KR102297963B1 - 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로 탈지미강을 단백질 분해효소로 가수분해한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 함유함으로써, 항산화 효과가 우수하여 화장료 조성물 또는 건강기능식품에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 항산화 효과가 우수한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
피부는 신체 중 가장 큰 기관으로 항상 외부환경과 직접 접하고 있으면서 여러 가지 자극이나 건조한 환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 역할을 하고 있으며, 다른 기관에 비하여 새로운 세포의 생성과 소멸이 활발히 일어난다.
또한, 물리적인 찰과상으로부터 신체를 보호하고, 신체 내부의 수분 손실을 막아주며 태양에서 발생되는 자외선으로부터 보호해줄 뿐만 아니라, 몸의 체온을 조절해주는 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.
이러한 피부는 여러 가지 물리적 요인, 외부환경적 요인, 감염 등으로 인해 피부의 오염과 건조, 트러블, 피부 면역체계 이상 등의 문제가 발생한다.
특히, 현대의 급격한 산업발전에 따라, 대기공해, 수질공해 등의 공해문제가 심각해지고, 주거환경의 개선에 따른 거주공간의 강한 냉난방에 의해 피부의 거칠어짐, 건조, 노화 등과 같이 피부가 외부환경으로부터 큰 영향을 받고 있다.
인간의 피부는 내인성 노화(intrinsic aging)와 광노화에 의해 점차 피부가 얇아지고 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐만 아니라 자외선 노출에 의해 기미와 주근깨가 증가하게 된다. 특히, 내인성 노화는 호르몬 분비가 감소하거나 면역세포의 기능과 활성이 저하됨에 따라 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들면서 발생하는데 이는 활성산소 증가에 따라 급속히 진행된다.
인간은 대사과정에서 끊임없이 활성산소종(Reactive Oxygen Species)을 발생시키며 이는 직·간접적인 노화의 원인물질로 작용한다고 알려져 있다. 피부노화를 방지하기 위해 화장품에는 다양한 항산화제가 사용되고 있는데 대표적인 합성 항산화제로 BHT(butylatedhydroxytoluene), BHA(butylated hydroxyanisole)와 tertiary butylhydroquinone(TBHQ) 등이 있다. 일반적으로 합성 항산화제는 우수한 효과와 낮은 가격으로 인해 폭넓게 사용되고 있지만 경구 또는 피부접촉 시 자체 독성뿐만 아니라 간비대증, 지방변이 및 암을 유발하는 것으로 알려져 사용이 제한받고 있다.
쌀은 밀, 보리, 옥수수와 더불어 전 세계적으로 소비되는 식량작물로서 주로 중국, 인도, 인도네시아 등 아시아 지역에서 생산되며 전 세계 인구 2/3의 해당하는 인구가 주식으로 삼고 있다. 세계 쌀 생산량은 약 5억 260만 톤/년이며 우리나라 쌀 생산량은 429만 톤/년에 이른다. 일반적으로 쌀은 현미에서 미강을 제거한 백미의 형태로 섭취하게 되는데 현미를 백미로 만드는 도정과정에서 부산물로 생산되는 것을 미강이라 한다.
도정 과정에서 생산되는 미강의 양은 전체 쌀 중 약 8~14%를 차지하며 국내에서 약 34~68만 톤/년의 도정 부산물이 발생하게 된다. 이러한 미강 부산물은 퇴비, 가축사료 또는 미강유 제조 등에 일부 이용되지만 대부분 폐기처분 되어지는 실정으로 효율적인 부산물 처리가 이루어지지 못하고 있으므로 부가가치창출을 위한 다양한 활용방안이 필요한 실정이다. 미강은 부산물 임에도 불구하고 3대 영양소인 탄수화물, 단백질, 지방의 함량이 풍부하고 비타민 B1, B2, phenolic acids, thiamine, riboflavin와 niacin 등과 같은 미량 영양소와 phosphorus, potassium, magnesium 등과 같은 미네랄을 함유하고 있으며 항균, 항암 등과 같은 생리활성기능이 있다고 보고되어 있다.
