KR102404012B1 - 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

소디움 플루오로시트레이트(Sodium fluorocitrate, SFC) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE}

본원은 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

지방간 질환(fatty liver disease)이란, 지방간이라고도 불리며 간세포에 지방(트리글리세리드 등)이 이상 축적되는 것에 기인하여 간장해를 초래하는 질환이다. 지방간 질환의 초기 병태는 간세포에 지방 침착만을 인정하는 단순성 지방간이며, 그 후에 지방간염(간섬유증을 포함), 또한 간경변이나 간세포암으로 병태가 진행되는 것이 알려져 있다. 일반적으로, 간장에 지방이 침착되는 원인으로서는, 알코올 섭취, 비만, 당뇨병, 지질대사 이상, 약제(스테로이드, 테트라사이클린 등), 쿠싱(Cushing) 증후군, 중독(황린 등), 고도의 영양 장해 등을 들 수 있다.

지방간 질환의 원인은 크게 알코올성과 비알코올성으로 나누어지며, 전자를 원인으로 하는 간 질환을 알코올성 지방간 질환(알코올성 간장해라고도 불린다), 후자를 원인으로 하는 간 질환을 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD, 또는 non-alcoholic steatohepatitis)이라고 부른다.

비알코올성 지방간 질환이란, 간에 유해할 정도로 인정되는 알코올 섭취 병력이 없음에도 불구하고 간 조직 검사에서 알코올성 간염의 특징적인 소견인 지방성 변화(fatty change, steatosis)와 소엽성 간염(lobular hepatitis, steatohepatitis)등을 나타내는 경우를 말한다. 간의 병리소견은 단순 지방간(Non-Alcoholic Fatty Liver, NAFL)으로부터 지방간염(Non-Alcoholic Steatohepatits, NASH), 지방간염과 동반된 섬유화증, 간경변증 등의 다양한 스펙트럼을 나타내는데, 비알코올성 지방간 질환은 이 모두를 포함하는 의미로 사용된다.

이러한 비알코올성 지방간 질환에 대한 확립된 치료법은 아직까지 없는데 이는 당뇨병, 비만, 관상동맥 질환, 앉아 있는 습관 등의 다양한 요소와 연관되어 나타나기 때문이다. 비만은 비알코올성 지방간 질환의 치료에 있어서 중요한 타겟인데, 체중 감소에 의해 간 손상의 위험 인자인 인슐린 저항성과 연관된 인자, 간으로 유입되는 지방산의 양 및 염증성 또는 섬유화성 아디포카인(adipokine)의 감소를 유도할 수 있기 때문이다.　식이 조절 및 운동에 의한 체중 감소로 의해 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT) 수치 및 간의 중성 지방 함량이 감소될 수 있으나, 괴사성 염증이 있거나 간섬유화가 있는 환자의 경우 체중 감소에 의한 개선은 거의 알려져 있지 않다.

이와 같이, 비알코올성 지방간 질환에 대해서는 충분한 치료방법이 확립되어 있지 않으며, 비알코올성 지방간 질환을 사전에 예방 또는 방지하는 것이 중요하다.

본원의 배경이 되는 기술인 한국등록특허공보 제 10-1976634 호는 네딜화 억제제를 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 그러나, 상기 등록특허는 소디움 플루오로시트레이트 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물에 대해서는 언급하고 있지 않다.

본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들에 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.

상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1측면은, 소디움 플루오로시트레이트(Sodium fluorocitrate, SFC) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 소디움 플루오로시트레이트 또는 이의 유도체의 유효량은 대상체의 체중 1 kg 에 대하여 0.001 g 내지 10 g 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 지방간 형성을 억제하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 간세포 섬유화를 억제하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환은 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 간세포 섬유화(liver fibrosis) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 질병을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 멘톨, 미네랄 오일 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 감미료, 착색제, 향미료, 염, 완충액, 산화방지제, 윤활제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 성분을 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 복강투여, 경구투여, 흡입투여, 정맥투여, 근육투여, 피하투여, 진피투여, 자궁내투여, 종양투여, 직장투여 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 투여되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 2 측면은 본원의 제 1 측면에 따른 알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는, 건강 기능 식품을 제공한다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 소디움 플루오로시트레이트(Sodium fluorocitrate, SFC) 또는 이의 유도체에 의해 지방간 축적, 지방간 염증, 간세포 사멸 및 간 조직 섬유화를 억제시킴으로써 비알코올성 지방간 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 소디움 플루오로시트레이트는 간세포에서 지방산 유입을 억제하기 때문에 고지방 식이시 간으로 유입되는 지방산을 억제함으로써 비알콜성 지방간을 예방 또는 치료할 수 있다.

다만, 본원에서 얻을 수 있는 효과는 상기된 바와 같은 효과들로 한정되지 않으며, 또 다른 효과들이 존재할 수 있다.

도 1 은 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 지방산 유입 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2 는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 몸무게 증가 제한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 지방간 제어 효능을 나타낸 사진이고, 도 3 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 지방간 제어 효능을 나타낸 그래프이다.
도 4 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 지방간 형성 억제를 나타내는 사진이고, 도 4 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직의 중성지방(TG) 농도를 측정한 그래프이다.
도 5 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직에서 스트레스 및 염증 신호전달계 활성화를 분석한 그래프이고, 도 5 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직에서 인슐린 저항성 및 신호전달계 활성화를 분석한 그래프이고, 도 5 의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 인슐린 민감도 검사 그래프이다.
도 6 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직 염증세포 마커의 발현 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 6 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직 염증 관련 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 6 의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 대식세포 침윤 감소 효과를 나타낸 간 조직 면역 염색 사진이다.
도 7 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 손상 억제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 공복 인슐린 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 공복 혈당 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (d)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 포도당 생산능력 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (e)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직 섬유화 유전자의 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver diseases, NAFLD)"는 유의한 알코올 섭취, 지방간을 초래하는 약물의 복용, 동반된 다른 원인에 의한 간질환이 없으면서 영상의학 검사나 조직검사에서 간 내 지방침착의 소견을 보이는 질환으로, 비알코올성 지방간에서 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간연관 간경변증을 포괄하는 진단명이다.

