감소되었는데, 이는 HRG 결합이 차단되었음을 시사하는 것이며, 반면, 음성 대조군으로서 세툭시맙과 미리 인큐베이션시켰을 때에는 동일한 효과를 보이지 않았다 (도 4).
실시예 5: 항- HER3 항체 3-43에 의한 헤레굴린 유도된 HER3 인산화 및 신호 전달의 억제
IgG 3-43을 HRG 유도성 HER3 인산화를 막는 그의 능력에 대해 추가로 분석하였다. 반-전면생장 세포를 1시간 동안 IgG 3-43과 함께 인큐베이션시킨 후, HRG (50 ng/ml)로 15분 동안 자극시켰다. 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석 결과, 상이한 세포주에서 (MCF-7, BT-474, NCI-N87, A431, A549, FaDu) HER3 인산화의 효율적인 차단 뿐만 아니라, HRG 유도성 Erk 및 Akt 인산화 억제도 나타났다 (도 5). IgG 3-43 적정 결과, 추가로 HRG 유도성 HER3 인산화의 추단을 위한 IC50 값은 낮은 피코몰 범위인 것으로 나타났다. 퓨전 솔로 S(Fusion Solo S) 소프트웨어 (빌버(Vilber))로 밴드의 밀도를 분석하였고, 튜뷸린 로딩 대조군에 대한 상대적인 값을 사용하여 IC50 값을 계산하였다. MCF-7 세포의 경우, IC50 값은 80 pM인 것으로 측정하였다. MCF-7 세포 상에서 세리반투맙과 동일한 가변 도메인을 포함하는 항-HER3 IgG 3M6과 비교하였을 때, IgG 3-43의 활성이 더 우수하다는 것이 입증되었다. 여기서, 3M6은 270 pM인 IC50 값으로 HER3 인산화를 억제시켰다.
실시예 6: 항- HER3 IgG 3-43에 의해 유도된 HER3 내재화
IgG 3-43의 인큐베이션 이후, 세포 HER3 발현 수준 및 IgG 국재화를 각각 웨스턴 블롯 및 면역 형광 현미경검사법에 의해 분석하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, MCF-7 세포를 2일 전 6 웰 플레이트에 시딩하여 실험 당일 반 전면생장 상태가 되도록 만들었다. 세포를 하룻밤 동안 혈청 결핍하에 놓고, 명시된 시점 동안 100 nM IgG 3-43과 함께 인큐베이션시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 HER3 수준을 분석하였다. 퓨전 솔로 S 소프트웨어 (빌버)로 밴드의 밀도를 분석하였다. 튜뷸린 로딩 대조군 대비로 비교하여 로딩차에 대해 값을 보정하고, 비처리된 프로브의 상대적인 값에 대해 정규화하였다. IgG 3-43은 MCF-7 세포에서 HER3 수준을 빠르게 감소시킨다 (도 6). 추가로, 공초점 현미경검사법에 의해 제시된 바와 같이, Cy5-표지된 IgG 3-43은 MCF-7 세포 빠르게 내재화되었다 (제시되지 않음). 1시간 후, IgG 3-43의 강력한 세포내 축적이 검출가능하였다.
실시예 7: 항- HER3 IgG 3-43에 의한 세포 증식 억제
IgG 3-43을 시험관내에서 종양 세포 증식을 감소시킬 수 있는 그의 능력에 관하여 추가로 평가하였다. 상기 효과를 모니터링하기 위해, 각종의 인간 암 세포주 (MCF-7, BT-474, NCI-N87, FaDu)를 96 웰 플레이트에 저밀도로 시딩하고, 부착되도록 하룻밤 동안 방치한 후, 이어서, 저혈청 농도하에서 IgG 3-43 또는 대조군으로서 다른 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 1주 경과 후, 증식을 측정하였다. 4개의 세포주 모두, 대조군 항체와 비교하였을 때, 증식이 감소된 것이 관찰되었다 (도 7). FaDu의 경우, 상기 조건하에서 IC50 값이 273 pM인 것으로 측정되었다.
실시예 8: IgG 3-43이 SCID 마우스에서 s.c. 이종이식편 FaDu 종양의 성장을 효율적으로 억제시킨다.
SCID 마우스의 피하 FaDu 이종이식편 모델에서 IgG 3-43의 항종양 활성을 시험하였다. 5x106개의 세포를 마우스의 양측 옆구리 모두에 주사하고, 종양 부피가 대략 80 ㎣에 도달하였을 때 (종양 세포 접종 후 14일째), 처리를 시작하였다. 마우스는 음성 대조군으로서 PBS를 포함하여, 30, 100, 및 300 ㎍ 용량으로 3주 동안 주 2회에 걸쳐 정맥내 주사를 받았다. IgG 3-43의 3개의 투약 요법 모두에 대해, 생존율 증가 (2개의 더 높은 고농도의 경우에만 중간 생존율 증가) 및 유의적인 종양 성장 억제와 같은 항종양 효과가 관찰되었다 (도 8).
실시예 9: EGFR 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 단일 쇄 디아바디 - Fc 융합 단백질이 EGFR 및 HER3 활성화의 강력한 억제를 유도한다
본 발명자들은 hu225 (인간화 버전의 C225 (세툭시맙, 얼비툭스)) 및 3-43의 항체 모이어티를 포함하는, 단일 쇄 디아바디-Fc 포맷의, EGFR 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 항체 (도 9a, c)를 생성하였다. scDb-Fc 융합 단백질을 HEK293-6E 현탁 세포에서 제조하고, 단백질 A 친화성 정제에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. scDb hu225x3-43-Fc의 SDS-PAGE 분석 결과, 구축물의 단량체 및 이량체 어셈블리에 상응하는, 환원 조건하에 겉보기 분자 질량 대략 82 kDa에서 및 비환원 조건하에 200 kDa에서 단일 밴드가 나타났다 (도 9b). 그에 반해, 세툭시맙 및 IgG 3-43은 환원 조건하에서 중쇄 및 경쇄를 나타내는 2개의 밴드를 보였다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순도를 확인하였다 (도 9c). scDb-Fc의 그의 항원에의, 및 ErbB 수용체 발현 세포에의 결합 활성을 각각 ELISA 및 유세포 분석법에 의해 사정하였다. ELISA 분석 결과, EGFR 및 HER3의 세포외 도메인 (ECD)에의 모체 항체의 결합 활성은 scDb-Fc 포맷에서 유지되는 것으로 밝혀졌다 (도 10a 참조). scDb-Fc 분자 및 모체 항체는 그의 상응하는 항원에 나노몰 이하 범위의 유사한 EC50 값으로 결합하였다 (하기 표 3). 유세포 분석법 분석 결과, 세툭시맙 및 scDb hu225x3-43-Fc는 0.2 nM의 EC50 값으로 FaDu 세포에 결합한 반면, IgG 3-43은 0.006 nM의 EC50 값으로 결합하였다 (도 10b).
