KR102232197B1

KR102232197B1 - 플라즈모닉 칩 및 이를 이용한 형광 화상 및 라만 분광에 의한 암 질환의 진단 방법

Info

Publication number: KR102232197B1
Application number: KR1020167034270A
Authority: KR
Inventors: 유키 하세가와; 가츠유키 하세가와
Original assignee: 유겐가이샤 마이테크
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2015-05-07
Publication date: 2021-03-25
Also published as: JP6492066B2; CA2948353C; NZ726748A; EP3141888B1; US10215700B2; JPWO2015170711A1; AU2015256932B2; AU2015256932A1; ES2905092T3; SG11201609331XA; MY193573A; EP3141888A1; IL248760A0; HUE057218T2; CN106461556A; US20170115216A1; KR20170007774A; JP2016208959A; CA2948353A1; EP3141888A4

Abstract

[요약] 플라즈모닉 기판, 그것을 이용한 관련 물질 또는 종양 마커의 형광 화상 진단 방법 그리고 그것을 이용한 라만 분광 분석 방법의 제공.
[해결수단] 본 발명에서는, 혈액 및 생체시료 중의 암 관련 물질을 선택적으로 검출할 수 있기 때문에, 그 플라즈모닉 칩상의 결정 또는 응집 상태의 형광 화상 진단에 의해, 암의 존부를 판단할 수 있다. 또한, 그 결정의 라만 스펙트럼으로부터 히스톤 테일의 화학 수식 상태를 판정할 수 있기 때문에, 암의 조기 발견, 암의 진행도에 관한 판정을 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 제 2는, 기판상에서 응집한 암 관련 물질의 위치는 육안으로는 판별할 수 없다. 이에, 현미경의 화상 진단으로 결정 영역의 위치를 결정하고, 위치 결정한 결정에 대해 레이저를 조사하여 히스톤 테일의 화학 수식, 리모델링 인자를 분석하는 것을 특징으로 하는 암 질환의 진단 방법을 제공한다.

Description

플라즈모닉 칩 및 이를 이용한 형광 화상 및 라만 분광에 의한 암 질환의 진단 방법{PLASMONIC CHIP, AND CANCER DISEASE DIAGNOSIS METHODS RESPECTIVELY EMPLOYING FLUORESCENT IMAGE AND RAMAN SPECTROSCOPY AND EACH USING SAME}

본 발명은, 형광 현미경으로의 형광 화상 진단에 적합한 형광 관측 기판(플라즈모닉 칩) 및 체액, 특히 혈액중의 암 관련 물질을 포착하여 국소 표면 플라즈몬 공명에 의한 자가 형광 및 종양 마커가 증강된 형광 화상에 의한 그리고 라만(Raman) 분광에 의한 암 질환의 진단을 실시하는 방법에 관한 것이다.

암 진단 및 치료학 분야에 있어서, 암 관련 물질로서 메틸화 DNA, 및 그들을 결합한 히스톤과의 결합단백(뉴클레오솜 및 크로마틴)이 주목되고 있으며, 그들을 포착하여, 그 결정화 또는 응집 상태를 화상 진단함과 동시에 그 결정에 레이저 조사하여 DNA의 메틸화 상태 및 히스톤 코드의 화학 수식 상태를 분석하는 것은, 암 존재의 간이 진단, 조기 발견에 중요하다.

모든 생물의 세포를 만들기 위한 정보는, 그 DNA에 포함되어 있다. DNA는, 4종의 염기, 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T) 및 시토신(C)의 고유의 배열로 구성되어 있다. 이들 염기는, DNA 이중 나선을 형성하는 2개의 사슬 상의 의 A와 T 및 G와 C의 접합이다. 이들 쌍의 사슬이, 유전자로 불리는 영역에 그룹 구분된 특정한 분자를 만들기 위한 정보를 기억한다. 각 세포 내에는, 어느 유전자가 온(ON)이 되는지, 즉 발현하는지를 제어하며, 그 세포 고유의 기능을 규정하는 프로세스가 있다. 이들 제어 기구 중 하나는, 시토신(C)에 메틸기를 부가함으로써 제공된다. 메틸기로 표지된 C는 mC로 표기할 수 있다.

DNA 메틸화는, 일부 유전자가 발현하고 있는지를 결정할 때에 중요한 역할을 한다고 하며, 필요로 하지 않는 유전자를 오프(OFF)로 함으로써, DNA 메틸화는, 생물의 정상적인 발달 및 기능에 있어서 불가결한 제어 기구이다. 또는, 이상 DNA 메틸화는, 가령 및 대부분의 암의 발생과 함께 인정되는 변화의 기초가 되는 기구의 하나라고도 한다.

