KR20180088148A - 미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 천연물에서 유래한 미강 효소 추출물을 이용하여 질병의 치료 및 예방에 기여할 수 있는 항산화용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 이를 위해 항산화용 조성물은 미강 효소 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 천연물에서 유래한 미강 효소 추출물을 이용하여 질병의 치료 및 예방에 기여할 수 있는 항산화용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
미강(rice bran)이란 현미에서 정백미로 도정하는 과정에서 생기는 과피(pericarp), 종피(seed caot) 및 호분층(aleurone layer) 등과 배아(embryo)의 일부가 포함된 분쇄혼합물을 말하며 현미의 약 8%정도를 차지한다(Kim, 2003). 현미의 거친 성질을 나타내는 미강은 도정과정 중 부산물로서 연간 약 40만톤이나 생산되지만 소량만이 미강유나 사료 제조 등에 사용되고 나머지는 폐기되고 있다. 근래 많은 연구에서 도정과정에서 버려지는 미강의 영양소 및 유효성분 등에 대한 효능이 규명되고 산업적인 이용가치가 높은 것으로 생각되어 미강에 대한 재고찰이 이루어지고 있다.
미강의 구성성분은 벼의 품종, 도정 방법 등에 따라 다르나, 미강에는 수분 10.5%, 탄수화물 48.26%, 조지방 17.43%, 조단백질 15.1%, 조회분 8.8%가 함유된 것으로 분석되었고, 지방산의 80% 이상이 올레산(oleic acid)과 리놀레산(linoleic acid) 등의 불포화지방산으로 나타났다(Choi et al., 2010). 그 밖에도 비타민 A를 비롯하여 B, B6, 철분 및 인 등 다양한 영양소들이 함유되어 있다. 따라서 미강은 정백미의 부산물이지만 영양에 관해서는 상당히 우수한 소재임이 밝혀졌다(Choi et al., 2010; Rukmini & Raghuram, 1991).
현대사회로 접어들면서 인간의 수명이 증가됨에 따라 건강에 대한 관심이 높아지면서 우리 몸의 노화억제와 각종 성인병 발생의 원인 물질로 작용하는 활성산소의 제거에 집중되고 있는데, 생체 내 노화의 주요 요인으로 인지되고 있는 활성산소가 체내에 유입된 산소로부터 생성되며, 미토콘드리아 산소 대사의 약 2% 정도가 유리 라디칼을 형성하기 때문이다(Kirkinezos & Moraes, 2001). 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 세포 내 기관의 정상적인 대사 및 세포질 내 일부 효소들에 의하여 자연적으로 생성되며, 세포 내에 적당량이 존재할 경우 여러 가지 세포반응을 조절할 수 있는 신호분자가 된다(Valko et al., 2007). 하지만 과량으로 존재할 경우 생체에 치명적인 산소독성을 일으키며, 세포막 분해, 단백질 분해, 지질산화, DNA 변성 등을 초래하여 세포의 기능 장애를 유발하고 암을 비롯한 뇌졸중, 파킨슨 병 등의 뇌질환과 심장질환, 동맥경화, 염증, 노화, 자가면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다(Jung et al., 2012; Valko et al., 2007). 그러므로 활성 산소를 방어하는 항산화 물질이 이러한 질병의 치료 및 예방 가능성 때문에 주목 받고 있으며, 그 중에서도 천연물에서 추출한 천연 항산화제에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 질병을 치료 및 예방하기 위한 미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.
상기 목적은, 미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물에 의해 달성될 수 있다.
이때, 미강 효소 추출물은, 미강과 셀룰라아제(Cellulase)를 혼합하여 추출한 추출물일 수 있고, 또는 미강과 트립신(Trypsin)을 혼합하여 추출한 추출물일 수 있다.
또한, 상기 목적은, 미강과 증류수를 혼합하는 제1단계; 미강이 혼합된 증류수에 효소를 첨가하여 혼합하는 제2단계; 효소를 불활성화 시키기 위하여 가열하는 제3단계; 및 미강 및 효소가 혼합된 증류수를 여과하여 미강 효소 추출물을 추출하는 제4단계;를 포함하는 항산화용 조성물 제조방법에 의해 달성될 수 있다.
이때, 제2단계에서 첨가하는 효소는, 셀룰라아제(Cellulase)일 수 있고, 셀룰라아제(Cellulase)와 미강은 1 : 80~120의 중량비로 혼합할 수 있으며, 제2단계는 pH 4.0~5.0, 45~55℃의 온도에서 수행될 수 있다.