이어서, MCF-7 세포에서의 신호전달 억제 검정법을 수행하여 수용체 활성화가 scDb hu225x3-43-Fc를 이용하는 처리에 의해 억제되는지 여부를 측정하였다 (도 11). 헤레굴린은 HER3 인산화 및 하류 이펙터 Akt 및 Erk1/2의 활성화를 유도하였다. IgG 3-43, 및 IgG 3-43과 세툭시맙의 조합으로 전처리하였을 때, HER3 인산화, 및 Akt 및 Erk1/2의 활성화는 효율적으로 차단되었고, HER3은 분해되었다. scDb hu225x3-43-Fc로 처리하였을 때에도 역시 HER3 신호전달은 강력하게 억제되었고, 그 결과, HER3은 분해되었다. 다른 ErbB 과다발현 세포주 (A-431, A549, FaDu, NCI-N87, SK-BR-3)에서도 또한 신호전달 억제 검정법을 수행하였고, EGF로 자극받은 EGFR의 억제를 추가로 평가하였다 (도 12a-f). 이중특이적 scDb hu225x3-43-Fc 뿐만 아니라, 세툭시맙과 IgG 3-43의 조합도 모든 세포주에서 EGF 존재하에서의 EGFR의 인산화 및 헤레굴린 존재하에서의 HER3의 인산화, 둘 모두를 억제시켰다. HER3 신호전달 억제에서의 scDb-Fc와 모체 항체 사이의 가능한 차이를 추가로 조사하기 위해, FaDu 세포에서 헤레굴린 존재하에서 항체의 일련의 희석액을 이용하여 신호전달 억제 검정법을 수행하였다 (도 13 참조). scDb-Fc는 0.008 nM인 IC50 값으로 HER3 인산화를 억제시킨 반면, IgG 3-43과 세툭시맙의 조합은 0.081 nM인 IC50 값으로 HER3 인산화를 차단시켰으며, 이는 단일특이적 모체 항체의 조합과 비교하였을 때, 이중특이적 항체가 HER3 인산화에 대하여 우수한 억제 활성을 가진다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 10: 2 -35 및 3-43으로부터 유래된 , HER2 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 단일 쇄 디아바디 - Fc 융합 단백질
본 발명자들은 항체 2-35 및 3-43의 항체 모이어티를 함유하는, 단일 쇄 디아바디-Fc 포맷의, HER2 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 항체를 구축하였다. 2-35 모이어티 또한 파지 디스플레이에 의해 확인하였고, 이는 HER2의 세포외 도메인에 특이적인 것이다. scDb-Fc 융합 단백질을 HEK293-6E 현탁 세포에서 제조하고, 단백질 A 친화성 정제에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. scDb 2-35x3-43-Fc의 SDS-PAGE 분석 결과, 환원 조건하에 겉보기 분자량 약 82 kDa에서 및 비환원 조건하에 겉보기 분자량 200 kDa에서 단일 밴드가 나타났다 (도 14a 참조). 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순도를 확인하였다 (도 14b 참조). 모체 항체 IgG 2-35 및 IgG 3-43에의 결합과의 비교로 scDb-Fc의 HER2 및 HER3의 세포외 도메인에의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. ELISA 분석 결과, HER2 및 HER3의 ECD 단백질에의 모체 항체의 결합 활성은 scDb-Fc 포맷에서 유지되는 것으로 밝혀졌다 (도 15 참조). scDb 2-35x3-43-Fc 및 IgG 2-35는 대략 1.5 nM의 EC50 값으로 HER2-ECD에 결합한 반면, 이중특이적 항체는 0.24 nM의 EC50 값으로 결합하였고, IgG 3-43은 0.33 nM의 EC50 값으로 HER3-ECD에 결합하였다. MCF-7 세포에서의 신호전달 억제 검정법 결과, IgG 2-35는 가능하게는 HER2와의 HER3 이종이량체화 억제에 기인하여 HER3 인산화를 약간만 감소시키는 것으로 나타났다 (도 11 참조). 이중특이적 항체 포맷으로의 2-35 및 3-43 모이어티의 조합은 HER3 신호전달을 강력하게 억제시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 scDb 2-35x3-43-Fc가 보상성 신호전달 축을 차단하기 위한, 따라서, 종양 회피를 방지하기 위한 추가 후보물질이 될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 11: 항- HER3 scTRAIL 융합 단백질이 표적 의존적 세포독성을 매개한다
TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드 (TRAIL)는 암 세포에 대한 그의 선택적 독성에 기인하여 유망한 이펙터 분자인 것으로 간주된다. 단일 쇄 버전의 TRAIL을 인간 IgG1 Fc 파트의 C-말단에 융합시켜 (Fc-scTRAIL) 이량체 어셈블리를 유도하였고, 이는 항종양 효과를 크게 증가시킨다. 생체활성을 추가로 개선시키기 위해, scFv 3-43을 Fc 파트 N-말단에 융합시켜 scFv3-43-Fc-scTRAIL을 생성하였다. 융합 단백질을 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 제조하고, 항-FLAG 친화성 크로마토그래피를 통해 상청액으로부터 정제하였다. SDS-PAGE 분석 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단백질의 순도 및 무결성을 확인하였다 (도 16 참조).
무손상 Colo205 및 HCT-116 세포를 사용하여 ELISA에 의해 뿐만 아니라, 유세포 분석법에 의해 새로운 scFv3-43-Fc-scTRAIL 융합 단백질을 상응하는 표적 항원 및 인간 TRAIL-R2에 결합할 수 있는 그의 능력에 관하여 평가하였다. 항원 및 TRAIL-수용체 결합을 상응하는 세포외 도메인의 Fc 융합 단백질을 이용하여 ELISA로 분석하였다. ScFv3-43-Fc-scTRAIL은 HER3에 대하여 특이적인, 농도 의존적 결합을 보였고, 여기서, EC50 값은 나노몰 이하의 범위를 나타내었다 (도 17a, 하기 표 4 참조). 추가 ELISA 연구 결과, 2.84 nM인 EC50 값으로 인간 TRAIL-R2에 강력하게 결합하는 것으로 나타났다 도 M2b, 표 M1 참조). 따라서, scFv3-43에의 융합이 TRAIL-R2 결합을 방해하지 않는다. 항원 및 TRAIL 수용체 발현 Colo205 및 HCT-116 세포를 이용하여 유세포 분석법 연구를 수행함으로써 ELISA 결과를 확인하였다 (도 17c, d 참조). 상기 데이터는 scFv3-43-Fc-scTRAIL이 정제되고, 세포 표면에서 발현된 HER3 및 TRAIL-R2에의 결합에 관하여 완전한 관능성을 가진다는 것을 보여준다.
scFv3-43-Fc-scTRAIL의 세포 사멸 유도를 Colo205 세포를 사용하여 분석하고, 비표적화된 Fc-scTRAIL과 비교하였다. 처리 하루 전, 50,000개의 Colo205 세포/웰을 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 30 min 동안 감작제 보르테조밉 (650 nM) 또는 배지로 세포를 전처리한 후, 세포를 16 h 동안 융합 단백질의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세포 사멸을 크리스털 바이올렛 염색체 의해 분석하였다. ScFv3-43-Fc-scTRAIL 결과, Colo205 상에서 세포 사멸이 강력하게 유도된 것으로 나타났고, 이는 보르테조밉의 존재하에서 추가로 증진될 수 있다 (도 18 참조). 비표적화된 Fc-scTRAIL과 비교해 본 결과, 보르테조밉의 부재 및 존재하에서 scFv3-43-Fc-scTRAIL의 효과가 더 우수한 것으로 나타났다 (도 18, 하기 표 5 참조). 이러한 우수성은 모이어티를 표적화하는 scFv3-43에 의해 유발되는지를 확인하기 위해, 상응하는 차단 항체 scFv3-43-Fc (200배 몰 과량)를 전처리 세포에 첨가하면서 실험을 반복하였다. 차단 항체의 존재하에서, scFv3-43-Fc-scTRAIL의 효과는 비표적화된 Fc-scTRAIL의 효과 수준으로까지 감소하였다 (도 18, 하기 표 5 참조). 이를 통해 항종양 효과를 개선시키기 위한, 세포독성 융합 단백질의 표적화를 위한 3-43 항체 모이어티의 적합성을 확인할 수 있었다.
실시예 12: T 세포 재표적화를 위한 항- HER3 x 항-CD3 이중특이적 항체
항-HER3 3-43의 결합 부위를 인간화 버전의 항-인간 CD3 항체 UCHT1과 조합함으로써 이중특이적 scDb 분자를 생성하였다. 따라서, scDb 3-43xCD3은 HER3에 대해 하나의 결합 부위 및 CD3에 대해 하나의 결합 부위를 나타낸다 (도 19a 및 b). scDb 3-43xCD3을 HEK293 세포에서 제조하고, IMAC에 의해 정제하였다. scDb 3-43xCD3의 SDS-PAGE 분석 결과, 환원 조건하에 겉보기 분자 질량 대략 55 kDa에서 및 비환원 조건하에 50 kDa에서 단일 밴드가 나타났다 (도 19c). 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단백질의 순도 및 무결성을 확인하였고, 여기서, 겉보기 분자 질량은 대략 50 kDa이었다 (유체역학적 반경: 2.96 nm) (도 19d).
ELISA 및 유세포 분석법에 의해 신규 scDb 구축물의 결합을 평가하였다.
