KR102312654B1 - 안티인플라메이징 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아마이드계 화합물을 포함하는 인플라메이징 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인플라메이징 조성물은 염증으로 인한 노화촉진 현상인 인플라메이징 현상을 억제할 수 있으며, 구체적으로 NLRP3 인플라마좀의 활성화 억제, 염증성 사이토카인인 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β의 발현 억제 및 caspase-1의 발현 억제 효과가 우수하여, 피부조직의 분해를 막아주고 다양한 원인에 의한 내/외인성 피부노화 촉진 현상 및 염증성 피부질환 등에 유효한 효과를 발현할 수 있다.

Description

안티인플라메이징 조성물{Anti-inflammaging composition}

본 발명은 안티인플라메이징 조성물에 관한 것이다.

인간은 나이가 들어감에 있어서 급성, 만성 염증 반응에 노출되기 쉽고, 이는 노화와 연관 지을 수 있으며, 생물학적 노화과정에서 나타나는 면역 노화에 노출되기 쉽다. 인플라메이징(inflammaging)은 inflammation과 aging의 합성어로, 염증(Inflammation)이 모든 주요한 노화관련 질병의 배경(background)이며, 이를 '인플라메이징'이라고 한다. 낮지만 꾸준히 지속되는 염증이 심장질환, 알츠하이머병, 암, 뇌졸증, 당뇨병, 파킨슨병, 골다공증등과 같은 만성 및 퇴행성질환을 유발하며, 이를 치료하기 위한 방안으로 '염증 반응의 조절'을 통한 접근 방식의 연구가 진행되고 있다.

인플라메이징은 다양한 원인에 의해 발생하는데 염증 반응을 촉진할 수 있는 손상이 조직에 축적되거나, 병원체 또는 이상한 세포를 제거할 수 있는 면역 시스템이 기능 장애를 가지거나, 노쇠한 세포가 염증 촉진성 사이토카인을 분비하거나, 특정한 면역 관련 전사 인자(NF-κB)가 활성화되거나, 자가 포식 작용이 잘못 활성화되거나 하는 등의 원인이 존재한다. 이러한 변화는 NLRP3(NOD-like receptor pyrin domain-containning protein 3, cryopyrin) 인플라마솜(inflammasome)의 과도한 활성화를 유발하고, 다른 염증 반응도 유발하여 종양 괴사 인자인 IL-1β와 인터페론의 생성이 많아진다. 이러한 염증반응을 조절하여 노화를 늦추기 위한 목표 하에 안티인플라메이징(anti-inflammaging)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

인플라메이징 현상으로 인한 피부에서의 변화를 살펴보면, 일반적으로 만성 피부 염증은 표피의 탄력을 저해하므로 주름살 생성의 주요 원인이 된다. 또한 피부에 염증이 생긴 후에는 멜라닌 색소의 침착이 증가하여 염증 부위가 짙은 갈색으로 변하기도 하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다. 이와 같이 염증 반응은 피부 노화를 촉진한다. 한편, 노화된 피부는 면역력, 특히 피부 세포의 면역력이 저하되어 있어 각종 피부 감염에 취약하며, 혈청 내 자가 항체의 발생 빈도가 높아 자가 면역 피부 질환의 빈도도 높아진다. 노화된 피부는 약한 자극에도 염증이 발생할 가능성이 높으며, 발생한 염증은 또 다시 노화를 야기하므로 악순환이 계속된다. 따라서, 염증으로 인한 노화 촉진 현상인 인플라메이징을 억제한다면, 주름, 탄력 상실, 피부 건조증 등의 피부 노화 증상을 더디게 하거나 완화시킬 수 있을 것이다.

현재, 실제 상업화에 이른 피부 주름 개선 및 피부 탄력 증진을 위한 항노화용 기능성 원료는 그리 많지 않다. 가장 대표적인 피부 주름 개선 및 피부 탄력 증진을 위한 피부 노화 개선용 기능성 원료로는 레티노이드 (Retinoids), 비타민 C 등이 있다. 레티노이드 중 레티노인산(Retinoic acid)은 강력한 항노화용 치료제로서 사용되고 있으나, 피부에 강한 자극성을 가지고 있어 치료제로는 제한적으로 사용되며, 피부 자극이 비교적 적은 레티놀, 팔미틸산 레티놀 등이 화장품 소재로서 널리 사용되고 있다. 그러나 레티놀, 팔미틸산 레티놀 등은 빛을 받았을 경우 빛에 의해 변성되면서 피부에 자극을 일으키는 광독성과 그 안정성이 문제가 되어왔으며, 비타민C도 널리 사용되는 주름개선 치료제이나 강한 산성으로 인한 피부 자극을 유발하고, 물질 자체의 안정성이 낮다는 단점을 가지고 있다.