이하에서는 본원의 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, 소디움 플루오로시트레이트(Sodium fluorocitrate, SFC) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 소디움 플루오로시트레이트는 세포내에서 시트르산 합성효소에 의해 소디움 플루오로아세테이트(Sodium fluoroacetate, SFA) 및 옥살아세트산(oxaloacetate)의 결합으로 생성되는 물질로서, 하기 화학식 1 과 같은 구조를 갖는다.

[화학식 1]

.

상기 소디움 플루오로시트레이트는 간세포에서 지방산 유입을 억제하기 때문에 고지방 식이시 간으로 유입되는 지방산을 억제함으로써 비알콜성 지방간을 예방 또는 치료할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 소디움 플루오로시트레이트 또는 이의 유도체의 유효량은 대상체의 체중 1 kg 에 대하여 0.001 g 내지 10 g 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 소디움 플루오로시트레이트 또는 이의 유도체의 유효량은 대상체의 체중 1 kg 에 대하여 0.02 g 내지 0.04 g 인 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따른 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량 및 투여 횟수는 투여 형태, 환자의 연령 및 체중, 치료해야할 증상의 성질 또는 중증도에 의해 다르지만, 일반적으로 성인 한 사람에 대하여 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 0.001 g 내지 10 g 또는 0.01 g 내지 0.1 g 을 2 일에 1 회 내지 5 회 투여하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 중 소디움 플루오로시트레이트 또는 이의 유도체의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 소디움 플루오로시트레이트 또는 이의 유도체는 지방간 형성을 억제하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 소디움 플루오로시트레이트 또는 이의 유도체는 간세포 섬유화를 억제하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 소디움 플루오로시트레이트는 지방간 형성, 간염증 형성, 간세포 사멸, 간세포 섬유화를 억제함으로써 비알코올성 지방간 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환은 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 간세포 섬유화(liver fibrosis) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 질병을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 소디움 플루오로시트레이트를 함유하는 것뿐만 아니라 약리학적으로 허용되는 1 종 또는 그 이상의 담체, 다른 예방 또는 치료를 위한 유효 성분, 당뇨병의 예방 또는 치료에 유효한 임의의 다른 성분을 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 다른 유효 성분을 약리학적으로 허용되는 1 종 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 멘톨, 미네랄 오일 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 감미료, 착색제, 향미료, 염, 완충액, 산화방지제, 윤활제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 성분을 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 복강투여, 경구투여, 흡입투여, 정맥투여, 근육투여, 피하투여, 진피투여, 자궁내투여, 종양투여, 직장투여 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 투여되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따른 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 형태는 정제, 산제, 과립제, 환제, 현탁제, 유제, 침제, 캡슐제, 시럽제, 주사제, 액제, 엘럭시르제, 엑기스제, 링크제, 유동엑기스 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 형태를 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 경구투여는 시럽제, 정제, 산제, 과립제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 제조물을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 시럽제는 물, 슈크로오스, 솔비트, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 기름류 등의 희석제, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 파라옥시벤조산메틸 등의 파라옥시벤조산 유도체, 벤조산나트륨 등의 보존제, 딸기향, 페퍼민트 등의 향료 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 정제, 산제 및 과립지는 유당, 백당, 포도당, 슈크로오스, 만니톨, 소르비톨 등의 당류, 감자, 밀, 옥수수 등의 전분, 탄산칼슘, 황산칼슘, 탄산수소나트륨, 염화나트륨 등의 무기물, 결정 셀룰로오스, 감초 분말, 겐티아나 분말 등의 식물 분말 등의 부형제, 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로오스, 카르멜로오스나트륨, 카르멜로오스칼슘, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 알긴산나트륨 등의 붕해제, 스테아르산마그네슘, 탈크, 수소 첨가 식물유, 마크로골, 실리콘유 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카르멜로오스, 젤라틴, 전분 풀액 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 복강투여, 상기 정맥투여, 상기 근육투여, 상기 피하투여, 상기 진피투여, 상기 자궁내투여, 상기 종양투여, 및 상기 직장투여에 적합한 제제는 수용자의 혈액과 등장인 활성 화합물을 포함하는 멸균 수성제로 이루어지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 주사제의 경우에는 염 용액, 포도당 용액 또는 염수와 포도당 용액의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 주사용 용액을 제조하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 복강투여, 상기 정맥투여, 상기 근육투여, 상기 피하투여, 상기 진피투여, 상기 자궁내투여, 상기 종양투여, 및 상기 직장투여에 적합한 제제는 희석제, 방부제, 보존제, 향료류, 부형제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제, 가소제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 2 측면은 본원의 제 1 측면에 따른 알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는, 건강 기능 식품을 제공한다.

본원의 제 2 측면에 따른 건강 기능 식품에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

상기 건강 기능 식품은 일반적인 식품의 제조 방법으로 제조할 수 있다.

