KR102254553B1 - 모발 성장 촉진 효능을 가지는 락토바실러스 파라카제이 hy7015 및 이를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 조성물 - Google Patents
모발 성장 촉진 효능을 가지는 락토바실러스 파라카제이 hy7015 및 이를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 모발 성장 촉진과 탈모 방지 효능을 가지는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 및 이를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진과 탈모 방지를 위한 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015는 모근을 구성하는 세포인 모유두세포와 동물의 결합조직인 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 모발의 성장 및 세포 성장주기에 관여하는 유전자의 발현을 증가시킴과 동시에 털을 제거한 마우스에서 모발의 성장을 촉진함으로써 모발 성장 촉진과 탈모 방지 효능(발모, 육모, 양모)을 가지므로 이를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진과 탈모 방지를 위한 식품조성물 및 화장료 조성물로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 모발 성장 촉진 효능을 가지는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 및 이를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모근을 구성하는 세포인 모유두세포(Human Follicle Dermal Papilla Cells)와 동물의 결합조직인 섬유아세포(NIH3T3)의 증식을 촉진하고, 모발의 성장 및 세포의 성장 주기에 관여하는 유전자의 발현을 증가시킴과 동시에 모발을 제거한 마우스에서 모발의 성장을 촉진함으로써 모발 성장 촉진 효능(발모, 육모, 양모)을 가지는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 및 이를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 조성물에 관한 것이다.
모발은 피부의 외세포층에서 유래한 신체 주요 부위 중 하나로, 땀선, 피지선 및 손발톱과 더불어 외피의 구속 구조라 여겨지고 있다. 모발은 다양한 외부 자극 등 물리적인 충격과 자외선, 추위나 더위 등으로부터 머리를 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 또한, 생명유지에 중요한 기관은 아니지만, 건강상태의 척도이자 외모등 외향에 대한 영향을 주는 신체의 일부분이다. 모발은 모낭에서 생성되고, 성장기(anagen), 휴지기(telogen), 퇴행기(catagen)와 같은 성장 단계를 포함한 모발 성장주기를 가진다. 성장기는 모발이 성장하는 시기를 말하며, 정상 모발의 90%를 차지한다. 휴지기는 모구(hair bulb)가 건조되고 곤봉모가 되는 시기를 말하고, 퇴행기는 모발의 생장 정지와 모근이 위축되는 시기를 말하는 것으로서 모발은 상기 3단계의 성장주기에 따라 성장과 탈모를 반복한다. 모발의 형성은 성장기, 휴지기, 퇴행기를 주기적으로 순환하는 패턴을 거치면서 성장과 탈락을 반복한다. 이러한 주기는 3~6년에 걸쳐 반복되며, 하루 평균 50~100개의 모발이 정상적으로 탈락하게 된다. 탈모증은 퇴행기 동안 많은 모낭이 세포사(apoptosis)가 진행되어 휴지기에 들어가면 모낭의 크기가 줄어들면서 탈락하는 모발의 숫자가 비정상적으로 증가하는 것을 말한다. 탈모의 원인으로는 모근, 피지선 등의 기관에서 남성호르몬의 작용설, 모낭의 혈류량 저하, 세균 번식이나 피지 분비 과다에 의한 두피 이상설, 노화, 유전적 요인 등이 있다. 최근 과도한 스트레스, 서구화된 식습관, 환경오염, 약물 오남용으로 인한 부작용, 영양불균형, 사회활동의 변화, 파마, 염색 등 다양한 원인에 의해 탈모 환자가 증가하고 있다. 남성형 탈모의 경우 남성호르몬의 일종인 테스토스테론(testosterone)이 5α-reductase 효소에 의해 디하이드로테스토스테론(dehydrotestosterone, DHT)으로 활성이 되고, 이 DHT가 특정 수용체와 결합하여 탈모증이 유발된다. 탈모증의 치료에는 경구복용법, 국소도포, 모발이식술이 있으며 FDA의 허가를 취득한 약물로 미녹시딜(Minoxidil)과 피나스테라이드(Finasteride)가 있다. 피나스테라이드는 5α-reductase 효소의 활성을 억제시켜 DHT의 농도를 낮추는 기전을 통해 남성형 탈모의 치료에 이용되고 있다. 미녹시딜은 고혈압 치료를 위한 혈관 확장제로 개발되었으나 약물의 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모제로 이용되고 있다. 미녹시딜의 메커니즘은 아직 충분히 밝혀지지 않았으나 혈관확장을 통해 모낭으로의 혈류량을 증가시켜 모발의 성장을 촉진하는 것으로 추정하고 있다. 이러한 치료 방법은 약물이나 스테로이드 제제 등에 의존하기 때문에 부작용이 존재하며, 각각의 효능이 사람마다 일률적이지 않다는 문제점을 가지고 있다.
