KR102419286B1 - 포르피린 전구체를 이용한 체외 광분리 반출법의 변형 - Google Patents

포르피린 전구체를 이용한 체외 광분리 반출법의 변형 Download PDF

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Abstract

체외 광분리 반출법 치료에서 사용되는, 5-아미노레불린산, 그의 에스터, 상기 산의 염 또는 에스터인 ALA-화합물에 있어서, 상기 체외 광분리 반출법은 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 상기 5-아미노레불린산, 그의 에스터, 상기 산의 염에 접촉하고 315nm 내지 450nm 사이의 파장의 광에 노출시키는 것으로, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 종양, 림프구-매개 종양 및 양성 장애, T-세포-매개 질병, 자가 면역 질환의 치료하거나, 종양 또는 면역 질환에 대하여 면역적 반응을 조절하기 위한 것이다.

Description

포르피린 전구체를 이용한 체외 광분리 반출법의 변형{MODIFICATION OF EXTRACORPOREAL PHOTOPHERESIS TECHNOLOGY WITH PORPHYRIN PRECURSORS}
본 발명은 광활성이 가능한 포르피린-유도체(photoactivatable Porphyrin-Derivative)를 포함하는 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화시키는 파장의 광에 노출시키는 체외 광분리 반출법(extracorporeal photophoresis, ECP) 치료에서 광활성이 가능한 포르피린-유도체의 사용에 관련된 것이다.
체외 광분리 반출법(extracorporeal photophoresis, ECP)은 전혈에서 백혈구(leucocytes 또는 white blood cells)를 분리하고, 감광제로서 광활성 8-메톡시소랄렌(8-methoxypsoralen, 8-MOP) 및 자외선-A(UV-A) 광에 노출시킨 후 환자의 혈액순환계로 재투여하는 성분채집술 및 광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)의 형태이다. ECP는 20년 넘게 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphomas, CTCL)을 치료하였다[1]. CTCL은 비-호드킨 림프종(non-Hodkin's lymphoma)의 이종성 그룹을 대표하며, GvHD는 줄기 세포 또는 골수 이식 후 면역 세포가 이식받는 인체를 공격하는 합병증이다.
또한, cGvHD, 이식된 장기의 거부반응, 및 특정 자가면역 장애를 포함하는 많은 T-세포 매개 질병들은 ECP를 적절한 조치로서 탐구되었다. 최근, 상기 치료를 위해 테라코스사(Therakos, Inc.)에 의해 고안된 장치, 테라코스 광분리 반출 시스템(Therakos Photopheresis System)이 미국 및 유럽의 150 대학의료센터에서 지금까지 250,000가지 넘는 치료법으로 사용되고 있다.
간략하게, ECP의 기본적인 시술은 환자 팔에 정맥 라인을 삽입하는 것으로 시작한다. 그리고 나서, 약 500ml의 혈액(전혈의 10% 내지 15%)이 채혈되고 항응혈제와 함께 테라코스 광분리 반출 시스템 내에 수집된다. 백혈구(주로 림프구)가 다수의 회전을 통한 원심분리에 의해 분리된다. 이어서, 백혈구 풍부 부분을 감광제로서 살균된 8-MOP 용액 처리하고, UVA 조사에 노출시킨 후, 상기 처리된 백혈구를 환자에게 재투여한다. 적혈구 및 혈장은 각 사이클 사이 환자에게 재투여된다[2, 3].
CTCL에서, 8-MOP는 분리된 백혈구 내 DNA에 공유결합되는 것으로 보이며, 세포주기 억류 및 세포고사를 야기한다. 그러나, 소랄렌 및 UV-A 조합(psoralen plus UV-A, PUVA) 조건 하에서 소랄렌(psoralens)의 사용 후 피부 악성종양을 발생시키는 위험성이 제기되고 있다[4]. 8-MOP은 신생 세포 DNA뿐만 아니라 일반 세포의 DNA와 결합하여, 발암의 잠재적 위험을 증가시킨다. 더불어, 8-MOP은 UV-A 노출 후 비선택적으로 종양세포 및 일반 세포 모두의 세포사를 야기한다. 그리고, 감광제인 광활성 8-메톡시소랄렌(8-MOP)에 대한 UV-A는 특정 상황에서만 독점적으로 사용된다. 또한, 상기의 독점적 사용은 자외선에 의해 수반되는 건강상 위험으로 잠재적으로 해롭다.
선행기술 목록
1. Photochemical & Photobiological Sciences, 10(11), 1773(2011)
따라서, 본 발명의 기본적 목적은 이러한 상황을 개선하고 ECP에서 사용되는 8-MOP의 대체품을 하나 이상 찾는 것이다.
본 발명은 ECP에서 기존에 사용된 화합물이 광활성이 가능한 포르피린-유도체(photoactivatable Porphyrin-Derivative)로 대체될 수 있다는 것을 기반으로 한다. 따라서, 강력한 광감제인 헥사미노레불리네이트-유도 프로토포르피린 IX(hexaminolevulinate(HAL)-induced protoporphyrin IX)이 세포핵 외부에 국한시키는 것과, HAL-매개 광역학 치료에서 활성화된/변형된 림프구가 선택적으로 파괴된다는 것과, 이러한 치료법은 전신 항암 면역을 야기한다는 것이 발견되었다. 또한, 기존의 8-MOP 치료는 UV-A만을 사용하여 세포 소멸만 유도한다는 것과 다르게, HAL-매개 광역학 치료에서 세포 고사 및 세포 괴사 모두의 유도를 초래하는 UV-A 및 "청색광"(가시광)의 사용이 가능하다. 결국, UV-A 광을 사용하는 HAL-매개 광역학 치료는 8-MOP보다 더 효율적으로 GvHD 및 CTLC 환자로부터 림프구를 깨끗하게 사멸시킨다. 따라서, ECP에서 8-MOP이 광활성이 가능한 포르피린-유도체 및(프로토포르피린 IX의 합성을 유도하는) HAL로 대체할 수 있다.
요약하면, 본 발명은 ECP에서 기존에 사용된 화합물이 광활성이 가능한 포르피린-유도체(photoactivatable Porphyrin-Derivative)로 대체될 수 있다는 것을 기반으로 한다. 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체는 포르피린(Porphyrins) 또는 프로토포르피린(Protoporphyrins)을 포함하되, 포르피린 또는 프로토포르피린의 합성은 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, ALA) 또는 헥사미노레불리네이트(hexaminolevulinate, HAL)과 같은 그의 에스테르에 의해 유도된다. 그래서, 이러한 화합물은 포르피린-유도체와 결합된 헥사미노레불리네이트-유도 프로토포르피린 IX(Hexaminolevulinate-induced protoporphyrin-IX)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 체외 광분리 반출법(ECP) 치료에서 광활성이 가능한 포르피린-유도체의 사용을 제공하되, 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 포함하는 환자의 혈액 또는 혈액의 일부가 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화하는 파장의 광에 노출된다.
상기 화합물을 활성화하는 광의 파장은 315nm 내지 630nm, 315nm 내지 495nm, 또는 315nm 내지 450nm 사이의 범위이거나, 315nm 내지 380nm(UV-A) 또는 380nm 내지 450nm("청색광") 사이의 범위를 포함하는 100nm 내지 1000nm사이의 파장으로부터 선택된다.
상기 포르피린-유도체는 벤조포르피린 유도체 1산 고리 A(benzoporphyrin derivative monoacid ring A, BPD-MA; Vysudyne®, Verteporfin®), 테트라(메타히드록시페닐)클로린(Tetra(metahydroxyphenyl) chlorin, mTHPC; Foscan®), 포르피머 소듐(porfimer sodium, Photofrin®), 클로린 e6(Chlorin e6), Pd-박테리오페오포르비드(Pd-bacteriopheophorbide, Tookad®), 또는 2-(1-헥실옥시에틸)-2-디비닐피로페오포르비드-a(2-(1- hexyloxyethyl)-2-devinylpyropheophorbide-a, HPPH; Photochlor®)와 같은 비자연적으로 발생하는 포르피린-유도체로부터 선택될 수 있다.
또한, 언급한 바와 같이, 포르피린-유도체는 프로토포르피린 IX와 같은 ALA-화합물(ALA-compound, 5-아미노레불린산(ALA) 또는 헥사미노레불리네이트와 같은 그의 에스테르)로부터 유도된 포르피린-유도체, 또는 헥사미노레불리네이트-유도 프로토포르피린 IX과 같은 ALA-화합물에 의해 유도되는 프로토포르피린/포르피린에서 선택될 수 있다.
따라서, 하위 관점에서 본 발명은 체외 광분리 반출법에서 ALA-화합물(5-아미노레불린산 또는 그의 에스테르 또는 상기 산의 염 또는 에스테르) 사용을 제공하되, 환자의 혈액 또는 혈액의 일부가 상기 5-아미노레불린, 에스테르 또는 염(상기 ALA-화합물)와 접촉하고 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시킨다. 상기 화합물을 활성화하는 광의 파장은 315nm 내지 630nm, 315nm 내지 495nm, 또는 315nm 내지 450nm 사이의 범위이거나, 315nm 내지 380nm(UV-A) 또는 380nm 내지 450nm("청색광") 사이의 범위를 포함하는 100nm 내지 1000nm사이의 파장으로부터 선택된다. 상기 ALA-화합물은 ALA-메틸에스테르(메틸-아미노레불리네이트)(ALA-methylester(methyl-aminolevulinate)) 또는 특히, ALA-헥실에스테르(헥사미노레불리네이트; 헥실-5-아미노-4-오소펜타노에이트; HAL)(ALA-hexylester(hexaminolevulinate; hexyl 5-amino-4-oxopentanoate) 또는 그의 염뿐만 아니라, 가장 대중적으로 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, ALA) 또는 그의 염이 있다.
상기 체외 광분리 반출법(ECP)은 주로 종양, 림프구-매개 종양 및 양성 장애, T-세포-매개 질병, 자가 면역 질환 및/또는 감염을 치료하거나 악성종양 또는 면역 질환에 대하여 면역적 반응을 자극 또는/및 조절하는 것을 목표로 한다. 특히, 이는 피부 T-세포 림프종 또는 홍색 피부 T-세포 림프종과 같은 림프종을 포함한다.
당해 기술 분야에서 알려진 종래의 ECP 치료에서와 같이, 본 발명의 ECP 치료의 대부분 경우는, 혈액을 환자로부터 채혈하고 수집한다. 백혈구(주로 림프구)를 다수의 회전을 통한 원심분리에 의해 분리한다. 이어서, 상기 포르피린-유도체를 포함하는 백혈구 풍부 부분(환자의 혈액의 일부인 경우)을 광 조사에 노출된 후, 처리된 백혈구(환자의 혈액에서 처리된 부분)를 환자에게 재투여한다. 적혈구 및 혈장(환자의 혈액의 나머지 부분)은 각 사이클 사이 환자에게 재투여한다. 본 발명에 따른 일반적인 사용에서, 환자의 혈액의 일부(예컨대, 백혈구 풍부 부분)가 상기 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물에 의해 처리된다(이어서, 30 내지 120분 동안 배양하여 포르피린-유도체의 유도된 합성을 완료한다). 상기 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물은 환자에게 전신으로(구강 또는 정맥주사로) 적용된다. 전신 투여 후 - ECP 접근법을 사용하는 것을 청구한 바와 같이, 본 발명에서 선택적으로 사용에서 - 환자의 신체는 예컨대, ALA 투여 후 피부의 노출과 같이, 광에 노출된다.
ECP용 ALA 사용의 장점을 다음과 같이 요약할 수 있다:
a. 증식하는(변형되거나 활성화된) T-세포는 ALA-유도 PpIX를, 일반적으로 휴면중의 T-세포보다 약 15배 이상 생산한다. 결과적으로, 8-MOP의 비선택적 효과와는 다르게, 광 조사 후 증식하는 T-세포는 선택적으로 더 많이 파괴될 수 있다.
b. ALA-유도 PpIX은 세포 핵의 외부 막 구조체에만 국한되어, 발암을 야기하지 않는다.
c. 대상막은 DNA-결합 8-MOP보다 더 강력한 항원 분자들을 생산한다. 유방암세포를 갖는 4T1 쥐에게 체외에서(ex-vivo) HAL-PDT는 전반적인 항암 면역을 야기한다는 것이 쥐를 통해 제안되었다[37].
d. ALA은 높은 안정성을 갖는 승인된 의약품이다. 소태아혈청 10% 존재 하에1 mM ALA 투여 및 1시간 배양한 후 UV-A 광 노출하여, 저캇 인간 T-세포 림프종 세포의 95% 이상을 사멸시킬 수 있다. 전형적인 임상 설정에서, 이는 약 1 mg/kg의 도즈량에 대응하되, 이는 임상적 ALA 사용에서 사용되는 안정한 도즈량보다 매우 적은 양이다[19-25].
e. 테라코스 광분리 반출 시스템을 사용하는 현재 방법에서 ALA의 적합성은 8-MOP와 유사할 수 있다. 다만, 환자가 UV-A 광 조사 전 ALA 배양을 위해 1시간 정도 기다리는 것이 유일한 차이점이다.
