KR102393416B1 - 대마 뿌리 추출물을 포함하는 항당뇨용 조성물 - Google Patents
대마 뿌리 추출물을 포함하는 항당뇨용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대마 뿌리 추출물로 이루어지거나 대마 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 대마 뿌리 추출물은 대마 종자 추출물 또는 상업적인 경구용 혈당강하제인 아카보스(Acarbose)에 비해 현저하게 우수한 α-glucosidase 효소 저해활성을 나타내므로 항당뇨 또는 혈당강화 소재로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도의 의약품, 건강기능식품으로 구현될 수 있다.
Description
본 발명은 항당뇨용 조성물 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 α-글루코시다제(α-glucosidase) 효소 활성을 저해할 수 있는 천연물 기반의 유효성분을 포함하는 항당뇨용 조성물 및 상기 유효성분이 적용된 의약품, 건강기능식품 등에 관한 것이다.
대마(Cannabis sativa L.)는 삼과(Cannabinaceae)에 속하는 한해살이 식물로 중앙아시아가 원산지이고, 온화하고 습한 기후에서 잘 자라며, 국내에는 기원전 1세기 무렵부터 재배되었다고 알려져 있다. 대마의 섬유질은 옷감, 실 등을 만드는데 이용되며, 대마씨는 오일의 원료로 사용된다. 대마의 환각 성분은 주로 잎과 줄기에 함유되어 있으며, 씨에는 환각 성분이 소량 함유되어 있으나 껍질을 제거하면 건강식품으로 활용이 가능하다. 이러한 대마씨의 효능으로는 항산화, 면역력 강화, 동맥경화 예방, 정력 향상, 고혈압 개선, 변비 예방, 다이어트, 피부 미용, 고지혈증 예방, 그리고 항염 및 항암작용 등이 있다고 보고되고 있다[Smeriglio, A., Galati, E. M., Monforte, M. T., Lanuzza, F., D'Angelo, V. and Circosta, C. 2016. Polyphenolic compounds and antioxidant activity of cold-pressed seed oil from finola cultivar of Cannabis sativa L. Phytother. Res. 30, 1298-307.]. 또한, 대마씨에는 칼슘, 감마리놀렌산(Gamma Linolenic acid)이 함유되어 있어 슈퍼 푸드(Superfood)로 인식되고 있다. 잣과 비슷한 형태를 가지는 대마씨(Cannabis sativa L. seed; HS)는 다량의 필수 아미노산과 불포화 지방산과 탄수화물 함량이 적고 체내에서 생성되지 않는 비타민 B1, 2, 6, 그리고 식이 섬유가 다량 함유되어 있다고 알려져 있다. 대마씨의 함유 물질은 테트라하이드로칸나비놀(Tetrahydrocanabinol; THC)과 칸나비디올(Cannabidiol;CBD)이 대표적이다. THC는 환각 성분으로 알려져 있으며, CBD는 THC의 환각 효과를 억제한다고 보고 되고 있으며, 대마씨에는 THC 뿐만 아니라, 이를 억제하는 CBD 성분도 다량 함유되어 있다. 최근 보고에 따르면 THC의 경우 신경 보호 활성, 뇌 성장인자 유전자 발현 조절 등이 있으며, CBD는 항경련 효과, 알츠하이머, 항간질 등이 알려져 있으며 이에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다.
예를 들어, 김동희 등[김동희, 성재신, 정태을, 이규재. 2015. 대마씨 추출물이 당뇨 및 지질개선에 미치는 영향. 한국물학회, 4권, 2호, 1-6.]에는 대마씨 추출물의 혈당 감소 효과가 개시되어 있다. 또한, 윤여총 등[윤여초, 김병혁, 김중규, 이준형, 박예은, 권기석, 황학수, 이중복. 2018. 대마씨 발효 추출물의 생리 활성 및 미백 활성 검증. Journal of Life Science, 28권, 6호, 688-696.]에는 유산균으로 발효한 대마씨 추출물의 항산화, α-glucosidase 저해 활성 및 tyrosinase 저해 활성이 발효하지 않은 대마씨 추출물에 비해 현저히 증가된다는 내용이 개시되어 있다.