이러한 생리활성 기능은 미강 내 존재하는 페놀 화합물(phenolic compounds)에 의한 것으로 페놀 화합물의 구조는 방향족 환에 한 개 이상의 하이드록시기가 치환된 것으로 일부는 유리형으로 존재하지만 대부분은 페놀하이드록시기(phenolic hydroxyl)로 인하여 단백질 또는 세포벽, 이외에 거대분자들과 결합하는 성질을 가지고 있어 결합상태로 존재한다.
본 발명은 천연물인 미강을 이용하여 항산화능을 가지면서 인체에 무해한 화장품 소재 및 건강기능식품을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 항산화 효과가 우수한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항산화용 화장료 조성물은 탈지미강을 단백질 분해효소로 가수분해한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 탈지미강은 미강을 용매로 처리한 후 원심분리한 침전물일 수 있다.
상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.
상기 혼합용매는 20 내지 99 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액일 수 있다.
상기 단백질 분해효소는 바실러스 나토(Bacillus natto)균의 조효소액일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항산화용 건강기능식품은 탈지미강을 단백질 분해효소로 가수분해한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 단백질 분해효소는 바실러스 나토(Bacillus natto)균의 조효소액일 수 있다.
본 발명의 탈지미강 효소분해물을 포함하는 조성물은 독성이 없으며, 총 폴리페놀의 함량 및 DPPH 라디칼 소거능이 우수하다.
도 1은 본 발명의 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 5에 따라 제조된 탈지미강 가수분해물의 가수분해능을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 이용함으로써 단백질 분자량을 비교한 것이다.
본 발명은 항산화 효과가 우수한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 화장료 조성물은 탈지미강을 단백질 분해효소로 가수분해한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함한다.
상기 미강(米糠 , rice bran)은 벼에서 왕겨를 뽑고 난 다음 현미를 백미로 도정하는 공정에서 분리되는 고운 속겨를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 탈지미강은 일반 미강으로부터 지질을 추출하고 잔류한 것으로서, 건조된 미강과 용매를 혼합하여 지질을 추출한 후 지질이 추출된 미강을 8,000 내지 15,000 xg, 바람직하게는 9,000 내지 11,000 xg; 1 내지 10 ℃, 바람직하게는 3 내지 5 ℃의 조건에서 10 내지 50분, 바람직하게는 20 내지 30분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물을 수거함으로써 탈지된 미강을 수득한다. 본 발명과 같이 탈지미강을 원재료로 사용하지 않고 탈지되지 않은 미강을 사용하는 경우에는 지방산화에 의해 자유라디칼이 생성되고 이는 총 폴리페놀의 함량 및 DPPH 라디칼 소거능이 저하될 뿐만 아니라 화장료 조성물로 사용 시 산폐취를 발생시키고 피부 트러블이 발생할 수 있으며, 식품으로 장기 보용 시 활성산소에 의한 발암물질 생성의 우려가 있을 수 있다.
미강을 탈지 시 원심분리 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 지질이 완전히 탈지된 미강을 수득할 수 없다.
상기 탈지미강을 제조 시 사용되는 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 혼합용매로는 20 내지 99 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액을 들 수 있으며, 바람직하게는 우수한 항산화 효과를 위하여 80 내지 99.5 부피%의 에탄올 수용액을 들 수 있다.
상기 탈지미강을 가수분해시키는 단백질 분해효소는 탈지미강을 효소적으로 가수분해하여 항산화 효과를 향상시킬 수 있는 단백질 분해효소라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 청국장으로부터 분리한 바실러스 나토(Bacillus natto) 균주를 배양한 후 원심분리로 얻은 상등액(조효소액)일 수 있다.
