KR102295590B1 - 활성화 당쇄 유도체의 제조방법 및 활성화 당쇄 유도체 - Google Patents

활성화 당쇄 유도체의 제조방법 및 활성화 당쇄 유도체 Download PDF

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Abstract

〔과제〕 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 제조할 때, 종래 기술로써의 탄산암모늄 법에서는, 당쇄의 환원 말단에 아미노기를 도입하는 과정에 있어서 당쇄의 환원 말단에 위치하는 단위당이 개환하여 α아노머와 β아노머의 혼합물이 생긴다는 과제가 발생하였다.
〔해결수단〕 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물을 원료로 당쇄의 환원 말단에 아스파라긴 측쇄 유래의 질소 원자가 결합한 상태를 보유하도록 당쇄를 당쇄 펩티드로부터 절단하고 상기 당쇄의 환원 말단과 상기 질소 원자와의 사이의 공유결합뿐만 아니라 β입체배치도 보유한 채, 상기 질소 원자에 활성화기를 도입하여 β선택성이 높은 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 화합물로, β-아노머인, 신규 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 제공한다.

Description

활성화 당쇄 유도체의 제조방법 및 활성화 당쇄 유도체{METHOD FOR PRODUCING ACTIVATED SUGAR-CHAIN DERIVATIVE, AND ACTIVATED SUGAR-CHAIN DERIVATIVE}
본 발명은 활성화 당쇄 유도체의 제조방법 및 활성화 당쇄 유도체 화합물에 관한 것이다.
당쇄는 일반적으로 단당과 단당이 글리코실화 결합이라는 결합을 통해 쇄상으로 결합한 것이다. 생체 내에서는 다양한 당쇄가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 생체 내에서는 당쇄는 펩티드, 단백질, 지질 등에 결합한 복합당질로써 존재는 것도 많다.
특히 생체 내에 존재하는 당펩티드 또는 당단백질에 있어서는, 펩티드의 특정 아미노산에 특정 구조를 갖는 당쇄가 결합하는 것으로 알려져 있다. 이들 당쇄는, 그 구조의 차이에 따라 펩티드（단백질）의 활성 또는 체내동태 등에 다양한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
이러한 당쇄 또는 당쇄 부가 펩티드를 의료품으로 사용하는 것도 행해지고 있지만, 당쇄 부가 펩티드를 세포계에 의해 조제하면, 당쇄의 구조가 불균일해진다는 것이 알려져 있다. 당쇄의 구조가 불균일하면 약효에도 차이가 생길 수 있기 때문에, 분리정제 또는 화학합성된 구조의 균일한 당쇄를 펩티드에 부가할 필요성이 높다. 그러나 분리정제 또는 화학합성된 당쇄를 펩티드 등의 다른 물질과 결합시키기 위해서는 필요에 따라서 결합에 필요한 관능기를 당쇄에 부가할 필요가 있다.
당쇄에 대해 다른 물질과의 결합에 필요한 관능기（본 발명에서 활성화기라고도 한다）를 부가하는 방법으로는, 예를 들어, 천연의 난황 등으로부터 당쇄의 환원 말단에 -OH기를 갖는 당쇄를 분리정제하고, 탄산암모늄 법에 의해 당쇄의 환원 말단에 아미노기를 도입하고, 해당 아미노기에 대해 활성화기를 부가하는 방법이 수행되어 왔다(국제공개 제2005/010053호, EP0413675A2, Biochemistry(1992), Vol. 31, 10724-10732항, Biochemical J. (1993), Vol. 296, 817-825항). 그러나 이와 같은 방법에서는, 천연에 존재하는 당펩티드는 당쇄와 펩티드와의 결합에서의 입체배치는 β형임에도 불구하고, 당쇄에 아미노기을 도입하는 과정에서, 당쇄의 환원 말단에 위치하는 단위 당이 개환폐환을 거쳐 아미노기가 도입되기 때문에, α아노머와 β아노머의 혼합물이 생긴다는 문제가 발생하였다.
활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 제조할 때, 종래 기술로써 탄산암모늄 법에서는 당쇄의 환원 말단에 아미노기를 도입하는 과정에서 당쇄의 환원 말단에 위치하는 단위 당이 개환하여 α아노머와 β아노머의 혼합물이 생긴다는 문제가 발생하였다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명자들은 당쇄의 환원 말단에 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 β선택적으로 제조하는 방법에 대해서 예의 검토하였다. 그 결과, 본 발명자들은 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물을 원료로써 당쇄의 환원 말단에 아스파라긴 측쇄 유래의 질소 원자가 결합한 상태를 유지하도록 당쇄를 당쇄 펩티드로부터 절단하고, 상기 당쇄의 환원 말단과 상기 질소 원자 간의 공유결합뿐만 아니라, β입체배치도 유지한 채로 상기 질소 원자에 활성화기를 도입하여 β아노머로써의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 제조하는 방법을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 상기 제조법에 대해 예의 검토한 결과, 본 발명의 화합물로써 β아노머인 신규 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 발견하였다.
즉, 본 발명은, 하기 식(1a)로 나타내는 화합물의 제조방법에 관한 것이다. G-NH-CO-CH2-Y1 (1a)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Y1은 활성기를 나타내며, G와 NH은 상기 당쇄의 환원 말단에 NH의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
본 발명의 제조방법은 상기 식(1a)로 나타내는 화합물의 제조방법이고, 이하의 공정(a)∼(b)를 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 공정(a)는 이하와 같이 나타내는 공정일 수 있다.
(a) 하기 식(b)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물;
G-Asn (2)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Asn은 아스파라긴을 나타내며, G와 Asn은 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
에 대해, 염기성 조건하에서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜,
하기 식(3)으로 나타내는 화합물;
G-NH2 (3)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, NH2는 아미노기를 나타내며, G와 NH2는 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자 유래의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
본 발명의 제조방법에서, 공정(b)는 이하와 같이 나타내는 공정일 수 있다.
(b) 공정(a)에서 얻은 상기 식(3)으로 나타내는 화합물과 하기 식(4)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정;
L1-CO-CH2-Y1 (4)
(여기서, L1은 이탈기이고, Y1은 활성화기이다)
또한, 본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시 양태에 있어서, 이하의 식(1b)로 나타내는 화합물의 제조방법에 관한 것이다;
G-NH-CO-CH2-Y2 (1b)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Y2는 활성화기를 나타내며, G와 NH는, 상기 당쇄의 환원 말단에 NH의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
본 발명의 제조방법에서, 상기 식(1b)로 나타내는 화합물의 제조방법은,
이하의 공정(a)∼(c)를 포함할 수 있다.
본 발명의 식(1b)로 나타내는 화합물의 제조방법에 있어서, 공정(a)는 이하와 같이 나타내는 공정일 수 있다.
(a) 하기 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물;
G-Asn (2)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Asn는 아스파라긴을 나타내며, G와 Asn은 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
에 대해, 염기성 조건하에서, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜,
이하의 식(3)으로 나타내는 화합물을 얻는 공정;
G-NH2 (3)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, NH2는 아미노기를 나타내며, G와 NH2는 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자 유래의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다).
본 발명의 식(1b)로 나타내는 화합물의 제조방법에서, 공정(b)는 이하와 같이 나타내는 공정일 수 있다;
(b) 공정(a)에서 얻은 상기 식(3)으로로 나타내는 화합물과 이하의 식(5)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정;
L1-CO-CH2-Z (5)
(여기서, L1은 이탈기이고, Z는 할로겐 원자이다).
본 발명의 식(1b)로 나타내는 화합물의 제조방법에서, 공정(c)는 이하와 같이 나타내는 공정일 수 있다.
(c) 공정(b)에서 얻은 화합물과,
이하의 식(6a) 또는 식(6b)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정;
L2-Y2 (6a)
(여기서, L2는 이탈기이고, Y2는 활성화기이다)
L3Y3 (6b)
(여기서, L3는 양이온이고, Y3은 상기 활성화기 Y2의 음이온이고, L3Y3는 L3와 Y3의 염이다).
본 발명의 상기 식(1a)로 나타내는 화합물의 제조방법의 일 실시 양태에 있어서, Y1은 브롬 원자, 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 식(1a)로 나타내는 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, Y1은 브롬 원자, 염소 원자, 요오드 원자 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 식(1b)로 나타내는 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, Z는 브롬 원자이고, Y2는 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3 NHNH2 및 SHCH2CH2NH2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 공정(a)에서 상기 당쇄 아스파라긴 가수분해효소는 글리코실 아스파라기나아제(GA) 및/또는 펩티드: N-글리카나제(PNGase)일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 공정(a)에서 상기 당쇄 아스파라긴 가수분해효소는 담체에 고정되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 공정(a)의 상기 당쇄 아스파라긴 가수분해효소는 담체에 고정되어 있고, 게다가, 상기 공정(a)의 후 및 상기 공정(b)의 전에, 이하의 공정(d);
(d) 담체에 고정된 상기 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 반응계로부터 분리하는 공정;
을 포함할 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 공정(a)가 0℃∼40℃의 온도 조건하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 공정(a)가 0℃∼10℃의 온도 조건하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 당쇄는 N-결합형 당쇄일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 당쇄는 N-결합형의 복합형 당쇄일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 당쇄는 디시알로(disialo) 당쇄, 아시알로(asialo) 당쇄 및 DiGlcNAc 당쇄로 이루어진 군에서 선택되는 당쇄일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 당쇄는 이하의 식(7)로 나타내는 것일 수 있다.
Figure 112014104772291-pct00001
(7)
(여기서, R 및 R＇는 각각 독립적으로 이하의 식(8a) 내지 식(8f)로 나타내는 당쇄로 이루어진 군에서 선택된다)
Figure 112014104772291-pct00002
(8a)
Figure 112014104772291-pct00003
(8b)
Figure 112014104772291-pct00004
(8c)
Figure 112014104772291-pct00005
(8d)
Figure 112014104772291-pct00006
(8e)
Figure 112014104772291-pct00007
(8f)
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태에 있어서, 상기 당쇄는 디시알로 당쇄이고, 상기 디시알로 당쇄를 구성하는 시알산의 측쇄 카르본산이 에스테르화 또는 아미드화에 의해 보호되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 활성화기를 갖는 당쇄 화합물로써 하기의 식(1c)로 나타내는 화합물에 관한 것이다.
Figure 112014104772291-pct00008
(1c)
(여기서, Y는 브롬 원자, 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되고, R 및 R＇는 각각 독립적으로 이하의 식(8a) 내지 식(8f)로 나타내는 당쇄로 이루어진 군에서 선택된다)
Figure 112014104772291-pct00009
(8a)
Figure 112014104772291-pct00010
(8b)
Figure 112014104772291-pct00011
(8c)
Figure 112014104772291-pct00012
(8d)
Figure 112014104772291-pct00013
(8e)
Figure 112014104772291-pct00014
(8f)
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 일 실시양태는, 상기 식(1c)로 나타내는 화합물일 수 있으며, 여기서, Y는 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되고, R 및 R'는 각각 독립적으로 상기 식(8a) 내지 식(8f)로 나타내는 당쇄로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 일 실시양태는, 상기 식(1c)로 나타내는 화합물일 수 있으며, 여기서, Y는 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되고, R 및 R'는 각각 독립적으로 상기 식(8a) 내지 식(8f)로 나타내는 당쇄로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 일 실시양태는, 상기 식(1c)로 나타내는 화합물일 수 있으며, 여기서, Y는 SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되고, R 및 R'는 각각 독립적으로 상기 식(8a) 내지 식(8f)로 나타내는 당쇄로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 일 실시양태는, 상기 식(1c)로 나타내는 화합물일 수 있으며, 여기서, Y는 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되고, R 및 R'는 각각 동일하고 상기 식(8a) 내지 (8e)로 나타내는 당쇄로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 일 실시양태는, 상기 식(1c)로 나타내는 화합물일 수 있으며, 여기서, Y는 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되고, R 및 R'는 모두 상기 식(8b)로 나타내는 당쇄일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 일 실시양태는, 상기 식(1c)로 나타내는 화합물일 수 있으며, 여기서, Y는 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되고, R 및 R'는 모두 상기 식(8c)로 나타내는 당쇄일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법의 일 실시양태는, 각 공정을 수행할 때의 염기성 조건, 반응온도, 반응시간, 반응시키는 화합물 등은 상기에 표시된 것의 임의의 조합으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 일 실시양태는, 식 중의 Y, R 및 R'는 상기에 표시된 것으로부터 선택되는 임의의 조합으로 하는 것일 수 있다.
본 발명은 활성화기를 갖는 당쇄 유도체의 제조방법으로, 종래 기술로써의 탄산암모늄 법과 비교해서, 당쇄의 환원 말단에 대해 β형의 입체배치를 유지한 채 활성화기의 도입을 가능하게 하는 효과, 즉, 뛰어난 β선택성을 갖는다는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 실시양태에 따라, 활성화기를 갖는 당쇄 유도체의 제조방법으로써, 종래의 탄산암모늄 법과 비교해서, 보다 단시간에, 보다 β아노머의 순도가 높은 당쇄 유도체의 제조를 가능하게 하는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 활성화기를 갖는 당쇄 유도체의 제조방법으로써, 저온조건을 이용함으로써, 보다 효율이 높고 β아노머의 순도가 높은 당쇄 유도체의 제조를 가능하게 하는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 효소를 고상에 고정화함으로써, 보다 간단하게, 보다 높은 수율로, β아노머의 순도가 높은 당쇄 유도체의 제조를 가능하게 하는 효과를 갖는다.
게다가, 본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 유도체를 이용하여 펩티드 등의 측쇄에 존재하거나, 또는, 펩티드 등의 측쇄에 도입되는 관능기와 반응시킴으로써, 펩티드에 대해 β아노머인 균일한 구조의 당쇄를 갖는 당펩티드 및/또는 당단백질을 제조할 수 있다.
〔도 1〕도 1은 종래 기술의 합성도식을 나타내는 반응식이다.
〔도 2〕도 2는 본 발명의 합성도식을 나타내는 반응식이다.
〔도 3〕도 3은 종래 기술의 방법으로 합성한 아시알로 당쇄-NH-AcBr의 1H-NMR스펙트럼이다.
〔도 4〕도 4는 본 발명의 방법으로 합성한 아시알로 당쇄-NH-AcBr의 1H-NMR스펙트럼이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법에 관련한 것이다.
본 발명에서, 활성화기를 갖는 당쇄 화합물은 당쇄의 환원 말단에 아미노기를 갖고, 해당 아미노기에 대해 더 활성화기를 결합시킨 것이다. 본 발명에서, 당쇄 화합물에 대해 활성화기를 결합시키는 것을 당쇄 화합물에 활성화기를 도입한다고 말하기도 한다. 활성화기란, 당쇄를 펩티트, 단백질, 지질 등의 다른 물질에 결합시키기 위해서 사용할 수 있는 반응성이 높은 관능기를 갖는 치환기를 말한다. 본 발명에서, 활성화기를 갖는 당쇄 화합물은 당쇄를 다른 물질에 결합시키기 위해서 유도체화 한 것이라는 의미에서 활성화 당쇄 유도체 또는, 단지 당쇄 유도체라고도 말 할 수 있다.
본 발명에서 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법은 공정(a)와 공정(b)를 포함한다.
공정(a)는, 당쇄 아스파라긴 또는 당쇄 아스파라긴을 포함하는 당쇄 펩티드에 대해, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜 당쇄의 환원 말단에 아스파라긴 측쇄 유래의 아미노기가 결합한 당쇄 아민화합물을 얻는 공정이다.
공정(b)는, 공정(a)에서 얻은 당쇄 아민화합물과 활성화기를 갖는 화합물을 반응시켜 당쇄의 환원 말단에 존재하는 아미노기의 질소 원자에 활성화기를 도입하는 공정이다.
공정(a)에서는, 염기성 조건하에서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 이용하는 것을 특징으로 한다.
