KR102304243B1

KR102304243B1 - 에피다우노루비신의 정제

Info

Publication number: KR102304243B1
Application number: KR1020167033697A
Authority: KR
Inventors: 홀거 빈더나겔; 테로 쿤나리
Original assignee: 메닥 게젤사프트 후르 클리니셰 스페지알프라파라테 엠베하
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2021-09-23
Also published as: DE102014208194A1; CN106459124B; RU2016146263A; DK3137475T3; US10081652B2; PL3137475T3; JP2017514821A; JP6553644B2; RU2662158C2; ES2686701T3; CN106459124A; AU2015254638B2; US20170051001A1; UA118585C2; EP3137475A1; AU2015254638A1; KR20170002535A; RU2016146263A3; WO2015166016A1; EP3137475B1

Abstract

본 발명은 에피다우노루비신을 정제하는 방법에 관한 것이고, 특히 에피다우노루비신의 생물공학 제조에서 부산물로서 형성되는 불순물 에피푸도마이신의 제거방법에 관한 것이다.

Description

에피다우노루비신의 정제{PURIFICATION OF EPIDAUNORUBICIN}

본 발명은 에피다우노루비신을 정제하는 방법, 구체적으로 에피다우노루비신 및 이 에피다우노루비신의 생물공학적 제조에서 부산물로서 형성되는 에피푸도마이신(epi-feudomycin)의 분리 방법에 관한 것이다.

에피다우노루비신은 글리코사이드의 군으로 존재하고 안트라사이클린 군의 항생제를 대표하는 다우노루비신의 4'-에피머이다. 그것은 유방암, 비호지킨 림프종, 육종, 위 암종 및 다른 고체 유형의 암의 화학요법에서 세포억제제를 사용되는 에피루비신에 대한 전구물질로서 주로 사용된다. 에피다우노루비신은 합성적으로, 반합성적으로 및 생물공학적으로 제조될 수 있다. 생물공학적 제조에서, 스트렙토마이신 페세티우스(Streptomyces peucetius) 균주가 사용된다. 에피다우노루비신은 하기 일반식(I)에 의해 표시될 수 있다:

에피다우노루비신의 미생물 합성에서, 소정의 생성물 이외에도, 구조적 유사성 때문에, 에피다우노루비신으로부터 매우 분리하기 어려운 부산물로서 에피푸도마이신이 형성되는 문제점이 야기된다. 부산물의 존재는 후속적인 공정 단계에서 에피다우노루비신으로부터 형성되는 에피루비신의 순도 및 수율에 유해하다. 보통, 발효 브로쓰로부터 에피다우노루비신의 분리 및 정제는 액체-액체 추출, 크로마토그래피 및 결정화에 의해 수행된다.

그러나, 에피푸도마이신의 존재 때문에, 이는 복잡한 공정을 필요로 하고, 결과로 비교적 높은 손실량의 에피다우노루비신을 초래한다.

EP 1 990 405 A1에는 에피다우노루비신의 생물공학적 제조에 적합한 상이한 미생물 균주가 기술되어 있다. 발효 브로쓰로부터의 에피다우노루비신의 분리는 알칼리 pH 값에서 클로로포름에 의한 추출을 통해 수행된다. 이어서, 결과로 얻어지는 미정제 혼합물이 이동 상으로서 클로로포름에 의해 크로마토그래피적으로 추가 정제된다. 최종 단계에서, 에피다우노루비신이 부탄올의 첨가 및 산성 pH 값의 조정에 의해 결정화된다.

EP 2 301 943 B1에는 알콜이 60℃의 온도에서 첨가되는 알콜/클로로포름의 혼합물로부터의 에피다우노루비신 염산염의 결정화가 기술되어 있다.

EP 0 030 295 B1에는 에피다우노루비신의 합성 제조가 개시되어 있다.

WO 2010/028667에는 흡착 수지에 의한 발효 브로쓰로부터의 13-DHED, 에피다우노루비신 및 에피푸마이신의 추출이 기술되어 있다.