그러나 대마씨를 이용한 다양한 연구와 제품들이 개발되어 있지만, 현재 대마 뿌리나 대마 줄기의 생리활성 및 효능 증대에 관한 기술적 연구는 거의 이루어지지 않고 있으며, 기능성 식품에 관한 제품화 개발 또한 미미한 실정이다. 또한, 해외에서는 점차 대마의 뛰어난 약리작용에 대한 중요성이 인식되고 대마의 치료적 목적의 사용을 허용하자는 움직임이 늘고 있는 반면, 국내에서는 대마에 대한 규제가 엄격하여 대마에 대한 연구가 부족한 실정이고, 특히 의약품용 또는 건강기능식품용 대마에 대한 효능 검정 등에 관한 연구가 매우 미비한 실정이다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 대마 뿌리 추출물의 다양한 생리활성에 기초한 의약품 용도 또는 건강기능식품 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 합성 화학물질에 비해 안전성이 확보된 수많은 천연물을 대상으로 생리활성이 우수한 추출물을 개발하기 위하여 연구를 수행하였다. 그 결과, 대마 뿌리 추출물이 대마 종자 추출물 또는 상업적인 경구용 혈당강하제인 아카보스(Acarbose)에 비해 현저하게 우수한 α-glucosidase 효소 저해활성을 가지는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 대마 뿌리 추출물로 이루어지거나 대마 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 또는 혈당강하용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 대마 뿌리 추출물로 이루어지거나 대마 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 바람직하게는 약학 조성물 또는 식품 조성물의 형태를 가진다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 대마 뿌리 추출물은 대마 종자 추출물 또는 상업적인 경구용 혈당강하제인 아카보스(Acarbose)에 비해 현저하게 우수한 α-glucosidase 효소 저해활성을 나타내므로 항당뇨 또는 혈당강화 소재로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도의 의약품, 건강기능식품으로 구현될 수 있다.
도 1은 대마 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 대마 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 대마 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 대마 추출물의 SOD 유사활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 대마 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 대마 추출물의 3T3-L1 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 대마 추출물의 3T3-L1 Cell에 대한 지방세포로의 분화 억제능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 대마 추출물의 Tyrosinase 효소 저해활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 대마 추출물의 B16F10 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 대마 추출물의 B16F10 Cell에 대한 멜라닌 생성 저해활성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 대마 추출물의 RAW 264.7 Cell에 대한 NO 생성 저해활성 평가(NO assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 대마 추출물의 α-glucosidase 효소 저해활성(α-glucosidase enzyme inhibition activity) 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 대마 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 대마 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 대마 추출물의 SOD 유사활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 대마 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 대마 추출물의 3T3-L1 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 대마 추출물의 3T3-L1 Cell에 대한 지방세포로의 분화 억제능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 대마 추출물의 Tyrosinase 효소 저해활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 대마 추출물의 B16F10 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 대마 추출물의 B16F10 Cell에 대한 멜라닌 생성 저해활성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 대마 추출물의 RAW 264.7 Cell에 대한 NO 생성 저해활성 평가(NO assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 대마 추출물의 α-glucosidase 효소 저해활성(α-glucosidase enzyme inhibition activity) 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "조성물"은 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의미하며, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소 또는 완화시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 대마 뿌리 추출물로 이루어지거나 대마 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 항당뇨; 혈당강하; 당뇨병 예방, 개선 또는 치료 등과 같이 다양한 의약품 용도 또는 건강기능식품 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 대마 뿌리 추출물은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 대마 뿌리 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출 방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용하여 제조될 수 있다. 용매 추출법에 이용되는 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 물, 알코올 또는 이들 중 2종 이상의 혼합 용매에서 선택되는 것이 바람직하고, 함수 알코올인 것이 더 바람직하다. 추출 용매로 물을 사용하는 경우 물은 열수인 것이 바람직하다. 또한, 추출 용매로 알코올을 사용하는 경우 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올인 것이 바람직하고, 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 것이 더 바람직하다. 