암은, 예로부터 DNA 내의 염색체 돌연변이에 의해 생기는 유전자 변화와 관련되어 있었다. 돌연변이는, 유전성인지 후천성인지에 관계없이, 건강한 상태를 유지하기 위해서 매우 중요한 유전자의 발현의 손실을 초래할 우려가 있다. 이제는, 비교적 다수의 암이, 대부분의 경우, DNA 돌연변이에 가까운 부적절한 DNA 메틸화에 의해 발생된다고 하는 것이 뒷받침되고 있다. 대부분의 경우, DNA의 과잉 메틸화가 결정적인 유전자, 예를 들면 종양 서프레서(suppressor) 유전자 또는 DNA 수복 유전자를 지나쳐 오프가 되어, 암의 발생 및 진행이 되고 만다. 유전자 발현을 제어하기 위한 이 비돌연변이 프로세스는 후성학이라고 한다.

DNA 메틸화는, 메틸트랜스페라제(methyltransferase)로 불리는 효소에 의해 실행되는 경우, 메틸기(m)가 DNA의 특정 시토신(C)에 부가되는 DNA의 화학적 수식이다. 이 비돌연변이(후성적) 프로세스(mC)는, 유전자 발현 조절에 있어서의 결정적 요인이라고 한다(비특허문헌 1). 이에, DNA 메틸화에 주목하여, 이를 검출하는 관점에서 결장암의 조기 검출 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1). 그러나, 메틸화 DNA를 검출하는 것은 복잡하고 곤란하며, 시간과 비용을 필요로 하기 때문에 간이 신속 검출에 적합하지 않다.

이에, 금속 나노 결정 시트를 작성하고, 이를 형광 관측 기판으로 함으로써, 특별한 광학계를 사용하지 않고, 시판된 형광 현미경으로 간단 조작하여 저농도까지, 정밀도가 양호하게 마커의 형광을 계측할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

즉, 마커 검출법으로서 현재, 표면 플라즈몬 공명법(SPR) 및 그 장치(특허문헌 2) 및 효소 면역 흡착 측정법(ELISA)이 제안되고 있다. 전자 SPR은 조작이 간단하고 신속성이 있지만, 감도 부족과 장치나 칩의 가격에 문제가 있고, 후자 ELISA는 고감도이며 장치나 칩의 가격은 저렴하지만, 신속성이나 조작성에 문제가 있어, 이의 진단 방법으로서는 적합하지 않다. 이에, 형광 표지 마커의 고도 검출과 감도와 신속성을 실현하는 플라즈모닉 칩으로서 피치 350nm의 주기 구조를 갖는 기판에 은과 산화 아연의 박막을 성막하여 플라즈모닉 칩을 이용하는 방법(특허문헌 3)이나 금속 나노 입자를 유기용매중에 분산시키고, 유기용매를 휘발시켜 금속 나노 입자를 이차원 방향으로 자기 조직화하여 입계가 갖추어진 은나노 미립자로 이루어진 국소 플라즈몬 형광 증강 시트(특허문헌 4)를 이용하는 방법이 제안되고 있다.

특허문헌 1: 일본 특허공표 2010-517582호 공보 특허문헌 2: 국제 특허 WO2011-11472호 공보 특허문헌 3: 일본 특허공개 2011-158369호 공보 특허문헌 4: 국제 특허 WO2013-039180호 공보

비특허문헌 1: J.G. Herman, Seminars in Cancer Biology, 9: 359-67, 1999

그러나, 소정의 플라즈모닉 칩의 양산은 간단하지 않고, 게다가 양산된 플라즈모닉에의 암 관련 물질의 흡착 또는 형광 표지 마커의 흡착이 용이하지 않고, 현상의 플라즈모닉 칩을 이용하여 소기의 형광 증강 효과를 발휘시키는 것은 어렵다. 이에, 본 발명은 양산 용이한 플라즈모닉 칩을 제공하며, 플라즈모닉 칩에의 암 관련 물질, 항체 등의 흡착 물질의 흡착 또는 형광 표지 마커의 흡착을 실현함으로써, 플라즈모닉 칩 상에서 플라즈몬 증강에 의해 형광 강도의 발광을 수 배에서 수십 배 증강하여, 형광 화상을 진단할 수 있는 플라즈모닉 칩 및 그것을 이용한 암 질환의 진단 방법의 제공을 제1 목적으로 한다.