EP 2 042 608 B1에는 13-DHED, 에피다우노루비신 및 푸도마이신을 함유하는 발효 브로쓰로부터 아글리콘(aglycone)의 추출이 기술되어 있다. 글리코사이드는 약한 알칼리 pH 값에서 클로로포름에 의해 수성 상으로부터 추출된다. pH 값은 포화 NaHCO₃ 용액에 이해 안정하게 유지된다.

발효 브로쓰로부터 에피다우노루비신을 정제하는 일반적인 방법이 높은 기술적 및 경제적 비용과 관련되어 있다. 특히 에피다우노루비신 및 에피푸도마이신의 분리는 그 2가지 화합물의 구조적 유사성 때문에 특히 어려워서 에피다우노루비신의 허용가능한 순도가 오로지 상당한 수율 손실과 함께 달성될 수 있다. 에피다우노루비신의 어려운 분리 때문에, 이러한 불순도물은 또한 에피루비신으로의 전환에 특히 지장을 주는 에피다우노루비신으로부터 유도된 생성물 내에서 발견될 수도 있다. 또다른 한편으로는, 고 순도 및 고 수율이 에파다우노루비신에서 에피루비신으로의 후속적인 전환에 있어서 특히 결정적이다.

그러므로, 본 발명의 목적은 미생물 제조 후 에피다우노루비신 및 에피푸도마이신의 효과적인 분리를 허용하는 방법으로서, 정제된 에피다우노루비신의 수율은 해당 기술 분야로부터 공지된 일반적인 방법에 의해 얻어지는 수율보다 더 높은 것인 방법을 제공하는 것이다.

그 목적은 독립항의 주제에 의해 달성된다. 종속항에는 바람직한 실시양태들이 기술되어 있다.

본 발명을 기초로 하는 목적은

a) 에피다우노루비신, 에피푸도마이신 및 하나 이상의 할로겐 함유 용매를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,

b) 혼합물의 pH 값을 5.0 내지 7.5의 범위로 조정하는 단계,

c) 단계 b)의 혼합물을 가열하여 25℃ 초과로 가열하는 단계,

d) 에피다우노루비신을 정제하는 단계

를 포함하는 에피다우노루비신의 정제 방법으로서, 단계 a) 및 b)의 혼합물에서 1 내지 5개의 원자를 지닌 알콜의 함량은 혼합물의 총 부피를 기준으로 5 부피%를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 정제 방법이다.

이론에 의해 한정하고자 하는 것이 아니지만, 본 발명에 따른 방법의 조건 하에서, 에피푸도마이신이 선택적으로 붕해되고, 결과로 얻어지는 분해 생성물이 소정의 에피다우노루비신으로부터 보다 용이하게 분리되는 것으로 가정된다. 본 발명에 따른 방법은 또한 반응 혼합물의 전환을 유도하고, 따라서 에피푸도마이신에서의 감소를 유도하는 것으로 가정된다. 더구나, 질량 분광법 분석에 의하면, 그 당은 분할되고 잔류 고리가 방향족화되는 것으로 나타난다. 더구나, 이는 에피다우노루비신의 분해 생성물이 검출될 수 없기 때문에, 에피푸도마이신의 특정 붕해인 것으로 가정된다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 방법에서 붕해는 에피다우노루비신에도 적용되는 안트라사이클린의 통상적인 산성 가수분해와는 상이하다.

본 발명에 따른 방법은 여러 단계에서 정제되는 원료로서 에파다우노루비신을 출발 물질로 시작한다. 에피다우노루비신의 원래 제조 방법이 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다. 실제 예를 들면, 에피푸도마이신의 일부를 함유하는 상업적으로 이용 가능한 에피다우노루비신이 사용될 수 있는데, 이는 그 에피다우노루비신을 다른 적용예에 부적합하게 한다.