종래 기술에서도, 당펩티드에서 당쇄를 분리정제할 때에 효소를 이용하여 당쇄를 당쇄 아스파라긴으로부터 절단하여 분리하는 것은 있었지만(국제공개제 2005 010053호), 이와 같은 종래의 방법에서는 당쇄 아스파라긴 가수분해효소에 의해 당쇄의 환원 말단에 아미노기가 아닌 수산화기를 갖는 당쇄를 얻었다. 그리고, 그 환원 말단에 수산기를 갖는 당쇄란, α입체위치의 -OH기를 갖는 당쇄(즉, α-아노머이다)와 β입체위치의 -OH기를 갖는 당쇄(즉, β-아노머이다)의 혼합물이 얻어지는 것으로 알려져 있다.
그리고, 이와 같은 환원 말단에 -OH기를 갖는 당쇄의 α-아노머 및 β-아노머의 혼합물로써의 당쇄에 대해, 탄산암모늄 법에 의해 환원 말단의 수산기를 아미노기로 치환하는 방법이 행해졌다. 그리고, 탄산암모늄 법에서는 탄산암모늄과 반응시키기 위해서 어느 정도 고온에서, 어느 정도 장기간 반응을 수행하는 것이 알려져 있다. 그리고, 그 결과로써 얻어진 당쇄 화합물도 β형의 아노머의 순도가 충분히 높지 않았다.
따라서, 본 발명자들은 β선택성이 높고 활성화기를 갖는 당쇄 화합물의 제조방법에 대해 예의 검토한 결과, 놀랍게도 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 이용할 때 염기성 조건을 이용함으로써, 당쇄의 환원 말단에 아스파라긴의 측쇄 질소 원자 유래의 아미노기를 보유하고, 뛰어난 β선택성을 실현할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
즉, 본 발명자들은 본 발명의 일 양태로써, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 이용할 때에 염기성 조건을 이용하고, 또한, 저온에서 반응을 수행함으로써 더욱 현저한 β선택성을 실현할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 일 양태에 있어서, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 이용할 때에 염기성 조건을 이용하고, 또한, 단기간에 반응을 수행함으로써, 더욱 현저한 β선택성을 실현할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 일 양태에 있어서, 당쇄 아스파라긴 가수분해 효소를 이용할 때에 염기성 조건을 이용하고, 저온에서, 또한, 단시간에 반응을 수행함으로써, 더 현저한 β선택성을 실현할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 본 발명의 제조방법에 의해, 다음의 실시예에서 설명하는 바와 같이, β선택성이 94%를 넘을 정도, 더 바람직하게는 99%를 넘을 정도의 매우 높은 β선택적 반응의 실현을 가능하게 한 것이다.
또한, 본 발명의 제조방법에 따르면, 당쇄를 분리정제한 후에 당쇄를 아미노화 하는 공정이 불필요해지기 때문에, 종래 방법에서 아미노화에 필요했던 비용과 시간을 삭감하는 것이 가능하다.
게다가, 본 발명의 제조방법에 따르면, 당쇄 아스파라긴 또는 당쇄 펩티드로부터 당쇄 아민화합물을 얻을때까지의 시간을 대폭 단축하는 것이 가능하다.
또한, 종래의 탄산암모늄 법에서는 30℃∼50℃라는 고온에서 장시간의 반응에 있어서, 당쇄의 분해반응이나 당쇄의 보호기의 탈보호 반응이 발생하고 수율이 저하해버리지만, 본 발명의 제조방법에 따르면 이와 같은 당쇄의 분해나 탈보호를 방지하고, 보다 효율 높은 제조방법으로 하는 것이 가능하다.
본 발명의 제조방법에서, 목적 화합물로써 활성화기를 갖는 당쇄 화합물은 식(1a)로 나타내는 화합물, 식(1b)로 나타내는 화합물, 식(1c)로 나타내는 화합물 등으로 나타낼 수 있다.
예를 들어, 식(1a)로 나타내는 화합물은 이하와 같다.
G-NH-CO-CH2- Y1 (1a)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Y1은 활성화기를 나타내며, G와 NH는, 상기 당쇄의 환원 말단에 NH의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
이들 화합물은 당쇄의 환원 말단에 -NH-CO-CH2-를 통해 활성화기(Y, Y1, 또는 Y2)가 결합한 것이라고 할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 사용되는 원료화합물로써는, 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물 등을 나타낼 수 있다.
G-Asn (2)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Asn은 아스파라긴을 나타내며, G와 Asn은, 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
여기서, "식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조"란 당쇄의 환원 말단에 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있는 것을 말하고, 이것을 본 명세서에서, "당쇄 아스파라긴 구조"라고 말할 때가 있다. "식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물"은 당쇄와 아스파라긴으로 구성된 당쇄 아스파라긴 외에, 당쇄 아스파라긴의 양단에 또 다른 아미노산이 펩티드 결합한 당쇄 아스파라긴 함유 펩티드도 포함한다.
즉, "식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물"은, 이하의 식(2a)로 나타낼 수도 있다.
(Aa)n-Asn(G)-(Aa)m (2a)
(여기서, Aa는 임의의 아미노산을 나타내고, (Aa)n은 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산이 n개 펩티드 결합해 있는 것을 나타내고, (Aa)m은 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산이 m개 펩티드 결합해 있는 것을 나타내고, n, m은 각각 독립적으로 0∼100의 정수이고, Asn(G)는 식(2)와 같이, 당쇄의 환원 말단에 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있는 것을 나타낸다)
여기서, n과 m이 동시에 0일 경우에는, 당쇄 아스파라긴의 양단에 다른 아미노산은 펩티드 결합하지 않고, 당쇄 1분자와 아스파라긴 1분자가 결합한 당쇄 아스파라긴을 의미한다.
여기서, n과 m이 0일 경우에는, 식(2a) 중의 아스파라긴 C말단의 카르복실기또는 N말단의 아미노기는 다른 아미노산과 펩티드 결합해 있지 않고, 유리 카르복실기 또는 유리 아미노기인 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, n은 0∼100의 정수이고, 바람직하게는 0∼10의 정수이고, 더 바람직하게는 0∼5의 정수이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, m은 0∼100의 정수이고, 바람직하게는 0∼10의 정수이고, 더 바람직하게는 0∼5의 정수이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물은, 당단백질 또는 당펩티드를 그대로 이용할 수 있는 것 외에, 당단백질 또는 당펩티드를 원료로써 미리 펩티드 가수분해효소에 의해 어느 정도 단편화한 것을 사용할 수 있다. 또한, 시판 중인 당펩티드 또는 당쇄 아스파라긴, 또는 그의 유도체 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서의 중간체로써는, 식(3)으로 나타내는 화합물 등을 나타낼 수 있다.
G-NH2 (3)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, NH2는 아미노기를 나타내며, G와 NH2는, 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자 유래의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
식(3)으로 나타내는 화합물은, 당쇄의 환원 말단에 아스파라긴 측쇄의 질소 원자 유래의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있고, 당쇄 아민화합물이라고도 말할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서의 활성화제로써는, 식(4)로 나타내는 화합물을 나타낼 수 있다.
L1-CO-CH2-Y1 (4)
(여기서, L1은 이탈기이고, Y1은 활성화기이다)
식(4)로 나타내는 화합물은, -CO-CH2-Y1의 부분을 상기 식(3)으로 나타내는 화합물의 질소 원자에 결합시키기 위한 활성화제 또는 단지 활성화제라고도 할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 공정(a)와 공정(b)를 포함한다. 공정(a)와 공정(b)에 대해서 이하에 더 자세히 설명한다.
공정(a)는 이하와 같이 나타낼 수 있다.
(a) 하기 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물;
G-Asn (2)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Asn은 아스파라긴을 나타내며, G와 Asn은, 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
에 대해서, 염기성 조건하에서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜,
하기 식(3)으로 나타내는 화합물을 얻는 공정;
G-NH2 (3)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, NH2는 아스파라긴을 나타내며, G와 NH2는, 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
공정(a)는 하기 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물에 대해서, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜, 상기 식(3)으로 나타내는 화합물(당쇄 아미노화합물이라고도 한다)을 얻는 공정이다.
본 발명의 제조방법에서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소는, 당쇄의 환원 말단과 아스파라긴 측쇄의 질소 원자와의 결합을 절단하지 않고, 아스파라긴 측쇄에서 질소 원자와 해당 질소 원자에 인접하는 카르복실 탄소 원자와의 사이의 결합을 가수분해하는 효소이면 특별히 제한되지 않는다. 이 반응에 의해 당쇄 아스파라긴으로부터 당쇄 아민화합물과 아스파라긴산이 생성된다.
본 발명의 당쇄 아스파라긴 가수분해효소의 예로써는, 글리코실아스파라기나아제(GA) 또는 펩티드: N-글루카나아제(PNGase)를 들 수 있다. PNGase는 그의 유래에 따라, 예를 들어, PNGase-F, PNGase-A 등이 알려져 있다. 글리코실아스파라기나아제(GA) 또는 펩티드: N-글루카나아제(PNGase)는 이들 효소를 발현시켜 정제하는 방법 등에 의해 제조할 수 있는 것 외에, BioLabs Inc. 등으로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소로써 글리코실아스파라기나아제(GA)를 사용할 경우에는, 기질로써, 식(2a)에서 n 및 m이 0인 당쇄 아스파라긴을 사용하는 것이 적합하다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소로써 펩티드: N-글루카나아제(PNGase)를 사용하는 경우에는, 기질로써, 식(2a)에서 n 및 m이 0이 아닌 당쇄 아스파라긴 함유 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 펩티드: N-글루카나아제(PNGase)를 사용할 경우, 기질로써는, 시알릴글리코펩티드(SGP) 라고 불리우는 당펩티드를 이용할 수 있다.
시알릴글리코펩티드(SGP)는 당쇄 아스파라긴의 N말단 측에 3개의 잔기, C말단 측에 2개의 잔기의 아미노산이 결합한 총 6개의 잔기의 당펩티드이고, 서열은 Lys-Val-Ala-Asn(당쇄)-Lys-Thr로 나타낼 수 있다. 시알릴글리코펩티드(SGP)는 주식회사 후쿠미제약소에서 구입할 수 있는 것 외에, 펩티드 부분이 보다 긴 당단백질과 당펩티드로부터 펩티드 부분을 절단함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 공정(a)는 염기성 조건하에서 수행한다. 여기서, 염기성 조건이란, 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물로부터 식(3)으로 나타내는 화합물(당쇄 아민화합물)을 얻는 공정에 있어서, 높은 β선택성을 실현할 수 있는 정도의 염기성인 것을 말한다. 본 명세서를 본 당업자라면, 본 발명에서의 높은 β선택성을 실현하는데 필요한 pH의 정도를 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 염기성 조건은 약 염기성 조건으로 할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 염기성 조건은 pH8∼11을 말하고, 바람직하게는 pH8∼10, 더 바람직하게는 pH8∼9로 할 수 있다. 이러한 염기성 조건은, 상기 pH를 나타내는 용매, 상기 pH가 되도록 조제한 용매를 이용하여 실현할 수 있다. 구체적인 예로서는, 탄산수소나트륨 수용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산칼륨 수용액, N, N-비스(2-히드록실에틸), 글리신(BICINE)완충용액 등, 일반적인 완충용액을 이용할 수 있다. 상기 염기성 조건은, 반응개시 전에 조절해 놓는 것 외에, 반응 중에 pH의 모니터링 등을 하여 더 조절할 수 있다. 본 발명에서, pH는 일반적으로 사용되는 pH메이커(주식회사 호리바 제작소 pH측정기 D-51S)등에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 탄산수소나트륨 수용액을 사용하고 있고, 이를 상기 pH미터로 측정한 결과, pH는 약 8.5이었다. 본 발명의 일 실시양태에 있어서, 염기성 조건은 상기 염기성 조건을 실현하는 양의 염기성 물질(탄산수소나트륨 등)을 반응계에 첨가하여 교반하는 방법 등에 의해 실현할 수 있고, 필연적으로 상기 염기성 조건을 실현할 수 있는 한, pH메이커 등을 이용하여 염기성 조건을 조정하는 공정을 반드시 필요로 하는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법의 일 양태에 있어서, 공정(a)는 염기성 조건하에서 또한, 단시간에 수행하는 것이 바람직하다. "단시간에" 수행한다 란, 종래 방법의 탄산암모늄 법보다도 단시간에 수행하는 것을 의미할 수 있다. 종래 방법으로 탄산암모늄 법에서는, 통상 1주일간 정도 반응시키는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은 당쇄 아스파라긴 가수분해효소에 의한 β선택적인 가수분해 반응의 조건을 예의 검토한 결과, 반응조건을 염기성 조건으로 하고, 추가로 반응시간을 단시간으로 함으로써, 당쇄의 환원 말단에 위치하는 개환반응을 억제하고 또한 β선택성을 높일 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명의 제조방법에서, 공정(a)는 염기성 조건하에서 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물로부터 식(3)로 나타내는 화합물(당쇄 아민화합물)을 효율적으로 얻을 수 있고, 반응시간을 보다 단시간으로 할 수 있다.
여기서, 단시간으로란 상기의 종래 방법보다도 단시간이라는 의미 외에, 10분∼3시간을 말하고, 바람직하게는 10분∼2시간, 더 바람직하게는 10분∼1시간을 말한다. 단, 본 발명의 제조방법에서 뛰어난 β선택성을 실현할 수 있는 한, 상기의 반응시간 이상으로 반응을 계속하는 것을 본 발명의 범위로부터 제외하는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법의 일 양태에 있어서, 공정(a)는 염기성 조건하에서 또한, 저온으로 수행하는 것이 바람직하다. 종래 방법으로써의 탄산암모늄 법에서는, 통상 30℃∼50℃에서 반응시킨다는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은 당쇄 아민화합물을 얻기 위해서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소에 의한 가수분해 반응의 조건을 예의 검토한 결과, 공정(a)를 저온에서 수행함으로써, 당쇄의 환원 말단에 위치하는 당의 개환반응을 억제하고, 또한, β선택성을 높일 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명의 제조방법에서, 공정(a)는 효소반응이기 때문에 37℃정도가 적온인 것도 예측할 수 있어 본 발명자들이 예의 검토한 결과, 놀랍게도, 통상의 효소에 알맞은 37℃정도의 온도에 한정되지 않고, 더욱이 4℃ 등, 통상의 효소 반응보다도 오히려 저온의 온도를 이용하여, β선택성에 뛰어나고 또한, 충분한 반응성을 갖는 실험조건을 발견하는데 성공하였다.
또한. 본 발명자들은 저온에서는 효소의 반응속도가 저하하는 것이 예상됨에도 불구하고, 저온이면서 또한, 예를 들어, 1시간 이상이라는 단시간에도 충분한 반응성을 실현할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
여기서 저온에서란 상기의 종래 방법보다도 저온이라는 의미 외에, 0℃∼40℃를 말하고, 본 발명의 일 양태에 있어서, 바람직하게는 0℃∼20℃, 더 바람직하게는 0℃∼10℃를 말한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 더 바람직하게는 2℃∼6℃로 하는 것이 바람직하다.
저온을 실현하기 위한 온도 조절 방법은, 상기 온도로 조절할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 온도 조절 방법으로써는, 통상의 생화학 실험에서 이용되는 방법을 사용하여 실현할 수 있고, 예를 들어, 항온조, 빙냉 등의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명에서, 온도는 일반적으로 사용되는 온도계(적액봉상 온도계 등)등에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 공정(b)는 이하와 같이 나타낼 수 있다.
(b) 공정(a)에서 얻은 상기 식(3)으로 나타내는 화합물과 이하의 식(4)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정;
L1-CO-CH2-Y1 (4)
(여기서, L1은 이탈기이고, Y1은 활성화기이다).
본 발명의 제조방법에서, 공정(b)는 공정(a)에서 얻은 식(3)으로 나타내는 화합물과 식(4)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정이다.
