KR102447082B1 - 애엽 추출물의 제조방법, 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물 - Google Patents

애엽 추출물의 제조방법, 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법은 애엽 분말로부터, 초임계 유체와 공용매를 이용하여 초임계 추출방법으로 추출하여 유파틸린 및 자세오시딘을 포함하는 애엽 추출물을 얻는 것을 특징으로 한다.

Description

애엽 추출물의 제조방법, 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물{PROCESS FOR PREPARING ARTEMISIA EXTRACT, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPOSITION COMPRISING ARTEMISIA EXTRACT FOR PREVENTING OR TREATING OF ATOPY}
본 발명은 애엽 추출물의 제조방법, 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식픔 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 유파틸린(Eupatilin)과 자세오시딘(Jaceosidin)을 최적 비율로 포함하는 애엽(Artemisia sp.) 추출물을 초임계 유체를 이용하여 제조하는 애엽 추출물의 제조방법, 상기 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 아토피 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된, 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 함유하는 애엽 추출물은 면역억제 능력이 우수하며, 아토피 증세의 개선용 건강기능식품 조성물 또는 아토피 치료제를 포함한 자가 면역질환에 유용하게 적용될 수 있다.
아토피 피부염은 자가면역 피부질환의 일종으로서 민감성이 높은 특정 유전자, 환경, 피부 외벽의 손상 정도 및 면역학적인 요인 등에 의한 복합적인 영향을 받는 질환이다. 인체 내의 면역 방어 반응이 과도하게 지속될 경우, 면역 과민 반응에 의하여 아토피 증상이 유발될 수 있다. 아토피와 같은 자가면역 질환은 몸에서 자신의 기관이나 조직을 외부에서 유래한 항원으로 인식, 면역 반응을 일으키는 증상을 가지는 질환을 말한다. 아토피의 경우 케라틴세포(Keratinocyte) 및 내피세포(Endothelial cell)에서 유래한 단백질에 대한 항체를 포함하고 있는 것으로 알려져 있으며, 개체의 혈청 내에 존재하는 자가항체(autoantibody)의 양이 상기 질환의 심각도와 서로 관련되어 있다고 알려져 있다. 대한민국 공개특허 제2017-0010303호에 따르면, 아토피 질환에서는 CD28에 대한 자가항체가 존재하며, 상기 자가항체는 T세포의 활성화를 가져와 아토피 질환을 유도할 수 있음이 보고되었고, CD28 자가항체는 새로운 바이오마커로서 제시되어 아토피 질환과 다른 염증성 피부 질환이 서로 구별될 수 있는 질환임이 제시되었다.
아토피 피부염은 피부 건조증 및 심한 가려움증을 동반하는 만성, 재발성 염증성 피부질환으로 영아와 어린이에게 집중적으로 발생하며, 면역 이상반응이 주요 원인이다. 1960년대 이후 급격한 산업화로 인해 아토피 피부염의 발생률이 해마다 증가하고 있으며, 어린이의 아토피 피부병 유병률이 20% 이상으로 크게 증가하였고, 성인의 경우도 2~3% 이상으로 빠른 속도로 증가하고 있다.
아토피 피부염의 병인은 유전적 요인과 함께 식생활의 변화 및 환경오염과 같은 환경적 요인, 알레르기 항원의 침투, 피부보호막의 이상 등 여러가지 요인들이 함께 작용하여 발병한다. 심각한 아토피의 경우, 취업 또는 결혼과 같은 사회 생활에 지장을 초래하기까지 하여 심각한 사회문제가 되고 있으며, 심하면 정신적 스트레스로 발전하여 대인기피증 또는 우울증을 앓기도 한다. 이렇듯 아토피는 심각한 사회적, 의학적 문제가 됨에도 병태생리가 정확하게 규명되지 않아 현재까지 효율적인 치료제가 없는 실정이다.
기존의 아토피 치료제는 스테로이드 제제, 부신피질 호르몬제, 항히스타민제 등이 사용되었으나 이러한 치료제들의 치료 효과가 미미하거나 치료 효과를 보이더라도 과민 반응 및 간독성 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 아토피가 유·소아에 집중적으로 발병된다는 점을 감안한다면 현재 장기적으로 사용 가능하고 안전하면서도 효능이 우수한 새로운 소재 개발이 절실히 요구되는 상황이다.
한편, 애엽(Artemisia sp.)은 국화과(compositae)에 속하는 다년생 초본식물로서, 독특한 향기와 맛을 가지고 있다. 애엽의 어린 잎은 식용으로서 쑥떡 등에 이용되어 왔고, 한방에서는 자궁을 따스하게 하여 자궁출혈, 임신 중의 출혈 등에 효과가 있다고 알려져 있으며, 강장보혈, 부인병, 설사치료제로 사용되어 왔음이 동의보감에 게시되어 있다.
애엽의 약리작용을 살펴보면, 애엽 추출물은 혈액응고시간을 연장시키며, 애엽으로부터 추출한 플라본(flavone)은 항암 활성, 혈소판응집 억제, 항진균 활성이 있으며, 혈압 강하와 진정작용을 하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 아토피를 치료할 수 있는 효능을 지니면서도 유·소아에도 안전하게 사용할 수 있는 천연물을 찾기 위하여 노력한 결과, 애엽 추출물이 아토피를 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제2017-0010303호(2017.01.26)
Sung, D. E. (2021). An overview of the regulatory effect of vitamin D supplementation on atopic dermatitis. Korean Journal of Food Science and Technology, 53(2), 139-148. Yi, Yunjeong, Hyun, Sook Jung, Lee, Jinhwa, & An, Ji-Yoen. (2017). Severity of Atopic Dermatitis and Associated Factors in Korean Adolescents by Sex. Journal of the Korean Society of School Health, 30(2), 164-173. Jeong Hyo Hong. (2008). A research Western medical science, The Korean traditional medicine, Local clinic and Naturopathy about Atopy. The Journal of Eco-Early Childhood Education, 7(1), 65-85. 이경인, 조주현, 표병식. (2011) 애엽(艾葉) 에탄올 및 메탄올 추출물과 용매별 분획의 세포독성과 항산화활성. 한국약용작물학회지, 19. 6: 421-425.
본 발명은 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하고 있는 애엽 추출물을 제조할 수 있는 애엽 추출물의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 전술한 애엽 추출물의 제조 방법으로 제조된 애엽 추출물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하고 있는 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하고 있는 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 목적이 있다.
본 발명은 애엽 분말로부터, 초임계 유체와 공용매를 이용하여 초임계 추출방법으로 추출하여 유파틸린 및 자세오시딘을 포함하는 애엽 추출물을 얻는, 애엽 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 애엽 추출물의 제조 방법으로 제조된 애엽 추출물, 또는 추출물로 유파틸린 및 자세오시딘을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 애엽 추출물의 제조방법으로 제조된 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법은, 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하는 애엽 추출물을 초임계 유체를 이용하여 용이하게 제조할 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 아토피 개선용 건강기능식품 조성물은 아토피를 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 실험예 1에 따른 IL-6 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1에 따른 TNF-α 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2에 따른 NO assay그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예 8-1에 따른 MTT assay그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예 8-2에 따른 DPPH 라디칼 소거능 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실험예 8-3에 따른 IL-6 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예 8-3에 따른 TNF-α 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예 8-4에 따른 NO assay그래프이다.
도 9는 본 발명의 실험예 9-1에 따른 Body weight 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실험예 9-2에 따른 Sensory evaluation score 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실험예 9-4에 따른 Spleen weight 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실험예 9-4에 따른 Spleen index(%) 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실험예 9-4에 따른 Axillary lymph node weight 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실험예 9-5에 따른 Count of WBC 그래프이다.
도 15는 본 발명의 실험예 9-5에 따른 Hematological results 그래프이다.
도 16은 본 발명의 실험예 9-5에 따른 count of WBC differentials(NEU, LYM) 그래프이다.
도 17은 본 발명의 실험예 9-5에 따른 count of WBC differentials(mono, EOS) 그래프이다.
도 18은 본 발명의 실험예 9-5에 따른 count of WBC differentials(BASO, LUC) 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 직접 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 개재되는 경우도 포함한다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
<애엽 추출물의 제조방법>
본 발명의 한 양태는, 애엽 분말로부터, 초임계 유체와 공용매를 이용하여 초임계 추출방법으로 추출하여 유파틸린 및 자세오시딘을 포함하는 애엽 추출물을 얻는, 애엽 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명자들은 초임계 유체를 이용하여 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하는 애엽 추출물의 제조방법을 발명하였으며, 상기 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 in vitro 실험에서 면역 억제 반응이 있음을 확인하고, in vivo 실험에서 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene)로 아토피가 유발된 Balb/c 마우스에 상기 조성물을 경구 투여했을 때 개선되는 것을 확인하여 아토피 치료 활성이 있음을 확인하였다.
요컨대, 본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법으로 얻는 애엽 추출물은 자가면역질환의 대표적인 질병인 아토피 치료에 효과가 있어, 아토피 치료제로 유용하게 적용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 애엽 추출물을 이용하여 DPPH 항산화 소거능 assay, No assay, IL-6 및 TNF-α의 변화를 확인할 수 있는 ELISA test를 통해서 아토피 치료를 기대할 수 있다.