본 발명의 가수분해는 상기 탈지미강 100 중량부에 상기 바실러스 나토(Bacillus natto)균에서 유래된 단백질 분해효소 1 내지 10 중량부, 바람직하게는 1 내지 5 중량부; 및 0.1 내지 0.5 M의 인산나트륨 완충액(sodium phosphate buffer) 1 내지 20 중량부, 바람직하게는 1 내지 10 중량부;를 첨가하여 pH 6-7, 30 내지 80 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃하에서 5 내지 15시간, 7 내지 10시간 동안 효소반응을 수행하여 펩타이드 또는 아미노산을 생산한다.
상기 탈지미강과 바실러스 나토(Bacillus natto)균에서 유래된 단백질 분해효소를 혼합 시 단백질 분해효소의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 효소반응이 수행되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 부피증가에 따른 부산물과 폐수가 다량 발생할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 탈지미강 효소분해물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 탈지미강 효소분해물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 탈지미강 효소분해물은 천연물로서 과량 사용하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 탈지미강 효소분해물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기의 화장료 조성물과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있으며, 이러한 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수, 수용성 비타민, 지용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스 등을 들 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상 사용되는 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 안료 및 천연향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 미스트, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 자외선 차단크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 마스크팩, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도우 등과 같은 화장품류와 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저 등이 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
건강기능식품이란, 탈지미강 효소분해물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 탈지미강 효소분해물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 바실러스 나토(
Bacillus natto
) 유래 단백질 분해효소
탈지미강
건조 미강((주) 삼정농산, 전라남도 장성군) 1 g과 99.5% 주정(E0235; Samchun, Korea) 10 mL를 혼합한 후 진탕배양기(KMC-1205SW1; Vision, Korea)에서 50 ℃로 24시간 동안 지질추출을 수행하여 탈지하였다. 이후 탈지된 미강을 10,000Xg, 4 ℃의 조건에서 20분간 원심분리(CT15R; Hitachi, Japan)하여 상등액을 제거하고 침전물을 회수한 후 이를 60 ℃ 강제순화 건조기(SHDO-54FG; SH Science, Korea)에서 건조하였다.
단백질 분해효소 생산
Yuzo takahashi lab(Japan)에서 구입한 청국장 종균 바실러스 나토(B. natto)를 YP 배지(yeast extract 1%, peptone 2%)에 접종하여 진탕배양기에서 37 ℃, 200 rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 YP 고체배지에 평판도말하여 37 ℃에서 24시간 배양하고, 효소생산을 위한 액체배양을 위해 단일 colony를 확보하고 50 mL YP 배지에 접종하여 37 ℃와 200 rpm에서 24시간 배양하였다. 액체배양에 단백질 분해효소 생산량 증대를 위해 YP 배지 기본성분 이외에 탄소원인 fructose(2.1% w/v)와 질소원인 casein(2.25% w/v)을 추가하여 배양하였다. 배양 종료 후 원심분리(10,000Xg, 4 ℃, 20분)하여 얻은 상등액을 미강 단백질 분해를 위한 조효소액(단백질 분해효소)으로 사용하였다.
가수분해
상기 탈지미강 1 g과 0.2 M sodium phosphate buffer 30 mL를 혼합하고 바실러스 나토 유래의 조효소액 30 mL를 혼합하여 진탕배양기에서 pH 7, 반응온도 50 ℃로 8시간 동안 150 rpm에서 교반하여 가수분해를 진행함으로써 펩타이드 또는 아미노산을 생산하였다. 가수분해 종료 후 -5 ℃ 부동액에 침지하여 효소반응을 정지시킨 후 10,000Xg 속도로 4 ℃에서 20분간 원심분리하여 얻은 상등액(탈지미강 효소분해물)을 회수하였다.
