KR102449406B1

KR102449406B1 - 백시니아 바이러스/진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생산하기 위한 개선된 방법

Info

Publication number: KR102449406B1
Application number: KR1020197005952A
Authority: KR
Inventors: 어니스트 스미스; 슈잉 쉬
Original assignee: 백시넥스 인코포레이티드
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2022-09-29
Also published as: IL264343B2; AU2017306062A1; US10640765B2; AU2017306062B2; CN109563143A; US20190241889A1; WO2018026715A1; JP2019524126A; IL264343A; MX2019001453A; BR112019001944A2; RU2019105695A3; EP3494131A4; CA3032512A1; US20190169606A1; RU2747557C2; US20200299683A1; JP7128177B2; EP3494131A1; JP2022109946A

Abstract

본 개시내용은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 관심 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터 시스템에서 구축하는 개선된 방법을 제공한다. 상기 방법은 폭스바이러스 조립 억제제, 예를 들어 리팜피신의 존재 하에 라이브러리를 구축하는 단계를 포함하고, 이것은 이전의 방법보다 더 높은 복잡성 및 다양성을 갖는 라이브러리의 구축을 가능하게 한다.

Description

백시니아 바이러스/진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생산하기 위한 개선된 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2016년 8월 2일 출원된 미국 특허 가출원 제62/370,009호의 이익을 주장하고, 이 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록의 참조

본원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(명칭 "58008-168081_Sequence_Listing_ascii_ST25.txt; 크기: 4,020 바이트 및 생성 일자: 2017년 7월 31일") 내의 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본 개시내용은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 단편과 같은 결합 분자를 진핵 세포에서 동정하는 개선된 방법, 및 특히 진핵 세포에서의 발현을 위한 단백질 라이브러리, 예를 들어, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 라이브러리를 생산하는 개선된 방법에 관한 것이다.

진핵 발현 라이브러리

분자 생물학 분야의 기본적인 도구는 폴리(A)⁺ mRNA의 이중 가닥(ds) cDNA로의 전환이고, 이것은 다시 클로닝 벡터에 삽입되어 적절한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 많은 cDNA 클로닝 전략에 공통적인 방법은 관심 유기체의 세포에서 유래된 폴리(A)⁺ mRNA로부터 유래된 cDNA 클론의 집단인 "cDNA 라이브러리"의 구축을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린 또는 항체 서브유닛 폴리펩티드를 발현하는 cDNA를 단리하기 위해, 프리-B 세포, B 세포 또는 형질 세포로부터 cDNA 라이브러리를 생산할 수 있다. 필라멘트형 박테리오파지, 박테리오파지 람다, 코스미드 및 플라스미드 벡터를 비롯한 상이한 발현 벡터에서 cDNA 라이브러리를 구축하는 방법이 공지되어 있다.

cDNA 라이브러리로부터 표적 유전자를 단리하는 많은 상이한 방법이 이용되었고, 다양한 성공을 거두었다. 이들은 예를 들어 표적 유전자의 DNA 서열에 상보성인 서열을 갖는 표지된 핵산 단편인 핵산 혼성화 프로브의 사용을 포함한다. 이 방법이 형질전환된 박테리아 숙주의 cDNA 클론에 적용될 때, 프로브에 강력하게 혼성화하는 콜로니 또는 플라크는 표적 DNA 서열을 포함할 가능성이 있다. 그러나, 혼성화 방법은 특정 cDNA 클론이 발현되는 것을 필요로 하지 않고, 그 발현 여부를 측정하지 않는다. 대안적인 스크리닝 방법은 박테리아 숙주에서의 발현에 의존하는데, 예를 들어, 콜로니 또는 플라크는 관심 단백질에 대해 생성된 항체에 대한 결합에 대한 면역검정에 의해 스크리닝될 수 있다. 그러나, 박테리아 숙주에서의 발현에 대한 검정은 종종 방해받고, 이것은 예를 들어 단백질이 박테리아 숙주에서 충분히 발현되지 않거나, 단백질이 잘못된 입체형태로 발현되거나, 또는 진핵 시스템에서와 같이 처리 및/또는 수송되지 않기 때문이다. 상기에서 언급된 바와 같이, 박테리아 숙주에서 항체 분자를 생산하려는 시도에서 이러한 많은 문제가 발생하였다.

따라서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 결합 분자를 코딩하는 cDNA를 단리하기 위한 진핵, 예를 들어, 효모 또는 포유동물 발현 라이브러리의 사용은 박테리아 라이브러리에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 예를 들어, 진핵 숙주에서 발현되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 서브유닛과 같은 결합 분자는 기능적일 수 있고, 전형적인 진핵 세포의 번역 후 변형을 겪을 수 있다. 세포내 막 시스템을 통해 세포 표면으로 통상적으로 수송되는 단백질은 수송 과정을 완료할 수 있다. 또한, 진핵 시스템의 사용은 진핵 RNA 또는 단백질의 기능적 발현에 기초하여 관심 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리할 수 있게 한다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 결합 분자는 주어진 항원에 대한 특이성에 기초하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,858,559호, 미국 특허 출원 공개 제2016-0152971호 및 2016년 4월 22일로 출원된 미국 특허 가출원 제62/326,501호를 참조하고, 이들은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 또한 문헌 [Smith et al., Nature Medicine 7:967-972 (2001)]을 참조한다.

폭스바이러스 벡터

폭스바이러스 벡터는 진핵 세포에서 단백질 및 항원 발현을 위한 발현 비히클로서 광범위하게 사용된다. 다양한 숙주 세포에서 백시니아의 클로닝 및 증식의 용이성 때문에, 폭스바이러스 벡터는 외래 단백질의 발현을 위해 및 백신 전달 비히클로서 광범위하게 사용되었다(Moss, B., Science 252:1662-7 (1991)).

전통적으로, 폭스바이러스에 대한 고효율, 고역가 생성의 클로닝 방법이 존재하지 않았기 때문에, 복잡한 클론 집단으로부터 관심 미공지 유전자를 확인하기 위해 폭스바이러스 벡터를 사용하지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 3분자 재조합을 이용하여 재조합 폭스바이러스에서 다양한 cDNA 라이브러리를 생성하는 방법을 개발하였다. 예를 들어, 2004년 3월 16일 등록된 자우더러(Zauderer)의 미국 특허 제6,706,477호 및 2010년 12월 28일 등록된 자우더러 등의 미국 특허 제7,858,559호를 참조하고, 이들은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

3분자 재조합은 그 단독으로 재조합 폭스바이러스를 생성하기 위한 고효율, 고역가 생성 방법이다. 훨씬 더 많은 양의 재조합 바이러스를 생산하기 위해 3분자 재조합을 사용하는 공정을 더욱 향상시킬 필요성이 존재한다.

개요

본 개시내용은 복수의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리를 구축하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 단리된 폭스바이러스 게놈을 절단하여 제1 바이러스 단편 및 제2 바이러스 단편을 생성시키는 단계로서, 제1 단편이 제2 단편과 비상동성인 단계; (b) 5' 인접 영역 및 3' 인접 영역이 인접한 관심 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 전달 플라스미드의 집단을 제공하는 단계로서, 5' 인접 영역은 제1 바이러스 단편의 3' 말단에 상동성인 영역을 포함하고, 3' 인접 영역은 제2 바이러스 단편의 5' 말단에 상동성인 영역을 포함하고, 상기 전달 플라스미드는 생존 가능한 폭스바이러스 게놈이 형성되도록 상기 제1 및 제2 바이러스 단편과의 상동성 재조합이 가능한 것인 단계; (c) 폭스바이러스 감염성을 허용하는 포유동물 숙주 세포 내로 전달 플라스미드 및 제1 및 제2 바이러스 단편을 도입하는 단계; (d) 폭스바이러스 조립 억제제를 첨가하는 단계; 및 (e) 전달 플라스미드 및 제1 및 제2 바이러스 단편이 상동성 재조합을 겪을 수 있도록 함으로써, 이종성 핵산을 각각 포함하는 생존 가능한 변형된 폭스바이러스 게놈의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 (f) 라이브러리를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 단계 (c)는 전달 플라스미드 및 제1 및 제2 바이러스 단편으로 포유동물 숙주 세포를 형질감염시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 숙주 세포는 형질감염 후 세포 배양 배지에서 유지된다.

특정 측면에서, 폭스바이러스 조립 억제제는 리팜피신(리팜핀) 또는 이의 유도체일 수 있다. 특정 측면에서, 리팜피신 또는 이의 유도체는 형질감염 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간 또는 약 60시간 후에 형질감염된 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 특정 측면에서, 리팜피신 또는 이의 유도체는 약 30 ㎍/ml, 약 40 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml, 약 60 ㎍/ml, 약 70 ㎍/ml, 약 80 ㎍/ml, 약 90 ㎍/ml, 약 100 ㎍/ml, 약 110 ㎍/ml, 약 120 ㎍/ml 또는 약 130 ㎍/ml의 농도로 세포 배양 배지에 첨가된다. 특정 측면에서, 리팜피신 또는 이의 유도체는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일 또는 약 5일 동안 세포 배양 배지에 유지될 수 있도록 한다. 특정 측면에서, 세포 배양 배지는 리팜피신 또는 이의 유도체로 처리한 후에 교환되고, 형질감염된 숙주 세포는 약 1일, 약 2일 또는 약 3일 동안 리팜피신 없이 추가로 배양될 수 있다.

본원에서 제공되는 방법은 상기 방법에 의해, 그러나 폭스바이러스 조립 억제제의 부재 하에 구축된 라이브러리보다 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈의 수를 증가시킬 수 있다. 특정 측면에서, 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈의 수는 상기 방법에 의해, 그러나 폭스바이러스 조립 억제제의 부재 하에 구축된 라이브러리에 비해 적어도 약 1배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배 또는 약 30배 증가한다. 특정 측면에서, 라이브러리는 상기 방법에 의해, 그러나 폭스바이러스 조립 억제제의 부재 하에 구축된 라이브러리에 비해 증가된 바이러스 역가를 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 방법의 특정 측면에서, 단리된 폭스바이러스 게놈은 제1 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 인식 부위 및 제2 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 측면에 따르면, 제1 및 제2 바이러스 단편은 바이러스 게놈을 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제로 소화시킨 후, 제1 및 제2 바이러스 단편을 단리함으로써 생성될 수 있다. 특정 측면에서, 단리된 폭스바이러스 게놈은 단리된 백시니아 바이러스 게놈이다. 특정 측면에서, 단리된 백시니아 바이러스 게놈은 WR 게놈 또는 이의 변형된 유도체, 또는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA: Modified Vaccinia virus Ankara) 게놈 또는 이의 변형된 유도체일 수 있다. 특정 측면에서, 제1 및 제2 제한 효소 인식 부위는 백시니아 바이러스 HindIII J 단편에 위치할 수 있다. 특정 측면에서, 제1 제한 효소는 NotI일 수 있다. 특정 측면에서, 제2 제한 효소 부위는 ApaI일 수 있다. 특정 측면에서, 단리된 백시니아 바이러스 게놈은 v7.5/tk 바이러스 게놈 또는 vEL/tk 바이러스 게놈일 수 있다. 특정 측면에서, 헬퍼 바이러스는 계두(fowlpox) 바이러스일 수 있다. 특정 측면에서, 전달 플라스미드의 5' 및 3' 인접 영역은 백시니아 바이러스 티미딘 키나제 유전자와 상동성 재조합을 할 수 있다. 특정 측면에서, 전달 플라스미드의 5' 및 3' 인접 영역은 백시니아 바이러스 HindIII J 단편과 상동성 재조합할 수 있다.