식(3)으로 나타내는 화합물에, 식(4)로 나타내는 화합물을 반응시키면, 식(3) 중의 NH2의 질소 원자가 식(4) 중의 카르보닐 탄소를 구핵공격한다고 생각된다. 그 결과, 식(3) 중의 NH2로부터 수소 원자가, 식(4)의 화합물로부터 L1이 이탈하고, 식(3) 중의 질소 원자와 식(4) 중의 카르보닐 탄소와의 사이에 공유결합이 형성된다고 생각된다.
이 공정(b)에서, 당쇄의 환원 말단에서, 당쇄의 환원 말단에 결합해 있는 질소 원자의 입체배치는 β형의 입체배치인 것을 특징으로 한다.
여기서, 식(4)로 나타내는 화합물은, 공정(b)에서 이탈 가능한 이탈기 L1과 활성화기 Y1을 갖는 화합물이다.
여기서, 이탈기는, 공정(b)에서, 당쇄 환원 말단의 β형의 입체구조를 보유 가능한 조건에서 이탈 가능한 이탈기인 한, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서, 이탈기로써는 카르보닐 탄소에 대한 구핵공격에 있어서, 이탈하는 이탈기를 사용할 수 있다. 이와 같은 이탈기로써는 예를 들어, 할로겐 원자 (브롬 원자, 염소 원자, 요오드 원자 등)등을 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 식(4)로 나타내는 화합물로써, 대칭 산 무수물(Y1-CH2-CO-O-CO-CH2-Y1)을 사용할 수 있고, 이 경우, 이탈기는 Y1-CH2-CO-O로 나타내는 기가 된다. 또한, 예를 들어, 식(4)로 나타내는 화합물로써, 히드록시숙신이미드에스테르를 사용할 수 있고, 이 경우에는, 이탈기는 히드록시숙신이미드 부분(숙신이미드의 질소 원자에 산소 원자가 결합한 부분)이 된다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 이탈기는 바람직하게는 할로겐 원자, Y1-CH2-CO-O로 나타내는 기이고, 더 바람직하게는 브롬 원자, 염소 원자이다.
본 발명의 제조방법에서, 활성화기는 본 발명의 식(a), 식(1b)로 나타내는 화합물을, 게다가, 다른 물질에 결합시키기 위한 반응기로 사용할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 다른 물질이란, 생체 내에서 복합 당질을 형성하는 생체 내 물질이 바람직하다. 본 발명에서, 활성화기로써는, 예를 들어, 펩티드 또는 지질 등의 생체물질에 존재하는 카르복실기, 아미노기, 수산기, 티올기 등의 관능기와 반응할 수 있는 기일 수 있고, 활성화기와 이들의 관능기와의 사이에서 결합을 형성하는 것을 들 수 있다. 또한, 활성화기로는 상기의 결합형태에서 사용되는 기 외에, 식(4)에서, 활성화기에 인접하는 -CH2-의 탄소 원자와, 상기와 같은 다른 물질의 관능기와의 사이에서 결합을 형성하고, 활성화기 자체는 결합시에 이탈하는 치환기일 수 있다.
본 발명의 제조방법의 일 양태에 있어서, 공정(b)에서 사용되는 활성화기는 상기 식(3)으로 나타내는 화합물과 반응시키기 위한 관능기 부분 이외의 부분에서 보호기에 의해 보호되고 있는 것을 사용할 수 있다. 이 경우에는, 공정(b) 또는 그 후, 적당한 공정을 거친 후에, 상기 보호기 부분을 탈보호하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 식(1a)로 나타내는 화합물로써, Y2가 SH인 화합물을 제조하고 싶은 경우, 공정(b)에서 식(4)로 나타내는 화합물에서 Y2로 SH를 대신하여 티올아세틸기인 것을 사용하여 티올아세틸기를 도입하고 후에 에세틸기를 탈보호함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 이와 같은 활성화기로써는, 예를 들어, 할로겐 원자, 아미노기, 카르복실기, 티올기, 아지드기, 하이드라지드기, 다이메톡시메틸기 등을 들 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 바람직하게는 브롬 원자, 탄소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2 및 CH(OMe)2이고, 더 바람직하게는 브롬 원자, 오오드 원자이다.
본 명세서를 본 당업자라면 실시예에 기재된 화합물의 활성화기 외에, 이것에 다소의 수정을 가한 활성화기라도 본 발명의 제조방법에 따라 제조할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
공정(b)는 약산성 용액 중에서 수행할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 용매로써는, 바람직하게는 탄산수소나트륨 수용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산칼륨 수용액, N, N-비즈(2-히드록시에틸)글리신(BICINE)완충용액 등, 일반적인 완충용액을 사용할 수 있고, 더 바람직하게는 탄산수소나트륨 수용액을 사용할 수 있다.
공정(b)의 pH는 공정(b)에서 뛰어난 β선택성을 실현할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 바람직하게는 pH8∼11이고, 더 바람직하게는 pH8∼10, 더 바람직하게는 pH8∼9이다.
공정(b)의 반응시간은 공정(b)에서, 뛰어난 β선택성을 실현할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 바람직하게는 10분∼20시간이고, 더 바람직하게는 10분∼1시간이다.
공정(b)의 반응 온도는 공정(b)에서, 뛰어난 β선택성을 실현할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 바람직하게는 0℃∼40℃이고, 더 바람직하게는 0℃∼10℃이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 공정(b)는 바람직하게는 얼음냉각하 또는 그와 동일한 온도 조건하에서 1시간 이내에 완료할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 공정(a) 및 (b)를 포함하는 제조방법을 사용하는 경우, Y1이 브롬 원자, 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 공정(a) 및 (b)를 포함하는 제조방법을 사용하는 경우, Y1이 브롬 원자, 염소 원자, 요오드 원자 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물은, 상기의 공정(a) 및 공정(b)의 방법에 따라 합성할 수 있는 것 외에, 활성화기의 종류에 따라 상기의 공정(a) 및 공정(b)의 후에 이하의 공정(c)를 포함하는 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
즉, 공정(a)∼(c)를 포함하는 방법은 이하와 같이 기재할 수 있다.
하기 식(1b)로 나타내는 화합물;
G-NH-CO-CH2-Y2 (1b)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Y2는 활성화기를 나타내며, G와 NH는, 상기 당쇄의 환원 말단에 NH의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
의 제조방법으로, 이하의 공정(a)∼(c)를 포함하는 제조방법;
(a) 하기 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물
G-Asn (2)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Asn은 아스파라긴을 나타내며, G와 Asn은, 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
에 대해서, 염기성 조건하에서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜,
하기 식(3)으로 나타내는 화합물을 얻는 공정;
G-NH2 (3)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, NH2는 아미노기를 나타내며, G와 NH2는, 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자 유래의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
(b) 공정(a)에서 얻은 상기 식(3)으로 나타내는 화합물과 이하의 식(5)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정;
L1-CO-CH2-Z (5)
(여기서, L1은 이탈기이고, Z는 할로겐 원자이다)
(c) 공정(b)에서 얻은 화합물과 이하의 식(6a) 또는 식(6b)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정;
L2-Y2 (6a)
(여기서, L2는 이탈기이고, Y2는 활성화기이다)
L3Y3 (6b)
(여기서, L3는 양이온이고, Y3는 상기 활성화기 Y2의 음이온이며, L3Y3는, L3와 Y3의 염이다)
즉, 공정(a), (b) 및 (c)를 포함하는 제조방법은, 공정(b)에서 식(3)으로 나타내는 화합물에 대해 활성기가 Z(할로겐 원자)인 식(5)로 나타내는 화합물을 활성화제로써 반응시켜, 또한, 공정(c)에서 활성화기 Y2를 포함하는 화합물을 반응시킴으로써 상기 할로겐 원자를 Y2에 치환하는 반응이다.
이 반응을 이용할 경우, 공정(b)의 반응에 의해, 식(1a)로 나타내는 화합물에서, 활성화기 Y1이 할로겐 원자인 화합물을 얻을 수 있다. 이 화합물을 식으로 나타내면 이하의 식(1d)로 나타낼 수 있다.
G-NH-CO-CH2-Z (1d)
(여기서, G는 당쇄를 나타내고, Z는 할로겐 원자를 나타내며, G와 NH는, 상기 당쇄의 환원 말달에 NH의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
이 식(1d)로 나타내는 화합물도 또한, 본 발명의 제조방법에서의 목적 화합물로 사용하는 것이 가능하지만, 이 화합물을 중간체로써 또한, 공정(c)를 수행함으로써 식(1b)로 나타내는 화합물을 얻을 수 있다.
공정(c)에서는, 공정(b)에 의해 얻은 화합물과 식(6a) 또는 식(6b)로 나타내는 화합물을 반응시킨다.
여기서 식(6a)로 나타내는 화합물은 이하와 같다.
L2-Y2 (6a)
(여기서, L2는 이탈기이고, Y2는 활성화기이다)
여기서, L2는 공정(c)에서 이탈 가능한 기 일 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, L2는 수소 원자 등이 바람직하다. 본 명세서를 본 당업자라면, 본 명세서에 기제된 활성화기를 도입하기 위해, 실시예에 기재한 이탈기 외에, 유사하게 사용할 수 있는 이탈기에 대해 적절히 검토할 수 있을 것이다.
여기서, Y2는 이미 설명한 활성화기 Y1 중, 공정(c)에서, 공정(b)에 의해 얻어진 화합물에서의 Z(할로겐 원자)와 치환 가능한 활성화기일 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, Y2는 Y1의 활성화기로부터 Z로 나타내는 할로겐 원자를 제외한 것인 것이 바람직하다. 본 발명의 일 양태에 있어서, Z가 할로겐 원자 중에서 특히 브롬 원자인 경우에는, Y2는 브롬 원자 이외의 할로겐 원자일 수 있고, Y1의 활성화기로부터 브롬 원자를 제외한 것인 것이 바람직하다.
식(6a)로 나타내는 화합물로써는, 하이드라진, 티오아세트산, 시스테아민 등을 들 수 있다. 본 명세서를 본 당업자라면, 본 명세서에 기재된 활성화기를 도입하기 위해, 실시예에 기재된 화합물 외에, 유사하게 사용할 수 있는 활성화제에 대해서 적절하게 검토할 수 있을 것이다.
여기서, 식(6b)로 나타내는 화합물은 이하와 같다.
L3Y3 (6b)
(여기서, L3은 양이온이고, Y3은 상기 활성화기 Y2의 음이온이며, L3Y3은, L3과 Y3의 염이다)
즉, 활성화기가 할로겐 원자 등일 경우에는, 할로겐 이온(예를 들어, 염소 이온, 브롬 이온, 요오드 이온)과 양이온의 염을 식(6b)로 사용할 수 있다. 또한, 할로겐 원자 이외에, 아지드이온(N3-)과 같은 유기화합물 이온과 양이온의 염 등도 사용할 수 있다.
여기서, 양이온으로써는, 암모늄 이온, 알칼리 금속 이온(나트륨, 칼륨 등), 알칼리토류 금속(마그네슘, 칼슘 등)등을 들 수 있다.
식(6b)로 나타내는 화합물로써는, 염화나트륨, 요오드화나트륨, 아지화나트륨, 티오아세트산칼륨 등을 들 수 있다.
이 공정(a), 공정(b) 및 공정(c)를 포함하는 제조방법을 사용함으로써, 활성화기가 할로겐 원자, 예를 들어, 브롬 원자인 화합물을 제조함으로써, 이 화합물을 중간체로써 다양한 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 제조할 수 있다. 이 방법에 의해, 당쇄와 활성기와의 사이의 결합을, β배좌에 고정한 채 다양한 반응성을 갖는 활성화기에 유도화할 수 있다는 이점이 있다. 활성화기가 브롬 원자인 화합물은, 단리가 쉽기 때문에 중간체로써 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 공정(a), (b) 및 (c)를 포함하는 제조방법을 사용하는 경우, Z가 브롬 원자이고, Y2가 염소 원자, 요오드 원자, SH, N3, NHNH2 및 SHCH2CH2NH2로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제조방법의 일 양태에 있어서, 공정(c)에서 사용되는 활성화기는, 상기 식(3)으로 나타내는 화합물과 반응시키기 위한 관능기 부분 이외의 부분에서, 보호기에 의해 보호되어 있는 것을 사용할 수 있다. 이 경우에는, 공정(c) 또는 그 후의 적절한 공정을 거친 후에, 상기 보호기 부분을 탈보호하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 식(1b)로 나타내는 화합물로써, Y2가 SH인 화합물을 제조하고 싶은 경우, 공정(c)에서는, 식(6a)로 나타내는 화합물에서 Y2로서 SH를 대신해 티오아세틸기인 것을 사용하여 티오아세틸기를 도입하고, 후에 아세틸기를 탈보호함으로써 제조할 수 있다.
게다가, 본 발명자들은 예의 검토를 거듭하여, 본 발명의 제조방법에 관해 상기 공정(a)의 후, 공정(b)를 수행하기 전에, 이하의 공정(d),
(d) 담체에 고정된 상기 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 반응계로부터 분리하는 공정;
을 수행함으로써, 보다 수율을 높일 수 있다는 것을 밝혀냈다.
여기서, 반응계로부터 분리하는 것이란, 반응계와 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 실질적으로 분리하는 것을 말하고, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소의 대부분을 분리할 수 있으면 좋고, 완전하게 분리한 것만을 의미하는 것은 아니다. 또한, 분리한다란, 반응계로부터 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 제거한다 라는 의미 외에, 반응계로부터 당쇄 아스파라긴 가수분해효소 이외의 것을 빼낸다 라는 의미일 수 있고, 양자를 실질적으로 분리할 수 있는 방법이라면 제한되지 않는다.
게다가, 본 발명자들은 예의 검토를 거듭하고, 본 발명의 제조방법에 관해 상기 공정(a)의 후, 단시간 안에 공정(b)를 수행함으로써 보다 β선택성을 높일 수 있다는 것을 밝혀냈다.
여기서, 단시간 안에란, 1시간 이내를 말하고, 더 바람직하게는 10분 이내를 말한다.
본 발명자들은 예의 검토를 거듭하고, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 반응계로부터 분리하는 방법으로써, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 담체에 결합시킴으로써, 공정(d)를 간단히 수행할 수 있고, 게다가, 공정(a)부터 단시간 안에 공정(d)를 수행하는 것을 가능하게 하는 것을 밝혀냈다.
즉, 본 발명의 일 양태에 있어서, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소는, 담체에 고정된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
담체에 고정되어 있다는 것은, 담체에 대해서, 공유결합 등을 형성함으로써, 고정한다는 것을 말하고, 담체와 함께, 담체를 다루는 것과 유사하게 다룰 수 있는 것이면, 결합양식 등은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 담체란 고상 수지인 것이 바람직하다. 산소의 고정화를 사용하는 고상 수지는 AminoLink(등록 상표) Plus Coupling resin (Thermo 사제, 아가로스 수지), TOYOPEARL-AF-Tresyl-650M, TOYOPEARL-AF-Formyl-650M (토소 사제, 메타크릴폴러머 수지)등을 들 수 있지만, 효소활성을 유지할 수 있는 고정화 담체라면, 수지의 종류, 고정화의 원리에 관계없이 시판 중인 수지를 사용할 수 있다. 또한, 담체에 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 고정하는 방법으로써는, 담체와 효소 사이에서 공유결합을 형성하는 방법, 이온쌍을 형성하는 방법, 효소를 포괄하는 방법 등을 사용할 수 있다. 본 명세서를 본 당업자라면, 본 발명의 실시예를 이용한 고상 수지 외에, 동종의 고상 수지에 대해 검토할 수 있을 것이다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 담체에 고정된 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 사용함으로써, 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 여과 등의 간편한 방법에 의해 반응계로부터 분리할 수 있다. 반응계로부터 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 담체의 구조, 성질에 따라, 여과, 원심조작 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 다양한 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 얻을 수 있고, 이와 같은 당쇄 화합물은, 펩티드 또는 단백질 또는 지질 등의 생체 내 물질 등에 당쇄를 결합시키기 위한 당쇄 유도체로써 알맞게 사용할 수 있다.
