KR102314026B1 - p38 MAP 키나아제 억제제로 염증성 질환의 치료 효과를 나타내는 신규 화합물 - Google Patents

p38 MAP 키나아제 억제제로 염증성 질환의 치료 효과를 나타내는 신규 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항염증 활성을 나타내는 신규 화합물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 염증전구물질 (pro-inflammatory cytokines)의 생성에 결정적인 역할을 하여 염증성 질환을 유발하는 것으로 알려진 p38 MAPK에 대하여 우수한 억제효능을 가지므로, 염증성 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

p38 MAP 키나아제 억제제로 염증성 질환의 치료 효과를 나타내는 신규 화합물 {NOVEL COMPOUNDS HAVING EFFECTS OF TREATING INFLAMMATORY DISEASE AS P38 MAP KINASE INHIBITOR}
본 발명은 항염증 활성을 나타내는 신규한 화합물에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 화합물은 우수한 p38 MAP 키나아제 억제 효능를 갖는 것으로 염증성 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
p38은 MAP 키나아제 (mitogen-activated protein kinases, MAPK) 패밀리에 속하는 세린/트레오닌 인산화 효소의 일종이다. MAPK 경로는 여러 가지 세포 외부의 자극에 의해 활성화되어 세포의 특정 기질의 인산화를 통해 세포 내 여러 가지 반응이 일어나도록 전환하는데, MAPK의 하위 종류로는 p38 외에도 JNK, ERK등이 있다. MAPK는 인슐린 (insulin), 유사분열물질 (mitogen), 성장인자 (growth factor), 면역세포의 활성화 자극 등에 의해 활성화되는 단백질 인산화 효소이며 세포 표면에 있는 수용체의 신호를 세포 안으로 전달하는 신호전달경로에서 중요한 위치를 차지한다.
p38 신호전달 체계는 신진 대사 및 세포 사멸과 같은 과정을 조절하며 상위 단계의 인산화 효소가 하위 단계의 인산화 효소에게 인산기를 전달하는 일련의 연쇄적인 인산화 과정을 거친다. p38 MAPK로는 p38-α, p38-β, p38-γ. p38-δ 등이 밝혀졌으며 삼투압 (osmotic shock), 염증 사이토카인 (inflammatory cytokines), LPS (lipopolysaccharides), 자외선 (UV), 성장인자 (GF) 등에 의해 활성화된다.
염증은 여러 가지 원인에 의해서 발생하는 것으로 알려져 있으나, 여러 연구에 의하면 다양한 스트레스 자극에 의해 MAPK가 활성화될 수 있고, 특히 p38 MAPK는 TNF-α, IL-1β, IL-6 등과 같은 염증전구물질 (pro-inflammatory cytokines)의 생성에 결정적인 역할을 하여, 염증성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다 (NATURE REVIEWS, Drug discovery (2003), Vol.2, 717-726). 이에 p38 MAPK의 억제제로서 몇몇 저분자 화합물 (small molecule)이 개발되어왔고 (한국등록특허 제10-1879481호 등), p38의 여러 가지 저분자 억제제는 낮은 농도에서 사람 단핵세포에서 IL-1 및 TNF 합성을 억제함으로써 염증 조절자 역할을 하며, 이러한 사이토카인의 억제는 염증 반응을 조절, 완화 또는 경감시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
이와 관련하여, 본 발명의 발명자들은 p38 MAPK 억제를 통해 항염증 활성을 갖는 신규한 화합물을 연구한 결과, 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1879481호
NATURE REVIEWS, Drug discovery (2003), Vol.2, 717-726
본 발명은 염증성 질환의 효과적인 치료를 위해서, p38 MAP 키나아제를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효능을 갖는 신규 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112021077889141-pat00001
상기 식에서,
R1은
Figure 112021077889141-pat00002
,
Figure 112021077889141-pat00003
,
Figure 112021077889141-pat00004
,
Figure 112021077889141-pat00005
,
Figure 112021077889141-pat00006
또는
Figure 112021077889141-pat00007
이고,
R2는 H, 할로겐, 또는 -C1-C6 이고,
R3는 H 또는 할로겐이다.
구체적으로, 본 발명의 화합물은 하기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
화합물 화학명 구조식
1 N-시클로프로필-3-(5-(4-(2,3-디하이드록시프로폭시)벤조일)피리딘-2-일)-5-플루오로-4-메틸벤자마이드
Figure 112021077889141-pat00008
2 6-클로로-N-시클로프로필-4'-(1H-인돌-3-카보닐)-[1,1'-바이페닐]-3-카복사마이드
Figure 112021077889141-pat00009
3 N-시클로프로필-3-(5-(6-(2,3-디하이드록시프로폭시)-1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-5-플루오로-4-메틸벤자마이드
Figure 112021077889141-pat00010
4 3-(5-(1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-N-시클로프로필-5-플루오로-4-메틸벤조아마이드
Figure 112021077889141-pat00011
5 3-(5-(1-벤질-1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-N-시클로프로필-5-플루오로-4-메틸벤조아마이드
Figure 112021077889141-pat00012
6 N-시클로프로필--3-(5-(1-(2,3-디하이드록시프로필)-1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-5-플루오로-4-메틸벤자마이드
Figure 112021077889141-pat00013
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 화합물은 염증전구물질 (pro-inflammatory cytokines)의 생성에 결정적인 역할을 하여 염증성 질환을 유발하는 것으로 알려진 p38 MAPK에 대하여 우수한 억제효능을 가지므로, 염증성 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 및 2는 본 발명에 따른 화합물의 염증 사이토카인 IL-1β 및 TNFα의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 3 내지 5는 본 발명에 따른 화합물의 염증 사이토카인 IL-1β, TNFα 및 IL-6의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물 (parent compound)의 바람직한 약리 활성을 유지하는 염을 의미한다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 "알킬"은 1차, 2차, 3차 또는 4차 탄소 원자를 갖는 탄화수소이며, 직쇄형, 분지형 또는 환형, 또는 이들의 조합일 수 있는 포화 지방족 기를 포함한다. 예를 들어, 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자 (즉, C1-C20 알킬), 1 내지 10개의 탄소 원자 (즉, C1-C10 알킬), 또는 1 내지 6개의 탄소 원자 (즉, C1-C6 알킬)를 가질 수 있다. 적합한 알킬기의 예로는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3), 및 옥틸 (-(CH2)7CH3)을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱이, 명세서, 실시예 및 청구항 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "알킬"은 비치환된 및 치환된 알킬 기 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "할로" 및 "할로겐"은 할로겐을 의미하고, 클로로, 플루오로, 브로모, 및 요오도를 포함한다.