본원에서 제공되는 방법의 특정 측면에서, 각각의 전달 플라스미드는 비제한적으로 pVHE, pVLE 및/또는 pVKE와 같은 플라스미드에 결찰된 관심 삽입 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 각각의 관심 폴리뉴클레오티드는 백시니아 바이러스 감염 세포에서 발현될 수 있는 관심 폴리펩티드의 코딩 영역을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 각각의 관심 폴리뉴클레오티드는 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 조합을 포함하는 항체 또는 항체 서브유닛 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, 각각의 항체 서브유닛 폴리펩티드는 불변 영역 또는 이의 단편, 항체 서브유닛 폴리펩티드의 세포 표면 발현 또는 분비를 유도할 수 있는 신호 펩티드, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 각각의 전달 플라스미드는 관심 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 전사 제어 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 전사 제어 영역은 백시니아 바이러스 감염 세포의 세포질에서 기능한다. 특정 측면에서, 전사 제어 영역은 폭스바이러스 프로모터, 예를 들어, 백시니아 p7.5 프로모터, 백시니아 pEL 프로모터, 또는 백시니아 MH-5 프로모터를 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 방법의 특정 측면에서, 숙주 세포는 변형된 백시니아 바이러스 게놈을 감염성 백시니아 바이러스 입자로 패키징(packaging)할 수 있다. 이 측면에 따르면, 전달 플라스미드 및 제1 및 제2 바이러스 단편은 헬퍼 바이러스를 포함하고 있거나 포함하도록 감염된 포유동물 숙주 세포에 도입될 수 있고, 여기서 숙주 세포는 헬퍼 바이러스의 감염성 바이러스 입자의 생산에 대해서는 비허용성이지만, 변형된 백시니아 바이러스 게놈을 감염성 백시니아 바이러스 입자로 패키징하는 것을 지원한다.

상세한 설명

본 개시내용은 진핵 시스템에서 기능적 관심 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 서브유닛과 같은 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 라이브러리는 기존 방법에 비해 개선된 복잡성 및 다양성을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 관심 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 서브유닛과 같은 결합 분자를 코딩하고 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 발현 라이브러리를 구축하는 방법을 제공하고, 여기서 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 확인되고 발현 라이브러리로부터 단리될 수 있고, 라이브러리는 폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스 벡터에서 구축되며, 라이브러리 스크리닝은 진핵 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포에서 수행되고, 상기 방법은 기존 방법에 비해 복잡성 및 다양성이 증가된 라이브러리를 제공한다.

본 개시내용은 폭스바이러스, 예를 들어 3분자 재조합에 의해 구축된 백시니아 바이러스 벡터를 사용하여 진핵 숙주 세포에서 복잡한 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 구축하는 것을 제공한다. 라이브러리의 복잡성 및 다양성은 라이브러리가 구축된 포유동물 숙주 세포를 구축 과정 동안 일정 시간 동안 폭스바이러스, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 복제의 억제제, 예를 들어 리팜피신과 접촉시킴으로써 개선될 수 있다.

정의

용어 "하나의"("a" 또는 "an") 엔티티는 하나 이상의 해당 엔티티를 지칭하고; 예를 들어, "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "하나의", "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본원에서 교환 가능하게 사용될 수 있다.

또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각을 다른 하나와 함께 또는 다른 하나가 없는 상태로 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 각각의 실시양태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]에는 본 개시내용에 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 용어집이 통상의 기술자에게 제공된다.

단위, 접두사, 및 기호는 SI(Systeme International de Unites) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 기술된다. 본원에서 제공되는 표제는 본 명세서를 전체로서 참조하여 보여줄 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 측면들을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어는 명세서 전체를 참조함으로써 보다 완전하게 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자연 발생적이지 않은" 물질, 조성물, 엔티티, 및/또는 물질, 조성물 또는 엔티티의 임의의 조합, 또는 이들의 임의의 문법적 변형은 "자연 발생적인" 것으로 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해되거나, 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생적"이라고 결정 또는 해석되는, 또는 임의의 시기에 결정 또는 해석될 수 있는 물질, 조성물, 엔티티, 및/또는 물질, 조성물 또는 엔티티의 임의의 조합의 형태를 명시적으로 배제하지만, 오직 이들만을 배제하는 조건적인 용어이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드"뿐 아니라 복수의 "폴리펩티드"를 포함하는 것으로 의도되고, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내는데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 이들 용어와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 및 공지된 보호/차단기, 단백질 분해성 절단 또는 자연 발생적이지 않은 아미노산에 의한 변형에 의한 유도체화를 포함하는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 산물을 지칭하는 것이 의도된다. 폴리펩티드는 생물학적 공급원으로부터 유래하거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이것은 화학 합성을 포함한 임의의 방법으로 생성될 수 있다.

본원에서 개시되는 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 그런 구조를 갖는 것은 아니다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩되었다고 지칭되고, 정의된 3차원 구조를 갖지 않지만 매우 많은 상이한 입체형태를 채택할 수 있는 폴리펩티드는 폴딩되지 않았다고 지칭된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 당단백질은 아미노산, 예를 들어, 세린 또는 아스파라긴의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티(moiety)에 커플링된 단백질을 지칭한다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 이의 자연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 이의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분별, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드일 때, 본원에서 개시되는 바와 같이 단리된 것으로 간주된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자연 발생적이지 않은" 폴리펩티드 또는 이의 임의의 문법적 변형은 "자연 발생적인" 것으로 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해되거나, 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생적"이라고 결정 또는 해석되는, 또는 임의의 시기에 결정 또는 해석될 수 있는 폴리펩티드의 형태를 명시적으로 배제하지만, 오직 이들만을 배제하는 조건적인 용어이다.

본원에서 개시되는 다른 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체, 또는 변이체, 및 이의 임의의 조합이다. 본원에서 개시되는 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 항체 또는 폴리펩티드의 특성 중 적어도 일부를 보유하는, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 예를 들어 본원의 다른 곳에서 논의되는 특정 항체 단편 이외에, 결실 단편뿐만 아니라 단백질 분해 단편을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 변이체는 상기 설명된 단편, 및 치환, 결실, 또는 삽입으로 인하여 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 또한 포함한다. 특정 측면에서, 변이체는 자연 발생적이지 않은 것일 수 있다. 자연 발생적이지 않은 변이체는 관련 기술 분야에 알려진 돌연변이 유발 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 유도체는 원래의 폴리펩티드에서 발견되지 않는 추가의 특징을 나타내기 위해서 변경된 폴리펩티드이다. 그 예는 융합 단백질을 포함한다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "유도체"는 기능적 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 갖는 대상 폴리펩티드를 지칭할 수도 있다. 또한, 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 유도체를 포함하는 펩티드가 "유도체"로서 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린을 치환할 수 있고, 5-히드록시리신이 리신을 치환할 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘을 치환할 수 있고; 호모세린이 세린을 치환할 수 있고; 오르니틴이 리신을 치환할 수 있다.

"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 패밀리는 관련 기술 분야에서 정의되어 있고, 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌으로 티로신을 치환하는 것은 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 및 항체의 서열에서 보존적 치환은 결합 분자, 예를 들어 면역글로불린 또는 항체가 결합하는 항원에 대한, 해당 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체의 결합을 방해하지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem . 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng . 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:412-417 (1997)] 참조).

용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포함하는 것이 의도되며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.

"단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 이의 천연 환경으로부터 분리된 임의 형태의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의도한다. 예를 들어, 겔 정제된 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터에 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주될 것이다. 또한, 클로닝을 위한 제한 부위를 갖도록 조작된 폴리뉴클레오티드 분절, 예를 들어 PCR 산물은 "단리된" 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 완충액 또는 염수와 같은 비천연 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 폴리뉴클레오티드의 생체 내 또는 시험관 내 RNA 전사체를 포함하고, 전사체는 자연에서 발견되는 것이 아니다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 그러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자연 발생적이지 않은" 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 임의의 문법적 변형은 "자연 발생적인" 것으로 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해되거나, 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생적"이라고 결정 또는 해석되는, 또는 임의의 시기에 결정 또는 해석될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 형태를 명시적으로 배제하지만, 오직 이들만을 배제하는 조건적인 용어이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않더라도, 코딩 영역의 일부로 간주할 수 있지만, 임의의 인접 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 인자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어 단일 벡터 상에 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들어 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 포함할 수 있거나, 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있고, 예를 들어 단일 벡터가 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 개별적으로 코딩할 수 있다. 또한, 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 또 다른 코딩 영역에 융합되거나 융합되지 않는 이종성 코딩 영역을 포함할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능성 도메인과 같은 특화된 요소 또는 모티프를 코딩하는 것들을 비제한적으로 포함한다.

특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 결합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 결합은 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드의 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 유도하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합될 때이다. 프로모터 기능이 유도되어 원하는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사를 일으키고, 발현 조절 서열이 유전자 산물의 발현을 유도하는 능력 또는 DNA 주형이 전사되는 능력이 2개의 DNA 단편 사이의 연결의 특성에 의해 방해받지 않는다면, 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 코딩 영역 및 그와 결합된 프로모터)은 "작동 가능하게 결합된" 것이다. 따라서, 프로모터가 해당 핵산의 전사를 수행할 수 있다면, 프로모터 영역은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 작동 가능하게 결합되어 있을 것이다. 프로모터는 소정의 세포에서 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호는 세포 특이적 전사를 유도하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 결합될 수 있다.

다양한 전사 제어 영역은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 이들은 비제한적으로, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 결합된 최조기(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 분절(이로 제한되지 않음)을 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같이 척추동물 유전자로부터 유래한 것뿐만 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적인 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라, 림포카인 유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도될 수 있는 프로모터)를 포함한다. 특정 측면에서, 전사 제어 영역은 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 논의되는 폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스 전사 제어 영역일 수 있다.

유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스로부터 유래한 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES(CITE 서열로도 언급됨))를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 또는 리보솜 RNA 형태의 RNA일 수 있다.

폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원에 개시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 코딩하는 추가의 코딩 영역과 결합될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은 성장하는 단백질 사슬의 조면 소포체를 통한 방출이 시작되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가질 수 있고, 이것은 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비되는 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성한다는 것을 알고 있다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 항체 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작동 가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 별법으로, 이종성 포유동물 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화 인자(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 폴리뉴클레오티드 영역은 숙주 세포, 예를 들어 진핵 또는 포유동물 숙주 세포에서 상동성 재조합을 겪을 수 있다면 "상동성"인 것으로 간주된다. 상동성 재조합은 2개의 유사하거나 동일한 DNA 분자 사이에서 뉴클레오티드 서열이 교환되는 일종의 유전자 재조합이다. 일반적으로, 상동성 재조합은 2개의 단일 폴리뉴클레오티드 가닥, 예를 들어, 이중 가닥 DNA의 돌출 말단이 상동성 염기쌍으로 인해 서로 어닐링할 수 있는 경우에 발생할 수 있다. 가닥들이 100% 상보성일 필요는 없고, 더욱이, 단일 가닥 영역은 특히 길어야 할 필요는 없다. 상동성 재조합의 많은 메커니즘 및 기능은 분자 생물학 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해되고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "라이브러리"는 예를 들어, 단일 동물 종, 조직 유형, 기관, 또는 세포 유형으로부터의 기원을 통해 관련되는 폴리뉴클레오티드의 군과 같은 폴리뉴클레오티드의 대표적인 속(genus)이고, 여기서 라이브러리는 총체적으로 폴리뉴클레오티드의 제시된 속 내에 적어도 2개의 상이한 종을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 총체적으로 폴리뉴클레오티드의 제시된 속 내에, 예를 들어 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 100, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 또는 10⁹개의 상이한 종을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 관심 폴리펩티드를 함유하는 복수의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 복수의 항체 서브유닛 폴리펩티드, 예를 들어, 중쇄 서브유닛 폴리펩티드 또는 경쇄 서브유닛 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 이러한 맥락에서, 본원에서 제공되는 "라이브러리"는 공통적인 속의 폴리뉴클레오티드를 포함하고(여기서, 속은 특정 유형 및 클래스의 항체 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드임), 예를 들어, 라이브러리는 인간 μ, γ-1, γ-2, γ-3, γ-4, α-1, α-2, ε, 또는 δ 중쇄, 또는 인간 κ 또는 λ 경쇄를 코딩할 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에 따라 구축된 임의의 하나의 라이브러리의 각각의 구성원이 동일한 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 및/또는 막 고정 도메인을 코딩할 수 있지만, 라이브러리는 총체적으로 공통적인 불변 영역과 관련된 적어도 2, 적어도 5, 또는 적어도 10, 100, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 또는 10⁹개의 상이한 가변 영역을 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 라이브러리는 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터에서 구축되며, 따라서 각각 관심 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복수의 변형된 폭스바이러스 게놈을 포함한다. 본원에서 제공되는 라이브러리의 "복잡성" 또는 "다양성"은 라이브러리 내에 포함된 상이한 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈의 수를 지칭한다. 따라서, 변형된 폭스바이러스 게놈의 라이브러리는 동일한 수의 전체 바이러스 게놈을 갖는 또 다른 라이브러리보다 더 큰 복잡성을 갖는다고 말할 수 있고, 여기서 보다 복잡한 라이브러리는 전체 폭스바이러스 게놈당 보다 많은 수의 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈을 포함한다.

