KR102367105B1 - 신규한 miRNA smR-78 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 신규한 miRNA인 smR-78은 세포의 증식률 개선을 기반으로 중간엽 줄기세포의 기능을 강화시키는 소재 또는 조성물로 활용됨으로써 줄기세포 치료제로서의 효율을 증가시킬 수 있으며, 나아가 중간엽 줄기세포의 노화 및 증식에 대한 특이적인 지표제로서 유용하게 활용 가능하다. 뿐만 아니라, 폐암 진단의 바이오마커로 사용할 수 있어 폐암 예방 및 치료제, 또는 폐암 증식 억제제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 miRNA smR-78 및 이의 용도{Novel microRNA smR-78 and Uses thereof}
본 발명은 신규한 miRNA smR-78 및 이의 용도에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 조혈모세포, 지방, 골수, 제대혈 등에서 분리 가능한 성체줄기세포이며, 이는 자가 재생능력, 조골, 연골, 지방세포 등으로 분화할 수 있는 것으로 보고되었다(Takeshi Katsuda et al., Proteomics, 2013). 이 중간엽 줄기세포는 배아 줄기세포와 달리 특정 조직으로만 분화할 수 있으며, 배아 줄기세포 대비 종양형성이나 면역거부반응이 상대적으로 완화될 수 있다. 또한 배아 줄기세포에 비해 윤리적인 논란에서 비교적 자유로워 현재 줄기세포 치료제로 각광을 받고 있다.
그러나 중간엽 줄기세포는 대량 증식이 어려우며, 세포 상태 유지 기간이 매우 짧아 다른 세포에 비해 빠른 시기에 노화가 진행된다. 이로 인해 줄기세포 치료제로서 한계점이 나타나고 있는 현실이다. 노화된 중간엽 줄기세포는 생물학적 기능의 감소(증식 억제, 분화능력 감소, 면역조절기능 감소) 또는 부작용을 보이며 줄기세포 치료제에 적합하지 못한 상태가 되는 문제점이 있다(Valentina Turinetto et al., Molecular Sciences, 2016). 이렇듯 중간엽 줄기세포의 기능은 노화와 함께 감소하는 것으로 알려져 있으며, 때문에 중간엽 줄기세포의 적절한 임상적 사용을 위해서는 중간엽 줄기세포의 노화 과정에 대한 충분한 이해가 필요하다고 보고 있다.(Yi Li et al., International Journal of Molecular Medicine, 2017).
한편, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)는 단백질을 암호화하지 않는 생체 내 작은 RNA 분자이며, 이는 핵에서 보통 RNA 중합효소-Ⅱ에 의해 전사되어 Drosha와 Dicer 등의 단백질 분자로부터 프로세싱 과정을 거쳐 성숙한 microRNA가 형성된다. 성숙한 microRNA는 아고너트(Argonaute)와 같은 RNA-결합 단백질과 RISC 복합체를 형성하여 표적 유전자 mRNA의 서열 내에 상보적으로 결합하여 mRNA의 분해 또는 번역을 억제하는 기능을 나타낸다. 진핵생물에서 microRNA는 세포의 발달, 분화, 증식, 세포사멸, 스트레스 반응, 발암과정 등과 같은 세포의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다(Dan Xu et al., J. Cell Biol, 2017).
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 인간 유래 중간엽 줄기세포의 노화 진행단계에서 특이적인 상향 조절 양상을 나타내는 신규한 microRNA 1종을 동정 및 특성화함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
1. 대한민국등록특허 제10-1299733호 (2013.08.28.) 2. 중국공개특허 제103285404호 (2013.09.11.)
본 발명의 주된 목적은 중간엽 줄기세포의 증식 또는 노화를 조절할 수 있는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 신규한 smR-78 miRNA를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 smR-78 miRNA를 중간엽 줄기세포의 노화 또는 증식에 대한 특이적인 지표제로서 활용하여 중간엽 줄기세포의 노화 또는 증식을 조절하는 방법 등 다양한 용도 및 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 smR-78 miRNA를 폐암 진단의 바이오마커로 사용하여 폐암 진단용 키트, 폐암 진단의 정보 제공 방법 및 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법 등 다양한 용도 및 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태로서, 서열번호 1의 염기서열로 구성된 smR-78 miRNA를 제공한다.
상기 smR-78 miRNA는 서열번호 1의 염기서열(5'-ACGGGAGCGCGCCCGGCC-3')로 구성된 것이 바람직하나, 상기 서열에 한정되지 않는다. 예컨대, 서열번호 1의 염기서열에서 1개, 2개 또는 소수의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되는 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 smR-78 miRNA는 서열번호 1의 염기서열에서 80% 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 90% 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 smR-78의 고유 서열은 인간의 17번 염색체 p.13.2(4949047-4949064)의 ENO3 유전자 암호화 지역 내 인트론 영역에 보존되어 암호화되는 것일 수 있으며, 2차 헤어핀 구조를 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-78 miRNA는 인간, 오랑우탄, 침팬지 또는 원숭이와 같은 다양한 포유류 세포에서 유래될 수 있으며, 바람직하게는 인간의 중간엽 줄기세포에서 유래된 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반 등으로부터 유래된 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다. 각 유래에서 줄기세포를 얻는 방법은 종래 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 본 발명의 실시예의 방법에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-78 miRNA는 세포주기의 조절인자로 알려진 CCNE1(Cyclin E1) 및/또는 CCND1(Cyclin D1)을 직접적인 표적으로 하여 결합함으로써, 이들 CCNE1 및/또는 CCND1의 발현을 억제하고, 이를 통해 전사 후 과정 및 단백질 수준에서 직접적으로 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-78 miRNA는 노화된 중간엽 줄기세포에서 상향 조절 또는 과발현되는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 smR-78 miRNA는 중간엽 줄기세포에서의 세포집단 배가횟수(Population Doubling Levels, PDL)의 누적이 낮은 중간엽 줄기세포와 비교하여 누적이 높은 중간엽 줄기세포에서 상대적으로 상향 조절되는 것을 확인하였다(실시예 3-1 및 도 3). 따라서 smR-78 miRNA는 중간엽 줄기세포의 노화를 촉진 또는 가속화하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-78 miRNA는 중간엽 줄기세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 smR-78 miRNA는 성장 중인 중간엽 줄기세포에서보다 증식 활성이 정지된 중간엽 줄기세포에서 발현 양상이 상향 조절되는 것을 확인하였다(실시예 3-2 및 도 4). 따라서 smR-78 miRNA는 중간엽 줄기세포에서 항증식 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-78 miRNA는 폐암 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 smR-78 miRNA는 다양한 폐암 세포주에서 하향 조절되는 발현 양상을 나타냄을 확인하였고, 폐암 세포주에 대해 농도의존적으로 증식을 억제하는 활성을 가짐을 확인하였다(실시예 6 및 7, 도 11 및 도 12).