용어 "Cx-y" 또는 "Cx-Cy"는 알킬, 알케닐 또는 알키닐과 같은 화학적 잔기와 함께 사용되는 경우, 사슬 내에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 기를 포함하는 것으로 여겨진다. C0알킬은 기가 말단 위치에 있는 경우에는 수소, 내부에 있는 경우에는 결합을 나타낸다. 예를 들어, C1-C20 알킬기는 사슬 내에 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유한다.
본 발명에 따른 화합물은 용이하게 입수가능한 출발 물질로부터 당업자에게 익히 공지된 아래 기재된 특정 합성 프로토콜에 대한 변형을 이용해서 제조될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[제조예]
본 발명에 따른 화합물의 합성 방법에 사용된 기기 및 시약
본 발명의 화합물 합성에 사용된 모든 시작물질과 시약들은 Aldrich, Alfa Aesar, TCI 등으로부터 구입하였으며 별도의 정제과정 없이 사용하였다. 반응에 사용된 각종 초자들은 80℃ 오븐에서 건조시킨 상태로 사용하였으며 공기 및 수분을 차단하기 위해 아르곤 가스나 질소 가스를 주입하여 반응을 진행하였다.
본 발명의 칼럼 크로마토그래피 (Flash column chromatography)는 실리카겔 60 (230-400 mesh)를 이용하여 헥세인 (Hexane), 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate), 다이클로로메테인 (Dichloromethane), 메탄올 (Methanol) 등의 용매들을 적절히 조절하여 사용하였다. 분석용 얇은막 크로마토그래피 (Thin-layer chromatography)는 0.25 mm 실리카겔 플레이트를 사용하였다.
본 발명의 1H-NMR 스펙트럼과 13C-NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 400 (400 MHz for 1H; 100 MHz for 13C) spectrometer 또는 VARIAN VNMRS 500 (500MHz for 13C) spectrometer를 이용해 분석하였다. 1H과 13C NMR 화학 시프트 값은 TMS (tetramethylsilane)를 내부 기준으로 사용하여 ppm단위로 표현되었다. NMR 신호들은 m (multiplet), s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quartet), quin (quintet), bs (broad singlet), bd (broad doublet), dd (doublet of doublets), dt (doublet of triplets), dq (doublet of quartets) 등으로 표기되었고 결합 상수는 헤르츠 (Hz) 단위로 표현되었다.
본 발명의 저해상도 질량 스펙트럼 (Low resolution mass spectra)과 고해상도 질량 스펙트럼 (High resolution mass spectra)은 VG Trio-2 GC-MS 또는 JEOL JMS-700 기기를 이용해 측정하였다.
일 실시태양에서, 본 발명의 중간체 화합물 10은 하기 반응식 1에 따라 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112021077889141-pat00014
시약 및 조건: (a) N-요오드숙신이미드, 황산, H2O, r.t., 85%; (b) 시클로프로필 아민, 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, N,N-디이소프로필에틸아민, 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트, DMF, r.t, 82%; (c) bis(pinacolato)diboron, PdCl2(dppf)2, KOAc, DMF, 90°C, 50%.
상업적으로 구입 가능한 3-플루오로-4-메틸벤조산 (화합물 7)을 출발물질로 하여 요오드화 반응을 통해 화합물 8을 합성한 후 시클로프로필 아민과의 EDC coupling을 통해 화합물 9를 합성하였다. Bis(pinacolato)diboron과의 cross coupling을 통해 주요 중간체 화합물 10을 합성하였다.
일 실시태양에서, 본 발명의 중간체 화합물 16 내지 21은 하기 반응식 2에 따라 제조될 수 있다.
[반응식 2]
Figure 112021077889141-pat00015
시약 및 조건: (a) 티오닐 클로라이드, reflux; (b) N,O-디메틸 하이드록시아민, Et3N, CH2Cl2, r.t., 62%; (c) 4-메톡시페닐 마그네슘 브로마이드, THF, 0°C, 87%; (d) BBr3, CH2Cl2, -78°C to 0°C, 79-87%; (e) (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메틸 4-메틸벤젠설포네이트, K2CO3, DMF, 70°C, 54-83%; (f) 인돌, AlCl3, CH2Cl2, 0 °C to r.t., 42%; (g) BnBr, NaH, DMF, 0 °C, 95-97%; (h) 6-메톡시인돌, AlCl3, ZnCl2, EtMgBr, CH2Cl2, r.t., 24%.