도 1(실험예 1 관련): A) 저캇 세포 내 HAL-유도 PpIX의 스펙트럼. B) UV-A 램프에 의해 발광된 광의 스펙트럼.
도 2(실험예 1 관련): HAL에 의한 저캇 세포의 광역학적 불활성.
도 3(실험예 1 관련): 8-MOP에 의한 저캇 세포의 광불활성화.
도 4(실험예 1 관련): UV-A 광원에 대한 8-MOP에 의한 저캇 세포 광불활성화의 의존도.
도 5(실험예 1 관련): HAL 및 8-MOP의 조합과 UV-A광의 조사에 의해 저캇 세포의 광불활성화.
도 6(실험예 1 관련): 암흑 독성(대조군과 관련).
도 7(실험예 1 관련): 세포 생존 분석.
도 8(실험예 1 관련): 서로 다른 처리 후 저캇 세포의 형광 이미지.
도 9(제2 실험예 관련): CD4+ T 림프구에 대한 5-ALA의 효과.
도 10(실험예 2 관련): CD8+ T 림프구에 대한 5-ALA의 효과.
도 11(실험예 3 관련): HAL에 의한 인간 T-세포 림프종의 광역학적 불활성.
도 12(실험예 3 관련): 8-MOP에 의한 인간 T-세포 림프종의 광역학적 불활성.
도 13(실험예 4 관련): 동일하게 처리된 환자 혈액 시료와 다르게 분석된 부분의 인간 백혈구에 대한 5-ALA 암흑 독성.
따라서, 본 발명의 가장 넓은 관점은 체외 광분리 반출법 치료에서 광활성이 가능한 포르피린-유도체의 사용을 제공하되, 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 포함하는 환자의 혈액 또는 혈액의 일부가 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화하는 파장의 광에 노출된다.
본 발명의 상기 넓은 관점의 다른 실시예에서, 본 발명은 체외 광분리 반출법에 의한 환자 치료용 의약품의 제조에서 광활성이 가능한 포르피린-유도체의 사용을 제공하되, 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 포함하는 상기 환자의 혈액 또는 혈액의 일부가 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화시키는 파장의 광에 노출된다.
따라서, 본 발명은 가장 넓은 측면에서 치료가 필요한 환자의 치료 방법을 포함하되, 상기 방법은:
a) 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 치료가 필요한 상기 환자의 혈액(또는 혈액의 일부)에 투여하고;
b) a) 단계의 상기 환자의 혈액(또는 혈액의 일부)을 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화시키는 파장의 광으로 처리하고; 및
c) b) 단계의 상기 환자의 혈액(또는 혈액의 일부)의 적어도 일부를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 가장 넓은 측면에 따른 바람직한 실시예에서, 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화시키는 파장은 100nm 내지 1000nm사이이다.
본 발명은, 체외 광분리 반출법에서 사용하는 5-아미노레불린산 또는 그 에스테르 또는 상기 산의 염 또는 에스테르인 ALA-화합물 제공하되, 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 상기 5-아미노레불린산, 상기 에스테르 또는 상기 염(상기 ALA-화합물)과 접촉시키고 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시킨다.
일 실시예에서, 체외 광분리 반출법은 병원균의 불활성을 위한 것이 아니다. 특히, HIV-1, HIV-2, B형 또는 C형 간염 또는 "불안정한 혈액 제품(PSL)"에서 비롯된 박테리아의 불활성을 위한 것이 아니다.
일 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법은 수혈에 대한 농축 혈소판의 치료를 위한 것이 아니다. 특히, 화학요법 또는 외과 수술 또는 혈소판감소증 후 수혈에 대한 농축 혈소판의 치료를 위한 것이 아니다.
ALA-화합물의 상기 사용의 또 다른 실시예에서, 본 발명은 체외 광분리 반출법에 의한 환자 치료 의약품의 제조에 있어서 ALA-화합물의 사용을 제공하되, 상기 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 ALA-화합물에 접촉시키고 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시킨다.
ALA-화합물의 사용에 있어서, 본 발명은 치료가 필요한 환자의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은:
a) ALA-화합물을 치료가 필요한 환자의 혈액(또는 혈액의 일부)을 투여하고;
b) a) 단계의 상기 환자의 혈액(또는 혈액의 일부)을 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광으로 처리하고; 및
c) b) 단계의 상기 환자의 혈액(또는 혈액의 일부)의 적어도 일부를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 체외 광분리 반출법에서 사용하기 위한 5-아미노레불린산, 그 에스테르, 상기 산의 염 또는 에스테르 중 하나인 ALA-화합물을 제공하되, 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 상기 5-아미노레불린산, 상기 에스테르 또는 상기 염과 접촉시키고 315nm 내지 450nm 사이의 파장의 광에 노출시킨다.
이때, 상기 체외 광분리 반출법은 암, 림프구-매개 악성종양 및 양성 장애, T-세포-매개 질병, 자가 면역 질환을 치료하거나 악성종양 또는 면역 질환에 대하여 면역적 반응을 조절하기 위한 것이다.
본 발명에 따른 ALA-화합물의 사용의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따라 사용되는 상기 ALA-화합물은 화학식 1의 화합물이다.
[화학식 1]
R2'R2N-CH2COCH2-CH2CO-OR1
이때, R1은 하이드록시(hydroxy), 알콕시(alkoxy), 아크릴옥시(acyloxy), 알코시카르보닐옥시(alkoxycarbonyloxy), 설포(sulpho), 아미노(amino), 아릴(aryl), 오쏘(oxo) 또는 할로겐 그룹(halogen groups)으로 선택적으로 치환되는 알킬(alkyl)일 수 있으며, 산소, 질소, 황소 또는 인 원자들에 의해 선택적으로 중단될 수 있으며,
R2 및 R2'은 서로 독립적으로 수소 원자 또는 하이드록시(hydroxy), 알콕시(alkoxy), 아크릴옥시(acyloxy), 알코시카르보닐옥시(alkoxycarbonyloxy), 아미노(amino), 아릴(aryl), 오쏘(oxo) 또는 할로겐 그룹(halogen groups)으로 선택적으로 치환되는 알킬(alkyl)일 수 있으며, 산소, 질소, 황소 또는 인 원자들에 의해 선택적으로 중단될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 위에서 정의된 바와 같이 상기 선택적으로 치환되는 알킬은 C1 -12-알킬, C1 -10-알킬, C1 -8-알킬 또는 C1 -6-알킬로부터 선택되며, 그래서 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 프로필(propyl), 부틸(butyl), 펜틸(pentyl), 헥실(hexyl), 헵틸(heptyl), 옥틸(octyl), 노닐(nonyl), 데실(decyl), 운데실(un-decyl) 또는 도데실(dodecyl)로 선택적으로 치환될 수 있다.
잠재적으로 연관된 바람직한 다른 실시예에서, 치환기는 -OH, -SH, -NH2, =0, -OCH3, -OC2H4, -OC3H7, -OC4H9, -C(O)OCH3, -C(O)C2H5, F, Cl, Br, I, 벤질(benzyl) 또는 페닐(penyl)으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 -OH, -SH, -NH2, =0, -F, -Cl, OCH3, -OC2H4, -OC3H7, -OC4H9, 또는 -C(O)OCH3으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 ALA-화합물의 사용의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 상기 ALA-화합물은 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, ALA), ALA-메틸에스테르(ALA-methylester), ALA-에틸에스테르(ALA-ethylester), ALA-프로필에스테르(ALA-propylester), ALA-헥실에스테르(헥시5-아미노-4옥소펜타노에이트)(ALA-hexylester(hexyl 5-amino-4-oxopentanoate; HAL)), ALA-헵틸에스테르(ALA-heptylester), ALA-옥틸에스테르(ALA-octylester) 또는 그들의 염들로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는, 5-아미노레불린산(ALA), ALA-메틸에스테르(메틸-아미노레불리네이트)(ALA-methyester(methyl-aminolevulinate)) 또는 ALA-헥실에스테르(헥사미노레불리네이트; 헥실 5-아미노-4-옥소펜타노에이트)(ALA-hexylester(hexaminolevulinate; hexyl 5-amino-4-oxopentanoate; HAL), 더욱 바람직하게는, 5-아미노레불린산(ALA) 또는 ALA-헥실에스테르(헥사미노레불리네이트; 헥실 5-아미노-4-옥소펜타노에이트)(ALA-hexylester(hexaminolevulinate; hexyl 5-amino-4-oxopentanoate; HAL)으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 상기 ALA-화합물의 사용의 바람직한 실시예에서, 환자의 혈액 또는 혈액의 일부와 상기 5-아미노레불린산, 에스테르 또는 염이 접촉한 후, 상기 파장의 광에 노출되는 사이의 시간은 5분 내지 480분 사이이며, 바람직하게 15분 내지 240분 사이이며, 더욱 바람직하게는 30분 내지 120분 사이이고, 가장 바람직하게는 45분 내지 75분 사이이다.
본 발명은 또한, 체외 광분리 반출법에서 사용되는 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 제공하되, 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 포함하는 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화시키는 파장의 광에 노출시킨다. 이때, 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화시키는 파장은 315nm 내지 450 nm 사이이며, 상기 포르피린 유도체는 ALA-화합물(상기에 언급한 바와 같이)로부터 유도된 포르피린-유도체로부터 선택되며, 바람직하게는 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX), ALA-유도-프로토포르피린 IX(ALA-induced protoporphyrin IX) 또는 헥사미노레불리네이트-유도 프로토포르피린 IX(hexaminolevulinate(HAL)-induced protoporphyrin IX)이며, 상기 체외 광분리 반출법은 암, 림프구-매개 악성종양 및 양성 장애, T-세포-매개 질병, 자가 면역 질환을 치료하거나 악성종양 또는 면역 질환에 대하여 면역적 반응을 조절하기 위한 것이다.
본 발명의 가장 넓은 관점에 따른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따라 사용된 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체에서, 상기 포르피린-유도체는 본 발명에 따라 상기에서 기술되고 사용된 바와 같이, ALA-화합물로부터 유도된 포르피린 유도체로부터 선택된다. 바람직하게, 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX), 상기에서 설명된 바와 같이 ALA-화합물에 의해 유도되는 프로토포르피린/포르피린 또는 헥사미노레불리네이트-유도 프로토포르피린 IX으로부터 선택된다.
5-아미노레불린산(ALA) 또는 그의 헥실에스테르(HAL)와 같은 포르피린 전구체인, 상기 ALA-화합물의 생물학적 근거를[5-8]에서 알 수 있다. 세포에서, ALA은 헴 생합성경로(heme biosynthetic pathway)의 시작에서 글리신(glycine) 및 숙시닐 CoA(succinyl CoA)로부터 형성된다. 생합성경로의 마지막 단계에서, 철이 중간산물인 프로트포르피린 IX(protoporphyrin IX, PpIX)과 결합되어 헴을 형성한다. 상기 PpIX는 강력한 광감제이며, 외인성 ALA의 투여 후 세포 내에 축적할 수 있다[5, 6]. 원칙적으로 적용된 ALA은 피부 표면 악성 종양의 PDT에서 주로 사용되며, 좋은 치료 결과를 나타낸다[5, 6]. ALA이 친수성을 가지기 때문에 HAL를 포함하는 친유성 ALA 에스테르는 세포막을 통해 용이하게 침투되도록 개발되고 있다[9, 10].
본 발명의 가장 넓은 측면의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체는 광감제이다.
본 발명의 가장 넓은 측면의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체는 비자연적으로 발생하는 포르피린-유도체로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 하기로부터 선택된다:
벤조포르피린 유도체 1산 고리 A(benzoporphyrin derivative monoacid ring A, BPD-MA; Vysudyne®, Verteporfin®),
테트라(메타히드록시페닐) 클로린(Tetra(metahydroxyphenyl) chlorin, mTHPC; Foscan®),
포피머 나트륨(porfimer sodium, Photofrin®),
틴 에티레티오푸르푸린(Tin ethyletiopurpurin, SnET2; Purlytin®),
Pc4,
헤마토포르피린 유도체(Hematoporphyrin derivative, HPD),
2-(1 -헥실옥시에틸)-2-데비닐 프로페오포오비드-a(2-(1 -hexyloxyethyl)-2-devinyl pyropheophorbide-a, HPPH; Photochlor),
모노-N-아스파르틸 클로린 e6(mono-N-aspartyl chlorin e6, NPe6, Talporfin®),
클로린 e6 콘쥬게이트 폴리비닐 피롤리돈(chlorin e6 conjugated with polyvinyl pyrrolidone, Fotolon®),
Pd-박테리오페포르비드(Pd-bacteriopheophorbide, Tookad®),
루테튬-텍사피린(Lutetium-texaphyrin, Lu-tex; Lutrin®),
보로네이티드 포르피린(Boronated porphyrin, BOPP),
하이퍼리신(Hypericin, VIMRxyn),
설포네이티드 알루미늄 프탈로시아닌(Sulphonated aluminium phthalocyanine, AIPcS; Photosense®),
포르피센(Porphycene, ATMPn), 또는
디브로모로다민 유도체(Dibromorhodamine derivative, TH9402).