본 발명에 있어서, "애엽(Artemisia sp.)"은 국화과의 황해쑥(Artemisia argyi Lev. et Vant), 쑥(A.princeps Pamp. Var. orientlis Hara) 또는 산쑥(A. montana Pamp)의 잎 및 어린 줄기를 말린 약재를 말하며, 약리작용으로 지혈작용, 억균작용, 기관지 평활근 이완 작용, 진해거담작용, 수면 작용, 자궁흥분유도작용, 과민성 쇼크 보호작용 등이 있다.
상기 애엽의 약리 활성 측면에서는 항암 활성, 혈소판 응집 억제 작용, 항진균 활성 등에 있어 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 상기 애엽 추출물의 아토피 피부 질환에 대한 예방 및 치료 용도에 대해서도 최근 알려지기 시작했으나, 아토피 피부 질환에 대해서는 그 효과가 미미한 수준이다.
본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법은, 초임계 유체를 이용하여 상기 애엽 추출물에 포함되는 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 조절함에 따라 그 아토피 피부 질환에 대한 효과를 증대시킬 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 목적상 상기 애엽은 아토피에 대하여 치료 효과를 가지는 애엽이라면, 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 경동시장에서 구매한 알테미시아 알기 허바(Artemisia argyi Herba)를 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 애엽을 분말화하는 방법을 본 발명에서 한정하지는 않는다. 예컨대, 상기 애엽은 자연 건조, 가열 건조 또는 동결 건조된 것일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 이렇게 건조된 애엽을 당업계에 공지된 분쇄 방법을 이용하여 분말로 제조할 수도 있다.
본 발명에 있어서, "애엽 추출물"은 애엽 분말을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 애엽 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예컨대 뿌리, 지상부, 줄기, 잎 및 식물 조직 배양물로부터 추출 가능하다.
본 발명에 따른 애엽 추출물은 자가면역질환의 일종인 아토피 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 애엽 추출물은 유파틸린 및 자세오시딘을 최적 비율로 포함한다.
상기 유파틸린은 하기 화학식 1로 표시될 수 있고, 상기 자세오시딘은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112021143204214-pat00001
[화학식 2]
Figure 112021143204214-pat00002
본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법은 1) 애엽 분말에 추출 용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 추출물을 여과하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 여과된 여과물을 감압 농축한 후 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.
요컨대, 상기 초임계 추출방법은 상기 1), 2) 및 3) 단계를 포함하는 것일 수 있다.
초임계 유체기술은 저탄소 사회 패러다임하에서 물질 및 에너지 소비를 최소화하고 이산화탄소의 순환과 재생가능 물질을 활용하는 녹색기술의 대표적인 기술이다. 일반적으로 액체와 기체의 두 상태가 서로 분간할 수 없게 되는 임계상태에서의 온도와 이때의 증기압을 임계점이라고 한다. 초임계 유체는 '임계 온도와 압력 이상에서 있는 유체'로 정의되며, 온도와 압력이 기체와 액체의 임계점을 넘는 비응축성 유체로, 물질의 고유 성질을 갖는다.
초임계 유체 상태는 임계점을 넘어서기 때문에 분자의 열운동이 격렬하며, 상변화를 동반하지 않아 액체에 상당하는 용해력과 기체에 상당하는 확산성을 가지는 독특한 성질을 지니고 있다.
또한, 유체의 평형 물성(용해도, entrainer 효과), 전달 물성(점도, 확산계수, 열전도도)뿐만 아니라 용매화 및 분자 클러스터링 상태를 조절할 수 있다. 초임계 유체 기술의 특징은 압력과 온도를 변화시킴으로써 물성을 원하는 상태로 조율할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 특히, 인체에 무해하고 환경오염에 미치는 영향이 적은 이산화탄소와 같이 용매를 사용하게 되면 무독성, 환경친화성 공정 개발이 가능하다. 현재까지 상업적으로 많이 사용되고 있는 초임계 유체로는 환경에 대한 저항이 적고 화학적 안정성과 안정성, 저비용 등의 측면을 고려하여 초임계 이산화탄소, 초임계수, 초임계 알콜(메탄올, 에탄올)이 주목받고 있다. 가장 많이 활용되고 있는 용매는 이산화탄소로 초임계 이산화탄소(임계온도 31.1℃, 임계압력 7.4MPa)는 실온 부근인 35~100℃, 25~30MPa 조건에서 주로 사용되며, 공정 대상물이 열변성을 일으킬 염려가 적기 때문에 추출, 함침, 건조, 세정, 코팅반응, 재료합성, 가공 등의 용매로 널리 사용되고 있다. 초임계 유체기술은 상용화된 유기용매를 대체할 수 있는 무독성이고 친환경, 저에너지 용매를 사용한다는 장점으로 식품산업에서 그 중요성이 확대되고 있으며, 초임계 이산화탄소를 이용하는 추출공정은 인체에 무해할 뿐 아니라 불연성이고 화학적으로 안정하며 임계온도가 낮으므로 추출하는 활성성분의 변질을 일으키지 않는 장점을 가지고 있다. 이런 초임계 유체 추출기술은 식품가공에 적합해 카페인이 제거된 커피와 차, 맥주에 사용되는 호프 추출물, 향신료 등의 원료로서 향추출물 등에 널리 사용되어 왔으며, 갈수록 그 응용범위가 넓어지고 있다. 최근에는 건강과 환경을 중시하는 로하스(LOHAS: Lifestyle of Health and Sustainability) 마케팅에 초임계 유체기술의 필요성이 더욱 강조되고 있다
본 발명에서는 이러한 초임계 유체 기술을 이용하여 유파틸린 및 자세오시딘을 최적 비율로 포함함으로써 아토피에 효과적인 애엽 추출물의 제조가 가능하다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 공용매는 물, 메탄올, 에탄올, n-부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 공용매는 에탄올일 수 있다. 구체적으로 상기 공용매는 50 내지 100%의 에탄올일 수 있으며, 더욱 구체적으로 70 내지 100%, 보다 구체적으로 90 내지 100%의 에탄올일 수 있다. 상기 공용매가 에탄올인 경우 상기 애엽 추출물의 추출 효율 및 수율이 우수하고, 아토피 질환의 치료 효과면에서도 우수하므로 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 애엽 분말 1g 대비 상기 공용매는 1ml 내지 50ml로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 40ml, 더욱 바람직하게는 1 내지 20ml로 첨가될 수 있다.
상기 공용매가 상기 범위 내로 첨가되는 경우 추출 효율 및 추출물의 수율이 극대화되어 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 공용매는 5ml/min 내지 25ml/min의 속도, 바람직하게는 5 내지 20 ml/min의 속도, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 ml/min의 속도로 공급될 수 있다. 상기 공용매가 상기 범위 내의 속도로 공급되는 경우 유파틸린과 자세오시딘 성분의 추출이 더 용이하다는 이점이 있어 바람직하다.
상기 초임계 유체는 초임계 상태로 만든 이산화탄소를 이용할 수 있다.
구체적으로 상기 초임계 유체 추출 방법은 초임계 상태로 만든 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합 유체를 이용하는 것일 수 있다
예컨대, 본 발명에 따른 초임계 추출(Supercritical Fluid Extraction)은 일정 온도로 가온된 반응기에 액화 이산화탄소와 공용매로서 에탄올 수용액을 애엽 분말에 통과시켜 추출물을 수득한 후 상기 추출물을 증발 농축하고 농축물을 동결 건조하는 방법을 일컬을 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 초임계 추출방법에서 추출 온도는 30 내지 60℃이고, 압력은 100 내지 400bar일 수 있다.
요컨대, 본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법은, 30 내지 60℃, 100 내지 400bar 조건 하에서 만들어진 초임계 상태의 이산화탄소를 이용하는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 추출 온도는 32 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 32 내지 40℃일 수 있으며, 바람직하게는 상기 압력은 150 내지 400bar, 더욱 바람직하게는 250 내지 300bar일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 다만, 상기 추출 온도 및 상기 압력 범위를 만족하는 경우 상기 애엽 추출물의 추출 효율 및 수율이 극대화되고, 아토피 질환의 치료 효과 또한 우수하므로 상기 범위 내에서 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 초임계 유체는 30cc/min 내지 80cc/min, 바람직하게는 50cc/min 내지 70cc/min의 속도로 공급되는 것일 수 있다. 상기 초임계 유체가 상기 범위 내의 속도로 공급되는 경우 추출물의 수율이 극대화되는 이점이 있어 바람직하다.
상기 추출 시간은 1 내지 12시간, 바람직하게는 1 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 4시간일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기 추출 횟수는 바람직하게는 1 내지 2회일 수 있으나 역시 이에 한정되지 않는다. 다만, 상기 추출 시간 및 추출 횟수가 상기 범위를 만족하는 경우 애엽 추출물의 추출 효율, 수율 및 아토피 질환의 치료 효과면에서 바람직하기 때문에 상기 범위를 만족하는 것이 바람직하다.
상기 감압 농축은 바람직하게는 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다.
상기 건조는 바람직하게는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있고, 가장 바람직하게는 동결건조일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 유파틸린과 상기 자세오시딘의 추출비율은 20:1 내지 2:1, 바람직하게는 15:1 내지 3:1, 더욱 바람직하게는 10:1 내지 5:1일 수 있다.