본 발명의 다른 양태로서, 상기 smR-78 miRNA를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 당업계에서 유전자 발현을 위해 일반적으로 이용되는 어떠한 벡터도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터일 수 있다. 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 DNA일 수 있으며, 바이러스성 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노부속바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 smR-78 miRNA를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 인간을 포함한 포유류의 체세포, 줄기세포 등의 모든 세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 중간엽 줄기세포, 또는 인간의 폐 또는 폐암 세포인 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 smR-78 miRNA, 이를 포함하는 발현벡터를 포함하는 중간엽 줄기세포의 노화 촉진용 조성물 또는 증식 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 있어서, "노화 촉진"은 세포의 노화에 수반하여 생기는 생리적 변화를 더욱 가속화 또는 촉진하는 것을 의미하며, 생리적 변화의 예로는 에너지 대사 증진, 미토콘드리아 기능 증진 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 나아가, 본 발명의 중간엽 줄기세포의 노화 촉진은 중간엽 줄기세포의 분화 상태를 유도하는 것을 포함할 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 smR-78 miRNA의 과발현 효과는 중간엽 줄기세포의 노화를 촉진시킴을 확인한 바 있다(실시예 5 및 도 9).
본 발명에 있어서, "증식 억제" 또는 "항증식"은 세포의 증식이 일어나는 과정에서 증식의 과정을 억제 또는 느리게 하거나, 증식되는 효율을 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 smR-78 miRNA가 세포주기 조절인자인 CCNE1과 CCND1을 표적하여 항증식 기능을 나타낼 수 있으며, 세포 내에서 이의 과도한 발현과 축적은 세포 노화의 가속화를 촉진할 수 있음을 확인하였다(실시예 5 및 도 10).
본 발명에 있어서, 조성물은 세포의 배양배지 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려진 통상적인 배지를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 smR-78 miRNA에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 세포치료제의 형태일 수 있다. "세포치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가, 동종 또는 이종 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 따라서 본 발명은 상기 smR-78 miRNA와 중간엽 줄기세포를 포함한 줄기세포 치료제로 제공될 수 있다.
이러한 맥락에서 본 발명의 다른 양태로서, 상기 smR-78 miRNA의 존재 하에 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 노화 촉진 방법 또는 중간엽 줄기세포의 증식 억제 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 상기 smR-78 miRNA의 중간엽 줄기세포에 대한 노화 촉진·가속화 및/또는 증식 억제 활성에 기반하여, smR-78 miRNA의 존재 하에 중간엽 줄기세포를 배양함으로써 중간엽 줄기세포의 노화를 더욱 촉진 또는 가속화하거나, 또는 증식을 억제할 수 있다.
같은 맥락에서 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 smR-78 miRNA의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 중간엽 줄기세포의 노화 또는 증식 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 smR-78 miRNA는 중간엽 줄기세포의 노화 및/또는 증식 상태에 따라 발현 수준이 달라짐을 확인하였는 바, 중간엽 줄기세포의 노화 및/또는 증식에 대한 특이적인 지표제로서 유용하게 활용 가능하다. 따라서 smR-78 miRNA의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는, 당업계에 이미 잘 알려진 제제를 사용하여 해당 miRNA의 발현 수준에 따라 중간엽 줄기세포의 노화 또는 증식 상태를 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 smR-78 miRNA의 발현 억제제를 포함하는 중간엽 줄기세포의 증식 촉진용 조성물 또는 노화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 smR-78 miRNA의 발현 억제제는 smR-78의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 모든 형태의 제제를 의미하며, 구체적인 예로는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 화합물 등일 수 있다.
본 발명에서, "siRNA"는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 목적상 smR-78 miRNA에 특이적으로 결합하여 이의 발현을 억제하는 siRNA를 의미할 수 있다. siRNA는 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다.
본 발명에서, "앱타머(aptamer)"는 안정된 3차 구조를 유지하면서 표적분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 단일 가닥의 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이나 펩타이드(peptide)를 말한다. 본 발명의 목적상 smR-78 miRNA에 특이적으로 결합하여 이의 발현을 억제하는 앱타머를 의미할 수 있으며, "셀렉스(selex)"와 같이 당업계에 공지된 방법에 따라 앱타머를 합성할 수 있다.
본 발명에서, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있는 염기서열로서, antisenseRNA, antagonist mRNA 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 smR-78 miRNA의 발현을 억제하였을 때(ASO-78) 세포주기 조절인자인 CCNE1 및/또는 CCND1의 발현량이 상대적으로 증가하게 됨으로써 세포 노화의 가속화를 지연시킬 수 있었고, 증식을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 5, 도 9 및 10). 따라서, smR-78 miRNA의 발현을 억제시킬 수 있는 제제를 포함하는 조성물은 중간엽 줄기세포의 증식을 촉진시키거나, 또는 중간엽 줄기세포의 노화를 억제할 수 있다.