본 발명에 따른 정제 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)의 혼합물의 에피다우노루비신은 생물공학 방법, 예를 들면 미생물에 의해 얻어진다. 바람직하게는, 에피다우노루비신은 에피푸도마이신과 함께 발효 브로쓰 내에 존재한다. 적합한 미생물은, 예를 들면 악티노박테리아 군의 박테리아, 특히 스트렙토마이세 스 에 스피.(Streptomyces sp .) 군의 균주, 예를 들면 에스 . 페세티우스 (S. peucetius ), 에스. 코에룰로루디우스 (S. coeruloruidus ), 에스 . 그리세우스 (S. griseus ), 스트렙토마이세스 에스피 . C5( Streptomyces sp . C5), 에스 . 페이세티우스 바르 . 케시우스 (S. peicetius var. caesius ) 및 에스 . 비푸르쿠스(S. bifurcus)를 포함한다. 게다가, 변형 균주 또는 돌연변이가 또한 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 단계 a)의 혼합물의 에피다우노루비신 및 에피푸도마이신은 발효 브로쓰로부터의 추출에 의해 얻어진다. 이 추출은 몇가지 단계, 예를 들면 적합한 중합체 수지에 의한 추출, 이어서 액체 추출을 포함할 수 있다. 혼합물 a)은 발효 브로쓰의 액체 추출의 농출물로부터 임의로 할로겐 함유 용매의 첨가에 의해 얻어지는 것이 바람직하다.

특히 바람직한 실시양태에서, 단계 a)에서 출발 혼합물은 알칼리 pH 값, 특히 바람직하게는 8 내지 10.5의 범위에 있는 pH 값을 갖는다.

혼합물 a)에서, 에피다우노루비신은 하나 이상의 할로겐 함유 용매의 존재 하에 용해된 형태로 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 할로겐 함유 용매는 염소화 용매 군, 특히 클로로포름(CHCl₃)으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 방법의 단계 a) 및 b)의 혼합물에서 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜의 함량은 혼합물의 총 부피를 기준으로 최대 5 부피%이다.

놀랍게도, 1 내지 5개의 원자를 지닌 알콜의 보다 높은 함량이 감소된 반응 속도를 유도하고, 이는 결국 에피다우노루비신의 순도에 부정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

그러므로, 단계 a) 및 단계 b)의 혼합물에서 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜의 함량이 그 혼합물의 총 부피를 기준으로 최대 4 부피%, 특히 바람직하게는 0.1 부피% 내지 0.4 부피%, 특히 1.0 부피% 내지 3 부피%인 본 발명의 실시양태가 바람직하다. 본 발명 범위에서 알콜 함량은 에피다우노루비신이 완전 용해되고 반응이 만족스러운 시간 프레임에서 일어나는 것을 보장한다.

1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜이 메탄올, 부탄올, 프로판올, 에탄올, 이소프로판올, 펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2,2-디메틸프로판올 및 이소부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 본 발명의 실시양태가 또한 바람직하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜이 메탄올이다.

게다가, 단계 a)의 혼합물에서 물의 함량이 그 혼합물의 총 부피를 기준으로 최대 1 부피%인 실시양태가 바람직하다.

더구나, 놀랍게도, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어지는 에피다우노루비신은 단계 a)의 혼합물에서 에피다우노루비신의 농도가 13 g/L 이하인 경우 매우 높은 순도를 갖는 것으로 밝혀졌다.

그러므로, 단계 a)의 혼합물에서 에피다우노루비신의 농도가 13 g/L 이하, 바람직하게는 6 내지 13 g/L, 특히 8 내지 13 g/L인 실시양태인 것이 바람직하다. 바람직하지 못한 부반응 및 반응 중단은 단계 a)의 혼합물에서 에피다우노루비신의 농도가 그러한 범위 내에 있는 경우 방지될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 실제 예를 들면, 에피다우노루비신의 침전 위험이 감소될 수 있다. 에피다우노루비신의 침전은 침전된 에피다우노루비신이 정제 공정으로부터 제거되기 때문에 바람직하지 못한 수율 손실을 유발한다. 게다가, 에피다우노루비신과 함께, 분리하고자 하는 불순물, 에피푸도마이신이 또한 침전되므로, 그 침전이 적합한 정제 방법이 되지 않는 것으로 관찰되었다.