따라서, 기존의 피부노화개선용 조성물보다 생체에 안전하고 효과가 높은 새로운 화장료 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

KR 10-2098871 B1

본 발명은 염증으로 인한 노화촉진 현상인 인플라메이징(inflammaging)현상을 개선할 수 있는, 안티인플라메이징(anti-inflammaging) 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는, 본 발명은 인플라메이징 현상을 억제함으로써 피부노화를 방지할 수 있으며, 그 효과가 우수하고 피부 안전성이 우수한 인체 친화적인 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피부에 대한 부작용을 유발하지 않으며, 인플라메이징 현상으로 인한 피부 질환 관련 매개 인자의 발현을 효과적으로 억제하여, 염증성 피부 질환의 예방과 개선에 탁월하고 안전한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 안티인플라메이징 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

일 측면에 따르면, 상기 안티인플라메이징 조성물은 NLRP3의 활성을 억제하는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 안티인플라메이징 조성물은 caspase 1의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 안티인플라메이징 조성물은 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 cytokine 발현을 억제하는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 5중량%로 포함될 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 안티인플라메이징 조성물은 N-(1,3-디히드록시프로판-2-일)-2-에틸헥산아마이드를 더 포함하는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 조성물은 화장료 조성물 일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 에센스 또는 팩으로 제형화되는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 약학 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 도는 분무제로 제형화되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 안티인플라메이징 조성물은 염증으로 인한 노화촉진 현상인 인플라메이징 현상을 억제하여 주름, 탄력 상실 등의 피부 노화증상을 방지하고 개선할 수 있다. 또한, 인플라메이징 현상으로 인한 피부 질환 관련 매개 인자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어, 염증성 피부 질환의 예방과 개선에 유효한 효과를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명에 따른 상기 조성물은 NLRP3 인플라마좀의 활성화 억제, 염증성 사이토카인인 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β의 발현 억제 및 caspase-1의 발현 억제 효과가 우수하여, 피부조직의 분해를 막아주고 다양한 원인에 의한 내/외인성 피부노화 촉진 현상 및 염증성 피부질환 등에 유효한 효과를 발현할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 인체에 도포 시 상술한 바와 같은 안티인플라메이징 효과로 인해, 피부노화증상 및 염증성 피부질환을 방지하는데 탁월한 효과를 보인다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 물질 자체의 안정성뿐만 아니라, 인체에 대한 안전성이 우수하여 화장료 조성물 및 약학 조성물 등의 다양한 외용제 제형으로 응용이 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 실시예 1의 NLRP3 활성화 억제 효과 테스트 결과를 정량화한 그래프를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1의 염증 인자(IL-8, IL-17α)와 caspase-1 발현 억제 효과 테스트 결과를 정량화한 그래프를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1의 IL-8 발현 억제 효과를 면역조직화학을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1의 IL-17α발현 억제 효과를 면역조직화학을 통하여 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 1의 IL-1α 발현 억제 효과를 면역조직화학을 통하여 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 실시예 1의 IL-1β발현 억제 효과를 면역조직화학을 통하여 확인한 결과이다.

본 발명에 따른 안티인플라메이징 조성물에 대하여 이하 상술하나, 이때 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 명세서의 용어, "안티인플라메이징(anti-inflammaging)"은 '항염(anti-inflammation)'과 '항노화(antiaging)'의 합성어이다. 안티인플라메이징은 염증 또는 만성 염증으로 인한 노화 촉진을 예방 또는 개선하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "도포"는 임의의 적절한 방법으로 개체의 피부에 본 발명에 따른 조성물을 접촉 시키는 것을 의미하며, 이를 통해 해당 조성물을 피부 내부로 흡수시키는 것을 목적으로 한다.

본 명세서의 용어, “포함한다”는 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.