이러한 맥락에서, 본 발명의 다른 양태로서, 중간엽 줄기세포 배양 시 본 발명의 smR-78 miRNA의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 노화 억제 방법 또는 증식 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 상기 smR-78 miRNA의 발현을 억제시킴으로써 중간엽 줄기 세포에 대한 노화를 억제하고, 또는 증식을 촉진시킬 수 있다. 이러한 활성에 기반하여, 중간엽 줄기세포를 배양시 smR-78 miRNA의 발현 억제제 등을 투여하는 방식으로 중간엽 줄기세포의 노화를 억제하거나, 또는 증식을 촉진할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 smR-78 miRNA, 이를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 다양함 폐암 세포주에서 smR-78 miRNA이 정상 세포 대비 하향조절(저발현)됨을 확인하였고, smR-78 miRNA의 농도의존적으로 폐암 세포의 증식활성이 억제됨을 확인하였다(실시예 6 및 7, 도 11 및 도 12). 이러한 결과는, smR-78 miRNA를 폐암 예방 또는 치료제, 또는 폐암 증식 억제제의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.
본 발명에 따른 조성물은 smR-78 miRNA에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 1000 ㎎/㎏이고, 구체적으로 0.001 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 smR-78 miRNA를 포함하는 벡터의 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유하고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유하며, smR-78 miRNA를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 103~1012IU(10 내지 1010PFU)를 함유하고, 보다 구체적으로 105 내지 1010IU를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 smR-78 miRNA를 포함하는 세포의 경우, 구체적으로 103 내지 108개를 함유하고, 보다 구체적으로 104 내지 107개를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 smR-78 miRNA를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 구체적으로 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏,재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010입자(106 내지 108IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
상기 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, smR-78 miRNA의 검출을 위한 프라이머쌍, 프로브 또는 항체를 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, miRNA의 검출인자로는 프라이머, 프로브 또는 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서,
1) 피검 개체의 분리된 중간엽 줄기세포에서 본 발명의 smR-78 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 smR-78 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 선별된 개체를 폐암 위험 또는 폐암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계;를 포함하는, 폐암 진단의 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 피검 개체는 인간을 포함한 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
상기 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 smR-78 miRNA의 발현 수준의 측정은 당업계에 알려진 유전자 발현 측정 방법은 모두 사용가능하며, 바람직하게는 실시간 qRT-PCR으로 수행할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서,
1) 피검 조성물 또는 화합물을 본 발명의 smR-78 miRNA 발현 세포에 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 smR-78 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 증가하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는, 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, smR-78 miRNA의 발현 세포는 smR-78 miRNA 서열에 대한 합성물인 모방체(mimic) 또는 smR-78 miRNA를 포함하는 발현벡터를 폐암 세포에 형질전환시켜 제조된 smR-78 miRNA 과발현 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 smR-78 miRNA의 발현 수준의 측정은 당업계에 알려진 유전자 발현 측정 방법은 모두 사용가능하며, 바람직하게는 실시간 qRT-PCR으로 수행할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서,
1) 피검 조성물 또는 화합물을 본 발명의 smR-78 miRNA 발현 중간엽 줄기세포에 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 smR-78 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 감소하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 증식 촉진제 또는 노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, smR-78 miRNA의 발현 중간엽 줄기세포는 smR-78 miRNA 서열에 대한 합성물인 모방체(mimic) 또는 smR-78 miRNA를 포함하는 발현벡터를 중간엽 줄기세포에 형질전환시켜 제조된 smR-78 miRNA 과발현 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 smR-78 miRNA의 발현 수준의 측정은 당업계에 알려진 유전자 발현 측정 방법은 모두 사용가능하며, 바람직하게는 실시간 qRT-PCR으로 수행할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 miRNA인 smR-78은 세포의 증식률 개선을 기반으로 중간엽 줄기세포의 기능을 강화시키는 소재 또는 조성물로 활용됨으로써 줄기세포 치료제로서의 효율을 증가시킬 수 있으며, 나아가 중간엽 줄기세포의 노화 및 증식에 대한 특이적인 지표제로서 유용하게 활용 가능하다. 뿐만 아니라, 폐암 진단의 바이오마커로 사용할 수 있어 폐암 예방 및 치료제, 또는 폐암 증식 억제제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 유래의 노화된 중간엽 줄기세포로부터 동정된 신규 microRNA, smR-78의 고유서열 보존 지역과 2차 헤어핀 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 신규 smR-78의 Dicer 비의존적 및 Ago2 의존적 성숙 과정을 분석한 도이다.
도 3은 인간 유래의 노화된 중간엽 줄기세포에서의 신규 smR-78 고유서열의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 4는 성장인자의 결핍 조건에서 세포 증식이 일시적으로 정지된 골수, 배아줄기세포 및 핵치환 배아줄기세포에서 유래한 중간엽 줄기세포에서의 신규 smR-78 고유서열의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 5는 예상 표적 유전자 서열을 삽입한 재조합 pmirGLO 벡터를 나타낸 도이다.
도 6은 이중 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석을 통한 신규 smR-78 고유서열의 표적 유전자를 검증한 결과를 나타낸 도이다. 아래 왼쪽 그래프는 wild type의 CCNE1 유전자를, 아래 오른쪽 그래프는 mutant type의 CCNE1 유전자를 대상으로 하였다.
도 7은 이중 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석을 통한 신규 smR-78 고유서열의 표적 유전자를 검증한 결과를 나타낸 도이다. 아래 왼쪽 그래프는 wild type의 CCND1 유전자를, 아래 오른쪽 그래프는 mutant type의 CCND1 유전자를 대상으로 하였다.