본 발명의 제1은, 은착체 양자 결정을 작성한 기판 또는 그 은착체 양자 결정을 알칼리 처리하여 형성한 과산화은 메소 결정 기판은 UV, 적외선을 포함한, 광조사에 의해 은착체 양자 결정 및 과산화은 메소 결정은 국소 표면 플라즈몬 공명이라고 하는 물리 현상을 이용할 수 있을(국소 표면 플라즈몬 공명 효과를 가진다)뿐만 아니라, 제2는 착체 양자 결정을 작성할 때에 배위자 등의 일종으로서, 항체, 형광 표지 마커를 또는 배위자에 결합하는 형광 표지 마커를 흡착하는 칩을 작성할 수 있는 화학적 성질을 가진다. 한편, 과산화은 메소 결정은 혈청중의 DNA를 포함하는 뉴클레오솜 또는 크로마틴을 포함하는 암 관련 물질, 특히 DNA가 감긴 히스톤을 응집시키는 화학적 성질을 가진다. 따라서, 본 발명의 제1은 해당 플라즈모닉 칩을 이용함으로써 종양 마커 또는 암 관련 물질로서 뉴클레오솜, 또는 크로마틴을 선택적으로 포착하고 통상의 형광 현미경으로 형광 화상 진단을 실시하여 암의 존부를 판단할 수 있는 것을 찾아내서 이루어진 것으로, 본 발명은 은착체 양자 결정 영역을 가지며, 종양 마커를 암 관련 물질과 함께 흡착하여, 국소 표면 플라즈몬 공명 기능으로 증강한 형광 화상 관찰을 위한 플라즈모닉 칩 및 은착체 양자 결정을 알칼리 처리하여 이루어진 과산화은을 포함하는 은산화물의 나노 결정으로 이루어진, 암 관련 물질을 국소 표면 플라즈몬 공명 기능으로 증강한 자가 형광 화상 관찰을 위한 메소 결정 영역을 가지며, 암 관련 물질 등의 흡착 물질을 포착하여, 국소 표면 플라즈몬 공명 기능으로 증강한 형광 화상 관찰을 위한 플라즈모닉 칩에 있다.

본 발명의 제2는 상기 플라즈모닉 칩을 사용하여 암 질환의 화상 진단을 실시하는 방법이며, 그 중 하나는 은착체 양자 결정을 알칼리 처리하여 이루어진 과산화은을 포함하는 은산화물의 나노 결정으로 이루어진 메소 결정 영역을 갖는 플라즈몬 칩을 준비하고, 그 플라즈모닉 칩의 결정 영역에 혈청 또는 생체 시료액을 적하하고, 시료 중의 단백 분자를 양전하를 갖는 암 관련 물질을 선택적으로 흡착하고, 플라즈모닉 칩 상에 응집하는 결정 영역에 광조사하고, 암 관련 물질의 자가 형광에 의해 형광 화상 진단하여 암의 유무를 진단하는 것을 특징으로 하는 암 질환의 형광 화상 진단 방법이다. 한편, 또 하나의 방법은, 은착체 양자 결정을 은착체의 환원 전위보다 낮은 금속 기판상에 작성할 때, 형광 기능을 갖는 종양 마커를 금속 착체 양자 결정의 배위자와 함께 또는 배위자의 1종으로서 첨가하여 결정 영역에 종양 마커를 배치하거나 또는 작성한 은착체 양자 결정에 피검체시료와 함께 종양 마커를 적하하고 종양 마커를 결정 영역에 배치하고, 은착체 양자 결정 영역에 광조사하여 국소 표면 플라즈몬 공명에 의해 종양 마커의 형광 발광 강도를 증강시켜, 종양 마커가 증강된 형광 화상을 관측하는 것을 특징으로 하는 암 질환의 형광 화상 진단 방법에 있다.

또한, 기판상에서 응집한 암 관련 물질의 위치는 육안으로는 판별할 수 없다. 이에, 현미경의 명시 화상 진단으로 그 결정 영역의 위치를 결정하고, 위치 결정한 결정에 대해 레이저를 조사하여 히스톤 테일의 화학 수식, 리모델링 인자를 해석하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법에 관한 것이며(도 19), 본 발명의 제3은 플라즈몬 칩상에서 포착한 암 관련 물질의 형광 화상을 포함하는, 화상을 안표로, 514, 532, 633, 785nm의 각종 레이저광을 조사하여 라만 분광 분석에 의해 정밀한 분석을 하는 것에 있다. 따라서, 본 발명은 체액, 특히 혈액중의 암 관련 물질을 선택적으로 트랩 하고, 히스톤 또는 크로마틴의 구조를 해석함과 동시에, 히스톤 테일을 화학 수식하는 인자를 해석함으로써, 암의 존부를 시작으로 암의 조기진단을 가능하게 하는 것이다.

본 발명에 따르면, 플라즈모닉 칩을 이용함으로써, 암 관련 물질을 또는 종양 마커를 선택적으로 흡착할 수 있기 때문에, 암 관련 물질의 자가 형광 또는 종양 마커의 형광 강도를 국소 표면 플라즈몬 공명에 의해 증강하여 형광 화상 판단을 용이하게 할 수 있다. 그런데, 본 발명자들은 금속 착체 수용액을 착체를 형성하는 금속보다 낮은 전극 전위(이온화 경향이 큰) 금속 기판상에서 전극 전위차에 의해 화학 환원하여 양자 결정(나노 사이즈의 금속 착체 결정)을 응집시키고 있다. 은착체의 경우, 티오황산은 수용액을 은보다 낮은 전극 전위(이온화 경향이 큼)의 구리 또는 구리합금 상에서 응집시킴으로써 은착체의 양자 결정을 화학 환원법을 채용하여 형성하고 있다. 자세하게는, 금속 착체의 수용액 중의 농도는 주로 형성하는 양자 결정의 사이즈를 고려해서 결정해야 하며, 분산제를 사용할 때는 그 농도도 고려하는 것이 좋고, 통상, 100ppm에서 5000ppm의 범위에서 사용할 수 있지만, 배위자의 기능에도 의존하여 나노 클러스터라고 할 만한 나노 사이즈를 조제하려면 500에서 2000ppm의 농도가 바람직하다.