본 발명자들은 인플라메이징 현상을 개선할 수 있는 소재에 대한 연구를 거듭하던 중, 특정 구조의 아마이드계 화합물이 인플라메이징 현상의 원인이 되는 염증성 인자의 활성화를 억제할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 아마이드계 화합물이 NLRP3 인플라마좀의 활성화 억제, 염증성 사이토카인인 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β의 발현 억제 및 caspase-1의 발현 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 이와 같은 효과를 기반하여 기존에 알려지지 않았던 새로운 용도 및 놀랍도록 현저한 효과를 밝힘으로써, 본 발명을 제안하고자 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 안티인플라메이징 조성물에 관한 것으로, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 5중량%로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1중량%로 포함될 수 있다. 상술된 범위로 유효성분을 포함하는 경우, 제형의 안정성을 해치지 않으면서도 본 발명에서 목적하는 효과, 즉 용도에 현저함을 보여 보다 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 안티인플라메이징 조성물은 NLRP3의 활성을 억제할 수 있다. 인플라메이징 현상의 주된 원인 중 하나인 NLRP3 인플라마좀의 과도한 활성화는 다른 염증 반응을 연쇄적으로 유발한다. NLRP3 활성화로부터 유래된 활성 사이토카인은 염증의 중요한 유도인자이고, 다른 사이토카인 경로와 상호작용하여 면역 반응을 감염 및 상해로 정형화한다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 NLRP3 활성화를 억제함으로써 만성 염증반응으로 인한 피부 노화 현상 및 피부질환의 개선을 가능하게 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 안티인플라메이징 조성물은 caspase-1의 발현을 억제할 수 있다. caspase-1은 면역 기능에서 중요한 역할을 갖는 사이토카인인 IL-1β 및 IL-18와 같은 염증성(proinflammatory) 사이토카인의 성숙 및 분비를 유도하는 것으로, caspase-1의 발현 및 활성을 억제함으로써 만성 염증반응으로 인한 피부 노화 현상 및 피부질환의 개선 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 안티인플라메이징 조성물은 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 cytokine 발현을 억제할 수 있다. 염증 반응에 의해 생성되는 TNF-α와 IL-1β 등과 같은 사이토카인(cytokine)은 혈관 내피(vascular endothelium)에 존재하는 수용체에 결합하여 여러 염증 관련 신호 경로(signaling pathway)를 활성화시킨다. 또한 이때 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)의 발현이 증가되어 염증성 세포들의 분출(extravasation)이 일어나게 된다. 이러한 염증성 세포의 침투(infiltration) 후 여러 사이토카인이나 케모카인 등의 케모-어트랙티브 활성(chemo-attractive activity)이 있게 되고, 이들이 염증이 일어난 부위로 이동하면서 면역 반응을 일으키게 된다. 이러한 염증성 사이토카인들은 매트릭스 메탈로프로테이나아제(Matrix Metalloproteinase)의 발현을 촉진하여 콜라겐 분해를 유도하므로, 피부 노화를 일으키는데 결정적인 역할을 하며 생성된 사이토카인은 다시 수용체에 결합하여 연쇄 반응을 일으키게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물이 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있다면 염증성 피부 노화 억제 물질로 작용할 수 있다고 판단할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 피부 부작용을 초래하지 않으며, 피부에 대한 안전성이 우수하고, 물리적·화학적으로 매우 안정하여 제형 개발이 용이하여 화장료 조성물, 약학 조성물 등으로 안전하고 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대 된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 안티인플라메이징 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 유효성분에 N-(1,3-디히드록시프로판-2-일)-2-에틸헥산아마이드을 더 포함할 수 있다. 유효성분과 N-(1,3-디히드록시프로판-2-일)-2-에틸헥산아마이드의 조합으로 사용하는 경우, 유효성분을 단일성분으로 사용하는 것 대비 현저한 시너지를 부여하여 보다 우수한 인플라메이징 억제 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 안티인플라메이징 조성물 내 상기 화학식 1로 표시되는 유효성분과 N-(1,3-디히드록시프로판-2-일)-2-에틸헥산아마이드의 중량비는 0.01:99.99 내지 99.99:0.01로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 60:40 내지 90:10으로 포함될 수 있다. 상술된 중량비 범위로 포함하는 경우, 제형의 안정성을 해치지 않으면서도 본 발명에서 목적하는 효과에 놀랍도록 향상된 시너지를 부여할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 상술된 유효성분 및 잔량을 물을 포함하는 것일 수 있으며, 다양한 양태로 제형화될 수 있음은 물론이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등으로 제형화될 수 있다. 일 예로, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 에센스, 팩 등에서 선택되는 제형으로 제형화되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 화장료 조성물은 목적하는 바에 따라 적절하게 추가의 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 상기 아마이드계 화합물과 함께 당업계에 공지된 주름 개선용 성분, 항산화용 성분, 미백 성분 등에서 선택되는 성분을 더 포함할 수 있다. 일 예로, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물 등에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 화장료 조성물은 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제;에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.