또한, 추출 용매로 함수 알코올을 사용하는 경우 알코올 함량은 55~95%(w/w)인 것이 바람직하고, 60~85%(w/w)인 것이 더 바람직하다. 추출 용매로 함수 에탄올을 사용하는 경우 대마 뿌리 추출물은 1) 대마 뿌리를 에탄올 농도가 55~95%(w/w)인 함수 에탄올로 추출하여 추출액을 얻는 단계; 2) 상기 추출액을 여과하여 잔사를 제거하고 여과된 추출액을 얻는 단계; 및 3) 상기 여과된 추출액을 농축하고 건조하여 고상의 추출물을 얻는 단계를 통해 얻어질 수 있다. 또한, 상기 1) 추출액을 얻는 단계에서 추출 용매인 함수 에탄올의 사용량은 대마 뿌리 건조 중량 100g을 기준으로 0.25~1 L인 것이 바람직하고, 함수 에탄올의 에탄올 농도는 60~85%(w/w)인 것이 바람직하고, 추출 온도는 45~75℃인 것이 바람직하고, 추출 시간은 12~48 hr인 것이 바람직하다. 한편, 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 대마 뿌리 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 대마 뿌리 추출물에는 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 다른 추출 방법을 통해 얻어진 추출물, 분획물, 정제물 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함될 수 있다. 예를 들어, 이산화탄소를 이용한 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리 또는 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리, 각종 미생물의 발효 산물에 의한 추출 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다. 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205). 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 본 발명의 초임계 추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매로 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되고, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다. 또한, 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출 효율을 증가시키게 된다. 초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸 에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 대마 뿌리 추출물에는 발효과정을 거친 추출물도 포함하는데, 예를 들어 대마 뿌리 발효 추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 대마 뿌리를 100~500 메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물용 배양액에 대마 뿌리 농도가 1~50g/L가 되도록 첨가하고 여기에 효모 균주 또는 유산균 등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 이후, 30~37℃의 배양 온도, 5~7의 pH와 같은 통상적인 미생물 배양조건으로 로 호기적 또는 혐기(anaerobic)적인 상태에서 약 5일 내지 10일간 배양한다. 이후, 숙성 및 여과를 통해 대마 뿌리 발효 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 대마 뿌리 추출물은 매우 우수한 α-글루코시다제(α-glucosidase) 효소 저해활성을 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 항당뇨 용도; 혈당강하 용도; 당뇨병 예방, 개선 또는 치료 용도의 의약품, 건강기능식품으로 구현될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 특히 당뇨병 중 α-글루코시다제(α-glucosidase) 효소 저해활성과 높은 관련성을 가진 높은 제2형 당뇨병을 예방, 개선 또는 치료하는 용도의 의약품, 건강기능식품으로 구현될 수 있다.
본 발명의 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 건강기능식품), 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서의 유효성분의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에서 유효성분인 대마 뿌리 추출물의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.1~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 대마 뿌리 추출물 외에 당뇨병 치료 효과를 갖는 다양한 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로 대마 뿌리 추출물 외에 대마 줄기 추출물을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분인 복합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 유효성분을 기준으로 할 때 0.1 내지 1000 ㎎/㎏(body weight)에서 선택될 수 있고, 1 내지 500 ㎎/㎏(body weight)에서 선택되는 것이 바람직하고, 10 내지 250 ㎎/㎏(body weight)에서 선택되는 것이 더 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물의 투여 횟수도 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물에서 유효성분인 대마 뿌리 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품(health functional food), 식이보충제(dietary supplement) 및 식품보충제(food supplement)를 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 유효성분 외에 식품학적으로 허용 가능한 담체, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 대마 추출물의 제조
제조예 1 : 대마 줄기 추출물의 제조
대마 줄기(Hemp stem)를 자연 건조시킨 후 분쇄기로 분말화하여 대마 줄기 건조 분말을 수득하였다. 이후, 대마 줄기 건조 분말 200에 에탄올 농도가 70%(w/w)인 함수 에탄올 1L를 넣고 교반한 후 60℃ 항온 수조상에서 중탕하여 24 hr 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 필터페이퍼를 이용하여 여과하고, 여과된 추출액을 감압농축기를 이용하여 농축한 후, 동결건조하여 고상의 대마 줄기 추출물을 수득하였다.
제조예 2 : 대마 뿌리 추출물의 제조
대마 뿌리(Hemp root)를 자연 건조시킨 후 분쇄기로 분말화하여 대마 뿌리 건조 분말을 수득하였다. 이후, 대마 뿌리 건조 분말 200에 에탄올 농도가 70%(w/w)인 함수 에탄올 1L를 넣고 교반한 후 60℃ 항온 수조상에서 중탕하여 24 hr 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 필터페이퍼를 이용하여 여과하고, 여과된 추출액을 감압농축기를 이용하여 농축한 후, 동결건조하여 고상의 대마 뿌리 추출물을 수득하였다.