인간 HER3의 세포외 도메인 (aa 27-599)을 포함하는 고정화된 HER3-Fc 융합물을 이용하여 ELISA로 scDb 3-43xCD3의 항원 결합을 분석하였다. HER3-Fc 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중 scDb 3-43xCD3의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-His 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. ScDb 3-43xCD3은 HER3에 대하여 특이적인, 농도 의존적 결합을 보였고, 여기서, EC50 값은 더 낮은 나노몰 범위를 나타내었다 (도 19e).
HER3 발현 MCF-7 (도 19f) 및 CD3 발현 주르카트 (도 19g)를 이용하여 유세포 분석법 연구를 수행하였다. 부착성 MCF-7의 경우, 세포를 37℃에서 간단히 트립신으로 처리하고, FCS 함유 배지로 트립신을 ??칭하고, 원심분리에 의해 제거하였다. MCF-7 및 주르카트, 둘 모두, 웰당 100,000개의 세포를 시딩하고, 4℃에서 1시간 동안 PBA (1 x PBS 중 2% (v/v) FCS, 0.02% (w/v) NaN3) 중 적정된 scDb 3-43xCD3과 함께 인큐베이션시켰다. PBA로 2회에 걸쳐 세척하였다. 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션된 PE-접합된 항-His 항체를 이용하여 결합된 단백질을 검출하였다. 세척 후, MACS콴트® 아날라이저 10을 이용하여 형광을 측정하였다. MACS콴트® 소프트웨어를 이용하여 (비염색된 세포 대비) 상대적인 중간 형광 강도를 계산하였다. 두 항원 결합 부위 모두에 대하여 더 낮은 나노몰 범위의 유사한 결합 활성이 관찰되었으며, 여기서, EC50 값은 MCF-7의 경우, 1.1 nM이고, 주르카트의 경우, 3.1 nM이었다 (도 19f 및 g).
HER3 발현 Colo205 세포 및 PBMC를 사용하여 IL-2 방출 검정법으로 T 세포의 활성화를 분석하였다. 처리 하루 전, 웰당 20,000개의 Colo205 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 배지를 제거하고, 신선한 배지 중의 적정된 scDb 3-43xCD3으로 치환하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 웰당 200,000개의 PBMC를 첨가하고, 37℃에서 추가의 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 수집하고, 제조사에 의해 공급받은 사용 설명서에 따라 ELISA (인간 IL-2 키트, R&D)에 의해 IL-2의 농도를 측정하였다. ScDb 3-43xCD3은 0.3 nM인 EC50 값의 나노몰 이하의 범위로 IL-2를 용량에 의존하는 방식으로 방출 (T 세포의 활성화)하는 것으로 나타났다 (도 19h).
실시예 13: T 세포 재표적화를 위한 3가, 이중특이적 항-HER3 x 항-CD3 이중특이적 항체
HER3 (3-43)에 특이적인 scDb 분자 및 CD3 (인간화 버전의 UCHT1)을 항-HER3 특이적 scFv (3-43)와 조합함으로써 3가, 이중특이적 scDb3-43xCD3-scFv343 (scDb-scFv) 분자를 생성하였다. 따라서, the scDb-scFv는 HER3에 대해 2개의 결합 부위 및 CD3에 대해 하나의 결합 부위를 나타낸다 (도 20a). scDb-scFv를 HEK293E 세포에서 제조하고, IMAC에 의해 정제하였다. scDb-scFv의 SDS-PAGE 분석 결과, 환원 조건하에 겉보기 분자 질량 대략 80 kDa에서 및 비환원 조건하에 75 kDa에서 단일 밴드가 나타났다 (도 20b). 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단백질의 순도 및 무결성을 확인하였고, 여기서, 겉보기 분자 질량은 대략 62 kDa이었다 (유체역학적 반경: 3.83 nm) (도 20c).
인간 HER3의 세포외 도메인 (aa 27-599)을 포함하는 고정화된 HER3-Fc 융합물을 이용하여 ELISA로 scDb-scFv의 항원 결합을 분석하였다. HER3-Fc 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중 scDb-scFv의 일련의 희석액 및 대조군으로서의 2가 및 이중특이적 scDb3-43xCD3의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-His 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. ScDb-scFv는 나노몰 이하 범위의 EC50 값 (0.81 nM)으로 HER3에 대하여 특이적인, 농도 의존적 결합을 보인 반면, scDb3-43xCD3은 더 낮은 나노몰 범위의 EC50 값 (4.87 nM)을 보였다 (도 20d).
HER3 발현 MCF-7 (도 20e) 및 CD3 발현 주르카트 (도 20f)를 이용하여 유세포 분석법 연구를 수행하였다. 부착성 MCF-7의 경우, 세포를 37℃에서 간단히 트립신으로 처리하고, FCS 함유 배지로 트립신을 ??칭하고, 원심분리에 의해 제거하였다. MCF-7 및 주르카트, 둘 모두, 웰당 100,000개의 세포를 시딩하고, 4℃에서 1시간 동안 PBA (1 x PBS 중 2% (v/v) FCS, 0.02% (w/v) NaN3) 중 적정된 scDb-scFv와 함께 인큐베이션시켰다. PBA로 2회에 걸쳐 세척하였다. 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션된 PE-접합된 항-His 항체를 이용하여 결합된 단백질을 검출하였다. 세척 후, MACS콴트® 아날라이저 10을 이용하여 형광을 측정하였다. MACS콴트® 소프트웨어를 이용하여 (비염색된 세포 대비) 상대적인 중간 형광 강도를 계산하였다. MCF-7 세포에의 결합은 전체 IgG3-43 분자의 결합 특성에 필적할 정도로, EC50 값은 피코몰 범위의 31.6 pM인 것으로 관찰되었고, 주르카트 세포에의 결합은 EC50 값이 나노몰 범위의 13.2 nM인 것으로 관찰되었다 (도 20e 및 f).
실시예 14: 항체 4D5 및 3-43으로부터 유래된 , HER2 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 단일 쇄 디아바디 - Fc 융합 단백질
본 발명자들은 4D5 (트라스투주맙, 허셉틴) 및 3-43의 항체 모이어티를 함유하는, 단일 쇄 디아바디-Fc 포맷의, HER2 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 항체 (도 21)를 생성하였다. scDb-Fc 융합 단백질을 HEK293-6E 현탁 세포에서 제조하고, 단백질 A 친화성 정제에 의해 및 FPLC SEC에 따라 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. scDb 4D5x3-43-Fc의 SDS-PAGE 분석 결과, 구축물의 단량체 및 이량체 폴리펩티드 쇄에 상응하는, 환원 조건하에 겉보기 분자 질량 대략 85 kDa에서 및 비환원 조건하에 200 kDa에서 단일 밴드가 나타났다 (도 21a). 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순도 및 무결성을 확인하였고, 여기서, 겉보기 분자 질량은 대략 175 kDa이었다 (도 21b). 인간 HER2 또는 HER3의 세포외 도메인을 포함하는 고정화된 HER2-His 또는 HER3-His를 이용하여 ELISA로 scDb 4D5x3-43-Fc의 항원 결합을 분석하였다. 항원을 PBS 중 2 ㎍/ml로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중 scDb-Fc 융합 단백질의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. ELISA 분석 결과, scDb 4D5x3-43-Fc 융합 단백질의 결합은 나노몰 범위인 것으로 나타났고, 여기서, EC50 값은 HER2-His의경우, 2.5 nM이고, HER3-His의 경우, 1.9 nM이었다 (도 21c 참조).
HER2 및 HER3 발현 FaDu 세포 (도 21d)를 이용하여 유세포 분석법 연구를 수행하였다. FaDu 세포를 37℃에서 간단히 트립신으로 처리하고, FCS 함유 배지로 트립신을 ??칭하고, 원심분리에 의해 제거하였다. 웰당 100,000개의 세포를 시딩하고, 4℃에서 1시간 동안 PBA (1 x PBS 중 2% (v/v) FCS, 0.02% (w/v) NaN3) 중 적정된 scDb-Fc와 함께 인큐베이션시켰다. PBA로 2회에 걸쳐 세척하였다. 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션된 PE-접합된 항-인간 Fc 항체를 이용하여 결합된 단백질을 검출하였다. 세척 후, MACS콴트® 아날라이저 10을 이용하여 형광을 측정하였다. MACS콴트® 소프트웨어를 이용하여 (비염색된 세포 대비) 상대적인 중간 형광 강도를 계산하였다. FaDu 세포에의 결합은 ELISA 분석으로부터 수득한 결합 특성에 필적할 정도로, EC50 값이 나노몰 범위의 2.9 nM인 것으로 관찰되었다.