상기 제조 방법으로 성형 조립, 유동층 조립, 교반 조립, 압출 조립, 전동 조립, 기류 조립, 압축 성형 조립, 파쇄 조립, 분무 조립, 분사 조립, 조립 방법, 팬 코팅, 유동층 코팅, 건식 코팅, 코팅 방법, 퍼프드라이, 과잉 수증기법, 폼 매트 방법, 마이크로파 가열 방법, 팽화 방법 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 제조하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 건강 기능 식품에는 상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 0.01 중량% 내지 50 중량% 함유하도록 첨가되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 건강 기능 식품은 건강 식품, 건강 음료, 쥬스류, 청량 음료수, 스프류, 차류, 유산균 음료, 발효유, 빙과, 버터, 치즈, 요구르트, 가공유, 탈지 분유 등의 유제품, 햄, 소세지, 햄버거 등의 축육 제품, 어육 혼합 제품, 계란말이, 달걀 두부 등의 알제품, 쿠키, 젤리, 스낵 과자, 츄잉껌 등의 과자류, 빵류, 국수류, 김치류, 훈제품, 건물, 해산물 조림, 조미료 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 식품을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 건강 기능 식품은 분말 식품, 시트상 식품, 병조림 식품, 통조림 식품, 레토르트 식품, 캡슐 식품, 정제상 식품, 유동 식품, 드링크제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 형태인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 건강 기능 식품은 감미료, 착색료, 보존료, 증점 안정제, 산화 방지제, 발색제, 표백제, 곰팡이 방지제, 껌베이스, 고미료, 효소, 광택제, 산미료, 조미료, 유화제, 강화제, 제조용 제제, 향료, 향신료 추출물 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 첨가물을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 감미료는 아스파탐, 감초, 스테비아, 크실로오스 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 착색료는 카로티노이드나 쿠르쿠민 색소, 후라보노이드, 카라멜 색소, 시콘 색소, 스피룰리나 색소, 엽록소, 퍼플 스윗 감자(Purple sweet potato) 색소, 퍼플 스윗 산감자 색소, 들깨(Perilla) 색소, 블루베리 색소 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 보존료는 아황산나트륨, 벤조산류, 독활(aralia cordata) 추출물, 에고노기 추출물, 사철쑥 추출물, 소르빈산류, 프로피온산류 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 증점 안정제는 아라비아 검이나 크산탄 검 등의 검류, 알긴산류, 키틴, 키토산, 알로에 추출물, 구아 검, 히드록시프로필셀룰로오스, 카제인나트륨, 옥수수 전분, 카르복시메틸셀룰로오스류, 젤라틴, 한천, 덱스트린, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 미소 섬유상 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 해초 셀룰로오스, 폴리아크릴산 소다, 폴리인산나트륨, 카라기난, 효모 세포벽, 곤약 감자 추출물, 나타드코코(Nata de coco), 만난 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 산화 방지제는 비타민 C, 에틸렌디아민 사아세트산나트륨, 에틸렌디아민 사아세트산칼슘, 에리소르빈산, 오리자놀, 카테친(catechin), 퀘르세틴(quercetin), 클로브 추출물, 효소 처리 루틴, 사과 추출물, 참기름 추출물, 디부틸히드록시톨루엔, 회향 추출물, 서양고추냉이 추출물, 미나리 추출물, 차 추출물, 템페 추출물, 약모밀 추출물, 토코트리에놀, 토코페롤류, 평지 기름 추출물, 원두 커피 추출물, 해바라기 종자, 페룰산, 부틸히드록시아니솔, 블루베리잎 추출물, 프로폴리스 추출물, 고사리은행나무 추출물, 헤스페리틴, 후추 추출물, 봉선화 추출물, 갈산, 소귀나무 추출물, 유칼립투스 추출물, 로즈마리 추출물 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발색제는 아질산나트륨, 아황산나트륨, 오르토페닐페놀 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 껌베이스는 아세틸리시놀산메틸, 옻 왁스, 에스테르 검, 엘레미(elemi) 수지, 오우리큐우릴로우, 오조케라이트(Ozokerite), 오포파낙스(Opopanax) 수지, 카우리 검, 카르나우바 왁스, 구아이악(guaiac) 수지, 구타카츄, 구타한칸, 구타페르카(Guttapercha), 글리세린지방산 에스테르, 고래 왁스, 코파오바 발삼, 코팔(copal) 수지, 고무, 라이스 왁스, 사탕수수 왁스, 쉘락, 젤톤, 슈크로오스지방산 에스테르, 소르바, 소르비탄산지방산 에스테르, 탈크, 탄산칼슘, 담마(Dammar) 검, 치클(chicle), 치르테, 쯔누(tunu), 저분자 고무, 파라핀 오일, 퍼발삼, 프로필렌글리콜지방산 에스테르, 분말 펄프, 분말 벼겨, 호호바 오일, 폴리이소부틸렌, 폴리부텐, 마이크로크리스탈 왁스, 유향수(mastic), 맛사란드쵸콜 레이트, 황랍, 인산칼슘 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 고미료는 이소 알파 고미산, 카페인, 구름버섯 추출물, 키나(kina) 추출물, 황다랑어 추출물, 겐티아나 추출물, 향신료 추출물, 효소 처리 나린진, 쟈마이카 카시아 추출물, 데오브로민, 나린진, 비가끼 추출물, 약쑥 추출물, 방아풀 추출물, 아가리쿠스 버섯, 버섯 추출물, 보라페트, 메틸티오아데노신, 영지 추출물, 올리브차, 광귤 추출물, 홉 추출물, 머그워트(mugwort) 추출물 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 효소는 아밀라아제, 트립신, 린넷, 유산균 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 광택제는 옻 왁스, 목랍 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 산미료는 아디프산, 이타콘산, 시트르산류, 숙신산류, 아세트산나트륨, 타르타르산류, 이산화탄소, 락트산, 피린산, 푸마르산, 말산, 인산 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조미료는 아스파라긴, 아스파라긴산류, 글루탐산, 글루타민, 알라닌, 이소류신, 글리신, 세린, 시스틴, 티로신, 류신, 프롤린 등의 아미노산, 이노신산나트륨, 우리딜산나트륨, 구아닐산나트륨, 시티딜산나트륨, 리보뉴 클레오티드 칼슘, 리보뉴클레오티드 나트륨 등의 핵산, 시트르산, 숙신산 등의 유기 산, 염화칼륨, 염수 호수 저염 나트륨액, 조제(粗製) 해수 염화칼륨, 유청 미네랄, 인산삼칼륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨, 인산삼나트륨, 클로렐라 추출물 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유화제는 지방산 모노글리세라이드, 소르비탄 지방산 에스테르 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 강화제는 아연 염류, 비타민 C, 각종 아미노산, 5-아데닐산, 염화철, 헤스페리딘, 각종 소성 칼슘, 각종 미소성 칼슘, 디벤조일티아민, 수산화칼슘, 탄산칼슘, 티아민염산염, 듀나리에라 카로틴, 토코페롤, 니코틴산, 당근 카로틴, 팜유카로틴, 판토텐산칼슘, 비타민 A, 히드록시프롤린, 피롤린산이수소칼슘, 피롤린산 제1 철, 피롤린산 제2 철, 페리틴, 햄철, 메나퀴논, 엽산, 리보플라빈 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제조용 제제는 아세톤, 이온 교환 수지 등의 가공 조제, 무화과 나뭇잎 추출물, 볏짚 재 추출물, 카올린, 글리세린지방산 에스테르, 뽕나무 추출물, 골회, 들깨 추출물, 생강 추출물, 각종 탄닌, 파파야 추출물, 포도종자 추출물, 에탄올 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 향신료 추출물은 고추 추출물, 마늘추출물 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 건강 기능 식품은 1 일 1 회 내지 5 회로 나누어 섭취함으로써 비알코올성 지방간 질환을 예방할 수 있다. 이미 비알코올성 지방간 질환이 발병되어 있는 경우에는 상기 건강 기능 식품을 일상적으로 섭취함으로써 비알코올성 지방간 질환의 증상을 완화, 치유 등 비알코올성 지방간 질환을 치료할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] 소디움 플루오로시트레이트(Sodium fluorocitrate, SFC)의 제조 방법