비교예 1. 알칼라아제(Alcalase) 단백질 분해효소
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 나토(Bacillus natto) 유래 단백질 분해효소 대신 알칼라아제(Alcalase, Novozyme, Korea) 단백질 분해효소 0.1 mL를 사용하여 탈지미강 효소분해물을 수득하였다.
비교예 2. 프로타맥스(Protamax) 단백질 분해효소
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 나토(Bacillus natto) 유래 단백질 분해효소 대신 프로타맥스(Protamax) 단백질 분해효소를 사용하여 탈지미강 효소분해물을 수득하였다.
비교예 3. 뉴트라제(Neutrase) 단백질 분해효소
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 나토(Bacillus natto) 유래 단백질 분해효소 대신 뉴트라제(Neutrase) 단백질 분해효소를 사용하여 탈지미강 효소분해물을 수득하였다.
비교예 4. 플라보르자임(Flavourzyme) 단백질 분해효소
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 나토(Bacillus natto) 유래 단백질 분해효소 대신 플라보르자임(Flavourzyme) 단백질 분해효소를 사용하여 탈지미강 효소분해물을 수득하였다.
비교예 5. 6M HCl
상기 실시예 1의 탈지 미강 1 g과 6M HCl 30 mL을 혼합한 후 진탕배양기에서 50 ℃ 조건으로 8시간 동안 가수분해한 다음 10,000Xg, 4 ℃에서 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 회수하고 1M NaOH을 이용하여 중화하여 탈지미강 가수분해물을 수득하였다.
<시험예>
시험예 1. 일반성분 분석
주요성분 함량 분석은 AOAC 방법에 따라 일반성분 분석을 수행하였다. 조단백질 함량은 Kjeldahl법을 이용하여 질소를 정량 한 후 질소계수(6.25)를 적용하여 계산하였으며 조지방은 soxhlet 추출장치로 ether를 용매로 사용하여 지방을 추출하고 추출액을 상온 감압하여 잔류물의 무게 변화를 확인하여 측정하였다. 조회분은 550 ℃ 직접 회화법으로 측정하였으며 회화 후 도가니 무게를 측정하여 조회분 함량을 계산하였다.
| 구분(%) | 탈지 전 미강 | 탈지 후 미강 |
| 조단백질 | 17.6 | 26.2 |
| 조지방 | 20.4 | 1.77 |
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 탈지된 미상은 탈지 전에 비하여 조단백질의 함량이 증가한 것을 확인하였다.
시험예
2. 단백질 분해효소의 활성 측정
단백질 분해효소를 이용한 탈지미강 가수분해를 통한 펩타이드 생산에 앞서 각 효소의 단백질 가수분해능을 확인하기 위해 효소활성을 측정하였다.
단백질 분해효소 활성 측정은 Hagihara의 방법을 변형하여 사용하였다. B. natto 유래 조효소액 0.25 mL에 0.05 M sodium phosphate buffer, 기질(0.6% Hammarstein casein)을 첨가하여 37 ℃에서 10분간 반응시킨 후 0.44 M trichloroacetic acid 0.25 ml 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후 원심분리하여 얻은 상등액 0.4 mL에 0.55 M Na2CO3 용액 1 mL과 0.6 N folin & ciocalteus' reagent 용액 0.2 mL 을 넣어 37 ℃에서 30분간 발색시켜 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성 단위는 37 ℃에서 효소액 1 mL이 1분 동안 1 μg의 tyroine을 유리시키는 것을 1 unit으로 하여 unit/mL로 표현하였다.