상업적으로 구입 가능한 6-브로모니코틴산 (화합물 11)과 티오닐 클로라이드를 환류하여 생성된 화합물 12를 정제과정 없이 차후 반응에 사용하였다. Weinreb amide를 만들어 메톡시페닐기를 도입한 뒤, demethylation하여 화합물 15를 수득하고 solketal을 도입하여 중간체 화합물 16을 수득하였다 ((6-브로모피리딘-3-일)(4-((2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시)페닐)메타논); 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.73 (dd, J = 2.4, 0.8 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.2, 2.5 Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 7.39 - 7.32 (m, 2H), 7.06 - 6.96 (m, 2H), 4.52 (p, J = 5.7 Hz, 1H), 4.28 (tt, J = 6.0, 5.1 Hz, 2H), 3.77 (dd, J = 8.7, 5.1 Hz, 2H), 1.48 (s, 3H), 1.42 (s, 3H).
화합물 12에 인돌을 도입하여 중간체 화합물 17을 합성하고 ((6-브로모피리딘-3-일)(1H-인돌-3-일)메타논); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.24 (s, 1H), 8.79 (d, J = 3.1 Hz, 0H), 8.27 - 8.18 (m, 2H), 7.69 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.31 - 7.24 (m, 1H), 7.26 (s, 2H), 이의 benzylation을 통해 중간체 화합물 18을 수득하였다 ((1-벤질-1H-인돌-3-일)(6-브로모피리딘-3-일)메타논); 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.81 (dd, J = 2.4, 0.8 Hz, 1H), 8.45 - 8.38 (m, 1H), 8.10 (dt, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.47 (dt, J = 8.2, 1.1 Hz, 1H), 7.36 (s, 2H), 7.42 - 7.29 (m, 5H), 7.26 (s, 1H), 7.21 - 7.12 (m, 2H), 5.38 (s, 2H).
6-메톡시인돌과 화합물 12의 결합 반응을 수행하고, 벤질기로 protection기를 도입한 뒤, demethylation하고 solketal을 도입하여 중간체 화합물 21을 수득하였다 ((1-벤질-6-((2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시)-1H-인돌-3-일)(5-브로모피리딘-2-일)메타논); 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.80 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.12 - 8.05 (m, 1H), 7.53 - 7.42 (m, 2H), 7.34 (dd, J = 7.3, 3.2 Hz, 2H), 7.15 (t, J = 9.3 Hz, 3H), 7.02 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.31 (d, J = 4.2 Hz, 3H), 4.48 (q, J = 6.0 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.4, 6.4 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 9.4, 5.4 Hz, 1H), 3.93 (ddd, J = 19.6, 8.9, 5.7 Hz, 1H), 1.46 (s, 3H), 1.41 (s, 3H).
[실시예 1]
N-시클로프로필-3-(5-(4-(2,3-디하이드록시프로폭시)벤조일)피리딘-2-일)-5-플루오로-4-메틸벤자마이드 (N-Cyclopropyl-3-(5-(4-(2,3-dihydroxypropoxy)benzoyl)pyridin-2-yl)-5-fluoro-4-methylbenzamide, 화합물 1)의 제조
Figure 112021077889141-pat00016
본 발명의 화합물 1은 하기 제조식 1에 따라 제조되었다.
[제조식 1]
Figure 112021077889141-pat00017
시약 및 조건: (a) Pd(PPh3)4, K2CO3, DMF, 90°C, 36%; (b) p-TsOH, H2O, MeOH, 50°C, 54%.
1-1. 중간체 화합물 22의 합성
중간체 화합물 10 (100.8 mg, 0.316 mmol)과 중간체 화합물 16 (82.6 mg, 0.210 mmol), K2CO3 (58.0 mg, 0.420 mmol), Pd(PPh3)4 (24.3 mg, 0.021 mmol)을 dry DMF에 녹이고 아르곤 치환한 뒤 90°C하에서 한시간 동안 교반하였다. TLC로 반응이 종결된 것을 확인한 후 실온으로 반응물의 온도를 낮추고 saturated aqueous NH4Cl solution을 이용하여 반응을 종결하였다. EtOAc와 H2O로 생성물을 유기층으로 추출한 뒤 MgSO4를 이용하여 탈수하였고, 여과한 여액을 감압증류한 다음 flash column chromatography를 이용해 정제하여 중간체 화합물 22를 합성하였다 (37.8 mg, 36%); 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.04 (dd, J = 2.3, 1.0 Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 7.88 (dt, J = 9.6, 2.8 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.60 - 7.52 (m, 2H), 7.04 (dd, J = 9.2, 2.3 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), 4.52 (q, J = 4.6, 3.3 Hz, 1H), 4.25 - 4.10 (m, 2H), 4.10 - 4.02 (m, 1H), 3.98 - 3.90 (m, 1H), 2.94 - 2.87 (m, 1H), 2.35 (d, J = 2.4 Hz, 3H), 1.42 (m, 1H), 0.92 - 0.81 (m, 2H), 0.67 - 0.58 (m, 2H).
1-2. 화합물 1의 합성
중간체 화합물 22 (37.8 mg, 0.075 mmol), p-TsOH (11.4 mg, 0.060 mmol)에 H2O 500㎕, MeOH 2 mL을 적가한 후 실온에서 교반하였다. TLC로 출발물질이 사라진 것을 확인한 다음 CH2Cl2와 H2O로 묽힌 후, 유기층을 추출하고 Na2SO4를 이용하여 탈수하였다. 여과한 여액을 감압증류한 다음 flash column chromatography를 이용해 정제하여 화합물 1을 최종적으로 수득하였다 (19 mg, 54%); 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.92 (dd, J = 2.3, 0.9 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 7.86 - 7.79 (m, 1H), 7.82 - 7.71 (m, 3H), 7.67 (dd, J = 10.4, 1.7 Hz, 1H), 7.16 - 7.05 (m, 2H), 5.02 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.70 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.16 - 4.04 (m, 1H), 4.03 - 3.93 (m, 1H), 3.85 - 3.75 (m, 1H), 3.50 - 3.40 (m, 2H), 2.88 - 2.77 (m, 1H), 2.28 (d, J = 2.3 Hz, 3H), 0.73 - 0.60 (m, 2H), 0.60 - 0.48 (m, 2H).