특정 측면에서, 라이브러리는 각각 가변 영역, 예컨대 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 둘 모두를 포함하는 복수의 항체 단일쇄 단편, 예를 들어 ScFv 단편을 코딩할 수 있다.

본 개시내용은 관심 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 서브유닛 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 구축하는 방법을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 관심 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에서 설명되는 방법에 따라 백시니아 바이러스 발현 벡터에서 구축된 항체 서브유닛 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 제공한다.

"수여자 세포" 또는 "숙주 세포" 또는 "세포"는 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리가 구축되고/되거나 증식될 수 있는 세포 또는 세포 집단을 의미한다. 본원에서 제공되는 숙주 세포는 전형적으로 진핵 세포 또는 세포주, 예를 들어 척추동물, 포유동물, 설치류, 마우스, 영장류, 또는 인간 세포 또는 세포주이다. "숙주 세포의 집단"은 본원에서 제공되는 "라이브러리"가 구축, 증식 및/또는 발현될 수 있는 배양된 세포 집단을 의미한다. 백시니아 바이러스 감염성을 허용하는 임의의 숙주 세포가 본 개시내용에서 제공되는 방법에 적합하다. 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 숙주 세포는 고체 기재에 부착되어 성장하는 숙주 세포와 같이 부착성일 수 있거나, 또는 별법으로 숙주 세포는 현탁 상태일 수 있다.

본원에서 제공되는 숙주 세포는 구성적 분비 경로를 포함할 수 있고, 여기서 단백질, 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에 의해 구축된 라이브러리, 예를 들어 항체 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리에 의해 발현되는 관심 단백질은 세포막 표면 상에 발현되어 세포의 내부로부터 분비되거나 가용성 폴리펩티드로서 완전히 분비된다. 특정 측면에서, 생포막 표면 상에 발현되는 관심 단백질은 예를 들어 숙주 세포, 예를 들어 세포외 피막형 백시니아 바이러스, 또는 EEV에 의해 생성된 피막형 바이러스의 표면에서 발현된다. 항체 서브유닛 폴리펩티드의 막 결합 형태는 하나 이상의 정지-전달 신호 또는 "막관통 도메인"의 존재에 의해 ER 막에 유지된다는 점을 제외하고는 ER 내강을 통과하여 완전히 분비되는 형태와 동일한 경로를 따른다. 막관통 도메인은 막을 가로지르면서 알파 나선형 입체형태를 취하는 약 20개 아미노산의 소수성 스트레치이다. 막에 내재된 단백질은 원형질막의 인지질 이중층에 고정된다. 관심 폴리펩티드의 막관통 형태, 예를 들어 막에 고정된 항체 중쇄 폴리펩티드는 전형적으로, 완전히 분비되는 형태처럼 아미노 말단 신호 펩티드를 이용한다.

매우 다양한 막 결합 단백질 및/또는 완전히 분비되는 단백질에 대한 신호 펩티드, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인은 공지되어 있다.

적합한 막관통 도메인은 백시니아 바이러스 EEV 특이적 HA 단백질 A56R, 또는 EEV 특이적 백시니아 바이러스 막관통 단백질 A33R, A34R, A36R, 또는 B5R을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 2013년 10월 31일 공개된 미국 특허 출원 공개 제2013/0288927호를 참조한다. 특정 측면에서, EEV 특이적 단백질, 예를 들어, 백시니아 바이러스 단백질 F13L은 팔미토일화를 통해 바이러스 외피에 고정될 수 있다. 예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 2016년 4월 22일 출원된 미국 특허 가출원 제62/326,501호를 참조한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 분자"는 이의 가장 넓은 의미에서 수용체, 예를 들어 에피토프 또는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 결합 분자는 본원에서 설명되는 하나 이상의 "항원 결합 도메인"을 포함할 수 있다. 결합 분자의 비제한적인 예는 항원 특이적 결합을 보유하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

용어 "결합 도메인" 및 "항원 결합 도메인"은 본원에서 교환 가능하게 사용되고, 에피토프에 특이적으로 결합하기 위해 필수적이고 충분한 결합 분자의 영역을 지칭한다. 예를 들어, "Fv", 예를 들어 2개의 별개의 폴리펩티드 서브유닛으로서 또는 단일 사슬로서 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 "결합 도메인"으로 간주된다.

다른 항원 결합 도메인은 낙타류 종으로부터 유래한 항체의 가변 중쇄(VHH), 또는 피브로넥틴 스캐폴드에서 발현되는 6개의 항체 상보성 결정 영역(CDR)을 비제한적으로 포함한다. 본원에서 설명되는 "결합 분자"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 초과의 "항원 결합 도메인"을 포함할 수 있다.

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 교환 가능하게 사용될 수 있다. 항체(또는 본원에 개시된 바와 같은 이의 단편, 변이체 또는 유도체)는 적어도 중쇄의 가변 영역(낙타류 종의 경우) 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 척추동물계에서 기본적인 항체 구조는 비교적 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조한다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 항체의 작은 항원 결합 단편으로부터 완전한 크기의 항체, 예를 들어 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 IgG 항체, 4개의 완전한 중쇄 및 4개의 완전한 경쇄를 포함하고 J 사슬 및/또는 분비 성분을 포함할 수 있는 IgA, 또는 10 또는 12개의 완전한 중쇄 및 10 또는 12개의 완전한 경쇄를 포함하고 J 사슬을 포함할 수 있는 IgM에 이르는 모든 것을 포함한다.

용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 클래스의 폴리펩티드를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)과 이들 중 몇몇 하위클래스(예를 들어, γ1-γ4 또는 α1-α2)로 분류된다는 것을 이해할 것이다. 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 결정하는 것은 이 사슬의 특성이다. 항체 하위클래스(이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, IgA₂ 등은 잘 특성화되어 있으며, 기능적 분화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 이소형의 각각의 변형된 버전은 본 개시내용에 비추어 통상의 기술자에게 쉽게 인식될 수 있고, 따라서 본 개시내용의 범위에 포함된다.

경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 항체가 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 공유 디술피드 연결 또는 비공유 연결에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 갈래로 된 말단부의 N-말단으로부터 각각의 사슬의 기부에 있는 C-말단으로 이어진다. 특정 항체, 예를 들어, IgG 항체의 기본 구조는 디술피드 결합을 통해 공유 연결된 2개의 중쇄 서브유닛 및 2개의 경쇄 서브유닛을 포함하여, 본원에서 "H2L2" 구조로도 지칭되는 "Y" 구조를 형성한다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 결정기를 포함한다. 특정 측면에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 술포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기를 포함할 수 있고, 특정 측면에서 3차원의 구조적 특징, 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 표적 영역이다.

"다중특이적 결합 분자 또는 항체" 또는 "이중특이적 결합 분자 또는 항체"는 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 결합 분자, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. "단일특이적"은 오직 하나의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다.

용어 "표적"은 결합 분자에 의해 결합될 수 있는 물질을 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 표적은 예를 들어 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자일 수 있다. 또한, "표적"은 예를 들어 결합 분자에 의해 결합될 수 있는 에피토프를 포함하는 세포, 기관 또는 유기체일 수 있다.

경쇄 및 중쇄 둘 모두는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"이 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 가변(VL) 및 중쇄 가변(VH) 부분 둘 모두의 가변 영역(본원에서 "가변 도메인"으로 교환 가능하게 불릴 수 있음)이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 이해할 것이다. 반대로, 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인(예를 들어, CH1, CH2 또는 CH3)은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 생물학적 특성을 부여한다. 관례에 따라, 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노 말단으로부터 보다 멀어지면서 불변 영역 도메인의 번호는 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고, C-말단 부분은 불변 영역이고; CH3(또는 IgM의 경우 CH4) 및 CL 도메인은 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단에 존재한다.

전형적인 항체 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 이의 3차원 배열을 취할 때 항원 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는 아미노산의 짧고 비연속적인 서열이다. "프레임워크" 영역으로 언급되는 항원 결합 도메인의 나머지 아미노산은 낮은 분자 사이의 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 주로 β-시트 형태를 채택하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프, 일부 경우에 상기 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬간 비공유 상호작용에 의해 CDR을 정확한 배향으로 배치시키는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보성인 표면을 한정한다. 이 상보성 표면은 이의 동족 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 구성하는 아미노산은 다양하고 상이한 방식으로 정의되었기 때문에 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있다(그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol . Biol., 196:901-917 (1987)] 참조).

특정 항체 분자는 또한 이펙터 분자의 결합에 의해 매개되는 이펙터 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 항체에 대한 보체의 CI 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화(opsonization) 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민증과 관련될 수 있다. 또한, 특정 항체는 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 항체 Fc 영역의 Fc 영역을 통해 세포에 결합할 수 있다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함하고 이로 제한되지 않는 상이한 클래스의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체가 코팅된 입자의 흡입(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해(항체 의존성 세포 매개 세포독성, 또는 ADCC로 불림), 염증 매개체의 방출, 태반 이동 및/또는 항체 생산의 제어를 비제한적으로 포함하는 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발할 수 있다.

관련 기술 분야에서 사용되고/되거나 허용되는 용어의 정의가 2개 이상일 경우, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 명시적으로 반대로 언급되지 않는다면 이러한 의미를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 가변 영역 내에서 발견되는 인접하지 않는 항원 결합 부위를 설명하는 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 이러한 특정 영역은 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 [Chothia et al., J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]에 의해 설명된 바 있다. 카바트 및 코티아 정의는 서로 비교할 때 아미노산의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의(또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 정의)의 적용은 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 언급된 각각의 참고 문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산은 비교로서 하기 표 1에 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 아미노산의 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 다양할 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 아미노산이 특정 CDR을 포함한다는 것을 통상적인 방식으로 결정할 수 있다.

표 1: CDR 정의^*

^*표 1에서의 모든 CDR 정의의 넘버링은 카바트 등에 의해 제시된 넘버링 관례(아래 참조)에 따른 것이다.