비교예 1 내지 4에 따라 상업효소인 Alcalase, Protamex, Neutrase와 Flavourzyme를 이용한 미강 단백질 분해에 있어 첨가하는 효소량은 Noh등이 제시한 바와 같이 buffer 부피 대비 0.3-0.6%(w/v)로 희석하여 효소분해를 진행하는데, 본 실험에서는 탈지미강과 buffer의 고액비를 1/20 (w/v)으로 하고 효소 첨가량을 탈지미강의 10%(v/w)로 첨가하여 효소원액을 200배 희석하여 사용하였다.
| 구분(unit/ml) | 단백질 분해효소 활성 |
| B. natto(실시예 1) | 255.3±7.7 |
| Alcalase(비교예 1) | 318.0±12.3 |
| Protamex(비교예 2) | 217.6±9.8 |
| Neutrase(비교예 3) | 183.2±5.0 |
| Flavourzyme(비교예 4) | 87.9±2.9 |
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 단백질 분해효소의 활성은 Alcalase가 가장 높았으며, B. natto로부터 생산된 조효소액의 단백질 분해 활성은 Alcalase의 활성보다는 낮지만 다른 상업효소에 비해서는 현저히 높은 것을 확인하였다.
시험예 3. 탈지미강 효소분해물의 전기영동 측정
전기영동은 Laemmli의 방법에 따라 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 이용하였으며 탈지미강 효소분해물은 sample buffer(pH 6.8 0.25 M Tris-HCl, 10% SDS, 4% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.05% bromo-phenol blue)처리하여 사용하였다. 전기영동은 25 mA로 1.2 내지 1.5시간 동안 진행하였다.
도 1은 본 발명의 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 5에 따라 제조된 탈지미강 가수분해물의 가수분해능을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 이용함으로써 단백질 분자량을 비교한 것이다. 대조군은 탈지미강을 0.2 M sodium phosphate buffer로 열수추출하여 단백질을 추출한 추출물이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 비교예 5의 탈지미강 가수분해물은 탈지미강 단백질이 모두 10 kDa 이하의 펩타이드로 분해된 것을 확인하였다. 또한, 비교예 1의 1%(v/v) Alcalase를 이용한 탈지미강 효소분물은 10, 15 및 35 kDa 부근에서 3개의 band가 위치한 것을 확인하였다.
또한, 실시예 1의 B. natto 유래 조효소액 이용한 탈지미강 효소분물은 10, 15 및 35 kDa부근에 band가 확인되어 비교예 1(Alcalase)과 유사한 단백질 분해 경향을 보이지만, 확인된 30-35 kDa 분자량의 펩타이드가 B. natto 유래 조효소액으로 배양 시 효소활성 증대를 위해 배지에 추가된 casein으로 확인되어 B. natto 유래 조효소액을 사용할 경우 비교예 1(Alcalase)에서 확인된 35-40 kDa의 펩타이드의 분해가 가능한 것으로 보인다.
즉, B. natto 유래 조효소액을 이용한 탈지미강 효소분해물에 있어 상업효소인 Alcalase와 동등 또는 우수한 분해능을 보여 미강 단백질 분해에 있어 B. natto 유래 조효소액이 상업효소를 대체 가능하다고 사료된다.
시험예 4. 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법을 변형하여 측정하였으며 Folin-Ciocalteu(FC)시약의 phosphomolybdic 및 phosphotungstic acid complex의 전자가 미강 단백질 가수분해물의 페놀성 물질에 의해 환원되어 발생하는 몰리브덴 청색발색 반응을 원리로 하였다. 탈지미강 효소분해물 0.14 mL에 0.2 N FC용액을 첨가하여 10분간 방치 후 7.5% Na2CO3 0.56 mL을 첨가하여 1시간 동안 반응시켜 흡광도 값을 756 nm에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 5, 10, 25와 50배 희석하여 사용했으며, 단위는 작성한 gallic acid 검량선과 비교하여 mg gallic acid equivalent(GAE)/g dry weight(DW)로 표시하였다.