실시예 15: IgG 3-43과 함께 인큐베이션된 SKBR3 및 BT474 종양 세포의 리간드 비의존적 콜로니 형성의 억제
SKBR3 및 BT474는 고수준의 HER2를 발현하고, 따라서, 리간드 비의존적 방식으로 증식될 수 있다. 세포 증식에 대한 마커로서 콜로니 형성을 억제시킬 수 있는 IgG 3-43의 잠재능을 상기 두 세포주에서 분석하였다 (도 22). 세포 (웰당 1,000개의 세포)를 RPMI 배지 중에서 12 웰 플레이트 내로 시딩하였다. 다음날, 세포를 2% FCS 함유 RPMI 배지 중 50 nM 농도의 항체 (IgG 3-43 또는 트라스투주맙)와 함께 인큐베이션시켰다. 7일 후, 배지를 제거하고, 동일한 농도의 항체를 포함하는 신선한 배지를 첨가하였다. 12일째, 세포를 실온에서 10 min 동안 히스토픽스(Histofix)로 고정시키고, 세포를 10 min 동안 크리스털 바이올렛으로 염색시켰다 (도 22a). 비처리된 세포 (con)를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 모든 인큐베이션은 삼중으로 수행하였다. HER2에 대한 트라스투주맙을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 두 세포주 모두에서 IgG 3-43 및 트라스투주맙은 콜로니 형성을 강력하게 억제시키는 것으로 관찰되었다 (도 22b). 이러한 관찰결과는 HER3이 심지어 헤레굴린의 부재하에서도, IgG 3-43에 의해 억제될 수 있는, HER2와 함께 신호전달 능력이 있는 이종이량체를 형성한다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 16: EGFR ( hu225 ) 및 HER3 (3- 43)을 표적화하는 이중특이적 및 4가 디아바디-Ig 융합 단백질 (Db-Ig)
EGFR (hu225; 인간화 버전의 C225 (세툭시맙, 얼비툭스)) 및 HER3 (3-43)에 특이적인 Db 분자를 IgG 항체의 불변 도메인과 조합함으로써 4가, 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig 분자를 생성하였다. 따라서, Db3-43xhu225-Ig 분자는 2개의 상이한 폴리펩티드, VH3-43xVLhu225-CL (경쇄, 서열 번호: 31) 및 VHhu225xVLhu3-43-CH1-CH2-CH3 (중쇄, 서열 번호: 32) (도 23a)으로 구성된다. 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig는 EGFR에 대하여 2개의 항원 결합 부위 및 HER3에 대하여 2개의 항원 결합 부위를 나타낸다 (도 23b). 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민을 사용하여, 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 2개의 플라스미드를 공동 투여한 후 일시적으로 형질감염된 HEK293-6E 세포에서 Db3-43xhu225-Ig를 발현시켰다. 세포 배양물 상청액 내로 분비된 단백질을 CH1-캡쳐셀렉트(CH1-CaptureSelect) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. SDS-PAGE 분석 결과, 환원 조건하에서 대략 65 kDa 및 35 kDa에서 중쇄 및 경쇄에 상응하는 2개의 밴드가 나타났고, 비환원 조건하에서 대략 220 kDa에서 이중특이적 Db-Ig 분자에 상응하는 1개의 주요 밴드가 나타났다 (도 23c). Db3-43xhu225-Ig 분자의 순도, 무결성 및 균질성을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인하였다 (도 23d). Db3-43xhu225-Ig 및 단일특이적 모체 항체 (세툭시맙 (항-EGFR) 및 3-43-IgG (항-HER3))의 EGFR (aa 20-643) 및 HER3 (aa 27-599)의 세포외 도메인 (ECD)에의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. His-태그부착된 EGFR 또는 HER3 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 희석된 농도로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig 또는 단일특이적 모체 항체의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. ELISA 분석 결과, 모체 항체의, EGFR 및 HER3의 세포외 도메인에의 결합 활성은 Db-Ig 포맷에서 유지되는 것으로 밝혀졌다. 이중특이적, 4가 Db3-43xhu225-Ig는 EGFR 및 HER3에 대하여 농도 의존적 결합을 보였고, 여기서, EC50 값은 나노몰 이하의 범위 (EGFR에 대해 0.19 nM; HER3에 대해 0.26 nM)를 나타내었다 (도 23e). 모체 항체는 유사한 EC50 값으로 그의 상응하는 항원에 결합하였다 (하기 표 6). 2차 결합 ELISA 분석에 의해 두 항원, EGFR 및 HER3, 모두에의 동시 결합을 확인하였다. 제1 항원으로서, EGFR-Fc 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중에 희석된 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 제2 항원인 HER3-His (헥사히스티딜-태그와 C-말단에서 융합된 HER3의 세포외 도메인 (aa 27-599); MPBS 중에 300 nM로 희석)를 플레이트에 첨가하였다. 세척 후, HER3-His (제2 항원)를 HRP-접합된 항-His-태그 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. 제2 항원은, Db3-43xhu225-Ig의 코팅된 HER3-Fc에의 결합과 유사하게 나노몰 이하 범위의 EC50 값 (0.85 nM)으로 농도에 의존하는 방식으로 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig에 결합하였다 (도 23f). 따라서, 이러한 결과는 Db-Ig 분자 내의 두 항원 결합 부위, 둘 모두의 비제한적인 접근가능성을 입증하는 것이다.
추가로, Db3-43xhu225-Ig 및 모체 모노클로날 항체 (세툭시맙 및 3-43-IgG)의 EGFR 및/또는 HER3 발현 세포 (MCF-7, SKBR-3, 및 FaDu)에의 결합 연구 (도 23g)를 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 부착성 세포를 PBS로 세척하고, 37℃에서 간단히 트립신으로 처리하였다. FCS 함유 배지로 트립신을 ??칭하고, 원심분리 500xg, 5분에 의해 제거하였다. 웰당 100,000개의 세포를 시딩하고, 4℃에서 1시간 동안 PBA (2% (v/v) FCS, 0.02% (w/v) NaN3을 함유하는 PBS) 중에 희석된 Db3-43xhu225-Ig 또는 모체 모노클로날 항체의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 PBA를 이용하여 2회에 걸쳐 세척하였다. 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션된 PE-표지된 항-인간 Fc 2차 항체를 이용하여 결합된 항체를 검출하였다. 세척 후, 밀테니이 MACS콴트® 아날라이저 10을 이용하여 중간 형광 강도 (MFI)를 측정하였다. MACS콴트® 소프트웨어 및 엑셀을 이용하여 (비염색된 세포 대비) 상대적인 MFI를 계산하였다. HER3 양성 MCF-7 세포주의 경우, 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig의 결합은 EC50 값이 나노몰 이하 범위인 0.054 nM으로 결합하였다. 모체 항-HER3 3-43-IgG가 유사한 EC50 값 (0.021 nM)으로 결합하였는 바, 모체 항-HER3 항체의 결합 활성은 Db-Ig 포맷에서 유지된다. 항-EGFR 항체 세툭시맙의 경우, MCF-7에의 결합은 관찰되지 않았다. 유사한 범위로 EGFR 및 HER3을 발현하는 세포주 SKBR-3의 경우, 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig 분자는, 모체 항체 세툭시맙 (0.031 nM) 및 3-43-IgG (0.022 nM), 둘 모두의 결합과 유사하게, 0.047 nM인 EC50 값으로 결합하였다. FaDu와 관련하여, Db3-43xhu225-Ig는 0.14 nM인 EC50 값으로 결합하였다. 모체 항-EGFR 항체 세툭시맙이 유사한 EC50 값 (0.13 nM)으로 결합하였는 바, 모체 항체 세툭시맙의 결합 활성 또한 Db-Ig 포맷에서 유지된다. FaDu 세포는 매우 높은 양의 EGFR 및 비교적 낮은 양의 HER3을 발현하는 바, Db3-43xhu225-Ig는 가능성이 가장 높게는 hu225 모이어티에 우선하여 세포에 결합하였다. 그러나, 모체 항-HER3 3-43-IgG는 또한 0.003 nM인 EC50 값으로 비교적 낮은 형광 신호로 세포에 결합하였다 (도 23g, 표 1).