한편, 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0068911호(2019.06.19.) 등은 한약재를 유산균으로 발효시킨 발효물이 발모 촉진과 탈모방지 효능이 있음이 개시되어 있을 뿐 유산균 자체의 모발 성장 촉진과 탈모 방지 효능은 개시되어 있지 않다.
따라서 본 발명자들은 부작용이 적은 유산균을 대상으로 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015가 모근을 구성하는 세포인 모유두세포와 동물의 결합조직인 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 모발의 성장 및 세포 성장주기에 관여하는 유전자의 발현을 증가시킴과 동시에 털을 제거한 마우스에서 모발의 성장을 촉진함으로써 모발의 성장을 도와주고 탈모를 방지하는 발모, 육모, 양모 효능을 갖는다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 모발 성장 촉진 효능을 가지는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 및 이를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 모근을 구성하는 세포인 모유두세포와 동물의 결합조직인 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 모발의 성장 및 세포의 성장 주기에 관여하는 유전자의 발현을 증가시킴과 동시에 모발을 제거한 마우스에서 모발의 성장을 촉진함으로써 모발 성장 촉진 효능(발모, 육모, 양모)을 가지는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 제공하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 식품조성물과 화장료 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 식품조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 발효유는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 유산균 배양액 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 건강기능식품은 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 포함하는 것 이외에 영양보조 성분으로 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 화장료 조성물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 외에 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적 등에 맞게 임의로 선정한 물질을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH 조절제, 향료 등이 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되는 바가 없지만, 예를 들면, 헤어토닉, 헤어샴푸, 헤어컨디셔너, 헤어로션 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명은 모근을 구성하는 세포인 모유두세포와 동물의 결합조직인 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 모발의 성장 및 세포 성장주기에 관여하는 유전자의 발현을 증가시킴과 동시에 털을 제거한 마우스에서 모발의 성장을 촉진함으로써 모발 성장 촉진 효능(발모, 육모, 양모)을 가지는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 식품조성물과 화장료 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 섬유아세포의 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 모유두세포의 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 섬유아세포 내 세포성장 관련 유전자인 EGF, VEGFA 및 SIRT1 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 섬유아세포 내 세포주기 관련 유전자인 BMAL-1 및 CLOCK 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 모유두세포 내 세포성장 관련 유전자인 EGF, VEGFA 및 SIRT1 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 모유두세포 내 세포주기 관련 유전자인 BMAL-1 및 CLOCK 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 제모를 진행한 마우스에서 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 6주 동안의 모발의 성장을 나타내는 사진이다.
도 8은 제모를 진행한 마우스에서 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 섭취 후 마우스 혈청 내 VEGF 단백질 분비량을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 모유두세포의 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 섬유아세포 내 세포성장 관련 유전자인 EGF, VEGFA 및 SIRT1 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 섬유아세포 내 세포주기 관련 유전자인 BMAL-1 및 CLOCK 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 모유두세포 내 세포성장 관련 유전자인 EGF, VEGFA 및 SIRT1 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 모유두세포 내 세포주기 관련 유전자인 BMAL-1 및 CLOCK 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 제모를 진행한 마우스에서 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 처리에 의한 6주 동안의 모발의 성장을 나타내는 사진이다.
도 8은 제모를 진행한 마우스에서 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 섭취 후 마우스 혈청 내 VEGF 단백질 분비량을 측정한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015 균주의 분리 및 동정
1-1. 균주의 분리
본 발명에 따른 신규 유산균주를 분리하기 위하여 전국 각지에서 수집한 막걸리를 PBS buffer에 희석한 후 100,000배 만큼 희석된 샘플을 MRS 배지(Oxoid)에 접종하였다. 혐기 조건에서 자라는 유산균을 배양하기 위해 BBL anaerobic GasPak(BD)을 넣은 혐기박스를 사용하여 37℃에서 36시간 동안 혐기 배양하였다. 상기 배양 후 배지에서 모양이 다른 각각의 콜로니(colony)를 새로운 MRS 배지에 접종하여 순수 분리하였다. 그 결과 총 2종의 유산균을 분리하였다.