도 8은 인간 유래의 중간엽 줄기세포에서의 신규 smR-78이 각 표적 유전자의 (A) mRNA 및 (B) 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 9는 신규 smR-78의 과발현 및 저발현이 유도된 핵치환 배아줄기 세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 SA β-Gal staining 분석을 통한 세포의 노화 정도를 나타낸 도이다.
도 10은 인간 유래의 노화된 중간엽 줄기세포에서 신규 smR-78 고유 서열의 역할에 대한 모식도이다.
도 11은 정상 폐 세포와 다양한 폐암 세포주 사이에서 smR-78의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 12는 A549 폐암 세포주로부터 smR-78의 항증식 효과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 세포주 및 조직 샘플의 준비 및 배양
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human Cord Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells, 이하 CB-MSCs으로 칭함), 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, 이하 BM-MSCs으로 칭함), 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(Human Embryonic Stem Cell Derived-Mesenchymal Stem Cells, 이하 ES-MSC, CHA-15으로 칭함), 인간 핵치환 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(Nuclear Transfer-Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Stem Cells, 이하 NT-ES-MSC, CHA-N4, CHA-N5으로 칭함), 인간 이배체 폐 정상 섬유아 세포(WI-38), 불멸화된 인간 이배체 폐 정상 섬유아 세포(WI-38-VA13), 인간 폐 선암종(A549), 인간 폐 선편평암 상피 세포(NCI-H596), 인간 폐 편평암 상피 세포(HCC-1588) 및 인간 자궁경부 선편평암 상피 세포(HeLa)에 해당하는 인간 유래 세포주는 미국 생물자원은행(American Type Culture Collection; ATCC), 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank; KCLB) 및 차의과학대학교(CHA university) 이동률 교수 연구실로부터 획득 및 분양하였다.
배양 방법으로서 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(CB-MSCs)는 Dulbeco's Modified Eagle's Media, DMEM 배양액(Welgene, Daegu, Korea), 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)는 α-MEM 배양액(Gibco, Grand Island, NY), 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC, CHA-15), 인간 핵치환 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(NT-ES-MSC, CHA-N4, CHA-N5)는 DMEM/F12 배양액(Gibco)에서 유지하였다. 또한 WI-38 및 WI-38-VA13 세포주는 Eagle's minimal essential medium, EMEM 배양액(Welgene)에서 유지하였으며, A549, NCI-H596, HCC-1588 세포주는 RPMI-1640 배양액(Welgene)에서 유지하였다. 상기의 대부분 인간 유래 세포주는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) (Welgene, Gibco)과 1% 페니실린(100 U/mℓ, Welgene) 및 스트렙토마이신 (100 μg/mℓ, Welgene)의 혼합 배양액으로 유지하였으며, 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC, CHA-15), 인간 핵치환 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(NT-ES-MSC, CHA-N4, CHA-N5)의 경우 1% Non-Essential Amino Acid(ㅧ100 Stock, Gibco)와 0.1% b-mercaptoethanol(ㅧ1000 Stock, Gibco)을 추가적으로 혼합하여 유지하였다. 상기의 모든 인간 유래 세포주는 5% CO2의 대기 조건과 37℃ 세포 전용 배양기에서 배양하였다.
실시예 2: smR-78의 클로닝 및 동정
2-1: 인간 중간엽 줄기세포로부터 RNA 분리
다양한 인간 유래 중간엽 줄기세포로부터 TRIzol 시약(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 전체 RNA을 분리하였다. 분리된 RNA는 75% 에탄올로 세척한 후, 0.1% DEPC로 처리된 멸균수(Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)에 재현탁하여 -80℃에서 보관하였다.
2-2: smR-78의 클로닝 및 시퀀싱/구조 확인
신규한 microRNA 고유 서열을 동정하기 위하여, 약 200 뉴클레오타이드(nt)보다 작은 RNA 단편을 mirVana RNA 분리 키트(Ambion, Foster City, CA, USA)를 사용하여 전체 RNA로부터 분리하였다. 분리된 작은 RNA는 DynaExpress miRNA Cloning Kit(BioDynamics Laboratory Inc., Tokyo, Japan)를 이용하여 벡터 내로 클로닝 하였다. 작은 RNA 단편은 15% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)에서 분리 및 정제하였다. 18-28nt 사이즈의 RNA는 알칼리인산분해효소(alkaline phosphatase)를 이용하여 탈인산화한 후, 3'-링커에 연결시켰다. 3'-링커가 연결된 산물은 5'-말단과 재원형화(re-circularization)되는 현상을 방지하기 위하여 3'-말단을 차단시켰다. 3'-말단이 차단된 산물을 15% 변성 PAGE를 이용하여 재분리한 후, 53-63nt의 산물을 절단한 다음 정제하였다. 산물은 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 산물은 TA 클로닝 벡터(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 클로닝 하였으며, 서열 내 정보는 시퀀싱(Macrogen Inc, Seoul, Korea)을 기반으로 분석하였다.
2-3: smR-78 고유 서열의 이종간 상동성 보존 확인
클로닝 및 서열화된 작은 RNA에 대한 인간 게놈에서의 정보, 특성 및 이종간 상동성 보존 유무 등은 NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 및 Ensemble genome browser의 생물 정보학 도구를 이용하여 고유 서열을 분석하였다. miRNA 고유 서열의 2차 머리핀(stem loop) 형성 유무는 RNAfold 웹 사이트 (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAfold.cgi)을 이용하여 분석하였다(도 1).