대조군은 탈지미강을 0.2 M sodium phosphate buffer로 열수추출하여 단백질을 추출한 추출물이다.
| 구분(mg GAE/g DW) | 총 폴리페놀 함량 |
| 대조군 | 1.18±0.1 |
| 실시예 1 | 14.51±0.9 |
| 비교예 1 | 8.32±0.5 |
| 비교예 5 | 8.20±0.5 |
위 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 탈지미강 효소분해물은 1% Alcalase로 가수분해한 비교예 1, 염산으로 가수분해한 비교예 5 및 대조군에 비하여 총 폴리페놀의 함량이 높은 것을 확인하였다. 폴리페놀은 항산화 효과가 우수하므로, 실시예 1의 탈지미강 효소분해물이 다른 군에 비하여 항산화 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
구체적으로, 실시예 1의 탈지미강 효소분해물은 14.5 mg GAE/g DW의 폴리페놀을 생산하였는데, 이는 대조군에 비해 약 12.3배 증가한 결과이며 비교예 1 및 2에 비해서는 약 1.7배 높은 생산농도이다.
이처럼 탈지미강의 단백질 가수분해 정도의 차이에 따라 총 폴리페놀 함량이 증가하는 것은 페놀하이드록시(phenolic hydroxyl)기의 구조적 특성상으로 단백질과 전분 등의 거대분자들과 결합하여 존재하는 결합형 폴리페놀이 단백질 가수분해 효소에 의해 저분자화가 이루어져 결합형 폴리페놀에서 유리형 폴리페놀로의 전환으로 인해 총 폴리페놀의 함량이 증가한 것이다.
시험예 5. DPPH radical 소거활성
전자공여능은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였으며 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)에 대한 전자공여능 측정을 통해 시료의 환원력을 측정하였다. 미강 단백질 가수분해물 0.25 mL에 DPPH 용액 1.25 mL을 가하여 암실에서 20분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도(AA)를 측정하였으며, 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도(AB)를 기준으로 하기 [수학식 1]에 따라 DPPH radical 소거활성을 백분율로 표시하였다.
[수학식 1]
| 구분(%) | DPPH 라디칼 소거능 |
| 대조군 | 3.65±0.2 |
| 실시예 1 | 50.06±3.6 |
| 비교예 1 | 31.21±1.0 |
| 비교예 5 | 30.72±1.8 |
위 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 탈지미강 효소분해물은 1% Alcalase로 가수분해한 비교예 1, 염산으로 가수분해한 비교예 5 및 대조군에 비하여 DPPH radical 소거능이 우수한 것을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1의 탈지미강 효소분해물은 50.06%의 DPPH radical 소거능을 보였는데, 이는 대조군에 비해 약 16배 증가한 결과이며 비교예 1 및 2에 비해서는 약 1.6배 높은 생산농도이다.
항산화 활성의 지표인 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, 총 폴리페놀 함량과 비례 관계를 확인하였는데, 이는 DPPH radical에 전자공여능을 부여하는 단백질을 포함한 세포벽 구조물의 분해에 의해 총 폴리페놀의 함량이 증가한 원인과 함께 저분자 peptide의 N-말단에 Met과 His 결합 또는 C-말단에 Trp과 Try 결합 시 항산화 기능성을 나타내는 구조적 특성으로 인하여 단백질 가수분해 진행에 따라 DPPH radical 소거능이 증가하였다고 예상 할 수 있다.
총 폴리페놀 함량과 DPPH radical 소거능 비교를 통해 B. natto 유래 단백질 분해효소가 상업효소 대비 탈지미강 단백질의 분해에 효과적이며, 단백질 분해를 통한 펩타이드 생산으로 항산화 활성을 증진시킨다는 결과를 확인하여 기능성 물질 생산에 B. natto 유래 단백질 분해효소를 이용하여 기존 상업효소 대체가 가능함을 확인하였다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 효소분해물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 2. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 효소분해물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
본 발명을 적용하기에 적합한 화장료 조성물의 제조예를 제시하기로 한다.