1-2. 신균주 HY7015의 동정
상기 실시예 1-2의 2종의 균주 중 HY7015 균주의 동정을 위하여 신균주 HY7015로부터 분리한 유전체 DNA를 주형으로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 반응[(95℃, 3분), 30cycles(95℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 90초), (72℃, 10분)]을 수행하여 1.4kbp의 증폭산물을 얻은 후 정제하여 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 염기서열을 분석한 결과를 토대로 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)와 비교하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다.
또한, Api 50CHL kit(BIOMERIEUX)을 이용하여 당이용성 검사를 하여 하기의 표 2에 나타내었다.
| 당 0-24 | 사용여부 | 당 25-49 | 사용여부 |
| 0 Control | - | 25 에스큘린 | + |
| 1 글리세롤 | - | 26 살리신 | + |
| 2 Erythritol | - | 27 셀로비오스 | + |
| 3 D 아라비노스 | - | 28 말토스 | - |
| 4 L 아라비노스 | - | 29 유당 | + |
| 5 리보스 | + | 30 멜리비오스 | - |
| 6 D 크실로스 | - | 31 자당 | + |
| 7 L 크실로스 | - | 32 트레할로스 | + |
| 8 아도니톨 | - | 33 이눌린 | - |
| 9 β 메틸-D-크실로시드 | - | 34 멜레지토스 | - |
| 10 갈락토스 | + | 35 라피노스 | - |
| 11 포도당 | + | 36 전분 | - |
| 12 과당 | + | 37 글리코겐 | - |
| 13 만노스 | + | 38 크실리톨 | - |
| 14 소르보스 | - | 39 겐티오비오스 | + |
| 15 람노스 | - | 40 D 투라노스 | + |
| 16 둘시톨 | - | 41 D 라이소스 | - |
| 17 이노시톨 | - | 42 D 타가토스 | + |
| 18 만니톨 | + | 43 D 푸코스 | - |
| 19 소르비톨 | - | 44 L 푸코스 | - |
| 20 α-메틸-D-만노시드 | - | 45 D 아라비톨 | - |
| 21 α-메틸-D-클루코시드 | + | 46 L 아라비톨 | - |
| 22 N-아세틸-글루코사민 | + | 47 글루코나테 | + |
| 23 아미그달린 | - | 48 2-케토-글루코나테 | - |
| 24 아르부틴 | + | 49 5-케토-글루코나테 | - |
상기의 표 1 및 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 1-2의 신균주 HY7015의 16S rRNA 유전자는 기존의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) R094 등의 16S rRNA 유전자와 99% 일치하는 것으로 나타났으며, 각종 당 분해능을 API 아이덴티피케이션 소프트웨어 프로그램(API identification software program)으로 분석한 결과도 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 속 균주와 99%의 유사성을 가진 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명자들은 상기 실시예 1-2의 신균주 HY7015를 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015로 명명하고, 2019년 10월 23일에 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(수탁번호: KCTC14004BP).
본 발명에 따른 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 간균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
①형상: 원형
②융기: 볼록
③표면: 매끄러움(slime)
3)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 20~40℃
최적 생장온도 37℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 4.5~10
최적 pH 5.0~6.0
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
<실시예 2>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015 농축균의 제조
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 순수 배양한 콜로니를 각각 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 4,000rpm에서 다시 원심분리하여 세척한 뒤 상등액을 제거하고 2.5~5% 멸균탈지유(Skim milk)를 보호제로 사용하여 펠렛을 풀어주었다. 이렇게 제조한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균의 생균수는 1010CFU/㎖ 이상으로 나왔다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균은 상기와 같은 액상농축균 형태 외에 동결 건조된 분말형태로 제공될 수도 있다.