[실시예 2]
6-클로로-N-시클로프로필-4'-(1H-인돌-3-카보닐)-[1,1'-바이페닐]-3-카복사마이드 (6-Chloro-N-cyclopropyl-4'-(1H-indole-3-carbonyl)-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide, 화합물 2)의 제조
Figure 112021077889141-pat00018
본 발명의 화합물 2는 하기 제조식 2에 따라 제조되었다.
[제조식 2]
Figure 112021077889141-pat00019
시약 및 조건: (a) Bis(pinacolato)diboron, PdCl2(dppf)2, KOAc, DMF, 90°C, 37%; (b) 17, PdCl2(PPh3)2, K3PO4, 1,2-다이옥산, H2O, reflux, 10%; (c) 시클로프로필 아민, 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드), N,N-디이소프로필에틸아민,1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트, CH2Cl2, r.t., 12%.
2-1. 중간체 화합물 24의 합성
상업적으로 구입가능한 3-브로모-4-클로로벤조산 (화합물 23, 1.5 g, 6.3 mmol)과 bis(pinacolato)diboron (2.6 g, 10.5 mmol), KOAc (3.1 g, 31.8 mmol), PdCl2(dppf)2를 dry DMF 23 mL에 녹이고 아르곤 치환 후 90°C에서 반응을 진행하였다. TLC로 반응이 종결된 것을 확인한 후 실온으로 반응물의 온도를 감소시켰다. Saturated aqueous NH4Cl solution을 이용하여 반응을 종결하고 EtOAc와 H2O로 생성물을 유기층으로 추출한 뒤 MgSO4를 이용하여 탈수하였다. 여과한 여액을 감압증류한 다음 flash column chromatography를 이용해 정제하여 중간체 화합물 24를 수득하였다 (664 mg, 37%).
2-2. 중간체 화합물 25의 합성
중간체 화합물 17 (500 mg, 1.67 mmol) 과 중간체 화합물 24 (659 mg, 2.33 mmol), PdCl2(PPh3)2 (117 mg, 0.17 mmol), K3PO4 (1.8 g, 8.33 mmol)를 1,2-다이옥산 9 mL와 H2O 3 mL를 혼합한 용매에 녹이고 아르곤 치환 후 환류하였다. 18시간 후 TLC로 반응이 종결된 것을 확인하고 실온으로 반응물의 온도를 감소시켰다. Celite로 여과하여 남은 여액을 H2O와 CH2Cl2로 묽힌 뒤 생긴 고체를 여과하였고, 여과물을 진공 감압하여 남은 용매를 제거하여 별도의 정제과정 없이 중간체 화합물 25를 합성하였다 (101 mg, 10%).
2-3. 화합물 2의 합성
중간체 화합물 25 (50 mg, 0.133 mmol)와 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 (29 mg, 0.213 mmol)을 dry DMF 0.7 mL에 녹이고 아르곤 치환 후 N,N-디이소프로필에틸아민 35㎕, 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 47㎕를 순서대로 적가하였다. TLC로 반응이 종결된 것을 확인한 후 H2O를 이용하여 반응을 종결하고, EtOAc와 H2O을 이용하여 생성물을 유기층으로 추출한 뒤 MgSO4를 이용하여 탈수하였다. 여과한 여액을 감압증류한 다음 flash column chromatography를 이용해 정제하여 화합물 2를 최종적으로 수득하였다 (6 mg, 12%); 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.15 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.63 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 8.34 - 8.27 (m, 1H), 8.04 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.97 - 7.91 (m, 3H), 7.90 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.71 - 7.64 (m, 2H), 7.59 - 7.53 (m, 1H), 7.34 - 7.24 (m, 2H), 2.93 - 2.84 (m, 1H), 0.76 - 0.66 (m, 2H), 0.66 - 0.56 (m, 2H).
[실시예 3]
N-시클로프로필-3-(5-(6-(2,3-디하이드록시프로폭시)-1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-5-플루오로-4-메틸벤자마이드 (N-Cyclopropyl-3-(5-(6-(2,3-dihydroxypropoxy)-1H-indole-3-carbonyl)pyridin-2-yl)-5-fluoro-4-methylbenzamide, 화합물 3)의 제조
Figure 112021077889141-pat00020
본 발명의 화합물 3은 하기 제조식 3에 따라 제조되었다.
[제조식 3]
Figure 112021077889141-pat00021
시약 및 조건: (a) Pd(PPh3)4, K2CO3, DMF, 90°C, 100%; (b) Potassium tert-butoxide, O2, DMSO, 0°C, 12%; (c) p-TsOH, H2O, MeOH, 50°C, 67%.
3-1. 중간체 화합물 26의 합성
중간체 화합물 21 (127 mg, 0.244 mmol)을 출발물질로 하여 중간체 화합물 22와 동일한 방법을 통해 중간체 화합물 26을 합성하였다 (158 mg, 100%); 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.12 (s, 1H), 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.22 (dd, J = 8.0, 2.2 Hz, 1H), 7.62 - 7.47 (m, 4H), 7.43 - 7.27 (m, 3H), 7.18 - 7.11 (m, 2H), 7.04 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.29 (s, 1H), 5.34 (s, 2H), 4.50 (p, J = 6.0 Hz, 1H), 4.18 (dd, J = 8.5, 6.4 Hz, 1H), 4.11 - 4.04 (m, 1H), 3.94 (ddd, J = 20.4, 8.9, 5.8 Hz, 2H), 2.91 (dt, J = 7.3, 3.8 Hz, 1H), 2.35 (d, J = 2.4 Hz, 3H), 2.28 - 2.22 (m, 1H), 2.05 (d, J = 0.8 Hz, 7H), 2.04 (s, 1H), 1.47 (s, 2H), 1.41 (s, 2H), 0.88 (q, J = 6.4 Hz, 3H), 0.62 (q, J = 6.0, 5.5 Hz, 2H).