제조예 3: 화장수
실시예 1의 탈지미강 효소분해물을 포함하는 화장료 중 화장수의 제조예는 하기 표 5와 같다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 효소분해물 | 5.0 |
| 글리세린 | 6.0 |
| 1,3-부틸렌글라이콜 | 3.0 |
| 피이지1500 | 1.0 |
| 알란토인 | 0.1 |
| DL-판테놀 | 0.3 |
| EDTA-2Na | 0.02 |
| 벤조페논-9 | 0.04 |
| 소듐하이알루로네이트 | 5.0 |
| 에탄올 | 10.0 |
| 폴리소르베이트20 | 0.2 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제조예
4: 로션
실시예 1의 탈지미강 효소분해물을 포함하는 화장료 중 로션의 제조예는 하기 표 6과 같다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 효소분해물 | 3.0 |
| 프로필렌글리콜 | 6.0 |
| 글리세린 | 4.0 |
| 트리에탄올아민 | 1.2 |
| 토코페릴아세테이트 | 3.0 |
| 유동 파라핀 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 3.0 |
| 마카다미너트오일 | 2.0 |
| 폴리소르베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄세스퀴올레이트 | 1.0 |
| 카르복시비닐폴리머 | 1.0 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제조예
5: 영양 크림
실시예 1의 탈지미강 효소분해물을 포함하는 화장료 중 영양 크림의 제조예는 하기 표 7과 같다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 효소분해물 | 1.0 |
| 친유형 모노스테아린산글리세린 | 1.5 |
| 세테아릴 알코올 | 1.5 |
| 스테아린산 | 1.0 |
| 폴리소르베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.6 |
| 이소스테아릴이소스테아레이트 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 광물유 | 35.0 |
| 디메치콘 | 0.5 |
| 하이드록시에칠셀룰로오스 | 0.12 |
| 글리세린 | 6.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.7 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제조예
6: 에센스
실시예 1의 탈지미강 효소분해물을 포함하는 화장료 중 에센스의 제조예는 하기 표 8과 같다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 효소분해물 | 1.5 |
| 글리세린 | 10.0 |
| 베타인 | 5.0 |
| PEG 1500 | 2.0 |
| 알란토인 | 0.1 |
| DL-판테놀 | 0.3 |
| EDTA-2Na | 0.02 |
| 벤조페논-9 | 0.04 |
| 하이드록시에칠셀룰로오스 | 0.1 |
| 소듐하이알루로네이트 | 8.0 |
| 카르복시비닐폴리머 | 0.2 |
| 트리에탄올아민 | 0.18 |
| 옥틸도데칸올 | 0.3 |
| 옥틸도데세스-16 | 0.4 |
| 에탄올 | 6.0 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제조예
7: 마스크
팩용
유액
실시예 1의 탈지미강 효소분해물을 포함하는 화장료 중 마스크 팩용 유액의 제조예는 하기 표 9와 같다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 효소분해물 | 1.0 |
| 폴리비닐알코올 | 15.0 |
| 셀룰로오스 검 | 0.15 |
| 글리세린 | 3.0 |
| PEG 1500 | 2.0 |
| 사이클로덱스트린 | 0.15 |
| DL-판테놀 | 0.4 |
| 알란토인 | 0.1 |
| 글리시리진산모노암모늄 | 0.3 |
| 니코틴아마이드 | 0.5 |
| 에탄올 | 6.0 |
| PEG 40 경화 피마자유 | 0.3 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
Claims (7)
- 탈지미강을 단백질 분해효소로 가수분해한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함하며,
상기 단백질 분해효소는 바실러스 나토(Bacillus natto)균의 조효소액인 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 탈지미강은 미강을 용매로 처리한 후 원심분리한 침전물인 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 혼합용매는 20 내지 99 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액인 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물.
- 삭제
- 탈지미강을 단백질 분해효소로 가수분해한 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 포함하며,
상기 단백질 분해효소는 바실러스 나토(Bacillus natto)균의 조효소액인 것을 특징으로 하는 항산화용 건강기능식품.
- 삭제
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