에피다우노루비신의 정제를 위한 본 발명의 방법의 단계 b)에 따르면, 혼합물이 pH 값은 5.0 내지 7.5의 범위로 조정된다. 놀랍게도, pH 값이 본 발명의 범위 초과인 경우, 에피다우노루비신은 붕해되는 것으로 밝혀졌다. pH 값이 너무 산성인 경우, 즉 5 미만의 값으로 조정되는 경우, 에피다우노루비신의 바람직하지 못한 부분 양성자화가 일어나며, 이것은 푸도마이신과 함께 에피다우노루비신의 침전을 유발하므로, 그것은 후속적인 공정 흐름으로부터 제거된다.

바람직하게는, 그 혼합물의 pH 값은 할로겐 함유 용매, 특히 클로로포름 중에서 적합한 pKa 값 및 우수한 용해도를 나타내는 산에 의해 5.0 내지 7.5의 범위로 조정된다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서 혼합물의 pH 값은 하나 이상의 산, 바람직하게는 유기 산, 특히 바람직하게는 아세트산에 의해 조정된다.

본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 산의 양은 혼합물의 총 부피를 기준으로 0.05 내지 0.3 부피%, 바람직하게는 0.1 내지 0.25 부피%이다. 산의 첨가 후, 반응 속도에서의 선명한 증가가 관찰될 수 있다. 또 다른 한편으로는, 산 함량이 혼합물의 총 부피를 기준으로 0.3 부피% 초과인 경우, 용해도 문제가 야기될 수 있으며, 이것은 용액으로부터의 에피푸도마이신와 함께 에피다우노루비신의 침전을 유발하므로, 그들은 후속적인 공정 흐름으로부터 제거된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 혼합물에서 pH 값을 조정하는데 사용되는 산은 첨가 전에 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜, 바람직하게는 메탄올 중에 용해된다. 놀랍게도 밝혀진 바와 같이, 이는 에피다우노루비신의 용해도에 관한 문제를 방지할 수 있고, 에피다우노루비신의 침전을 방지할 수 있다. 혼합물에서 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜, 메탄올의 총 함량은 혼합물의 총 부피를 기준으로 5 부피%의 본 발명의 값을 초과하지 않아야 한다.

에피다우노루비신을 정제하기 위한 본 발명의 방법의 단계 c)에 따르면, pH 값이 본 발명의 범위로 조정된 후, 단계 b)의 혼합물은 25℃ 초과로 가열된다. 놀랍게도, 정제는 혼합물이 25℃ 초과의 온도로 가열되는 경우 가속될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 혼합물은 할로겐 함유 용매의 비등점에 상응하는 온도로 가열되는 것이 바람직하다. 50℃ 초과의 온도는 그 온도에서 반응 속도에서의 유의적인 증가가 관찰될 수 있기 때문에 매우 적합한 것으로 나타났다.

그러므로, 단계 c)의 혼합물이 55 내지 75℃, 바람직하게는 60 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열되는 것인 실시양태가 바람직하다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 혼합물은 25℃ 초과의 온도, 바람직하게는 35℃ 초과의 온도, 특히 60 내지 65℃의 범위에 있는 온도에서 특정 시간 동안 교반된다. 시간은 본 발명의 방법을 효율적이고 시간 적절한 방식으로 수행하는 것을 허용하고, 동시에 결과로 에피다우노루비신의 만족스러운 순도를 생성하는 길이를 가져야 한다.

결국, 단계 c)의 혼합물이 최대 48 h의 시간 동안, 바람직하게는 10 내지 30 h의 시간 동안, 특히 15 내지 25 h 시간 동안 교반되는 것인 본 발명의 방법의 실시양태가 바람직하다. 48 h 초과의 반응 시간은 절차 관점으로부터 유리하지 못하는 것으로 밝혀졌고, 반면에 10 h 미만의 반응 시간 후에, 혼합물의 에피푸도마이신 함량에서의 감소는 불충분한 것으로 밝혀졌다. 48 h의 반응 시간이 초과되지 않는 한, 단계 c)에서 혼합물은 에피푸도마이신의 총 함량이 에피다우노마이신의 총 중량을 기준으로 1 중량% 미만이 될 때까지 교반되는 것인 실시양태가 특히 바람직하다. 혼합물에서 에피푸도마이신의 양은, 예를 들면 RP-18 HPLC와 같은 표준화 크로마토그래피 공정에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서 기술되어 있는 바와 같이, 에피다우노루비신이 정제된다. 이 정제는, 에피푸도마이신의 총 함량이 분석 크로마토그래피에 의해 측정된 에피다우노마이신의 중량을 기준으로 1 중량%의 임계치 미만으로 떨어질 때, 일정 시간으로 수행되는 것이 바람직하다. 더구나, 단계 d)에서 에피다우노루비신의 정제는 수성 추출에 의해 수행되는 것이 바람직하다.