또한, 항체 가변 도메인은 CDR을 포함하는 가변 영역 분절을 확인하기 위해, 예를 들어 IMGT 정보 시스템(www://imgt.cines.fr/)(IMGT®/V-Quest)을 사용하여 분석될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Brochet et al., Nucl . Acids Res.,36:W503-508, 2008] 참조).

카바트 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 서열 자체를 넘어서는 어떠한 실험 데이터에 의존하지 않고도, 임의의 가변 도메인 서열에 이 "카바트 넘버링" 시스템을 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "카바트 넘버링"은 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 그러나, 카바트 넘버링 시스템의 사용이 명시적으로 언급되지 않는 한, 본 개시내용에서 모든 아미노산 서열에 대해 연속적인 넘버링이 사용된다.

결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프 결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 디술피드 연결 Fv(sdFv), 단일 도메인 항체, 예컨대 낙타류 VHH 항체, VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. ScFv 분자는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다. 본 개시내용에 포함되는 면역글로불린 또는 항체 분자는 항체 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위클래스일 수 있다. 또한, 2가이고 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR) 가변 도메인(VNAR)을 포함하는 단일쇄를 포함하는 IgNAR 이소형(예를 들어, 상어로부터의)이 고려된다(문헌 [Walsh et al., Virology 411:132-141, 2011] 참조).

"특이적으로 결합한다"는 일반적으로 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체가 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합한다는 것, 및 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 결합 분자는 무작위의 관련없는 에피토프에 결합하는 것보다 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 보다 쉽게 결합할 때, 그 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다. 용어 "특이성"은 특정 결합 분자가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 평가하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 결합 분자 "A"는 결합 분자 "B"보다 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주할 수 있거나, 결합 분자 "A"는 관련 에피토프 "D"에 대해서보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 언급될 수 있다.

결합 분자, 예를 들어, 본원에서 개시되는 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 5 X 10^-2 sec^-1, 10^-2 sec^-1, 5 X 10^-3 sec^-1, 10^-3 sec^-1, 5 X 10^-4 sec^-1, 10^-4 sec^-1, 5 X 10^-5 sec^-1, 또는 10^-5 sec^-1, 5 X 10^-6 sec^-1, 10^-6 sec^-1, 5 X 10^-7 sec^-1 또는 10^-7 sec^-1 이하의 오프 레이트(k(off))로 표적 항원에 결합한다고 언급될 수 있다.

결합 분자, 예를 들어, 본원에서 개시되는 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 10³ M^-1 sec^-1, 5 X 10³M^-1 sec^-1, 10⁴ M^-1 sec^-1, 5 X 10⁴ M^-1 sec^-1, 10⁵ M^-1 sec^-1, 5 X 10⁵ M^-1 sec^-1, 10⁶ M^-1 sec^-1, 또는 5 X 10⁶ M^-1 sec^-1 또는 10⁷ M^-1 sec^-1 이상의 온 레이트(k(on))로 표적 항원에 결합한다고 언급될 수 있다.

결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 제시된 에피토프에 대한 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 어느 정도 차단하는 정도까지 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 상기 에피토프에 대한 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 언급된다. 경쟁적 억제는 관련 기술 분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 경합 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 결합 분자는 제시된 에피토프에 대한 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 억제한다고 언급될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 예를 들어 항체 분자의 하나 이상의 항원 결합 도메인을 갖는 개개의 에피토프의 결합 강도의 척도를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]의 27-28 페이지를 참조한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합력"은 항원 결합 도메인의 집단과 항원 사이의 복합체의 전체 안정성을 나타낸다. 예를 들어, 상기 할로우(Harlow)의 문헌 29-34 페이지를 참조한다. 결합력은 특정 에피토프를 갖는 집단 내의 개별 항원 결합 도메인의 친화도, 및 항체와 항원의 결합가 둘 모두와 관련된다. 예를 들어, 2가 모노클로날 항체와, 중합체와 같이 고도로 반복하는 에피토프 구조를 갖는 항원 사이의 상호작용은 높은 결합력 중 하나일 것이다. 세포 표면에서 고밀도로 존재하는 수용체와 2가 모노클로날 항체 사이의 상호작용도 높은 결합력을 가질 것이다.

본원에서 개시되는 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 이의 교차 반응성의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "교차 반응성"은 항원에 특이적인 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체가 제2 항원과 반응하는 능력을 지칭하고, 이것은 2개의 상이한 항원 물질 사이의 관련성의 척도이다. 따라서, 결합 분자는 이의 형성을 유도한 에피토프 이외의 다른 에피토프에 결합하면 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 보완적인 구조적 특징을 다수 포함하고, 일부 경우에 원래의 에피토프보다 실질적으로 더 적합할 수 있다.

결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 항원에 대한 이의 결합 친화도의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 5 x 10^-2M, 10^-2M, 5 x 10^-3M, 10^-3M, 5 x 10^-4M, 10^-4M, 5 x 10^-5M, 10^-5M, 5 x 10^-6M, 10^-6M, 5 x 10^-7M, 10^-7M, 5 x 10^-8M, 10^-8M, 5 x 10^-9M, 10^-9M, 5 x 10^-10M, 10^-10M, 5 x 10^-11M, 10^-11M, 5 x 10^-12M, 10^-12M, 5 x 10^-13M, 10^-13M, 5 x 10^-14M, 10^-14M, 5 x 10^-15M, 또는 10^-15M 이하의 해리 상수 또는 K_D로 항원에 결합할 수 있다.

단일쇄 항체 또는 다른 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편은 단독으로, 또는 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인, J-쇄 또는 분비 성분 중 하나 이상과 조합하여 존재할 수 있다. 또한, 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인, J-쇄 또는 분비 성분 중 하나 이상과 가변 영역(들)의 임의의 조합을 포함할 수 있는 항원 결합 단편이 포함된다. 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조류 및 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 항체는 인간, 뮤린, 당나귀, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 야마, 말 또는 닭 항체일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 가변 영역은 콘드릭토이드(condricthoid)(예를 들어, 상어)에서 기원한 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간" 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 항체 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 항체에 대해 트랜스제닉 동물로부터 단리된 항체를 포함하며, 예를 들어, 아래에서 설명되고 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati 등)에 기재된 바와 같이 일부 경우에는 내인성 면역글로불린을 발현할 수 있고, 일부 예에서는 그렇지 않다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중쇄 서브유닛" 또는 "중쇄 도메인"은 항체 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 결합 분자, 예를 들어 중쇄 서브유닛을 포함하는 항체는 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편.

결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 단편의 중쇄 서브유닛은 상이한 항체 분자로부터 유래된 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 서브유닛은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 서브유닛은 부분적으로 IgG1 분자 및 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 서브유닛은 부분적으로 IgG1 분자 및 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쇄 서브유닛" 또는 "경쇄 도메인"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 서브유닛은 VL 또는 CL(예를 들어, Cκ 또는 Cλ) 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.

결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들)의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 항원의 부분은 "에피토프" 또는 "항원 결정기"이다. 표적 항원은 단일 에피토프 또는 적어도 2개의 에피토프를 포함할 수 있고, 항원의 크기, 입체형태 및 유형에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득되거나 유래되고 불변 부분(무손상, 부분적인 또는 변형된 것일 수 있음)은 제2 종으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원(예를 들어, 마우스 또는 영장류)으로부터 유래할 것이고, 불변 영역은 인간의 것이다.

용어 "다중특이적 항체" 또는 "이중특이적 항체"는 단일 항체 분자 내의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 지칭한다. 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는, 표준 항체 구조 이외의 다른 결합 분자가 구축될 수 있다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체에 의한 에피토프 결합은 동시적 또는 순차적일 수 있다. 트리오마(trioma) 및 하이브리드 하이브리도마는 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 세포주의 2가지의 예이다. 또한, 이중특이적 항체는 재조합 수단에 의해 구축될 수 있다(Stroehlein and Heiss, Future Oncol . 6:1387-94 (2010); Mabry and Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)). 이중특이적 항체는 또한 디아바디(diabody)일 수 있다. 따라서, 다량체인 이중특이적 결합 분자는 잠재적으로 각각 상이한 특이성을 갖는 여러 가지의 상이한 항원 결합 도메인을 보유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 가변 도메인이 CDR 또는 프레임워크 영역 중 하나에서 하나 이상의 아미노산의 적어도 부분적인 치환에 의해 변경된 항체를 지칭한다 지역. 특정 측면에서, 공지된 특이성을 갖는 항체로부터의 전체 CDR은 이종성 항체의 프레임워크 영역 내로 그라프팅될 수 있다. 다른 CDR은 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 하위클래스의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR은 또한 상이한 클래스의 항체로부터, 예를 들어 상이한 종의 항체로부터 유래될 수 있다. 공지된 특이성의 비인간 항체로부터의 하나 이상의 "공여자" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역에 그라프팅된 조작된 항체는 본원에서 "인간화 항체"로 언급된다. 특정 측면에서, 모든 CDR이 공여자 가변 영역으로부터의 완전한 CDR로 대체되는 것은 아니지만, 공여자의 항원 결합 능력은 여전히 수여자 가변 도메인으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호 및 제6,180,370호에 제시된 설명을 고려하여, 통상적인 실험의 수행 또는 시행착오 시험에 의해 기능적으로 조작된 또는 인간화된 항체를 얻는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에서 잘 수행될 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된"은 합성 수단(예를 들어, 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부 조합)에 의한 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 조작을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합" 또는 다른 문법적 동등 표현은 교환 가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함한 수단에 의해 두 가지 이상의 요소 또는 성분이 함께 결합됨을 의미한다. "인-프레임(in-frame) 융합"은 원래의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 번역 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 ORF를 결합시켜 연속적인 보다 긴 ORF를 형성하는 것을 지칭한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래의 ORF에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 분절(이 분절은 통상 자연에서는 그와 같이 결합되어 있지 않음)을 함유하는 단일 단백질이다. 리딩 프레임이 이와 같이 융합된 분절 전체에 걸쳐 연속적이더라도, 분절은 예를 들어 인-프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 항체 가변 영역의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인-프레임으로 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속된 폴리펩티드의 일부로서 동시 번역되는 한, 적어도 하나의 항체 프레임워크 영역 또는 추가의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.

폴리펩티드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 아미노 말단으로부터 카르복실 말단 방향으로의 폴리펩티드 내의 아미노산의 순서이며, 여기서 서열에서 서로 이웃하는 아미노산은 폴리펩티드의 1차 구조에서 연속적이다.

폴리펩티드의 또 다른 부분에 대해 "아미노 말단" 또는 "N-말단"인 폴리펩티드 부분은 순차적인 폴리펩티드 사슬에서 먼저 존재하는 부분이다. 이와 유사하게, 폴리펩티드의 또 다른 부분에 대해 "카르복시 말단" 또는 "C-말단"인 폴리펩티드 부분은 순차적인 폴리펩티드 사슬에서 나중에 존재하는 부분이다. 예를 들어, 전형적인 항체에서, 가변 도메인은 불변 영역에 대해 "N-말단"이고, 불변 영역은 가변 영역에 대해 "C-말단"이다.