이때, 상기 각 첨가제는 상기 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 10중량%, 0.05 내지 5중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 안티인플라메이징 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 약학 조성물은 염증성 피부 질환을 개선할 수 있으며, 상기 염증성 피부 질환의 일 예로, 아토피피부염, 건선, 접촉성피부염, 습진성 피부염, 광선 피부염, 지루 피부염, 포진성 피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 전신성 경화증, 피부근염, 다발성 근염, 염증성 근병변, 나병 또는 세자리 증후군일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한 안티인플라메이징 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 일 예로, 상기 약학 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취, 분무제 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제형화되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 적절하게 추가의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 일 예로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 담체 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등의 담체를 더 포함할 수 있다.

이때, 상기 각 담체는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 10중량%, 0.05 내지 10중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] CB-059제조

1,3-다이아미노-2-프로판올(1,3-Diamino-2-propanol, 16.07g, 178.31mmol, Sigma-Aldrich)을 메탄올 80mL와 디클로로메탄 240mL에 녹이고 트리에틸아민(TEA, 49.70mL, 삼전순약)을 투입하여 반응액을 만들었다. 반응 온도를 0℃로 낮추고 헥사노일클로라이드(Hexanoyl chloride, 40g, 297.18mmol, TCI)를 반응액에 천천히 가한 후 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 반응액에 정제수 160mL를 넣고 교반, 정치 후 층분리 하였다. 유기층에 brine 160mL를 넣고 교반, 정치 후 층분리 하였다. 유기층을 모아 소듐설페이트(Na₂SO₄)로 탈수하고, 여과 후 여액을 감압 농축하였다. 잔여물을 t-부틸메틸에테르(t-Butyl methyl ether) 200mL로 슬러리 세척하고 여과한 후 건조하여 흰고체인 화합물을 얻었다(39 g, 수율=92%).

수득된 고체를 'CB059'이라 명명하고, MS(Thermo Fisher, 미국) 및 NMR(Bruker Biospin, 캐나다)로 분석하였다. 상기 분석 결과는 다음과 같다.

MS (ESI pos. ion) m/z: 287(MH+)

¹H-NMR (700 MHz, CDCl3): 6.46(t, J = 5.6Hz, 2H), 4.39(d, J = 2.8Hz, 1H), 3.77-3.76(m, 1H), 3.33(t, J = 5.6Hz, 4H), 2.22(t, J = 7.7Hz, 4H), 1.66-1.61 (m, 4H), 1.36-1.28 (m, 8H), 0.90(t, J = 7.0Hz, 6H).

[실시예 1]

상기 제조예 1에서 제조된 화합물인 아마이드계 화합물(CB059) 1wt% (in DMSO)를 포함하는 안티인플라메이징 조성물을 제조하였다.

[비교예 1]

CB059 대신에 하기의 비교화합물 1(Madecassoside)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 안티인플라메이징 조성물을 제조하였다.

비교화합물 1:

상기 실시예 1 및 비교예 1의 조성물을 각 평가방법에 따라 다양한 농도로 준비하여 하기 실험예 1 내지 3을 실시하였으며, 그 결과를 도 1 내지 도 6에 도시하였다.

[실험예 1] NLRP3 활성화 억제 효과 확인

본 발명의 실시예 1의 아마이드계 화합물(CB059) 및 비교예(Madecassoside)1의 NLRP3 활성화 억제 효능을 확인하기 위해 q-PCR 법을 사용하였다.