또한, 제2단계에서 첨가하는 효소는, 트립신(Trypsin)일 수 있고, 트립신(Trypsin)과 미강은 1 : 80~120의 중량비로 혼합할 수 있으며, 제2단계는 pH 7.0~8.0, 35~40℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 천연물인 미강으로부터 효소를 이용하여 추출한 미강 효소 추출물을 포함함으로써 항산화 효과를 가진다.
또한, 미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 다양한 건강식품 및/또는 건강보조식품에 첨가함으로써 항산화 효과를 가지는 기능성 식품을 제공할 수 있는 효과를 가진다.
다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 미강 효소 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 미강 효소 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 미강 효소 추출물의 과산화수소(Hydrogen peroxide) 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 미강 효소 추출물의 환원력(Reducing power)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 미강 효소 추출물의 ORAC 값(value)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 미강 효소 추출물의 세포독성을 측정한 그래프이다.
도 7은 미강 효소 추출물의 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 미강 효소 추출물의 산화적 스트레스에 대한 ROS 감소량을 측정한 그래프이다.
도 2는 미강 효소 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 미강 효소 추출물의 과산화수소(Hydrogen peroxide) 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 미강 효소 추출물의 환원력(Reducing power)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 미강 효소 추출물의 ORAC 값(value)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 미강 효소 추출물의 세포독성을 측정한 그래프이다.
도 7은 미강 효소 추출물의 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 미강 효소 추출물의 산화적 스트레스에 대한 ROS 감소량을 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.
도면에서 제안된 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다. 그리고, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에서 기술한 "부"란, 특정 기능을 수행하는 하나의 단위 또는 블록을 의미한다.
각 단계들에 있어 식별부호(제1, 제2, 등)는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항산화용 조성물은 미강 효소 추출물을 포함한다. 본 발명은 천연물인 미강으로부터 최적의 효소를 이용하여 추출한 미강 효소 추출물을 포함함으로써 활성산소 종 생성 억제효과 등 항산화 효과를 가지고, 인체에 부작용을 발생시키지 않는 등의 효과를 가진다. 나아가, 미강 효소 추출물을 다양한 건강식품 및/또는 건강보조식품에 첨가하여 용이하게 섭취할 수 있는 등의 효과를 가진다. 여기에서, 미강 효소 추출물이란, 미강과 효소를 혼합하여 추출한 추출물을 말한다.
일 실시예에 있어서, 미강 효소 추출물은 미강과 셀룰라아제(Cellulase)를 혼합하여 추출한 추출물일 수 있다. 구체적으로, 증류수에 미강 및 셀룰라아제를 넣고 혼합하여 반응시킨 후, 셀룰라아제의 불활성화를 위하여 가열하고, 이어서 이를 여과함으로써 미강 효소 추출물을 수득할 수 있다. 이때, 수득률의 향상을 위하여 셀룰라아제와 미강은 1 : 80~120의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, pH 4.0~5.0, 45~55℃의 조건에서 미강과 셀룰라아제를 혼합하여 추출하는 것이 바람직하다.
일 실시예에 있어서, 미강 효소 추출물은 미강과 트립신(Trypsin)을 혼합하여 추출한 추출물일 수 있다. 구체적으로, 증류수에 미강 및 트립신을 넣고 혼합하여 반응시킨 후, 트립신의 불활성화를 위하여 가열하고, 이어서 이를 여과함으로써 미강 효소 추출물을 수득할 수 있다. 이때, 수득률의 향상을 위하여 트립신과 미강은 1 : 80~120의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, pH 7.0~8.0, 35~45℃의 조건에서 미강과 트립신을 혼합하여 추출하는 것이 바람직하다.
다음으로, 미강 효소 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 제조방법에 대해 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항산화용 조성물 제조방법은 미강과 증류수를 혼합하는 제1단계; 미강이 혼합된 증류수에 효소를 첨가하여 혼합하는 제2단계; 효소를 불활성화 시키기 위하여 가열하는 제3단계; 및 미강 및 효소가 혼합된 증류수를 여과하여 미강 추출물을 추출하는 제4단계;를 포함한다. 본 발명은 천연물인 미강으로부터 최적의 효소를 이용하여 추출한 미강 효소 추출물을 포함함으로써 활성산소 종 생성 억제효과 등 항산화 효과를 가지고, 인체에 부작용을 발생시키지 않는 등의 효과를 가진다. 나아가, 미강 효소 추출물을 다양한 건강식품 및/또는 건강보조식품에 첨가하여 용이하게 섭취할 수 있는 등의 효과를 가진다.