플루오로시트레이트 바륨 염(Fluorocitrate barium salt, Cat. No. F9634, St. Louis, MO, USA) 100 mg 를 DW 1.2 ml 에 녹인 후, 염산(37%) 60.58 μl, 황산나트륨 51.12 mg 및 탄산나트륨 38.16 mg 을 단계적으로 넣어 혼합한 후, 원심분리기에 10,000 rpm 으로 1 분 동안 원심분리하였다. 침전물인 황산바륨을 버리고 소디움 플루오로시트레이트가 생성된 상등액을 사용하였다.

[실험예 1: SFC 의 지방산 유입 억제 효과 조사]

C57BL/6J 생쥐를 식염수, BODIPY-PA, BODIPY-PA/SFC 3 그룹으로 나누었다. 생쥐를 10 시간 절식시킨 후 각각 그룹에 따라 식염수 또는 SFC 를 20 mg/kg 로 복강 투여하였다. 한 시간 후 BODIPY-C16(50 μg)을 정맥 투여하였고, 약물 투여 2 시간 후 생쥐를 희생하고 각 조직을 분리한 후 각 조직 내에 BODIPY 형광의 강도를 조사한 결과 간 조직은 지방산이 다량 유입되는 조직이며, SFC 의 투여로 인한 지방산 유입이 가장 잘 억제 되는 조직으로 나타났다.

[실험예 1-1: 동물의 각 조직에서 지방산 유입 및 SFC 의 지방산 유입 저해 효과]

6 주령의 수컷 C57BL6/J 마우스를 일본의 SLC 에서 수입하였다. 이 동물을 아주대학교 의과대학 동물 실험실에서 우리당 3 내지 4 마리씩 분리하여 온도 22±0.5℃, 습도 55±5%에서 12 시간 밤낮의 주기로 사육하였다. 사료는 보통 식이(Research diet, D12450)를 자유식(ad libitum)으로 공급하였다. C57BL/6J 생쥐를 식염수, BODIPY-PA, BBODIPY-PA/SFC 3 그룹으로 나누고 10 시간 절식시킨 후 각각 그룹에 따라 식염수 또는 SFC 를 20 mg/kg 로 IP 주입하였다. 한 시간 후 BODIPY-C16(50 μg)을 인산완충식염수(PBS) 200 μl 에 섞어서 IV 주입하였으며, 대조군은 동량의 식염수를 IV 주입하였다. 약물 투여 2 시간 후 쥐를 희생하고 간, 근육, 지방 조직을 분리하였다. 같은 양 무게의 조직을 RIPA 용액에 넣고 갈아서 현탁 시킨 후 원심분리(13,000 g, 10 min)하여 상등액을 모았다. 단백질을 보정 한 후 동량의 샘플을 형광 분석기(여기 504 nm/방출 512 nm)로 형광을 측정 하였다.

도 1 은 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 지방산 유입 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 1 에 나타난 결과에 따르면, BODYP-PA(지방에 형광 표지가 되있음)를 혈중에 주입하고 각 조직으로 흡수를 조사한 결과 간 조직과 지방으로 주로 흡수가 되었으며, SFC 를 처리한 경우 간에서 지방산 유입이 현저히 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 간 조직은 지방산이 다량 유입되는 조직이며 SFC 의 투여로 인한 지방산 유입이 가장 잘 억제 되는 조직임을 알 수 있다.

[실험예 2: SFC 의 몸무게 제한 효과 및 지방간 생성 억제 효과 조사]

8 주령 C57BL/6J 생쥐에 15 주간 고지방식(Research diet, D12492)을 자유식으로 공급한 군과 고지방식 투여 생쥐에 이틀 마다 한번씩 SFC(10 mg/kg)를 복강 투여한 군에서 몸무게를 비교한 결과 고지방식은 정상 식이보다 몸무게가 16 g 정도 증가하였으며 고지방식에 SFC 를 함께 투여하면 고지방식 유도 몸무게 증가를 제한하는 것으로 나타났다. 고지방식 군과 고지방식과 함께 SFC 를 투여한 군에서 간과 지방의 무게를 비교한 결과이다. SFC 투여 군에서 지방조직의 무게는 크게 감소하지 않으나 간의 무게는 의미 있게 감소함을 보여주었고, 이는 SFC 에 의한 몸무게의 증가 제한 효과는 주로 간의 무게 감소가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 고지방식과 함께 SFC 를 투여한 군에서 얻어진 간의 중성지방(TG) 양을 조사한 결과 SFC 는 간의 지방간 축적을 뚜렷이 감소시켰으며, Oil-Red-O 로 염색한 결과도 SFC 의 지방간 감소현상을 확인할 수 있다.

[실험예 2-1: SFC의 몸무게 제한 효과]

8 주령의 수컷 C57BL6/J 마우스를 일본의 SLC 에서 수입하였다. 이 동물을 아주대학교 의과대학 동물 실험실에서 우리당 3 내지 4 마리씩 분리하여 온도 22±0.5℃, 습도 55±5%에서 12 시간 밤낮의 주기로 사육하였다. 8 주령의 C57BL6/J 마우스를 3 개의 군으로 나누고, 1 개의 군은 10% 지방의 정상식이(Research diet, D12450)를 하였고, 2 개의 군은 60% 지방(Research diet, D12492)을 포함하는 고지방식(high fat diet, HFD)을 섭취하도록 하였다. 실험군으로는 0.9% 생리식염수에 SFC 를 10 mg/kg 로 용해시켜 2 일에 한번씩 15 주간 복강 투여하였고, 대조군으로는 PBS 를 투여하였다. 매주 먹이 섭취량, 음수량, 몸무게를 측정하였다.