본원에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학적 물질, 예를 들어 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이 과정은 유전자 넉다운뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현 둘 모두를 비제한적으로 포함하는, 세포 내 유전자의 기능적 존재의 제시를 포함한다. 여기에는 메신저 RNA(mRNA)로의 유전자의 전사 및 상기 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역이 비제한적으로 포함된다. 원하는 최종 산물이 생화학적 물질이면, 발현은 그 생화학적 물질 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에서 설명되는 유전자 산물은 폴리아데닐화와 같이 전사 후에 변형된 핵산, 또는 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 결합, 단백질 분해성 절단 등과 같이 번역 후에 변형된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

용어 "진핵생물" 또는 "진핵 유기체"는 원생동물, 진균, 효모, 녹조류, 단세포 식물, 다세포 식물, 및 척추동물 및 무척추동물 둘 모두에 속하는 모든 동물를 비롯한 동물, 식물 및 원생생물계의 모든 유기체를 포함하는 것으로 의도된다. 이 용어는 박테리아 또는 바이러스를 포함하지 않는다. "진핵 세포"는 단수의 "진핵 세포"뿐만 아니라 복수의 "진핵 세포"를 포함하는 것으로 의도되고, 진핵생물로부터 유래한 세포를 포함한다.

용어 "척추동물"은 단수의 "척추동물"뿐만 아니라 복수의 "척추동물"을 포함하는 것으로 의도되고, 포유동물 및 조류뿐만 아니라 어류, 파충류, 및 양서류를 포함한다.

용어 "포유동물"은 단수의 "포유동물" 및 복수의 "포유동물"을 포함하는 것으로 의도되고, 인간; 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 및 침팬지; 개과, 예컨대 개 및 늑대; 고양잇과, 예컨대 고양이, 사자, 및 호랑이; 말과, 예컨대 말, 당나귀, 및 얼룩말, 식용 동물, 예컨대 소, 돼지 및 양; 유제류, 예컨대 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니 피그; 및 곰을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 포유동물은 인간 대상체이다.

용어 "조직 배양" 또는 "세포 배양" 또는 "배양" 또는 "배양하기"는 세포 구조의 보존, 세포 기능의 보존, 추가의 분화, 또는 상기 세 가지 모두를 허용하는 조건 하에서 시험관 내에서의 식물 또는 동물 조직 또는 세포의 유지 또는 성장을 지칭한다. "1차 조직 세포"는 조직으로부터 직접 채취한 세포, 즉 유기체에서 동일한 기능을 수행하는 동일한 종류의 세포 집단이다. 이러한 조직 세포를 단백질 분해 효소인 트립신으로 처리하면, 예를 들어 배양 플레이트 상에 접종될 때 세포 구조를 성장시키거나 유지하는 개개의 1차 조직 세포로 해리시킬 수 있다. 조직 배양에서 1차 세포의 증식으로 인한 세포 배양을 "2차 세포 배양"이라고 한다. 대부분의 2차 세포는 유한한 횟수로 분열한 후 사멸한다. 그러나, 몇몇의 2차 세포는 이 "위기 기간"을 통과할 수 있으며, 그 후에 이들은 무한히 증식하여 연속적인 "세포주"를 형성할 수 있다. 세포가 배양되는 액체 배지는 본원에서 "배양 배지(들)"라고 지칭한다. 원하는 분자, 예를 들어, 바이러스 또는 단백질, 예를 들어, 항체 분자가 세포 배양 중에 그 안에 분비된 배양 배지는 "조건화 배지"로 지칭될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "확인하다"는 원하는 분자, 예를 들어, 원하는 특징 또는 기능을 갖는 관심 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이러한 분자의 다수 또는 라이브러리로부터 구별하는 방법을 지칭한다. 확인 방법은 "선택" 및 "스크리닝" 또는 "패닝"을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "선택" 방법은 원하는 분자를 라이브러리로부터 직접 분리할 수 있는 방법이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "스크리닝" 또는 "패닝" 방법은 원하는 분자를 포함하는 풀에 대해 원하는 분자를 검출할 수 있는 검정을 수행하는 방법이다. 분자가 검출된 풀의 분취액을 이어서 연속적으로 보다 작은 풀로 나누고, 이를 원하는 분자로부터 고도로 농축된 풀을 얻을 때까지 유사하게 검정한다.

폭스바이러스 벡터

본원에서 제공되는 방법에 따라 구축된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 폭스바이러스 벡터에서 구축될 수 있다. "폭스바이러스"는 코르도폭스비리대(Chordopoxviridae)(척추동물 폭스바이러스) 및 엔토모폭스비리대(Entomopoxviridae) (곤충 폭스바이러스)를 포함하는 폭스비리대(Poxviridae) 패밀리의 임의의 구성원을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [B. Moss in: Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2080 (1990)]을 참조한다. 코르도폭스바이러스는 특히 다음과 같은 속을 포함한다: 오르토폭스바이러스(예를 들어, 백시니아, 바리올라 바이러스, 라쿤 폭스바이러스); 아비폭스바이러스(예를 들어, 계두); 카프리폭스바이러스(예를 들어, 양두(sheeppox)), 레포리폭스바이러스(예를 들어, 토끼(쇼프(Shope)) 섬유종 및 점액종); 및 수이폭스바이러스(예를 들어, 돈두(swinepox)). 엔토모폭스바이러스는 3개의 속, 즉 A, B 및 C를 포함한다. 백시니아 바이러스는 오르토폭스바이러스의 원형이며, 이종성 단백질의 발현을 위한 벡터로서 개발되어 잘 특성화되어 있다.

폭스바이러스는 이의 큰 크기 및 복잡성에 의해 구별되고, 유사하게 크고 복잡한 게놈을 포함한다. 특히, 폭스바이러스 복제는 숙주 세포의 세포질 내에서 전적으로 일어난다. 폭스바이러스 게놈의 중앙 부분은 유사하지만, 바이러스 게놈의 말단 부분은 더 가변적이다. 따라서, 폭스바이러스 게놈의 중앙 부분은 복제와 같이 모든 폭스바이러스에 공통적인 필수 기능을 담당하는 유전자를 가지고 있다고 생각된다. 이와 대조적으로, 폭스바이러스 게놈의 말단 부분은 상이한 폭스바이러스 사이에서 다양한 병원성 및 숙주 범위와 같은 특성에 대한 책임이 있는 것으로 보이며, 이는 조직 배양에서 바이러스 복제에 필수적이지 않을 수 있다. 결과적으로, 폭스바이러스 게놈이 DNA 단편의 재배열 또는 제거 또는 외인성 DNA 단편의 도입에 의해 변형되는 경우, 외인성 DNA의 도입에 의해 재배열, 제거 또는 붕괴되는 자연 발생 DNA의 부분은 조직 배양에서 바이러스의 복제 및 감염성 비리온의 경우 생산에 필수적이지 않은 것으로 생각되는 영역, 예를 들어 더 먼 영역에 존재할 수 있다.

자연 발생적인 백시니아 바이러스 게놈은 역위(inverted) 말단 반복체를 특징으로 하는 약 186,000개 염기쌍(bp)의 가교결합된 이중 가닥 선형 DNA 분자이다. 백시니아 바이러스의 게놈은 완전히 서열결정되었고, 다양한 비필수 영역이 백시니아 바이러스 게놈에서 확인되었다. 예를 들어, 문헌 [Perkus, M. E., et al., Virology 152:285-97 (1986); 및 Kotwal, G. J. and Moss B., Virology 167:524-37]을 참조한다. 외래 유전자를 백시니아 바이러스에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 비필수 영역은 게놈의 HindIII J 단편에 위치한 티미딘 키나제 유전자좌이다. 특정 백시니아 바이러스 벡터에서, tk 유전자좌는 1 또는 2개의 고유한 제한 효소 부위를 포함하도록 조작되어, 라이브러리 생성을 위한 3분자 재조합 방법을 편리하게 사용할 수 있다. 하기 설명 및 자우더러의 PCT 공개 WO 00/028016을 참조한다.

관심 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 폭스바이러스 감염 세포의 세포질에서 기능하는 전사 제어 영역과 작동 가능하게 결합한 상태 하에 폭스바이러스 벡터, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터 내로 삽입될 수 있다.

폭스바이러스 전사 제어 영역은 프로모터 및 전사 종결 신호를 포함한다. 폭스바이러스에서 유전자의 발현은 일시적으로 조절되고, 초기, 중기, 및 후기 유전자의 프로모터는 다양한 구조를 갖는다. 특정 폭스바이러스 유전자는 구성적으로 발현되고, 이들 "초기-후기(early-late)" 유전자의 프로모터는 하이브리드 구조를 보유한다. 합성 초기-후기 프로모터도 또한 개발되었다. 문헌 [Hammond J. M., et al., J. Virol. Methods 66:135-8 (1997); Chakrabarti S., et al., Biotechniques 23:1094-7 (1997)]을 참조한다. 임의의 폭스바이러스 프로모터가 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있다.

초기 프로모터의 예는 7.5 kD 프로모터(또한 후기 프로모터임), DNA pol 프로모터, tk 프로모터, RNA pol 프로모터, 19 kD 프로모터, 22 kD 프로모터, 42 kD 프로모터, 37 kD 프로모터, 87 kD 프로모터, H3' 프로모터, H6 프로모터, D1 프로모터, D4 프로모터, D5 프로모터, D9 프로모터, D12 프로모터, I3 프로모터, M1 프로모터, 및 N2 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Moss, B., "Poxviridae and their Replication" IN Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2088 (1990)]을 참조한다. 백시니아 바이러스 및 다른 폭스바이러스에서 전사된 초기 유전자는 전사 종결 신호 TTTTTNT를 인식하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 전사는 일반적으로 이 신호의 약 50 bp 상류에서 종결된다. 따라서, 이종성 유전자가 폭스바이러스 초기 프로모터로부터 발현되는 경우, 상기 유전자에 대한 코딩 영역에서 상기 신호의 발생을 제거하는데 유의하여야 한다. 예를 들어, 문헌 [Earl, P. L., et al., J. Virol. 64:2448-51 (1990)]을 참조한다.

후기 프로모터의 예는 7.5 kD 프로모터, MIL 프로모터, 37 kD 프로모터, 11 kD 프로모터, 11L 프로모터, 12L 프로모터, 13L 프로모터, 15L 프로모터, 17L 프로모터, 28 kD 프로모터, H1L 프로모터, H3L 프로모터, H5L 프로모터, H6L 프로모터, H8L 프로모터, D11L 프로모터, D12L 프로모터, D13L 프로모터, A1L 프로모터, A2L 프로모터, A3L 프로모터 및 P4b 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Moss, B., "Poxviridae and their Replication" IN Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2090 (1990)]을 참조한다. 후기 프로모터는 분명히 초기 프로모터에 의해 인식되는 전사 종결 신호를 인식하지 못한다.

본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 구성적 프로모터는 해몬드(Hammond) 및 챠크라바티(Chakrabarti)에 의해 설명된 합성 초기-후기 프로모터인 MH-5 초기-후기 프로모터, 및 7.5 kD 또는 "p7.5" 프로모터를 포함할 수 있다.