제1단계는, 미강과 증류수를 혼합하는 단계로, 미강 1 중량부에 대하여 증류수는 45~55 중량부를 혼합하는 것이 바람직하다.
제2단계는, 미강이 혼합된 증류수에 효소를 첨가하여 혼합하는 단계로, 이때, 첨가하는 효소는 셀룰라아제(Cellulase)일 수 있다. 수득률의 향상을 위하여 셀룰라아제와 미강은 1 : 80~120 중량비로 혼합하는 것이 바람직하고, pH는 4.0~5.0, 온도는 45~55℃인 조건에서 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 제2단계에서 첨가하는 효소는 트립신(Trypsin)일 수 있다. 이때, 수득률의 향상을 위하여 트립신과 미강은 1 : 80~120 중량비로 혼합하는 것이 바람직하고, pH는 7.0~8.0, 온도는 35~40℃인 조건에서 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제3단계는, 효소를 불활성화시키기 위하여 가열하는 단계로, 미강 및 효소가 첨가된 증류수를 100℃까지 가열하는 것이 바람직하고, 반응시간은 10분 정도인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제4단계는, 미강 및 효소가 혼합된 증류수를 여과하여 미강 효소 추출물을 추출하는 단계로, 여과는 여과지(Whatman No.6) 등 공지의 다양한 도구를 이용하여 여과할 수 있다.
이하, 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
재료준비
미강은 여수 시장에서 구입하였고, 미강 효소 추출물을 제조하기 위한 탄수화물 가수분해 효소인 셀룰라아제는 ㈜바이오스(부산)에서 구입한 셀루클래스트(Celluclast)를 사용하였으며, 단백질 가수분해 효소인 트립신(Trypsin)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
또한, 실험예에 사용된 시약(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), gallic acid, Folin-Ciocalteau reagent, hydrogen peroxide, 2,2-Azobis(2-methylpropion-amidine) dihydrochloride(AAPH))은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 그 외의 모든 분석시약은 특급 또는 HPLC급 시약을 사용하였다.
미강 효소 추출물 제조
미강으로부터 셀루클래스트(Celluclast)와 트립신(Trypsin) 효소 추출물을 제조하기 위하여 미강 1 g과 증류수 50 ml를 혼합한 뒤, 효소를 섞어(1 : 100의 효소 : 기질(미강) 중량비) 각각의 효소 최적 조건(Celluclast : pH 4.5, 50℃, Trypsin : pH 7.0, 37℃)에서 24시간 반응시켰다. 24시간 반응 후, 효소의 불활성화를 위해 100℃에서 10분간 반응시켜 이를 여과지(Whatman No.6)로 여과하였고, 동결건조 시킨 후 영하 20℃에서 저장하였다. 셀루클래스트를 이용하여 추출한 미강 효소 추출물을 실시예 1(Celluclast), 트립신을 이용하여 추출한 미강 효소 추출물을 실시예 2(Trypsin)로 하였다.
[실험예 1 : 미강 일반성분 분석]
미강의 일반성분은 공인분석화학자협회(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)의 기준에 준하여 분석하였다. 즉 수분함량은 105℃ 상압건조법, 회분함량은 550℃ 직접회화법을 이용하여 분석하였으며, 조단백질은 Kjeldahl법을 이용한 질소정량법, 조지방은 Soxhlet법에 따라 성분 함량을 측정하였다.
미강의 일반성분 분석 결과는 하기 표 1과 같이 탄수화물이 34.34%로 가장 높은 함량을 차지하였고, 지방이 21.25%, 수분이 19.93%, 단백질이 15.01%, 회분이 9.47% 순서로 높은 함량을 나타내었다.
[표 1]
[실험예 2 : 미강 효소 추출물의 수율 및 일반 성분 분석]
실시예 1(Celluclast) 및 실시예 2(Trypsin)의 수율은 여과한 후, 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
[수학식 1]
수율(%) = (추출 후 시료 무게 / 건조 시료 무게) x 100
또한, 실시예 1(Celluclast) 및 실시예 2(Trypsin)의 단백질, 탄수화물 및 페놀 성분을 측정하였다.