도 2 는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 몸무게 증가 제한 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2 에 나타난 결과에 따르면, 고지방식 군은 정상 식이보다 몸무게가 16 g 정도 증가하였으며 고지방식에 SFC 를 함께 투여하면 고지방식이 유도한 몸무게 증가를 제한하는 것으로 나타났다. SFC 의 투여는 C57BL/6J 생쥐에서 고지방식 유도 몸무게 증가를 제한하는 것을 확인할 수 있다.

[실험예 2-2: SFC 의 지방간 생성 억제 효과]

상기 실험예 2-1 의 C57BL/6J 생쥐를 희생하여 간 조직을 분리한 후 사진을 찍은 후, 각군에서 나온 간의 무게를 측정하였다. 간 조직내 지방 축정 양을 측정하기 위해 간 조직 100 mg 을 1 ml 의 5% NP-40 DW 에 균질화(homogenize)하였다. 샘플을 물 중탕에서 2 분 내지 3 분 동안 80℃ 내지 100℃까지 천천히 열을 가하고 간의 중성지방(tryglyceride, TG)이 녹아 나오게 하였다. 버퍼(Buffer)가 불투명해지면 상온에서 천천히 식히고 이를 2 회 내지 3 회 반복하였다. 샘플을 원심분리하여 불용성 조직을 제거하고 중성지방이 포함된 상등액을 얻었다. 상등액을 트리글리세리드 정량화 키트(Triglyceride Quantification kit)(K-622-100/Biovision)를 이용하여 간 조직의 중성지방(TG) 농도를 측정하였다.

간 조직의 형태 계측을 위하여, 상기 C57BL/6J 생쥐의 간을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 4℃에서 24 시간 고정시킨 후, 유수에 수세하고 파라핀으로 포매하여 조직을 5 μm 두께로 박절하였다. 박절한 조직을 코팅 슬라이드 위에 붙인 후, 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거하고, 계열 알코올 순(100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 에탄올(EtOH))으로 함수 과정을 거친 후, 면역 조직학적 염색을 수행하였다. 박절한 조직을 해리 헤마톡실린(Harry's hematoxylin) 염색액으로 5 분간 염색 후, 유수에 5 분간 수세하고 1% HCl 알코올 및 암모니아로 탈염색 하였다. 이후 유수에 10 분간 수세한 후, 다시 에오신 염색액으로 1 분간 대조염색하고, 함수의 역방향으로 탈수 과정을 거친 후, 봉입하여 현미경(Olympus)으로 관찰하였다.

도 3 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 지방간 제어 효능을 나타낸 사진이고, 도 3 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 지방간 제어 효능을 나타낸 그래프이다.

도 3 의 (a) 및 (b)에 나타난 결과에 따르면, SFC 의 투여는 고지방식에 의한 간의 증가를 억제 하였으나 지방 조직은 감소시키지 않았다. 간의 무게와 각 부위 지방의 무게를 비교한 결과 SFC 를 투여하면 고지방식에 의해 증가된 지방조직의 무게를 감소하지 않았으나, 고지방식에 의해 증가하는 간의 무게는 억제하였다. 이는 SFC 에 의한 몸무게의 증가 억제 효과는 간의 무게 감소가 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

[실험예 2-3: Oil Rd O staining 방법 기술]

상기 분리한 조직은 수세한 후 물기를 제거하고 동결조직 포매제인 OCT 용액(Optimal cutting temperature compound)(SAKURA, 미국)에 고정시켜 동결조직 블럭을 만들었으며 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 간 조직은 10 ㎛ 두께로 마이크로톰(microtome)으로 잘라 간 조직 절편을 슬라이드에 신속히 붙인 후 실온에서 1 시간 가량 건조 후 -70℃ 디프 프리저(deep freezer)에서 슬라이드를 보관하였다. 3 g/ℓ 의 Oil-red-O(Sigma, 미국) 파우더를 99% 아이소프로판올 용액에 넣고 실온에서 진탕하여 포화용액을 만든 후, 60℃ 오븐에 보관하며 염색 직전에 포화용액과 증류수를 6:4 의 비율로 섞은 용액을 와트먼 여과지 #2 (Whatman®, 영국)로 여과하여 사용하였다. -70℃ 디프 프리저에 보관하고 있던 슬라이드는 실험 직전 꺼내어 실온에서 1 시간 내지 2 시간 가량 건조 후, 슬라이드를 물에 수세하고 70％ 아이소프로판올 용액에 10 분간 수세하였다. 여과한 Oil-red-O 에 슬라이드를 넣고 15 분간 염색 후 70％ 아이소프로판올 용액에 넣고 3 분간 탈색하였다. 다시 슬라이드를 흐르는 물에 5 분간 수세하고 헤마톡실린 용액(hematoxylin solution)(Sigma, 미국)에 5 분간 염색하고 다시 흐르는 물에 5 분간 수세하였다. 염색 후 수용성 봉입제(Faramount Aqueous Mounting Medium)(Dako. cat. S3025, 일본)로 봉합하고 현미경으로 관찰하였다.

도 4 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 고지방식 유도 지방간 형성 억제를 나타내는 사진이고, 도 4 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직의 중성지방(TG) 농도를 측정한 그래프이다.

도 4 의 (a) 및 (b)에 나타난 결과에 따르면, 고지방식 군과 고지방식과 함께 SFC 를 투여한 군에서 얻어진 간 조직의 H&E 를 통한 형태학적 분석을 한 결과 고지방식 군의 동물은 간 조직에 지방이 증가해있고, SFC 를 처리한 군의 동물은 지방의 축적이 감소함을 확인할 수 있다. 또한 간 조직의 중성지방(TG)을 측정하고 Oil-Red O 염색을 한 결과 SFC 의 투여는 고지방식 유도 지방간 형성을 억제한다는 것을 확인할 수 있다.