많은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스가 개발되어 벡터로 사용되고 있다. 예를 들어, 변형된 백시니아 앙카라(MVA)는 1차 병아리 배아 섬유모세포에서 570회 초과의 계대배양 동안 유도된 매우 약독화된 백시니아 바이러스 주이다(Mayr, A. et al., Infection 3:6-14 (1975)). 회수된 바이러스는 바이러스의 숙주 범위 제한에 중대한 영향을 미치는 야생형 백시니아 DNA의 약 15%를 결실시켰다. MVA는 대부분의 포유동물 세포주에서 복제할 수 없거나 또는 매우 비효율적으로 복제한다. 숙주 범위 제한의 고유한 특징은 비허용성 세포의 차단이 복제 주기의 비교적 늦은 단계에서 발생한다는 것이다. 바이러스 후기 유전자의 발현은 상대적으로 손상되지 않지만, 비리온의 형태 형성은 중단된다(Suter, G. and Moss, B., Proc Natl Acad Sci USA 89:10847-51 (1992); Carroll, M. W. and Moss, B., Virology 238:198-211 (1997)). 심지어 비허용성 숙주 세포에서의 높은 수준의 바이러스 단백질 합성은 MVA를 특히 안전하고 효율적인 발현 벡터로 만든다. 그러나, MVA는 대부분의 포유동물 세포에서 감염 주기를 완료할 수 없기 때문에, 다중 선택 사이클을 위한 감염성 바이러스를 회수하기 위해서는, 헬퍼 바이러스의 동시 감염 또는 중복 감염(superinfection)에 의해 MVA 결핍을 보완할 필요가 있을 것이고, 여기서 헬퍼 바이러스는 그 자체가 결핍되고 MVA 허용성 숙주 세포에서 낮은 MOI에서의 차등 팽창에 의해 감염성 MVA 재조합체로부터 후속적으로 분리될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보완"은 숙주 세포, 트랜스제닉 동물 또는 헬퍼 바이러스와 같은 또 다른 공급원에 의해 트랜스로(in trans) 손실된 기능을 회복하는 것을 의미한다. 기능 손실은 기능을 담당하는 유전자 산물의 결함 바이러스에 의한 손실에 기인한다. 따라서, 결함 폭스바이러스는 모체 폭스바이러스의 비 생존 가능한 형태이며, 보완의 존재 하에서 생존할 수 있는 형태이다. 숙주 세포, 트랜스제닉 동물 또는 헬퍼 바이러스는 손실된 유전자 산물 또는 "보완 요소"를 코딩하는 서열을 함유한다. 보완 요소는 일부 측면에서 숙주 세포, 트랜스제닉 동물 또는 헬퍼 바이러스에서 발현 가능하고 안정적으로 통합될 수 있으며, 특정 측면에서는 결함 폭스바이러스의 게놈과의 재조합에 대한 위험을 거의 또는 전혀 갖지 않도록 조작된다.

보완 세포주에서 생성된 바이러스는 비-보완 세포를 감염시킬 수 있고, 또한 초기 유전자 산물의 높은 수준의 발현이 가능하다. 그러나, 필수 유전자 산물이 없으면, 숙주 차단(shut-off), DNA 복제, 패키징 및 감염성 바이러스 입자의 생산이 일어나지 않는다.

3분자 재조합 방법

전통적으로, 백시니아 바이러스와 같은 폭스바이러스 벡터는 복잡한 라이브러리로부터 이전에 알려지지 않은 관심 유전자를 확인하기 위해 사용되지 않았고, 그 이유는 라이브러리 구축 및 스크리닝을 위한 고효율, 고복잡성, 고역가 생성 방법이 백시니아에 존재하지 않기 때문이다. 백시니아 바이러스에서의 이종성 단백질 발현의 전통적인 방법은 전달 플라스미드와 무손상 백시니아 바이러스 게놈 사이의 생체 내 상동성 재조합 및 시험관 내 직접 결찰을 수반하였다. 전통적인 상동성 재조합을 사용할 때, 재조합 바이러스의 생산 효율은 약 0.1% 이하의 범위이었다. 직접 결찰을 이용한 재조합 바이러스 생산의 효율이 더 높긴 하지만, 생성되는 역가는 상대적으로 낮다. 따라서, 백시니아 바이러스 벡터의 용도는 단백질 발현 및 백신 개발을 위해 이전에 단리된 DNA의 클로닝으로 제한되었다.

자우더러의 PCT 공개 WO 00/028016에 개시된 바와 같은 3분자 재조합은 재조합 폭스바이러스, 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스를 생산하기 위한 고효율, 고역가 생성 방법이다. 3분자 재조합 방법은 재조합 바이러스를 직접 결찰에 의해 얻어진 것에 비해 적어도 90%의 효율로, 및 적어도 10의 제곱만큼 더 높은 역가로 생성할 수 있다. 이러한 고효율을 고려하여, 관심 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 서브유닛 폴리펩티드를 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 3분자 재조합을 사용하여 폭스바이러스 벡터, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터에서 구축될 수 있다.

"3분자 재조합" 또는 "3분자 재조합 방법"은 바이러스 게놈의 2개의 비상동성 단편, 예를 들어 서로 상동성 재조합이 불가능한 2개의 바이러스 게놈 "아암(arm)", 및 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 벡터 또는 전달 DNA를 수여자 세포에 도입하고 3개의 DNA 분자를 생체 내에서 재조합하도록 허용함으로써, 관심 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 바이러스 게놈, 예를 들어 폭스바이러스 게놈, 예를 들어, 백시니아 바이러스 게놈을 생산하는 방법을 의미한다. 재조합의 결과로서, 2개의 각각의 게놈 단편 및 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생존 가능한 바이러스 게놈이 생성된다. 따라서, 본원에서 설명되는 3분자 재조합 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 단리된 폭스바이러스 게놈, 예를 들어 백시니아 바이러스 게놈을 절단하여 제1 바이러스 단편 및 제2 바이러스 단편을 생성시키는 단계로서, 제1 바이러스 단편이 제2 바이러스 단편과의 상동성 재조합이 불가능한 것인 단계; (b) 5' 인접 영역 및 3' 인접 영역이 인접한, 전사 제어 영역과 작동 가능하게 결합한 관심 폴리펩티드, 예를 들어 항체 서브유닛 폴리펩티드, 예를 들어 항체 경쇄, 항체 중쇄 또는 어느 하나의 항원 특이적 단편을 코딩하는 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 플라스미드의 집단을 제공하는 단계로서, 5' 인접 영역은 제1 바이러스 단편의 3' 말단에 상동성인 영역을 포함하고, 3' 인접 영역은 제2 바이러스 단편의 5' 말단에 상동성인 영역을 포함하고, 상기 전달 플라스미드는 생존 가능한 바이러스 게놈이 형성되도록 상기 제1 및 제2 바이러스 단편과의 상동성 재조합이 가능한 것인 단계; (c) (b)에서 설명된 전달 플라스미드 및 (a)에서 설명된 제1 및 제2 바이러스 단편을, 전달 플라스미드 및 2개의 바이러스 단편이 생체 내에서 상동성 재조합, 즉 3분자 재조합을 겪을 수 있는 조건 하에 숙주 세포에 도입하여, 관심 폴리펩티드, 예를 들어 항체 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생존 가능한 변형된 바이러스 게놈을 생성시키는 단계; (d) 폭스바이러스 조립 억제제, 예를 들어 본원의 다른 곳에서 설명되는 리팜피신을 첨가하고, 이 기술에 의해 생성된 변형된 바이러스 게놈을 회수하는 단계. 특정 측면들에서, 회수된 변형된 폭스바이러스 게놈은 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다.

"재조합 효율" 또는 "재조합 바이러스 생산 효율"은 본원에서 제공되는 방법에 의해 바이러스 라이브러리를 생성하는 동안 생산된 총 바이러스에 대한 재조합 바이러스의 비율을 의미한다. 효율은 재조합 바이러스의 역가를 총 바이러스의 역가로 나누고 100%를 곱하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 역가는 선택을 수행한(예를 들어, 재조합 바이러스의 경우) 또는 선택을 수행하지 않은(예를 들어, 재조합 바이러스 + 야생형 바이러스의 경우) 적절한 세포에 대한 조질 바이러스 원액의 플라크 검정에 의해 결정할 수 있다. 선택 방법은 특히 이종성 폴리뉴클레오티드가 바이러스 티미딘 키나제(tk) 유전자좌에 삽입되는 경우, 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, tk 유전자의 파괴로 인한 브로모데옥시우리딘(BDUR) 또는 다른 뉴클레오티드 유사체에 대한 내성을 포함한다. 선택 방법의 예는 본원에서 설명된다.

"고효율 재조합"은 적어도 약 1%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 재조합 효율을 의미한다.

각각 tk^-, hgprt^- 또는 aprt^- 세포에서 사용될 수 있는 티미딘 키나제, 예컨대 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), 히포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 48:2026), 및 아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사산물 내성이 다음 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler, et al., 1980, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147).

상기 설명한 바와 같은 바이러스 게놈의 제1 및 제2 바이러스 단편 또는 "아암"은 전형적으로 바이러스 복제 및 감염성 바이러스 입자의 생산에 필요한 모든 유전자를 함께 함유한다. 적합한 아암 및 백시니아 바이러스 벡터를 사용한 이의 생산 방법의 예가 본원에서 개시된다. 또한, 백시니아 복제를 위한 필수 영역에 관한 지침에 대해서는 포크너(Falkner) 등의 미국 특허 제5,770,212호를 참조한다.

그러나, 백시니아 바이러스 게놈과 같은 네이키드 폭스바이러스 게놈 DNA는 유입되는 바이러스 입자와 관련된 바이러스 코딩 단백질(들)/기능(들)이 없는 감염성 자손체를 생성할 수 없다. 요구되는 바이러스 코딩 기능에는 형질감염된 백시니아 바이러스 DNA를 주형으로서 인식하고 형질감염된 DNA의 전사 및 궁극적으로 복제를 개시하는 RNA 폴리머라제를 포함한다. 도너(Dorner) 등의 미국 특허 제5,445,953호를 참조한다.

따라서, 백시니아 바이러스와 같은 폭스바이러스를 사용하여 3분자 재조합에 의해 감염성 자손체 바이러스를 생성하기 위해, 수여자 세포는 패키징 기능을 포함할 수 있다. 패키징 기능은 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 형질감염된 네이키드 게놈 DNA와 함께 자손체 바이러스의 복제 및 조립에 필요한 적절한 단백질 및 인자를 제공하는 바이러스에 의해 제공될 수 있다.

헬퍼 바이러스는 밀접하게 관련된 바이러스, 예를 들어, 동일한 속에서 유래하든 상이한 속에서 유래하든 상관없이, 백시니아와 동일한 폭스바이러스 하위패밀리의 폭스바이러스일 수 있다. 이러한 경우에, 형질감염된 DNA를 주형으로 인식하여 형질감염된 DNA의 전사 및 궁극적으로는 복제를 개시하는 역할을 하는 RNA 폴리머라제를 제공하는 헬퍼 바이러스를 선택하는 것이 유리하다. 밀접하게 관련된 바이러스가 헬퍼 바이러스로 사용되는 경우, 이것은 감염성 바이러스의 형성이 손상될 정도로 약독화되는 것이 유리하다. 예를 들어, 온도 감수성 헬퍼 바이러스는 비허용 온도에서 사용할 수 있다. 특정 측면에서, 이종성 헬퍼 바이러스가 사용된다. 그 예는 조류폭스(avipox) 바이러스, 예컨대 계두 바이러스 또는 엑트로멜리아(ectromelia) 바이러스(서두(mouse pox) 바이러스)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 조류폭스 바이러스는 필요한 헬퍼 기능을 제공하지만, 포유동물 세포에서 복제하거나 감염성 비리온을 생성하지 않는다(Scheiflinger, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:9977-9981 (1992)). 이종성 바이러스의 사용은 밀접하게 관련된 바이러스의 상동성 서열이 하나의 세포에 존재할 때 발생하는, 헬퍼 바이러스 게놈과 형질감염된 게놈 사이의 재조합 현상을 최소화한다. 문헌 [Fenner & Comben, Virology 5:530 (1958); Fenner, Virology 8:499 (1959)]를 참조한다.

별법으로, 수여자 세포에서 필요한 헬퍼 기능은 헬퍼 바이러스 이외의 다른 유전 요소에 의해 공급될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 헬퍼 기능을 구성적으로 생성하도록 형질전환될 수 있거나, 숙주 세포는 헬퍼 기능을 발현하는 플라스미드로 일시 형질감염되거나, 헬퍼 기능을 발현하는 레트로바이러스로 감염되거나, 또는 요구되는 헬퍼 바이러스 기능을 발현하는데 적합한 임의의 다른 발현 벡터가 제공될 수 있다. 도너 등의 미국 특허 제5,445,953호를 참조한다.