<실시예 3>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.55~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix0)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 적정온도로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각각 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP배지에서의 총 유산균 수가 1.0X109cfu/㎖이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
다음으로, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
상기 유산균 배양액 69.5중량%와 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고, 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 5>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<실시예 6>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조
헤어토닉
상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 동결건조분말 5중량%, 피마자유 5중량%, 레조시놀 0.1중량%, 멘톨 0.05중량%, 판테놀 0.2중량%, 살리실산 0.1중량%, 토코페릴 아세테이트 0.1중량%, 염산피리독신 0.1중량%, 적량의 색소, 적량의 조합향료, 적량의 에탄올 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 헤어토닉 제조방법에 따라 제조하였다.
헤어샴푸
상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 동결건조분말 11중량%, 암모늄라우릴설페이트(ALS) 20중량%, 암모늄라우레스설페이트(ALES) 20중량%, 디소늄이디티에이 0.03중량%, 공지의 한방추출물 30중량%, 코카마이드프로필베타인 6중량%, 디메치콘(50%) 2중량%, 디메치콘(70%) 2중량%, 메칠클로로이소치아졸리논 및 메칠이소치아졸리논 혼합액(MC/IMI) 0.03중량%, 적량의 코카마이드미파, 적량의 카보머, 적량의 에탄올, 적량의 메칠파라벤, 적량의 DL-판테놀, 적량의 토코페릴아세테이트, 적량의 트리에탄올아민, 적량의 조합향료, 적량의 멘톨 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 헤어샴푸 제조방법에 따라 제조하였다.
헤어컨디셔너
상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 동결건조분말 5중량%, 에탄올 3.5중량%, 자기유화형 모노스테아린산글리세린 1.5중량%, 프로필렌 글리콜 2.5중량%, 염화스테아릴메틸벤젤 암모늄(25%) 7중량%, 파라옥시안식향산메틸 0.3중량%, 적량의 색소, 적량의 조합향료 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 헤어컨디셔너 제조방법에 따라 제조하였다.
헤어로션
상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 동결건조분말 5중량%, 레조시놀 2중량%, 멘톨 2중량%, 판테놀 0.5중량%, 피록톤올아민 0.1중량%, 적량의 색소, 적량의 조합향료 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 헤어로션 제조방법에 따라 제조하였다.
<시험예 1>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015의 섬유아세포의 증식 효과
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 동물의 결합조직인 섬유아세포(Fibroblast)의 증식 효과를 확인하기 위하여 NIH3T3 섬유아세포를 24 웰 플레이트(well plate)에 1.0x105cells/well로 배양한 뒤, 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균을 1.0x106cells/well 농도로 처리한 후에 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 뒤, 인산완충식염수(Phosphate buffer saline)로 2회 세척한 후, MTT assay를 진행하였다.
한편, 양성대조군으로서 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 대신에 50μM 농도의 미녹시딜(Minoxidil)을 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
또한, 상기 섬유아세포에 아무것도 처리하지 않은 것을 무처리군으로 하여 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 섬유아세포 증식능 100%를 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 섬유아세포 증식능이 약 12% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 섬유아세포 증식능이 약 13% 증가하였다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015은 미녹시딜과 동등한 정도의 섬유아세포 증식능이 있음을 알 수 있었다.
<시험예 2>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015의 모유두세포의 증식 효과
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 모근을 구성하는 모유두세포의 증식 효과를 확인하기 위하여 모유두세포를 24웰 플레이트(well plate)에 1.0x105cells/well로 배양한 뒤, 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균을 1.0x106cells/well 농도로 처리하였다. 그런 다음, 48시간 동안 37℃ CO2 incubator에서 배양한 후, 인산완충식염수로 2회 세척한 후, MTT assay를 진행하였다.
한편, 양성대조군으로서 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 대신에 50μM 농도의 미녹시딜을 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
또한, 상기 모유두세포에 아무것도 처리하지 않은 것을 무처리군으로 하여 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 모유두세포 증식능 100%를 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군 및 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 처리한 실험군에서 모유두세포 증식능이 각각 약 15% 및 약 14%씩 증가하였다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015은 미녹시딜과 유사한 정도의 모유두세포 증식능이 있음을 알 수 있었다.