[실험예 3: SFC의 고지방식 유도 지방간염 제어 효능 측정]

고지방식과 함께 SFC 를 투여한 군의 간 조직에서 고지방식 군보다 대식세포 수가 감소하였고 염증 신호전달계인 P-JNK 및 P-NF-κB 의 양이 감소하였다. 특히, 염증 관련 유전자(TNF-α, IL-1β, MCP-1)의 발현을 RT-PCR 법으로 분석한 결과 SFC 의 투여 군에서 단순 고지방식 투여 군보다 염증 유전자의 발현이 감소함을 보여 SFC 의 투여는 고지방식 유도 지방간염의 발생을 저하시키는 것을 보여주었다. 이러한 염증성 사이토카인의 원인을 파악하기 위하여 대표적으로 염증성 사이토카인을 분비한다고 알려져 있는 마크로파지와 림포사이트의 침윤여부를 qRT-PCR 과 면역 염색법으로 조사하였다. 그 결과 SFC 는 염증성 세포의 침윤을 억제함을 알 수 있었다.

[실험예 3-1: 대식세포 조직 염색]

SFC 를 15 주간 투여한 후, 간 조직의 형태 계측을 위하여 마우스를 희생하여 간을 적출하고, 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 24 시간 고정시킨 후, 유수에 수세하고 파라핀으로 포매하여 조직을 5 μm 두께로 박절하였다. 박절한 조직을 코팅 슬라이드 위에 붙인 후, 자일렌으로 파라핀을 제거하고, 계열 알코올 순(100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 에탄올)으로 함수 과정을 거친 후, F4/80 항체로 면역 조직학적 염색을 시행하여 대조염색하고, 함수의 역방향으로 탈수 과정을 거친 후, 봉입하여 현미경(Olympus)으로 관찰하였다.

[실험예 3-2: 간조직내 염증성 세포침윤 확인]

SFC 를 15 주간 투여한 후, 간 조직의 염증성 세포의 침윤을 계측하기 위하여 마우스를 희생하여 간을 적출하고, RNA 트리졸을 이용하여 RNA 를 추출하여 정량하였다. 2 μg 의 RNA 를 1,000U AMV 역전사 효소 0.5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, 랜덤 9 mer 1 μl, RNase 억제제 0.5μl, MgCl2 4 μl, 10X RT 버퍼 2 μl 와 혼합하여, 30℃에서 10 분, 42℃에서 30 분, 99℃에서 5 분 동안 역전사 반응을 시켜 cDNA 를 합성하였다. 이렇게 얻어진 cDNA 로 하기 표 1 의 염증성 세포(대식세포(macrophage), CD4 T-cell, 호중구(Neutrophils)) 특이적인 프라이머와 다카라 qPCR 키트(cybergreen)를 이용하여 qPCR 을 수행하였다.

qPCR 에 사용한 프라이머 서열

유전자	포워드(5'-3')	리버스 (5'-3')
CD68	AGGGACACTTCGGGCCATGT	GGGTGATGCAGAAGGCGATG
F4/80	CCCGTGTTGTTGGTGGCACT	GCTTTGGCTGGATGTGCTGG
L3T4 (CD4)	AGGAAGTGAACCTGGTGGTG	CTCCTGCTTCAGGGTCAGTC
NE (neutrophil)	AGGTGGTCATTATGGCTTCG	ATTGTACCCAGATGCCTTCG
RPL32	AAGCGAAACTGGCGGAAACC	CCCATAACCGATGTTGGGCA

실험예 3-3: 염증 신호전달계 활성화 조사]

간조직 일부 100 mg 을 100 ul 단백질 추출 RIPA 액(프로테아제 억제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Roche, Indianapolis, IN, 미국), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% 오소바나데이트 나트륨(sodium orthovanadate), 1% 트리톤 X-100, 0.5% 디옥시콜산(deoxycholate), 0.1% SDS)을 사용하여 추출하였다. 브래드퍼드 정량법(Bradford assay)으로 단백질 농도를 정량 후 단백질은 10% 내지 15% SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)로 전개하고 플루오르화 폴리비닐리덴(Polyvinylidenefluoride, PVDF) 멤브레인에 전사하였다. 5% 탈지유(skim milk)가 들어 있는 TBS(Tris-buffered saline) 용액으로 상온에서 1 시간 동안 차단(blocking)하였다. 각각의 특정 1 차 항체(specific primary antibody)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음 당근과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어 있는 2 차 항체와 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 강화된 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL) 키트(Thermo Scientific, IL, 미국)를 이용하여 밴드(band)를 검출하였으며 X-ray 박막에 노출시켜 밴드를 현상시켰다. 밴드의 강도는 이미지 분석기를 통해 정량 분석하였다.

[실험예 3-4: 염증 사이토카인 발현 조사]

SFC 를 15 주간 투여한 후, 간 조직의 형태 계측을 위하여 마우스를 희생하여 간을 적출한 후, RNA 트리졸(TRIZol)을 이용하여 RNA 를 추출하여 정량하였다. 2 μg 의 RNA 를 1,000U AMV 역전사 효소 0.5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, 랜덤 9 mer 1 μl, RNase 억제제 0.5 μl, MgCl2 4 μl, 10X RT 버퍼 2 μl 와 혼합하여, 30℃에서 10 분, 42℃에서 30 분, 99℃에서 5 분 동안 역전사 반응을 시켜 cDNA 를 합성하였다. 이렇게 얻어진 cDNA 로 하기 표 2 의 프라이머 및 다카라 qPCR 키트(cybergreen)를 이용하여 qPCR 을 수행하였다.

qPCR 에 사용한 프라이머 서열

유전자	포워드(5'-3')	리버스 (5'-3')
MCP-1	CAGCCAGATGCAGTTAACGC	CCTACTCATTGGGATCATCTTG
IL-1	TCTCGCAGCAGCACATCAACA	CCTGGAAGGTCCACGGGAAA
TNF-α	AGCCCCCAGTCTGTATCCTT	GGTCACTGTCCCAGCATCTT
IL-6	CCATCCAGTTGCCTTCTTGGG	GCCGTGGTTGTCACCAGCAT
RPL32	AAGCGAAACTGGCGGAAACC	CCCATAACCGATGTTGGGCA

도 5 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직에서 스트레스 및 염증 신호전달계 활성화를 분석한 그래프이고, 도 5 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직에서 인슐린 저항성 및 신호전달계 활성화를 분석한 그래프이고, 도 5 의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 인슐린 민감도 검사 그래프이다.