단백질 함량
미강 효소 추출물의 단백질 함량은 Lowry 등(1951)의 방법을 이용하였으며, 각 시험관에 시료 용액 1㎖와 100㎕ 2N NaOH를 혼합하여 100℃에서 10분간 가수분해시킨 후, 1㎖의 Lowry reagent를 넣고 암실에서 10분간 반응시켰다. 그 후, 0.1㎖ Folin-Ciocalteau reagent를 첨가하여 30분간 암실에서 반응시키고 microplate reader(Molecular Devices, USA, CA)를 이용하여 660nm에서 흡광도를 측정하였다. Bovine serum albumin(BSA)를 이용하여 표준 검량곡선을 작성하였고, 시료 내에 포함되어 있는 단백질의 함량을 계산하였다.
탄수화물 함량
미강 효소 추출물의 탄수화물 함량은 시험관에 1㎖시료 용액과 25㎕ 80% Phenol 시약, 2.5㎖ 황산을 혼합하여 상온에서 30분간 반응시키고 microplate reader를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. Glucose를 이용하여 표준 검량곡선을 작성하였고, 시료 내에 포함된 탄수화물의 함량을 계산하였다.
페놀 함량
미강 효소 추출물의 페놀 함량은 시험관에 40㎕ 시료 용액과 200㎕ Folin-Ciocalteau reagent, 증류수 1160㎕를 혼합하였다. 그런 다음 5분 이내 600㎕의 20% sodium carbonate를 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 반응시키고 microplate reader를 이용하여 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 이용하여 표준 검량곡선을 작성하였고, 미강 효소 추출물 내에 포함되어 있는 phenol의 함량을 계산하였다.
미강 효소 추출물에 대한 수율과 일반성분 측정 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
실시예 1(Celluclast)과 실시예 2(Trypsin)의 수율은 각각 30.4%, 26.8%로 실시예 1이 실시예 2보다 높은 수율을 나타내었다. 또한, 미강 효소 추출물의 일반성분 결과 단백질 함량은 Trypsin 추출물(실시예 2)이 37.18%로 Celluclast 추출물(실시예 1)보다 높은 단백질 함량을 나타내었으며, 탄수화물 및 페놀 함량은 Celluclast 추출물(실시예 1)이 각각 29.68%, 1.54%로 Trypsin 추출물(실시예 2)보다 높은 함량을 나타내었다.
[실험예 3 : 실시예의 항산화 활성 측정]
DPPH 라디칼 소거능 측정
DPPH radical 소거능은 Blois(1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.1 mL에 0.15 mM DPPH 용액 0.1 mL를 넣고 혼합하여 실온에서 30분간 방치시킨 후 microplate reader를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조구는 시료 대신에 증류수를 가하여 같은 방법으로 측정하였다.
DPPH 소거활성 측정은 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유 라디칼로서 항산화제, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 탈색되는 것을 이용하는 실험이다. 미강 효소 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 측정 결과 Celluclast 추출물(실시예 1)이 모든 농도에서 Trypsin 추출물(실시예 2)보다 유의적으로 우수한 활성을 나타내었다(도 1 참조).
ABTS
+
radical 소거능 측정
ABTS+ 라디칼을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Park과 Kim(2009)의 방법에 따라 7 mM ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12~16 시간동안 반응시켰다. 이를 414 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정한 후 150㎕를 취하여 추출물 50㎕를 가하여 실온에서 10분간 반응시켜 414 nm에서 흡광도를 측정하였다.
ABTS+ 라디칼 소거활성은 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)와 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합하여 암소에 두면 ABTS 양이온이 생성되는데 추출물의 항산화 물질과 반응하여 양이온이 소거됨으로써 특유의 청록색이 탈색되며 이의 흡광도를 측정하여 항산화 능력을 측정할 수 있는 방법으로 사용이 되고 있다. 미강 효소 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성 측정 결과, 도 2와 같이 추출물 모두 농도의존적으로 소거활성이 증가하였으며, 모든 농도에서 Trypsin 추출물(실시예 2)이 Celluclast 추출물(실시예 1)보다 유의적으로 높은 활성을 나타내었다.