본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법은 유파틸린과 자세오시딘의 추출비율을 상기 범위 내로 최적화하여 조절가능함에 따라 아토피 치료에 가장 효과적인 유파틸린과 자세오시딘의 적정비율을 함유하는 추출 조성물을 얻을 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 양태는, 전술한 애엽 추출물의 제조 방법으로 제조된 애엽 추출물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 애엽 추출물은 유파틸린 및 자세오시딘의 최적비율을 유효성분으로 포함하기 때문에 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 아토피 개선용 건강기능식품 조성물에 유용하게 적용 가능한 이점이 있다.
<아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물>
본 발명의 다른 양태는, 전술한 애엽 추출물의 제조 방법으로 제조된 애엽 추출물, 또는 추출물로 유파틸린 및 자세오시딘을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
요컨대, 본 발명의 다른 양태는, 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하는 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법으로 제조된 애엽 추출물을 이용한 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하여 DPPH 항산화 소거능 assay, No assay, IL-6 및 TNF-α 의 변화를 확인할 수 있는 ELISA test를 통해서 아토피 치료 효과를 기대할 수 있다.
현재까지 아토피 치료제로는 스테로이드제가 대표적이며, 병변 부위와 질환의 심한 정도에 따라 국소적으로 연고 또는 전신 스테로이드제를 복용하지만 장기간 사용시 피부 위축, 사용빈도를 줄이거나 끊게 되면 증상이 급격히 악화되는 경향이 있고, 만성질환에서는 전신 부작용의 가능성이 대두되어 지속적으로 사용이 어렵다. 또한, 가려움증 완화를 위해 항히스타민제제를 사용하기도 하는데 심한 부작용이 없는 비교적 안전한 약제로 알려져 있지만 졸리는 부작용이 있어 낮 시간대에 사용이 어려웠다. 또한, 타크로리무스(tacrolimus), 피메크로리무스(pimecrolimus) 성분으로 만든 국소면역조절제와 사이클로스포린(cyclosporine), 메쏘트레제이트(methotrexate), 마이코페놀레이트(mycophenolate) 성분인 전신면역억제제가 스테로이드를 대신할 수 있는 약제로 개발되었으나, 효과는 우수하지만 고혈압, 신기능 장애 등의 부작용이 나타날 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 "애엽"으로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하기 때문에 스테로이드제나 항히스타민제, 면역억제제의 부작용이 나타나지 않는다.
"자가면역질환"은 자가 항원에 대한 병리적 반응을 특징으로 하며 정상적인 신체 구성 요소에 대한 비정상적인 면역반응이 염증, 세포 손상 등을 일으킬 때 발생한다. 자가면역반응은 전신에 나타나거나 조직 또는 장기에 특이적일 수 있으며 급성 또는 만성일 수 있다. 일반적으로 자가면역질환의 치료에는 면역계의 활동을 감소시키는 면역억제제 사용이나 조직 손상을 유발하는 염증을 차단하는 항염증제를 투여하며, 뚜렷한 치료법이 없는 실정이다. 자가면역질환의 종류로는 류마티스관절염, 전신 홍반성 루푸스, 전신 경화증 및 아토피 등이 있으며, 본 발명에서는 애엽 추출물이 자가면역질환의 일종인 아토피에 효능을 가지고 있음을 확인하였다.
"아토피"는 자가면역 피부질환의 일종으로서, 주로 유아기 또는 소아기에 시작되어 만성 재발성의 염증성 피부질환으로 소양증과 피부건조증, 특징적인 습진을 동반한다. 유아기에는 얼굴과 팔다리의 폄 쪽 부분에 습진으로 시작되지만, 소아기가 되면서 특징적으로 팔 오금과 무릎 뒤 오금에 습진을 나타내며, 성장하면서 자연히 호전되는 경향을 보이지만 알레르기 비염, 천식 같은 호흡기 아토피를 동반하는 경우도 많다. 아토피의 발병 원인은 환경적인 요인, 유전적인 소인, 면역학적 이상 및 피부보호막의 이상 등 다양한 원인들이 알려져 있으나 정확한 발병 기전은 규명되지 않았다.
본 발명에서는 상기 애엽 추출물을 아토피 유발 동물 모델에 처리하였을 때, 관능 평가 시 시험물질 고용량군에서 통계적으로 유의하게 감소하였고, 용량상관성 있게 수치가 감소함을 확인할 수 있었으며, 혈액학 분석 결과에서도 부형제 대조군 대비 백혈구 수 감소 및 neutrophil, lymphocyte의 수가 감소하여 면역반응이 감소함을 확인하여 면역 억제됨을 확인할 수 있었다. 시험물질 고용량군은 부형제 대조군 대비 백혈구 수 감소, neutrophil 비율 감소, lymphocyte 비율 증가로 인한 면역반응이 전체적으로 감소하였기에 과도한 면역억제로 인한 영향으로 볼 수 있었다. 특히, 애엽 추출물이 500mg/kg 투여되었을 때, 아토피 치료 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 애엽 추출물은 자가면역질환의 일종인 아토피의 치료에 있어 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에 있어서, 상기 애엽 추출물은 상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 전체 100 중량%에 대하여 0.1 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 25 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.4 내지 20 중량%, 가장 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다만, 상기 애엽 추출물이 상기 범위 내로 포함되는 경우 아토피 치료에 항염, 항산화 활성이 가장 높은 이점이 있어 바람직하다.
본 발명에 있어서 "유효성분"은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 일컬을 수 있다.
본 발명에 있어서 "치료"는 특정 질병, 장애 및/또는 질환 또는 질환에 따른 증상을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 저해 또는 지연시키며, 중증도를 감소시키거나, 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생을 감소시키는 것을 일컬을 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에 있어서, 상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "담체"는 세포 또는 조직 내로 화합물의 이동을 용이하게 하는 화합물을 일컬을 수 있다.
본 발명에 있어서, "약학적으로 허용"되는 이란, 생리화학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 일컬을 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미결정셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에 있어서, 상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 항진균제, 항균제, 설파제, 면역억제제, 항염증제, 항생물질, 항바이러스제, 대사 길항제, 항히스타민제, 조직수복 촉진제, 비타민, 항알러지 제제 및 스테로이드제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 제제를 더 포함할 수 있다.
이 외에도 본 발명에 따른 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 그 목적을 저해하지 않는 범위라면 상기 성분들 이외에 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 첨가제의 함량을 특별히 한정하지는 않으며, 예컨대 통상의 제제화에 사용되는 범위 내에서 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 트로키제, 주사제 또는 엑스제의 형태로 제형화된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, "액제"는 의약품을 물 또는 유기 용매에 용해한 물약 상태로 먹는 약을 일컬을 수 있다. 상기 액제는 현탁제 또는 고형제에 비하여 장관에서의 전신 순환계로의 약물 흡수가 보다 효과적인 이점을 지니며, 상기 액제는 의약품 외에도 부가적인 용질도 포함할 수 있으며, 색깔, 냄새, 감미 혹은 안정성을 주는 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "현탁제"는 알기네이트 함유 조성물의 요망되는 용해도 및/또는 분산도를 제공할 수 있는 즉, 실질적으로 투명하며 침강 및 덩어리가 없는 수성 제제를 제공할 수 있는 어떠한 작용제를 일컬을 수 있다.
본 발명에 있어서, "산제"는 잘게 분할된 약물, 화학물질 또는 양자의 건조 상태의 혼합물을 일컬을 수 있다.
본 발명에 있어서, "과립제"는 의약용 또는 의약품의 혼합물을 입상으로 한 것으로, 보통 4.76 내지 20mm의 체를 통과하는 범위의 것을 말한다. 과립은 일반적으로 분말 또는 분말 혼합물을 적셔서 그 덩어리를 필요로 하는 과립의 크기에 따라 적당한 망 사이즈의 체 또는 과립기를 통과시킴으로써 생성한다. 과립제 역시 산제와 마찬가지로, 입자 상태이기 때문에 약물이 혀에 닿는 정도가 커서, 쓴맛을 가지는 약물을 과립제 형태로 사용할 경우에는 환자, 특히 어린이나 노약자에게는 불편함을 야기할 수 있다.
본 발명에 있어서, "정제"는 분말상의 의약품을 작은 원판 모양으로 압축하여 복용하기 쉽게 만든 것을 일컬을 수 있다. 정제는 나정, 필름 코팅정, 당의정, 다층정, 유핵정, 내핵정, 구강붕해정, 츄어블정, 발포정, 분산정, 용해정 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "캡슐제"는 의약품을 액상, 현탁상, 물상, 분말상, 과립상, 미니정제 또는 펠렛 등의 형태로 캡슐에 충전하거나 캡슐기제로 피포 성형하여 만든 것을 일컬을 수 있다.
본 발명에 있어서, "환제"는 결합제 및 기타 부형제와 혼합된 혼합입자를 포함하는 작고 둥근 고체 투여형을 포괄하는 의미일 수 있다.
본 발명에 있어서, "엑스제"는 식물성 또는 동물성 생약 중의 약효성분을 적당한 침출제를 사용해서 침출하고 용매를 증발시켜 규정된 농도로까지 농축하고 주성분함량의 규정이 있는 것에서는 부형제를 가해 함량을 조절해서 만든 반고형 또는 고형의 제제를 일컬을 수 있다.