도 5 의 (a) 내지 (c)에 나타난 결과에 따르면, SFC 의 처리는 고지방식에 의해 증가된 P-JNK 및 P-NFkB의 단백질 수준을 낮추고 인슐린에 의한 P-AKT 와 p-GSK3b 분자 단백질의 수준을 높여주는 것으로 확인할 수 있다. 또한 인슐린 민감도를 나타내는 인슐린 민감도 검사(insulin tolerance test, ITT)을 수행한 결과 SFC 는 인슐린 저항성을 회복시킴을 알 수 있다.

[실험예 4: SFC 의 고지방식 유도 간조직 손상 제어 및 간 섬유화 억제 효능 측정]

간 조직의 손상을 손쉽게 확인 할 수 있는 방법 중 하나는 혈액 중에 존재하는 알라닌 아미노 전이효소(alanine aminotransferase, ALT)를 아스파르테이트 아미노 전이효소(aspartate amino transferase, AST) 분석하는 것이다. 고지방식 군은 정상군에 비해서 ALT 및 AST 의 현저한 증가를 나타냈고, SFC 를 투여한 고지방식 군에서는 혈액에 존재하는 AST 및 ALT 가 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있다. 또한 혈당과 혈중 인슐린 양을 조사한 결과 SFC 의 투여는 혈중 포도당 농도를 낮추고 혈중 인슐린 양도 낮추었다. 고지방식으로 인해 유발된 간 손상은 간 섬유화를 유발시키는데 이때 TIMP, COL1A2, COL3A1, CTGF 유전자들의 발현이 증가된다. 그러나 SFC 를 처리한 동물의 간 조직에서는 간 섬유화 유전자들을 감소시켰다. 이는 SFC 의 투여가 고지방식으로 인한 간세포 손상 및 감 섬유화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.

[실험예 4-1: ALT 및 AST 조사]

실험예 2 가 종료된 후 시험동물을 아이소플루레인(isoflurane) 용액을 이용하여 마취하였고 심장 좌심실로부터 채혈하였다. 혈액은 3,000 rpm, 15 분간 원심분리 한 후 혈청을 회수하여 AST 와 ALT 를 측정하였다. AST, ALT 측정을 위하여 IFCC UV 방법을 이용하였고, ASAT/GOT(Roche, 독일), ALAT/GPT(Roche, 독일) 제품을 사용하여 혈청자동분석기(Hitachi7600, Hitachi, 일본)를 이용해 결과를 도출하였다.

[실험예 4-2: 공복 포도당 및 인슐린 조사]

혈중 포도당은 6 시간 공복 후 꼬리 정맥에서 간이 혈당측정기(Accucheck, Roche, 독일)를 사용하여 측정하였다. 실험예 2 가 종료된 후 시험동물을 아이소플루레인(isoflurane) 용액을 이용하여 마취하였고 심장 좌심실로부터 채혈하였다. 혈액은 3,000 rpm, 15 분간 원심분리 한 후 혈청을 회수하였고 인슐린은 마우스 인슐린 엘리사 키트(Mouse Insulin ELISA Kit)(Code No. AKRIN-011T, Shibayagi co., Ltd, 일본) 제품을 사용하여 측정하였다.

[실험예 4-3: 피르브산 내성 시험(pyruvate tolerance test, PTT)]

피르브산 내성 검사는 SFC 를 15 주간 투여한 생쥐와 대조군, 정상군 생쥐를 6 시간 금식시킨 후 피르브산(1 g/kg)을 복강내로 투여하여 수행하였다. 피르브산에 의한 혈당 증가 효과는 혈액내 피르브산을 주입 전(0 h), 주입 후 30 분, 60 분, 120 분에 꼬리 정맥에서 간이 혈당측정기(Accucheck, Roche, 독일)를 사용하여 측정하였다.

[실험예 4-4: 간 섬유화 억제 조사]

간 조직의 섬유화 측정을 위하여 간 섬유화를 나타내는 유전자들(TIMP, COL1A2, COL3A1, CTGF)를 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 즉 SFC 를 15 주간 투여한 후, 간 조직의 섬유화 계측을 위하여 마우스를 희생하여 간을 적출한 후, RNA 트리졸을 이용하여 RNA 를 추출하여 정량하였다. 2 μg 의 RNA 를 1,000U AMV 역전사 효소 0.5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, 랜덤 9 mer 1 μl, RNase 억제제 0.5 μl, MgCl2 4 μl, 10X RT 버퍼 2 μl 와 혼합하여, 30℃에서 10 분, 42℃에서 30 분, 99℃에서 5 분 동안 역전사 반응을 시켜 cDNA 를 합성하였다. 이렇게 얻어진 cDNA 로 하기 표 3 의 프라이머 및 다카라 qPCR 키트(cybergreen)를 이용하여 qPCR을 수행하였다.

qPCR 에 사용한 프라이머 서열

유전자	포워드(5'-3')	리버스 (5'-3')
TIMP	CCACAAGTCCCAGAACCGCA	ACGCCAGGGAACCAAGAAGC
COL1A2	CTGGGTGAACCTGGTCCTCT	ACCAGGGGCACCATTAACTC
COL3A1	GTCCAAAAAGGGTGAAGTCGGT	CAGCTCCACCTCTAGCACCA
CTGF	CTTTCTGGCTGCACCAGTGT	GGCAGAGTGGTGGTTCTGTG
RPL32	AAGCGAAACTGGCGGAAACC	CCCATAACCGATGTTGGGCA

도 6 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직 염증세포 마커의 발현 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 6 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직 염증 관련 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 6 의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 대식세포 침윤 감소 효과를 나타낸 간 조직 면역 염색 사진이다.