그 결과, 동정된 신규 smR-78의 고유 서열은 17번 염색체 p.13.2(4949047-4949064)의 ENO3 유전자 암호화 지역 내 인트론 영역에 보존되어 암호화되고 있다는 것과 2차 헤이핀 구조를 형성하고 있음을 확인하였다(도 1). 나아가 신규 smR-78의 고유 서열은 이종간 상동성이 보존되는 특성을 확인함으로써, 인간의 염색체 뿐만 아니라 다양한 종으로부터 보존되어 기능을 나타낼 수 있음을 확인하였다(표 1).
Homo sapiens 5'-ACGGGAGCGCGCCCGGCC-3'
Gorilla gorilla gorilla 5'-ACGGGAGCGCGCCCGGCC-3'
Chlorocebus sabaeus 5'-ACGGGAGCGCGCCCGGCC-3'
Piliocolobus tephrosceles 5'-ACGGGAGCGCGCCCGGCC-3'
Pongo abelii 5'-ACGGGAGCGCGCCCGGCC-3'
Pan troglodytes 5'-ACGGGAGCGCGCCCGGCC-3'
2-4: smR-78 고유 서열의 성숙 과정 분석
miRNA 생합성 과정에 중대한 역할을 수행하는 Dicer 유전자와 AGO2 유전자를 이들에 특이적 siRNA 서열(Genolution pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)과 Lipofectamine 3000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 침묵화를 유도한 후, miScript II RT Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)와 qRT-PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 시스템을 사용하여 제조사의 지시에 따라 miRNA 고유 서열의 발현 양상을 대조군 세포와 Dicer 유전자 침묵 세포 및 AGO2 유전자 침묵 세포 사이에서 프로파일링 하였다.
Dicer Sense 5'-UGCUUGAAGCAGCUCUGGAUU-3'
Antisense 5'-UCCAGAGCUGCUUCAAGCAUU-3'
AGO2 Sense 5'-GAAUCAUGGUCAAAGAUGAUU-3'
Antisense 5'-UCAUCUUUGACCAUGAUUCUU-3'
그 결과, Dicer 의존적 성숙 과정을 거치는 대부분의 microRNA와는 달리, 신규한 smR-78의 고유 서열은 miR-451a와 유사하게 Dicer 인자로부터 비의존적이며, Ago2 인자로부터 직접적으로 성숙되어짐을 확인하였다(도 2).
이렇듯 이종간 상동성 보존의 특성과 보편적인 microRNA 생합성 과정으로부터 성숙되어진다는 사실을 확인함으로써 microRNA에 대한 smR-78 고유 서열의 유효성을 입증하였다.
실시예 3: 인간 중간엽줄기세포에서 smR-78의 발현 양상 프로파일 분석
3-1: 핵치환 배아줄기세포와 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서의 세포집단 배가횟수(Population Doubling Levels; PDLs)의 누적에 따른 smR-78의 발현 양상 비교
인간 핵치환 배아줄기세포 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 낮은 PDL과 높은 PDL을 각각 β-Gal staining kit(Biovision, Korea)를 이용하여 제조사 지시에 따라 염색하였다. 상기 세포들의 염색 여부에 따라 세포의 분열한계에 도달한 노화된 중간엽 줄기세포를 분류하였으며, 이들 세포에서 신규 smR-78의 발현 양상을 분석하기 위하여 폴리-A-테일(Poly-A-tailed) RT-PCR 분석을 수행하였다. 각 세포로부터 RNA는 상기 실시예 2의 <2-1>에서 언급한 RNA 분리 기법을 이용하여 전체 RNA를 회수하였다. 분리된 RNA는 miScript II RT 키트(QIAGEN)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 miRNA 서열에 대한 cDNA를 합성하였다. 발현 양상에 대한 프로파일화는 QuantiTect SYBR Green PCR 키트(QIAGEN) 및 실시간 PCR 검출 시스템(qRT-PCR) (Bio-Rad)을 이용하여 분석하였으며(프라이머 서열은 하기 표 3에 나타내었음), 정량적 수치화는 2-ΔΔC(t) 방법을 이용하였다. 상기의 방법을 기반으로 PDL의 누적이 낮은 세포와 PDL의 누적이 높은 세포 사이에서 smR-78의 발현 양상을 비교 분석하였다.
Name Genbank Accession Zone Primer Sequence (5'-3')
smR-78 Novel Forward ACGGGAGCGCGCCCGGCC
Reverse miScript universal primer
RNU6B NG_034215 Forward CTGCGCAAGGATGACACG
Reverse miScript universal primer
그 결과, smR-78은 PDL의 누적이 낮은 중간엽 줄기세포와 비교하여 PDL의 누적이 높은 중간엽 줄기세포에서 상대적으로 상향 조절되는 것을 확인하였다(도 3).
3-2: 성장인자 결핍 조건 하에서의 smR-78의 발현 양상 비교
인간 골수, 배아줄기세포, 핵치환 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs, ES-MSC, NT-ES-MSC)의 각 세포에서 동일한 PDL 누적 조건으로 배양액에 10% 소태아혈청(FBS)의 첨가로 인해 성장 중인 인간 유래의 다양한 중간엽 줄기세포와 10% 소태아혈청(FBS) 부재로 성장인자의 결핍에 의한 증식 활성이 일시적으로 정지된 인간 유래의 다양한 중간엽 줄기세포로부터 신규 smR-78의 발현 양상을 분석하기 위하여 폴리-A-테일(Poly-A-tailed) RT-PCR 분석을 수행하였다. 각 세포주로부터 RNA는 상기 실시예 2의 <2-1>에서 언급한 RNA 분리 기법을 이용하여 전체 RNA를 회수하였다. 분리된 RNA는 상기 실시예 3의 <3-1>과 같은 분석법으로 smR-78의 발현 양상 분석하였으며, 정량적 수치화는 2-ΔΔC(t) 방법을 이용하였다. 상기의 방법을 기반으로 인간 유래의 다양한 중간엽 줄기세포 사이에서 smR-78의 발현 양상을 비교 분석하였다.