게다가, 본 발명자들은 본 발명의 일 양태에 있어서, β아노머이며 신규 활성화기를 갖는 당쇄 유도체를 제공한다. 본 발명자들은 활성화기를 갖는 당쇄 화합물로써, 목적으로 하는 생채 내 물질 등에 당쇄를 결합시키기 위해 알맞은 반응성을 갖는 활성화기에 대하여 예의 검토한 결과, 적어도 식(1c)로 나타내는 화합물이 특히 적합하다는 것임을 밝혔다.
특히, 본 발명에 관해서, 식(1c)로써 구체적으로 표시된 화합물은, 당쇄 부가 펩티드를 제조하기 위한 당쇄 유도체로써 적절한 당쇄 구조를 갖고, 또한, 펩티드의 천연 측쇄 또는 펩티드에 도입된 측쇄에 대한 적합한 선택성, 반응성을 갖도록 본 발명자들에 의해 예의 검토되어 얻어진 것이다.
또한, 식(1c)로써 구체적으로 표시된 화합물은, 이미 설명한 공정(a) 및 공정(b)를 포함하는 제조방법에 의해 적합한 제조하는 것이 가능한 화합물이다. 또한, 식(1c)로 구체적으로 표시된 화합물은, 이미 설명한 공정(a), 공정(b) 및 공정(c)를 포함하는 제조방법에 의해 알맞게 제조하는 것이 가능한 화합물이기도 하다.
그러나, 본 발명에서, 식(1c)로 나타내는 화합물의 발명은, 상기 제조방법에 따라 제조된 것에 한하는 것은 아니다.
본 명세서를 본 당업자라면, 본 발명의 제조방법은 특히 환원 말단 부근의 구조가, 본 발명의 제조방법의 β선택성에 강한 영향을 끼친다는 것을 이해하기 위해, 식(1c)에 구체적으로 예시된 화합물에 한하지 않고, 식(1a)와 식(1b)로 나타내는 것과 같은 당쇄부분의 구조나 활성화기의 부분의 구조가 다소 다른 화합물이라도 본 발명의 제조방법에 의해 유사하게 제조 가능하다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에서 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을, 당쇄를 생체 내 물질 등의 표적 화합물에 결합시키기 위한 유도체로써 사용하는 경우, 식(1c)로 나타내는 화합물은, 목적으로 하는 당쇄의 R 및 R＇와 알맞은 활성화기 Y를 식(1c)로 기재된 선택사항 중에서 임의로 조합한 것으로 할 수 있다.
또한, 생체 내 물질 등의 표적 화합물에서, 당쇄를 결합시키는 표적이 되는 관능기는, 목적으로 하는 생체 내 물질 등이 천연의 상태에서 본래 갖는 관능기에 한하지 않고, 본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물과 반응시키기 위해 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물에서, 예를 들어, 활성화기가 브롬 원자, 염소 원자, 요오드 원자 또는 SH인 경우에는, 목적으로 하는 생체 내 물질 등의 티올기를 표적으로써 도입할 수 있다. 예를 들어, 활성화기가 N3인 경우에는, 목적으로 하는 생체 내 물질 등의 알킨기를 표적으로써 도입할 수 있다. 예를 들어, 활성화기가 NHNH2인 경우에는, 목적으로 하는 생체 내 물질 등에서의 활성화된 에스테르기 또는 알데히드기를 표적으로써 도입할 수 있다. 예를 들어, 활성화기가 CH(OMe)2인 경우에는, 목적으로 하는 생체 내 물질 등의 아미노기를 표적으로써 도입할 수 있다. 이와 같은 활성화기와 표적 관능기와의 관계는 예시적인 것이며, 본 명세서를 본 당업자라면, 상기의 활성화기와 반응할 수 있는 그 외의 관능기를 유사하게 표적 관능기로 하는 것을 알맞게 검토할 수 있을 것이다.
본 명세서 중에서, "당쇄"란 단위당(단당 및/또는 그의 유도체)이 2개 이상 연결되어 이루어진 화합물 외에, 1개의 단위당(단당 및/또는 그의 유도체)으로 이루어진 화합물을 포함한다. 이와 같은 단당으로써는, 예를 들어, 생체 중에 함유된 단당류 및 다당류(글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코오스, 자일로스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민, 시알산 및 이들의 복합체와 유도체)외에, 분해된 다당, 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질 등의 복합 생체 분자로부터 분해 또는 유도된 당쇄 등 광범위한 것을 들 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 단위 당이 2개 이상 연결된 경우, 각각의 단위 당 간은 글리코시드 결합에 의한 탈수축합에 의해 결합한다. 당쇄는 직쇄형일 수도 분기쇄형일 수 도 있다.
본 명세서 중에서, "당쇄"에는 당쇄의 유도체도 포함되고, 당쇄의 유도체로써는, 예를 들어, 당쇄를 구성하는 당이, 카르복실기를 갖는 당(예를 들어, C-1위치가 산화되어 카르본산이 된 알돈산(aldonic acid)(예를 들어, D-글루코스가 산화된 D-클루콘산), 말단의 C원자가 카르본산이 된 우론산(uronic acid)(D-글루코스가 산화된 D-글루크론산(D-glucuronic acid), 아미노기 또는 아미노기의 유도체(예를 들어, 아세틸화된 아미노기)를 갖는 당(예를 들어, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카르복실기를 양쪽 다 갖는 당(예를 들어, N-아세틸뉴라믹산(N-acethylneuramic acid)(시알산), N-아세틸무라민산 등), 데옥시화된 당(예를 들어, 2-데옥시-D-리보스), 황산기를 포함하는 황산화당, 인산기를 포함하는 인산화당 등인 당쇄를 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서 중에서 "당쇄"는 생체 내에 존재하는 복합 당질(당펩티드(또는 당당백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)을 화학적으로 합성하는 관점에서 보면, 당쇄는 생체 내에서 복합 당질(당펩티드(또는 당단백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)로써 존재하는 당쇄인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 생체 내에 존재하는 당펩티드 또는 당단백질을 화학적으로 합성한다고 하는 관점에서는, 아스파라긴에 결합해 있는 당쇄로 알려져 있는 N-결합형의 당쇄(아스파라긴 결합형 당쇄, N형 당쇄라고도 한다)가 바람직하다.
N-결합형 당쇄는, 펩티드의 아스파라긴(Asn) 측쇄에 대해 결합해 있는 것으로 알려져 있는 당쇄로써, 이하의 식으로 나타내는 5당을 기본 구조로 갖는 것이 알려져 있다.
(Man)2-Man-GlcNAc-GlcNac-
(여기서, Man은 만노스, GlcNAc은 N-아세틸글루코사민을 나타내고, 좌단이 비환원 말단, 우단이 환원 말단이며, 환원 말단에서 아스파라긴 측쇄의 질소 원자와 결합한다)
N-결합형 당쇄는, 상기의 5당의 비환원 말단에 더 결합하는 당쇄의 구조에 따라 유형화된 것이 알려져 있고, 예를 들어, 고 마노스(high-mannose)형, 복합(complex)형, 혼성(hybrid)형을 들 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 당쇄는 N-결합형의 복합형 당쇄가 바람직하다.
본 발명의 제조 방법을 당펩티드 또는 당단백질의 의약품 등을 화학적으로 합성한다는 관점에서 보면, 바람직한 당쇄로써는, 예를 들어, 사람의 체내에서 단백질과 결합한 당단백질로써 존재하는 당쇄(예를 들면, FEBS LETTERS, Vol. 50, No.3, Feb. 1975에 기재된 당쇄)와 동일한 구조를 갖는 당쇄(구성 당의 종류 및 이들의 결합양식이 동일한 당쇄)또는 이들의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 잃은 당쇄를 들 수 있다.
N-결합형 당쇄의 결합형 당쇄로써는, 2분기형, 3분기형, 4분기형의 것 등이 알려져 있고, 분기수는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태에 있어서, N-결합형 당쇄의 복합형 당쇄로써는, 예를 들어, 2분기형으로써 이하의 식(7)로 나타내는 당쇄일 수 있다.
Figure 112014104772291-pct00015
(7)
(여기서, R 및 R＇는 각각 독립적이고 이하의 식(8a) 내지 (8f)로 나타내는 당쇄로 이루어진 군에서 선택된다)
Figure 112014104772291-pct00016
(8a)
Figure 112014104772291-pct00017
(8b)
Figure 112014104772291-pct00018
(8c)
Figure 112014104772291-pct00019
(8d)
Figure 112014104772291-pct00020
(8e)
Figure 112014104772291-pct00021
(8f)
본 발명에서, N-결합형 당쇄와 복합형 당쇄로써는, 그 종류의 당쇄로써 일반적으로 알려져 있는 당쇄의 기본골격을 갖는 것이면 그의 결합양식, 푸코오스의 유무, 측쇄의 치환기에 대한 수식의 유무 등이 다른 것이라도 포함된다.
본 발명에서, 디시알로(disialo)당쇄란, N-결합형 당쇄, 2분기형 복합형 당쇄로 알려져 있는 당쇄의 기본 구조를 갖고, 2분기형의 2개의 비환원 말단의 양쪽에 시알산이 결합해 있는 당쇄를 말한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 디시알로 당쇄로써는, 상기 식(7)의 화합물에서 R 및 R＇이 모두 식(8a)로 나타내는 당쇄인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 이 화합물을 1개의 화학식으로 나타내면 이하의 식(9)로 나타낼 수 있다.
Figure 112014104772291-pct00022
(9)
상기의 화합물은, 시알산이 α2-6결합에 의해 결합해 있는 디시알로 당쇄의 예이다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 시알산이 α2-3결합에 의해 결합해 있는 디시알로 당쇄인 이하의 식(10)으로 나타내는 당쇄를 사용할 수도 있다.
Figure 112014104772291-pct00023
(10)
본 발명에서, 아시알로 당쇄란, N-결합형 당쇄, 2분기형의 결합형 당쇄로 알려져 있는 당쇄의 기본 구조를 갖고, 상기의 디시알로 당쇄로부터 2분기형의 2개의 비환원 말단의 양쪽의 시알산이 이탈한 구조를 갖는 당쇄를 말한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 아시알로 당쇄로써는, 상기 식(7)의 화합물에서 R 및 R＇가 모두 식(8d)로 나타내는 당쇄인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, DiGlcNAc 당쇄란, N-결합형 당쇄, 2분기형의 복합형 당쇄로 알려져 있는 당쇄의 기본 구조를 갖고, 상기의 디시알로 당쇄로부터 2분기형의 2개의 비환원 말단의 양쪽의 시알산 및 해당 시알산의 환원 말단 측에 결합해 있던 갈락토스가 이탈한 구조를 갖는 당쇄를 말한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, DiGlcNAc 당쇄로는, 상기 식(7)의 화합물에서 R 및 R＇이 모두 식(8e)로 나타내는 당쇄인 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 식(7)로 나타내는 당쇄는, 상기에서 구체적으로 예시한 디시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, DiGlcNAc 당쇄 외에, R 및 R＇를 독립적으로 선택함으로써 나타내는 다양한 당쇄를 포함한다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 생체 내 당단백질의 인식성과 혈중 체류성 등에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 당쇄의 활성화체를 제공한다는 관점에서는, 당쇄는 디시알로 당쇄인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 디시알로 당쇄의 시알산에 포함되는 카르본산은, 본 발명의 제조방법의 공정에서 다른 물질과 반응해 버릴 가능성이 있기 때문에, 디시알로 당쇄의 카르본산을 보호해 두는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 디시알로 당쇄의 카르본산의 보호로써는, 카르본산을 에스테르화 하는 것 또는 아미드화하는 것이 바람직하다.
에스테르화에 대해서는 예를 들어, 벤질 에스테르화, 페나실에스테르화, 메틸에스테르화, 아릴에스테르화 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 디시알로 당쇄의 카르본산을 아미드화에 의해 보호한 예로써는, 예를 들어, 벤질 에스테르화한 디시알로 당쇄를 들 수 있다. 본 발명에서, 이와 같은 당쇄를 디벤질 디시알로 당쇄 또는 디Bn디시알로 당쇄라고도 할 수 있다. 디벤질 디시알로 당쇄는 상기 식(7)로 R 및 R＇가 모두 식(8c)로 나타내는 화합물로써 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 디시알로 당쇄의 카르본산을 에스테르화에 의해 보호한 다른 예로써는, 예를 들어, 페나실에스테르화한 디시알로 당쇄를 들 수 있다.
디시알로 당쇄의 시알산 중의 카르복실기를 에스테르화하는 방법으로써는, 예를 들어, 디시알로 당쇄 또는 그의 유도체(디시알로 당쇄-Fmoc 등)와 벤질 브로마이드 또는 페나실브로마이드 등을 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또는, 벤질 다이아조메탄과의 반응 등의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 메틸에스테르화, 아릴에스테르화도, 목적으로 하는 에스테르화의 구조에 따라 벤질 에스테르화 또는 페나실에스테르화와 같은 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 디시알로 당쇄의 카르본산을 아미드화에 의해 보호한 예로써는, 예를 들어, 아미드화한 디시알로 당쇄로써, 상기 식(7)에서 R 및 R＇가 모두 식(8c)로 나타내는 화합물을 들 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서는, 아미드화로써는, 상기 식(8c)로 나타내는 1급 아미드기 외에, 디시알로 당쇄의 카르본산(-COOH로 나타내는 부분)을, -CONR1R2로 한 화합물이라고 할 수도 있다. (R1, R2는 알킬기 등의 2급 아미드기와 3급 아미드기를 형성할 수 있는 기를 나타낸다)
디시알로 당쇄의 시알산 중의 카르복실기를 에스테르화하는 방법으로써는, 예를 들어, 디시알로 당쇄 또는 그의 유도체(디시알로 당쇄-Fmoc 등)을 에스테르화 한 화합물과 탄산수소암모늄 수용액, 암모니아수 등과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또는 상기 탄산수소암모늄 수용액 등 대신에, 1급 또는 2급 아민을 포함하는 유기용매와 반응시켜, 이들을 아미드기로 도입하는 방법 등에 의해서도 제조할 수 있다.
시알산의 카르본산의 보호에 관해서는, 종래의 기술로써도 시알산을 에스테르화 등에 의해 보호한 당쇄를 사용하려고 하는 시도가 있었다. 하지만 종래에 사용되었던 탄산암모늄법을 이용하여 환원 말단의 아미노화를 실시할 때에는, 그의 반응 중에 보호기인 에스테르기가 일부 가수분해 또는 아미드화 되기 때문에, 시알산의 카르본산이 에스테르화에 의해 보호되어 있고, 또한, 당쇄의 환원 말단에 활성화기를 갖는 디시알로 당쇄 유도체를 제조하는 것은 곤란하였다. 이에 대해, 본 발명의 방법에 의하면, 탄산암모늄에 의한 아미노화를 경유하지 않고, 저온하의 탄산수소나트륨 용액 중에서 효소처리를 수행하는 것 만으로 환원 말단의 아미노체가 얻어지기 때문에, 카르본산이 에스테르화에 의해 보호된 디시알로 당쇄 유도체를 조제하는 것이 가능하다는 뛰어난 효과를 갖는다.
본 발명의 제조방법에 따르면, β선택성이 뛰어난 당쇄 유도체의 제조방법을 제공할 수 있다.
제조방법의 발명에서, β선택성이 뛰어난다함은, 제조방법의 생성물을 당쇄화합물의 분자의 집합으로 보았을 경우에, 생성물로써의 당쇄의 환원말단의 입체배치에 관해, α아노머와 β아노머를 더한 당쇄 화합물의 총수에 대한, β아노머의 비율(존재율)이 높다는 것을 말한다. 반대 방향에서 표현한다면, 당쇄 화합물의 총수에 대한 α아노머의 존재율이 작은 것이라고도 표현할 수 있다. 또한, β아노머의 존재율이 높다는 것을 β아노머의 순도가 높다는 것이라고도 할 수 있다.