양자 결정을 형성하는 금속 착체는 담지 금속의 전극 전위 E와 관련된 식(I)에서 나타낸 착체 안정도 정수(logβ) 이상을 가지도록 선택된다.

식(I): E˚=(RT/｜Z｜F) ln(βi)

(여기서 E˚는 표준 전극 전위, R은 기체 정수, T는 절대온도, Z는 이온값, F는 페러데이 정수를 나타낸다.)

여기서, 금속 착체가, Au, Ag, Pt 또는 Pd에서 선택되는 플라즈몬 금속의 착체인 경우는, 라만광에 대해서 국소 표면 플라즈몬 공명 증강 효과를 가진다. 특히, 금속 착체가 은착체일 때는, 안정도 정수(생성 정수)(logβi)가 8 이상의 은 착화제와 할로겐화은의 반응에 의해 형성되는 것이 좋고, 할로겐화은으로서는 염화은이 바람직하고, 착화제로서는 티오황산염, 티오시안산염, 아황산염, 티오요소, 요오드화칼륨, 티오살리실산염, 티오시아누르산염에서 선택되는 1종인 것이 바람직하다. 은착체는 평균 직경이 5~20nm인 나노 클러스터로 이루어진 양자 도트를 가지며, 양자 결정의 사이즈가 100~200nm가 된다.

해당 은착체 양자 결정을 알칼리 처리(차아염소산나트륨 수용액으로 처리)하면, 이하의 반응에 의해 은할로겐화물을 핵으로서 과산화은을 포함하고, 은산화물의 복합물의 침상 나노 결정군이 형성되는 것이라고 생각되며(도 5), 게다가 수중에서 (-)하전을 띠는 한편, DNA가 감긴 히스톤이 (+)하전을 띠기 때문에(도 7(a)), 이 유리 뉴클레오솜으로 대표되는 양전하를 띠는 암 관련 물질을 선택적으로 흡착하는 것을 볼 수 있었다. 게다가 과산화은을 포함하는 은산화물의 침상 나노 결정군은 레이저광의 조사에 의해 환원되고, 금속은을 석출하기 때문에, 레이저광 조사에 의해 표면 플라즈몬 증강 효과를 나타내, 흡착된 히스톤으로 대표되는 암 관련 물질의 자가 형광을 검출할 수 있다.

Na₂S₂O₃ + 4NaClO + H₂O → Na₂SO₄ + H₂SO₄(2NaHSO₄) + 4NaCl

Ag⁺+ NaCl→AgCl + Na⁺

Ag⁺ + 3NaOCl → 2AgCl + NaClO₃ + 2Na⁺

Ag⁺ + OH^-→AgOH

2Ag⁺ + 2OH^-→Ag₂O + H₂O

본 발명의 은산화물의 복합 침상 나노 결정군은, 과산화은을 포함하는 은산화물이 자기 조직화하여 뉴런 형상의 삼차원 초구조체(메소 결정)를 형성하는 것으로(도 8 및 9), 은이온 수용액을 Ag/AgCl 전극을 이용하여 정전위 전석을 실시하고, 또는 은의 양자 결정을 알칼리 처리로 산화함으로써 형성할 수 있지만, 은착체 양자 결정, 예를 들면 티오황산은 양자 결정을 알칼리 처리(차아염소산나트륨 수용액으로 처리)함으로써 용이하게 형성할 수 있다.

또한, 본 발명의 플라즈모닉 칩을 이용함으로써, 형광 화상 진단에 의해, 혈중 포함하는 생체 시료중의, 암 관련 물질의 존부, 크로마틴 리모델링을 제어하는 화학 수식 인자를 판정할 수 있다. 즉, 은할로겐화물 또는 할로겐을 포함하는 은산화물의 복합 침상 나노 결정군, 즉 과산화은을 포함하는 은산화물의 메소 결정 영역(도 8 및 9)을 갖는 플라즈모닉 칩을 준비하고, 그 플라즈모닉 칩의 침상 나노 결정군영역에 혈청 또는 생체 시료액을 적하하고, 시료 중의 양전하를 갖는 암 관련 물질을 선택적으로 포착시킨다.

(플라즈모닉 칩상의 결정의 화상 진단)

흡착한 암 관련 물질에 자외, 적색, 녹색 레이저를 조사하여 형광 현미경(배율 50배)으로 관측했다. 위암(도 1(a), (b) 및 (c)), 대장암(도 2(a), (b) 및 (c))의 경우에 암 관련 물질의 결정의 형광 화상을 나타내며, 양성 질환에 대해서는 형광을 나타내지 않았다. 이 화상의 결정의 형상, 휘도, 면적 등의 정보를 수치화하여, 수치를 히스토그램으로 할 수 있다. 형광 현미경으로 관측하면, 양성 질환과 위암, 대장암과의 사이에는 결정의 형태에 차이를 확인할 수 있다. 따라서, 과산화은을 포함하는 메소 결정의 플라즈모닉 칩을 이용하면, 혈액중의 암 관련 물질을 선택적으로 포착하고 암의 존부를 형광 관찰하여 식별할 수 있는 것을 알 수 있다.