제조예 3 : 대마 종자(또는 씨앗) 추출물의 제조
대마 종자(Hemp seed)를 자연 건조시킨 후 분쇄기로 분말화하여 대마 뿌리 건조 분말을 수득하였다. 이후, 대마 뿌리 건조 분말 200에 에탄올 농도가 70%(w/w)인 함수 에탄올 1L를 넣고 교반한 후 60℃ 항온 수조상에서 중탕하여 24 hr 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 필터페이퍼를 이용하여 여과하고, 여과된 추출액을 감압농축기를 이용하여 농축한 후, 동결건조하여 고상의 대마 뿌리 추출물을 수득하였다.
2. 대마 추출물의 항산화 활성 평가
대마 추출물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity), 총 폴리페놀 함량(Total polyphenol contents), 총 플라보노이드 함량(Total flavonoid contents), SOD 유사활성(Superoxide dismutase like activity), ABTS+ 라디칼 소거능 등과 같은 다양한 지표를 이용하여 평가하였다.
(1) DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity)
200 μM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 180 ㎕와 시료 20 ㎕를 혼합고 37℃의 온도 및 암소 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로 Vitamin C를 이용하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
도 1은 대마 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 자유라디칼 소거 작용은 활성라디칼에 전자를 공여하여 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 이용되고 있다. 천연물이 가지는 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 대표적으로 사용되는 방법이 DPPH 라디칼 소거능 실험이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 5,000㎍/㎖ 농도에서 각각 23% 및 18%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었으나, 표준품으로 사용한 100 ㎍/㎖의 Vitamin C 와 비교하였을 때 50배 높은 농도에서도 Vitamin C 보다 현저히 낮은 값을 보였는바, 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 모두 항산화 효과가 미비한 것으로 사료된다.
(2) 총 폴리페놀 함량(Total polyphenol contents)
총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법을 일부 변형하여 측정하였다. 시료 10 ㎕에 2% Na2CO3 용액 200 ㎕를 첨가하고 Folin & Ciocalteu’s phenol reagents 10 ㎕를 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 760nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 Galic acid(Sigma co., USA)를 사용하고 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.
도 2는 대마 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 폴리페놀은 분자 내에 다수의 수산화기가 있는 페놀을 지칭하며, 페놀 링 구조의 수에 따라 분류된다. 폴리페놀에 존재하는 phenolic hydroxyl(-OH)기는 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있어 폴리페놀은 항산화 효과 및 항암, 항염증 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다. 일반적으로 총 폴리페놀 함량이 증가할수록 항산화 등의 생리활성이 증가하는 경향을 가지는 것으로 보고되였다. 도 2에서 보이는 바와 같이, 대마 줄기 추출물의 총 폴리페놀 함량은 5381.78 ㎍/g이고 대마 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량은 4654.67 ㎍/g으로서, 대마 줄기 추출물이 대마 뿌리 추출물보다 높은 총 폴리페놀 함량 값을 나타내었지만 두 결과 값의 차이는 크지 않았다.
(3) 총 플라보노이드 함량(Total flavonoid contents)
총 플라보노이드 함량 측정은 Jia 등[1. Jia, Z., Tang, M. and Wu, J. 1999. The determination of flavonoid contents in mulberry and they scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem 64: 555-559.]의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 시료 20 ㎕에 증류수 80 ㎕와 5% NaNO2 6 ㎕를 첨가하고 상온에서 5분간 반응시킨 후 10% AlCl3·6H2O 12 ㎕를 첨가하고 6분간 반응시킨 후 1N NaOH 40 ㎕를 첨가하여 반응을 정지 시킨 다음 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 Rutin(Sigma co., USA)을 사용하고 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
도 3은 대마 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 플라보노이드는 폴리페놀에 속하는 성분으로 자연계에 널리 분포하고 있고 활성산소종을 효과적으로 제거하여 항산화능이 높다고 알려져 있으며 폴리페놀과 동일하게 항염증, 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 도 3에서 보이는 바와 같이, 대마 줄기 추출물의 총 폴리페놀 함량은 3461.33 ㎍/g이고 대마 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량은 2175.33 ㎍/g으로서, 총 폴리페놀 함량 결과와 동일하게 대마 줄기 추출물이 대마 뿌리 추출물보다 높은 값을 나타내었다.