그 결과, 증식 활성이 일시적으로 정지된 인간 유래의 다양한 중간엽 줄기세포에서 성장 중인 중간엽 줄기세포와 비교하여 smR-78의 발현 양상이 상대적으로 상향 조절되는 것을 확인하였다(도 4). 이를 통해 신규 smR-78 고유 서열은 세포의 증식 과정에 밀접하게 관여한다는 것을 간접적으로 확인할 수 있다.
실시예 4: smR-78의 CCNE1 및 CCND1에 대한 직접적인 조절 여부 확인
4-1: smR-78의 표적 유전자 탐색
PDL 누적 횟수가 상대적으로 많은 중간엽 줄기세포와 증식이 일시적으로 정지된 중간엽 줄기세포에서 신규 smR-78의 특이적인 상향 조절에 대한 신호전달체계와 생물학적 기능을 규명하기 위하여 세포의 증식 및 노화에 관여하는 유전자를 탐색하였다. 이들 중 신규 smR-78의 표적 인식 영역(seed region)와 상보적 결합 서열을 가진 유전자를 동정하였으며, 세포주기 조절 인자로 알려진 2개의 유전자(Cyclin E1, 이하 CCNE1으로 칭함 및 Cyclin D1, 이하 CCND1으로 칭함)가 smR-78에 대한 잠재적인 후보 표적 유전자로 선발되었다.
4-2: 루시퍼레이즈 리포터 유전자 분석을 통한 smR-78의 CCNE1 및 CCND1에 대한 직접적인 표적 여부 확인
pmirGLO 벡터(Promega, Madison, WI, USA)의 다중 클로닝 부위(Multi Cloning Site, MCS)에 잠재적인 후보 표적 유전자(CCNE1 및 CCND1)의 3'-UTR 서열을 결합하여 재조합 리포터 유전자 구조물 또는 플라스미드를 제작하였다. 돌연변이 리포터 유전자 플라스미드는 Muta-Site-Directed Mutagenesis Kit(iNtRON, Seoungnam, Korea)를 사용하여 신규 smR-78의 표적 인식 서열(seed sequence)에 대한 잠재적 결합 영역을 부조화(mismatch) 서열로 돌연변이화한 형태로 제작하였다 (도 5 참조). HeLa 세포(5ㅧ104)를 24-웰 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 pmirGLO 리포터 유전자 구조물(100ng)과 각 miRNA 미믹(100 nM)을 공동-형질전환 하였다. 약 48시간 동안 공동-형질전환한 후, 파이어플라이(Fire-fly) 및 레닐라 (Renilla) 루시퍼라아제 활성은 이중 루시퍼라아제 리포터 분석 시스템 키트(Dual-Luciferase Reporter Assay System kit)(Promega, Madison, WI, USA)와 VICTOR3 분석기 (PerkinElmer Inc., Foster City, CA, USA)를 사용하여 연속적으로 측정하여 분석하였다.
그 결과, scrambled RNA(Negative control; NC)와 CCNE1을 표적하지 않는 hsa-miR-12528을 대조군으로 루시퍼레이즈 리포터 유전자 기법을 수행한 결과, smR-78을 처리한 세포에서 리포터 유전자의 발현이 상대적으로 감소하였음을 확인하였다. 반면에, 잠재적인 결합 영역을 mis-match 서열로 돌연변이화 한 mutant type에서는 리포터 유전자의 발현에 영향을 미치지 못한다는 사실을 추가로 입증함으로써 신규 smR-78 고유 서열은 CCNE1 유전자를 직접적으로 표적한다는 사실을 최종적으로 확인하였다(도 6).
같은 방법으로 CCND1에 대한 표적 여부를 확인하였을 때에도, 신규 smR-78 고유 서열은 CCND1 유전자도 직접적으로 표적함을 확인하였다(도 7). 이로써, 신규 smR-78은 세포주기 조절 인자로 알려진 CCNE1과 CCND1을 직접적으로 조절/표적하는 것을 확인하였다.
4-3: 분자적 수준에서 smR-78의 CCNE1 및 CCND1의 단백질 발현 조절 효과 확인
신규 smR-78 고유 서열에 대한 유도체[음성 대조군(Negative Control, NC), smR-78, ASO-78(smR-78 저해제), si-CCNE1(CCNE1을 표적화하는 siRNA), si-CCND1(CCND1을 표적화하는 siRNA)은 진파마 사(GenePharma Company, Shanghai, China)로부터 화학적 합성 및 제작 의뢰 하였으며(유도체에 대한 서열은 하기 표 4에 나타내었음), NT-ES-MSC(CHA-N5)를 3ㅧ105으로 6-웰 세포 배양 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 상기 유도체들을 각각 Lipofectamine 3000 시약(Invitrogen)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 48시간 동안 37℃ 및 5% CO₂세포 전용 배양기에서 세포 내 형질전환을 유도하였다.
No miRNA/siRNA Position Sequence (5' - 3')
1 Negative Control; NC Sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
Antisense ACGUGACACGUUCGGAGAATT
2 smR-78 Sense ACGGGAGCGCGCCCGGCC
Antisense CCGGGCGCGCUCCCGUUU
3 ASO-78 Sense Complementary sequence of smR-78 sense
Antisense
4 si-CCNE1 Sense GGUUCCAUUUGCCAUGGUUTT
Antisense AACCAUGGCAAAUGGAACCTT
5 si-CCND1 Sense GCAUGUUCGUGGCCUCUAATT
Antisense UUAGAGGCCACGAACAUGCTT
smR-78을 포함하는 각 유도체들(NC, smR-78, ASO-78, si-CCNE1, si-CCND1)을 형질전환을 시킨 세포로부터 표적 유전자의 mRNA 수준 발현양상을 분석하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. 각 세포로부터 RNA는 상기 실시예 2의 <2-1>에서 언급한 RNA 분리 기법을 이용하여 전체 RNA를 회수하였다. 분리된 RNA는 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 키트(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 mRNA 서열에 대한 cDNA를 합성하였다. 발현 양상에 대한 분석은 TaKaRa Taq Hot Strart Version Kit(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)와 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio, Shiga, Japan) 시스템을 사용하여 제조사의 지시에 따라 중합효소 연쇄 반응을 하였다(프라이머 서열은 하기 표 5에 나타내었음). PCR 산물을 1% 아가로스 젤 전기영동(Agarose gel electrophoresis)으로 분획화한 후, 표적 유전자(CCNE1 및 CCND1) mRNA의 발현 양상을 miRNA 유도체를 형질전환을 시킨 세포 사이에서 분석하였다.