3-2. 중간체 화합물 27의 합성
중간체 화합물 26 (158 mg, 0.249 mmol)을 DMSO 0.8 mL에 녹인 혼합물에 O2를 bubbling 한 뒤 potassium tert-butoxide (1.0 M in THF, 1.5 mL)를 0°C하에서 천천히 적가하였다. TLC로 반응이 종결된 것을 확인한 후 EtOAc로 묽히고 saturated aqueous NH4Cl solution을 이용하여 반응을 종결하였다. EtOAc와 물로 생성물을 유기층으로 추출한 뒤 MgSO4를 이용하여 탈수하였고, 여과한 여액을 감압증류한 다음 flash column chromatography를 이용해 정제하여 중간체 화합물 27을 합성하였다 (18.1 mg, 12%).
3-3. 화합물 3의 합성
중간체 화합물 27 (10.0 mg, 0.018 mmol)을 출발 물질로 하여 화합물 1과 동일한 방법을 통해 화합물 3을 최종적으로 수득하였다 (6 mg, 67%); 1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 9.05 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 8.35 (dt, J = 7.9, 2.7 Hz, 1H), 8.21 (dd, J = 8.9, 3.3 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 3.5, 1.7 Hz, 1H), 7.82 - 7.72 (m, 2H), 7.67 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 7.09 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 7.06 - 6.98 (m, 1H), 4.17 - 4.11 (m, 1H), 4.10 - 4.02 (m, 2H), 3.77 - 3.70 (m, 2H), 2.88 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 2.36 (q, J = 2.5 Hz, 3H), 2.03 (s, 1H), 1.31 (s, 1H), 0.83 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 0.66 (d, J = 5.7 Hz, 2H).
[실시예 4]
3-(5-(1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-N-시클로프로필-5-플루오로-4-메틸벤조아마이드 ((3-(5-(1H-indole-3-carbonyl)pyridin-2-yl)-N-cyclopropyl-5-fluoro-4-methylbenzamide, 화합물 4)의 제조
Figure 112021077889141-pat00022
본 발명의 화합물 4는 하기 제조식 4에 따라 제조되었다.
[제조식 4]
Figure 112021077889141-pat00023
시약 및 조건: (a) Pd(PPh3)4, K2CO3, 디메톡시 에탄, 톨루엔, 이소프로필 알콜, H2O, MW, 84%.
중간체 화합물 10 (48 mg, 0.15 mmol)과 중간체 화합물 17 (30 mg, 0.1 mmol), Pd(PPh3)4 (11.6 mg, 0.01 mmol), K2CO3 (28 mg, 0.2 mmol)을 담은 반응 용기에 (디메톡시 에탄: 톨루엔: 이소프로필 알콜: H2O = 10: 1: 3: 6)으로 혼합한 용매 2 mL를 적가한 뒤, 아르곤 치환하고 용기를 Microwave reactor로 130 °C에서 30분간 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 혼합물을 실온으로 식힌 뒤, 물을 이용하여 반응을 종결하고, EtOAc와 H2O로 생성물을 유기층으로 추출한 뒤 MgSO4를 이용하여 탈수하였다. 여과한 여액을 감압증류한 다음 flash column chromatography를 이용해 정제하여 화합물 4를 최종적으로 수득하였다 (34.8 mg, 84%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.25 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.60 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.14 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.34 - 7.25 (m, 2H), 2.87 (dq, J = 7.6, 4.2, 3.3 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 0.75 - 0.67 (m, 2H), 0.61-0.57 (m, 2H).
[실시예 5]
3-(5-(1-벤질-1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-N-시클로프로필-5-플루오로-4-메틸벤조아마이드 ((3-(5-(1-Benzyl-1H-indole-3-carbonyl)pyridin-2-yl)-N-cyclopropyl-5-fluoro-4-methylbenzamide, 화합물 5)의 제조
Figure 112021077889141-pat00024
본 발명의 화합물 5는 하기 제조식 5에 따라 제조되었다.
[제조식 5]
Figure 112021077889141-pat00025
시약 및 조건: (a) Pd(PPh3)4, K2CO3, DMF, 90°C, 94%.
중간체 화합물 18 (24.6 mg, 0.063 mmol)을 출발물질로 하여 중간체 화합물 22와 동일한 방법을 통해 화합물 5를 최종적으로 수득하였다 (29.7 mg, 94%); 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.13 (dd, J = 2.2, 0.9 Hz, 1H), 8.48 (dd, J = 8.2, 1.7 Hz, 1H), 8.23 (dd, J = 8.0, 2.2 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.62 - 7.52 (m, 3H), 7.43 - 7.25 (m, 6H), 7.17 (dd, J = 7.5, 2.0 Hz, 2H), 6.35 (s, 1H), 5.41 (s, 2H), 2.98 - 2.82 (m, 1H), 2.35 (d, J = 2.5 Hz, 3H), 0.96 - 0.81 (m, 2H), 0.67 - 0.55 (m, 2H).