본 발명에 있어서, "시럽제"는 설탕 또는 설탕 대용제의 농조한 수제를 일컬을 수 있다. 상기 시럽제는 불쾌한 맛, 예컨대 쓴맛이 있는 의약품을 액제로 하여 복용하기 쉽게 한 것으로, 특히 어린이들이 복용하기에 적합한 제형이다. 상기 시럽제는 정제수 및 추출물 외에 사당 또는 감미와 점성을 주기 위하여 쓰이는 사당의 대용약품, 항균성 보존제, 착미제 향료(flavor) 또는 착색제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 시럽제에 포함될 수 있는 감미제의 예로는 백당, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 아스파탐, 스테비오사이드, 과당, 유당, 수크랄로스, 사카린 또는 멘톨 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구투여용일 수 있다.
본 발명에 있어서 "경구투여"는 활성물질이 소화되도록 제조된 물질, 즉 흡수를 위한 위장기관으로 투여되는 것을 일컬을 수 있다. 상기 경구투여용 제제의 비제한적인 예로는, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제분말, 과립, 에멀젼, 하드캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 이칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "부형제"는 치료제가 아닌 어느 물질을 의미하며, 치료제의 전달을 위한 담체 또는 매체로 이용되거나 또는 약학적 조성물에 추가되는 것을 일컬을 수 있다. 이에 의해, 취급 및 저장 특성을 개선하거나 또는 조성물의 단위 투여량 형성을 허용 및 촉진시키게 된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적 조성물은 베타-사이클로덱스트린으로 포접된 포접 화합물을 포함하는 제제로 제형화된 것일 수 있다.
구체적으로 상기 포접 화합물은 베타-사이클로덱스트린 내부 공동에 상기 애엽 추출물의 건조 분말 또는 애엽 추출물로부터 분리된 유파틸린과 자세오시딘이 봉입되어 있는 형태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 베타-사이클로덱스트린은 2,6-디메틸-베타-사이클로덱스트린, 2-히드록시에틸-베타-사이클로덱스트린 및 2-히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.
상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 베타-사이클로덱스트린으로 포접된 포접 화합물을 포함하는 제제로 제형화되는 경우 추출물 특유의 향과 맛을 차폐하는 효과 및 약물의 생체이용률을 높이는 이점이 있어 바람직하다.
본 발명에 따른 아토피의 예방 또는 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위, 1 내지 8,000mg/kg의 범위, 5 내지 6,000mg/kg의 범위 또는 10 내지 4,000mg/kg의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 약 50 내지 2,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 아토피의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료제로 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 아토피의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 아토피의 예방 또는 치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
<아토피 개선용 건강기능식품 조성물>
본 발명의 다른 양태는, 전술한 애엽 추출물의 제조방법으로 제조된 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
요컨대, 본 발명의 다른 양태는, 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하는 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법으로 제조된 애엽 추출물은 자가면역질환의 대표적인 질병인 아토피 치료에 효과가 있어, 아토피 증세의 개선용 건강기능식품 또는 건강기능식품 조성물로서 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 본 발명의 혼합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 일컬을 수 있다. 본 발명에 있어서는 아토피에 유익한 효과가 있다.
본 발명에 있어서 "기능"이란, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적인 작용으로 보건 용도에 유용한 효과를 의미할 수 있다.
본 발명의 식품의 종류는 특별히 제한하지 않는다. 본 발명에 따른 애엽 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 캔디, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 젤리 및 음료 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 아토피 개선용 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 페게트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 그 밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으나, 역시 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로도 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법으로 제조된 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 이외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 포함할 수 있으며 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 애엽 추출물은 아토피 개선 또는 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 애엽 추출물의 양은 식품 전체 100 중량%에 대하여 0.01 내지 30 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물인 경우 음료 100ml를 기준으로 0.01 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%의 비율로 가할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 유효성분은 유파틸린과 자세오시딘은 상기 아토피 개선용 건강기능식품 조성물 전체 100 중량%에 대하여 0.1 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 아토피 개선용 건강기능식품 조성물은 본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조 방법으로 제조된 애엽 추출물 외 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 예컨대, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 첨가제로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 사카라이드류가 있으며, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 있을 수 있다.
상기 향미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제, 사카린, 아스파탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물, 제제 및 건강기능식품 조성물에서 언급된 사항은 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 포함하는 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하기 때문에 아토피 개선에 효과적이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. 또한, 이하에서 함유량을 나타내는 "%" 및 "부"는 특별히 언급하지 않는 한 중량 기준이다.
실시예 1: 유파틸린(Eupatilin)과 자세오시딘(Jaceosidin)의 비율별 효과 확인
애엽의 대표적 유효성분인 유파틸린(Eupatilin)과 자세오시딘(Jaceosidin)의 비율별 효과의 차이를 하기의 실험예를 통해 확인하였다.
실험예 1: 염증성 싸이토카인 활성 확인(IL-6, TNF-α)
염증성 싸이토카인 활성의 확인은 LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 raw 264.7 cell에 물질을 처리하여 분석하여 효능을 평가하였다.
염증성 싸이토카인의 활성을 평가하기 위한 raw 264.7 cell 배양 및 처리방법은 하기와 같이 수행되었다.
유파틸린(CFN90190, Chemfaces)과 자세오시딘(CFN90386, Chemfaces)의 비율을 Eu:Ja의 비율 10:1, 5:1, 3:1로 혼합하여 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 시료를 준비하였다.
마우스 대식세포인 raw 264.7 cell을 10% FBS DMEM 배지를 넣고 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. raw 264.7 대식세포를 96 well plate에 4×104 cells/well의 세포 수로 분주하고 24시간 후 LPS를 2㎍/㎖ 농도로 처리하였다.
다음으로 앞서 제조한 유파틸린과 자세오시딘의 비율별로 혼합된 시료를 100㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 배양한 뒤 배양액을 수거하여 ELISA kit 사용자 매뉴얼에 기재된 방법대로 실험을 수행하여 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1의 결과를 살펴보면 유파틸린과 자세오시딘의 비율이 5:1인 시료에서 부형제인 DMSO 처리군에 비교하여 염증성 cytokine인 IL-6의 활성이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2의 결과에서도 다른 비율보다 5:1 비율의 시료에서 TNF-α의 활성이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: Nitric oxide (NO)농도 측정
LPS로 유도된 raw 264.7 세포에서 유파틸린과 자세오시딘의 비율별 NO 생성 억제를 측정하기 위해 실험예 1에서 준비된 3가지 시료와 LPS 2㎍/㎖를 동시처리하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후 griess reagent system을 이용하여 NO를 측정하였으며, 96 well plate에 세포 배양 상등액과 griess reagent를 1:1로 혼합하여 넣고 10분 동안 반응시킨 후 ELISA microplate reader(Infinite 200 pro, TECAN, Mnnedrf, Switzerland)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과를 살펴보면, 유파틸린과 자세오시딘의 조제 비율이 10: 1과 5:1에서 유의적으로 감소하는 경향을 보였으며, 최적의 비율은 5:1임을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 본 발명의 애엽 추출물 내 유효성분인 유파틸린과 자세오시딘의 비율별로 효과를 보이는 정도가 다름을 확인할 수 있었다. 애엽 추출물 내에서 유파틸린과 자세오시딘이 최적 비율로 일정하게 추출하기 위한 제조방법을 알아보기 위해 하기와 같이 실험하였다.
실시예 2: 유파틸린과 자세오시딘의 최적 비율 5:1을 안정적으로 추출하기 위한 제조방법
유파틸린과 자세오시딘을 최적 비율로 안정적으로 추출하기 위하여 하기의 실험예를 통해 확인하였다.
실험예 3: 환류 추출과 초임계유체 추출의 함량 비교
애엽을 물로 깨끗이 세척하여 건조한 후, 분쇄하여 환류 추출과 초임계유체 추출을 수행하였다.
실험예 3-1: 환류 추출 및 함량
100g의 애엽 분말을 공용매 95% 에탄올 1L로 60℃ 2시간 환류 추출하고, 추출여액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 감압 농축한 후 동결건조하여 고형분 5g을 얻었다.
애엽 추출물(고형분)을 DMSO로 희석하여 최종 농도를 조절하고 0.45㎛ 필터로 여과하여 조제한 샘플을 HPLC(High pressure liquid Chromatography)에 주입하여 분석하였다. 이동상은 아세토니트릴과 0.1% 개미산을 물에 50:50 (v/v%)의 비율로 섞은 혼합물이고, 유속은 1.0mL/min, UV 파장은 341nm였다. 컬럼은 C18(4.6 x 250 mm, 5㎛) Agilent column을 사용하여 유파틸린 및 자세오시딘 함량을 얻었으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
실험예 3-2: 초임계유체 추출 및 함량
애엽을 구입하여 세척한 후 건조기를 이용하여 55℃에서 5시간 건조하였다. 건조된 애엽 100g을 분쇄하여 초임계 추출기(Supercritical fluid extractor, 5L SCF SYSTEM, 포스엔텍, 한국)의 5L 추출조에 넣고 액화 이산화탄소 공급펌프를 통하여 이산화탄소를 70 cc/min의 속도로 공급하면서 온도 60℃ 및 압력 250 기압 조건의 초임계 상태로 만들어, 공용매 95% 에탄올 1L를 10ml/min의 유속으로 추출하였다. 추출여액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 회전감압농축기(EYELA, A-3S, 일본)로 감압 농축한 후 동결건조기(BK-80N50, 중국)로 동결건조하여 고형분 10g을 얻었다. 상기 온도 및 압력은 향후 최적 추출 조건을 수립하기 위해 기본 추출 조건으로 설정하였다.