본 발명의 가장 넓은 측면의 바람직한 다른 실시예에서, 본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체는 비자연적으로 발생하는 포르피린-유도체로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 하기로부터 선택된다:
벤조포르피린 유도체 1산 고리 A(benzoporphyrin derivative monoacid ring A, BPD-MA; Vysudyne®, Verteporfin®),
테트라(메타히드록시페닐) 클로린(Tetra(metahydroxyphenyl) chlorin, mTHPC; Foscan®),
포피머 나트륨(porfimer sodium, Photofrin®),
클로린 e6(Chlorin e6),
Pd-박테리오페오포르비드(Pd-bacteriopheophorbide, Tookad®), 또는
2-(1-헥실옥시에틸)-2-디비닐피로페오포르비드-a(2-(1- hexyloxyethyl)-2-devinylpyropheophorbide-a, HPPH; Photochlor®).
본 발명에 따르면, "광활성이 가능한 포르피린-유도체"는 포르피린과 구조적으로 연관된 광활성이 가능한 화합물로 정의된다. 따라서, 광활성 가능한 포르피린 유도체는 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 의해 활성될 수 있는 능력을 가지며 상기 파장에서 강한 흡광대를 갖는 고공액계(highly conjugated system)이다. 대부분의 경우, 광활성 가능한 포르피린 유도체는 하기에서 정의되는 광감제이다. 정의에 의하며, 상기 광활성 가능한 포르피린 유도체는 그 구조 내에서 포르피린 고리 시스템을 포함하는 화합물이 가장 대중적이며, 프로토포르피린(protoporphyrin)일 수 있다. 예를 들면, 프로토포리피린 IX(protoporphyrin IX)일 수 있다. 이외에 아래에서 정의되는 광감제로서, 이는 상기에서 기재한 바와 같이 ALA-화합물에 의해 유도되는 프로토포르피린/포르피린(protoporphyrin/porphyrin)일 수 있다. 가능한 일 예는 ALA-유도 프로토포르피린 IX이며 - 적어도 몇몇은 - 합성 중에 ALA(5-아미노레불린산 또는 그의 염)이 프로토포르피린의 구조와 결합된다(구조의 일부가 된다). 가능한 다른 예는 헥사미노레불리네이트-유도-프로토포르피린-IX이며 -적어도 몇몇은- 합성 중에 헥사미노레불리네이트가 상기 프로토포르피린의 구조와 결합된다(구조의 일부가 된다).
본 발명에 따르면, "광감제"는 100nm 내지 1000nm 사이 파장을 갖는 광에 민감한 화합물로서 정의되며, 상기 광에 의해 활성될 수 있다. 대부분의 경우, 상기 광감제는 그 구조 내에 포르피린 고리를 포함하고, 또는 프로토포르피린이다. 바람직하게는, 상기 광감제는 벤조포르피린 유도체 1산 고리 A(benzoporphyrin derivative monoacid ring A, BPD-MA; Vysudyne®, Verteporfin®), 테트라(메타히드록시페닐) 클로린(Tetra(metahydroxyphenyl) chlorin, mTHPC; Foscan®), 포피머 나트륨(porfimer sodium, Photofrin®), 틴 에티레티오푸르푸린(Tin ethyletiopurpurin, SnET2; Purlytin®), Pc4, 헤마토포르피린 유도체(Hematoporphyrin derivative, HPD), 2-(1 -헥실옥시에틸)-2-데비닐 프로페오포오비드-a((2-(1 -hexyloxyethyl)-2-devinyl pyropheophorbide-a, HPPH; Photochlor), 모노-N-아스파르틸 클로린 e6(mono-N-aspartyl chlorin e6, NPe6, Talporfin®), 클로린 e6 콘쥬게이트 폴리비닐 피롤리돈(chlorin e6 conjugated with polyvinyl pyrrolidone, Fotolon®) Pd-박테리오페포르비드(Pd-bacteriopheophorbide, Tookad®), 루테튬-텍사피린(Lutetium-texaphyrin, Lu-tex; Lutrin®), 보로네이티드 포르피린(Boronated porphyrin, BOPP), 하이퍼리신(Hypericin, VIMRxyn), 설포네이티드 알루미늄 프탈로시아닌(Sulphonated aluminium phthalocyanine, AIPcS; Photosense®), 포르피센(Porphycene, ATMPn), 또는 디브로모로다민 유도체(Dibromorhodamine derivative, TH9402)로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 광감제는 벤조포르피린 유도체 1산 고리 A(benzoporphyrin derivative monoacid ring A, BPD-MA; Vysudyne®, Verteporfin®), 테트라(메타히드록시페닐) 클로린(Tetra(metahydroxyphenyl) chlorin, mTHPC; Foscan®), 포피머 나트륨(porfimer sodium, Photofrin®), 클로린 e6(Chlorin e6), Pd-박테리오페오포르비드(Pd-bacteriopheophorbide, Tookad®), 또는 2-(1-헥실옥시에틸)-2-디비닐피로페오포르비드-a(2-(1- hexyloxyethyl)-2-devinylpyropheophorbide-a, HPPH; Photochlor®)로부터 선택된다.
상기 구조를 갖는 상기 감광제의 예시들은 하기에서 발견될 수 있다.
Figure 112016115033970-pct00001
본 발명에 따르면, "유도될" 포르피린-유도체 또는 "유도된" 포르피린-유도체와 같은 화합물은 프로토포르피린 또는 포르피린과 같은 화합물로 정의되되, 상기 프로토포르피린 또는 포르피린의 구조는- 적어도 몇몇은- 합성 중에 유도된 화합물(예컨대, ALA-화합물)과 결합된다. 이는 "유도된 화합물"의 합성을 유도/증가시킬 수 있으며, 특히 율속 단계(rate limiting step)에서 국부적 증가/축적에 의해 발란스를 이동한다. 바람직한 예는 ALA(5- 아미노레불린산) 또는 그의 염에 의해 유도된 프로토포르피린 IX와 같은 프로토포르피린이되, ALA의 일부는 상기 프로토포르피린의 구조와 결합되며 ALA의 국부적 과잉은 프로토포르피린의 축적을 야기한다. 또 다른 예는 HAL(헥사미노레불리네이트)으로부터 유도된 프로토포르피린 IX이되, 상기 HAL의 일부 또한 상기 프로토포르피린의 구조와 결합하고, HAL의 국부적 과잉은 상기 프로토포르피린의 축적을 야기한다.
본 발명에 따르면, "ALA-화합물"은 5-아미노레불린산, 그의 에스테르, 상기 산의 염 또는 에스테르로 정의되며, R2'R2N-CH2COCH2-CH2CO-OR1 구조식의 화합물을 포함한다. 바람직한 예들로는 5-아미노레불린산(ALA), ALA-메틸에스테르(메틸아미노레불린산)(ALA-methyester(methyl-aminolevulinate)), 또는 ALA-헥실에스테르(헥사미노레불리네이트; 헥실 5-아미노-4-오소펜타노에이트; HAL)(ALA-hexylester(hexaminolevulinate; hexyl 5-amino-4-oxopentanoate; HAL). ALA는 헴 합성(heme synthesis)의 첫 단계에서 숙시닐 CoA 및 글리신으로부터 형성된다. 페로킬라테이스(ferrochelatase, 금속성의 효소)의 활성은 헴 합성에서 율속 단계이기 때문에 ALA의 증가(그래서 ALA-화합물 전체의 증가)는 프로토포르피린 IX의 국한적 축적을 초래한다. 따라서, ALA(및 ALA-화합물 전체)의 과잉은 아주 강한 광감제(photosensitizing agent/"Photosensitizer")인 프로토포르피린 IX의 축적을 야기시킨다. 이는 예컨대, ALA(ALA-유도 프로토포르피린 또는 ALA-유도 프로토포르피린 IX)에 의해 "야기될" 프로토포르피린 IX로서 이해된다. 이론적으로, ALA-화합물은 포르피린 전구체이다. ALA-화합물의 일부로서 정의되는 5-아미노레불린산의 에스테르는 함께 제공되는 참조 문헌 WO96/028412 A1에 상세하게 설명된다.
본 발명에 따르면, "체외 광분리 반출법(약자로 "ECP")"은 성분채집술 및 광역학 치료(PDT)의 형태로서 정의된다. 환자의 혈액- 또는 가장 바람직하게 전혈로부터 분리된(원심분리) 백혈구의 경우-는 광활성 화합물 또는 광활성 화합물을 유도하는 화합물(형성하는 부분 및 합성을 유도하는; 상기를 참조)에 노출된다. 그리고 나서, 상기 혈액 또는 혈액의 일부, 예를 들면, 백혈구 풍부 부분이 상기 광활성 화합물을 활성화시키는 파장의 광에 노출된다. 이후, 처리된 혈액(또는 그의 일부)을 상기 환자에게 재투여한다.
본 발명에 따르면, "체외 광분리 반출법 치료"는 "체외 광분리 반출법"에 의한 질병의 치료로 정의된다. 예컨대, 암, 림프구-매개 악성종양 및 양성 장애, T-세포-매개 질병, 자가 면역 질환 및/또는 감염의 치료를 포함한다. 또한, 상기 "체외 광분리 반출법 치료"는 악성종양 또는 면역 질환에 대하여 면역적 반응을 자극 또는/및 조절하는 것을 목표로 한다. 대부분 열거된 예시들은 피부 T-세포 림프종, 홍색피부 T-세포 림프종, 또는 피부암과 같은 림프종을 포함한다.
본 발명에 따르면, "노출"은 일 물질 예컨대, 환자의 혈액 또는 혈액의 일부가 특정 물리적 영향 예컨대, 특정 파장의 광 조사에 노출되는 것으로 정의된다.
본 발명에 따르면, "환자 혈액의 일부"는 환자의 혈액의 단핵/미립자 성분들이나, 단핵/미립자 성분들이 풍부한 환자의 혈액으로 정의된다. 따라서, 이는 분리된 백혈구, 백혈구 풍부 혈액 또는 백혈구 풍부 연층(buffy coat)을 포함한다. 환자 혈액의 일부는 0% 내지 10% 또는 2.5% 내지 7%의 적혈구용적률(hematocrit value)을 가질 수 있거나, 전체 말초혈액 단핵 세포 구성(total peripheryl blood mononuclear cell component)의 5% 내지 25% 또는 10% 내지 30%일 수 있다. 환자 혈액의 일부는 원심분리 또는 필터링에 의해 혈액에서 단핵/미립자가 풍부하도록 분리된다. 환자 혈액에서 상기 단핵/미립자 성분의 농축 후 남는 부분을 "환자 혈액의 나머지 부분"이라 하며, 예컨대 적혈구(red blood cells 또는 erythrocytes) 및 혈장으로 구성된다.
본 발명에 따르면, "상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성화하는 파장의 광"은 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광으로 정의된다. 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체가 높은 흡광대(absorption band)를 갖는 고공액계로서, 흡광대는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 활성시키는 파장을 정의한다.
본 발명에 따르면, "ALA-화합물과 접촉"은 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 ALA-화합물에 적용함으로써, ALA-화합물을 가지고 환자의 혈액 또는 혈액의 일부를 치료하는 것으로 정의한다. 이는 혈액이 환자의 신체 외부(예컨대, 혼합 또는 용해에 의해)에 있을 때 수행되는 것이 일반적이지만, 이론적으로 ALA-화합물이 환자에게 전반적으로 투여되는(예컨대, 정맥 또는 구강을 통해) 경우에도 적용되어 혈액은 신체 내에서 ALA과 접촉한다.
하기에서, 본 발명에 따른 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 갖는 본 발명의 가장 넓은 측면 및 ALA-화합물의 연관된 측면의 두 실시예들 모두가 기술될 것이다. 바람직한-실시예들이 본 발명의 관련된 두 측면들 모두에 적용 가능하다는 사실은 다음을 통해 나타난다: "본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서". 상기 실시예들은 의약품의 제조에 사용되는 것뿐만 아니라 각각의 치료 방법에 적용된다는 것을 이해한다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물이 8-메톡시소랄렌(8-MOP)과 같은 소랄렌에 결합하여 사용된다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 화합물이 활성화되는 광의 파장은 100 nm 내지 900 nm, 100 nm 내지 630 nm, 100 nm 내지 495 nm, 315 nm 내지 630 nm, 315 내지 495 nm, 또는 315 nm 내지 450 nm 사이의 파장으로부터 선택된다. 바람직하게는, 315 nm 내지 495 nm, 315 내지 450 nm, 315 nm 내지 380 nm, 380 내지 495 nm, 또는 380 내지 450 nm 사이의 파장으로부터 선택되거나, 더욱 바람직하게는 315 nm내지 450 nm 또는 380 nm 내지 450 nm에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 화합물을 활성화하는 광의 파장은 380nm 내지 450nm 사이의 파장으로부터 선택된다.