SWISS 마우스에서 이중특이적 및 4가 Db3-43xhu225-Ig 분자의 약동학적 프로파일을 분석하였다. 25 ㎍의 단백질을 100 ㎕ 멸균 PBS 중에 희석시키고, 꼬리내로 정맥내 주사하였다. 상이한 시점 (3분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 1일, 3일, 및 7일) 후에, 꼬리로부터 혈액 샘플을 채취하고, 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 응고된 혈액을 원심분리하고 (16,000x g, 20분, 4℃), 혈청 샘플을 -20℃에서 보관하였다. ELISA를 통해 단백질 혈청 농도를 측정하였다. EGFR-Fc 또는 HER3-Fc 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 희석된 농도로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중에 희석된 혈청과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. 정제된 융합 단백질의 표준 곡선으로부터 Db3-43xhu225-Ig 분자의 혈청 농도를 내삽하였다 (도 24). 코팅된 항원으로서 EGFR-Fc 또는 HER3-Fc 융합 단백질을 사용하였을 때, Db3-43xhu225-Ig의 혈청 농도에 있어서는 어떤 차이도 관찰되지 않았다. 이중특이적 Db3-43xhu225-Ig 분자의 초기 반감기는 대략 2.7 h이고, 말단 반감기는 87 내지 92 h 범위였다.
실시예 17: 항- HER3 scFv - Fc - scTRAIL 융합 단백질은 시험관내에서 각종 흑색종 세포주에 대한 표적 의존적 세포독성을 매개한다
흑색종 세포주 패널을 유세포 분석법에 의해 HER3의 발현에 대하여 스크리닝하였으며, 상기 HER3의 발현은 QIFIKIT (다코(Dako))를 이용하여 정량화하였다 (도 25a). 분석된 흑색종 세포주는 대부분 다양한 정도로 HER3 발현을 나타내었다. 항-HER3 scFv-Fc-scTRAIL 융합 단백질의 결합을 분석하기 위해 중간 정도의 HER3 발현을 보인 A375를 선택하였다 (실시예 11; 도 25b, c 참조). scFv3-43-Fc-scTRAIL의 HER3 양성 세포주 A375에의 결합을 유세포 분석법을 통해 분석하였다. scFv3-43-Fc-scTRAIL은 1.19 ± 0.31 nM인 EC50 값으로 농도에 의존적인 방식으로 결합하는 것이 관찰되었다 (도 25d). 표적화된 포맷의 개선된 결합이 3-43 결합 도메인으로부터 생성되었는지 여부를 확인하기 위해 scFv3-43-Fc 융합 단백질과 scFv3-43-Fc-scTRAIL의 경쟁적 억제를 수행하였다 (도 25e). 그러므로, scFv3-43-Fc-scTRAIL의 결합 도메인을 200배 몰 과량의 scFv3-43-Fc (억제제)로 차단하였다. scFv3-43-Fc-scTRAIL의 결합은 억제제의 존재하에서 비표적화된 단백질 수준으로 감소되었지만, Fc-scTRAIL 그 자체의 결합은 어떤 영향도 받지 않았다. TRAIL 융합 단백질의 표적화 모이어티 (scFv3-43)가 HER3 양성 세포에의 결합을 증가시킨다는 것을 상기 결과를 통해 확인할 수 있었다.
이어서, 항-HER3 scFv-Fc-scTRAIL 융합 단백질을 시험관내에서 보르테조밉의 존재 또는 부재하에서 상이한 흑색종 세포주의 사멸에 대하여 분석하였다 (도 26). 처리 하루 전, 30,000 내지 60,000개의 세포/웰을 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 보르테조밉과의 조합 처리를 위해, 세포를 250 ng/ml (650 nM) 보르테조밉으로 전처리하였고, 단, 예외적으로, A375의 경우, 이는 30 min 동안 50 ng/ml 보르테조밉으로 전처리하였다. 이어서, 세포를 16 h 동안 융합 단백질의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 크리스털 바이올렛 염색에 의해 세포 생존능을 분석하였다.
보르테조밉의 부재하에서, scFv3-43-Fc-scTRAIL은 W793 (EC50 값 4.25 pM), MW1366 (EC50 값 48.2 pM) 및 WM35 (EC50 값 4.96 pM)에서는 세포 사멸을 강력하게 유도한 것으로 나타났고, A375, MelJuso 및 MeWo에서는 (50% 사멸에 도달하지 못하는) 세포 사멸의 부분적 유도를 이끈 것으로 나타났다 (도 26 참조). 그에 반해, 보르테조밉 첨가는 시험된 흑색종 세포주 모두를 감작화시켰으며, EC50 값 0.17 내지 4.63 pM의 사멸을 나타내었다 (도 26). 비표적화된 Fc-scTRAIL과 비교하였을 때, 보르테조밉의 부재 또는 존재, 둘 모두에서 EC50 값은 감소되었다 (하기 7). 추가로, 세포 생존능 검정법에서 사용되었던 흑색종 세포의 HER3 발현을 보르테조밉의 부재 또는 존재하에서 QIFIKIT (다코)를 이용하여 유세포 분석법을 통해 분석하였다. 보르테조밉 처리는 흑색종 세포에 의한 HER3 발현에 대해서 어떤 효과도 없거나, 또는 단지 미미한 효과만을 보였다 (도 26).
실시예 18: 항- HER3 scFv - Fc - scTRAIL 융합 단백질은 생체내 Colo205 이종이 식편 종양 모델에서 강력한 항종양 활성을 나타내고, 우수한 내약성을 가진다
종양 보유 마우스에서 scFv3-43-Fc-scTRAIL 융합 단백질 (실시예 11 참조)을 그의 항종양 활성, 안전성 및 약동학적 프로파일에 대하여 평가하였다. (100 ㎕ DPBS 중) 3 x 106개의 Colo205 세포를 암컷 NMRI 누드 마우스의 좌측 및 우측 평구리 내로 피하로 주사하였다. 캘리퍼로 종양의 길이 (a) 및 너비 (b)를 측정하여 종양 부피 (V = a x b2/2)를 계산함으로써 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 크기가 대략 100 ㎣에 도달하였을 때 처리하기 시작하였다. (150 ㎕ DPBS 중) 융합 단백질의 주사를 정맥내로 수행하였다. 대조군 동물은 각각 150 ㎕ DPBS의 주사를 받았다. 마우스 (9 또는 11주령, 군당 마우스 6마리)를 3주 동안 주 2회에 걸쳐 (14, 18, 21, 25, 28, 32일째에) 0.2 nmol 단백질 (0.4 nmol scTRAIL 유니트)로 처리하였다. 최종 처리 후 4 h 및 24 h째에 혈액 샘플을 채취하여 단백질 농도 및 ALT 수준을 분석하였다.
scFv3-43-Fc-scTRAIL 및 비표적화된 Fc-scTRAIL을 처리하였을 때, 종양의 완전 관해가 관찰되었다. scFv3-43-Fc-scTRAIL로 처리된 동물의 경우, 거의 100 d의 모니터링 기간 동안에 걸쳐 종양 관해는 안정적이었고, Fc-scTRAIL의 경우, 실험 종료시 단지 미미한 재성장만이 검출되었다 (도 27a, b). 최종 처리 후 4 및 24시간 경과시, 혈청 중 ALT 활성은 비처리군또는 PBS 처리군과 비교하였을 때 유사하였는 바, TRAIL 융합 단백질 처리군의 경우, 간에 대해서 어떤 독성 효과도 관찰되지 않았다 (도 27c). 최종 처리 후 4 및 24시간째에 혈청 중 단백질 농도를 측정하였다 (도 27d). scFv3-43-Fc-scTRAIL 및 Fc-scTRAIL 사이에 어떤 차이도 관찰되지 않았다.