단계 d)에서 에피다우노루비신의 정제 동안, 단계 d)에서 에피다우노루비신의 수성 추출이 알칼리 매질 중에서 수행되는 경우가 유리한 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 d)에서 에피다우노루비신의 수성 추출은 8 내지 10, 바람직하게는 8.5 내지 9.5의 pH 값에서 수행된다. 그 pH 값은, 예를 들면 암모니아에 의해 조정될 수 있으며, 이로써 그 암모니아가 유기 상에서 수성 상으로 에피다우노루비신의 부분 전이를 방지하기 위해서 약 0.5 내지 1.5 중량% NaCl, 예를 들면 약 1 중량% NaCl를 함유하는 경우가 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 소정의 pH 값을 조정하는데 요구되는 암모니아의 양은 달라질 수 있으며, 첨가된 산의 양에 따라 좌우된다. 예를 들면, 요구된 암모니아의 양은 산의 양(g)보다 2.5배일 수 있다.

에피다우노루비신의 고 순도가 에피다우노루비신에서 에피루비신으로의 후속적인 전환에 있어 필수적인데, 이는 수율을 증가시키는 유일한 방식이기 때문이다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 d)에 이어서 또다른 단계 c)가 수행되는데, 단계 e)는 에피다우노루비신의 크로마토그래피 정제이다. 크로마토그래피 정제는 고정 상으로서 실리카 겔(SiO₂)에 의해 수행되는 것이 바람직하고, 반면에 메탄올과 클로로포름의 혼합물이 이동 상으로서 사용되는 것이 바람직하다. 이는 용매가 변경되지 않아야 하고, 이것이 결국 본 발명에 따른 방법의 증가된 효율에 기여한다는 이점을 갖는다.

놀랍게도, 본 발명의 방법에 따라 정제된 에피다우노루비신에 의한 크로마토그래피 컬럼의 로드(load)는 분리 성능의 열화를 결과로 야기하는 일 없이 통상적인 공정에 의해 정제된 에피다우노루비신와 비교하여 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 본 발명에 따른 방법의 또 다른 이점을 나타내는데, 왜냐하면 동일 분리 성능과 조합인 컬럼의 보다 높은 로드가 보다 효과적이고 보다 경제적인 공정 사이클을 허용하기 때문이다. 놀랍게도, 본 발명의 방법에 따라 정제된 에피다우노루비신에 의한 크로마토그래피 컬럼의 로드는 컬럼 매트릭스의 건조 중량을 기준으로 7 중량% 이하로 증가될 수 있고, 반면에 통상적인 공정에서 컬럼의 최대 로드는 약 4 중량%인 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 e)의 에피다우노루비신은 추가 정제 공정, 예를 들어 결정화를 수행한다. 그 결정화는 예를 들어 염산염의 형태로 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법에 따라 정제된 에피다우노루비신의 품질은 단지 하나의 결정화 단계 후에만 매우 높으므로 종래 기술의 통상적인 분리 공정에서 일반적으로 수행된 제2 결정화 단계에 대한 필요성이 없는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 본 방법은

a) 에피다우노루비신, 에피푸도마이신 및 하나 이상의 할로겐 함유 용매, 바람직하게는 클로로포름을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 푸도마이신의 함량은 에피다우노루비신 및 에피푸도마이신의 총중량을 기준으로 1 중량% 초과인 것인 단계,

b) 혼합물의 pH를 5.0 내지 7.5의 범위로 조정하는 단계,

c) 단계 b)의 혼합물을 55℃ 내지 75℃, 바람직하게는 60℃ 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열하는 단계,

d) 에피다우노루비신을, 바람직하게는 수성 추출에 의해 정제하는 단계,

e) 단계 d)의 에피다우노루비신을 크로마토그래피 정제하는 단계

를 포함하고, 단계 a) 및 b)의 혼합물에서 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜의 함량은 혼합물의 총 부피를 기준으로 0.1 내지 4 부피%, 바람직하게는 1.0 내지 3.0 부피%이고, 단계 a)의 혼합물에서 물의 양은 혼합물의 총 부피를 기준으로 최대 1 부피%이다.