(플라즈모닉 칩상의 종양 마커의 화상 진단)

플라즈모닉 칩상에 흡착한 종양 마커의 결정은 육안으로는 관측할 수 없지만, 자외, 적색, 녹색 레이저를 조사하여 형광 현미경(50배)으로 관측하면, 점 형상으로 분산한 결정 덩어리가 관측된다. 이 결정덩어리의 하나에 대해 각종 레이저광을 조사하여 그로부터의 라만 스펙트럼을 검지함으로써, 표면 증강 라만 산란(SERS)의 강도에 의해 암 질환을 판단할 수 있다.

(암 관련 물질의 선택적 포착)

혈청중의 암 관련 물질로서는, DNA가 한번 감긴 히스톤(뉴클레오솜), 그들이 모여 끈 형상이 된 구조의 크로마틴(섬유)을 포함하는다고 생각할 수 있다. 글로불린은 양전하를 띠지만, 그 증가는 다른 암 관련 물질에 비해 최대 2배 이하이므로, 본 발명으로 검지되는 물질은 암 진행에 수반하는 증가가 100배 이상에 이르기 때문에 글로불린 이외의 증가(암 관련 물질)가 검지되고 있는 것을 말하고 있다. 또한, 정상 세포로부터 나오는 DNA, 아세틸화하여 히스톤으로부터 해리한 DNA, 그리고 알부민은 혈청중의 약 60%를 차지하지만, 음전하을 띠기 때문에, 본 발명에서는 흡착되지 않는다. 따라서, 암 관련 물질의 형광 화상 진단에는 안성맞춤이다. 이것을 확인하기 위해, 이하의 시험을 실시했다. 도 15는 양성 질환(Benign disease), 위암(Gastric cancer), 대장암(Colon cancer)의 10배 희석, 100배 희석했을 경우의 100배, 3000배, 3D화상을 도시한다. 도 16은 KatoIII(위인환세포암) 배양하고, 그 암세포로부터 추출한 이중사슬DNA, RNA 및 프로텐을 희석하여 관측했지만, (a,b,c)는 레이저 현미경을 사용한 KatoIII(위인환세포암)의, (d,e,f)는 그로부터 추출한 DNA의, (g,h,i)는 RNA의, (j,k,l)는 프로텐의 표면 구조를 나타내는 100배, 3000배(화상 및 언듈레이션), 3D화상을 도시하며, (m, n, o)는 암 세포를 물리적으로 분쇄했을 때의 표면 구조를 나타내는 100배, 1000배(화상 및 언듈레이션), 3D화상을 도시한다. 도 17은 화학적으로 배양한 암 세포(a), 그로부터 추출한 DNA(b)의, RNA(c)의, 프로텐(e)의, 물리적으로 분쇄한 암 세포(e)의, 위암 환자로부터의 혈청(f)의, 대장암 환자로부터의 혈청(g)의, 양성 질환의 환자로부터의 혈청(h)의 메소 결정 프로테오닉 칩상에서의 라만 산란 스펙트럼을 도시한다. 또한, KatoIII(위인환세포암), MKN-45(저분화형위선암), CW-2(일본인유례대장암세포주), PK45-P(사람췌장암세포주), NHDF-Neo(피부섬유아세포)를 도시한다. 이러한 결과로부터 본 발명의 프로테오닉 칩에 의해 암 관련 물질이 선택적으로 포착되며, 검출된 것을 나타낸 것이라고 생각할 수 있다.

또한, 본 발명의 침상 나노 결정(과산화은을 포함하는 은산화물의 메소 결정)은, 과산화은을 포함하는 은산화물이 수용액중에서 음전하를 띠기 쉽고, 시료(타겟 분자)와 접촉해서 전하 이동 착체를 형성한다고 생각된다. 게다가, 은산화물은 광에너지를 받아 환원되고, 금속은을 석출하기 때문에, 규칙적으로 배열하는 금속 나노 입자가 갖는 국소 표면 플라즈몬 공명에 의해 증강 효과를 가지게 된다. 따라서, 본 발명의 침상 나노 결정(메소 결정)은 비금속이지만 금속 성질과 이온화 성질을 겸비하기 때문에, 표면 증강 라만 산란(SERS) 측정용에 바람직한 플라즈모닉 칩이 되어, 암 진단 칩으로서 안성맞춤이다.

금속 기판 또는 금속 입자상에 형성된 양자 결정은 금속 착체 결정으로서 수용액중에서는 정극성을 가지기 쉬운 것이라고 생각되며, 생체 시료 중의 단백질을 흡착 고정하기 위해서는, 할로겐 이온의 존재하에서 알칼리 처리, 예를 들면 pH11 이상의 차아염소산 탄산수 용액을 적하하여 극성을 조정하는 것이 바람직하다. 양자 결정은 재결정하여 수용액중에서 음극성이 될 뿐만 아니라, 은산화물의 복합 침상 나노 결정은 과산화물을 형성하기 때문에, 시료 중 암 관련 물질이 양전하를 갖는 히스톤의 고정화를 촉진할 수 있다.