<시험예 3>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015의 섬유아세포의 세포성장 및 세포주기 관련 유전자의 발현 촉진 효과
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 세포 성장 관련 유전자인 SIRT1(NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1), EGF(Epidermal growth factor) 및 VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)와 세포 주기 관련 유전자인 BMAL-1(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein-1; ARNTL) 및 CLOCK(Circadian locomoter output cycles protein kaput)의 발현 여부를 확인하기 위하여 NIH3T3 섬유아세포를 60 pi dish에 1.0x105cells/mL로 배양한 뒤, 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균을 1.0x106CFU/mL의 농도로 처리하였다. 24시간의 세포 배양이 끝난 뒤, 상기 배양 세포의 총 RNA를 추출한 후 Reverse transcription kit(Qiagen)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. Taqman gene expression master-mix(Applied Biosystems)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
한편, 양성대조군으로서 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 대신에 50μM 농도의 미녹시딜을 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
또한, 무처리군으로서 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 대신에 50μg/ml의 인산완충식염수만을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 성장 관련 유전자인 EGF의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 EGF의 상대적 유전자 발현율이 약 65% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 EGF의 상대적 유전자 발현율이 약 110% 증가하였다.
또한, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 성장 관련 유전자인 VEGFA의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 VEGFA의 상대적 유전자 발현율이 약 46% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 VEGFA의 상대적 유전자 발현율이 약 59% 증가하였다.
또한, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 성장 관련 유전자인 SIRT1의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 SIRT1의 상대적 유전자 발현율이 약 75% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 SIRT1의 상대적 유전자 발현율이 약 31% 증가하였다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015은 섬유아세포의 세포 성장 관련 유전자인 SIRT1, EGF, VEGFA의 유전자 발현이 미녹시딜 보다는 다소 높거나 떨어지지만 무처리군 보다 증가시키는 것을 알 수 있었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 주기 관련 유전자인 BMAL-1의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 BMAL-1의 상대적 유전자 발현율이 약 74% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 BMAL-1의 상대적 유전자 발현율이 약 8% 증가하였다.
또한, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 주기 관련 유전자인 CLOCK의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 CLOCK의 상대적 유전자 발현율이 약 39% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 CLOCK의 상대적 유전자 발현율이 약 34% 증가하였다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015은 섬유아세포의 세포 주기 관련 유전자인 BMAL-1 및 CLOCK의 유전자 발현이 미녹시딜 보다는 다소 떨어지지만 무처리군 보다 증가시키는 것을 알 수 있었다.
<시험예 4>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015의 모유두세포의 세포성장 및 세포주기 관련 유전자의 발현 촉진 효과
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 모유두세포의 세포 성장 관련 유전자인 SIRT1, EGF 및 VEGFA와 세포 주기 관련 유전자인 BMAL-1 및 CLOCK의 발현 여부를 확인하기 위하여 모근을 구성하는 모유두세포를 6 웰 플레이트에 1.0x105cells/well로 배양한 뒤, 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균을 1.0x106CFU/mL 농도로 처리하였다. 그런 다음, 24시간 동안 배양한 뒤, 세포의 총 RNA를 추출한 후 Reverse transcription kit(Qiagen)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. Taqman gene expression master-mix(Applied Biosystems)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
한편, 양성대조군으로서 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 대신에 50μM 농도의 미녹시딜을 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
또한, 무처리군으로서 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 대신에 50μg/ml 농도의 인산완충식염수만을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 성장 관련 유전자인 EGF의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 EGF의 상대적 유전자 발현율이 약 81% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 EGF의 상대적 유전자 발현율이 약 41% 증가하였다.
또한, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 성장 관련 유전자인 VEGFA의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 VEGFA의 상대적 유전자 발현율이 약 31% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 VEGFA의 상대적 유전자 발현율이 약 50% 증가하였다.
또한, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 성장 관련 유전자인 SIRT1의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 SIRT1의 상대적 유전자 발현율이 약 36% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 SIRT1의 상대적 유전자 발현율이 약 10% 증가하였다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015은 모유두세포의 세포 성장 관련 유전자인 SIRT1, EGF, VEGFA의 유전자 발현이 미녹시딜 보다는 다소 높거나 떨어지지만 무처리군 보다 증가시키는 것을 알 수 있었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 주기 관련 유전자인 BMAL-1의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 BMAL-1의 상대적 유전자 발현율이 약 22% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 BMAL-1의 상대적 유전자 발현율이 약 3% 증가하였다.