3분자 재조합 방법에 따르면, 제1 및 제2 바이러스 게놈 단편은 서로 결찰되거나 재조합할 수 없으며, 즉, 이들은 상보적인 점착성 말단 또는 상동성 영역을 함유하지 않거나, 또는 별법으로, 점착성 말단이 탈인산화 효소로 처리되었다. 특정 측면에서, 바이러스 게놈은 제1 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 인식 부위 및 제2 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 인식 부위를 포함할 수 있고, 제1 및 제2 바이러스 단편은 바이러스 "아암"을 생성하기 위해 바이러스 게놈을 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 생성되고, 제1 및 제2 바이러스 단편은 표준 방법에 의해 단리된다. 이상적으로는, 제1 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 바이러스 게놈에 고유하거나, 또는 별법으로, 2개의 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 절단은 모든 필수 기능을 위한 유전자를 포함하는 바이러스 "아암"을 생성하고, 즉, 여기서 제1 및 제2 인식 부위는 제1 바이러스 단편과 제2 바이러스 단편 사이에서 연장되는 영역이 바이러스 감염성을 위해 필수적이지 않도록 바이러스 게놈 내에 물리적으로 배열된다.

3분자 재조합 방법에 백시니아 바이러스 벡터를 사용하는 경우, tk 유전자 내에 2개의 고유한 제한 부위를 갖는 바이러스 게놈을 포함하는 백시니아 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 제1 제한 효소는 tk 유전자 내에 인식 부위 GCGGCCGC를 갖는 NotI일 수 있고, 제2 제한 효소는 tk 유전자 내에 인식 부위 GGGCCC를 갖는 ApaI일 수 있다. 예시적인 백시니아 바이러스 벡터는 v7.5/tk 바이러스 게놈 또는 vEL/tk 바이러스 게놈을 포함한다(Merchlinsky, et al., Virology 238:444-451 (1997)).

본 실시양태에 따르면, 티미딘 키나제 유전자를 함유하는 백시니아 바이러스 게놈의 영역과 상동성 재조합이 가능한 인접 영역을 갖는 전달 플라스미드가 사용된다. tk 유전자를 함유하는, HindIII-J 단편을 포함하는 백시니아 바이러스 게놈의 단편이 편리하게 사용된다.

특정 측면에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 폭스바이러스 발현 제어 서열, 예를 들어 p7.5 또는 합성 초기/후기 프로모터와 같은 강력한 구성적 폭스바이러스 프로모터와 작동 가능하게 결합될 수 있다.

따라서, 본원에서 제공되는 전달 플라스미드는 백시니아 바이러스 p7.5 프로모터, 또는 합성 초기/후기 프로모터와의 작동 가능한 결합을 통해, 예를 들어 관심 단백질, 예를 들어 항체 서브유닛 폴리펩티드, 예를 들어 중쇄, 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전달 플라스미드는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 PCT 공개 WO 00/028016, 미국 특허 제6,706,477호 또는 미국 특허 제7,858,559호에 기재된 임의의 전달 플라스미드일 수 있다.

한 측면에서, 백시니아 바이러스 p7.5 프로모터와의 작동 가능한 결합을 통해 관심 단백질, 예를 들어 항체 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 플라스미드는 본원에서 하기 서열 번호 1로 지정된 서열을 포함하는 pVHE일 수 있다:

PCR 증폭된 중쇄 가변 영역은 상기 서열에서 굵게 표시된 고유한 BssHII 및/또는 BstEII 부위에 인 프레임으로 삽입될 수 있다.

또 다른 측면에서, 백시니아 바이러스 p7.5 프로모터와의 작동 가능한 결합을 통해 관심 단백질, 예를 들어 항체 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 플라스미드는 본원에서 하기 서열 번호 2로 지정된 서열을 포함하는 pVKE일 수 있다:

PCR 증폭된 카파 경쇄 가변 영역은 상기 서열에서 굵게 표시된 고유한 ApaLI 및/또는 XhoI 부위에 인 프레임으로 삽입될 수 있다.

또 다른 측면에서, 백시니아 바이러스 p7.5 프로모터와의 작동 가능한 결합을 통해 관심 단백질, 예를 들어 항체 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 플라스미드는 본원에서 하기 서열 번호 3으로 지정된 서열을 포함하는 pVLE일 수 있다:

PCR 증폭된 람다 경쇄 가변 영역은 상기 서열에서 굵게 표시된 고유한 ApaLI 및/또는 HindIII 부위에 인 프레임으로 삽입될 수 있다.

"삽입 DNA" 또는 "관심 폴리뉴클레오티드"는 재조합 폭스바이러스 벡터에서 발현되는 하나 이상의 이종성 DNA 절편을 의미한다. 본원에서 사용되는 "관심 폴리뉴클레오티드"는 관심 단백질, 예를 들어 항체 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 관심 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적이거나, 자연 발생적이 아니거나, 합성된 것이거나, 또는 이의 조합물일 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 관심 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

"전달 플라스미드"는 상기 설명한 바와 같이 5' 인접 영역과 3' 인접 영역 사이에 위치한 관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드 벡터를 의미한다. 5' 인접 영역은 제1 바이러스 단편과 상동성을 공유하고, 3' 인접 영역은 제2 바이러스 단편과 상동성을 공유한다. 특정 측면에서, 전달 플라스미드는 관심 폴리뉴클레오티드의 상류에 강력한 구성적 백시니아 프로모터와 같은 적합한 프로모터를 함유한다. 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드 절편을 적합한 숙주 세포 내로 전달할 수 있는, 이종성 폴리뉴클레오티드 절편을 함유하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 특정 측면에서, 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 수행할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 그러한 제어 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 제어하기 위한 선택적인 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스, 메신저 RNA 또는 단순히 잠재적인 게놈 삽입체일 수 있다. 일단 적합한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과는 독립적으로 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 자체에 통합될 수 있다. 포유동물 세포 배양 발현을 위한 전형적인 플라스미드 발현 벡터는 예를 들어 pRK5(EP 307,247), pSV16B(WO 91/08291) 및 pVL1392(Pharmingen)에 기초할 수 있다.

그러나, 본원에서 사용되는 "전달 플라스미드"는 특정 플라스미드 또는 벡터로 제한되지 않는다. 원형 또는 선형 또는 다른 적합한 형태의 임의의 DNA 절편은 3분자 재조합 방법에서 제1 및 제2 바이러스 "아암"과 함께 숙주 세포 내에 DNA 삽입체를 전달하기 위한 운반체로서 작용할 수 있다. 다른 적합한 벡터는 본원에서 설명되거나 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 람다 파지, mRNA, DNA 단편 등을 포함한다. 복수의 플라스미드는 본원에서 람다에 대해 본원에서 설명된 것과 같은 "1차 라이브러리"일 수 있다.

백시니아 바이러스 조립 억제제의 첨가

본원에서 제공되는 방법에 따라, 3분자 재조합을 사용하여 구축된 폭스바이러스 라이브러리의 복잡성, 다양성 및/또는 역가를 개선하기 위해, 백시니아 바이러스 조립 억제제를 첨가할 수 있다. 그러한 억제제 중 하나가 리팜피신이다. 리팜피신은 일반적으로 다양한 박테리아 감염을 치료하기 위해 사용되는 항생제이다. 리팜피신은 박테리아 RNA 폴리머라제를 억제하여, 박테리아에서의 재조합 단백질 발현 동안 숙주 박테리아 단백질의 합성을 억제할 수 있다. 또한, 리팜피신은 DNA 및 단백질이 성숙한 바이러스 입자로 조립되는 것을 억제함으로써 백시니아 바이러스의 복제를 가역적으로 억제할 수 있다(Moss., B., et al., Nature 224: 1280-1284 (1969)). 다른 폭스바이러스 조립 억제제는 비제한적으로, 아자티오프린, 노보비오신 및/또는 미톡산트론을 포함할 수 있다.

바이러스 성장을 억제하는 것은 자연적인 재조합에서와 같이 복제 속도를 감소시킬 필요가 있는 경우에 유리하지만, 3분자 재조합은 바이러스를 생성하기 위해 바이러스 게놈의 재조합을 필요로 한다. 따라서, 리팜피신과 같은 억제제의 첨가가 3분자 재조합을 사용하여 구축된 재조합체의 품질, 복잡성 및/또는 역가를 개선하는 것은 예상되지 않는다. 그러나, 본원에서 제공되는 방법은 재조합이 일어날 때까지 총 바이러스 성장을 지연시킬 수 있다. 예를 들어, 리팜피신은 재조합이 이루어지는 기간을 연장하고 패키징된 바이러스가 배양액에서 과도하게 성장하는 것을 방지함으로써, 구축되는 개개의(고유한) 재조합체의 수를 증가시키기 위해 형질감염 후, 예를 들어 형질감염 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간 또는 약 60시간 후에 첨가될 수 있다. 특정 측면에서, 리팜피신 또는 이의 유도체는 약 30 ㎍/ml, 약 40 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml, 약 60 ㎍/ml, 약 70 ㎍/ml, 약 80 ㎍/ml, 약 90 ㎍/ml, 약 100 ㎍/ml, 약 110 ㎍/ml, 약 120 ㎍/ml 또는 약 130 ㎍/ml의 농도로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 특정 측면에서, 리팜피신 또는 이의 유도체는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일 또는 약 5일 동안 세포 배양 배지에서 유지될 수 있다. 형질감염된 세포를 리팜피신을 포함하는 세포 배양 배지와 함께 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지를 리팜피신이 없는 세포 배양 배지로 대체할 수 있고, 형질감염된 숙주 세포를 리팜피신 없이, 예를 들어 약 1일, 약 2일, 또는 약 3일 동안 추가로 배양할 수 있다.

본원에서 제공되는 라이브러리 구축 방법은 폭스바이러스 조립 억제제, 예를 들어, 리팜피신의 부재 하에 구축된 라이브러리보다 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈의 수 증가, 즉, 복잡성 및 다양성이 개선된 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈의 수는 폭스바이러스 조립 억제제, 예를 들어, 리팜피신의 부재 하에 구축된 라이브러리에 비해 적어도 약 1배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배 또는 약 30배 또는 그 초과로 증가할 수 있다. 더욱이, 본원에서 제공되는 라이브러리 구축 방법은 폭스바이러스 조립 억제제의 부재 하에 구축된 라이브러리보다 바이러스 역가가 증가된 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 48시간 처리 동안 형질감염 48시간 후에 80 ㎍/ml의 리팜피신을 첨가하였다. 그 후, 배지를 교체하고, 세포를 추가로 48시간 동안 배양한다. 최종 결과는 리팜피신이 첨가되지 않은 경우보다 적어도 5배 더 많은 생산량이다.

본원에서 제공되는 방법에 따르면, 리팜피신과 같은 폭스바이러스 조립 억제제는 출발 플라스미드에 상관없이 및 라이브러리에서 스크리닝되는 관심 단백질의 유형에 상관없이 임의의 폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스 라이브러리에 사용될 수 있다.

본 개시내용은 달리 지시되지 않는 한, 관련 분야의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국 특허 제4,683,195호(Mullis 등); Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); 및 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)] 참조).

단백질 및 항체 공학의 일반적인 원리는 문헌 [Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)]에 제시되어 있다. 단백질 공학의 일반적인 원리는 문헌 [Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)]에 제시되어 있다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원리는 문헌 [Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); 및 Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)]에 제시되어 있다. 또한, 문헌 [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) 및 Mishell and Shiigi (eds.) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)]에서와 같이 관련 분야에 공지되어 있고 구체적으로 설명되지 않은 면역학의 표준 방법을 따를 수 있다.