도 1a는 플라즈모닉 칩상에 흡착시킨 위암의 암 관련 물질의 결정의 UV(380nm)의 형광 현미경 사진을 도시한다.
도 1b는 플라즈모닉 칩상에 흡착시킨 위암의 암 관련 물질의 결정의 적색 레이저의 형광 현미경 사진을 도시한다.
도 1c는 플라즈모닉 칩상에 흡착시킨 위암의 암 관련 물질의 결정의 녹색 레이저의 형광 현미경 사진을 도시한다.
도 2는 플라즈모닉 칩상에 흡착시킨 대장암의 암 관련 물질의 결정의 형광 현미경 사진을 나타낸다. (a)는 UV(380nm), (b)는 적색 레이저, (c)는 녹색 레이저의 경우를 도시한다.
도 3은 인청동판상에 적하 후의 방치 시간과 양자 결정 형상의 관계를 도시하는 사진이다.
도 4는 양자 결정의 EDS 스펙트럼(원소 분석)의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5는 양자 결정을 할로겐 이온의 존재하에 알칼리 처리(차아염소산 처리)했을 경우의 SEM상이다.
도 6a는 알칼리 처리한 양자 결정 중 침상 결정을 도시하는 도이다.
도 6b는 럭비공 형상의 덩어리를 도시하는 도이다.
도 6c는 큰 덩어리의 EDS 스펙트럼(원소 분석)의 결과를 도시하는 그래프도이다.
도 7은 메틸화한 유리 DNA(a)와 아세틸화한 DNA(b)의 히스톤에 대한 기능 설명도이다.
도 8은 양자 결정 기판을 할로겐 이온의 존재하에 알칼리 처리(차아염소산 소다 처리)했을 경우의 재결정기판의 SEM상(위쪽)과 재결정기판의 EDS 스펙트럼(원소 분석)의 결과를 도시하는 그래프(아래쪽)이다.
도 9는 알칼리 처리한 재결정기판의 XPS 측정 결과를 도시한다.
도 10은 재결정기판의 표면을 에칭한 후의 XPS 측정 결과를 도시한다.
도 11은 플라즈모닉 칩상에 흡착시킨 암 관련 물질의 결정의 현미경 사진을 도시한다. (a)는 양성 질환, (b)는 위암, (c)는 대장암의 경우를 도시한다.
도 12a는 양성 질환 환자로부터 얻은 혈청을 조정한 시료로 한 레이저 현미경 사진으로, 그 RGB의 히스토그램을 도시한다.
도 12b는 위암 환자로부터 얻은 혈청을 조정한 시료로 한 레이저 현미경 사진으로, 그 RGB의 히스토그램을 도시한다.
도 12c는 대장암 환자로부터 얻은 혈청을 조정한 시료로 한 레이저 현미경 사진으로, 그 RGB의 히스토그램을 도시한다.
도 13은 환자의 혈청으로부터 채취한 양성 질환(Benign disease), 위암(Gastric cancer), 대장암(Colon cancer)의 플라즈모닉 현미경 사진의 명시 화상과 거기에 표시되는 결정의 중심을 이용하여 측정한 표면 라만 산란 스펙트럼(미조정)의 측정 방법을 도시한다.
도 14는 위암 관련 물질인 히스톤 테일의 화학 수식 상태를 나타내는 라만 스펙트럼을 도시한다.
도 15는 3D레이저 주사 현미경을 이용하여, 시료를 10배 희석과 100배 희석한 양성 질환(Benign disease)의 (a,b,c; d,e,f), 위암(Gastric cancer)의 (g,h,i; j,k,l), 대장암(Colon cancer)의 (m, n, o;p, q, r)의 100배, 3000배, 3D화상을 도시한다. 또한, 10배 희석한 양성 질환(Benign disease)의 (s, t), 위암(Gastric cancer)의 (u, v), 대장암(Colon cancer)의 (w, x)는 3D레이저 주사 현미경을 이용하여 얻을 수 있는 화상(3000배)의 각 대응하는 RGB 칼라 히스토그램을 도시한다.
도 16은 (a,b,c)는 레이저 현미경을 사용한 KatoIII(위인환세포암), (d,e,f)는 그로부터 추출한 DNA의, (g,h,i)는 RNA의, (j,k,l)는 프로텐의 표면 구조를 나타내는 100배, 3000배(화상 및 언듈레이션), 3D화상을 도시하며, (m,n,o)는 암 세포를 물리적으로 분쇄했을 때의 표면 구조를 나타내는 100배, 1000배(화상 및 언듈레이션), 3D화상을 도시한다.
도 17은 화학적 배양한 암 세포(a), 그로부터 추출한 DNA(b)의, RNA(c)의, 프로텐(e)의, 물리적으로 분쇄한 암 세포(e)의, 위암 환자로부터의 혈청(f)의, 대장암 환자로부터의 혈청(g)의, 양성 질환 환자로부터의 혈청(h)의 메소 결정 프로테오닉 칩상에서의 1200~1600nm영역의 라만 산란 스펙트럼을 도시한다. 또한, KatoIII(위인환세포암), MKN-45(저분화형위선암), CW-2(일본인유례대장암세포주), PK45-P(사람췌장암세포주), NHDF-Neo(피부섬유아세포)을 도시한다.
도 18은 히스톤 테일의 화학 수식을 식별하기 위한 히스톤 관련 항체도를 도시한다(www.genetex.com).
도 19는 본 발명의 플라즈모닉 칩상에서 관측되는 양성 질환과 암의 자가 형광 상태를 나타내는 형광 화상이다.