하기의 특정 파장 범위의 광에서,
315nm 내지 380nm 사이의 파장의 광은 UV-A 광이며,
380nm 내지 495nm 사이의 파장의 광은 보라색 및 청색을 포함하는 가시광이며,
315nm 내지 450nm 사이의 파장은 UV-A광 및 가시광 "청색"이며, 및
380nm 내지 450nm은 가시광 "청색"이다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 및 ALA-화합물의 다른 실시예들은 시간에 관한 것이다. 상기 시간은 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체를 포함하거나 ALA-화합물과 접촉하는 환자의 혈액 또는 혈액의 일부가 상기 특정 파장의 광에 노출되는 것의 시간이다. 이는 꽤 넓은 범위로, 수초에서 1시간 또는 2시간 이상까지 다를 수 있다. 일 경우에서(예를 들면, 혈액 또는 혈액의 일부가 UV-A광에 노출되는 경우에 적용), 노출 시간은 10분 내지 120분 사이이다. 다른 경우에서(예를 들면, 혈액 및 혈액의 일부가 "청색광"에 노출되는 경우에 적용) 노출시키는 5초 내지 30분 사이이다.
하기에서, 다른 질병에 대한 치료 목록이 있는데, 상기 체외 치료는 - 즉, 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물이 본 발명에 따라 사용되는 것 - 잠재적이고 성공적으로 상기 치료 목록에 적용될 수 있다. 따라서, 상기 목록은 본 발명에 따라 제조되는 의약품의 사용을 위한 측면 이외에 각각의 치료 방법에 대한 조치를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 암, 림프구-매개 종양 및 양성 장애, T-세포-매개 질병, 자가 면역 질환 및/또는 감염을 치료하거나 악성종양 또는 면역 질환에 대하여 면역적 반응을 자극 또는/및 조절을 위한 것이다. 바람직하게는, 암, 림프구-매개 종양, 양성 장애, T-세포-매개 질병, 자가 면역 질환을 치료하거나 악성종양 또는 면역 질환에 대하여 면역적 반응을 조절(예컨대, 자극 또는 억제)하기 위한 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법은 암의 치료를 위한 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 치료를 위한 것이다:
림프종, 바람직하게는 T-세포 림프종, 가장 바람직하게는 피부 T-세포 림프종 또는 홍색피부 T-세포 림프종; 및/또는
혈액학적 암, 또는 림프성 백혈병; 및/또는
대숙주성 이식편병,
예를 들면, 골수 이식 후 cGvHD(chronic graft versus host disease), 피부/점막 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 간 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 위장/폐 관련 급성 또는 만성 대숙주성 이식편병; 및/또는
이식 거부
예를 들면, 폐, 신장, 또는 간장 이식과 같은 고형 장기 이식, 심장 이식, 심장 이상 거부 예방,
장기 동종 이식 거부, 예를 들면 심장, 폐 또는 신장 동종 이식 거부, 폐색성 모세기관지 증후군(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS), 및/또는
다발성 경화증, 전신성 경화증, 진행성 전신성 경화증(progressive systemic sclerosis, PSS), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE), 류머티스성 관점염, 소아당뇨병, 제1형 당뇨병; 및/또는
크론병 또는 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환 및/또는 방광염 또는 간질성 방광염과 같은 방광 염증질환; 및/또는
레트로바이러스 간염 이외의 감염, 급성 또는 만성 바이러스 감염, HCV 또는 CMV 감염, 만성 C형 간염 감염; 및/또는
AIDS 관련 합병증, HIV-감염 질병, AIDS 관련 카포시(AIDS-related kaposis), 자궁경부 HPV 감염; 및/또는
신성 전신 섬유화증, 궤양성 대장염, 후천성 표피 수포증; 및/또는
심상성 천포창, 건선성 관절염, 아토피성 피부염, 아토피성 습진, 편평 태선.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 바람직한 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법 치료에 사용되는 치료는 하기와 같다.
림프종, 바람직하게는 T-세포 림프종, 가장 바람직하게는 피부 T-세포 림프종 또는 홍색피부 T-세포 림프종; 및/또는
혈액학적 암, 또는 림프성 백혈병; 및/또는
대숙주성 이식편병,
예를 들면, 골수 이식 후 cGvHD(chronic graft versus host disease), 피부/점막 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 간 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 위장/폐 관련 급성 대숙주성 이식편병; 및/또는
이식 거부
예를 들면, 폐, 신장, 또는 간장 이식과 같은 고형 장기 이식, 심장 이식, 심장 이상 거부 예방,
장기 동종 이식 거부, 예를 들면 심장, 폐 또는 신장 동종 이식 거부, 폐색성 모세기관지 증후군(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS), 및/또는
전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE), 류머티스성 관점염, 소아당뇨병, 제1형 당뇨병; 및/또는
크론병 또는 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환 및/또는 방광염 또는 간질성 방광염과 같은 방광 염증질환; 및/또는
레트로바이러스 간염 이외의 감염, 급성 또는 만성 바이러스 감염, HCV 또는 CMV 감염, 만성 C형 간염 감염; 및/또는
AIDS 관련 합병증, HIV-감염 질병, AIDS 관련 카포시(AIDS-related kaposis), 자궁경부 HPV 감염; 및/또는
심상성 천포창, 건선성 관절염, 아토피성 피부염, 아토피성 습진, 편평 태선.
또는 더욱 바람직하게는 하기의 질병의 치료이다:
림프종, 바람직하게는 T-세포 림프종, 가장 바람직하게는 피부 T-세포 림프종 또는 홍색피부 T-세포 림프종; 및/또는
혈액학적 암 또는 B-세포 또는 만성 림프성 백혈병과 같은 림프성 백혈병; 및/또는
대숙주성 이식편병,
예를 들면, 골수 이식 후 cGvHD(chronic graft versus host disease), 피부/점막 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 간 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 위장/폐 관련 급성 또는 만성 대숙주성 이식편병; 및/또는
이식 거부
예를 들면, 폐, 신장, 또는 간장 이식과 같은 고형 장기 이식, 심장 이식, 심장 이상 거부 예방,
장기 동종 이식 거부, 예를 들면 심장, 폐 또는 신장 동종 이식 거부, 폐색성 모세기관지 증후군(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS), 및/또는
전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE), 류머티스성 관점염, 소아당뇨병, 제1형 당뇨병; 및/또는
AIDS 관련 합병증, HIV-감염 질병, AIDS 관련 카포시(AIDS-related kaposis), 자궁경부 HPV 감염; 및/또는
심상성 천포창, 건선성 관절염, 아토피성 피부염, 아토피성 습진, 편평 태선.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 치료를 위한 것이다:
림프종, 바람직하게는 T-세포 림프종, 가장 바람직하게는 피부 T-세포 림프종 또는 홍색피부 T-세포 림프종; 및/또는
혈액학적 암, 또는 림프성 백혈병.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 치료를 위한 것이다:
대숙주성 이식편병,
예를 들면, 골수 이식 후 cGvHD(chronic graft versus host disease), 피부/점막 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 간 관련 만성 대숙주성 이식편병(cGvHD), 위장/폐 관련 급성 또는 만성 대숙주성 이식편병; 및/또는
이식 거부
예를 들면, 폐, 신장, 또는 간장 이식과 같은 고형 장기 이식, 심장 이식, 심장 이상 거부 예방,
장기 동종 이식 거부, 예를 들면 심장, 폐 또는 신장 동종 이식 거부, 폐색성 모세기관지 증후군(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS).
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 치료를 위한 것이다:
다발성 경화증, 전신성 경화증, 진행성 전신성 경화증(progressive systemic sclerosis, PSS), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE), 류머티스성 관점염, 소아당뇨병, 제1형 당뇨병.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 및 ALA-화합물의 일 실시예에서, 노출된 상기 환자의 혈액의 일부는, 분리된 백혈구, 백혈구가 풍부한 혈액, 또는 백혈구가 풍부한 연층으로부터 선택되되, 바람직하게는 0% 내지 10%의 적혈구용적률(또는 선택적으로 2.5% 내지 7%의 적혈구용적률) 및/또는 전체 말초혈액 단핵 세포 구성의 5% 내지 25%을 가질 수 있다. 이론적으로, 특히 이는 환자로부터 채혈된 혈액(전혈의 5% 내지 25%, 5% 내지 20% 또는 10% 내지 15% )일 경우에 적용된다(선택적으로 항응혈제와 결합한다). 백혈구(주로, 림프구)는 다수의 회전을 통한 원심 분리에 의해 분리된다. 이러한 백혈구 풍부 부분은 가장 바람직한 실시예이며, "환자의 혈액의 일부"에 의해 포함되는 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 치료는 일주일에 하루 또는 연 이틀에서 4주에 하루 또는 연 이틀까지, 또는 매 2주간 연 이틀 간격으로 수행;
되고/되거나
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 상기 치료는 1 내지 12개월, 2 내지 6개월 또는 3개월 동안 수행된다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 단계를 포함 또는 구성한다:
a) 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물을, 선택적으로 구강 또는 정맥을 통해 전반적 투여된 환자를 선택하고; 및/또는
b) 상기 환자의 혈액을 체외에서 수집하되, 선택적으로 항응혈제와 혼합하며; 및/또는
c) 백혈구 응축과 같이 상기 환자의 혈액 내 단핵 세포 성분 중 하나를 응축하여, 상기 단핵 세포 성분들 중 응축된 환자의 혈액의 상기 부분과 나머지 부분을 형성하되, 선택적으로 원심분리를 이용하며; 및/또는
d) 선택적으로 상기 환자의 혈액의 나머지 부분을 - 바람직하게는 이후 수시로- 재주입하며; 및/또는
e) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물과 접촉시키며; 및/또는
f) 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물과 함께 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 배양하며; 및/또는
g) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체가 활성화하는 파장 또는 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시키며; 및/또는
h) 상기 처리된 환자의 혈액 또는 처리된 환자의 혈액의 일부를 재주입하는 것을 포함하되,
바람직하게, 체외 광분리 반출법 치료는 단계 b) 내지 단계 h), 단계 a) 내지 단계 d) 및 단계 g) 내지 단계 h), 또는 단계 b) 내지 단계 e) 및 단계 g) 내지 단계 h)를 포함 또는 구성되고,
더욱 바람직하게는, 추가적으로, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 단계 b) 내지 단계 h), 단계 a) 내지 단계 d) 및 단계 g) 내지 단계 h), 또는 단계 b) 내지 단계 e) 및 단계 g) 내지 단계 h)를 순차적으로 진행한다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 단계를 포함 또는 구성한다:
b) 상기 환자의 혈액을 체외에서 수집하되, 선택적으로 항응혈제와 혼합하며; 및
c) 백혈구 응축과 같이 상기 환자의 혈액 내 단핵 세포 성분 중 하나를 응축하여, 상기 단핵 세포 성분들 중 응축된 환자의 혈액의 상기 부분과 나머지 부분을 형성하되, 선택적으로 원심분리를 이용하며; 및
d) 선택적으로 상기 환자의 혈액의 나머지 부분을 - 바람직하게는 이후 수시로- 재주입하며; 및
e) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물과 접촉시키며; 및
f) 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물과 함께 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 배양하며; 및
g) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체가 활성화하는 파장 또는 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시키며; 및
h) 상기 처리된 환자의 혈액 또는 처리된 환자의 혈액의 일부를 재주입하는 것을 포함한다.
바람직하게는 상기 체외 광분리 반출법 치료에서 각 단계들은 순차적으로 진행될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 단계를 포함 또는 구성한다:
b) 상기 환자의 혈액을 체외에서 수집하되, 선택적으로 항응혈제와 혼합하며; 및
c) 백혈구 응축과 같이 상기 환자의 혈액 내 단핵 세포 성분 중 하나를 응축하여, 상기 단핵 세포 성분들 중 응축된 환자의 혈액의 상기 부분과 나머지 부분을 형성하되, 선택적으로 원심분리를 이용하며; 및
d) 선택적으로 상기 환자의 혈액의 나머지 부분을 - 바람직하게는 이후 수시로- 재주입하며; 및
e) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물과 접촉시키며; 및
f) 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물과 함께 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 배양하며; 및
g) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체가 활성화하는 파장 또는 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시키며; 및
h) 상기 처리된 환자의 혈액 또는 처리된 환자의 혈액의 일부를 재주입하는 것을 포함한다.
바람직하게는 상기 체외 광분리 반출법 치료에서 각 단계들은 순차적으로 진행될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 단계를 포함 또는 구성한다:
b) 상기 환자의 혈액을 체외에서 수집하되, 선택적으로 항응혈제와 혼합하며; 및
c) 백혈구 응축과 같이 상기 환자의 혈액 내 단핵 세포 성분 중 하나를 응축하여, 상기 단핵 세포 성분들 중 응축된 환자의 혈액의 상기 부분과 나머지 부분을 형성하되, 선택적으로 원심분리를 이용하며; 및
d) 선택적으로 상기 환자의 혈액의 나머지 부분을 - 바람직하게는 이후 수시로- 재주입하며; 및
e) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물과 접촉시키며; 및
g) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체가 활성화하는 파장 또는 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시키며; 및
h) 상기 처리된 환자의 혈액 또는 처리된 환자의 혈액의 일부를 재주입하는 것을 포함한다.