[실시예 6]
N-시클로프로필--3-(5-(1-(2,3-디하이드록시프로필)-1H-인돌-3-카보닐)피리딘-2-일)-5-플루오로-4-메틸벤자마이드 (N-Cyclopropyl-3-(5-(1-(2,3-dihydroxypropyl)-1H-indole-3-carbonyl)pyridin-2-yl)-5-fluoro-4-methylbenzamide, 화합물 6)의 제조
Figure 112021077889141-pat00026
본 발명의 화합물 6은 하기 제조식 6에 따라 제조되었다.
[제조식 6]
Figure 112021077889141-pat00027
시약 및 조건: (a) (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-yl)메틸 4-메틸벤젠설포네이트, NaH, DMF, 90°C, 19%; (b) p-TsOH, H2O, MeOH, 50°C, 62%.
6-1. 중간체 화합물 28의 합성
화합물 4 (50 mg, 0.121 mmol)를 dry DMF 1.5 mL에 녹인 뒤 NaH (60% dispersion in mineral oil, 7.24 mg, 0.181 mmol)을 0°C 하에 넣고 아르곤 치환 후 교반하였다. 10분 뒤 (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메틸 4-메틸벤젠설포네이트(52.0 mg, 0.181 mmol), 4-디메틸아미노피리딘(catalytic amount)을 넣고 90°C까지 천천히 온도를 올리며 반응을 진행하였다. TLC를 확인하여 출발물질이 사라지면, 혼합물 온도를 실온으로 식히고 saturated aqueous NH4Cl solution을 이용하여 반응을 종결하고, EtOAc와 brine으로 생성물을 유기층으로 추출한 뒤 MgSO4를 이용하여 탈수하였다. 여과한 여액을 감압증류한 다음 flash column chromatography를 이용해 정제하여 중간체 화합물 28을 합성하였다 (13.5 mg, 19%).
6-2. 화합물 6의 합성
중간체 화합물 28 (12 mg, 0.023 mmol)을 출발 물질로 하여 화합물 1과 동일한 방법을 통해 화합물 6을 최종적으로 수득하였다 (7 mg, 62%); 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.11 (s, 1H), 8.48 - 8.44 (m, 1H), 8.22 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.48 - 7.43 (m, 1H), 7.38 (dd, J = 6.2, 3.1 Hz, 2H), 6.35 (s, 1H), 4.39 (dd, J = 14.5, 4.4 Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 14.5, 7.3 Hz, 1H), 4.16 (s, 1H), 3.76 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.58 (s, 1H), 2.89 (dd, J = 7.0, 3.5 Hz, 1H), 2.52 (s, 1H), 2.35 (d, J = 2.4 Hz, 3H), 1.40 (m, 1H), 0.87 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 0.63 (d, J = 8.1 Hz, 1H).
[실험예 1]
Calculated LogP (CLogP)를 통한 지질친화도 평가
Chemdaw 소프트웨어를 이용하여 화합물 1부터 6까지 구조식을 기입한 후 CLogP 값을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
화합물 번호 CLogP
1 2.05
2 3.96
3 2.24
4 4.49
5 5.70
6 3.35
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 기존의 약물을 조사하여 작성된 Lipinski’s rule of five에 따르면 CLogP가 5 미만일 경우 경구투여되기 쉬운 약물의 특징을 가진다. 따라서, 본 발명의 화합물은 경구투여 약물로 개발가능한 것을 알 수 있다.
[실험예 2]
p38α MAPK (mitogen-activated protein kinase) 저해능 평가
p38 MAPK를 저해하는 능력을 확인하기 위해 화합물 1 내지 5를 희석하여 농도에 따른 저해효과 확인하였다. 간략하게, 1000, 333, 111, 37.0, 12.3, 4.12, 1.37, 0.457, 0.152, 0.0495 nM농도로 화합물을 희석한후 각각 peptide/kinase 혼합물 (최종 7.07-28.3 ng p38 alpha, 2 μM Serine/Threonine 15, 50 mM HEPES pH 7.0, 0.01% NaN3)과 ATP 용액을 넣었다. 1시간 상온에서 반응시킨 후 development 시약을 넣고 1시간 상온에서 다시 반응시켰다. 445 nm와 520 nm 파장에서 Kinase 저해능을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
화합물 IC50 (nM)
1 22.3
2 34.1
3 34.3
4 18.8
5 193
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 200 nM이하의 농도에서 p38 alpha를 50% 억제하는 강력한 저해제임을 확인하였다.
[실험예 3]
세포에서의 p38 MAPK 단백질 억제능 평가
p-p38 MAPK의 억제를 확인하기 위해 p-p38 MAPK 활성에 따라 염증을 유발하는 macrophage를 암세포화 시킨 Raw264.7 세포에 각 화합물을 처리 후 p38 MAPK의 억제를 확인하였다. 간략하게, Raw264.7 세포를 10% 소태아혈청 및 penicillin/streptomycin (100 U/ml)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle Medium에서 배양하였다. 배양접시에서 Raw264.7 세포에 본 발명에 따른 화합물 1 내지 5를 1 μM씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후 LPS 100 ng/ml씩 처리하여 CO2 배양기에서 6 시간 추가 배양하였다.