(4) SOD 유사활성(Superoxide dismutase like activity)
SOD 유사활성은 Marklund의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 시료 10 ㎕에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer[50 mM tris(hydroxymethyl)amino-methane+10 mM EDTA] 130 ㎕와 7.2 mM pyrogallol 10 ㎕를 첨가하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 10 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로 Vitmin C를 이용하였다. SOD 유사활성은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
도 4는 대마 추출물의 SOD 유사활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다. SOD(Superoxide dismutase)는 생체 내에서 superoxide의 소거에 관여하는 효소이며 인체 내의 superoxide를 제거함으로써 노화 억제와 더불어 산화적 장해를 방어하는 작용을 한다. SOD 유사활성 물질은 효소는 아니지만 SOD와 유사한 역할을 하여 superoxide로부터 생체를 보호한다고 보고되었다. 도 4에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 5,000 ㎍/㎖ 농도에서 각각 16% 및 28%의 SOD 유사활성을 나타내었고, 같은 농도에서 대마 뿌리 추출물이 대마 줄기 추출물보다 약 2배 정도 높은 값을 나타냈다. 다만, 표준품으로 사용한 500 ㎍/㎖의 Vitamin C 와 비교하였을 때 10배 높은 농도에서도 Vitamin C 보다 낮은 값을 보였는바, 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 모두 항산화 효과가 크지 않은 것으로 사료된다.
(5) ABTS+ 라디칼 소거능
ABTS+ 라디칼 소거능은 Re 등의 방법[1. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A. and Yang, M, Rice-Evans C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Bio. Med. 26: 1231-1237.]에 준하여 측정하였다. ABTS를 7.4 mM의 농도로 증류수에 용해한 다음 여기에 2.6 mM potassium persulfate를 1:1의 부피비로 혼합하고 실온의 암소 조건에서 24 hr 동안 반응시켰다. 혼합한 ABTS용액을 PBS용액으로 희석하여 732 nm에서 0.7(±0.02)가 되도록 조정하였다. 이후, ABTS 용액 180 ㎕와 시료 20㎕를 혼합하고 5분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로 Vitmin C를 이용하였다. ABTS+ 라디칼 소거능은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
도 5는 대마 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. ABTS+ 라디칼 소거능 실험은 DPPH 라디칼 소거능 실험과 함께 대표적인 항산화 활성 측정 방법 중 하나로 알려져 있다. 도 5에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 2,500 ㎍/㎖ 농도에서 각각 86% 및 79%의 ABTS+ 라디칼 소거능을 나타내었고, 대마 줄기 추출물이 대마 뿌리 추출물보다 다소 높은 결과를 나타내었다. 다만, 표준품으로 사용한 Vitamin C와 동일한 농도인 50 ㎍/㎖에서 비교하였을 때 대마 줄기 추출물과 대마 뿌리 추출물 모두 현저히 낮은 ABTS+ 라디칼 소거능 값을 나타내고 있으므로 DPPH 라디칼 소거능 결과와 동일하게 항산화 효능은 미비한 것으로 사료된다.
3. 대마 추출물의 항비만 활성 평가
(1) 3T3-L1 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay)
96-well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 1×106 cells/well로 동일하게 분주하고 24 hr 동안 배양하였다. 이후, 기존의 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 후 시료를 농도 의존적으로(50, 200 ㎍/㎖)을 넣고 4 hr 동안 배양한 후 상등액을 제거하고 well에 형성된 formazan은 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 용해시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 음성대조군을 100%의 생존율로 간주하고 이를 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
도 6은 대마 추출물의 3T3-L1 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay) 결과를 나타낸 그래프이다. 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 여러 호르몬과 다양한 전사인자들에 의해 지방세포로 분화되면서 세포 내 지방을 축적한다. 지방분화 세포에 대한 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물의 세포독성을 측정한 결과, 도 6에서 보이는 바와 같이 모든 추출물에서 200㎍/㎖ 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다.