β선택성이나 α아노머 및/또는 β아노머의 존재율은. 생성물로써의 당쇄 화합물을 1H-NMR에 의해 분석하여 구할 수 있다. 1H-NMR의 분석조건으로써는, 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 기술한 조건을 사용할 수 있다. 또한, 당업자라면, 1H-NMR의 분석조건을 적절하게 검토할 수 있을 것이다. 또한, β선택성은 그 외에 HPLC 등에 의해 구할 수도 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 높은 β선택성을 갖거나 또는 β선택성이 뛰어날 경우, 제조방법에 의해 얻어진 화합물에서 α아노머 존재율이 6%이하인 것을 말한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 바람직하게는, 2%이하이고, 더 바람직하게는, 1%이하이다.
본 발명에서, 수율도 높은 것이 바람직하다. 본 발명의 일 양태에서, 바람직하게는 80%이상이고, 더 바람직하게는 90%이상이다.
본 발명의 제조방법에 따르면 β선택성이 높기 때문에, β아노머로써의 당쇄 유도체의 수율이 높다라고도 말할 수 있다.
종래 방법에서, β선택성이 낮은 제조방법에 의해 당쇄 유도체를 얻은 경우에는, α아노머와 β아노머가 분리정제 가능하다면, β아노머 만을 분리 정제하는 것도 고려되었지만, 본 발명의 방법에 따르면, 그와 같은 분리정제 공정을 얻는 방법보다도 β아노머인 당쇄 유도체를 수율 좋게 제조할 수 있다.
게다가, 당쇄 화합물의 α아노머와 β아노머의 분리정제가 곤란한 경우에도, 본 발명의 방법에 따르면, β아노머율이 매우 높은 당쇄 유도체를 제조하는 것도 가능하다.
본 발명의 활성화기를 갖는 당쇄 화합물을 복합 당질을 제조하기 위한 생체 내 물질과 반응시키는 당쇄 유도체인 중간체로써, 즉, 복수 분자의 집합체로써의 중간체 조성물로 사용하는 경우, 본 발명의 제조방법을 사용하여 제조하면, 당쇄의 구조가 균일하고 β아노머율이 매우 높은 조성물로써 얻을 수 있다. 여기서, 복수 분자의 집합체에서 당쇄의 구조가 균일하다는 것은, 당쇄 유도체간에서 비교했을 경우에, 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 결합순서 및 당간의 결합양식이 동일한 것을 말하고, 적어도 90%이상, 바람직하게는 95%이상, 더 바람직하게는 99%이상의 당쇄의 구조가 균일하다는 것을 말한다. 또한, β아노머율이 매우 높다란, β아노머율이 94%이상, 바랍직하게는 99%이상인 것을 말한다. 당쇄가 균일하고 β아노머율이 매우 높은 당쇄 유도체는 품질이 일정하고, 특히 의료품의 제조와 분석 등의 분야에 있어서 바람직하다.
본 명세서에 명시적으로 개시되어 있지 않은 임의의 구성요소가 존재하지 않더라도, 본 명세서 중에 예시로 개시된 본 발명의 양태는 실시할 수 있다.
본 명세서에서 특정된 모든 특허 및 다른 간행물은 참조에 의해, 그들 전체가 명확하게 본 명세서에 인용된다. 이들 문서는, 본 출원의 출원일 전의 관련기술의 개시만을 목적으로 제공되고, 본 발명자들이 선행발명 또는 임의의 다른 이유에 의해, 이러한 개시에 선행하는 권리를 갖지 않는다는 것을 시인하는 것으로 해석되면 안된다. 이들 문서의 내용에 관한 날짜 및 표시에 관한 모든 기술은, 출원인이 입수 가능한 정보를 기초로 하고 있고, 이들 문서의 날짜 및 내용이 정확하다는 자인을 조금도 구성하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어는, 특정의 실시양태를 설명하기 위해 사용되고 있는 것으로 발명을 한정하는 의도가 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "함유하다" 또는 "포함하다" 라는 용어는 문맥상 명확히 다르게 이해해야 할 경우를 제외하고, 기재된 사항(부재, 스텝, 요소 또는 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소 또는 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다. 상기 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소 또는 숫자 등)이 존재하는 것을 제외해도 좋은 경우, "∼으로 구성된 (consist of)"라는 용어가 적용될 수 있다. 용어 "함유하다" 또는 "포함한다"의 개념은, 용어"∼으로 이루어지다"의 개념을 포함한다.
다른 정의가 없는 한, 여기에서 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는, 다른 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련기술 분야의 의미와 명확한 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 이상화되거나 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시양태는 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있으나, 모식도인 경우, 설명을 명확하게 하기 위해서 과장되어 표현하는 경우가 있다.
제1의, 제2의 등의 용어가 다양한 요소를 표현하기 위해서 사용되지만, 이들 요소는 이들 용어에 의해서 한정되어서는 안된다는 것으로 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들어, 제1의 요소를 제2의 요소라고 기재하고, 마찬가지로, 제2의 요소와 제1의 요소라고 기입하는 것은, 본 발명의 범위를 이탈하지 않고 가능하다.
본 발명에서, 성분 함유량과 수치범위 등을 나타내는데 사용되는 수치는 특별히 명시가 없는 한, 용어"약"으로 수식되어 있는 것이라고 이해되어야 한다. 예를 들어, "30mL"란, 특별히 명시가 없는 한, "30mL"를 의미하는 것으로 이해된다.
문맥상 명백하게 다른 의미를 나타내는 경우를 제외하고, 본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용되는 경우, 단수형으로 나타내는 각 양태는 기술적으로 모순되지 않는 한, 복수형일 수 있다고 이해되고, 반대도 또한 같다.
본 명세서 중에 인용되는 문맥은, 그들 모두의 개시가 본 명세서 중에 원용되어 있는다고 간주되어야 하고, 당업자는, 본 명세서의 문맥에 따라, 본 발명의 정신 및 범위를 이탈하지 않고, 그들의 선행기술문헌에서 관련하는 개시내용을 본 명세서의 일부로 인용하여 이해한다.
이하에서, 본 발명을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러가지 양태에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 관련분야의 당업자는, 본 발명의 정신 또는 범위를 변경시키지 말고 다양한 개변, 부가, 결실, 치환 등에 따라 본 발명을 실시할 수 있다.
〔 실시예 〕
이하의 실시예에는, 디시알로 당쇄 화합물에 대해서는, 이하의 식(7)에서
Figure 112014104772291-pct00024
(7)
R 및 R＇가 모두 이하의 식(8a)
Figure 112014104772291-pct00025
(8a)
로 나타내는 당쇄를 사용한 것으로,
아시알로 당쇄 화합물에 대해서는, 상기 식(7)에서 R 및 R＇가 모두 이하의 식(8d)
Figure 112014104772291-pct00026
(8d)
로 나타내는 당쇄를 사용한 것으로,
DiGlcNAc 당쇄 화합물에 대해서는, 상기 식(7)에서 R 및 R＇이 모두 이하의 식
Figure 112014104772291-pct00027
(8e)
으로 나타내는 당쇄를 사용한 것이다.
단, 본 명세서를 본 당업자라면, 이들의 당쇄를 사용한 경우에 더해, 본 발명의 다른 당쇄를 사용한 경우에도, 이하의 실시예와 같이 필요에 따라 적절히 검토를 더해 제조가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 이하의 실시예에서, 「-NH-AC-」란, 「-NH-CO-CH2-」를 의미한다.
〔 참고예 〕
참고예 1: 디시알로 당쇄 아스파라긴 혼합물의 합성
에탄올(EtOH, 67mL)을 교반하고 있는 중에 난황 1개를 깨어넣었다. 약 5시간 교반한 후에 여과하고, 다시 EtOH(30mL)로 세척을 하였다. 얻어진 결정에 재차 EtOH(83 mL)를 첨가하고 하룻밤 교반한 다음에 여과를 하고, 이어서 EtOH(30 mL)로 세척하였다. 다음으로 결정을 건조시켜, 탈지난황(Delipidated Egg Yolk)을 약3g 얻었다.
얻어진 탈지난황을, 인산 완충액(pH=7,0, 30 mL)에 용해시킨 후, NaN3(10 mg)을 첨가하였다. 추가로, 오리엔타제ONS(HBI 사제, 1.0 g)을 첨가하고, 50℃에서 약 24시간 방치하였다. 반응의 종료를 박층 크로마토그라피(TLC)로 확인한 후, 반응액을 셀라이트(등록상표)(Celite Corporation)을 사용하여 여과하였다. 여과액을 농축을 통해 줄인 다음, 겔 여과 컬럼크로마토그라피(Sephadex G-25, 2.5 x 100 cm, water)로 정제하였다. 목적으로 하는 당이 포함되는 분획을 회수하여 농축한 다음, 동결건조를 하였다.
얻어진 잔류물(약 430 mg)에 Tris-HCl·염화칼슘 완충용액(pH=7.4, 43 mL), 아지화 나트륨(NaN3, 21 mg)을 첨가하여, 해당 잔류물을 용해시켰다. 추가로, 액티나아제 E(43 mg)를 첨가하여 12시간마다 pH를 체크하면서 24시간 방치시켰다. 24시간 방치후, 반응액에 재차 액티나아제 E(21.5mg)을 첨가하고, 다시 pH를 채크하면서 약 48시간 반응시켰다. 반응의 종료를 TLC로 확인한 후, 셀라이트로 여과하였다. 여과액를 농축을 통해 줄인 다음, 겔 여과 컬럼크로마토그라피(Sephadex G-25, 2.5 x 100 cm, water)로 정제하였다. 목적으로 하는 디시알로 당쇄 아스파라긴을 포함하는 분획을 회수한 다음, 동결건조하여 디시알로 당쇄 아사파라긴을 포함하는 혼합물을 얻었다.
참고예 2: Fmoc 기로 아스파라긴의 아미노기의 질소가 보호된 디지알로 당쇄 아스파라긴- Fmoc 의 합성
참고예 1에서 얻어진 디지알로 당쇄 아스파라긴 혼합물(약 120 mg)을 물(1.5 mL)에 녹이고, 탄산수소나트륨(26 mg)을 첨가하였다. 추가로, Fmoc-Osu[N-(9-플루오레닐 메틸옥시 카르보닐(옥시숙신이미드)](68 mg)를 녹인 디메틸포름 아미드(DMF, 2.5 mL)를 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 원료소실을 TLC로 확인한 후, 증발기를 사용하여 농축하였다. 잔사에 물(15 mL), 다이에틸에테르(25 mL)를 첨가하여 10분간 교반하였다. 이어서, 분액 조작(liquid separation)을 행한 후, 수층을 다이에틸에테르(15 mL)로 세척하고, 다시 농축, 동결건조하였다. 이어서, 얻어진 잔류물을 ODS컬럼(Wakogel 100C18)을 사용하여 농도구배로 정제하였다. 당쇄가 포함되어 있는 분획을 회수하고, 농축 후, 동결건조하였다. 얻어진 잔류물을 HPLC분취 컬럼으로 정제하였다(YMC-Pack R&D ODS, D-ODS-5-A, 20 × 250 mm, AN/25 mM AcONH4 buffer = 20/80, 7.5 ml/min). 약 15분 후에 나오는 메인 피크를 분취 후, 농축하였다. 이어서, ODS컬럼으로 탈염처리하였다. 동결건조하여 목적으로 하는 Fmoc기에서 아스파라긴의 아미노기 질소가 보호된 당쇄 아스파라긴 화합물인 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc를 약 13.3 mg얻었다.
참고예 3: 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 아스파라긴- Fmoc 의 합성
4℃로 냉각한 Dowex-50W × 8 (H+) 의 컬럼 (φ 0.5 cm × 5 cm)에, 참고예 2에서 얻은 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc (20 mg, 7.8 μmol)의 냉각용액을 부어, 용출한 수용액을 동결건조하였다.
얻어진 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc를 4℃의 냉수에 녹이고, 여기에 Cs2CO3수용액(2.5 mg/1 mL)을 첨가하여 수용액의 pH가 5 내지 6이 되도록 조절하였다. 그 다음, 이 당쇄 수용액을 동결건조하였다. 동결견조 후의 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc시료를 건조 DMF(1.3 mL)에 녹이고 벤질 브로마이드(5.1 μL)를 첨가하여 아르곤 기류 하의 실온에서 45시간 교반하였다. TLC로 반응 종료를 확인 후, 반응 용액을 0℃로 냉각한 다이에틸에테르(10 mL)에 첨가하여 목적물을 석출하였다. 이것을 여과지를 사용하여 여과하였다. 남은 목적물에 증류수를 첨가하고, 여과액으로써 용출시킨 후, 계속해서 이를 감압농축하였다. 얻어진 잔사를 ODS컬럼에 의해 정제하고, 목적화합물로써의 시알산 중의 카르본산을 벤질 에스테르화한 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(18.2 mg, 6.6 μmol, 수율 85%)를 얻었다.
참고예 4: 시알산 중의 카르본산이 페나실에스테르기로 보호된 디시알로 당쇄 아스파라긴- Fmoc 의 합성
참고예 2에서 얻어진 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(153 mg, 59.8 μmol)를 DMF(1.9 mL)에 녹이고, 여기에 LiBr(51.9 mg, 598.0 μmol), 페나실브로마이드(119.0 mg, 598.0 μmol)를 첨가하여 37℃에서 18시간 교반하였다. HPLC로 반응의 종료를 확인한 후, 톨루엔(20 mL)중에 반응용액을 첨가하여 당쇄 성분을 슬러리로써 석출하였다. 이 슬러리에 대해서, 원심분리기에 의해 원심조작하여 목적의 당쇄를 포함하는 잔사를 회수하였다. 회수한 잔사를 ODS컬럼에 의해 정제하고 목적 화합물로써 시알산 중의 카르본산이 페나실에스테르화 된 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(100.4 mg, 35.9 μmol, 수율 60%)를 얻었다.
참고예 5: 고정화 GA 효소의 조제
그램음성간균 Elizabethkingia meningoseptica의 게놈 DNA로부터 글리코실 아스파라기나제(GA)를 인코딩하는 영역을 PCR에 의해 취득하였다. GA효소의 정제를 간편하게 하기 위해, GA유전자의 C말단에 His×6 tag 유전자를 부가하고, 단백질 발현용 벡터 pET24a (Novagen)을 이용하여 C말단 His tag융합 GA발현 백터를 구축하였다. C말단 His tag융합 GA발현 백터에 의해 숙주대장균주 Rosetta2(DE3)pLysS(Novagen)을 형질전환하였다. 이 균을 2×YT배지에서 배양하고 목적 단백질을 균체내 가용성 단백질로 발현시켰다. 균체를 초음파로 파괴하여 목적단백질을 용출시켜, Ni2 +컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 목적단백질을 정제하였다.
정제 후의 단백질 용액(100 mL, 단백질 농도: 17.5 mg/mL, 비활성: 69.6 units/mL)을 미리 0.1 M 인산 완충액(pH=7.4)으로 세척한 고상 수지(TOYOPEARL AF-Tresyl, 30 g) 에 첨가하여 20℃에서 4시간 교반하였다. 4시간 후 여과하고, 회수한 고상 수지를 1 M NaCl로 세척하였다. 고상 수지 상의 잔존 활성기를 캐핑하기 위해, 0.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl완충액 (pH = 7.4, 200 mL)을 첨가하여 20℃에서 1시간 교반하엿다. 1시간 후, 여과하고 회수한 고상 수지를 1M NaCl수용액, 다음으로, 물로 세척하여, 수지 표면에 GA효소가 고정화된 고상 수지(고정화 GA효소 함유 고상 수지. 이하, 고정화 GA효소라고도 한다.)(120mL, 비활성 5.8unit/mL)를 얻었다.