실험 조건에 따라 세포의 배양이 끝난 후, 차가운 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하였다. 이후 세포를 수거하여 1200 rpm에서 3분동안 원심 분리하였다. 침전물을 2X sample buffer (1M Tris-HCl pH 6.8, 50 % Glycerol, 10 % SDS, 2-mercaptoethanol, 1 % bromophenol blue)로 세포를 용해하고 100℃에서 10 분 동안 끓였다. 제조된 단백질 샘플을 Sodium Dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis 하고 PVDF membrane (Millipore)으로 옮겼다. PVDF membrane의 단백질과 항체 사이의 특이 적 결합 반응을 위해 5 % bovine serum albumin (BSA, RMbio) 용액에서 blocking을 수행하였다. 이어서 BSA 용액을 폐기하고 membrane을 PBS-T (0.5 % tweene 20 in PBS)로 세척하였다. Membrane의 단백질과 antibody의 결합 반응을 4℃에서 밤새 수행하고 PBS-T로 다시 세척하였다. 마지막으로, Horse radish peroxidase (HRP)이 접합된 2차 항체 (Cell signaling Technology)를 PBS-T에 희석하고 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. Luminata Forte HRP substrate (Millipore)을 사용하여 membrane의 단백질양을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
화합물 p-p38 inhibition (%)
1 11.3
2 69.0
3 39.7
4 68.0
5 52.8
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 면역 블랏 결과, 본 발명의 화합물은 1 μM 농도에서 세포 내의 p38 인산화를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
[실험예 4]
염증반응에 따른 사이토카인 mRNA 발현 억제능 평가
p-p38 MAPK의 억제를 확인하기 위해 p-p38 MAPK 활성에 따라 염증을 유발하는 macrophage를 암세포화 시킨 Raw264.7 세포에 각 화합물을 처리 후 p38 MAPK의 억제를 확인하였다. 간략하게, Raw264.7 세포를 10% 소태아혈청 및 penicillin/streptomycin (100 U/ml)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle Medium에서 배양하였다. 배양접시에서 Raw264.7 세포에 본 발명에 따른 화합물 1 내지 5를 1 μM씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후 LPS 100 ng/ml씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 추가 배양하였다.
실험 조건에 따라 세포의 배양이 끝난 후, 차가운 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하였다. 이후 세포를 수거하여 1200 rpm에서 3분동안 원심 분리하였다. RNA는 Hybrid-R total RNA purification kit (GeneAll®, 305-101)에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다. Nanodrop을 이용하여 RNA의 농도와 순도를 측정한후 TOPscript RT DryMIX (Enzynomics, RT200)에서 제공하는 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. cDNA는 Primer와 함께 SYBR Green Mix를 이용하여 95°C에서 3분 반응 후 95°C에서 10초, 55°C에서 10초, 72°C에서 30초 반응을 30회 반복하여 RNA 발현량을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 6, 및 도 1 및 2에 나타내었다.
화합물 IL-1β mRNA inhibition (%)
1 21.4
2 24.4
3 12.3
4 38.2
5 3.2
화합물 TNFα mRNA inhibition (%)
1 38.1
2 37.6
3 39.2
4 51.5
5 4.1
상기 표 5 및 6, 및 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 염증반응을 발생시키는 사이토카인 IL-1β, TNFα의 mRNA 발현을 억제하는 것을 확인하였고, 본 발명의 화합물은 p38의 억제를 통해 염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것을 알 수 있다.
[실험예 5]
세포 염증반응에 따른 TNFα 억제능 평가
p-p38 MAPK의 억제를 확인하기 위해 p-p38 MAPK 활성에 따라 염증을 유발하는 macrophage를 암세포화 시킨 Raw264.7 세포에 각 화합물을 처리 후 p38 MAPK의 억제를 확인하였다. 간략하게, Raw264.7 세포를 10% 소태아혈청 및 penicillin/streptomycin (100 U/ml)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle Medium에서 배양하였다. 배양접시에서 Raw264.7 세포에 본 발명에 따른 화합물 1 내지 5를 1 μM씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후 LPS 100 ng/ml씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 추가 배양하였다.
실험 조건에 따라 세포의 배양이 끝난 후, 상층액을 취득하여 1200 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 원심분히한 상층액을 antibody가 코팅된 plate에 분주 후 상온에서 2시간 반응시키고 PBS-T (0.5% tween 20 in PBS)로 세척하였다. HRP가 포함된 detection antibody를 분주 후 상온에서 1시간 반응시키고 450nm 파장에서 단백질 양을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
화합물 TNFα inhibition (%)
1 22.1
2 68.5
3 16.7
4 76.6
5 23.8
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 염증반응을 발생시키는 사이토카인 TNFα의 발생을 억제하였고, 본 발명의 화합물은 p38 억제를 통해 염증반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
[실험예 6]
뇌 유래 세포에서의 p38 MAPK 단백질 억제능 평가
뇌세포에서의 p-p38 MAPK의 억제를 확인하기 위해 사람의 neuron을 암세포화 시킨 SH-SY5Y 세포에 각 화합물을 처리 후 염증을 유발시켜 p38 MAPK의 억제를 확인하였다. 간략하게, SH-SY5Y 세포를 10% 소태아혈청 및 penicillin/streptomycin (100 U/ml)이 보충된 Minimum essential medium/Eagle's balnced salts에서 배양하였다. 배양접시에서 SH-SY5Y 세포에 본 발명에 따른 화합물 4 및 6을 1 μM씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후 LPS 1000 ng/ml씩 처리하여 CO2 배양기에서 6 시간 추가 배양하였다.