구체적으로, 인간 각질형성세포(Human Epidermal Keratinocytes)로부터의 mRNA의 획득은 트리졸시약을 사용하여 제작사의 설명서에 따라 RNA를 분리하여 수행하였다. 구체적으로는 6 웰 플레이트(well plate)에 1Х10⁵cells/dish의 세포를 준비한 뒤, 37℃및 5%의 CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 인간 각질형성세포에서 TLR3 ligand의 agonist인 Poly(I:C) 10ug/ml와 Inflammatory cytokines으로 알려져 있는 TNF-α 3.5ng/ml, IL-4 30ng/ml, IL-13 30ng/ml를 복합 처리하여 NLRP3 활성화가 유도됨을 확인하였다. 이때, 시료는 유효성분으로 CB059를 사용한 것이고, 유효성분을 사용하지 않은 시료는 음성 대조군(control)이다. 이후, 상기 24시간 동안 배양한 배양액을 제거한 뒤 트리졸 0.7mL를 가하여 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포를 각각 1.5mL microfuge 튜브로 옮긴 후, 클로로포름(Chloroform) 0.2mL를 첨가하여 실온에서 5분 방치한 후, 14,000rpm으로 15분간 원심 분리를 수행하였다. 원심분리 수행 후, 세포를 파괴시킨 혼합액의 상등액을 새 1.5mL microfuge 튜브로 옮긴 후, 이소프로필알코올을 0.4mL 첨가하여 inverting 한 후, 실온(25

에서 15분간 방치한 후, 14,000rpm으로 15분간 원심분리를 가하여 RNA를 침전시켜 수득하였다. 상기의 튜브에서 이소프로필알코올을 제거한 후, 75% 에탄올 1mL를 첨가하여 inverting한 후, 10,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 에탄올을 제거하여 정제된 RNA를 수득하고, RNA가 완전히 건조되면 DEPC-DW를 첨가하여 RNA를 획득하였다.

이는 하기 표 1과 같은 각각의 특이적 프라이머를 이용하여 Q-PCR로 mRNA양의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 도시하였다.

	방향	염기서열
β-Actin	forward	ATTGGCAATGAGCGGTTCC
	reverse	GGTAGTTTCGTGGATGCCACA
NLRP3	forward	CTTCTCTGATGAGGCCCAAG
	reverse	GCAGCAAACTGGAAAGGAAG

도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 화합물(CB059)은 유효량 범위 내에서 NLRP3의 발현을 현저하게 억제할 수 있음을 확인하였다.

[실험예 2] 염증 인자(IL-8, IL-17α)와 caspase-1 발현 억제 효과 확인

본 발명에 따른 아마이드계 화합물(CB059)의 염증 인자(IL-8, IL-17α)와 caspase-1 활성화 억제 효능을 확인하기 위해, 본 발명의 실시예 1의 아마이드계 화합물(CB059) 및 비교예 1의 염증 인자(IL-8, IL-17α)와 caspase-1 활성화 억제 효능을 하고자 q-PCR 법을 사용하였다.

인간 각질형성세포(Human Epidermal Keratinocytes)로부터의 mRNA의 획득은 트리졸시약을 사용하여 제작사의 설명서에 따라 RNA를 분리하여 수행하였다. 구체적으로는 6 웰 플레이트(well plate)에 1Х10⁵cells/dish의 세포를 준비한 뒤, 37℃및 5%의 CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 인간 각질형성세포에서 TLR3 ligand의 agonist인 Poly(I:C) 10ug/ml와 Inflammatory cytokines으로 알려져 있는 TNF-α 3.5 ng/ml, IL-4 30 ng/ml, IL-13 30 ng/ml를 복합 처리하여 상기 인자들의 활성화가 유도됨을 확인하였다. 이때, 시료는 유효성분으로 CB059를 사용한 것이고, 유효성분을 사용하지 않은 시료는 음성 대조군(control)이다. 이후, 상기 24시간 동안 배양한 배양액을 제거한 뒤 트리졸 0.7mL를 가하여 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포를 각각 1.5mL microfuge 튜브로 옮긴 후, 클로로포름 (Chloroform) 0.2mL를 첨가하여 실온에서 5분 방치한 후, 14,000rpm으로 15분간 원심 분리를 수행하였다. 원심분리 수행 후, 세포를 파괴시킨 혼합액의 상등액을 새 1.5mL microfuge 튜브로 옮긴 후, 이소프로필알코올을 0.4mL 첨가하여 inverting 한 후, 실온(25℃)에서 15분간 방치한 후, 14,000rpm으로 15분간 원심분리를 가하여 RNA를 침전시켜 수득하였다. 상기의 튜브에서 이소프로필알코올을 제거한 후, 75% 에탄올 1mL를 첨가하여 inverting한 후, 10,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 에탄올을 제거하여 정제된 RNA를 수득하고, RNA가 완전히 건조되면 DEPC-DW를 첨가하여 RNA를 획득하였다.