(2) 3T3-L1 Cell에 대한 지방세포로의 분화 억제능 측정
대마 추출물의 3T3-L1 세포에 대한 지방세포로의 분화 억제능을 알아보기 위해 1×105 cells/mL의 농도로 24 well plate에 분주(seeding)한 후 48 hr 뒤에 배지를 교환하고, 48 hr 후에 MDI(IBMX, dexametason, insulin)와 시료를 처리하였다. MDI 처리 48 hr 후에 insulin과 시료를 처리하고, 다시 48 hr 후에 시료를 처리하고, 다시 48 hr 후에 시료를 처리하고, 48 hr 후에 분화된 세포를 관찰하기 위해서 배양된 세포를 10% formalin in PBS로 10분간 실온에서 고정하고 60% isopropanol을 이용하여 1회 세척 후 건조시켰다. 이후, Oil red-o를 이용하여 15분 간 염색하고 증류수로 4번 세척한 후 증류수를 제거하자마자 바로 fat droplets를 현미경으로 관찰하였다. 현미경 관찰 후 99% isoprophyl alcohol을 넣고 180 rpm에서 5분간 녹인 뒤 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7은 대마 추출물의 3T3-L1 Cell에 대한 지방세포로의 분화 억제능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물을 50, 200ppm으로 희석하여 전지방 세포의 지방세포로의 분화 억제능을 측정한 결과 지방세포로의 분화를 유도한 MDI 처리군과 비교할 때 200 ㎍/㎖ 농도에서 대마 줄기 추출물과 대마 뿌리 추출물은 모두 약 13% 억제하는 효능을 나타내었지만 그 효능은 미비한 것으로 확인되었다.
4. 대마 추출물의 미백 활성 평가
(1) Tyrosinase 효소 저해활성(Tyrosinase enzyme inhibition activity) 평가
대마 추출물의 Tyrosinase 효소 저해활성(Tyrosinase enzyme inhibition activity) 평가를 Laskin 등의 방법[Laskin, D. L., Pendino, K. J. 1995. Macrophages and inflammatory mediators in tissue injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35: 655-677.]에 준하여 DOPA oxidase의 방법으로 진행하였다. 시료 10 ㎕에 110 Unit/㎖ Tyrosinase enzyme 20 ㎕를 첨가하고 1.5mM L-DOPA(3,4-Dihydroxyl phenylalanine) 170 ㎕를 혼합한 후 37℃에서 10분간 반응시킨 다음 450 nm에서 흡광도로 측정하였다. 대조군으로 Arbutin(Sigma co., USA)을 이용하였다. Tyrosinase 효소 저해활성은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
도 8은 대마 추출물의 Tyrosinase 효소 저해활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다. Tyrosinase는 멜라닌 합성 초기단계에 필수적으로 관여하는 산화효소이다. 멜라닌은 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 생성되지만 과잉 생성될 경우, 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 피부 트러블 문제가 생기고 색소 침착으로 인해 피부색이 어두워지며 더 나아가 피부암을 유발하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다. Tyrosinase 효소를 저해하게 되면 최종적으로 멜라닌의 과잉 생성을 막을 수 있기 때문에 피부트러블, 피부미백, 피부암 등의 문제를 예방할 수 있기 때문에 미백 효능 평가 방법 중 하나로 Tyrosinase 효소 저해활성 실험을 진행하였다. 도 8에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 5,000 ㎍/㎖ 농도에서 각각 26% 및 43%의 Tyrosinase 효소 저해활성을 보였으나, 500 ㎍/㎖ 농도에서 대조군으로 사용한 Vitmin C의 경우 37%의 저해활성을 보인 반면, 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 500 ㎍/㎖ 농도에서 각각 4% 및 16%의 저해활성을 보여 그 효능은 미비한 것으로 확인되었다.
(2) B16F10 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay)
96-well plate에 B16F10 멜라닌세포를 1×106 cells/well로 동일하게 분주하고 24 hr 동안 배양하였다. 이후, 기존의 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 후 시료를 농도 의존적으로(50, 200 ㎍/㎖)을 넣고 4 hr 동안 배양한 후 상등액을 제거하고 well에 형성된 formazan은 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 용해시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 음성대조군을 100%의 생존율로 간주하고 이를 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
도 9는 대마 추출물의 B16F10 Cell에 대한 세포 독성 평가(MTT assay) 결과를 나타낸 그래프이다. B16F10 Cell은 멜라닌 세포로서 표피 기저층에 존재하며, 세포질내의 멜라노좀에서 멜라닌이 합성된다. 멜라닌 합성은 자외선, cytokine, 성장인자 및 호르몬 등에 의해 조절되고 세포내의 다양한 기전을 통해 이루어진다. 도 9에서 보이는 바와 같이, 피부 멜라닌 세포에 대한 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물의 세포독성을 측정한 결과 50, 200 ㎍/㎖ 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다.