또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은

a) 에피다우노루비신, 에피푸도마이신 및 하나 이상의 할로겐 함유 용매, 바람직하게는 클로로포름을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계로서, 푸도마이신의 함량은 에피다우노루비신 및 에피푸도마이신의 총 중량을 기준으로 1 중량% 초과이고, 에피다우노루비신의 농도는 6 내지 13 g/L의 범위에 있는 것인 단계,

b) 혼합물의 pH를 5.0 내지 7.5의 범위로 조정하는 단계,

d) 에피다우노루비신을 수성 추출에 의해 정제하는 단계로서, 추출 혼합물의 pH 값은 8 내지 10, 바람직하게는 8.5 내지 9.5의 범위에 있는 것인 단계,

바람직한 실시양태에서, 개별 공정 단계 a) 내지 e)는 상호 교환 가능하지 않다. 상기 방법은 주어진 바와 같은 순서로 수행되어야 하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 후술하는 실시예에서 보다 상세히 설명할 것이다. 그러나, 실시예는 본 발명의 사상을 어떠한 방식으로 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1:

클로로포름(CHCl₃), 에피다우노루비신 및 에피푸도마이신을 포함하는 혼합물에서 에피다우노마이신의 농도는 증류에 의해 8 내지 12 g/L으로 설정되었다. 상응하는 출발 혼합물은 예를 들어 발효 브로쓰로부터 클로로포름 상을 분리함으로써 얻어질 수 있다. 그 농축 용액(128 L)에 194 g 아세트산(0.15 부피%) 및 2.4 kg 메탄올(2 부피%)을 첨가하였고, 이어서 pH 값을 5.0 내지 7.5의 범위로 조정하였으며, 여기서 부피%로 제시된 양은 그 용액의 총 부피를 기준으로 한다. 결과로 얻어지는 용액을 60℃ 내지 65℃로 가열하고, 그 온도 범위에서 17 h 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 25℃로 냉각하고, 불순물 에피푸도마이신의 함량은 에피다우노루비신의 중량을 기준으로 한 것으로, 분석 HPLC(RP18-HPLC) 및 측정된 피크의 적분에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 2는 비교예로서 작용을 하고, 에피다우노루비신의 통상적인 정제의 결과를 나타내는 것이고, 여기에서는 혼합물을 60℃ 내지 65℃의 온도로 가열하고, 아세트산을 첨가하지 않았다. 에피푸도마이신에 대하여 제시된 백분율은 에피다우노루비신의 양을 기준으로 한 것이다.

실시예	에피푸도마이신(%)
1	0.6
2(비교예)	3.3

표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 보다 높은 순도의 에피다우노루비신은 본 발명에 따른 방법을 이용함으로써 얻을 수 있으며, 이것은 에피푸도마이신의 보다 낮은 함량으로 반영되었다.

또다른 단계에서, 본 발명의 방법에 따른 정제된 에피다우노루비신은 8 내지 9의 pH 값에서 수성 추출 및 후속적인 크로마토그래피 정제에 의해 추가 처리하였다. 컬럼의 상이한 로드를 시험하였다. 크로마토그래피 정제 동안 얻어지는 분획들을 합하고, 에피다우노루비신의 순도 및 에피푸도마이신의 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 컬럼의 로드는 컬럼 매트릭스의 건조 중량에 대한 에피다우노루비신의 중량비에 100%를 곱한 것을 의미한다.

실시예	로드(%)	순도(%)	수율(%)	에피푸도마이신의 함량(%)
3	5.1	91	87	0.3
4	5.8	86	97	0.2
5	7.2	90	97	0.2

표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 심지어는 컬럼의 고 로드에서도, 분리 성능은 단지 비변경된 상태로만 유지되는 것이 아니라 심지어 증가될 수 있었다.