실시예 1: 공정(a)를 37℃의 온도 조건 하에서 수행한 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 - NH - AcBr 의 합성
참고예 3에서 얻어진 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(1.0 g, 0.4 mmol)을 디메틸포름 아미드(DMF) (10.0 mL)에 녹인 후, 피폐리딘(144.2 μL, 1.5 mmol)을 첨가하여 실온에서 반응시켰다. 30분 후, HPLC분석(하기 분석조건(1))에서 20분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 13분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 여기서 새로운 피크로 확인된 화합물은 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 아스파라긴이라고 추정되었다. 반응 종료를 확인 후, 반응용액을 다이클로로메테인(DCM, 50 mL)에 첨가하여 당쇄 화합물을 침전시켰다. DCM 중에 침전되어 있는 당쇄 화합물을 용해하기 위해서, 4.6% 브로모아세트산 수용액(10 mL)를 첨가하여 DCM을 분상하여 제거하고 수상을 DCM으로 세척 후, 회수하였다. 회수한 수상에 NaHCO3 (874.0 mg), 참고예 5에서 조제한 고정화 GA효소(약 10 mL)를 첨가하여 37℃의 온도조건 하에서 교반하였다. 반응개시로부터 1시간 후, HPLC분석(분석조건(2))에서 14분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 16분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인한 후, 고정화 효소를 여과에 의해 제거하였다. 여기서, 새로운 피크로 확인된 화합물은 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄-NH2라고 추정되었다. 얻어진 여과액에 NaHCO3 (537.6 mg, 6.4 mmol)를 첨가한 후에, 아세트나이트릴(10 mL)에 용해한 브로모아세틸브로마이드(1.1 mL, 12.7 mmol)를 첨가하여 얼음냉각하에서 교반하였다. HPLC분석(분석조건(2))에서 16분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 27분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 또한, 이 브로모아세틸브로마이드와의 반응은 1시간 이내에 완료하였다. 여기서, 새로운 피크로 확인된 화합물은 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄-NH-AcBr이라고 추정되었다. 반응종료 확인 후, 5% HBr수용액(30 mL)으로 반응용액을 희석하고 ODS담채를 이용하여 정제함으로써 (Nacalaitesque, ODS-140C18OPN, 물, 5% 아세트나이트릴 수용액, 50% 아세트나이트릴 수용액의 순으로 용매를 치환하여 당쇄를 용출시킨다)벤질 에스테르화한 디시알로 당쇄 브로모아세토아미드를 수량 816.0 mg, 수율 89%로 얻었다. 얻어진 당쇄를 분석한 결과, α이성체 존재비는 5.1%였다. 또한 α이성체 존재비는, 이하의 1H-NMR조건에서 1H-NMR을 이용하여 분석하고, 1H-NMR에서의 면적백분율에 의해 산출하였다. 또한, 실시예 및 비교예에서, α이성체 존재비의 분석방법에 대해서는 이하 동일하다.
HPLC분석조건(1): (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 90% 0.70 mL/min -> A 40% 0.70 ml/min, 30 분)
HPLC분석조건(2): (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매: 25 mM 아세트산암모니아 수용액:아세트나이트릴 = 86:14, 0.70 ml/min, 0.70 ml/min)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준 : 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.42(m, 10H, Ar), 5.68(d, GlcNAc1-H-1(α이성체)), 5.31(d, 1H, Bn-CH 2), 5.24(d, 1H, Bn-CH 2), 5.05(s, 1H, Man4-H-1), 5.00(d, 1H, GlcNAc1-H-1 (β이성체)), 4.87(s, 1H, Man4'-H-1), 4.53(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1),4.26(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.18(bs, 1H, Man3-H-2), 4.12(bd, 1H, Man4-H-2), 4.04(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.61(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 2.01, 1.97, 1.95, 1.94(m, 18H, Ac x 6), 1.77(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C100H152BrN7O62 [M+Na]+ 2544.804, 실측치 2544.470
실시예 2: 공정(a)를 4℃이하의 온도 조건하에서 수행한 시알산을 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 - NH - AcBr 의 합성
참고예 3에서 얻은 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(29.8 g, 10.9 mmol)을 디메틸포름 아미드 (DMF, 297.5 mL)에 녹이고, 피페리딘(4.3 mL, 43.4 mmol)을 첨가하여 실온에서 반응시켰다. 30분 후, HPLC분석(분석조건(1)) 에서 20분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 13분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 여기서, 새로운 피크로 확인된 화합물은 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 아스파라긴이라고 추정되었다. 반응종료를 확인 후, 반응용액을 DCM(900 mL)에 첨가하고 당쇄를 침전시켰다. DCM 중에 침전해 있는 당쇄를 용해하기 위해, 4.6%의 브로모아세트산 수용액(312 mL)를 첨가하고 DCM을 분상하여 제거하고 수상을 DCM으로 세척 후, 회수하였다. 회수한 수상에 NaHCO3 (26.0 g)을 첨가하고 1시간 4℃로 냉각하였다. 1시간 후, 고정화 GA효소(약 100 mL)를 첨가하고 4℃의 온도 조건하에서 교반하였다. 반응개시로부터 1시간 후, HPLC분석(분석조건(2))에서 14분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 16분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인한 후, 고정화 효소를 여과에 의해 제거하였다. 여기서 새로운 피크로 확인된 화합물은 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 -NH2라고 추정되었다. 얻어진 여과액에 NaHCO3(63.8 g, 760.0 mmol)을 첨가한 후에, 아세트나이트릴(110 mL)에 용해한 브로모아세틸브로마이드(32.9 mL, 380.0 mmol)에 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. HPLC분석(분석조건(2))에서 16분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 27분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 또한, 이 브로모아세틸브로마이드와의 반응은 1시간 이내에 완료하였다. 여기서, 새로운 피크로 확인된 화합물은 시알산 중의 카르본산이 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄-NH-AcBr이라고 추정되었다. 반응종료 확인 후, 5% Hbr수용액(450 mL)으로 반응용액을 희석하고 ODS담체를 사용하여 정제함으로써(Nacalaitesque, ODS-140C18OPN, 물, 5% 아세트나이트릴 수용액, 50% 아세트나이트릴 수용액 순으로 용매를 치환하고 당쇄를 용출 시킨다) 벤질 에스테르화된 디시알로 당쇄 브로모아세트아마이드(이하, 디Bn디시알로-NH-AcBr)이라고도 한다)를 수량 26.6g, 수율 97%로 얻었다. 얻어진 당쇄를 분석한 결과, 그의 α이성체 존재비는 (n=2로 실험을 한 결과 모두)0.8%이하였다.
HPLC분석조건 (1): (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 90% 0.70 mL/min -> A 40% 0.70 ml/min, 30 분)
HPLC 분석조건 (2): (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매: 25 mM 아세트산암모니아 수용액:아세트나이트릴 = 86:14, 0.70 ml/min, 0.70 ml/min)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.39(m, 10H, Ar), 5.29(d, 1H, Bn-CH 2), 5.22(d, 1H, Bn-CH 2), 5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.98(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.68(s, 1H, Man3-H-1), 4.51(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.24(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.16(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.02(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.59(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.98, 1.95, 1.92, 1.91(m, 18H, Ac x 6), 1.75(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C100H152BrN7O62 [M+Na]+ 2544.804, 실측치 2545.509
실시예 3: 디시알로 당쇄 아스파라긴의 합성
참고예 2에서 얻어진 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(15.5 g, 6.1 mmol)을 물(100 mL)에 용해하고 25% 암모니아수(125 mL)를 첨가하여 37℃에서 교반하였다. 4시간 후, HPLC분석에서 7분에 용출하는 원료 피크의 소실로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 반응 중에 생긴 불용물을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 동결건조함으로써 디시알로 당쇄 아스파라긴을 수량 14.1 g, 수율 99%로 얻었다.
HPLC 분석조건: (UG-120 (250 × 4.6 mm), 전개용매: 25 mM 아세트산암모니아 수용액:아세트나이트릴 = 80:20, 0.70 mL/min)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.04(s, 1H, Man4-H-1), 4.98(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.86(s, 1H, Man4'-H-1), 4.52(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.35(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.16(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.03(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.83(dd, 1H, Asn(CH 2)), 2.74(dd, 1H, Asn(CH 2)), 2.58(bdd, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.99, 1.98, 1.97, 1.94, 1.92(m, 12H, Ac x 3), 1.63(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C88H141BrN8Na3O64 [M+Na]+ 2425.762, 실측치 2425.480
실시예 4: 디시알로 당쇄 - NH - AcBr 의 합성
실시예 3에서 합성한 디시알로 당쇄 아스파라긴(0.9 g, 0.4 mmol)을 1 M NaHCO3수용액(10 mL)에 용해하고 1시간 4℃에서 냉각하였다. 1시간 후, 고정화 GA효소(약 4 mL)를 첨가하고 4℃의 온도 조건하에서 교반하였다. 반응개시에서 1시간 후, HPLC분석에서 13분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 16분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인한 후, 고정화 효소를 여과에 의해 제거하였다. 여기서 새로운 피크로 확인된 화합물은 디시알로 당쇄-NH2라고 추정되었다. 얻어진 여과액에 NaHCO3(3.1 g, 37.0 mmol)을 첨가한 후에, 다이클로로메테인(DCM, 5.6 mL)에 용해한 브로모에세틸브로마이드(1.6 mL, 18.5 mmol)를 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. HPLC분석에서 16분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 20분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응을 종료하였다. 또한, 이 브로모아세틸브로마이드와의 반응은 1시간 이내에 완료하였다. 여기서, 새로운 피크로 확인된 화합물은 디시알로 당쇄-NH-AcBr이라고 추정되었다. 다음으로 분상에 의해 DCM상을 제거하고 수상을 겔 여과 컬럼크로마토그라피(Sephadex G25, 2.3 cm × 100 cm, 물, 유속 1.0 ml/min) 로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축 후, 동결건조하여 디시알로 당쇄 브로모아세트아마이드(디시알로 당쇄-NH-AcBr)를 수량 0.4 g, 수율 46%로 얻었다. 얻어진 당쇄를 분석한 결과, 그의 α이성체 존재비는 0.2%였다.
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.04(s, 1H, Man4-H-1), 4.98(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.85(s, 1H, Man4'-H-1), 4.52(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.35(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.16(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.02(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.57(bdd, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.99, 1.98, 1.93, 1.91(m, 12H, Ac × 3), 1.65(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax) MALDI-MS: 계산치 C86H138BrN7Na2O62 [M+Na]+ 2408.674, 실측치 2408.620
실시예 5: 아시알로 당쇄 아스파라긴의 합성
아시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(Glytech. Inc. 제, 7.2 g, 3.6 mmol)을 물(36 mL)에 용해하고, 25% 암모니아수(60 mL)를 첨가하여 37℃에서 교반하였다. 4시간 후, HPLC분석에서 12분에 용출하는 원료 피크의 소실로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 반응 중에 생긴 불용물을 여과에 의해 제거하고 여과액을 동결건조함으로써 아시알로 당쇄 아스파라긴을 수량 6.2 g, 수율 97%로 얻었다.
HPLC 분석조건: (Kromasil (250 × 4.6 mm), 전개용매: 25 mM 아세트산암모니아 수용액:아세트나이트릴 = 80:20, 0.70 mL/min)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.04(s, 1H, Man4-H-1), 4.99(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.52(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.39(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.17(bs, 1H, Man3-H-2), 4.11(bd, 1H, Man4-H-2), 4.03(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.81(dd, 1H, Asn(CH2)), 2.70(dd, 1H, Asn(CH2)), 2.00, 1.97, 1.96, 1.93(m, 12H, Ac x 3)
MALDI-MS: 계산치 C66H110N6O48 [M+Na]+ 1777.625, 실측치 1777.675
실시예 6: 아시알로 당쇄 - NH - AcBr 의 합성
실시예 5에서 합성한 아시알로 당쇄 아스파라긴(2.5 g, 1.4 mmol)을 0.5 M NaHCO3 수용액(31.5 mL)에 용해하고 1시간 4℃로 냉각하였다. 1시간 후, 고정화 GA효소(약 12 mL)를 첨가하고 4℃하에서 교반하였다. 반응개시에서 1시간 후, HPLC분석에서 13분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 21분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인한 후, 고정화 효소를 여과에 의해 제거하였다. 얻어진 여과액에 NaHCO3(8.5 g, 98.0 mmol)를 첨가한 후에, DCM (16.7 mL)에 용해한 브로모아세틸브로마이드(4.4 mL, 49.0 mmol)를 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. HPLC분석에서 21분에 용출하는 원료의 피크의 소실 및 24분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 또한, 이 브로모아세틸브로마이드와의 반응은, 1시간 이내에 완료하였다. 반응 종료 확인후, 분상에 의해 DCM상을 제거하고 수상을 겔 여과 컬럼크로마토그라피 (Sephadex G25, 2.3 cm × 100 cm, 물, 유속 1.0 ml/min)로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 아시알로 당쇄 브로모아세트아미드 (아시알로 당쇄-NH-ArBr)을 수량 2.0 g, 수율 80%로 얻었다. 얻어진 당쇄를 분석한 결과, 그의 α이성체 존재비는 1.0%였다. 이 1H-NMR 스펙트럼을 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 주 생성물인 β이노머 이외에, 원료 유래의 불순물 등의 시그널은 거의 전혀 확인되지 않았다.
HPLC 분석조건: (Hydrosphere 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 암모니아 아세트산, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 100% 0.70 ml/min -> A 90% 0.70 ml/min, 30 분)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.97(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.51(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.38(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.17(bs, 1H, Man3-H-2), 4.11(bd, 1H, Man4-H-2), 4.03(bd, 1H, Man4'-H-2), 1.99, 1.97, 1.96, 1.92(m, 18H, Ac × 6)
MALDI-MS: 계산치 C64H106BrN5O46 [M+Na]+ 1782.519, 실측치 1782.462
실시예 7: DiGlcNAc 당쇄 아스파라긴의 합성
DiGlcNAc 당쇄 아스파라긴-Fmoc(Glytech. Inc. 제, 1.0 g, 0.6 mmol)을 물(5.1 mL)에 용해하고 25% 암모니아수(8.5 mL)를 첨가하여 37℃에서 교반하였다. 4시간 후, HPLC분석에서 17분에 용출하는 원료 피크의 소실로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 반응 중에 생긴 불용물을 여과에 의해 제거하고 여과액을 동결건조함으로써 DiGlcNAc 당쇄 아스파라긴을 수량 0.8 g, 수율 95%로 얻었다.
HPLC 분석조건: (UG-120 (250 x 4.6 mm), 전개용매: 25 mM 아세트산암모니아 수용액:아세트나이트릴 = 78:22, 0.70 mL/min)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부기준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.99(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.53(d, 1H, GlcNAc2-H-1), 4.47(d, 2H, GlcNAc5,5'-H-1), 4.16(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.02(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.83(dd, 1H, Asn(CH2)), 2.75(dd, 1H, Asn(CH2)), 1.99, 1.97, 1.93(s, 12H, Ac × 4)
MALDI-MS: 계산치 C54H90N6O38 [M+Na]+ 1453.519, 실측치 1453.384
실시예 8: DiGlcNAc 당쇄 - NH - AcBr 의 합성
실시예 7에서 합성한 DiGlcNAc 당쇄 아스파라긴(0.7 g, 0.5 mmol)을 0.5 M NaHCO3수용액(17.4 mL)에 용해하고 1시간 4℃로 냉각하였다. 1시간 후, 고정화 GA효소(약 5 mL)를 첨가하여 4℃하에서 교반하였다. 반응개시로부터 시간 후, HPLC분석에서 12분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 21분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인한 후, 고정화 효소를 여과에 의해 제거하였다. 얻어진 여과액에 NaHCO3 (2.0 g, 33.4 mmol)을 첨가한 후에, DCM(16.7 mL)에 용해한 브로모아세틸브로마이드(1.1 mL, 16.7 mmol)을 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. HPLC분석에서 21분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 29분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 또한, 이 브로모아세틸브로마이드와의 반응은 1시간 이내에 종료하였다. 반응종료 확인 후, 분상에 의해 DCM상을 제거하고, 수상을 겔 여과 컬럼크로마토그라피 (Sephadex G25, 2.3 cm × 100 cm, 물, 유속 1.0 ml/min) 로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 DiGlcNAc 당쇄 브로모아세트아미드를 수량 0.6g, 수율 88%)로 얻었다. 얻어진 당쇄 화합물을 분석한 결과, 그의 α이성체 존재비는 (n=2로 실험한 결과, 모두)0.1% 이하였다.