상기 인용된 모든 참고 문헌 및 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 하기 실시예는 제한적인 것이 아니라 예시로서 제공된다.

실시예

실시예 1: 리팜피신 처리에 의한 백시니아 라이브러리 구축 개선

라이브러리 VHEH5VHA56RIresNeoFLVH3-30CR9B A

형질감염은 6개의 100 mm² 플레이트에서 NotI 및 ApaI으로 절단된 36 ㎍의 v7.5/tk 바이러스 DNA, 12 ㎍의 전달 플라스미드 DNA, 54 x 10⁶ 플라크 형성 단위(pfu)의 계두 헬퍼 바이러스 및 36 x 10⁶개의 BSC-1 세포를 사용하여 수행하였다. 형질감염된 세포의 5개의 플레이트를 형질감염 24시간 후에 5개의 세포 스태커(stacker)에 도말하였다. 1개의 플레이트는 T175 플라스크에 씨딩하였다. 재조합 효율을 결정하기 위해, 형질감염된 세포의 2%, 1%, 0.5% 및 0.25%를 계수 플레이트로서 96웰에 2중으로 씨딩하였다. 형질감염 48시간 후에, 리팜피신을 1세트의 계수 플레이트에 및 T175 플라스크에 80 ㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 약물은 3일 동안 배지에서 유지되었다. 제5일에 배지를 교체하고, 세포를 리팜피신 없이 2일간 추가로 인큐베이팅하였다. 리팜피신 없이 인큐베이팅된 스태커를 제5일에 수거하였다.

재조합 클론의 수는 각각의 96웰 플레이트에서 플라크를 형성한 웰의 백분율을 현미경으로 관찰함으로써 포아송(Poisson) 분포에 의해 계산되었다.

리팜피신이 없을 때의 효율은 23,652 클론/100 mm² 플레이트이었다.

리팜피신 사용시의 효율은 113,148 클론/100 mm² 플레이트이었고, 중요한 것은 이것을 1/8의 세포수 및 세포 배양 부피를 사용하여 달성하였다는 사실이다.

후속 실험에서, 리팜피신 사용시의 클론 생산의 전체 효율은 리팜피신이 없을 때의 효율보다 대략 10배 더 높았다.

SEQUENCE LISTING <110> Vaccinex, Inc. Smith, Ernest Shi, Shuying <120> IMPROVED METHODS FOR PRODUCING POLYNUCLEOTIDE LIBRARIES IN VACCINIA VIRUS/EUKARYOTIC CELLS <130> 58008-168081 <150> US 62/370,009 <151> 2016-08-02 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transfer Plasmid containing pVHE promoter <400> 1 ggccaaaaat tgaaaaacta gatctattta ttgcacgcgg ccgcaaacca tgggatggag 60 ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggcgcg catatggtca ccgtctcctc 120 agggagtgca tccgccccaa cccttttccc cctcgtctcc tgtgagaatt ccccgtcgga 180 tacgagcagc gtggccgttg gctgcctcgc acaggacttc cttcccgact ccatcacttt 240 ctcctggaaa tacaagaaca actctgacat cagcagcacc cggggcttcc catcagtcct 300 gagagggggc aagtacgcag ccacctcaca ggtgctgctg ccttccaagg acgtcatgca 360 gggcacagac gaacacgtgg tgtgcaaagt ccagcacccc aacggcaaca aagaaaagaa 420 cgtgcctctt ccagtgattg ctgagctgcc tcccaaagtg agcgtcttcg tcccaccccg 480 cgacggcttc ttcggcaacc cccgcagcaa gtccaagctc atctgccagg ccacgggttt 540 cagtccccgg cagattcagg tgtcctggct gcgcgagggg aagcaggtgg ggtctggcgt 600 caccacggac caggtgcagg ctgaggccaa agagtctggg cccacgacct acaaggtgac 660 tagcacactg accatcaaag agagcgactg gctcagccag agcatgttca cctgccgcgt 720 ggatcacagg ggcctgacct tccagcagaa tgcgtcctcc atgtgtgtcc ccgatcaaga 780 cacagccatc cgggtcttcg ccatcccccc atcctttgcc agcatcttcc tcaccaagtc 840 caccaagttg acctgcctgg tcacagacct gaccacctat gacagcgtca ccatctcctg 900 gacccgccag aatggcgaag ctgtgaaaac ccacaccaac atctccgaga gccaccccaa 960 tgccactttc agcgccgtgg gtgaggccag catctgcgag gatgactgga attccgggga 1020 gaggttcacg tgcaccgtga cccacacaga cctgccctcg ccactgaagc agaccatctc 1080 ccggcccaag ggggtggccc tgcacaggcc cgatgtctac ttgctgccac cagcccggga 1140 gcagctgaac ctgcgggagt cggccaccat cacgtgcctg gtgacgggct tctctcccgc 1200 ggacgtcttc gtgcagtgga tgcagagggg gcagcccttg tccccggaga agtatgtgac 1260 cagcgcccca atgcctgagc cccaggcccc aggccggtac ttcgcccaca gcatcctgac 1320 cgtgtccgaa gaggaatgga acacggggga gacctacacc tgcgtggtgg cccatgaggc 1380 cctgcccaac agggtcactg agaggaccgt ggacaagtcc accgaggggg aggtgagcgc 1440 cgacgaggag ggctttgaga acctgtgggc caccgcctcc accttcatcg tcctcttcct 1500 cctgagcctc ttctacagta ccaccgtcac cttgttcaag gtgaaatgag tcgac 1555 <210> 2 <211> 446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transfer plasmid containing pVKE promoter <400> 2 ggccaaaaat tgaaaaacta gatctattta ttgcacgcgg ccgcccatgg gatggagctg 60 tatcatcctc ttcttggtag caacagctac acgggtgcac ttgactcgag atcaaacgaa 120 ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 180 ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 240 aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 300 aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 360 acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct 420 tcaacagggg agagtgttag gtcgac 446 <210> 3 <211> 455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transfer plasmid containing pVLE promoter <400> 3 ggccaaaaat tgaaaaacta gatctattta ttgcacgcgg ccgcccatgg gatggagctg 60 tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggcgtgcac ttgactcgag aagcttaccg 120 tcctacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga 180 aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag 240 tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc 300 aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact 360 acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca 420 caaagagctt caacagggga gagtgttagg tcgac 455

Claims

(a) 단리된 폭스바이러스 게놈을 절단하여 제1 바이러스 단편 및 제2 바이러스 단편을 생성시키는 단계로서, 제1 단편이 제2 단편과 비상동성인 단계;
(b) 5' 인접 영역 및 3' 인접 영역이 인접한 관심 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 전달 플라스미드의 집단을 제공하는 단계로서, 5' 인접 영역은 제1 바이러스 단편의 3' 말단에 상동성인 영역을 포함하고, 3' 인접 영역은 제2 바이러스 단편의 5' 말단에 상동성인 영역을 포함하고, 전달 플라스미드는 생존 가능한 폭스바이러스 게놈이 형성되도록 제1 및 제2 바이러스 단편과의 상동성 재조합이 가능한 것인 단계;
(c) 폭스바이러스 감염성을 허용하는 포유동물 숙주 세포 내로 전달 플라스미드 및 제1 및 제2 바이러스 단편을 형질감염시키는 단계로서, 숙주 세포는 형질감염 후 세포 배양 배지에서 유지되는 것인 단계;
(d) 가역적 폭스바이러스 조립 억제제를 첨가하는 단계;
(e) 전달 플라스미드 및 제1 및 제2 바이러스 단편이 상동성 재조합을 겪을 수 있도록 함으로써, 이종성 핵산을 각각 포함하는 생존 가능한 변형된 폭스바이러스 게놈의 라이브러리를 생성하는 단계; 및
(f) 라이브러리를 회수하는 단계로서, 라이브러리가 폭스바이러스 조립 억제제의 부재 하에 구축된 라이브러리보다 증가된 바이러스 역가를 포함하는 것인 단계
를 포함하는, 복수의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리를 구축하는 방법.
제1항에 있어서, 가역적 폭스바이러스 조립 억제제가 리팜피신(리팜핀) 또는 이의 유도체인 방법.
제2항에 있어서, 리팜피신 또는 이의 유도체를 형질감염 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 54시간 또는 60시간 후에 형질감염된 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 첨가하는 것인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 리팜피신 또는 이의 유도체를 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 90 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 110 ㎍/ml, 120 ㎍/ml 또는 130 ㎍/ml의 농도로 세포 배양 배지에 첨가하는 것인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 리팜피신 또는 이의 유도체가 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 동안 세포 배양 배지에 유지될 수 있도록 하고, 리팜피신 또는 이의 유도체로 처리한 후 세포 배양 배지를 교환하고, 형질감염된 숙주 세포를 1일, 2일 또는 3일 동안 리팜피신 없이 추가로 배양하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 라이브러리가 폭스바이러스 조립 억제제의 부재 하에 구축된 라이브러리보다 증가된 수의 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈을 포함하고, 독립적인 변형된 폭스바이러스 게놈의 수가 적어도 1배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배 또는 30배 증가하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폭스바이러스 게놈은 단리된 백시니아 바이러스 게놈인 방법.
제7항에 있어서, 상기 단리된 백시니아 바이러스 게놈은 WR 게놈 또는 이의 변형된 유도체, 또는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 게놈 또는 이의 변형된 유도체인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폭스바이러스 게놈이 제1 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 인식 부위 및 제2 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 인식 부위를 포함하고; 제1 및 제2 바이러스 단편은, 바이러스 게놈을 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고 제1 및 제2 바이러스 단편을 단리시킴으로써 생성되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 제1 제한 효소가 NotI이고, 제2 제한 효소 부위가 ApaI인 방법.
제7항에 있어서, 단리된 백시니아 바이러스 게놈이 v7.5/tk 바이러스 게놈 또는 vEL/tk 바이러스 게놈인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 숙주 세포가 변형된 백시니아 바이러스 게놈을 감염성 백시니아 바이러스 입자로 패키징할 수 있는 것인 방법.
제12항에 있어서, 전달 플라스미드 및 제1 및 제2 바이러스 단편을, 헬퍼 바이러스와 함께 포유동물 숙주 세포로 도입하고, 여기서 숙주 세포는 헬퍼 바이러스의 감염성 바이러스 입자의 생산에 대해서는 비허용성이지만, 변형된 백시니아 바이러스 게놈을 감염성 백시니아 바이러스 입자로 패키징하는 것을 지원하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 플라스미드의 5' 및 3' 인접 영역이 백시니아 바이러스 티미딘 키나제 유전자와 또는 백시니아 바이러스 HindIII J 단편과 상동성 재조합할 수 있고, 전달 플라스미드가 pVHE, pVLE, 및 pVKE로 이루어지는 군으로부터 선택되는 플라스미드 내로 결찰된 삽입 핵산을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 관심 폴리뉴클레오티드가 각각 백시니아 바이러스 감염 세포에서 발현될 수 있는 관심 폴리펩티드의 코딩 영역을 포함하고, 전달 플라스미드가 관심 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 폭스바이러스 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 폭스바이러스 프로모터는 백시니아 바이러스 감염 세포의 세포질에서 기능하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 복수의 관심 폴리뉴클레오티드가 각각 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 조합을 포함하는 항체 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 항체 서브유닛 폴리펩티드가 불변 영역 또는 이의 단편, 항체 서브유닛 폴리펩티드의 세포 표면 발현 또는 분비를 유도할 수 있는 신호 펩티드, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
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