Hydrogen peroxide 소거능 측정
hydrogen peroxide 소거 활성은 Mㆌller(1985)의 방법에 따라 수행하였다. 0.1 M 인산완충액(pH 6.0)과 시료 50㎕, 20㎕ hydrogen peroxide(10 mM)를 잘 혼합한 후 37℃에서 5분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30㎕ ABTS(1.25 mM)와 30㎕ peroxidase(1 Unit/ml)를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
Hydrogen peroxide는 과산화지질 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 과산화지질은 동맥경화, 뇌졸중 등과 같은 성인병의 원인이 되고, 간장의 세포막에 과산화 지질을 증가시켜 세포기능 저하 및 염증이 일어나게 된다. Hydrogen peroxide 소거 활성은 물질내의 항산화제가 hydrogen peroxide와 같은 prooxidants의 함량을 감소시키는 능력을 측정하는 가장 유용한 방법이다. 미강 효소 추출물의 hydrogen peroxide 소거활성을 측정한 결과, Trypsin 추출물(실시예 2)이 Celluclast 추출물(실시예 1)보다 250, 500 ㎍/ml 농도에서 우수한 활성을 나타내었다(도 3 참조).
Oxygen radical absorbance capacity(ORAC) assay
ORAC assay는 항산화력 측정기법인 라디칼 소거 활성 측정법으로 Zulueta 등(2009)이 제시한 방법에 의해 수행하였다. 각 한약재 추출물의 ORAC 활성은 각 시료를 200 ㎍/mL 농도로 제조한 다음 시료(50㎕)와 75 nM fluorescein(50㎕)을 잘 혼합하고 37℃ incubator에 15분 동안 반응시켜 221 mM로 제조한 AAPH를 혼합시켰다. 37℃에서 microplate reader를 이용하여 excitation 파장 485 nm와 emission 파장 538 nm에서 5분 간격으로 120분간 측정하였다. 표준 시약으로 trolox를 사용하였으며, 표준시약과 추출물의 area under the curve(AUC)를 측정하였다. ORAC은 표준시약 농도와 AUC간의 회귀곡선을 이용하여 μM trolox equivalent(TE)/mg sample로 표기하였다.
ORAC활성은 AUC를 측정함으로써 free radical 손상에 대한 억제 시간과 억제율을 모두 반영하는 항산화능 측정 방법이다. Trolox를 표준물질로 사용하여 AAPH에 의해 생성된 peroxyl radical에 대한 소거활성을 형광도로 측정하였다. 미강 효소 추출물의 ORAC value를 측정한 결과 Trypsin 추출물(실시예 2)이 Celluclast 추출물(실시예 1)보다 우수한 ORAC value를 나타내었으며, 유의적인 차이를 나타내었다(도 4 참조).
Reducing power 측정
환원력(Reducing power) 측정은 Seo 등(2008)의 방법에 따라 측정하였으며, 시료 1 mL에 pH 6.6의 200 mM 인산완충액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각 1 mL씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 항온수조에서 20분간 반응시켰다. 여기에 15% trichloroacetic acid(TCA) 용액을 1 mL 가하고 12,000rpm에서 15분간 원심분리 하여 얻은 상층액 1 mL에 증류수 및 ferric chloride 각 1 mL를 가하여 혼합한 후 700 mm에서 흡광도를 측정하였다.
환원력 측정은 시료 중의 전자공여능이 있는 물질이 ferric iron(Fe3+)를 ferrous ion(Fe2+)로 환원시키는 원리를 이용한 것으로 시료의 환원력을 측정하여 항산화 물질로 사용할 수 있는 잠재력을 확인할 수 있다. 미강 효소 추출물의 reducing power 측정결과 농도의존적으로 흡광도 값이 증가하며 Trypsin 추출물(실시예 2)이 Celluclast 추출물(실시예 1)보다 우수한 환원력을 확인하였다(도 5 참조).
[실험예 4 : 실시예의 간세포에서 산화적 스트레스에 대한 보호 효과 확인]
세포 독성 측정
세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. Chang 세포를 96-well plates에 1 x 104 cells/well로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후, 각 시료를 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이 후 MTT 용액(5.0 mg/mL)을 가하고 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 떨어져나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다. DMSO를 100㎕ 분주하여 20분 동안 혼합한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 대조구에 대한 백분율로 나타내었다.
정상 간세포에 미강 효소 추출물를 농도별로(0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 처리한 결과 아무것도 처리하지 않은 정상대조군과 미강 효소 추출물(실시예 1 및 2)을 처리한 모든 농도에서 독성을 나타내지 않았다(도 6 참조).