(3) B16F10 Cell에 대한 멜라닌 생성 저해활성 평가
B16F10 cell을 12-well plate에 0.5×105 cells/mL이 되도록 접종하고 24 hr 동안 배양한 후, 각 well에 시료와 200 nM의 melanin stimulating hormone(α-MSH)을 48 hr 동안 처리하였다. 이후, phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척한 후 lysis buffer(0.1 M sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.2 mM PMSF)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 이후, Cell scraper를 이용하여 cell을 긁어내고 원심분리하여 세포 침전물을 만든 후 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)가 첨가된 1 N NaOH 용액을 200 μL 첨가하고 80℃에서 1 hr 동안 용해한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준 직선으로로부터 구하고, 실험군의 멜라닌 양을 정상군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다. 또한, 양성대조군으로는 arbutin(100 μg/mL)을 사용하였다.
도 10은 대마 추출물의 B16F10 Cell에 대한 멜라닌 생성 저해활성 평가 결과를 나타낸 그래프이다. 멜라닌은 자외선이나 외부자극으로부터 피부를 보호하는 긍정적인 기능을 하고 있지만 과도한 멜라닌 생성과 비정상적인 분포는 비정상적인 과색소침착의 원인이 되며 피부에 흑색종 및 색소침착을 일으켜 심할 경우 피부암의 원인이 되기도 한다. α-MSH에 의해 멜라닌 합성이 활성화된 B16F10 세포에 대해 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물이 멜라닌 생성에 미치는 억제 효과를 알아보았다. 도 10에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 약 19% 및 약 15% 정도 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었지만 그 효능은 미비한 것으로 사료된다.
5. 대마 추출물의 항염증 활성 평가
대마 추출물의 항염증 활성은 대마 추출물의 RAW 264.7 Cell에 대한 NO 생성 저해활성을 통해 평가하였다. 96-well plate에 1×106 cells/well이 되도록 분주하고 5% CO2와 37℃가 유지되는 배양기에서 24 hr 동안 배양하여 세포를 well에 부착시켰다. 이후, 그 후 기존 배지를 제거하고, 시료를 농도 의존적으로(25, 50, 100, 200 ㎍/㎖) 처리하고 1 hr 동안 배양하고, LPS(1 ㎍/㎖)를 처리한 후 23 hr 동안 배양하였다. 배양 완료 후 상등액 100 ㎕를 취하고, 여기에 동량의 Griess 시약을 첨가하고 10분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 11은 대마 추출물의 RAW 264.7 Cell에 대한 NO 생성 저해활성 평가(NO assay) 결과를 나타낸 그래프이다. NO는 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 대한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있는바, 대마 추출물의 항염증 효능을 NO 생성 저해 활성 평가를 통해 진행하였다. 도 11에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물, 대마 뿌리 추출물 및 대마 종자 추출물은 200 ㎍/㎖의 농도에서 각각 약 54%, 약 45% 및 약 약 50% 수준으로 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났고, 대마 줄기 추출물이 가장 우수한 항염증 효능을 보였으나, 대마 종자 추출물과 큰 차이를 보이지 않았다.
6. 대마 추출물의 항당뇨 활성 평가
대마 추출물의 α-glucosidase 효소 저해활성(α-glucosidase enzyme inhibition activity)을 Choe 등의 방법에 따라 측정하고 대마 추출물의 항당뇨 활성을 평가하였다. 시료 25 ㎕에 2.5 mM ρNPG(ρ-nitrophenol glucoside) 50 ㎕를 첨가하고 여기에 0.2 Unit/㎖ α-glucosidase enzyme 25 ㎕를 혼합한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 이후, 1 M NaOH 50 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로 Acarbose(Sigma co., USA)를 이용하였다. α-glucosidase 효소 저해활성은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
도 12는 대마 추출물의 α-glucosidase 효소 저해활성(α-glucosidase enzyme inhibition activity) 측정 결과를 나타낸 그래프이다. α-glucosidase는 소장점막의 미세융모막에 존재하는 효소로써 다당류의 탄수화물을 단당류로 분해하기 때문에 탄수화물의 소화와 흡수에 필수적인 효소이다. 소장내의 점막에서 α-glucosidase의 효소 활성을 저해하면 다당류의 분해를 방해하고, 소장에서 glucose의 흡수를 지연시켜 식후 혈당의 급격한 상승을 제어할 수 있다. 도 12에서 보이는 바와 같이 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 각각 59% 및 65%의 α-glucosidase 효소 저해활성을 나타내었고, 동일 처리 농도의 대마 종자 추출물과 비교하였을 때 약 10배 이상의 효능을 보였다. 또한, 표준품으로 사용한 Acarbose가 500㎍/㎖ 농도에서 36%의 α-glucosidase 효소 저해활성을 나타낸 것과 비교하였을 때에도 대마 줄기 추출물 및 대마 뿌리 추출물은 낮은 처리 농도에서도 현저하게 높은 저해활성 값을 나타내고 있는바, 항당뇨 효능이 매우 우수한 것으로 사료된다.