실험 조건에 따라 세포의 배양이 끝난 후, 차가운 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하였다. 이후 세포를 수거하여 1200 rpm에서 3분동안 원심 분리하였다. 침전물을 2X sample buffer (1M Tris-HCl pH 6.8, 50 % Glycerol, 10 % SDS, 2-mercaptoethanol, 1 % bromophenol blue)로 세포를 용해하고 100℃에서 10 분 동안 끓였다. 제조된 단백질 샘플을 Sodium Dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis하고 PVDF membrane (Millipore)으로 옮겼다. PVDF membrane의 단백질과 항체 사이의 특이적 결합 반응을 위해 5 % bovine serum albumin (BSA, RMbio) 용액에서 blocking을 수행하였다. 이어서 BSA 용액을 폐기하고 membrane을 PBS-T (0.5 % tweene 20 in PBS)로 세척하였다. Membrane의 단백질과 antibody의 결합 반응을 4℃에서 밤새 수행하고 PBS-T로 다시 세척하였다. 마지막으로, Horse radish peroxidase (HRP)이 접합된 2차 항체 (Cell signaling Technology)를 PBS-T에 희석하고 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. Luminata Forte HRP substrate (Millipore)을 사용하여 membrane의 단백질양을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
화합물 p-p38 inhibition (%)
4 74.6
6 22.8
상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 면역 블랏 결과, 본 발명의 화합물 4 및 6은 1 μM 농도에서 사람 유래의 세포 내의 p38 인산화를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
[실험예 7]
정상 뇌세포에서의 p38 MAPK 단백질 억제능 평가
암세포가 아닌 정상세포에서의 p-p38 MAPK의 억제를 확인하기 위해 ICR 마우스의 대뇌에서 채취한 neuron 세포에 각 화합물을 처리하고 염증을 유발하여 p38 MAPK의 억제를 확인하였다. 간략하게, 임신한지 17-18일 정도 지난 ICR 마우스의 태아의 대뇌에서 neuron을 채취하여, 2% B27 supplyments, 2 mM glutamine 및 penicillin/streptomycin (100 U/ml)이 보충된 Neurobasal Medium에서 7일간 배양하였다. 배양접시에서 primary neuron에 본 발명에 따른 화합물 4 및 6을 1 μM씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후 LPS 1000 ng/ml씩 처리하여 CO2 배양기에서 6 시간 추가 배양하였다.
실험 조건에 따라 세포의 배양이 끝난 후, 차가운 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하였다. 이후 세포를 수거하여 1200 rpm에서 3 분동안 원심 분리하였다. 침전물을 2X sample buffer (1M Tris-HCl pH 6.8, 50 % Glycerol, 10 % SDS, 2-mercaptoethanol, 1 % bromophenol blue) 로 세포를 용해하고 100℃에서 10 분 동안 끓였다. 제조된 단백질 샘플을 Sodium Dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis하고 PVDF membrane (Millipore)으로 옮겼다. PVDF membrane의 단백질과 항체 사이의 특이적 결합 반응을 위해 5 % bovine serum albumin (BSA, RMbio) 용액에서 blocking을 수행하였다. 이어서 BSA 용액을 폐기하고 membrane을 PBS-T (0.5 % tweene 20 in PBS)로 세척하였다. Membrane의 단백질과 antibody의 결합 반응을 4℃에서 밤새 수행하고 PBS-T로 다시 세척하였다. 마지막으로, Horse radish peroxidase (HRP)이 접합된 2차 항체 (Cell signaling Technology)를 PBS-T에 희석하고 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. Luminata Forte HRP substrate (Millipore)을 사용하여 membrane의 단백질양을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
화합물 p-p38 inhibition (%)
4 55.8
6 60.7
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 면역 블랏 결과, 본 발명의 화합물 4 및 6은 1 μM 농도에서 암세포가 아닌 정상 세포에서도 염증에 따른 p38 인산화를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
[실험예 8]
염증반응에 따른 사이토카인 mRNA 발현 억제능 평가
p-p38 MAPK의 억제를 확인하기 위해 뇌 내에서 p-p38 MAPK 활성에 따라 염증을 유발하는 microglia를 암세포화시킨 BV2 세포에 각 화합물을 처리 후 p38 MAPK의 억제를 확인하였다. 간략하게, BV2 세포를 10% 소태아혈청 및 penicillin/streptomycin (100 U/ml)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle Medium에서 배양하였다. 배양접시에서 BV2 세포에 본 발명에 따른 화합물 4 및 6을 1 μM씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후 LPS 1000 ng/ml씩 처리하여 CO2 배양기에서 24 시간 추가 배양하였다.
실험 조건에 따라 세포의 배양이 끝난 후, 차가운 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한다. 이후 세포를 수거하여 1200 rpm에서 3분동안 원심 분리하였다. RNA는 Hybrid-R total RNA purification kit (GeneAll®, 305-101)에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다. Nanodrop을 이용하여 RNA의 농도와 순도를 측정한후 TOPscript RT DryMIX (Enzynomics, RT200)에서 제공하는 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. cDNA는 Primer와 함께 SYBR Green Mix를 이용하여 95℃에서 3분 반응 후 95℃에서 10초, 55℃에서 10초, 72℃에서 30초 반응을 30회 반복하여 RNA 발현량을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 10 내지 12, 및 도 3 내지 5에 나타내었다.
화합물 IL-1β mRNA inhibition (%)
4 68.5
6 12.6
화합물 TNFα mRNA inhibition (%)
4 24.5
6 15.7
화합물 번호 IL-6 mRNA inhibition (%)
4 52.8
6 14.4
상기 표 10 내지 12, 및 도 3 내지 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 염증 사이토카인 IL-1β, TNFα 및 IL-6의 mRNA 발생을 억제하였고, 본 발명의 화합물은 p38 억제를 통해 염증 사이토카인 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
    [화학식 1]
    Figure 112021077889141-pat00028

    상기 식에서,
    R1은
    Figure 112021077889141-pat00029
    ,
    Figure 112021077889141-pat00030
    ,
    Figure 112021077889141-pat00031
    ,
    Figure 112021077889141-pat00032
    ,
    Figure 112021077889141-pat00033
    또는
    Figure 112021077889141-pat00034
    이고,
    R2는 H, 할로겐, 또는 -C1-C6알킬이고,
    R3는 H 또는 할로겐이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    Figure 112021077889141-pat00035

  3. 제1항에 따른 화합물을 포함하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  4. 제2항에 따른 화합물을 포함하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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