산화적 스트레스를 유발시킨 간세포에 대한 보호능 측정
Hydrogen peroxide로부터 산화적 스트레스를 유발시킨 간세포에 미강 효소 추출물의 세포 보호효과를 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 배양된 세포는 96-well plates에 1 x 104 cells/well로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후, 각 시료를 첨가하였고 1시간 뒤 1 mM hydrogen peroxide를 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 이 후 MTT 용액(5.0 mg/mL)을 가하고 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 떨어져나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다. DMSO를 100㎕ 분주하여 20분 동안 혼합한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 대조구에 대한 백분율로 나타내었다.
간세포에 산화적 스트레스를 hydrogen peroxide로 유도하였을 때 정상 대조군과 비교하여 생존율이 50%로 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 그러나 미강 효소 추출물을 농도별로 처리하였을 때 hydrogen peroxide에 의해 감소한 생존율이 증가된 것을 볼 수 있었다. 특히, Trypsin 추출물(실시예 2)이 Celluclast 추출물(실시예 1)보다 모든 농도에서 높은 생존율을 보였으며, 특히 1 mg/mL의 농도에서 생존율이 정상 대조군 수준으로 회복한 것으로 보아 Trypsin 추출물(실시예 2)의 hydrogen peroxide에 대한 우수한 보호효과를 확인하였다(도 7 참조).
DCF-DA를 이용한 ROS 소거능 측정
Hydrogen peroxide가 처리된 간세포 내 ROS(Reactive oxygen species) 생성량을 측정하기 위하여 2'-7'-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA) assay를 실시하였다. 간세포를 96 well plate의 각 well 당 1 x 104/well 개로 분주하고, 미강 효소추출물을 농도별로 처리하였다. 세포 배양기에서 2시간 배양 후, 25 μM의 DCF-DA 용액을 첨가하여 30분을 추가 배양하였다. 이후 형광물질의 흡광도를 측정하는 microplate reader를 이용하여 585 nm와 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DCF-DA 법을 이용하여 실험을 수행한 결과 미강 효소 추출물을 처리하였을 때 hydrogen peroxide에 의해 생성된 ROS를 농도의존적으로 감소시켰다. 특히, Trypsin 추출물(실시예 2)이 Celluclast 추출물(실시예 1)보다 우수한 ROS 소거능을 보였으며, 유의적인 차이를 나타내었다(도 8 참조).
본 명세서에서는 본 발명자들이 수행한 다양한 실시예 가운데 몇 개의 예만을 들어 설명하는 것이나 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고, 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.
Claims (12)
- 미강 효소 추출물을 포함하는, 항산화용 조성물.
- 제1항에 있어서, 미강 효소 추출물은,
미강과 셀룰라아제(Cellulase)를 혼합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물. - 제1항에 있어서, 미강 효소 추출물은,
미강과 트립신(Trypsin)을 혼합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물. - 미강과 증류수를 혼합하는 제1단계;
미강이 혼합된 증류수에 효소를 첨가하여 혼합하는 제2단계;
효소를 불활성화 시키기 위하여 가열하는 제3단계; 및
미강 및 효소가 혼합된 증류수를 여과하여 미강 효소 추출물을 추출하는 제4단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제4항에 있어서, 제2단계에서 첨가하는 효소는,
셀룰라아제(Cellulase)인 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제5항에 있어서, 제2단계에서,
셀룰라아제(Cellulase)와 미강은 1 : 80~120의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제5항에 있어서, 제2단계는,
pH 4.0~5.0에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제5항에 있어서, 제2단계는,
45~55℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제4항에 있어서, 제2단계에서 첨가하는 효소는,
트립신(Trypsin)인 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제9항에 있어서, 제2단계에서,
트립신(Trypsin)과 미강은 1 : 80~120의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제9항에 있어서, 제2단계는,
pH 7.0~8.0에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법. - 제9항에 있어서, 제2단계는,
35~40℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 항산화용 조성물 제조방법.
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| KR20210046409A (ko) | 2019-10-18 | 2021-04-28 | 선문대학교 산학협력단 | 탈지미강 효소분해물을 유효성분으로 하는 조성물 |
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| KR101309680B1 (ko) | 2011-04-15 | 2013-09-17 | 주식회사 대원지에스아이 | 미강 추출물을 함유하는 미백 및 주름개선용 조성물 |
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