이하 도면을 참조하여, 본 발명의 실시 형태를 상세하게 설명한다.

(실시예 1)

티오황산은 1000ppm 수용액을 조제하고, 그 한 방울을 인청동판상에 적하하고, 약 3분간 방치하여, 용액을 날려 버리면, SEM상으로 보면, 양자 결정이 작성되었다. 도는 실시예 1로 제조한 나노 입자 응집체(양자 결정)의 각종 SEM상을 나타내는 사진이며, 100nm 전후의 얇은 육각 기둥 형상 결정이며, 표면에 수nm오더의 요철이 발현하고 있다. 금속 나노 결정에 특유의 패싯은 확인할 수 없었다. 도 6은 인청동판상에 적하 후의 방치 시간과 양자 결정 형상의 관계를 나타내는 사진이다. 우선, 육각형의 양자 결정이 생성하고, 형상을 유지하면서 성장하는 것이 인정된다. 도 4는 양자 결정의 EDS 스펙트럼(원소 분석)의 결과를 나타내는 그래프이다. 인청동판상에 형성된 결정은 은 및 착체 배위자 유래의 원소를 검출했지만, 동판상에 티오황산은 1000ppm 수용액을 조제하고, 그 한 방울을 적하하고, 약 3분간 방치하여, 용액을 날려 버렸을 경우에는, 은만을 검출한 것에 지나지 않았다.

(양자 결정의 작성의 고찰)

양자 결정은 1000ppm 티오황산은착체 수용액의 경우, 인청동판상에 적하하고 3분간 방치하면, 100nm 전후의 육각 기둥 형상으로 형성되며, 각 육각 기둥 형상의 양자 결정은 수nm오더의 요철을 갖는 것이 SEM상으로부터 확인되었지만, 금속 나노 결정에 특유의 패싯은 확인할 수 없고, EDS 원소 분석으로 은 및 착체 배위자 유래의 원소가 검출되었기 때문에, 전체는 은착체의 나노 결정이며, 그 표면에 나타나는 요철은 착체 중의 은이 클러스터로서 양자 도트를 형성해서 넓어지고 있다고 추측된다. 본 발명의 은착체 양자 결정이 인청동판상에 형성되는 한편, 동기판상에는 은만의 나노 입자가 석출하는 현상을 보면, 티오황산은착체의 평형 전위가 0.33으로 동의 전극 전위(0.34)와 동등하기 때문에, 동기판상에는 은(0.80)만이 석출되며, 인청동의 경우는 0.22로 전극 전위가 약간 낮기 때문에, 은착체의 결정이 석출한 것이라고 생각된다. 따라서, 양자 결정을 작성하기 위해서는 1) 착체 수용액이 500~2000ppm라고 하는 희박한 영역인 것, 2) 금속 착체 수용액의 평형 전위에 대해 담지 금속의 전극 전위가 약간 낮은 것, 3) 전극 전위차로 금속 착체가 응집시키는 것이 중요하다고 생각된다. 또한, 1000ppm 티오요소은착체 수용액을 사용했을 경우도 마찬가지였다.

(은산화물의 메소 결정에 대한 고찰: 제 1점)

상기 양자 결정 기판에 5% 차아염소산 탄산수 용액을 적하하고 2분간 처리하여 제거하면 도 11에 도시한 결정 구조를 볼 수 있고, 침상의 결정과 럭비공 형상의 덩어리와 큰 덩어리를 볼 수 있기 때문에, 각각의 조성을 EDS 스펙트럼(원소 분석)으로 분석하면, 이하의 반응식으로부터 침상의 결정은 모두 염화은과 산화은의 복합 결정으로 이루어진 것이라고 생각할 수 있지만, 도 7의 결과는 염소는 확인할 수 없고, 은과 산소가 지배적인 것을 알 수 있다.