실험예 3-1과 동일한 방법으로 추출물 수득량, 유파틸린 및 자세오시딘 함량을 얻었으며 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
환류 추출물 초임계유체 추출물
추출물 수득량(g) 4.5±1.5 9.8±0.7
유파틸린 함량(%) 0.54±0.22 0.85±0.21
자세오시딘 함량(%) 0.21±0.10 0.16±0.09
동일량의 애엽 분말을 환류 추출과 초임계 추출하였을 때 환류 추출 대비 초임계 추출에서 수득량은 약 2.0배, 유파틸린의 함량은 약 1.5배 많은 것을 확인할 수 있었다. 자세오시딘의 함량은 환류 추출물과 초임계 추출물에서 비슷한 값을 보였다.
환류 추출법 대비 초임계 추출법에서 애엽 추출물을 약 2배 획득할 수 있었으며, 유효성분인 유파틸린의 추출이 매우 효과적임을 알 수 있다.
실험예 4: 초임계 추출의 공용매 에탄올의 농도별 유효성분 함량 확인
상기 실험예 3의 결과에 따라 초임계 추출법의 상세 조건을 설정하기 위하여, 공용매 에탄올 수용액의 농도별 유효성분 함량을 확인하였다.
상기 실시예 3-2와 같이 100g의 애엽 건조 분말을 초임계 추출기(Supercritical fluid extractor, 5L SCF SYSTEM, 포스엔텍, 한국)의 5L 추출조에 넣고 액화 이산화탄소 공급펌프를 통하여 이산화탄소를 70 cc/min의 속도로 공급하면서 온도 60℃ 및 압력 250 기압을 공통조건으로 설정하고, 70, 80, 90, 95, 100%의 공용매 에탄올 수용액의 농도를 달리하여 15ml/min 유속으로 2L 이용하여 초임계 추출하였다. 이에 추출여액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 회전감압농축기(EYELA, A-3S, 일본)로 감압 농축한 후 동결건조기(BK-80N50, 중국)로 동결건조하여 고형분을 수득하고, 고형분을 분석하여 하기의 표 2와 같은 결과를 얻었다.
공통조건 애엽 분말 투입량
공용매 유속/량
추출조 온도/압력		 100g
15ml/min /2L
60℃/ 250bar
공용매 에탄올(%) 70 80 90 95 100
수득량(g) 9.1±1.1 9.5±0.3 9.4±0.7 9.6±0.7 9.8±0.3
유파틸린 함량(%) 0.74±0.24 0.68±0.18 0.81±0.09 0.92±0.13 0.94±0.11
자세오시딘 함량(%) 0.16±0.11 0.19±0.15 0.22±0.11 0.22±0.15 0.19±0.12
공용매 에탄올 수용액의 농도별로 비교하였을 때, 추출물의 수득량에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 유파틸린은 100% 공용매에서 가장 함량이 많은 것을 확인하였으며, 95% 에탄올 수용액과 100% 에탄올로 추출한 애엽 추출물의 유파틸린 함량은 큰 차이를 보이지 않았다. 자세오시딘은 90 내지 95% 공용매에서 함량이 많았으며, 80%와 100%에서도 차이는 크지 않았다. 최적 비율은 95% 에탄올 수용액 내지 100% 에탄올 조건에서 근접하게 나온 것을 확인할 수 있었다.
다음 조건을 설정하기 위하여 공용매는 100%를 선택하기로 하였다.
실험예 5: 초임계 추출의 공용매 에탄올의 유속에 따른 유효성분 함량 확인
상기 실시예 4에서 확인된 공용매인 100% 에탄올을 공통조건으로 포함하여 최적 초임계 추출법의 상세조건을 설정하기 위하여, 공용매 에탄올의 유속에 따른 유효성분 함량을 확인하였다.
100g의 애엽 분말을 초임계 추출기(Supercritical fluid extractor, 5L SCF SYSTEM, 포스엔텍, 한국)의 5L 추출조에 넣고 액화 이산화탄소 공급펌프를 통하여 이산화탄소를 70 cc/min의 속도로 공급하면서 2L의 100% 에탄올을 공용매로 하고, 온도 60℃ 및 압력 250 기압을 공통조건으로 설정하였다. 공용매인 100% 에탄올의 유속을 10ml/min, 15ml/min, 20ml/min으로 설정하여 초임계 추출하였다. 이에 추출여액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 회전감압농축기(EYELA, A-3S, 일본)로 감압 농축한 후 동결건조기(BK-80N50, 중국)로 동결건조하여 고형분을 수득하고, 고형분을 분석하여 하기의 표 3와 같은 결과를 얻었다.
공통조건 애엽 분말 투입량
공용매 농도/량
추출조 온도/압력		 100g
100% / 2L
60℃/ 250bar
공용매 에탄올 유속(ml/min) 10 15 20
수득량(g) 8.9±0.8 9.1±0.4 9.0±0.6
유파틸린 함량(%) 0.94±0.08 0.96±0.05 0.78±0.06
자세오시딘 함량(%) 0.18±0.04 0.2±0.06 0.18±0.06
공용매 100% 에탄올이 투입되는 유속의 차이에서 추출물의 수득량은 큰 차이를 보이지 않았다. 유파틸린과 자세오시딘의 함량은 20ml/min에서는 유파틸린 0.78±0.06%, 자세오시딘 0.18±0.06%이고, 15ml/min과 10ml/min 조건에서는 유파틸린 0.96±0.05%, 0.94±0.08%, 자세오시딘 0.2±0.06%, 0.18±0.04%로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.
공용매의 유속은 15ml/min 이하에서 유효성분 함량이 많은 것을 확인할 수 있었다. 유파틸린과 자세오시딘의 최적비율 또한 15ml/min과 10ml/min 조건에서 근사값을 나타냄을 확인할 수 있었다. 공용매의 유속은 15ml/min으로 선택하였다.
실험예 6: 초임계 추출의 공용매 에탄올의 양에 따른 유효성분 함량 확인
상기 실험예 5에서 확인된 공용매 100% 에탄올, 유속 15ml/min을 공통조건으로 포함하여 초임계 추출법의 상세조건을 설정하기 위하여, 공용매 에탄올의 양에 따른 유효성분 함량을 확인하였다.
100g의 애엽 분말을 초임계 추출기(Supercritical fluid extractor, 5L SCF SYSTEM, 포스엔텍, 한국)의 5L 추출조에 넣고 액화 이산화탄소 공급펌프를 통하여 이산화탄소를 70 cc/min의 속도로 공급하면서 100% 에탄올을 공용매로 하여 15ml/min으로 공급하고, 온도 60℃ 및 압력 250 기압을 공통조건으로 설정하였다. 공용매인 100% 에탄올의 투입량을 각각 1L, 2L, 4L를 15ml/min 유속으로 공급하여 초임계 추출하였다. 이에 추출여액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 회전감압농축기(EYELA, A-3S, 일본)로 감압 농축한 후 동결건조기(BK-80N50, 중국)로 동결건조하여 고형분을 수득하고, 고형분을 분석하여 하기의 표 4와 같은 결과를 얻었다.
공통조건 애엽 분말량
공용매 농도/유속
추출조 온도/압력		 100g
100% / 15ml/min
60℃/ 250bar
공용매 에탄올 량(L) 1 2 4
수득량(g) 5.4±0.4 9.5±0.8 9.4±0.4
유파틸린 함량(%) 0.66±0.04 0.93±0.10 0.89±0.09
자세오시딘 함량(%) 0.18±0.04 0.20±0.05 0.21±0.08
공용매 100% 에탄올의 공급량에서는 1L를 공급하였을 때의 수득량이 2L, 4L 공급하였을 때와 비교하여 약 40% 감소하였다. 반면, 2L와 4L 공급량에서는 수득량의 차이가 거의 없었다. 유파틸린과 자세오시딘의 함량은 공급량 1L에서는 유파틸린 0.66±0.04%, 자세오시딘 0.18±0.04%이고, 2L와 4L에서는 유파틸린 0.93±0.10, 0.89±0.09%, 자세오시딘 0.20±0.05, 0.21±0.08 %로 큰 차이를 보이지 않았다.
공용매의 공급량은 2L 이상에서 유효성분 함량이 많은 것을 확인할 수 있었으며, 최적 비율의 조건도 2L 이상에서 근사값을 나타냄을 확인할 수 있었다. 공용매의 공급량은 2L로 선택하였다.
실험예 7: 초임계 추출의 추출조 온도와 압력에 따른 유효성분 함량 확인
상기 실험예 6에서 확인된 공용매 100% 에탄올, 유속 15ml/min을 2L 공급하는 공통조건으로 포함하여 초임계 추출법의 상세조건을 설정하기 위하여, 추출조 온도와 압력에 따른 유효성분 함량을 확인하였다.