HPLC 분석조건: (Hydrosphere 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 100% 0.70 ml/min -> A 90% 0.70 ml/min, 30 분)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.99(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.83(s, 1H, Man4'-H-1), 4.53(d, 1H, GlcNAc2-H-1), 4.47(d, 2H, GlcNAc5,5'-H-1), 4.17(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.02(bd, 1H, Man4'-H-2), 1.99, 1.97, 1.92(s, 18H, Ac x 6)
MALDI-MS: 계산치 C52H86BrN5O36 [M+Na]+ 1458.413, 실측치 1458.575
실시예 9: 시알산의 카르본산을 아미드화 한 디시알로 당쇄 아스파라긴- Fmoc 의 합성
참고예 4에서 합성한 시알산의 카르본산이 페나실에스테르기로 보호된 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(3.0 g, 1.1 mmol)을 포화탄산수소암모늄 수용액(30 mL)에 용해하고 3시간 교반하였다. 반응 중에 생긴 침전을 원심조작으로 제거하고, 상청액을 겔 여과 컬럼크로마토그라피(Sephadex G25, 2.3 cm × 100 cm, 물, 유속 1.0 ml/min)로 탈염하여 당쇄가 포함되는 분획을 모아 농축, 동결건조하였다. 동결건조 후의 당쇄 화합물을 물(60 mL)에 용해하고 NaHCO3 (900 mg), DMF (30 mL)에 용해한 Fmoc-OSu (1.8 g)을 얼음냉각 하에서 첨가하여, 실온에서 교반하였다. 반응개시로부터 12시간 후, 반응용액을 아세톤(500mL)에 첨가하여 당쇄를 침전시켰다. 침전을 원심조작에 의해 회수하고 상온, 상압에서 건조시켰다. 건조 후, 얻어진 잔사를 물에 용해하고 HPLC로 정제하여 시알산의 카르본산을 아미드화 한(「-COOH를 -CONH2」로 하였다) 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc를 수량 1.1 g, 수율 40.0%로 얻었다.
(Hipersep LC200 Kromasil 13C18 200 × 250 mm, 전개용매: 25 mM NH4OAc 수용액:아세트나이트릴 = 85:15, 1.883 L/min)
MALDI-MS: 계산치 C103H156N10O64 [M+Na]+ 2579.916, 실측치 2580.103
또한, 실시예 9에서 이용한 시알산의 카르본산이 페나실에스테르기로 보호된 경우의 시알산 부분의 화학구조는 이하와 같은 식으로 나타낼 수 있다(이하의 식은 보호된 시알산의 부분만을 나타낸다)
Figure 112014104772291-pct00028
실시예 10: 시알산의 카르본산이 아미드화 된 디시알로 당쇄 - NH - AcBr 의 합성
실시예 9에서 얻어진 시알산의 카르본산이 아미드화 된 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(1.0 g, 0.4 mmol)을 25% 암모니아수(15 mL)에 용해하고 37℃에서 교반하였다. 4시간 후, HPLC분석에서 11분에 용출하는 원료 피크의 소실로 반응의 종료를 확인하였다. 반응 중에 생긴 불용물을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 동결건조하였다. 동결건조 후, 0.5 M NaHCO3수용액에 용해하고 1시간 4℃로 냉각하였다. 1시간 후, 고정화 GA효소(약 5.0 mL)을 첨가하여 4℃하에서 교반하였다. 반응개시로부터 1시간 후, HPLC로 반응의 종료를 확인하고, 고정화효소를 여과에 의해 제거하였다. 얻어진 여과에 NaHCO3 (3.6 g, 41.6 mmol)를 첨가한 후에, DCM(6.5 mL)에 용해한 브로모아세틸브로마이드(1.8 mL, 20.8 mmol)을 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. 또한, 이 브로모아세틸브로마이드와의 반응은 1시간 이내에 완료하였다. 반응종료 확인 후, 분상에 의해 DCM상을 제거하고 수상을 겔 여과 컬럼크로마토그라피(Sephadex G25, 2.3 cm × 100 cm, 물, 유속 1.0 ml/min)로 정제하고, 농축, 동결건조하여, 시알산의 카르본산을 아미드화한 디시알로 당쇄 브로모아세트아미드(시알산의 카르본산을 아미드화한 디시알로 당쇄-NH-AcBr)를 수량 0.5g, 수율 52%로 얻었다. 얻어진 당쇄를 분석한 결과, 그의 α이성체 존재비는 0.8%였다.
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.07(s, 1H, Man4-H-1), 5.01(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.88(s, 1H, Man4'-H-1), 4.55(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.39(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.20(bs, 1H, Man3-H-2), 4.14(bd, 1H, Man4-H-2), 4.06(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.62((bdd, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 2.04, 2.04, 2.00, 1.98, 1.95(m, 18H, Ac × 6), 1.78(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C86H142BrN9O60 [M+Na]+ 2362.742, 실측치 2362.484
다음으로, 실시예 2에서 합성한 벤질 에스테르화한 디시알로 당쇄 브로모아세트아미드(다이Br디시알로 당쇄-NH-AcBr), 실시예 4에서 합성한 디시알로 당쇄-NH-AcBr을 원료로, 다양한 유도체의 합성을 수행하였다.
실시예 11: 디 Bn디시알로 당쇄 - NH - AcCl 의 합성
실시예 2에서 합성한 디Bn디시알로 당쇄-NH-AcBr(30.8 mg, 12.2 μmol)을 물(950 μL)에 용해하고 염화나트륨(NaCl, 60.0 mg, 1.0 mmol)을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 96시간 후, HPLC분석에서 28분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 26분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 반응용액을 겔 여과 컬럼크로마토크라피 (Sephadex G25, 1.5 cm × 45 cm, 물, 유속 0.7 mL/min)로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 디Bn-디시알로-AcCl을 수량 22.3 mg, 수율 74%로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.40(m, 10H, Ar), 5.28(d, 1H, Bn-CH 2), 5.21(d, 1H, Bn-CH 2), 5.02(s, 1H, Man4-H-1), 4.99(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.67(s, 1H, Man3-H-1), 4.51(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.23(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.15(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.02(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.59(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.98, 1.94, 1.92, 1.91(m, 18H, Ac × 6), 1.75(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C100H152ClN7O62 [M+Na]+ 2502.729, 실측치 2501.034
실시예 12: 디 Bn디시알로 당쇄 - NH - AcI 의 합성
실시예 2에서 합성한 디Bn디시알로 당쇄-NH-AcBr(30.9 mg, 12.2 μmol), 물(900 μL)에 용해하고, 요오드화나트륨(NaI, 150.0 mg, 1.0 mmol)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, HPLC분석에서 28분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 31분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 반응용액을 겔 여과 컬럼크로마토그라피(Sephadex G25, 1.5 cm × 45 cm, 물, 유속 0.7 mL/min)로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 디Bn-디시알로 당쇄-NH-AcI를 수량 28.5mg, 수율 91%로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.41(m, 10H, Ar), 5.29(d, 1H, Bn-CH 2), 5.22(d, 1H, Bn-CH 2), 5.04(s, 1H, Man4-H-1), 4.96(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.85(s, 1H, Man4'-H-1), 4.68(s, 1H, Man3-H-1), 4.51(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.24(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.16(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.02(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.59(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.99, 1.95, 1.93, (m, 18H, Ac × 6), 1.75(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C100H152ClN7O62 [M+Na]+ 2592.790, 실측치 2592.929
실시예 13: 디 Bn디시알로 당쇄 - NH - AcN 3
실시예 2에서 합성한 디Bn디시알로 당쇄-NH-AcBr(51.9 mg, 20.6 μmol)을 DMF(1 mL)에 용해하고 아지드화나트륨(NaN3, 64.4 mg, 990.4 μmol)을 첨가하여 37℃로 교반하였다. 6시간 후, HPLC분석에서 26분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 28분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 아세트산에틸(EtOAc, 4 mL)중에 반응용액을 첨가하고, 당쇄 성분을 침전시켰다. 침전물을 원심분리기에 의한 원심분리로 회수하고, 회수한 잔사를 HPLC로 분취함으로써 디Bn디시알로 당쇄-NH-AcN3를 수량 35.3 mg, 수율 69%로 얻었다.
HPLC 분석조건: (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용액:물:아세트나이트릴 = 86:14, 0.70 mL/min)
HPLC 분취조건: (UG-120 250 × 20 mm, 전개용액:물:아세트나이트릴 = 86:14, 7.0 mL/min)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.40(m, 10H, Ar), 5.28(d, 1H, Bn-CH 2), 5.21(d, 1H, Bn-CH 2), 5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.99(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.67(s, 1H, Man3-H-1), 4.51(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.23(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.15(bs, 1H, Man3-H-2), 4.10(bd, 1H, Man4-H-2), 4.02(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.58(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.98, 1.94, 1.92, 1.91(m, 18H, Ac × 6), 1.79(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C100H152N10O62 [M+Na]+ 2507.895, 실측치 2507.702
실험예 14: 디시알로 당쇄 - NH - AcNHNH 2
실시예 4에서 합성한 디시알로 당쇄-AcBr(90.9 mg, 38.8 μmol)을 0.1M 인산완충용액(pH=7.4)에 용해하고 하이드라진 수화물(10 μL)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 7시간 후, HPLC분석에서 12분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 10분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 아세트산(20 μL)을 첨가하여 중화하고 겔 여과 컬럼크로마토그라피 (Sephadex G25, 1.5 cm × 45 cm, 물, 유속 0.7 mL/min)으로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 디시알로 당쇄-NH-AcNHNH2를 수량 82.5 mg, 수율 93%로 얻었다. HPLC 분석조건: (Hydrosphere 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 98% 0.70 ml/min -> A 65% 0.70 ml/min, 30 분)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ5.06(s, 1H, Man4-H-1), 5.03(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.88(s, 1H, Man4'-H-1), 4.54(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.38(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.18(bs, 1H, Man3-H-2), 4.12(bd, 1H, Man4-H-2), 4.05(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.60(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 2.01, 2.00, 1.96, 1.93(m, 18H, Ac × 6), 1.66(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax) ESI-MS: 계산치 C86H143N9O62 [M+2H]2+ 1147.916, [M+3H]3+ 765.610, 실측지 1147.930, 765.620
실시예 15: 디 Bn디시알로 당쇄 - NH - Ac - SH
실시예 2에서 합성한 디Bn디시알로 당쇄-NH-AcBr(97.2 mg, 38.5 μmol)을 0.1 M 인산완충용액(pH=7.4, 2 mL)으로 용해하고 티오아세트산(5 μL, 61.4 μmol)을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 1시간 후, HPLC분석에서 23분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 24분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 계속해서 2-머캅토에탄술폰산나트륨(2-mercaptoethane sulfonate sodium, MESNA, 162.0 mg, 986.7 μmol)을 반응용액에 더해서 실온에서 교반하였다. 44시간 후, HPLC분석에서 24분에 용출하는 원료 피크의 감쇠 및 22분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, HPLC분석으로 분취하여 목적 당쇄가 포함되는 분획의 탈염을 겔 여과 컬럼크로마토그라피(Sephadex G25, 1.5 cm × 45 cm, 물, 유속 0.4 mL/min)에 의해 수행하고, 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조함으로써 디Bn디시알로 당쇄-NH-Ac-SH를 수량 48 mg, 수율 50%로 얻었다.
HPLC 분석조건: (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 90% 0.70 mL/min -> A 70% 0.70 mL/min, 30 분)
HPLC 분취조건: (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 90% 0.70 mL/min -> A 70% 7.00 mL/min, 30 분)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.40(m, 10H, Ar), 5.29(d, 1H, Bn-CH 2), 5.22(d, 1H, Bn-CH 2), 5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.96(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.51(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.24(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.15(bs, 1H, Man3-H-2), 4.09(bd, 1H, Man4-H-2), 4.01(bd, 1H, Man4'-H-2), 3.13(dd, 2H, -COCH 2 SH), 2.58(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.98, 1.94, 1.92, 1.91(m, 18H, Ac × 6), 1.75(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C100H153N7O62S [M+Na]+ 2498.865, 실측치 2499.051
실시예 16: 디 Bn디시알로 당쇄 - NH - Ac - SCH 2 CH 2 NH 2
실시예 2에서 합성한 디Br디시알로 당쇄-NH-AcBr(106.4 mg, 42.2 μmol)을 61 mM 시스테아민, 20 mM 트리스-2-카르복실에틸포스핀염산염(TCEP)를 포함하는 0.1 M 인산완충용액(pH=7.0, 0.4 mL)에 용해하고 실온에서 교반하였다. 20시간 후, HPLC분석에서 23분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 19분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, HPLC로 분취하고 목적 당쇄가 포함되는 분획의 탈염을 겔 여과 컬럼크로마토그래피 (Sephadex G25, 1.5 cm × 45 cm, 물, 유속 0.4 mL/min)에 의해 수행하고 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조함으로써 디Bn디시알로 당쇄-NH-Ac-SCH2CH2NH2를 수량 63mg, 수율 59%로 얻었다.
HPLC 분석조건: (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 90% 0.70 mL/min -> A 70% 0.70 mL/min, 30 분)
HPLC 분취조건: (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매: 25 mM 아세트산암모니아 수용액:아세트나이트릴 = 85:15, 7.00 mL/min, 30 분)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.40(m, 10H, Ar), 5.29(d, 1H, Bn-CH 2), 5.22(d, 1H, Bn-CH 2), 5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.98(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.50(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.24(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.15(bs, 1H, Man3-H-2), 4.09(bd, 1H, Man4-H-2), 4.01(bd, 1H, Man4'-H-2), 3.23(bs, 2H, -COCH 2 S-), 3.12(m, 2H, -SCH 2 CH2NH2-), 2.78(m, 2H, -SCH2 CH 2 NH2-), 2.58(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 1.98, 1.94, 1.92, 1.91(m, 18H, Ac x 6), 1.75(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C102H158N8O62S [M+Na]+ 2541.907, 실측치 2542.020
실시예 17: 디 Bn디시알로 당쇄 - NH - Ac - CH ( OMe ) 2
참고예 3의 벤질 에스테르화한 디시알로 당쇄 아스파라긴-Fmoc(109.6 m g, 40.0 μmol)을 디메틸포름 아미드(DMF, 1.1 mL)에 녹이고 피페리딘(16 μL, 160.1 μmol)를 첨가하여 실온에서 반응시켰다. 30분 후, HPLC분석(분석조건(1))에서 20분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 13분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료를 확인 후, 반응용액을 아세트산 에틸(10.0mL)에 첨가하여 당쇄를 침전시켰다. 원심조작에 의해 침전한 당쇄 성분을 회수하였다. 얻어진 잔사를 상온상압에서 건조 후, 1M 아세트산나트륨 수용액(pH = 5.0, 3 mL)에 용해하고 겔 여과 컬럼크로마토그래피(Sephadex G25, 1.5 cm × 45 cm, 물, 유속 0.4 mL/min)에 의해 정제하고 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조함으로써 디Bn디시알로 당쇄-Asn을 수량 100.8 mg, 수율 100%로 얻었다. 얻어진 디Bn디시알로 당쇄-Asn을 0.5M NaHCO3수용액(1 mL)에 용해하여 1시간 얼음냉각 하에서 냉각하였다. 1시간 후, 고정화 GA효소(약 500 μL)를 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. 반응개시로부터 1시간 반 후, HPLC분석(분석조건(2))에서 11분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 13분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인한 후, 고정화 효소를 여과에 의해 제거하였다. 얻어진 여과액에 NaHCO3 (38.0 mg, 452.4 μmol)를 첨가한 후에, DMF(1.5mL)에 용해한 3,3디메톡시프로피온산-하이드록시 석신이미드에스테르(200.5 mg, 867.2 μmol)를 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. 30분 후, 실온까지 승온하여 교반을 계속하였다. 20시간 후, HPLC분석(분석조건(2))에서 13분에 용출하는 원료 피크의 소실 및 20분에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 겔 여과 컬럼크로마토그래피(Sephadex G25, 1.5 cm × 45 cm, 물, 유속 0.4 mL/min)로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 디Bn디시알로 당쇄-NH-Ac-CH(OMe)2를 수량 79mg, 수율 79%로 얻었다. 얻어진 당쇄의 분석을 수행한 결과, 그의 α이성체 존재비는 0.1%이하였다.