Name Zone Primer sequence (5'-3')
CCNE1 Forward GGTATATGGCGACACAAGAA
Reverse CATCTCCTGAACAAGCTCCA
CCND1 Forward GGAGGAGAACAAACAGATCA
Reverse AGTAGGACAGGAAGTTGTTG
18S rRNA Forward TACCTACCTGGTTGATCCTG
Reverse GGGTTGGTTTTGATCTGATA
포스파타아제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail)(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 보충한 프로-프렙 (Pro-Prep) 세포 용해 완충용액(iNtRON, Seoungnam, Korea)을 사용하여 각 유도체들(NC, smR-78, ASO-78, si-CCNE1, si-CCND1)을 형질전환 시킨 세포로부터 단백질을 용해 및 추출하였다. 추출된 단백질을 도데실황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)으로 단백질을 분획화한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드(불화물) 막(polyvinylidene fluoride, PVDF, 공극 크기: 0.45 μm)(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)에 전압을 주어 이동시켰다. 단백질의 이동이 완료된 막(membrane)은 약 1 시간 동안 5% 탈지유(skim milk) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)가 첨가된 TBS-T 완충용액에서 단백질 사이의 틈을 메우는 블로킹(blocking)을 수행하였다. 이 후, 1차 항체(primary antibodies)를 1% 탈지유 첨가 TBS-T 완충용액에 1:500-1000 비율로 희석하여 막에 처리한 후 4℃에서 24시간 동안 면역블롯반응(immunoblotting)을 수행하였다. 여기서 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase) 1차 항체는 단백질 정량 분석의 표준화를 위한 내부 대조군으로 사용하였다. 다음날 1차 단백질 항체 회수와 동시에 TBS-T 완충용액으로 3회 세척한 후 적절한 2차 항체(Secondary antibodies)를 처리하여 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 2차 항체의 반응 후, TBS-T 완용액으로 3회 세척을 실시하였으며, 세척이 완료된 막은 웨스트-큐 피코 이씨엘 용액 (West-Q Pico ECL solution)(GenDEPOT, Barker, TX, USA)과 라스-4000 이미지 분석기 (LAS-4000 imager)(FUJIFILM Medical Systems, Woodbridge, CT, USA)를 이용하여 면역블롯반응에 대한 단백질 발현 정도를 검출하였다. 사용된 1차 항체 및 2차 항체는 하기 표 6에 나타내었으며, 분석 결과는 도 8에 나타내었다.
Form Antibody Company Cat. No
Primary CCND1 (M-20) Santa Cruz SC-718
Primary CCNE1 (C-19) Santa Cruz SC-198
Primary GAPDH (FL-335) Santa Cruz SC-25778
Secondary Goat anti-Rabbit IgG-HRP Santa Cruz SC-2004
그 결과, CCNE1과 CCND1 단백질 발현을 대조군과 비교하였을 때, smR-78 형질전환 세포에서 유의적으로 감소하였다(도 8). 이러한 결과는 smR-78이 CCNE1과 CCND1 유전자에 직접적으로 결합하여 전사 후 번역과정에서 이들의 단백질 합성을 억제한다는 사실을 확인하였다.
실시예 5: 신규 smR-78의 세포 증식에 미치는 영향 분석
NT-ES-MSC(CHA-N5)를 1ㅧ104으로 96-웰 세포배양 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 상기 실시예 4에서 언급한 형질전환 방법과 동일하게 100 nM 농도의 각 유도체들(NC, smR-78, ASO-78, si-CCNE1, si-CCND1)을 30일 동안 5일 간격으로 세포에 주기적인 형질 전환을 유도하였다. 이 후, 각 형질 전환이 유도된 세포에 β-Gal staining kit(Biovision)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 염색하였다.
그 결과, smR-78의 과발현은 중간엽 줄기세포의 노화를 촉진시키며 저발현은 세포 노화의 가속화를 상대적으로 지연시킬 수 있음을 확인하였다(도 9).
이와 같이, 신규 smR-78 고유 서열은 세포주기 조절인자인 CCNE1과 CCND1을 표적하여 항증식 기능을 나타낼 수 있으며, 세포 내에서 이의 과도한 발현과 축적은 세포 노화의 가속화를 촉진할 수 있음을 규명하였다(도 10).
실시예 6: 폐암 세포주에서의 smR-78의 발현 양상 프로파일 분석
WI-38의 정상 폐 세포와 WI-38-VA13의 불멸화된 정상 폐 세포 및 A549, NCI-H596, HCC-155의 폐암 세포주에서 신규 smR-78의 발현 양상을 분석하기 위하여 폴리-A-테일(Poly-A-tailed) RT-PCR 분석을 수행하였다. 각 세포주로부터 RNA는 상기 실시예 2의 <2-1>에서 언급한 RNA 분리 기법을 이용하여 전체 RNA를 회수하였다. 분리된 RNA는 상기 실시예 3의 <3-1>과 같은 분석법으로 smR-78의 발현 양상 분석하였으며, 정량적 수치화는 2-ΔΔC(t) 방법을 이용하였다. 상기의 방법을 기반으로 정상 폐 세포와 불멸화된 정상 폐 세포 및 폐암 세포 사이에서 smR-78의 발현 양상을 비교 분석하였다.