100g의 애엽 분말을 초임계 추출기(Supercritical fluid extractor, 5L SCF SYSTEM, 포스엔텍, 한국)의 5L 추출조에 넣고 액화 이산화탄소 공급펌프를 통하여 이산화탄소를 70 cc/min의 속도로 공급하면서 2L의 100% 에탄올을 공용매로 하여 15ml/min으로 공급하는 것을 공통조건으로 설정하였다. 초임계 추출 시 추출온도를 에탄올 임계온도 이상인 32℃, 40℃, 50℃, 60℃로 설정하고 압력은 150bar, 250bar, 300bar, 380bar로 설정하여 초임계 추출하였다. 이에 추출여액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 회전감압농축기(EYELA, A-3S, 일본)로 감압 농축한 후 동결건조기(BK-80N50, 중국)로 동결건조하여 고형분을 수득하고, 고형분을 분석하여 하기의 표 5와 같은 결과를 얻었다.
공통조건 애엽 분말량
공용매 농도/유속
공용매 양		 100g
100% / 15ml/min
2L
추출온도(℃) 32 40
추출압력(bar) 150 250 350 400 150 250 350 400
수득량(g) 8.6±0.8 9.2±0.5 9.2±0.2 9.3±0.4 8.8±0.8 9.5±0.8 9.1±0.4 8.8±0.5
유파틸린 함량(%) 0.84±0.05 0.98±0.02 0.96±0.01 0.92±0.02 0.82±0.03 0.98±0.01 0.93±0.04 0.88±0.05
자세오시딘 함량(%) 0.22±0.01 0.20±0.02 0.19±0.03 0.16±0.03 0.19±0.03 0.20±0.05 0.18±0.05 0.23±0.05
추출온도(℃) 50 60
추출압력(bar) 150 250 350 400 150 250 350 400
수득량(g) 7.4±0.6 8.8±0.4 8.6±0.3 8.6±0.4 7.5±0.8 8.5±0.8 8.9±0.2 9.0±0.2
유파틸린 함량(%) 0.77±0.08 0.89±0.04 0.91±0.02 0.88±0.02 0.77±0.10 0.89±0.03 0.90±0.03 0.86±0.02
자세오시딘 함량(%) 0.19±0.02 0.18±0.01 0.19±0.05 0.16±0.08 0.21±0.04 0.24±0.02 0.25±0.02 0.24±0.01
전체 추출온도와 압력변화에서 애엽 추출물의 수득량은 조건별로 차이가 있었으며, 온도가 높아질수록 수득량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 온도조건에서는 유파틸린이 32 내지 40℃에서 가장 높은 함량을 보였으며, 50℃, 60℃에서는 근소하게 함량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 자세오시딘은 60℃를 제외한 추출 온도별로 크게 차이를 보이지 않았다. 압력에 따른 유파틸린의 함량은 150bar에서 가장 낮은 값을 보였으며, 250bar에서 최적으로 추출되었다.
본 실험에서는 250bar, 32℃에서 유파틸린과 자세오시딘의 비율이 5:1로 안정적으로 추출됨을 확인할 수 있었다.
실험예 8: 초임계 추출에서 수득한 애엽 추출물의 in vitro 실험
본 실험은 앞서 실시예 1에서 유파틸린과 자세오시딘 혼합물의 비율별 비교 실험이 상기 초임계 추출에서 얻어진 유파틸린과 자세오시딘의 최적비율을 포함하는 애엽 추출물에서 재현이 되는지 확인하기 위함이다.
실험예 8-1: MTT assay
본 실험은 애엽 추출물에 대한 세포독성을 확인하는 시험으로, 보편적으로 사용하는 MTT 시험법을 이용하였다. MTT assay는 미토콘드리아의 활성을 측정하는 실험으로 살아있는 세포에 MTT를 처리하면 MTT가 미토콘드리아에 있는 리덕테이즈(reductase)에 의해 포르마잔(formazan)이라 불리는 크리스탈을 형성하는데, 죽은 세포에서는 리덕테이즈가 존재하지 않으므로, 살아있는 세포의 포르마잔을 색으로 확인하여 독성을 확인하는 실험이다.
애엽 추출물은 유파틸린과 자세오시딘이 10:1, 5:1, 3:1의 비율을 포함하는 추출물에 DMSO를 넣어 녹여 시료를 준비하였다.
먼저 마우스 대식세포인 raw 264.7 cell을 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 넣고 37℃, 5% CO2의 조건에서 80% 정도 배양한 뒤, 배양액을 버리고 앞서 준비한 시료와 플레인 배양배지를 혼합하여 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지와 시료를 걷어내고 PBS로 세척을 한 후에 MTT 솔루션을 처리한 후에 암실 상태로 2~4시간 인큐베이터에서 보관하였다. MTT 솔루션을 걷어내고 DMSO을 넣어준 후 shaking 해준 후 ELISA로 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 결과를 보면, Y축은 살아있는 세포의 양, X축은 추출물의 농도이다. 추출물을 처리하지 않은 경우와 비교했을 때, 150㎍/ml로 처리했을 때, 50% 이하로 떨어짐을 확인할 수 있었다. 이는 애엽 추출물의 양이 많아지면 세포의 성장을 억제하기 때문에, 독성으로 작용할 수 있다. 이 결과, 추출물의 최대 처리 농도는 100㎍/ml으로 볼 수가 있다.
실험예 8-2: DPPH 라디칼 소거능
DPPH(α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해, 0.15mM 농도로 메탄올로 용해한 DPPH 용액을 튜브당 2㎖에 분획시료 300㎕ 및 DPPH 메탄올 1700㎕를 혼합하였다. 실온에서 30분 간 반응시킨 다음 하기 식 1을 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
[식 1]
DPPH 라디칼 소거 활성 (%) = (대조구의 흡광도 - (실험구의 흡광도/대조구의 흡광도)) × 100
(실험구의 흡광도: 시료를 가한 시험액의 흡광도, 대조구의 흡광도: 시료 대신 용매를 가한 시험액의 흡광도)
도 5의 결과에 따르면, 항산화능이 가장 좋은 비율은 5:1이며, 10:1 → 3:1 순으로 나타났다.
실험예 8-3: in vitro 실험(IL-6, TNF-α)
염증성 싸이토카인 활성의 확인은 LPS로 유도된 raw 264.7 cell에 물질을 처리하여 분석하여 효능을 평가하였다.
염증성 싸이토카인의 활성을 평가하기 위한 raw 264.7 cell 배양 및 처리방법은 하기와 같이 수행되었다.
유파틸린(CFN90190, Chemfaces)과 자세오시딘(CFN90386, Chemfaces)의 비율을 Eu:Ja의 비율 10:1, 5:1, 3:1로 혼합하여DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 시료를 준비하였다.
마우스 대식세포인 raw 264.7 cell을 10% FBS DMEM 배지를 넣고 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. raw 264.7 대식세포를 96 well plate에 4x104 cells/well의 세포 수로 분주하고 24시간 후 LPS를 2㎍/㎖ 농도로 처리하였다.
다음으로 앞서 제조한 유파틸린과 자세오시딘의 비율별로 혼합된 시료를 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 인큐베이션한 뒤 배양액을 수거하여 ELISA kit 사용자 매뉴얼에 기재된 방법대로 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6, 도 7의 결과를 살펴보면, IL-6 활성의 경우 부형제인 DMSO 처리군에 비해 전체적으로 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 그 중 유파틸린과 자세오시딘 5:1 비율을 포함하는 애엽 추출물이 가장 활성이 감소하는 것을 볼 수 있었다. TNF-α 활성의 경우 부형제인 DMSO 처리군에 비교하여 염증성 cytokine인 TNF-α의 활성이 5:1 비율을 포함하는 애엽 추출물에서 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8-4: NO assay
LPS로 유도된 raw 264.7 세포에서 초임계로 추출한 유파틸린과 자세오시딘이 최적 비율로 포함된 애엽 추출물의 NO 생성 억제를 측정하기 위해 실험예 1에서 준비된 3가지 시료와 LPS 2㎍/㎖를 동시처리하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후 griess reagent system을 이용하여 NO를 측정하였으며, 96 well plate에 세포 배양 상등액과 griess reagent를 1:1로 혼합하여 넣고 10분 동안 반응시킨 후 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Mnnedrf, Switzerland)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8의 결과를 살펴보면, 유파틸린과 자세오시딘 5:1 비율을 포함하는 애엽 추출물이 가장 NO의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 9: 초임계 추출에서 수득한 애엽 추출물의 in vivo 실험
본 실험은 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene)로 아토피가 유발된 Balb/c 마우스에 시험물질1종(유파틸린과 자세오시딘 5:1 비율이 포함된 애엽 추출물)의 경구 투여시 개선 효능을 알아보기 위하여 수행하였다.
20g 내외의 생후 6주령 수컷 Balb/c 마우스를 5일 동안 정상 식이를 공급하면서 실험실 환경에 적응시킨 후 본 실험을 시작하였다. 실험기간 동안 명암주기 12시간 간격(오전 7시 점등 ~ 오후 7시 소등), 온도 19.57 ~ 24.13℃, 상대습도 38.37 ~ 68.2%로 실험실 환경을 유지하였다.