도 6 의 (a) 내지 (c)에 나타난 결과에 따르면, SFC 의 투여는 고지방식 유도 증가된 지방간염의 유전자의 발현을 저하시켰다. 이러한 염증성 사이토카인의 원인을 파악하기 위하여 대표적으로 염증성 사이토카인을 분비한다고 알려져 있는 마크로파지 침윤여부를 qRT-PCR 과 면역 염색법으로 조사하였다. 그 결과 15 주간 고지방식을 한 간 조직에서 대식세포 같은 염증세포의 침윤이 증가됨을 확인하였고, SFC 를 처리한 군은 염증세포의 마커인 L3T4, F4/80, CD68 의 발현을 유의적으로 감소됨을 확인하였다. F4/80 으로 간 조직을 염색해본 결과 고지방식 군 생쥐의 간에서는 유의적으로 대식세포의 침윤이 증가 되었고, SFC 처리한 군 생쥐의 간은 세포의 침윤이 유의적으로 감소되었다. 이를 통해 SFC 의 처리는 고지방식 지방 간염을 억제한다는 것을 알 수 있다.

[실험예 5: SFC의 고지방식 유도 인슐린 저항성 개선 효과]

간 조직에서 인슐린은 포도당 신생성을 조절하는 중요한 기능을 한다. 그러므로 SFC 가 고지방에 의해 유도된 인슐린 저항성을 회복시키는지 인슐린 민감도 검사 (insulin tolerance test, ITT), 인슐린 신호체계 등을 조사하였다. SFC 를 처리한 고지방식 군에서 인슐린 신호전달계를 분석한 결과 SFC 투여는 간 조직에서 고지방식 유도 인슐린 신호전달계의 저하를 회복시키는 것을 확인할 수 있다. 또한 ITT 조사 결과 SFC 의 투여는 인슐린에 의한 혈당감소 효과를 뚜렷이 개선시킬 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 5-1: 인슐린 민감도 검사(insulin tolerance test, ITT)]

인슐린 민감도 검사는 SFC 를 15 주간 투여한 생쥐와 대조군, 정상군 생쥐를 6 시간 금식시킨 후 총량 0.7 U/kg 인슐린(Novolin R, Novodisk, 덴마크)를 복강내로 투여하였다. 인슐린에 의한 혈당 저하 효과는 혈액내 포도당을 인슐린 주입 전(0 h), 주입 후 30 분, 60 분에 꼬리 정맥에서 간이 혈당측정기(Accucheck, Roche, 독일)를 사용하여 측정하였다.

간 조직 100 mg을 300 ul 단백질 추출 RIPA 액(프로테아제 억제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Roche, Indianapolis, IN, 미국), 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% 오소바나데이트 나트륨(sodium orthovanadate), 1% 트리톤 X-100, 0.5% 디옥시콜산(deoxycholate), 0.1% SDS)를 사용하여 추출하였다. 브래드퍼드 정량법(Bradford assay)으로 단백질 농도를 정량 후 단백질은 10% 내지 15% SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)로 전개하고 플루오르화 폴리비닐리덴(Polyvinylidenefluoride, PVDF) 멤브레인에 전사하였다. 5% 탈지유(skim milk)가 들어 있는 TBS(Tris-buffered saline) 용액으로 상온에서 1 시간 동안 차단(blocking)하였다. 각각의 특정 1차 항체(specific primary antibody)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음 당근과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어 있는 2 차 항체와 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 강화된 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL) 키트(Thermo Scientific, IL, 미국)를 이용하여 밴드(band)를 검출하였으며 X-ray 박막에 노출시켜 밴드를 현상시켰다. 밴드의 강도는 이미지 분석기를 통해 정량 분석하였다.

도 7 의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 손상 억제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 공복 인슐린 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 공복 혈당 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (d)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 포도당 생산능력 감소 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7 의 (e)는 본원의 일 실시예에 따른 SFC 의 간 조직 섬유화 유전자의 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7 의 (a) 내지 (e)에 나타난 결과에 따르면, 15주간 고지방식을 한 생쥐의 혈액을 분석한 결과 정상 식이군에 비해서 혈중 ALT, AST, 포도당, 인슐린이 증가되어 있음을 확인하였다. SFC 를 처리한 실험군은 ALT, AST, 인슐린, 공복혈당이 유의적으로 감소함을 보였다.

또한 간 조직에서 포도당 신생성 기능을 조사하기 위해서 피르브산 내성 시험(pyruvate tolerance test, PTT) 수행한 결과 SFC 는 고지방 식이로 인해 증가하는 포도당 신생성을 억제함을 알 수 있었다. 간 손상이 심하면 간 조직의 섬유화를 유발하게 되는데 15 주 고지방식을 진행한 동물의 간 조직에서 섬유화를 나타내는 유전자들(TIMP, COL1A2, COL3A1, CTGF)를 분석한 결과 섬유화 유전자들이 현저히 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 그러나 SFC 를 처리한 군의 간 조직에서는 섬유화 유전자의 발현이 억제됨을 확인하였다. 즉 SFC 의 처리는 고지방식에 의한 간 손상 및 간 섬유화를 회복시키며 포도당 생성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 소디움 플루오로시트레이트(Sodium fluorocitrate, SFC)를 유효성분으로 포함하고, 상기 소디움 플루오로시트레이트에 의해 지방간 축적, 지방간 염증, 간세포 사멸 및 간 조직 섬유화가 억제되는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 소디움 플루오로시트레이트의 유효량은 대상체의 체중 1 kg 에 대하여 0.001 g 내지 10 g 인 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 소디움 플루오로시트레이트는 지방간 형성을 억제하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 소디움 플루오로시트레이트는 간세포 섬유화를 억제하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 비알코올성 지방간 질환은 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 간세포 섬유화(liver fibrosis) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 질병을 포함하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가 포함하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 멘톨, 미네랄 오일 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 감미료, 착색제, 향미료, 염, 완충액, 산화방지제, 윤활제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 성분을 추가 포함하는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 복강투여, 경구투여, 흡입투여, 정맥투여, 근육투여, 피하투여, 진피투여, 자궁내투여, 종양투여, 직장투여 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 투여되는 것인, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는, 건강 기능 식품.

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