그 결과, smR-78의 발현이 노화된 중간엽 줄기세포와는 달리, 증식 활성이 반영구적인 폐암과 같은 암 세포주에서 하향 조절되는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 7: 폐암 세포주에서의 smR-78의 증식 억제 효과 확인
신규한 smR-78이 비소세포 폐암세포에서 증식을 제어하는지 확인하기 위하여 A549(3ㅧ105)를 6-웰 세포 배양 플레이트에 성장시킨 후, 다음날 각 유도체들(NC, smR-78-50nM, smR-78-100nM)을 Lipofectamine 3000 시약(Invitrogen)으로 48시간 동안 37℃ 및 5% CO₂조건의 세포 전용 배양기에서 세포 내 형질전환을 유도하였으며, 이후 현미경으로 세포의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과, 대조군을 형질전환 시킨 세포에 비해 smR-78의 과발현이 유도된 세포에서 증식이 감소한 것을 확인할 수 있으며, 또한 smR-78의 농도가 증가할수록 세포의 증식이 감소하는 것을 확인하였다(도 12).
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel microRNA smR-78 and Uses thereof <130> CDP20200358 <140> 10-2020-0087561 <141> 2020-07-15 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> smR-78 miRNA <400> 1 acgggagcgc gcccggcc 18 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dicer sense <400> 2 ugcuugaagc agcucuggau u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dicer antisense <400> 3 uccagagcug cuucaagcau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGO2 sense <400> 4 gaaucauggu caaagaugau u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGO2 antisense <400> 5 ucaucuuuga ccaugauucu u 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> smR-78 Forward Primer <400> 6 acgggagcgc gcccggcc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNU6B Forward Primer <400> 7 ctgcgcaagg atgacacg 18 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative Control; NC sense <400> 8 uucuccgaac gugucacgut t 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative Control; NC antisense <400> 9 acgugacacg uucggagaat t 21 <210> 10 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> smR-78 sense <400> 10 acgggagcgc gcccggcc 18 <210> 11 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> smR-78 antisense <400> 11 ccgggcgcgc ucccguuu 18 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CCNE1 sense <400> 12 gguuccauuu gccaugguut t 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CCNE1 antisense <400> 13 aaccauggca aauggaacct t 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CCND1 sense <400> 14 gcauguucgu ggccucuaat t 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CCND1 antisense <400> 15 uuagaggcca cgaacaugct t 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNE1 forward <400> 16 ggtatatggc gacacaagaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNE1 reverse <400> 17 catctcctga acaagctcca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 forward <400> 18 ggaggagaac aaacagatca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 reverse <400> 19 agtaggacag gaagttgttg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA forward <400> 20 tacctacctg gttgatcctg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA reverse <400> 21 gggttggttt tgatctgata 20 <210> 22 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNE1 Wild type <400> 22 accagugcgu gcucccga 18 <210> 23 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCNE1 Mutant type <400> 23 accagugcgu aaaaaaaa 18 <210> 24 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 Wild type <400> 24 ugaggaggag gcucccga 18 <210> 25 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCND1 Mutant type <400> 25 ugaggaggag aaaaaaaa 18

Claims (18)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 구성된 smR-78 miRNA.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 인간의 중간엽 줄기세포 유래인 것을 특징으로 하는 smR-78 miRNA.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 세포 유래인 것을 특징으로 하는 smR-78 miRNA.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 CCNE1(Cyclin E1), CCND1(Cyclin D1), 또는 둘 다의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 smR-78 miRNA.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 중간엽 줄기세포의 증식을 억제하거나, 또는 노화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 smR-78 miRNA.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA는 인간 폐 또는 폐암 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 smR-78 miRNA.
  7. 제1항의 smR-78 miRNA를 포함하는 발현벡터.
  8. 제7항의 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체.
  9. 제1항의 smR-78 miRNA 또는 제7항의 발현벡터를 포함하는 중간엽 줄기세포의 노화 촉진용 또는 증식 억제용 조성물.
  10. 제1항의 smR-78 miRNA 또는 제7항의 발현벡터를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항의 smR-78 miRNA의 검출을 위한 프라이머쌍, 프로브 또는 항체를 포함하는 폐암 진단용 키트.
  12. 제1항의 smR-78 miRNA의 발현 억제제를 포함하는 중간엽 줄기세포의 증식 촉진 또는 노화 억제용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 smR-78 miRNA의 발현 억제제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 miRNA 발현 억제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 중간엽 줄기세포 배양 시 제1항의 smR-78 miRNA의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 노화 억제 방법 또는 증식 촉진 방법.
  15. 제1항의 smR-78 miRNA의 존재 하에 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 노화 촉진 방법 또는 증식 억제 방법.
  16. 1) 피검 개체의 분리된 중간엽 줄기세포에서 제1항의 smR-78 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 smR-78 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 개체를 선별하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)에서 선별된 개체를 폐암 위험 또는 폐암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계;를 포함하는, 폐암 진단의 정보를 제공하는 방법.
  17. 1) 피검 조성물 또는 화합물을 제1항의 smR-78 miRNA 발현 세포에 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 smR-78 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 증가하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는, 폐암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  18. 1) 피검 조성물 또는 화합물을 제1항의 smR-78 miRNA 발현 중간엽 줄기세포에 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 smR-78 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 발현 수준이 무처리 대조군의 발현 수준에 비해 감소하는 피검 조성물 또는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 증식 촉진제 또는 노화 억제제의 스크리닝 방법.
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