군 성별 투여량
(mg/kg)		 투여액량
(ml/kg/day)		 동물 수(동물번호)
G1 음성대조군 M 0 10 10 (1101-1110)
G2 유발군 M 0 10 10 (1201-1210)
G3 양성대조군 M 1 2.5 10 (1301-1310)
G4 시험물질I(저용량)군 M 200 10 10 (1401-1410)
G5 시험물질I(중용량)군 M 500 10 10 (1501-1510)
G6 시험물질I(고용량)군 M 1,000 10 10 (1601-1610)
아토피 피부염 유발은 첫 유발 1일 전에 등배부를 깨끗하게 제모하고 미세상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 이후 제모는 주 1회 이상 실시하였다. 아토피 피부염 유발물질(DNBC)는 아세톤과 올리브오일이 3대 1의 비율로 조제하여 1%를 등배부에 편편한 스틱으로 균일하게 도포하였다. 2회차부터는 SDS 용액으로 등배부를 닦아 큐티클 층과 지방성분을 제거한 후 0.2% DNBC(아세톤: 올리브오일=3:1)를 주 2회, 4주간 도포하였다. 음성대조군에는 동량의 용매를 동일한 방법으로 도포하였다.
적정량의 애엽 추출물을 전자저울로 칭량하여 폴리프로필렌 튜브에 넣고 0.5% 소듐 카르복실메틸셀룰로오스(CMC-Na)를 넣어 가온하고 vortex mixer로 혼합하여 조제하였다. 사료와 음수는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 시험물질의 투여 경로는 경구투여하였고, 양성대조물질은 복강투여로 하였다. 시험물질 투여는 1회/일, 7회/주로 하며, 29일간 투여하였고, 양성대조물질은 1회/일, 6회/주로 25일 투여하였다. 아토피 유발 후 시험물질 투여를 진행하며, 아토피 유발을 4주간 진행하고 시험물질은 4주간 투여하며 유발과 시험물질 투여를 2주간 병행하였다. 시험물질은 경구투여용 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 위 내에 강제투여하고, 양성대조물질은 투여 시 동물을 고정하고 투여할 부위에 주사침 및 주사기를 이용하여 복강에 투여하였다.
4주간의 사망률, 일반증상, 체중, 관능평가 및 부검소견을 관찰, 부형제 대조군과 비교하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
실험예 9-1: 4주 간의 일반증상 관찰 및 Body weight
투여 및 관찰기간 동안 사망여부, 일반증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 1일 1회 관찰하고 개체별로 기록하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
모든 군에서 사망동물은 관찰되지 않았고 특이할 만한 일반증상은 관찰되지 않았다.
동물입수 시, 군분리 및 투여개시(투여전, Day 1), 이후 주 1회(Day 8,15,22, 29), 부검일(Day 30)에 측정하였다.
Day 1에 G2의 체중에 비해 다른 모든 군의 동물 체중이 높았으나, Day 8, Day 15 및 Day 22에 G3 및 G4의 체중이 G2에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였고, Day 29 및 Day 30에 G3의 체중이 G2에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였다. 증체량에서도 G3 및 G4의 체중이 G2에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였다.
Body weight (N = 10)
Days (Mean ± SD) Gain
1 8 15 22 29 30
G1 22.14 ± 1.07 22.41 ± 1.16 23.11 ± 1.11 23.23 ± 1.07 24.10 ± 0.86 24.54 ± 1.01 2.40 ± 1.42
G2 20.00 ± 1.48 22.79 ± 1.00 23.49 ± 1.06 24.03 ± 0.93 24.64 ± 1.12 24.79 ± 1.02 2.40 ± 1.42
G3 21.22 ± 0.80 21.37 ± 0.72 22.43 ± 1.01 23.36 ± 0.83 24.07 ± 0.57 24.51 ± 0.40 0.62 ± 1.59
G4 22.20* ± 1.02 21.32* ± 1.31 22.41* ± 1.15 22.86* ± 1.37 23.89 ± 1.25 24.24 ± 1.59 2.04 ± 2.10
G5 21.23* ± 1.22 21.98 ± 0.78 22.81 ± 0.78 23.57 ± 0.78 24.14 ± 0.96 24.58 ± 1.21 3.35 ± 1.64
G6 21.23* ± 1.25 22.22 ± 1.01 23.18 ± 1.08 23.66 ± 1.01 24.68 ± 1.15 24.78 ± 1.29 3.54 ± 2.24
*p < 0.05
실험예 9-2: 관능평가
첫 유발 당일 및 주 1회 확인하였으며, 등 부위의 피부병변 정도를 보기 위해 육안으로 관찰하여 각 군의 아토피성 피부염 상태를 확인하였다. 아토피성 피부염 상태는 하기 평가지표에 따라 없음(0), 약함(1), 중증도(2), 심함(3)으로 채점하고, 5개 항목의 점수를 합산하여 최소 0점에서 최고 15점 사이의 평가점수를 부여하며, 평가는 주 1회 동일한 시험자가 수행하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.
관능평가 결과, G1 대비 G2에서 통계적으로 유의하게 수치가 증가하였고, G2 대비 G3에서는 수치가 감소하였다. Day 1에 G2 대비 다른 모든 군에서 유의성이 없었으나 Day 8에 G2 대비 G4, G5에서 유의하게 증가하였고, Day 22에 G2 대비 G4가 유의하게 증가함을 확인하였다. Day 29에 G2 대비 G6에서 유의하게 감소함을 확인하였다.
평가지표
점수 홍반
(Erythema)		 피부건조
(Dry skin)		 부종, 혈종
(Edema & Hematoma)		 짓무름
(Erosion)		 태선화
(Lichenification)
0 없음 없음 없음 없음 없음
1 약함 약함 약함 약함 약함
2 중증도 중증도 중증도 중증도 중증도
3 심함 심함 심함 심함 심함
실험예 9-3: 부검
투여기간 종료 후, 생존동물 중 앞번호 5마리에 대해서 isoflurane으로 마취하여 후대정맥으로 채혈을 실시한 후, 항응고제인 EDTA가 들어있는 CBC bottle에 주입하였다. 혈액학적 검사에 사용되는 0.2mL 혈액을 취하고 복대동맥 및 후대정맥을 절단하여 방혈/치사시켰다. 액와림프절(axillary lymph node)를 절취하여 무게를 측정하고 cell strainer를 이용하여 세포로 분리하여 배양하였다.
생존동물 중 뒷번호 5마리에 대해서 isoflurane으로 마취하여 후대정맥으로 채혈을 실시하고 SST bottle에 주입하여 혈청을 분리하고 초저온냉동고에 보관하였다. 피부조직의 병변 확인 및 피부두께를 측정을 위하여 피부를 적출하여 formalin에 담가 보관하였다. 부검 시 소견 결과, G3의 한 개체에서 장유착이 발견되었고, 다른 모든 개체에서는 특이할 만한 소견이 없었다.
실험예 9-4: 장기중량
실험예 9-3에서 부검 후 액와림프절 및 비장을 적출하여 무게를 측정하여 그 결과를 표 9, 도 11 내지 13에 나타내었다. 액와림프절은 G2 대비 G3에서 유의하게 감소하고 G4에서 유의하게 증가하는 것으로 확인하였다. 비장 무게 및 spleen index는 G2 대비 G3에서 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다. 비장 무게 및 Spleen index는 G2 대비 G3에서 유의하게 감소함을 확인하였다.
Organ weight
Spleen (n = 10)
(Mean ± SD)		 Axillary Lymph Node (n = 5)
(Mean ± SD)
Weight (g) Index (%) Weight (g)
G1 0.08 ± 0.007 0.328 ± 0.028 0.005 ± 0.003
G2 0.086 ± 0.008 0.347 ± 0.027 0.009 ± 0.001
G3 0.055 ± 0.009 0.251 ± 0.032 0.004 ± 0.001
G4 0.086 ± 0.012 0.354 ± 0.044 0.012* ± 0.003
G5 0.083 ± 0.008 0.337 ± 0.03 0.010 ± 0.002
G6 0.087 ± 0.009 0.353 ± 0.039 0.008 ± 0.002
*P < 0.05
실험예 9-5: 혈액학적 검사
실험예 9-3에서 부검 후 CBC bottle에 있는 혈액을 이용하여 자동 혈구분석기(Advia2120i, SIEMENS, USA)로 다음 항목을 측정하여 그 결과를 도 14 내지 18에 나타내었다.
(백혈구(WBC) / 호중구(NEU) / 림프구(LYM) / 단핵구(MONO) / 호산구(EOS) / 호염구(BASO) / 대형비염색성세포(LUC))
그 결과 혈액학 검사에서 백혈구의 농도 및 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염구, 대형비염색성세포의 비율을 확인하였으며 백혈구는 G2 대비 G5에서 유의하게 감소하였고, 호중구는 G2 대비 G3에서 유의하게 증가하였다. 림프구는 G2 대비 G3에서 유의하게 감소하였고, 단핵구, 호산구 및 호염구는 G2 대비 모든 군에서 통계적으로 유의성이 없었다. 대형비염색성세포는 G2 대비 G3에서 유의하게 감소하였다.
실험예 9-6: Cytokine
실험예 9-3에서 부검 후 액와림프절 세포 배양액에서 시판중인 Mouse Premixed Multi-Analyte Kit (Luminex Assay)를 이용하여 Cytokine(IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, IFN-γ)의 수준을 정량하여 그 결과를 표 10에 나타내었다.
그 결과 Cytokine IFN-γ는 G2 대비 G5, G6에서 감소하는 경향이 나타났고, IL-2는 G2 대비 G3에서 유의하게 감소하고, G5, G6에서 통계적으로 유의하게 감소하였다. IL-4는 G2 대비 G3, G5, G6에서 감소하는 경향이 나타났고, IL-5 및 TNF-α는 G2 대비 다른 모든 군에서 유의성이 없었다. IL-6는 모든 군에서 검출한계 이하의 값으로 측정되었다.