HPLC 분석조건 (1): (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 90% 0.70 mL/min -> A 40% 0.70 ml/min, 30 분)
HPLC 분석조건 (2): (UG-120 250 × 4.6 mm, 전개용매 A: 25 mM 아세트산암모니아 수용액, B: 아세트나이트릴, 농도구배: A 90% 0.70 mL/min -> A 70% 0.70 ml/min, 30 분)
1H-NMR (400 MHz, D2O, 외부표준: 아세톤 (1H: 2.61 ppm)
δ7.40(m, 10H, Ar), 5.28(d, 1H, Bn-CH 2), 5.22(d, 1H, Bn-CH 2), 5.03(s, 1H, Man4-H-1), 4.97(d, 1H, GlcNAc1-H-1), 4.84(s, 1H, Man4'-H-1), 4.50(m, 3H, GlcNAc2,5,5'-H-1), 4.23(d, 2H, Gal6,6'-H-1), 4.15(bs, 1H, Man3-H-2), 4.09(bd, 1H, Man4-H-2), 4.01(bd, 1H, Man4'-H-2), 2.58(m, 2H, NeuAc7,7'-H-3eq), 2.55(m, 2H, CH 2 (OMe)2), 1.98, 1.94, 1.92(m, 18H, Ac × 6), 1.75(dd, 2H, NeuAc7,7'-H-3ax)
MALDI-MS: 계산치 C103H159N7O64 [M+Na]+ 2540.930, 실측치 2541.123
비교예 1: 종래 법에 의한 활성화 당쇄의 조제
시알릴글리코펩티드(SGP)(100 mg)을 5 0mM 인산완충액 pH7.0에 녹여 PNGase F(BioLabs Inc., 1 U)를 첨가하였다. 37℃에서 24시간 배양하여 TLC로 반응종료를 확인 후, 동결건조하였다. 동결건조품을 겔 여과 컬럼크로마토그래피 (Sephadex G25, 1.5 cm × 30 cm, 물, 유속 1.0 mL/min)로 정제하여 디시알로 당쇄-OH를 수량 74 mg얻었다.
얻어진 디시알로 당쇄-OH(10 mg)을 포화탄산수소암모늄 수용액에 녹여 30mM로 조제하였다. 실온에서 반응시켜 항상 포화된 상태를 유지하였다. 7일간 반응시켜 TLC에서 반응이 거의 종료한 후, 반응용액을 그대로 동결건조하였다. 탄산수소암모늄을 제거하기 위해, 동결건조를 3회 반복하여 아미노화한 디시알로 당쇄가 포함되는 분말을 9 mg얻었다.
얻어진 아미노화한 디시알로 당쇄가 포함되는 분말(5 mg)을 물(10 μL)에 녹여 탄산수소나트륨(2 mg)을 첨가하였다. 거기에, 다이클로로메테인(DMC, 100 μL)에 용해한 브로모아세틸브로마이드(8.0 μL, 92.5 μmol)를 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. 1.5시간 후, TLC로 반응종료를 확인하고 탄산수소나트륨으로 중화하고 여과 후, 감압농축하였다. 계속해서 겔 여과 컬럼크로마토그래피 (Sephadex G25, 1.5 cm × 30 cm, 물, 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 디시알로 당쇄 브로모아세트아미드를 수량 4 mg, 수율 77%로 얻었다. 얻어진 당쇄를 분석한 결과, 그의 α이성체 존재비는 9.1%였다. 또한, 이 반응에서 원료도 잔존해 있다고 짐작되었지만, 원료의 잔존량은 산출이 곤란하였다.
비교예 2: 종래 방법에 의한 활성화 당쇄의 조제
아시알로 당쇄-OH(Glytech. Inc. 제, 500.0 mg, 304.6 μmol)를 물(5 mL)에 용해하고 포화수용액이 되도록 탄산수소암모늄을 첨가하여 30℃에서 교반하였다. 6일간 반응시켜 TLC반응이 거의 종료한 것을 확인한 후, 반응용액을 농축, 공비, 동결건조에 의해 여분의 탄산수소암모늄을 제거하였다. 동결건조 후, 얻어진 아미노화한 아시알로 당쇄가 포함되는 분말(250 mg, 152.1 μmol)을 물(2 mL)에 용해하고 NaHCO3 (269.6 mg, 3.2 mmol)를 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. 20분 후, DCM(1.5 mL)에 용해한 브로모아세틸브로마이드(140.2 μL, 1.6 mmol)을 첨가하여 얼음냉각 하에서 교반하였다. 2시간 후, HPLC분석에서 14분 부근에 용출하는 원료 피크의 소실 및 21분 부근에 용출하는 새로운 피크의 확인으로 반응의 종료를 확인하였다. 반응종료 확인 후, 분상에 의해 DCM상을 제거하고, 수상만을 겔 여과 컬럼크로마토그래피(Sephadex G25, 1.5 cm × 30 cm, 물, 유속 0.4 mL/min)로 정제하였다. 당쇄를 포함하는 분획을 농축, 동결건조하여 아시알로 당쇄 브로모아세트아미드를 포함하는 혼합물을 수량 235.0 mg, 수율 88%로 얻었다. 얻어진 혼합물에 대해서 1H-NMR로 분석한 결과, 목적 당쇄인 아시알로 당쇄 브로모아세트아미드가 68.5%, 그의 α이성체 존재비가 6.5%, 원료가 약 25%혼재해 있었다. 이 1H-NMR스팩트럼을 도 3에 나타낸다. 그럼 3에 나타내는 바와 같이, 종래 법을 이용할 경우에는, 주 생성물인 β아노머 외에, α아노머 원료 유래의 시그널이 확인되었다.
이와 같이, 종래 방법으로 합성한 경우는 원료의 잔존이 확인되었지만, 이미 실시예 6에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 합성법에서는 원료의 혼재는 확인되지 않았다(도 4 참조).
이 대비에 의해, 본 발명의 방법은 종래 방법보다도 단시간에 β선택성뿐만 아니라 수율에 있어서도 뛰어난 제조방법이라는 것을 나타내었다.
비교예 3: 종래 방법에 의한 디 Bn디시알로 당쇄 - NH 2 의 조제
디Bn디시알로 당쇄-OH(Glytech. Inc. 제, 98.7 mg, 41.1 μmol)를 물(1.0 mL)에 용해하고 포화수용액이 되도록 탄산수소암모늄을 첨가하여 30℃에서 교반하였다. TLC로 반응을 추적한 결과, 22시간 후에 복수의 생성물이 발생한 것을 확인할 수 있었다. 그래서, 농축, 공비, 동결건조에 의해 여분의 탄산수소암모늄을 제거하였다. 동결건조 후, NMR, ESI-MS에 의해 벤질 에스테르의 탈보호를 확인할 수 있었다. NMR의 적분강도비에 의해, 30%정도의 벤질 에스테르기가 탈보호된 것이 시사되었다. 이상의 결과로부터 종래 법을 이용하여 디Bn디시알로-NH2를 효율적으로 합성하는 것은 곤란하다고 여겨진다. 따라서 그것을 중간체로써 이용하여, 벤질 에스테르화한 디시알로 당쇄 브로모아세트아미드를 합성하는 것도 또한 곤란하다고 여겨진다.
ESI-MS:
디Bn디시알로-OH; Calcd for C98H150N6O62 [M+2H]+ 1202.44, found 1201.96
모노Bn디시알로-OH; Calcd for C91H144N6O62 [M+2H]+ 1157.42, found 1156.95
<110> GlyTech, Inc. <120> METHOD FOR PRODUCING ACTIVATED SUGAR-CHAIN DERIVATIVE, AND ACTIVATED SUGAR-CHAIN DERIVATIVE <130> IPA141070-JP <150> JP2013-088902 <151> 2013-04-19 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SGP <220> <221> CARBOHYD <222> (4) <223> sugar chain added <400> 1 Lys Val Ala Asn Lys Thr 1 5

Claims (17)

  1. 하기 식(1a)로 나타내는 화합물의 제조방법으로서:
    G-NH-CO-CH2-Y1 (1a)
    (여기서, G는 당쇄를 나타내고, Y1은 활성화기를 나타내며, G와 NH는 상기 당쇄의 환원 말단에 NH의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
    이하의 공정(a)∼(b)을 포함하며:
    (a) 하기 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물에 대해서, 염기성 조건하에서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜,
    G-Asn (2)
    (여기서, G는 당쇄를 나타내고, Asn은 아스파라긴을 나타내며, G와 Asn은 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다)
    하기 식(3)으로 나타내는 화합물을 얻는 공정:
    G-NH2 (3)
    (여기서, G는 당쇄를 나타내고, NH2는 아미노기를 나타내며, G와 NH2는 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자 유래의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합해 있다);
    (b) 공정(a)에서 얻은 상기 식(3)으로 나타내는 화합물과 하기 식(4)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정:
    L1-CO-CH2-Y1 (4)
    (여기서 L1은 이탈기이고, Y1은 활성화기이다);
    상기 공정(a)가 0℃∼10℃의 온도 조건하에서 수행되는,
    제조방법.
  2. 하기 식(1b)로 나타내는 화합물의 제조방법으로서:
    G-NH-CO-CH2-Y2 (1b)
    (여기서, G는 당쇄를 나타내고, Y2는 활성화기를 나타내며, G와 NH는 상기 당쇄의 환원 말단에 NH의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합하고 있다)
    이하의 공정(a)∼(c)을 포함하며:
    (a) 하기 식(2)로 나타내는 당쇄 아스파라긴 구조를 갖는 화합물에 대해서 염기성 조건하에 있어서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 작용시켜,
    G-Asn (2)
    (여기서, G는 당쇄를 나타내고, Asn은 아스파라긴을 나타내며, G와 Asn은 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합하고 있다)
    하기 식(3)으로 나타내는 화합물을 얻는 공정:
    G-NH2 (3)
    (여기서, G는 당쇄를 나타내고, NH2는 아미노기를 나타내며, G와 NH2는, 상기 당쇄의 환원 말단에 상기 아스파라긴 측쇄의 질소 원자 유래의 질소 원자가 β형의 입체배치가 되도록 결합하고 있다);
    (b) 공정(a)에서 얻은 상기 식(3)으로 나타내는 화합물과 하기 식(5)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정:
    L1-CO-CH2-Z (5)
    (여기서, L1은 이탈기이고, Z은 할로겐 원자이다);
    (c) 공정(b)에서 얻은 화합물과 이하의 식(6a) 또는 식(6b)로 나타내는 화합물을 반응시키는 공정:
    L2-Y2 (6a)
    (여기서, L2은 이탈기이고, Y2는 활성화기이다);
    L3Y3 (6b)
    (여기서, L3는 양이온이고, Y3는 상기 활성화기 Y2의 음이온이고, L3Y3은 L3와 Y3의 염이다);
    상기 공정(a)가 0℃∼10℃의 온도 조건하에서 수행되는,
    제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    Y1이 브롬원자, 염소원자, 요오드원자, SH, N3, NHNH2, SHCH2CH2NH2 및 CH(OMe)2로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    Z가 브롬원자이고, Y2가 염소원자, 요오드원자, SH, N3, NHNH2 및 SHCH2CH2NH2로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정(a)에서의 당쇄 아스파라긴 가수분해효소가 글리코실아스파라기나아제(GA) 및/또는 펩티드:N-글리카나아제(PNGase)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정(a)에서의 당쇄 아스파라긴 가수분해효소가 담체에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정(a)에서 당쇄 아스파라긴 가수분해효소가 담체에 고정되어 있고; 상기 공정(a)의 다음 및 상기 공정(b)의 이전에, 이하의 공정(d)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법:
    (d) 담체에 고정된 상기 당쇄 아스파라긴 가수분해효소를 반응계로부터 분리하는 공정.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당쇄가 N-결합형 당쇄인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당쇄가 N-결합형의 복합형 당쇄인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당쇄가 디시알로(disialo) 당쇄, 아시알로(asialo) 당쇄 및 DiGlcNAc 당쇄로 이루어진 군에서 선택되는 당쇄인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당쇄가 이하의 식(7)로 나타내는 것을 특징으로 하는 제조방법:
    Figure 112021035187573-pct00029
    (7)
    (여기서, R 및 R＇는 각각 독립적으로 이하의 식(8a) 내지 식(8f)로 나타내는 당쇄로 이루어진 군에서 선택된다):
    Figure 112021035187573-pct00030
    (8a)

    Figure 112021035187573-pct00031
    (8b)

    Figure 112021035187573-pct00032
    (8c)

    Figure 112021035187573-pct00033
    (8d)

    Figure 112021035187573-pct00034
    (8e)

    Figure 112021035187573-pct00035
    (8f).
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당쇄가 디시알로 당쇄이며, 상기 디시알로 당쇄를 구성하는 시알산의 측쇄 카르본산이 에스테르화 또는 아미드화에 의해 보호된 것을 특징으로 하는 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107384987A (zh) * 2017-06-19 2017-11-24 西北大学 利用Glycosylasparaginase酶释放及纯化制备还原性N‑糖链的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004533404A (ja) 2000-07-18 2004-11-04 バイオヌメリック ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ２，２’−ジチオビス（エタンスルホン酸）二ナトリウムの調製のためのプロセス
WO2007034183A2 (en) 2005-09-22 2007-03-29 Astrazeneca Ab Process for the preparation of 4-aminopyrazole derivatives
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01502266A (ja) * 1986-12-11 1989-08-10 ジェンジム・コーポレーション １―アミノ―１―デオキシオリゴ糖とその誘導体の製造
DK0413675T3 (da) * 1989-08-16 1995-09-04 Oxford Glycosystems Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af syntetiske N-bundne glycokonjugater
JP4121044B2 (ja) * 1996-08-30 2008-07-16 三菱化学株式会社 シアル酸誘導体の製造方法
CA2533849C (en) 2003-07-28 2013-07-02 Otsuka Chemical Co., Ltd. Aminated complex-type sugar chain derivatives and process for the production thereof
US10202469B2 (en) * 2012-11-30 2019-02-12 Glytech, Inc. Sugar chain-attached linker, compound containing sugar chain-attached linker and physiologically active substance or salt thereof, and method for producing same
CA2908136C (en) * 2013-03-30 2021-06-29 Glytech, Inc. Sugar chain-polypeptide complex

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004533404A (ja) 2000-07-18 2004-11-04 バイオヌメリック ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ２，２’−ジチオビス（エタンスルホン酸）二ナトリウムの調製のためのプロセス
WO2007034183A2 (en) 2005-09-22 2007-03-29 Astrazeneca Ab Process for the preparation of 4-aminopyrazole derivatives
WO2010122162A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Tibotec Pharmaceuticals Diaryl ethers

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