바람직하게는 상기 체외 광분리 반출법 치료에서 각 단계들은 순차적으로 진행될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물의 일 실시예에서, 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 단계를 포함 또는 구성한다:
a) 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물을, 선택적으로 구강 또는 정맥을 통해 침투 투여된 환자를 선택하고; 및
b) 상기 환자의 혈액을 체외에서 수집하되, 선택적으로 항응혈제와 혼합하며; 및
c) 백혈구 응축과 같이 상기 환자의 혈액 내 단핵 세포 성분 중 하나를 응축하여, 상기 단핵 세포 성분들 중 응축된 환자의 혈액의 상기 부분과 나머지 부분을 형성하되, 선택적으로 원심분리를 이용하며; 및
d) 선택적으로 상기 환자의 혈액의 나머지 부분을 - 바람직하게는 이후 수시로- 재주입하며; 및
g) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체가 활성화하는 파장 또는 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시키며; 및
h) 상기 처리된 환자의 혈액 또는 처리된 환자의 혈액의 일부를 재주입하는 것을 포함한다.
바람직하게는 상기 체외 광분리 반출법 치료에서 각 단계들은 순차적으로 진행될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물을 사용하는 전술된 치료 방법에 특히 적합한 또 다른 실시예에서, 상기 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 단계를 포함한다:
a) 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물을, 선택적으로 구강 또는 정맥을 통해 침투 투여된 환자를 선택하는 것.
본 발명에 따른 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 상기 ALA-화합물의 일 실시예에서,
5-아미노레불린산(ALA) 또는 ALA-헥실에스테르(헥사미노레불리네이트; 헥실 5-아미노-4-오소펜타노에이트; HAL)을 사용하는 화합물,
바람직하게, 환자의 혈액 또는 혈액의 일부 내에서 0.1 내지 10mM 사이, 0.5 내지 5mM 사이 또는 1mM 농도에서, 또는 환자 몸무게의 0.1 내지 10 mg/kg, 0,5 mg/kg 내지 5 mg/kg, 또는 0,75 내지 2 mg/kg의 농도에서; 및/또는
혈청이 없거나 5 내지 20% 또는 10% 혈청이 존재 하에서; 및/또는
ALA, HAL, 또는 그의 염이 상기 환자의 혈액 또는 혈액의 일부와 접촉하여 상기 파장의 광에 노출되는 시간은 30분 내지 120분, 45분 내지 75분 또는 1시간으로; 및/또는
상기 광의 파장은 315nm 내지 1000nm 및 315nm 내지 850nm 사이이며, 바람직하게는 315nm 내지 380nm, 380nm 내지 450nm, 또는 315nm 내지 450nm 사이일 수 있으며;
상기 광은 0.01 내지 20J/cm2 사이의 도즈량을 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 체외 광분리 반출법 또는 체외 광분리 반출 방법에서 사용되는 키트 및 지시 설명서(instruction leaflet)를 제공하되, 키트는 상기 광활성이 가능한 포르피린-유도체 또는 ALA-화합물을 포함하는 용기를 포함한다. 더욱 상세하게 상기 용기는 ALA 또는 HAL과 같은 ALA-화합물을 포함할 수 있다. 또한, 항응혈제 및/또는 8-MOP를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기에서 실험예들을 이용하여 설명한다. 하기의 설명은 단지 실험예의 방식으로 제공되며, 본 발명의 일반적인 개념을 한정하지 않는다.
실험예 :
요약( 실험예 1과 관련)
배경지식: 분리된 백혈구를 8-메톡시소랄렌(8-MOP) 및 자외선-A(UV-A) 광에 노출시키는 체외 광분리 반출법은 피부 T-세포 림프종 및 대숙주성 이식편병의 치료를 위해 사용된다. 8-MOP은 암세포 DNA 및 일반 세포 DNA 모두에 결합하여, 일반 세포의 발암 위험을 증가시키며 UV-A 조사 후 암세포 및 일반 세포를 선택 없이 사멸시킨다. 헥사미노레불리네이트(HAL)-유도 프로토포르피린 IX는 강력한 감광제로서 세포의 핵의 외부 막 구조체에 국한된다. HAL-매개 광역학 치료는 활성화된/변형된 림프구를 선택적으로 파괴하고 전반적 항암 면역을 유도한다. 본 발명의 목적은 UV-A 조사 후 세포들을 죽이는 8-MOP을 대신하는 HAL의 이용 가능성을 알아보는 것이었다.
방법: 인간 T-세포 림프종 저캇 세포계(human T-cell lymphoma Jurkat cell line)가 8-MOP 및/또는 HAL에 UV-A 또는 청색광 조사의 조합 후 세포증식 분석 및 장기생존 분석을 통해 세포 광불활성화를 평가하기 위해 사용되었다. 또한, 세포사의 형태가 형광현미경검사에 의해 분석되었다.
결과: 세포 증식은 HAL/UV-A, HAL/청색광, 8-MOP/UV-A 또는 HAL/8-MOP/UV-A에 의해 감소되었다. 충분한 도즈량에서는 모든 치료요법에서 세포가 사멸되었다; 그러나, 세포사의 형태는 치료 조건에 의존적이었다. 8-MOP/UV-A만이 세포 고사가 나타났다. 한편, 세포 고사와 세포 괴사 두 가지는 HAL/UV-A 또는 HAL/청색광에서 나타났다.
결론: 8-MOP은 HAL에 의해 대체될 수 있되, HAL은 UV-A 조사 후 세포 고사 및 세포 괴사를 통해 저캇 세포를 불활성화시킬 수 있다. 상기의 발견은 광분리 반출법의 효율 향상에 영향을 줄 수 있다.
약어: ALA- 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid), CTCL- 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), ECP- 체외 광분리 반출법(extracorporeal photopheresis), FBS- 소태아혈청(fetal bovine serum), HAL- 헥사미노레불리네이트(hexaminolevulinate), GvHD- 대숙주성 이식편병, MOP- 메톡시소랄렌(methoxypsoralen), MTS- 3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-5(3-카르복시메토니페놀)-2-(4-설포페닐)-2H-테프라 졸륨)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethonyphenol)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetra zolium), PDT- 광역학 치료(photodynamic therapy), PI- 프로피듐 오요드(propidium iodide), PpIX- 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX), PUVA- 소랄렌 플러스 자외선-A(psoralen plus ultraviolet-A), UV-자외선(ultraviolet)
도입부.
ECP용 ALA 또는 HAL의 사용의 큰 이점은 강력한 광감제로서 ALA/HAL-유도 PpIX을 세포 핵의 외부 막 구조체에 국한시키는 것이다[5]. 그래서, 8-MOP와 비교하여 잠재적 발암의 위험을 감소시킬 수 있다. 더욱이, ALA/HAL-유도 PpIX는 광 노출 후 선택적으로 활성화된/변형된 림프구를 파괴시킨다[11-13]. 추가적으로, PDT는 전반적 항암 면역을 유도할 수 있다(예컨대,[14-15]).
임상적이고 원칙적으로 적용되는 ALA-PDT는 자외선 각화증 및 피부 기저 세포암에 대하여 이미 검증된 치료법이다[16-18]. 또한, ALA의 전반적 투여는 악성 신경교종의 PpIX 형광체-유도 절제술[19-22] 및 바레트 식도(Barrett's oesophagus) 내 형성이상의 PDT 치료[23-25]에서 널리 사용되고 있다.
ALA은 자연적으로 아미노산을 발생시키고 임상적 사용에서 약간의 암흑 독성(dark toxicity)을 나타낸다. 일반적으로, 20%의 도즈량과 3시간 이내로 사용하는 ALA의 국소 적용은 일반화된 광감작(photosensitisation)을 야기하지 않는다. 전반적 투여의 경우, ALA을 구강 또는 복강 내에서 단일 도즈 투여 후, 쥐를 통해서 LD50가 몸무게당(b.w) 2,500 mg/kg인 것이 알려져 있다[26]. 쥐에게 ALA를 정맥 주사로 단일 도즈를 투여하였더니, 생쥐 및 쥐 각각에서 LD50가 500 mg/kg 및 250 mg/kg로 나타났고, 이는 관찰 가능한 유독성 효과는 없었다는 것이다[26]. 인간의 경우, 신경교종의 형광-유도 절제술을 위해, 식수 내에 단일 도즈의 ALA을 구강을 통해 통상적으로 투여한 경우, LD50가 20 mg/kg이다[19-22]; 바레트 식도의 PDT 치료를 위해 구강을 통해 투여한 경우, LD50가 60 mg/kg이다[23-25]. 구강을 통한 ALA투여의 가장 일반적인 부작용은 매스꺼움, 구토 및 간 효소의 일시적 상승이며 이는 통상적으로 48시간 후 해소된다[27].
동물 종양 모델에서, PDT를 위한 ALA 사용의 가능성이[28, 29]후 연구되었고, 1990년 이래로, ALA의 국부 또는 전신 투여 이후[16-18, 30, 31] 인간의 피부 및 위장기관의 암의 PDT 치료에서 임상적 시도들이 있었다. 1996년에, ALA-PDT가 폐암 세포 내 세포 고사를 야기시킬 수 있다는 것이 발견되었다[32, 33]. 상기 발견은 몇 종의 인간 백혈병 및 임파종 세포계 내에서 ALA(HAL)의 헥실에스테르의 사용을 더욱 확인시켰다[7, 8, 34].
본 발명에 대한 일 선행 실험에서, 백혈병 또는 전이된 유방암종에 대한 임상적 연관 동물 모델에서, 골수로부터 암세포를 제거하기 위하여 PDT내 HAL를 사용하였고, 기대할만한 성과를 얻었다[35, 36].
본 발명에서는, 변형되거나 활성화된 림프구에서 ALA 또는 그의 에스테르로부터 PpIX이 선택적으로 형성되기 때문에, 일반 휴면중인 대조군의 PpIX과 비교할 때, PpIX의 양이 많다는 것은 기본적인 발견이었다.
최근, HAL과 UV-A 램프(상업적인 테라코스 광분리 반출 시스템(Therakos photopheresis system)에서 사용되는 UV-A 램프의 발광 스펙트럼과 거의 동일한 스펙트럼을 갖는)의 조합이 체외에서(in-vitro, 본 발명) 저캇 인간 T-세포 림프종 세포계를 효과적으로 사멸하는 것을 알아냈으며, ECP를 위한 ALA 또는 그의 에스테르의 사용 가능성을 제기했다.
ECP용 ALA 사용의 장점을 다음과 같이 요약할 수 있다:
a. 증식하는(변형되거나 활성화된) T-세포는 ALA-유도 PpIX를, 일반적으로 휴면중의 T-세포보다 약 15배 이상 생산한다. 결과적으로, 8-MOP의 비선택적 효과와는 다르게, 광 조사 후 증식하는 T-세포는 선택적으로 더 많이 파괴될 수 있다.
b. ALA-유도 PpIX은 세포 핵의 외부 막 구조체에만 국한되어, 발암을 야기하지 않는다.
c. 대상막은 DNA-결합 8-MOP보다 더 강력한 항원 분자들을 생산한다. 유방암세포를 갖는 4T1 쥐에게 체외에서(ex-vivo) HAL-PDT는 전반적인 항암 면역을 야기한다는 것이 쥐를 통해 제안되었다[37].
d. ALA은 높은 안정성을 갖는 승인된 의약품이다. 소태아혈청 10% 존재 하에1 mM ALA 투여 및 1시간 배양한 후 UV-A 광 노출하여, 저캇 인간 T-세포 림프종 세포의 95% 이상을 사멸시킬 수 있다. 전형적인 임상 설정에서, 이는 약 1 mg/kg의 도즈량에 대응하되, 이는 임상적 ALA 사용에서 사용되는 안정한 도즈량보다 매우 적은 양이다[19-25].
e. 테라코스 광분리 반출 시스템을 사용하는 현재 방법에서 ALA의 적합성은 8-MOP와 유사할 수 있다. 다만, 환자가 UV-A 광 조사 전 ALA 배양을 위해 1시간 정도 기다리는 것이 유일한 차이점이다.
인간 T-세포 림프종 저캇 세포계를 피부 T-세포 림프종의 체외(in vitro) 모델로서 사용하였으며, UV-A와 HAL의 조합으로 세포를 불활성시킬 수 있는 가능성을 실험했다. 또한, 세포사에 대하여 8-MOP/UV-A 및 HAL/청색광의 효과를 비교하여, 현재 HAL를 이용하는 ECP 기술에서, 8-MOP 대체에 대한 실행 가능성을 평가했다.