Cytokine activity (N = 10)
Cytokines (Mean ± SD)
IL-2 IL-4 IL-5 TNF-α IFN-γ
G1 6.32 ± 3.01 19.19 ± 7.41 1.82 ± 0.16 8.76 ± 6.44 384.10 ± 291.68
G2 14.81 ± 4.49 21.24 ± 5.57 2.63 ± 1.07 16.32 ± 5.05 836.82 ± 561.19
G3 4.49* ± 2.04 14.34* ± 7.75 2.65 ± 1.59 12.52* ± 4.53 539.85* ± 362.66
G4 8.81 ± 2.12 21.68 ± 15.36 5.69* ± 1.84 15.92 ± 3.39 841.47 ± 331.01
G5 4.77* ± 0.97 14.45* ± 3.46 2.57 ± 2.57 12.85* ± 2.22 552.33* ± 215.40
G6 5.17* ± 3.2 15.09* ± 7.92 3.65 ± 2.46 12.61* ± 6.44 523.95* ± 516.32
*P < 0.05
실험예 9-7: 피부조직 병변 판독 및 피부 두께 측정
실험예 9-3에서 부검 후 피부의 두께를 측정하여 그 결과를 표 11에 나타내었다.
측정치의 평균을 비교하여 결과를 도출하였으며 그 결과 G2 대비 G4 및 G6에서 상승하였고 G3, G5에서 감소하였다.
Skin Thickness (N = 10)
Skin thickness (Mean ± SD)
G1 822.76 ± 139.50
G2 989.06 ± 54.20
G3 854.40* ± 56.07
G4 1113.91 ± 275.08
G5 853.87* ± 134.40
G6 969.22* ± 228.13
*P < 0.05
실시예 3: 통계
모수적인 다중비교(parametric multiple comparison procedures)의 경우에는 Levene test로 등분산성을 검정한 후, one-way ANOVA test로 유의성을 확인하였다. 사후검정시 등분산인 경우 군당 개체수가 동일하면 Duncan multiple range test, 군당 개체수가 동일하지 않으면 Scheffe multiple range test를 이용하여 대조군과의 유의성을 검정하였고, 이분산인 경우에는 Dunnett's T3-test를 이용하여 대조군과의 유의성을 검정하였다. 반수치사량은 probit 법을 이용하여 산출하였다. 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되고 있는 통계 패키지인 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences)를 이용하여 실시하였으며, p<0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
제제예
제제예 1: 애엽 추출물과 2-히드록시프로필 베타- 사이클로덱스트린 포접물의 제조
ㆍ실험예 7의 기본조건과 최적조건으로 설정된 250bar, 32℃에 따라 제조된 애엽 추출물 10g
ㆍ2-히드록시프로필 베타-사이클로덱스트린 20g
30 v/v % 에탄올 수용액 100mL에 2-히드록시프로필 베타-사이클로덱스트린 20g을 가하여 녹인 후, 애엽 추출물을 가하고 균질기(Homogenizer, ULTRA TURRAX®IKA®T18basic)를 이용하여 1분당 6,000rpm으로 30분간 교반한 다음, 동결건조기(BK-10N50, 중국)로 동결 건조하였다.
제제예 2: 애엽 추출물과 2-히드록시프로필 베타- 사이클로덱스트린 포접물의 제조
ㆍ실험예 7의 기본조건과 최적조건으로 설정된 250bar, 32℃에 따라 제조된 애엽 추출물 100mg
ㆍ2-히드록시프로필 베타-사이클로덱스트린 300mg
30 v/v % 에탄올 수용액 50mL에 2-히드록시프로필 베타-사이클로덱스트린 300mg을 가하여 녹인 후 애엽 추출물 100mg을 가하고 균질기(Homogenizer, ULTRA TURRAX®IKA®T18basic)를 이용하여 1분당 6,000rpm으로 30분간 교반한 다음, 동결건조기(BK-10N50, 중국)로 동결 건조하였다.
제제예 3: 캡슐의 제조
ㆍ제제예 1의 포접물 100mg
ㆍ유당 80mg
ㆍ카르복시메틸셀룰로오스칼슘 4mg
ㆍ경질무수규산 4mg
ㆍ스테아린산폴리옥실40 2mg
ㆍ스테아린산마그네슘 1mg
제제예 1의 포접물을 유당, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 경질무수규산, 스테아린산폴리옥실40 및 스테아린산마그네슘을 스피드믹서에서 30분간 혼합하였다. 이 혼합물을 캡슐충진기에서 젤라틴 경질캡슐에 충진하였다.
제제예 4: 정제의 제조
ㆍ실험예 7의 기본조건과 최적조건으로 설정된 250bar, 32℃에 따라 제조된 애엽 추출물 100mg
ㆍ유당 300mg
ㆍ옥수수전분 22mg
ㆍ탄산수소나트륨 5mg
ㆍ스테아린산마그네슘 1mg
ㆍ정제수 0.22mL
애엽 추출물을 유당, 탄산수소나트륨, 옥수수전분에 가하여 혼합하고 여기에 옥수수전분을 정제수에 가하여 호화시킨 결합액을 가하여 30분 동안 혼합믹서에서 연합하였다. 이 연합물을 제립기를 통과시켜 제립 후 건조기에 넣어 5시간 동안 건조 후 정립기에서 정립하였다. 정립물에 활택제인 스테아린산마그네슘을 가하고 혼합한 후 정당 288mg의 중량으로 타정하였다.
제제예 5: 액제의 제조
ㆍ제제예 1의 포접물 300mg
ㆍ자일리톨 30g
ㆍ체리향 20mg
ㆍ정제수 97.5mL
제제예 1의 포접물과 2-히드록시프로필 베타-사이클로데스트린의 포접물 300mg을 정제수에 가하여 녹이고, 자일리톨과 체리향을 가하여 호모믹서로 20분간 교반한 후 전량을 100mL로 하여 액제를 제조하였다.
제제예 6: 츄어블정의 제조
ㆍ제제예 2의 포접물 60mg
ㆍ자일리톨 620mg
ㆍ말토덱스트린 260mg
ㆍ구연산 50mg
ㆍ요구르트향 10mg
ㆍ스테아린산마그네슘 1mg
제제예 2의 애엽 포접물을 자일리톨, 말토덱스트린, 구연산 혼합물에 가하여 30분 동안 스프드믹서에서 혼합하였다. 이 혼합물을 제립기를 통과시켜 제립 후 활택제인 스테아린산마그네슘과 요구르트향을 가하고 혼합한 후 타정기로 정당 1g의 중량으로 타정하였다.
본 발명에 따른 애엽 추출물의 제조방법으로 제조된 애엽 추출물은 오랫동안 천연약제로 사용되어온 천연물에서 유래되었기 때문에 부작용이 없으면서도 아토피를 효과적으로 치료할 수 있으므로, 자가면역질환의 일종인 아토피 치료에 있어서 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 천연물에서 유래되어 부작용이 없는 안전한 치료가 요구되는 유소아에 적합한 장점을 지니며, 아토피로 인한 가려움, 피부건조 증상 또는 2차 세균 감염과 같은 증상을 완화시키는 목적으로 이용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 애엽을 초임계 유체와 공용매를 이용하여 초임계 추출방법으로 추출하여 유파틸린 및 자세오시딘을 포함하는 애엽 추출물을 얻는, 애엽 추출물의 제조방법에 있어서,
    상기 유파틸린과 상기 자세오시딘의 추출비율은 5:1이고,
    상기 초임계 유체는 70cc/min의 속도로 공급되며,
    상기 초임계 추출방법에서 추출 온도는 32℃이고, 압력은 250bar이고,
    상기 공용매는 15ml/min의 속도로 공급되며,
    아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물용인, 애엽 추출물의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 공용매는 물, 메탄올, 에탄올, n-부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 포함하는 것인 애엽 추출물의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 공용매는 에탄올인 것인 애엽 추출물의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 애엽 분말 1g 대비 상기 공용매는 1ml 내지 50ml로 혼합되는 것인 애엽 추출물의 제조방법.
  9. 제1항, 제3항, 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 애엽 추출물의 제조 방법으로 제조된 애엽 추출물.
  10. 제1항, 제3항, 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 애엽 추출물의 제조 방법으로 제조된 애엽 추출물, 또는 추출물로 유파틸린 및 자세오시딘을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 애엽 추출물은 상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 전체 100 중량%에 대하여 0.1 내지 30 중량%로 포함되는 것인 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것인 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 트로키제, 주사제 또는 엑스제의 형태로 제형화된 것인 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제10항에 있어서,
    항진균제, 항균제, 설파제, 면역억제제, 항염증제, 항생물질, 항바이러스제, 대사 길항제, 항히스타민제, 조직수복 촉진제, 비타민, 항알러지 제제 및 스테로이드제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 제제를 더 포함하는 것인 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적 조성물은 베타-사이클로덱스트린으로 포접된 포접 화합물을 포함하는 제제로 제형화된 것인 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 베타-사이클로덱스트린은 2,6-디메틸-베타-사이클로덱스트린, 2-히드록시에틸-베타-사이클로덱스트린 및 2-히드록시프로필-베타-사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 포함하는 것인 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제1항, 제3항, 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 애엽 추출물의 제조방법으로 제조된 애엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선용 건강기능식품 조성물.
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