표 3은 pH 값을 조정하는데 사용된 아세트산의 양을 다양하게 한 실험들의 결과를 나타낸 것이다. 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 에피푸도마이신의 함량은 산의 양이 증가됨에 따라 감소되었다. 클로로포름을 용매로서 사용하였다. 혼합물은 각각 1 부피% 메탄올을 함유하였고, 에피푸도마이신의 양을 측정하기 전에 60℃에서 25h 동안 교반하였다. 출발 혼합물에서 에피푸도마이신이 양은 8.7%이었다. 실시예 6은 혼합물에 아세트산을 첨가하지 않은 비교예이었다.

실시예	아세트산(부피%)	에피푸도마이신(%)
6	0	7.7
7	0.1	3.3
8	0.2	1.9
9	0.3	1.3
10	0.5	0.8

표 3에 도시되어 있는 바와 같이, 심지어 클로로포름, 에피다우노루비신, 에피푸도마이신 및 1 부피% 메탄올을 포함하는 혼합물에 0.1 부피%의 아세트산을 첨가하는 것은 60℃의 온도에서 25 h의 반응 시간에서 불순물 에피푸도마이신에서의 현저한 감소를 유발하였다. 따라서, 결과로 얻어지는 에피다우노루비신의 순도는 수고스러운 정제 방법에 기인한 수율 손실을 결과로 초래하는 일 없이 증가할 수 있었다.

상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 종래의 정제 방법과 비교하여 유의적으로 보다 높은 순도의 에피다우노루비신을 유도할 뿐만 아니라 적어도 동일 분리 성능 및 필수적인 공정 단계의 감소, 예컨대 제2 결정화 단계의 불필요성과의 조합인 보다 높은 컬럼 로드에 기인한 정제 공정의 효능 및 경제성에서의 증가를 허용한다.

Claims

에피다우노루비신의 정제 방법으로서,
a) 에피다우노루비신, 에피푸도마이신(epi-feudomycin) 및 하나 이상의 할로겐 함유 용매를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,
b) 혼합물의 pH 값을 5.0 내지 7.5의 범위로 조정하는 단계,
c) 단계 b)의 혼합물을 55℃ 내지 75℃의 범위에 있는 온도로 가열하는 단계, 및
d) 에피다우노루비신을 정제하는 단계
를 포함하고, 단계 a) 및 b)의 혼합물에서 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜의 함량은 혼합물의 총 부피를 기준으로 최대 5 부피%인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항에 있어서, 단계 a)의 혼합물에서 물의 함량은 혼합물의 총 부피를 기준으로 최대 1 부피%인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1 내지 5개의 탄소 원자를 지닌 알콜은 메탄올, 부탄올, 이소프로판올, 에탄올, 프로판올, 펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2,2-디메틸프로판올 및 이소부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에서 에피다우노루비신의 농도는 6 내지 13 g/L인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 할로겐 함유 용매는 염소화 용매 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)에서 pH 값은 하나 이상의 산에 의해 조정되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제6항에 있어서, 산의 양은 혼합물의 총 부피를 기준으로 0.1 부피% 내지 0.3 부피%인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 c)에서 혼합물은 60℃ 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제3항에 있어서, 단계 c)에서 혼합물은 60℃ 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제4항에 있어서, 단계 c)에서 혼합물은 60℃ 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제5항에 있어서, 단계 c)에서 혼합물은 60℃ 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제6항에 있어서, 단계 c)에서 혼합물은 60℃ 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제7항에 있어서, 단계 c)에서 혼합물은 60℃ 내지 65℃의 범위에 있는 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 c)에서 혼합물은 최대 48h의 시간 동안 교반되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 d)에서 에피다우노루비신의 정제는 수성 추출에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제15항에 있어서, 단계 d)에서 에피다우노루비신의 수성 추출은 8 내지 10의 pH 값에서 수행되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 d) 후, 또다른 단계 e)가 추가되고, 상기 단계 e)가 에피다우노루비신의 크로마토그래피 정제인 것을 특징으로 하는 정제 방법.