세포 증식이 HAL/UV-A, HAL/청색광, 8-MOP/UV-A 또는 HAL/8-MOP/UV-A에 의해 감소된다는 점을 발견하였다. 충분한 도즈량에서는 모든 치료요법에서 세포가 사멸되었다: 그러나, 세포사의 형태는 처리 조건에 의존하였다. 8-MOP/UV-A만이 세포 고사되었다. 한편, 세포 고사와 세포 괴사 두 가지는 HAL/UV-A, HAL/청색광에서 유도되었다. 따라서, 8-MOP는 HAL에 의해 대체될 수 있으며, UV-A 조사 후 세포 고사 및 세포 괴사를 통해 저캇 세포를 불활성화한다고 결론내렸다.
GvHD 환자로부터 혈액 시료에서 체외(ex-vivo) 추적조사는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 ECP-매개 세포사에서, 8-MOP 보다 5-ALA에 대한 우수성이 증명되었다.
상기 발견은 5-ALA를 이용함으로써 광분리 반출법의 효율이 개선된 것을 나타낸다.
도면:
도 1(실험예 1 관련): A) 저캇 세포 내 HAL-유도 PpIX의 스펙트럼. B) UV-A 램프에 의해 발광된 광의 스펙트럼.
도 2(실험예 1 관련): HAL에 의한 저캇 세포의 광역학적 불활성.
도 3(실험예 1 관련): 8-MOP에 의한 저캇 세포의 광불활성화.
도 4(실험예 1 관련): UV-A 광원에 대한 8-MOP에 의한 저캇 세포 광불활성화의 의존도.
도 5(실험예 1 관련): HAL 및 8-MOP의 조합과 UV-A광의 조사에 의해 저캇 세포의 광불활성화.
도 6(실험예 1 관련): 암흑 독성(대조군과 관련).
도 7(실험예 1 관련): 세포 생존 분석.
도 8(실험예 1 관련): 서로 다른 처리 후 저캇 세포의 형광 이미지.
도 9(제2 실험예 관련): CD4+ T 림프구에 대한 5-ALA의 효과.
도 10(실험예 2 관련): CD8+ T 림프구에 대한 5-ALA의 효과.
도 11(실험예 3 관련): HAL에 의한 인간 T-세포 림프종의 광역학적 불활성.
도 12(실험예 3 관련): 8-MOP에 의한 인간 T-세포 림프종의 광역학적 불활성.
도 13(실험예 4 관련): 동일하게 처리된 환자 혈액 시료와 다르게 분석된 부분의 인간 백혈구에 대한 5-ALA 암흑 독성.
실험예 1
물질 및 방법.
화학물질.
헥사미노레불리네이트(HAL)는 포토큐어 ASA(Photocure ASA, Oslo, 노르웨이)에 의해 제공되었다. HAL의 원액을 에탄올의 1:9 혼합으로 무혈청 RPMI 1640 배지(PAA Laboratories GmbH, Fisher Scientific, 노르웨이)에 각 실험 전 8mM농도로 준비했다. 8-메톡시소랄렌(8-methoxypsoralen, 8-MOP)의 원액을 순수 에탄올 내에 준비하고, 사용 전까지 냉동시켰다. 준비된 모든 화학물질은 상업적으로 사용가능하며 최상의 순수한 상태로 사용되었다.
세포계 .
계대 4-24에서 중단 상태로 성장하는 인간 T-세포 림프종 세포계, 즉 저캇(ATCC number: TIB-152TM)이 본 연구에 사용되었다. 세포는, 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco, Invitrogen, 노르웨이), L-글루타민(L-glutamine, Gibco, Invitrogen, 노르웨이), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토미신(streptomycin, Gibco, Invitrogen, 노르웨이)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 계대배양(subcultivation)하는 동안, 세포는 격일로 3x105cells/ml의 밀도로 희석되었다. 실험 중, 세포는 실험 시작 하루 전 1 x106cells/ml의 밀도로 희석되었다.
형광 스펙트럼.
형광 여기 스펙트럼은 635nm의 발광 파장에서 퍼킨 엘머 LS50B 형광분광광도계(Perkin Elmer LS50B Luminescence Spectrometer, Norwalk, CT)의 수단으로 기록되었다. 15nm 슬릿 폭과 1.0X0.4 cm2 석영 큐벳(cuvette)이 본 측정에 사용되었다.
UV 및 청색광 램프의 발광 스펙트럼은 섬유 결합된 분광계들(fibre-coupled spectrometers, 각각 USB4000, Ocean Optics, Duiven, 네덜란드 및 Avantes AvaSpec-2048x14-USB2, 네덜란드)를 사용하여 기록되었다.
광역학적 및 소랄렌 / UV- A 처리.
세포는 배양 플라스크로부터 수집되었고, 1400rpm 에서 5분 동안 원심 분리되었고, 무혈청 RPMI 1640 배지에서 37.5x105cells/ml 밀도로 희석되었다. 세포부유액 80μl는 96개의 웰 플레이트(well plates)로 이동되었다. HAL 용액 10μl 또는 무혈청 RPMI 1640 배지 10μl(대조군)을 추가한 후, 세포를 37℃ 암흑에서 4시간 배양했다. HAL을 포함하는 배양 종료 5분 전, 8-MOP 용액 10μl 및 무혈청 RPMI 1640 배지 10μl(대조군)을 웰에 추가했다. HAL를 포함하는 4시간 배양 및 8-MOP를 포함하는 5분 배양 후, 시료를 UV-A, 청색광 또는 이 둘 모두를 이용하여 조사하는데, 노출 시간은 결과 부분에 기재하였다.
시료의 UV-A 조사를 위해, 주로 340nm 내지 410nm 영역에서 발광하는 국산 UV-A 램프(SΦrensen UV-A lamp, Phillips Th 20W/09)를 사용하였다(도 1). 시료의 청색광 조사를 위해, 주로 410nm 내지 500nm의 영역에서 발광하되 440nm에서 최대로 발광하는 4개의 형광 튜브층(model 3026, Applied Photophysics, 런던, 영국)으로부터 광이 사용되었다(도 1).
체외( in vitro ) 증식 분석.
세포 증식은 상업적으로 이용 가능한 키트를 가지고 평가되었다. 키트는 테트라졸륨 화합물(tetrazolium compound, 3-(4,5. dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl) -2-(4-sulfophenyl)-2 H-tetrazolium, 분자 내염, MTS)이 포르마잔 생성물(formazan product)로 세포적 변환을 기반으로 하는 비색 방법을 이용하되 포르마잔은 492nm 흡광도에 의해 검출될 수 있다. 조사 후 24시간 후에 MTS(Promega Corporation, Madison, Wl) 20μl을 각 웰에 추가하였다. 37℃에서 1시간 배양 후 웰 플레이트 리더의 수단(Multiskan Ex, Lab-systems, 핀란드)을 이용하여 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
체외( in vitro ) 장기 생존 분석.
재조합 시토카인(recombinant cytokines)을 포함하는 메틸셀루오스-기반 배지 인간 MethoCult®(H4034, StemCell Technologies, 프랑스)를 생존 분석을 위해 사용했다. 처리 후 즉시, 200개 저캇 세포를 포함하는 무혈청 RPMI 1640 배지 120μl를 MethoCult® 1.2ml에 추가했다. 시료는 제조사의 지시에 따라 처리되었고, 현탄액은 35mm 페트리 접시로 이동되었다. 5% CO2를 가지고 가습되는 배양기 내에서 37℃에서 배양되었다.
고사 세포의 평가.
4.0 μg/ml의 Hoechst 33342(Sigma, St. Louis, MO)로 37℃에서 10분 동안 염색한 후, 핵 형태를 기반으로 하는 형광 현미경 검사에 의해 고사 세포를 확인하였다. 상기 분석은 이전 실험들에서 확인되었다[7]. 필터 조합은 330 내지 380nm 여기 필터, 400nm 빔 스플리터, 및 420nm 롱-패스(long-pass) 발광 필터로 구성되었다. 세포사를 확인하기 위하여 시료로 프로피듐 요오드(propidium iodide, PI) 2.5 μg/ml를 추가하였다. PI 형광 검출을 위해, 필터 조합은 540/25nm 여기 필터, 565nm 빔 스플리터, 및 605/55nm 밴드-패스(band-pass) 발광 필터로 구성했다. 형광 이미지는 고감광의 열전 냉각 전하결합소자 카메라(thermo-electrically cooled charge-coupled device camera) ORCAII-ER(Ha-mamatsu, Japan)에 의해 캡처되었다.
통계적 분석.
데이터 및 곡선 맞춤의 통계적 평가를 위해, 시그마 플롯 소프트웨어(Sigma plot software)가 사용되었다. 스튜던트 t-테스트(Student's t-tests)가 통계적 분석을 위해 적용되었다.
결과.
스펙트럼 측정.
HAL과 함께 무혈청 배지에서 4시간 동안 배양된 저캇 세포의 현탁액에서, 세포 HAL-유도 PpIX의 형광 여기 스펙트럼이 측정되었다. 실험실 내에서 사용된 램프에 의해 발광된 광과, 임상적으로 사용되는 테라코스 광분리 반출 시스템의 광원에 의해 발광된 광을 이용하여, 다양한 환경(컴팩트 램프, 형광 튜브 단독, 플라스틱을 통과한 광, 등)에서 스펙트럼을 측정하였다.
측정된 스펙트럼들(도 1A)을 비교하면, 두 개의 결론이 도출될 수 있다. 첫째, 모든 램프들의 발광 스펙트럼은 세포 HAL-유도 PpIX의 여기 스펙트럼과 부분적으로 겹친다. 둘째, UV 램프로부터 발광된 광은 상기 환경에 의존한다(도 1B).
HAL 및 광을 이용한 처리.
세포 내에서 생성된 HAL-유도 PpIX의 형광 여기 스펙트럼이 본 연구에서 사용된 UV-A 램프뿐만 아니라 청색광에서 발광 스펙트럼과 상당히 겹치는 것을 보여준다(도 1A). 그러므로, 저캇 세포의 HAL-유도 PpIXdp 대한 민감성은 세포에 대하여 청색광 또는 UV-A광 중 어떤 것이든 조사한 후 평가되었다. 10 또는 20초 청색광 조사, 이는 백혈병 및 림프종 세포계의 광역학적 불활성을 위해 일반적으로 사용되는 충분히 높은 도즈량이다; 및 임상 ECP 시 UV-A에 대한 세포 노출 기간과 대략적으로 대응하는 5 또는 10분 UV-A 조사를 이용하여 실험하였다. MTS 분석에 의해 평가된 세포 증식은 모든 경우에서 농도-의존 방식으로 감소되는 것을 나타내었다(도 2A). 청색광과 함께 HAL-기반 PDT 시 시료 내 1.00 μM의 8-MOP 존재는 세포 증식에 영향을 미치지 않았다. 실험적 오차 내에서, UV-A 조사 후 혈청(FBS, 10%의 최종 농도)이 세포에 추가되었을 때에도 동일한 결과가 얻었다(도 2B 및 도 2C).
상기 결과는 HAL과 테라코스 UV-A광(Therakos UV-A light)의 결합이 셀을 광불활성화한다는 것을 명확하게 보여준다.
8-MOP 및 광을 이용한 처리.
우선, HAL 부재 중에 8-MOP 및 UV-A 광의 조합된 처리에서 저캇 세포의 감광성을 실험했다. UV-A광 조사 시간(5분 및 10분) 모두에서, 시료 내 8-MOP 농도 증가가 MTS 분석에 의해 측정된 세포 증식을 감소시킨다는 결과를 나타냈다(도 3). 청색광의 발광 스펙트럼이 8-MOP의 동작 스펙트럼에서 벗어나서 발생되기 때문에(예컨대,[38]), 청색광에 의한 8-MOP의 활성은 실험하지 않았다. 이와는 다르게, 8-MOP 효과가 UV-A 램프 발광 스펙트럼의 스펙트럼 범위에 의존적일 것이라고 기대된다. 실로, UV-A 램프의 스펙트럼을 단지 몇 nm이동시켰는데, 1.00 μM의 8-MOP는 세포의 광불활성화 감광을 상당히 증가시켰다.
상기 실험은 8-MOP의 효과가 UV-A광에 의해 커버되는 스펙트럼 영역에 매우 의존적이라는 것을 명백하게 알려준다.
HAL , 8-MOP 및 광의 조합을 이용한 처리.
UV-A 광 조사 후, HAL 및 8-MOP 모두가 세포 광불활성화 효과를 발생시킬 수 있기 때문에, 감소된 농도에서 두 약품의 사용 조합의 가능성을 실험했다. 목적을 위하여 몇몇 8-MOP 및 HAL의 조합이 실험되었다(표 1). 0.10 μM 8-MOP + 1.55 μM HAL를 갖는 세포의 배양 후 10분 UV-A 조사하면, 0.10 μM 8-MOP 또는 1.55 μM HAL을 단독으로 사용할 때에 비하여 세포 증식이 현저히 낮을 것을 알 수 있다(도 5). 5분 UV-A 조사할 때 유사한 효과가 0.10 μM 8-MOP + 1.55 μM HAL의 조합에서 성취될 수 있다(도 5). UV-A 조사 후 혈청(10% FBS)이 시료에 추가될 때 질적으로 동일한 결과가 획득되었다(미도시). 5.00 μM 농도의 HAL은 광 조사 후 최소한의 세포 증식으로 감소시키기에 충분하였다. 따라서, 8-MOP과의 조합에 대한 효과를 실험하지 않을 수 있다.