이는 하기 표 2과 같은 각각의 특이적 프라이머를 이용하여 Q-PCR로 mRNA양의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 도시하였다.

	방향	염기서열
β-Actin	forward	ATTGGCAATGAGCGGTTCC
	reverse	GGTAGTTTCGTGGATGCCACA
IL-8	forward	ATGACTTCCAAGCTGGCCGT
	reverse	TCCTTGGCAAAACTGCACCT
IL-17alpha	forward	TGGGAAGACCTCATTGGTGT
	reverse	GGATTTCGTGGGATTGTGAT
Caspase-1	forward	GCCTGTTCCTGTGATGTGGAG
	reverse	TGCCCACAGACATTCATACAGTTTC

도 2에 도시한 바와 같이, 본 발명의 화합물(CB059)은 유효량 범위 내에서 염증인자(IL-8, IL-17α)와 caspase-1 발현을 현저하게 억제할 수 있음을 확인하였다.

[실험예 3] cytokine 발현 억제 효과 확인

본 발명에 따른 아마이드계 화합물(CB059)의 항염 효능 측정을 위해, 상기 염증 유도조건으로 유도되는 사이토카인인 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β 대한 그 발현량을 측정하였다.

구체적으로, MatTek에서 판매하는 3D culture tissue(EpiDerm Full Thickness 400)에 전용배지(EFT-400)에서 18시간 동안 안정화를 시킨 후 비교예 1 0.1% 와 실시예 1을 0.3%의 농도로 30μL 도포한 후 72시간 뒤에 인공피부조직을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하였다. 파라핀으로 포매하여 5㎛로 박절한 조직을 이용하여 IHC 염색을 진행하여 염증에 대한 항염증 활성 효능을 평가하였으며, 그 결과를 도 3 내지 도6에 도시하였다.

도 3 내지 도 6에 도시한 바와 같이, 본 발명의 화합물(CB059)은 유효량 범위 내에서 사이토카인인 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β 발현을 현저하게 억제할 수 있음을 확인하였다.

[실시예 2] 안티인플라메이징 화장료 조성물 제조

하기 표 3에 도시한 조성에 따라 안티인플라메이징 화장료 조성물을 제조하였다.

원료명	실시예2 (중량%)
스테아린산	1.5
CB059	0.06
세테아릴 알코올	3.5
소르비탄 스테아레이트	2
글리세릴 스테아레이트	1.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5
글리세린	5
잔탄검	0.2
소듐하이알루로네이트(1wt% sol)	3
아르기닌	0.1
1,3-프로판올	5
카보머	0.2
디메치콘	0.5
1,2-헥산디올, 카프릴글라이콜, 트로폴론	0.6
정제수	잔량
계	100

이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 NLRP3 활성 억제용 유효성분으로 포함하는, 안티인플라메이징 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 안티인플라메이징 조성물은 caspase 1의 발현을 억제하는 것인, 안티인플라메이징 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 안티인플라메이징 조성물은 IL-8, IL-17α, IL-1α 및 IL-1β로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 cytokine 발현을 억제하는 것인, 안티인플라메이징 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 5중량%로 포함되는, 안티인플라메이징 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   N-(1,3-디히드록시프로판-2-일)-2-에틸헥산아마이드를 더 포함하는, 안티인플라메이징 조성물.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 화장료 조성물인, 안티인플라메이징 조성물.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 에센스 또는 팩으로 제형화되는 것인, 안티인플라메이징 조성물.
9. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 약학 조성물인, 안티인플라메이징 조성물.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 도는 분무제로 제형화되는 것인, 안티인플라메이징 조성물.
    

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