또한, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 세포 주기 관련 유전자인 CLOCK의 상대적 유전자 발현율 1을 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 CLOCK의 상대적 유전자 발현율이 약 39% 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 CLOCK의 상대적 유전자 발현율이 약 38% 증가하였다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015은 모유두세포의 세포 주기 관련 유전자인 BMAL-1 및 CLOCK의 유전자 발현이 미녹시딜 보다는 다소 높거나 떨어지지만 무처리군 보다 증가시키는 것을 알 수 있었다.
<시험예 5>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7015의 털이 제거된 마우스에서 모발 성장 개선 효과
5-1. 제모를 통한 마우스 발모 실험 모델에서 모발성장 효과 확인
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015의 모발성장 개선 효과를 생체 내에서 확인하기 위해 7주령 C57BL/6 암컷 마우스 4마리를 각각 제모크림을 사용하지 않고, 제모기를 이용하여 마우스 등(背)에 자란 털을 모두 제거하였으며, 털 제모과정 중 피부에 상처가 난 마우스는 시험에서 제외하였다.
식이는 일반사료 AIN-93G에 마우스 한 마리당 상기 실시예 2의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015 농축균 1x108CFU를 섭취하도록 첨가한 유산균 식이를 상기 제모된 마우스에 6주 동안 매일 일정양을 급여한 뒤, 매주 마우스의 털이 자라는 정도를 사진을 찍어 관찰하였다.
한편, 양성대조군으로서 상기 유사균 식이 대신에 일반사료 AIN-93G를 사용한 일반식이를 하였고, 미녹시딜 100μL를 마우스의 등(背) 부분에 매일 도포한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
또한, 무처리군으로서 상기 유사균 식이 대신에 일반사료 AIN-93G를 사용한 일반식이를 하였고, 상기 제모된 마우스에 아무것도 처리하지 않은 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 6주 후 무처리 그룹은 모발이 거의 성장하지 않았으나, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015를 섭취한 실험군은 양성대조군과 거의 유사한 모발성장 촉진 효과를 가지는 것으로 확인 되었다.
5-2. 제모를 통한 마우스 발모 실험 모델에서 혈액 내 VEGF 단백질 분비량 확인
상기 시험예 5-1의 6주차의 무처리군, 양성대조군 및 실험군의 마우스를 희생시킨 후 혈액을 수거하여 상온 방치 후 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청에서 mouse VEGF ELISA Kit(MMV00, R&D systems, USA)를 통해 분비된 혈청 내 VEGF 단백질량을 측정하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 무처리군의 혈청내 VEGF 분비량 30pg/mL를 기준으로 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 혈청내 VEGF 분비량이 약 48pg/mL로서 약 1.6배 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015을 처리한 실험군에서는 혈청내 VEGF 분비량이 약 58pg/mL로서 약 1.9배 정도 증가하였다.
따라서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015은 양성대조군보다 우수한 정도의 혈청내 VEGF 분비 유도효과가 있는 것으로 확인되었다.
Claims (7)
- 모발 성장 촉진 효능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015(수탁번호: KCTC14004BP).
- 청구항 1에 있어서,
상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015(수탁번호: KCTC14004BP)는 세포 성장 관련 유전자인 SIRT1(NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1) 유전자, VEGFA(Vascular endothelial growth factor A) 유전자 및 EGF(Epidermal growth factor) 유전자의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 효능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015(수탁번호: KCTC14004BP).
- 청구항 1에 있어서,
상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015(수탁번호: KCTC14004BP)는 세포 주기 관련 유전자인 BMAL1(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1) 유전자 및 CLOCK(Circadian locomoter output cycles protein kaput) 유전자의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 효능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015(수탁번호: KCTC14004BP).
- 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015(수탁번호: KCTC14004BP)를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 식품조성물.
- 청구항 4에 있어서,
상기 식품조성물은 발효유, 건강기능식품, 기능성 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 식품조성물.
- 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7015(수탁번호: KCTC14004BP)를 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진을 위한 화장료 조성물.
- 청구항 6에 있어서,
상기 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어샴푸, 헤어컨디셔너, 헤어로션 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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