그래서, 데이터는 HAL 및 8-MOP의 조합에 의해 세포 광불활성화의 가능성을 설명하되, 각각은 세포 광불활성화를 위해 필요한 농도보다 낮은 농도를 갖는다.
암흑 독성.
8-MOP가 DNA와 결합되면 독성에 대한 우려를 증가시킨다. 또한, HAL은 전반적 투여 시 독성을 가질 수 있다. 그러므로, 각 실험에서, 광에 노출되지 않은 상태에서 약품들로 처리된 시료는 약품에 대한 암흑 독성을 확인하는 것이 포함되었다. 일반적으로, MTS 분석의 데이터에 따르면, HAL(11.00 μM까지: 도 2 및 도 6) 또는 8-MOP(1.00 μM까지; 도 3, 도 4, 도 6)의 암흑 독성에 대한 조짐이 없었다. 다소 낮은 세포 증식율은 약품의 조합이 세포를 처리하는데 사용될 때 발견되었다(도 6).
장기 세포 생존.
실험한 모든 치료요법은 저캇 세포 증식의 감소를 야기시켰다. 장기 세포사와 연관된 세포 증식이 감소하는지를 확인하기 위해, 반고형 배지에서 클론원성 분석을 하기의 처리 후에 수행했다: 1.0 μM의 MOP/10분 UV-A, 5.0 μM의 HAL/10분 UV-A, 0.1 μM의 MOP+ 1.55 μM의 HAL/10분 UV-A, 7.4 μM의 HAL/10초 청색광. 특정 배지에서는 집락(colony)이 형성될 것이라는 기대에도 불구하고, 세포 시딩(cell seeding) 후 1주일 후 밀집한 집락을 갖는 시료를 찾을 수 없었다[39-41]. 그러나, 대조군에서 생존 단세포가 많이 발견되었다. 2주 후, 대조군에서 높은 세포 밀도로 확산되고 겹쳐진 영역이 나타났으며, 접시의 모든 영역을 완전하게 덮었다. UV-A처리된 시료에서는 생존 세포를 발견하지 못했다. 몇몇 경우들에서, 대조군에서 보여지는 것과 유사하게, HAL과 청색광의 조합으로 처리된 시료들에서 세포들이 밀집된 특정 영역을 볼 수 있었다(표 2). 이는 도 2에서 설명된 결과와 일치하며, 어떤 조건(7.4 μM의 HAL/10초 청색광)에서 세포 증식이 완전하게 감소하지 않는 것을 보여준다. 생존 및 대사하는 세포들의 존재와 일치하게, 배지 색의 누르스름한 변화가 대조 시료에서 확인되었다(도 7).
세포사 평가.
본 연구에서 실험한 모든 처리(8-MOP/UV-A, HAL/청색광, HAL/UV-A, MOP+HAL/UV-A)는 약품 또는 광 도즈량-의존 방식에서 저캇 세포의 죽음을 포함할 수 있다. 처리 후 20시간 후, 세포사의 형태가 처리방법에 따라 다른지를 알아보기 위해 세포를 형광 현미경에 의해 분석하였다. 시료 내에서 고사체의 양이 상당히 상이하였다. 1.00 μM의 8-MOP을 처리한 후, UV-A 조사한 대부분의 세포는 세포 고사에 의해 사멸되었다고 보여지는 반면, 5.00 μM의 HAL를 처리한 후 10분 UV-A 조사한 시료에서는 고사된 세포를 볼 수 없었다(도 8). HAL이 처리된 시료 내에서 사멸된 세포들 중에서 고사체의 양은 처리요법에 의존적이었다(표 3).
논의.
본 연구에서, UV-A와 HAL의 조합으로 피부 T-세포 림프종의 체외(in vitro) 모델로서 T-세포 림프종 저캇 세포계를 불활성화하기 위하여 실험했고, 8-MOP를 갖는 세포에 UV-A 조사하는 조합 또는 HAL를 갖는 세포를 청색광 조사하는 조합 중 어떤 요법에서든 성취된 효과를 비교했다.
HAL 및 UV-A 조사 처리는 저캇 세포의 증식 및 생존 모두를 감소시켰다. PpIX의 여기 스펙트럼과 본 연구에서 사용된 UV-A 램프의 방출 스펙트럼과 부분적으로 겹치기 때문에 이는 놀라운 결과가 아니다. PpIX 여기 스펙트럼과 청색광 램프를 사용하는 방출 스펙트럼 사이의 겹침도 필적할만하다(도 1A). 청색광 램프는 HAL-PDT 후 백혈병 및 림프종 세포계를 포함하는 다양한 기관의 세포의 불활성에 효과적인 것을 보여준다[7, 8, 34-37]. HAL 및 UV-A로 처리한 후 저캇 세포의 증식의 감소는, ALA 및 UV-A의 조합이 T-세포 백혈병 HUT-78 세포계(T-cell lymphoma HUT-78 cell line)에서 PUVA 처리의 목적을 위해 실험한 다른 연구의 결과와 일치한다[42].
사용된 처리요법에 따라, 세포사의 형태가 다름을 볼 수 있다. 세포 고사는 8-MOP 및 UV-A 광으로 처리된 세포에서만 유도되었던 반면, HAL-유도 세포 광불활성화의 경우에서는, HAL 농도, 광원(UV-A 또는 청색광), 및 조사 시간과 같은 변수들이 저캇 세포사의 형태에 영향을 주었다.
몇몇 공개된 문서에서 논의된 바와 같이, 생체 내(in vivo) ECP 치료 효과는 세포 불활성에 의해서만 야기되지 않으며, 추가적으로 면역 반응의 유도에 의존한다(참고문헌[43] 참조). 이점과 관련하여, 몇 공개된 문서가 면역 효과의 유도에 대한 세포사의 형태의 중대성을 논의하였다는 점이 중요하다[44-48]. 볼 수 있는 세포를, 구별되는 세포 표면 수용기를 통해 괴사성 대상으로부터 세포 고사를 구별해 낼 수 있다는 것과 상기 수용기는 괴사 대상과 상이한 세포 고사의 신호 행적(signalling events)을 유도할 수 있다[49]. 본 데이터는 세포 고사가 8-MOP-UV-A에 의해 유도되며, 임상적 경험은 세포사의 형태가 광분리 반출의 치료 효과를 획득하기에 효율적이라는 것을 보여준다. 세포 괴사뿐만 아니라 세포 고사는 본 연구에서 HAL-PDT에 의해 유도될 수 있으며, 문제는 세포 괴사의 출현이 치료 성과에 유익한지이다. 이 점에 있어서, PDT에 의해 유도된 면역 강화가 많은 발표된 문서들에서 보여지고 있다(예컨대[14, 50]에서 검토됨). 중요한 것은, 외인성 광감제-매개 PDT에 의해 생성된 백신 및 용해물은 UV 및 이온화 조사 또는 동결 융해 기법의 수단에 의해 생성된 것보다 효율적인 것을 보여준다[51-53]. UV 또는 이온화 방사선 프로토콜 하에서 순수한 괴사성 세포 또는 순수한 고사성 세포가 각각 존재하는 것과는 다르게, DPT-생성 백신의 개선된 효과는 PDT 처리 프로토콜 하에서 괴사성 및 고사성 세포의 동시 발생하기 때문이라고 간주되었다[51]. 그러나, 특정 조건 하에서, PDT는 면역 억제를 야기시킨다는 점을 언급되어야 한다(참고문헌[50] 참조).
ECP는 CTCL을 위해 권장되는 치료이고, GvHD에서의 사용을 지지할만한 공정한 증거가 있다[1]. 그러나, 많은 환자들은 난치성 질병을 앓고 있어서, 현재 ECP 요법의 발전이 환자들에게 희망적으로 도움이 될 수 있다.
본 연구의 데이터를 근거로, HAL가, 상업적으로 사용되는 테라코스 광분리 반출 시스템의 광원과 유사한 발광 스펙트럼을 갖는 UV-A램프를 사용한 후 T-세포 림프종 저캇 세포계의 광불활성화에 효과적이라고 결론지었다. 따라서, 저캇 세포의 괴사 및 고사 모두를 야기시키는 HAL-UV-A는 ECP의 증가된 효율에 대한 잠재적 선택을 제공할 수 있다. HAL이 ECP에 사용된다면, 처리 조건은 무손상 면역계를 갖는 대상에서 최적화되는 것이 필요하며, 목적하는 면역 반응의 유도를 성취할 수 있다.
HAL, 8-MOP 및 UV-A 광의 조합으로 세포 치료의 조건들
8-MOP(μM) HAL(μM) UV-A(분)
0.10 1.55 10
0.10 5.00 10
0.50 1.55 5
0.50 5.00 5
처리 후 2주 후 반고형 배지에서 형성된 고 세포밀도 영역의 수량
시료 집락의 수
대조군(처리하지 않음) 많음
1.00μM MOP/UV-A 10분 0.8±2.0(1/6*)
5.00μM HAL/UV-A 10분 0
7.40μM HAL/청색광 10분 4.5±5.6(4/6)
1.55μM HAL+0.10μM MOP/UV-A 10분 0
* 집락이 형성될 때 실험의 수량/실험의 총 수량
HAL-유도 광불활성화 후 세포사 형태의 분석(수량 평가는 고사 세포의 분해로 인해 불가능하다)
약품 농도 조사량 처리 후 20시간 후 셀 형태
1.55μM HAL UV-A 10분 대부분 고사+몇 생존 또는
대부분 괴사+몇 생존*
5.00μM HAL UV-A 10분 괴사만, 고사 없음
5.00μM HAL UV-A 10초 고사+생존(유사 비율)
* 시료 대 시료 변이
도면 설명.
도 1 A)는 저캇 세포 내 HAL-유도 PpIX의 정규 형광 여과 스펙트럼과 청색광 및 UV-A의 정규 형광 여과 스펙트럼. B) 서로 다른 환경(플라스틱 배양 평판을 덮은 본 실험실에서 사용되는 컴팩트 램프, 본 실험실에서 사용되는 램프의 형광 튜브 및 임상적으로 사용되는 광분리 반출 시스템의 램프)에서 UV-A램프의 발광된 광의 스펙트럼
도 2 HAL를 이용하는 저캇 세포의 광역학적 불활성. A) 8-MOP의 부재(흰색 원) 및 1.00 μM 8-MOP 시 청색광 조사(검은색 원); a) 대조군(청색광 없음), b) 청색광 10초 조사 c) 청색광 20초 조사. B) 도 1에 도시된 스펙트럼을 갖는 광에 의한 UV-A 광 조사, 형광 튜브 단독;(○) 대조군(광 조사 없음),(●) 5분 조사,(■) 10분 조사. C) B)와 동일하나 UV-A 조사 후 FBS를 시료에 추가(최종 농도 10%). 각 데이터 점은 적어도 4개의 서로 다른 세포 시료들로부터 평균±표준편차(S.D.)를 나타낸다.
도 3 8-MOP 및 UV-A 광 조사를 사용하는 저캇 세포의 광불활성화.(○) 대조군(광 조사 없음),(●) 5분 조사,(■) 10분 조사. 시료는 도 1에 도시된 스펙트럼을 갖는 컴팩트 램프에 의해 조사된다. 각 데이터 점은 6개의 서로 다른 세포 시료로부터 평균±표준편차(S.D.)를 나타낸다.
도 4 UV-A광원에 대한 8-MOP에 의한 저캇 세포의 광불활성화의 의존성. 세포는 1.00 益의 8-MOP를 가지고 배양되었고, 시료는 도 1에 도시된 스펙트럼을 갖는 광에 의해 조사되었다. 형광 튜브 단독(●) , 모든 램프(■);(○, □) 대조군(광 조사 없음). 각 데이터 점은 6개의 서로 다른 세포 시료로부터 평균±표준편차(S.D.)를 나타낸다. 다만, 10분 및 30분 시간 지점에서는 각각 4개 및 2개의 시료를 사용하였다.
도 5 HAL 및 8-MOP의 조합과 UV-A광의 조사를 사용함에 의한 저캇 세포의 광불활성화. 1.55 μM HAL에 대한 데이터를 보여준다. 시료는 도 1에 도시된 스펙트럼을 갖는 형광 튜브광에 의해 조사되었다. 데이터는 대조군과 관련되어 표현된다. 막대는 8개의 서로 다른 세포 시료로부터 평균±표준편차(S.D.)를 나타낸다.
도 6 암흑 독성(대조군과 관련). 세포는 지시된 약품 및 도즈량을 가지고 처리되었지만 시료들은 광에 조사되지 않았다. 막대들은 6개의 서로 다른 세포 시료로부터 평균±표준편차(S.D.)를 나타낸다.