실시예 19: EGFR 및 HER3을 표적화하는 , G 4 S -링커를 함유하는 이중특이적 단일 쇄 디아바디 - Fc 융합 단백질
VL3-43과 VH3-43을 연결하는, EGFR 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 단일 쇄 디아바디-Fc 융합 단백질의 링커 L2를 서열 GGGGSGGRASGGGGS (서열 번호: 21)에서GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 16) (도 28a, b)로 변형시켰다. 변형된 scDb-Fc 융합 단백질을 HEK293-6E 현탁 세포에서 제조하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 고속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 scDbhu225x3-43-Fc의 SDS-PAGE 분석 결과, 분자의 단량체 및 이량체 어셈블리에 상응하는, 환원 조건하에 겉보기 분자 질량 대략 82 kDa에서 및 비환원 조건하에 200 kDa에서 단일 밴드가 나타났다 (도 28c). 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순도를 확인하였다 (도 28d). 모체 항체 (hu225-IgG 및 3-43-IgG)와 비교하여, scDb-Fc의, EGFR (aa 20-643) 및 HER3 (aa 27-599)의 His-태그부착된 세포외 도메인에의 결합을 ELISA에 의해 사정하였다. EGFR-His 또는 HER3-His 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 희석된 농도로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 이중특이적 scDb-Fc 또는 단일특이적 모체 항체의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. ELISA 분석 결과, 모체 항체의, EGFR 및 HER3의 세포외 도메인 (ECD)에의 결합 활성은 변형된 scDb-Fc 포맷에서 유지되는 것으로 밝혀졌다 (도 28e 참조). scDb-Fc 분자는 EC50 값 0.16 nM으로 EGFR에 결합하였고, 0.20 nM으로 HER3에 결합한 반면, 모체 항체는 나노몰 이하의 범위의 유사한 EC50 값으로 그의 상응하는 항원에 결합하였다 (hu225-IgG: 0.20 nM; 3-43-IgG: 0.54 nM).
실시예 20: EGFR 및 HER3을 표적화하는 , 이중특이적 디아바디 -Ig (Db-Ig) 및 이중특이적 단일 쇄 디아바디-Fc 융합 단백질의 비교
EGFR 및 HER3을 표적화하는, 상이한 포맷의 두 이중특이적 및 4가 항체인, 단일 쇄 디아바디-Fc (scDb-Fc) (실시예 19 참조) 및 디아바디-Ig (Db-Ig) (실시예 16)를 EGFR, HER2, HER3, Akt, 및 Erk의 억제 활성에 대해 분석하였다. FaDu 세포를 사용하여 신호 억제 검정법을 수행하였다. 세포를 37℃에서 15 min 동안 헤레굴린 (50 ng/ml)으로 자극시키기 전 1시간 동안 50 nM의 모체 항체 (단독 또는 조합하여 (50 nM의 각 항체)), 이중특이적 항체 (scDbhu225x3-43-Fc (GGGGS) 서열 번호: 33, Db3-43xhu225-Ig)로 처리하였다. 세포를, 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.25% DOC, 0.1% SDS)를 사용하여 용해시키고, 면역블롯팅에 의해 용해물을 분석하였다. HER2 및 HER3의 인산화는 헤레굴린 자극 부재하에서 이중특이적 항체 뿐만 아니라, 3-43-IgG에 의해 억제된 반면, 헤레굴린의 존재하에서 수용체 인산화는 3-43-IgG와 비교하였을 때, 두 이중특이적 항체 모두에 의해 더욱 효율적으로 억제되었다. 추가로, 이중특이적 항체는 헤레굴린의 부재 및 존재하에서 Akt 및 Erk의 인산화를 효율적으로 억제시켰다 (도 29).
이어서, 결장암 세포주 (SW620, HCT116, 및 LoVo)에서 단독으로 또는 조합하여 2개의 상이한 이중특이적 항체 포맷 또는 모체 항체 (hu225-IgG 미 3-43-IgG)를 사용하여 증식 검정법을 수행하였다. 2D 배양으로 중에서 또는 3D 배양으로 세포를 성장시켰다. 2,000개의 세포/웰을 96 웰 플레이트 중에 시딩하였다 (3D 배양을 위해: 1:2 마트리겔:콜라겐 혼합물, RPMI 또는 DMEM + 10% FCS + 2% 마트리겔). 24 h 후, 배지를 폐기하고, 기아 배지 (RPMI 또는 DMEM + 0.2% FCS + 1% P/S)를 첨가하였다. 추가의 24 h 인큐베이션 후, 세포를 MEK-억제제 (AZD6244, 셀루메티닙)로/그의 부재하에, 및/또는 항체 (50 nM, 조합: 각 50 nM)로 처리하였다. 1 h 후, 세포를 HRG (6 ng/웰)로 자극시키거나, 또는 자극시키지 않은 상태 그대로 유지시켰다. 세포 시딩 후 8일째, 셀타이터글로 3D 키트 (25 ㎕의 셀타이터글로 2.0/웰과 혼합된 25 ㎕의 기아 배지)를 이용하여 검정을 발색시키고, 플레이트 판독기 (테칸 인피니트(tecan infinite))를 이용하여 발광을 측정하였다. SW620 및 HCT116 세포의 경우, 증식에 있어 모든 항체에 대해 단지 미미한 차이만이 관찰되었다. 그러나, 세포를 헤레굴린 존재하에서 MEK 억제제과 조합하여 처리하였을 때, 이중특이적 항체는 다른 항체와 비교하여 감소된 증식 효과를 보였다. HRG 자극을 받지 않은 LoVo 세포의 경우, MEK-억제제의 존재하에서 또는 부재하에서 3D 배양시 두 이중특이적 항체 모두에 대해, 그 뿐만 아니라, hu225-IgG 또는 두 모체 항체의 조합에 대해 강력하게 감소된 증식 효과가 관찰되었다. HRG 자극 후에는 오직 이중특이적 항체만이 MEK-억제제의 존재하에서 또는 부재하에서 세포의 증식을 효율적으로 감소시킬 수 있었다.
실시예 21: HER2 및 HER3을 표적화하는 이중특이적 , 2가 단일 쇄 디아바디 (scDb)
항-HER3 3-43의 결합 부위를 인간화 항-HER2 항체 4D5 (트라스투주맙)의 것과 조합하여 이중특이적 scDb 분자를 생성하였다. scDb4D5x3-43-LL은 HER3에 대해 하나의 결합 부위 및 HER2에 대해 하나의 결합 부위를 나타낸다 (도 31a 및 b). VL3-43을 VH3-43과 연결하는 링커 (L2)는 20개의 아미노산 (GGGGSGGRASGGGGSGGGGS, 서열 번호: 21)으로 구성된다. scDb4D5x3-43-LL (서열 번호: 34)을 HEK293E 현탁 세포에서 제조하고, IMAC 및 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에 의해 정제하였다. 정제된 scDb4D5x3-43-LL의 SDS-PAGE 분석 결과, 각각 환원 조건하에 겉보기 분자 질량 대략 53 kDa에서 및 비환원 조건하에 50 kDa에서 단일 밴드가 나타났다 (도 31c). 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단백질의 순도 및 무결성을 확인하였다 (도 31d).
인간 HER2 (aa 23-652) 또는 HER3 (aa 27-599)의 세포외 도메인 (ECD)을 포함하는 고정화된 HER2-Fc 또는 HER3-Fc 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 모체 항체 (트라스투주맙 및 3-43 IgG)와 비교하여 scDb4D5x3-43-LL의 결합을 평가하였다. ECD-Fc 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 MPBS 중 scDb4D5x3-43-LL 또는 모체 항체의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 scDb4D5x3-43-LL의 경우에는 HRP-접합된 항-His 항체로, 또는 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. scDb4D5x3-43-LL은 낮은 나노몰 범위의 EC50 값 (HER2: 1.54 nM; HER3: 0.93 nM)으로 HER2 및 HER3에 대해 농도 의존적 결합을 보였다 (도 31e). 모체 항체는 각 항원에 결합을 보였고 (트라스투주맙의 HER2에의 결합: 0.80 nM; 3-43-IgG의 HER3에의 결합: 0.27 nM), 따라서, scDb4D5x3-43-LL 단백질의 결합은 유지된다.