7. 대마 뿌리 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제조
하기의 약학 조성물 제조에서 대마 뿌리 추출물은 상기의 제조예 2에서 수득한 것이다.
<7-1> 산제의 제조
대마 뿌리 추출물 20 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<7-2> 정제의 제조
대마 뿌리 추출물 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<7-3> 캡슐제의 제조
대마 뿌리 추출물 10 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
유 당 15 ㎎
스테아린산 마그네슘 0.2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<7-4> 환의 제조
대마 뿌리 추출물 10 ㎎
유당 150 ㎎
글리세린 100 ㎎
자일리톨 50 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<7-5> 과립의 제조
대마 뿌리 추출물 15 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<7-6> 주사제의 제조
대마 뿌리 추출물 10 ㎎
소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎
메틸파라벤 0.8 ㎎
프로필파라벤 0.1 ㎎
주사용 멸균증류수 적량
상기의 성분을 혼합한 후, 이중 2㎖를 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
8. 대마 뿌리 추출물을 포함하는 식품 조성물의 제조
하기의 식품 조성물 제조에서 대마 뿌리 추출물은 상기의 제조예 2에서 수득한 것이다.
<8-1> 밀가루 식품의 제조
밀가루 100 중량부에 대마 뿌리 추출물 0.5 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<8-2> 유제품(dairy products)의 제조
우유 100 중량부에 대마 뿌리 추출물 0.5 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<8-3> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 대마 뿌리 추출물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 17 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
대마 뿌리 추출물(1 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<8-4> 건강음료의 제조
액상과당(0.5 g), 올리고당(4 g), 설탕(2 g), 식염(0.5 g), 물(77 g)과 같은 부재료와 대마 뿌리 추출물 1 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
<8-5> 야채 주스의 제조
대마 뿌리 추출물 2 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
<8-6> 과일 주스의 제조
대마 뿌리 추출물 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (9)
- 대마 뿌리 추출물로 이루어지거나 대마 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 대마 뿌리 추출물의 추출 용매는 에탄올 농도가 55~95%(w/w)인 함수 에탄올인 것을 특징으로 하는 항당뇨용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 대마 뿌리 추출물은 하기의 단계들을 통해 얻어지는 것을 특징으로 하는 항당뇨용 조성물 :
1) 대마 뿌리를 에탄올 농도가 55~95%(w/w)인 함수 에탄올로 추출하여 추출액을 얻는 단계;
2) 상기 추출액을 여과하여 잔사를 제거하고 여과된 추출액을 얻는 단계; 및
3) 상기 여과된 추출액을 농축하고 건조하여 고상의 추출물을 얻는 단계.
- 대마 뿌리 추출물로 이루어지거나 대마 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 대마 뿌리 추출물의 추출 용매는 에탄올 농도가 55~95%(w/w)인 함수 에탄올인 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 제4항에 있어서, 상기 대마 뿌리 추출물은 하기의 단계들을 통해 얻어지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물 :
1) 대마 뿌리를 에탄올 농도가 55~95%(w/w)인 함수 에탄올로 추출하여 추출액을 얻는 단계;
2) 상기 추출액을 여과하여 잔사를 제거하고 여과된 추출액을 얻는 단계; 및
3) 상기 여과된 추출액을 농축하고 건조하여 고상의 추출물을 얻는 단계.
- 대마 뿌리 추출물로 이루어지거나 대마 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 대마 뿌리 추출물의 추출 용매는 에탄올 농도가 55~95%(w/w)인 함수 에탄올인 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 상기 대마 뿌리 추출물은 하기의 단계들을 통해 얻어지는 것을 특징으로 하는 식품 조성물 :
1) 대마 뿌리를 에탄올 농도가 55~95%(w/w)인 함수 에탄올로 추출하여 추출액을 얻는 단계;
2) 상기 추출액을 여과하여 잔사를 제거하고 여과된 추출액을 얻는 단계; 및
3) 상기 여과된 추출액을 농축하고 건조하여 고상의 추출물을 얻는 단계.
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