도 7 세포 생존 분석. 세포 시딩 후 3주 후에 대조 시료 내 배지의 색 차이의 변화- 생존 및 대사하는 세포의 존재와 일치
도 8 Hoechst 33342(왼쪽 열) 및 PI(중간 열)을 가지고 염색한 후, 서로 다른 처리 후 핵 형태를 보여주는 저캇 세포의 형광 이미지. 위상 대비 이미지는 오른쪽 열에 나타난다.(A) 대조군,(B) 0.10 μM의 8-MOP/UV-A,(C) 1.55 μM의 HAL/UV-A,(D) 0.10 μM의 8-MOP+1.55 μM의 HAL/UV-A,(E) 1.00 μM의 8-MOP/UV-A,(F) 5.00 μM의 HAL/UV-A,(G) 5.00 μM의 HAL/UV-A,(H) 5.00 μM의 HAL/청색광. 시료는 10분(B-F) 또는 10초(G, H) 동안 도 1에 도시된 스펙트럼을 갖는 광에 의해 조사되되, 형광 튜브 단독(도 1B) 또는 청색광(도 1A).
실험예 2
cGvHD 및 CTCL 를 갖는 환자 내 ALA-ECP 의 체외( ex-vivo ) 효율의 평가.
ALA-ECP를 위한 실험 조건의 최적화는 저캇 세포 내에서 수행되되, 10%의 소태아 혈청 존재 하에 ALA 농도(1 내지 5 mM) 및 처리 시간(1 내지 4시간)을 다양화하였다. 그리고 나서, 존재하는 상업적 테라코스 광분리 분출 시스템에서 사용되는 UV-A 램프의 스펙트럼과 거의 동일한 발광 스펙트럼을 갖는 UV-A램프를 이용하여, 세포에 UV-A를 10분 동안 노출시켰다. ALA UV-A 처리 후 세포 생존은 프로피듐 요오드(PI) 염색을 이용하여 형광 현미경으로 측정되었다.
ALA의 적절한 도즈량과 배양 시간은 ECP 환자로부터 수집된 백혈구 시료에 적용되었다. 해당 농도에서 ALA의 암흑 독성을 평가하고 이어서 ALA UVA-매개 치사 효율이, 치사 행태(고사/괴사)의 메커니즘에 대한 연구 전에, 평가되었다. ECP 치료에서 사용되는 동일한 광 도즈량으로 테라코스 광분해 분출 시스템의 UVA 램프를 이용하는 광 노출 전에, 최적화된 실험 조건 하에서 환자로부터의 림프구는 ALA를 가지고 배양되었다. ALA 암흑 독성의 세포 생존, ALA/UVA 매개 치사 효율 및 고사/괴사는, 아네신V/IP(Annexin V/PI)으로 염색한 CD4+ 또는 CD8+의 결합 표지를 사용하는 유동 세포 분석법(flow cytometry)으로 측정되었다.
표준 광분해 분출법을 시작한 대숙주성 이식편병 환자로부터 수집된 CD4+/CD8+ T 림프구에 대한, 5-ALA(포르피린 전구체)와 UVA 광 조사의 조합의 치사 효과가 평가되었다. 표준 광분해 분출 장치에서 ALA + UVA 조합에 세포를 노출시키고, 1시간 내지 20시간 사이 다양한 시간지점에서 생존율을 평가하였다. 또한, 표준 광분해 분출법에 사용되는 8-MOP + UVA 조합이 비교를 위해 포함되었다. 세포 생존은, CD4/CD8 항체 및 아네신-V(Annexin-V) 및 eFluor450의 결합 염색을 이용하는 유동세포 분석법으로 측정되었다.
일 환자로부터 증식/활성화된 CD4+ T-세포에 대한 데이터는 도 9에 도시되며, CD8+ T-세포를 위한 것은 도 10에 도시된다. 결과는 ALA + UVA 조합을 이용하는 치료는 8-MOP + UVA 조합보다, 특히 더 작은 광 도즈량에서 예컨대 5분 광 조사 시, CD4+ 및 CD8+ T-세포를 더 효과적으로 죽인다는 것을 보여준다.
피부 T-세포 림프종 또는 GvHD 환자 중 4명의 환자로부터 T- 세포를 치료하였고, 유사한 결과로 표 4에 요약하였다. UVA 조사 만으로 T-세포를 죽이는 것이 명확하며, 무독성 가시광원을 이용하는 이러한 치료법을 발전시키는 것이 필요하다고 제안한다.

 1시간(CD4+/CD8+) 20시간(CD4+/CD8+)
대조군 5-ALA 8-MOP 대조군 5-ALA 8-MOP
환자-1 89.7/95.8 73.7/85.1 87.3/94.2 72.2/61.6 4.3/0.0 57.2/56.9
환자-2 79.8/83.6 52.1/53.1 78.4/84.7 40.4/16.3 1.2/0.3 13.3/5.8
환자-3 78.4/82.2 78.0/76.1 81.3/78.1 45.8/35.0 6.2/0.7 18.2/15.7
환자-4 48.3/31.3 56.4/35.7 53.6/30.6 27.7/22.5 6.4/1.0 12.0/8.8
데이터는 UVA 단독으로(대조군), UVA + 5-ALA 조합, 또는 UVA + 8-MOP 조합을 가지고 치료 한 후 1시간 및 20시간에서 CD4+/CD8+ T-세포 생존을 백분율로 나타낸다. UVA 광 도즈량은 0.158 J/cm2이었다.
도면 설명.
도 9 GvHD 환자로부터 수집된 CD4+ T 림프구에 대한 5-ALA + UVA 광 조사 조합의 치사효과
도 10 GvHD 환자로부터 수집된 CD8+ T 림프구에 대한 5-ALA + UVA 광 조사 조합의 치사효과
실험예 3
실험예 1에서 설명한 동일한 조건 하에서, 실험이 실험예 1에서 사용된 저캇 세포와 상이한 인간 T-세포 림프종인 Karpas 299에서 수행되었고, 도 11 및 도 12에서 도시된 바와 같이 유사한 결과를 나타냈다.
도면 설명.
도 11 HAL + UV-A 조사 조합을 사용하는 인간 T-세포 림프종 세포계(Karpas 299) 광역학적 불활성,(○) 대조군(광 조사 없음),(●) 5분 조사,(■) 10분 조사.
도 12 8-MOP + UV-A 조사 조합을 사용하는 인간 T-세포 림프종 세포계(Karpas 299) 광역학적 불활성,(○) 대조군(광 조사 없음),(●) 10분 조사,(■) 20분 조사.
실험예 4
인간 백혈구에 대한 5-ALA 암측 독성의 평가
광 매개 활성(암흑 독성)의 부재에서 5-ALA의 일반적인 안정성은 하기의 조건으로 평가되었다. 10명의 GvHD 또는 CTLC 환자로부터 혈액 시료를 37℃에서 10 mM의 5-ALA로 처리하고, 5%의 CO2로 가습된 배양기 내에서 하루밤(17 내지 24시간)을 배양하였다. 환자로부터 연층 시료는 표준 광분리 분출 치료 동안 테라코스 광분리 분출 시스템으로부터 직접적으로 수확되었다. 모든 개체에서 대조군으로 포함되도록 5-ALA를 포함하지 않는 배지에 세포를 배양하였다. 다양한 부분 모집단의 유동세포 분석을 위해 백혈구가 항체로 표지된다. 사용되는 항체는 다음과 같다: 백혈구용 CD45 PerCP-Cyanine 5.5, T 보조 세포용 CD4 FITC, T 세포독성 세포용 CD8 FITC 및 B-세포용 CD19 FITC. 또한, 세포는 괴사 세포를 위한 고정가능한 생존 염색 eFluor 450(Fixable Viability Dye eFluor 450) 및 고사/괴사 세포를 위한 아네신 V(Annexin V)으로 표지되었다. 백혈구의 서로 다른 부분 모집단이 나타나고, 세포 생존을 위해 분석되었다. 고정가능한 생존 염색 eFluor 450 및 아네신 V 모두에 음성인 백혈구는 생존 세포로서 간주되었다.
결과는 도 13에 요약되었으며, 동일하게 치료된 환자 혈액 시료로부터 다른 분석 결과를 보여준다. 기술적 이유로, B-세포 부분은 5명의 환자 시료에서만 획득되었으나, 전혈 세포(whole blood cell, WBC)부분은 환자 시료 중 하나만 없었다. 일반적으로, 임상적 설정에서 사용될 것으로 기대되는 것보다 초과인 조건 즉, 10mM의 5-ALA을 17 내지 24시간 동안 노출시켰을 때, 5-ALA의 암흑 세포 독성 효과는 연구된 백혈구에서 크게 발견되지 않았다. 결국 임상적 상황에서 사용되는 농도 및 노출 시간이 여러 가지 요인들 및 특정 상황들에 의존할 것이며, 변경될 수 있다는 점을 주의해야 한다.

Claims (15)

  1. 5-아미노레불린산 또는 상기 산의 염인 ALA-화합물을 포함하고,
    체외 광분리 반출법 치료에 의해 환자의 혈액 또는 혈액의 일부와 접촉되어 315nm 내지 450nm 사이의 파장의 광에 노출되고,
    상기 혈액의 일부는 분리된 백혈구, 백혈구가 풍부한 혈액, 또는 백혈구가 풍부한 연층으로부터 선택되는,
    림프종,
    혈액학적 암, 림프성 백혈병,
    대숙주성 이식편병,
    이식 거부,
    장기 동종 이식 거부,
    크론병, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 진행성 전신성 경화증(progressive systemic sclerosis, PSS), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE), 류머티스성 관점염, 소아당뇨병, 또는 제1형 당뇨병 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 상기 환자의 혈액 및 혈액의 일부와 접촉한 후, 상기 파장의 광에 노출되기까지 사이의 시간이 5분 내지 480분, 15분 내지 240분, 30분 내지 120분, 또는 45분 내지 75분인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 상기 ALA-화합물은 8-메톡살렌(8- MOP)과 같은 솔라렌과 결합되어 사용되는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 파장은 380nm 내지 450nm 사이의 파장으로부터 선택되는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    림프종, 혈액학적 암, 림프성 백혈병 치료용인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 체외 광분리 반출법은 일주일에 하루 또는 연 이틀에서 4주에 하루 또는 연 이틀까지, 또는 매2주간 연 이틀 간격으로 수행되고/되거나
    상기 체외 광분리 반출법은 1 내지 12개월, 2 내지 6개월 또는 3개월 동안 수행되는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 체외 광분리 반출법 치료는 하기의 단계들을 포함하거나 하기의 단계들로 구성되는, 조성물.
    a) 상기 ALA-화합물을, 선택적으로 구강 또는 정맥을 통해 전반적 투여한 환자를 선택하고; 및/또는
    b) 상기 환자의 혈액을 체외에서 수집하되, 선택적으로 항응혈제와 혼합하며; 및/또는
    c) 백혈구 응축과 같이 상기 환자의 혈액 내 단핵 세포 성분 중 하나를 응축하여, 상기 단핵 세포 성분들 중 응축된 환자의 혈액의 상기 부분과 나머지 부분을 형성하되, 선택적으로 원심분리를 이용하며; 및/또는
    d) 선택적으로 상기 환자의 혈액의 나머지 부분을 재주입하며; 및/또는
    e) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 ALA-화합물과 접촉시키며; 및/또는
    f) 상기 ALA-화합물과 함께 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 배양하며; 및/또는
    g) 상기 환자의 혈액 또는 상기 혈액의 일부를 100nm 내지 1000nm 사이의 파장의 광에 노출시키며; 및/또는
    h) 상기 처리된 환자의 혈액 또는 처리된 환자의 혈액의 일부를 재주입함
  9. 제1항에 있어서,
    상기 ALA-화합물은 5-아미노레불린산(ALA) 이고,
    상기 체외 광분리 반출법 치료가,
    상기 ALA-화합물의 환자의 혈액 또는 혈액의 일부 내에서 0.1 내지 10mM 사이, 0.5 내지 5μM 사이 또는 1mM 농도에서, 또는 환자 몸무게의 0.1 내지 10 mg/kg, 0,5 mg/kg 내지 5 mg/kg, 또는 0,75 내지 2 mg/kg의 농도에서; 및/또는
    혈청이 없거나 5 내지 20% 또는 10% 혈청 존재 하에서 수행되고/수행되거나;
    조성물이 상기 환자의 혈액 또는 혈액의 일부와 접촉한 후 상기 파장의 광에 노출될 ‹š까지의 시간은 30분 내지 120분, 45분 내지 75분 또는 1시간이고/이거나;
    상기 광의 파장은 315nm 내지 450nm 사이이며;
    상기 광은 0.01 내지 20J/cm2 사이의 도즈량을 갖는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 ALA-화합물은 8-메톡시소랄렌(8-MOP)와 같은 소랄렌에 결합하여 사용되는 것인, 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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