모체 항체와 비교하여, 이중특이적 scDb4D5x3-43-LL 분자에 의한 단일 처리로서 또는 조합 처리로서의 처리에 의해 HER2, HER3, Akt, 및 Erk의 수용체 활성화가 억제되는지 여부를 측정하기 위해 MCF-7 세포에서 신호 억제 검정법을 수행하였다. 추가로, 수용체 인산화를 측정하기 위해 이중특이적 및 4가 scDb4D5x3-43-Fc 융합 단백질 또한 본 실험에서 사용하였다. 세포를 37℃에서 15 min 동안 헤레굴린 (50 ng/ml)으로 자극시키기 전 1시간 동안 50 nM의 모체 항체 (단독 또는 조합하여 (50 nM의 각 항체)), 이중특이적 scDb4D5x3-43-LL로 처리하였다. 세포를, 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 20 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Na3VO4, 0.5 mM PMSF, 0.25% DOC, 0.1% SDS)를 사용하여 용해시키고, 면역블롯팅에 의해 용해물을 분석하였다. HRG 자극을 받지 않은 세포의 경우, 오직 이중특이적, 2가 scDb4D5x3-43-LL 분자만이 HER2, Akt, 및 Erk의 인산화 감소를 나타낸 반면, 모체 항체의 경우, 단일 처리로서 또는 조합 처리로서 Akt의 활성화가 관찰되었다. 추가로, Akt의 활성화는 이중특이적이되, 4가인 scDb4D5x3-43-Fc 융합 단백질에 대해 검출되었다 (도 32). HRG 자극을 받은 세포에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 또한, 오직 이중특이적 및 2가 scDb4D5x3-43 분자만이 HER2, HER3, Akt, 및 Erk의 인산화를 효율적으로 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 22: T 세포 재표적화를 위한, 상이한 결합가를 가지는 항- HER3 x 항-CD3 이중특이적 항체
본 발명자들은 한편으로는 인간 CD3에 결합하는 1가의 것 (인간화 버전의 UCHT1), 및 다른 한편으로는 HER3에 결합하는, scDb3-43xhuU3 (실시예 12 또한 참조)과 같은 1가의 것, scDb3-43xhuU3-scFv3-43 (실시예 13 또한 참조)과 같은 2가의 것, 또는 scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43 (서열 번호: 35, 도 33a, b)과 같은 3가의 것인 이중특이적 항체를 생성하였다. 이중특이적 및 다가 항체를 HEK293E 세포에서 제조하고, IMAC에 의해 정제하였다. 3가 (scDb3-43xhuU3-scFv3-43) 및 4가 (scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43) 항체는 고속 단백질 액체 크로마토그래피를 통해 추가로 정제하여 하나의 균질한 항체 집단을 생성하였다.
CD3 발현 주르카트 세포 (도 33c) 및 HER3 발현 MCF-7 세포 (도 33d)를 이용하여 유세포 분석법에 의해 이중특이적 항체의 결합을 분석하였다. 부착성 MCF-7의 경우, 세포를 37℃에서 간단히 트립신으로 처리하고, FCS 함유 배지로 트립신을 ??칭하고, 원심분리에 의해 제거하였다. 주르카트 및 MCF-7, 두 세포주 모두, 웰당 100,000개의 세포를 시딩하고, 4℃에서 1시간 동안 PBA (1 x PBS 중 2% (v/v) FCS, 0.02% (w/v) NaN3) 중 적정된 상이한 이중특이적 및 다가 항체와 함께 인큐베이션시켰다. PBA로 2회에 걸쳐 세척하였다. 4℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션된 PE-접합된 항-His 항체를 이용하여 결합된 단백질을 검출하였다. 세척 후, MACS콴트® 아날라이저 10을 이용하여 형광을 측정하였다. MACS콴트® 소프트웨어를 이용하여 (비염색된 세포 대비) 상대적인 중간 형광 강도를 계산하였다. 3개의 항체 모두 CD3 양성 주르카트 세포에 대해 농도에 의존하는 방식으로 결합하며, 그 결과, 나노몰 범위의 유사한 EC50 값을 보이는 것으로 관찰되었다 (scDb3-43xhuU3: 2.4 nM; scDb3-43xhuU3-scFv3-43: 4.2 nM; scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43: 5.2 nM). MCF-7 세포에 대해서도 또한 농도에 의존하는 방식으로 결합하는 것으로 관찰되었지만, 이중특이적 항체의 결합은 HER3 결합의 결합가에 의존하였다. 1가 HER3 결합제 (scDb3-43xhuU3)의 EC50 값은 1.1 nM인 것으로 측정된 반면, 2가 및 3가 HER3 결합제는 EC50 값이 scDb3-43xhuU3-scFv3-43의 경우, 31.4 pM, 및 scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43의 경우, 17.3 pM인 피코몰 범위의 결합을 보였다.
HER3 발현 MCF-7 세포 및 인간 PBMC를 사용하여 IL-2 방출 검정법으로 T 세포의 활성화를 분석하였다. 처리 하루 전, 웰당 20,000개의 MCF-7 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 배지를 제거하고, 신선한 배지 중의 적정된 상이한 이중특이적 항체로 치환하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 웰당 200,000개의 PBMC를 첨가하고, 37℃에서 추가의 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 수집하고, 제조사에 의해 공급받은 사용 설명서에 따라 ELISA (인간 IL-2 키트, R&D)에 의해 IL-2의 농도를 측정하였다. 3개의 이중특이적 항체 모두 나노몰 이하 범위인 0.48 nM (scDb3-43xhuU3), 0.29 nM (scDb3-43xhuU3-scFv3-43), 및 0.22 nM (scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43)인 EC50 값으로 IL-2를 용량에 의존하는 방식으로 방출 (T 세포의 활성화)하는 것으로 나타났다 (도 33e).
HER-3 발현 MCF-7 세포 및 인간 PBMC를 사용하여 상이한 이중특이적 항체에 의한 표적 세포의 사멸을 분석하였다. 처리 하루 전, 웰당 20,000개의 MCF-7 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 배지를 제거하고, 신선한 배지 중의 상이한 이중특이적 및 다가 항체로 치환하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 웰당 200,000개의 PBMC를 첨가하고, 37℃에서 추가의 48시간 동안 인큐베이션시켰다. MTT 검정법을 통해 세포 생존능을 측정하였다. 3개의 이중특이적 항체 모두 피코몰 이하 범위인 84 pM (scDb3-43xhuU3), 34 pM (scDb3-43xhuU3-scFv3-43), 및 32 pM (scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43) (도 33F; 검은색 선)인 EC50 값으로 MCF-7 세포를 용량에 의존하는 방식으로 사멸시키는 것으로 나타났다. PBMC의 부재하에서는 어떠한 MCF-7 세포의 세포 생존능의 감소도 관찰되지 않았다 (도 33f; 회색 선).
실시예 23: IgG 3-43은 도메인 III 및 IV 중에서 돌연변이화된 HER3 - Fc 융합 단백질에 결합한다
Q5® 부위 지정 돌연변이유발 키트 (NEB)를 통해 도메인 III 및 IV 중의 HER3 체세포 돌연변이를 클로닝하였다. 하나의 핫 스폿 돌연변이 (T335A) 이외에도, 도메인 III 및 IV 중의 6개의 다른 돌연변이 (T389I, M406K, R453H, Y464C, D492H, K498I)를 HER3-Fc 융합 단백질로서 발현시켰고, 이를 일시적으로 형질감염된 HEK 293-6E 세포에서 제조하고, 단백질 A 크로마토그래피를 통해 정제하였다. SDS-PAGE 분석에 의해 단백질의 순도를 확인하였고, 그 결과, 환원 조건하에서 대략 140 kDa의 하나의 단일 밴드가 나타났다 (도 34a). 상이한 돌연변이화된 HER3-Fc 융합 단백질에 결합할 수 있는 3-43-IgG의 결합 능력을 ELISA로 분석하고, 야생형 (돌연변이화되지 않은) HER3-Fc 융합 단백질에의 결합과 비교하였다. 상이한 HER3-Fc 융합 단백질을 PBS 중 2 ㎍/ml로 희석된 농도로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 남은 결합 부위를 PBS, 2% 탈지유 (MPBS)로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 항HER3 항체 3-43-IgG 및 3M6-IgG의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 및 기질로서 TMB, H2O2로 검출하였다. IgG 3-43은 핫 스폿 돌연변이 T335A를 비롯한, 시험된 돌연변이 모두에 결합하는 것으로 나타났다. HER3의 도메인 I에 결합하는 IgG 3M6은 양성 대조군으로서 포함시켰고, 이는 야생형 HER3-Fc에 대해 관찰된 신호와 유사한 100 nM으로 결합한 것으로 나타났다. 비록 IgG 3-43이 HER3의 모든 돌연변이체 형태에 결합할 수는 있었지만, 돌연변이체 중 일부의 경우, EC50 값이 모든 HER3 돌연변이체에 대하여 유사한 범위에 존재하기는 하였지만 (0.1 내지 0.3 nM), ELISA에서 고정화된 HER3-Fc 돌연변이체와의 감소된 포화 결합이 관찰되었다 (도 34b)
표:
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SEQUENCE LISTING <110> Universitat Stuttgart <120> ANTIGEN BINDING PROTEIN AGAINST HER3 <130> IPA190209-DE <150> EP16188871.4 <151> 2016-09-15 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1342 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu 1 5 10 15 Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr 20 25 30 Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr 35 40 45 Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu 50 55 60 Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile 65 70 75 80 Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr 85 90 95 Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp 100 105 110 Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser 115 120 125 His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser 130 135 140 Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr 145 150 155 160 Ile Asp Trp Arg 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Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Gln Ser Leu Lys Ser Arg Ile 340 345 350 Thr Ile Asn Pro Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn 355 360 365 Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly 370 375 380 Gln Leu Gly Leu Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 385 390 395 400 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 405 410 415 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 420 425 430 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 435 440 445 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr 450 455 460 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 465 470 475 480 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 485 490 495 Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 500 505 510 Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala 515 <210> 35 <211> 770 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv3-43-scDb3-43xhuU3-scFv3-43 <400> 35 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30 Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80 Asn Asp Tyr Ala Gln Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp 85 90 95 Thr Pro Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gln Leu Gly Leu Asp 115 120 125 Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 145 150 155 160 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 165 170 175 Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 180 185 190 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 195 200 205 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 210 215 220 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn 225 230 235 240 Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 260 265 270 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser 275 280 285 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr Thr 290 295 300 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 305 310 315 320 Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 325 330 335 Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 340 345 350 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 355 360 365 Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 370 375 380 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala 385 390 395 400 Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ala Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala 405 410 415 Ser Ile Thr Cys Gly Arg Asp Asn Ile Gly Ser Arg Ser Val His Trp 420 425 430 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp 435 440 445 Ser Asp Arg Pro Ala Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Tyr 450 455 460 Glu Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu 465 470 475 480 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Gly Ile Thr Ser Asp His Val Val 485 490 495 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Gly Ser 500 505 510 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser 515 520 525 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala 530 535 540 Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile 545 550 555 560 Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr 565 570 575 Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Gln Ser Leu Lys Ser Arg Ile 580 585 590 Thr Ile Asn Pro Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn 595 600 605 Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly 610 615 620 Gln Leu Gly Leu Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 625 630 635 640 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 645 650 655 Gly Gly Ser Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ala Val Ser Val Ala 660 665 670 Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Gly Arg Asp Asn Ile Gly Ser 675 680 685 Arg Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 690 695 700 Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ala Gly Ile Pro Glu Arg Phe 705 710 715 720 Ser Gly Ser Asn Tyr Glu Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val 725 730 735 Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Gly Ile Thr 740 745 750 Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 755 760 765 Ser Leu 770

Claims (15)

  1. 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3)의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프(conformational epitope)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서, 상기 입체형태적 에피토프가 서열 번호: 1에 따른 HER3의 도메인 III의 아미노산 329 내지 531 및 서열 번호: 1에 따른 HER3의 도메인 IV의 아미노산 532 내지 587에 의해 형성된 것인, 항원 결합 단백질.
  2. HER3에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 항원 결합 단백질로서,
    상기 참조 항체는 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3)의 도메인 III 및 IV에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 입체형태적 에피토프가 서열 번호: 1에 따른 HER3의 도메인 III의 아미노산 329 내지 531 및 서열 번호: 1에 따른 HER3의 도메인 IV의 아미노산 532 내지 587에 의해 형성되며,
    상기 참조 항체는
    (a) 서열 번호: 2에 따른 아미노산 32 내지 37을 포함하는 CDRH1; 서열 번호: 2에 따른 아미노산 52 내지 69를 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호: 2에 따른 아미노산 102 내지 112를 포함하는 CDRH3; 및
    (b) 서열 번호: 3에 따른 아미노산 23 내지 33을 포함하는 CDRL1; 서열 번호: 3에 따른 아미노산 49 내지 55를 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호: 3에 따른 아미노산 88 내지 98을 포함하는 CDR3L
    을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 항원 결합 단백질:
    (a) 15 nM 미만의 EC50 값으로 HER3 발현 세포에 결합함;
    (b) 100 nM 미만의 KD 값으로 단량체 HER3에 결합함; 및
    (c) 10 nM 미만의 IC50 값으로 헤레굴린 유도된 HER3 인산화를 억제시킴.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 항원 결합 단백질:
    (i) HER3이 그의 리간드에 결합하는 것을 억제시킴;
    (ii) 수용체 활성화, 신호전달(signaling), 또는 이 둘 모두를 억제시킴;
    (iii) HER3 내재화를 유도함;
    (iv) 세포 증식을 억제시킴; 및
    (v) 종양 성장을 억제시킴.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 단백질이
    a) 항체 또는 그의 항원 결합 단편,
    b) 항체 유사 단백질, 및
    c) 펩티도미메틱(peptidomimetic)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항원 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적인 것인 항원 결합 단백질.
  7. 제2항에 있어서, 항원 결합 단백질이 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적인 것인 항원 결합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 항원 결합 단백질:
    (a) 서열 번호: 2에 따른 아미노산 32 내지 37을 포함하는 CDRH1, 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열 번호: 2에 따른 아미노산 52 내지 69를 포함하는 CDRH2, 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열 번호: 2에 따른 아미노산 102 내지 112를 포함하는 CDRH3, 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체;
    (b) 서열 번호: 3에 따른 아미노산 23 내지 33을 포함하는 CDRL1, 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열 번호: 3에 따른 아미노산 49 내지 55를 포함하는 CDRL2, 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열 번호: 3에 따른 아미노산 88 내지 98을 포함하는 CDR3L, 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 또는
    (c) 상기 (a) 및 (b) 모두.
  9. 제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하고, 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티(moiety)를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  10. 제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질; 또는 상기 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
  11. 제10항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제10항의 핵산; 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  13. 제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질; 상기 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티를 포함하는 융합 단백질; 상기 항원 결합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 벡터; 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 포함하고,
    하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제, 보존제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는,
    종양 성장을 억제시키거나 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  14. 제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적으로 사용하기 위한 것이거나, 또는 종양 성장을 억제시키거나 암을 치료하기 위한 것인 항원 결합 단백질.
  15. 제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질; 상기 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티를 포함하는 융합 단백질; 상기 항원 결합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 벡터; 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포; 또는 제약 조성물의 치료 유효량을,
    이를 필요로 하는 환자; 또는 종양 성장 또는 암을 앓고 있거나, 종양 성장 또는 암의 발생 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장을 억제시키거나 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 제약 조성물은 제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질; 상기 항원 결합 단백질과 적어도 하나의 제약상 활성인 모이어티를 포함하는 융합 단백질; 상기 항원 결합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 벡터; 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 포함하고, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제, 보존제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하고,
    상기 환자는 인간을 제외하는 것인, 방법.
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