Na₂S₂O₃ + 4NaClO + H₂O → Na₂SO₄ + H₂SO₄+ 4NaCl (1)

Ag⁺ + NaCl → AgCl + Na⁺ (2)

Ag⁺ + 3NaOCl → 2AgCl + NaClO₃ + 2Na⁺ (3)

Ag⁺ + OH^- → AgOH (4)

2Ag⁺ +2OH^- → Ag₂O + H₂O (5)

따라서, 본 발명에 관한 메소 결정의 형성에는 은이온과 티오황산이온이 염소이온의 존재하에 알칼리 산화 반응에 의해 발생하는 것으로 생각되지만, 통상의 수용액중에서는 산화은이 형성되는 것에 지나지 않지만, 이하의 XPS 측정으로부터 과산화은이 지배적으로 형성되어 있다고 추측된다.

(은산화물의 메소 결정에 대한 고찰: 제 2점)

XPS 측정:

상기 양자 결정 기판에 차아염소산나트륨 수용액 25μl를 2분간 적하하고, 재결정기판을 만들어, 에칭하지 않고 그대로(사용 기종: 알박-파이(주)/PHI5000 Versa Probe II(주사형 X선 광전자 분광 분석 장치))로 Ag와 O를 XPS 측정했다. 또한, 비교 대상을 위해, 산화은의 가루와 염화은의 가루의 Ag를 측정했다. 한편, 재결정기판을 아르곤가스 클러스터 이온총으로 5분간 에칭하여 Ag와 O를 XPS 측정했다. 도 9 및 도 10의 XPS 측정 결과를 도 8에 따른 EDS의 결과로부터 추측하면, 529 eV부근의 피크는 과산화은(AgO)에 유래하는 O 피크로, 530 eV부근의 피크는 산화은(Ag2O)에 유래하는 O피크라고 인정된다. 에칭했을 경우에, 산소량은 감소하지만, 529eV부근의 피크의 과산화은(AgO)에 유래하는 O 피크가, 530 eV부근의 피크는 산화은(Ag2O)에 유래하는 O피크보다 큰 것은 기판 근방에 과산화은이 형성되어 있는 것을 말하는 것이라고 할 수 있다. 이것은, 메소 결정 형성시의 촉매 작용과 기판의 전극 전위가 영향을 주고 있는 것이라고 추측된다.

또한, EDS 측정은 상기 재결정기판을 사용 기종: 일본전자주식회사/JSM-7001F(전계방출형 분석 주사전자현미경)를 이용하여 실시했다.

또한, 티오황산은의 양자 결정을 차아염소산 수용액, 0.01 규정 가성소다 수용액, 0.01 규정 염산 수용액, 0.1몰 탄산나트륨 수용액으로 처리해도 같은 결과는 얻을 수 없었다. 따라서, 이 침상 결정의 형성에는 은이온과 티오황산이온의 존재하에 상기 반응에 의해 생기는 것이라고 생각된다. 산화은은 수용액중에서 음전하를 띠며, 빛에 의해 환원되어 금속은을 석출시킨다. 과산화은은 그 경향이 현저하기 때문에, 양전하의 암 관련 물질을 흡착하며, 게다가 흡착한 암 관련 물질과 은입자 사이의 표면 플라즈몬 증강 효과를 얻을 수 있을 것이라고 생각된다.

또한, 본 발명의 플라즈모닉 칩을 이용함으로써, 화상 진단 및 라만분석에 의해, 혈중 포함하는 생체 시료중의, 암 관련 물질의 존부, 크로마틴 리모델링을 제어하는 화학 수식 인자를 판정할 수 있다. 즉, 은할로겐화물 또는 할로겐을 포함하는 은산화물의 복합 침상 나노 결정군, 즉 과산화은을 포함하는 은산화물의 메소 결정 영역(도 9 및 10)을 갖는 플라즈모닉 칩을 준비하여, 그 플라즈모닉 칩의 침상 나노 결정군 영역에 혈청 또는 생체 시료액을 적하하고, 시료중의 양전하를 갖는 암 관련 물질을 선택적으로 흡착시킨다.

(플라즈모닉 칩상의 결정의 화상 진단)

흡착한 암 관련 물질을 반사 현미경(배율 500배)으로 관측했다. 양성 질환, 위암, 대장암의 경우의 암 관련 물질의 결정 화상을 나타낸다(도 1(a), (b) 및 (c)). 이 화상의 결정의 면적, 체적, 길이, 폭 등의 정보를 수치화하여, 수치를 히스토그램으로 할 수 있다. 레이저 현미경(키엔스사제 VK-X250 형상 해석 레이저 현미경 1만 5천배)으로 관측하면, 도 2a, 도 2b, 도 2c에 도시한 바와 같이, 양성 질환과 위암, 대장암 사이에는 결정의 형태에 차이를 볼 수 있다. 이 화상의 R, G, B를 히스토그램으로 그래프화하면, 도 2A, 도 2B, 도 2C의 그래프에 도시한 바와 같이, 양성 질환과 위암, 대장암 사이에는 분명하게 피크의 위치 및 형상에 차이가 인정된다. 따라서, 과산화은을 포함하는 메소 결정의 플라즈모닉 칩을 이용하면, 혈액중의 암 관련 물질을 선택적으로 포착하여 암의 존부를 식별할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, 공초점 레이저 현미경을 이용하면, 슬라이스 화상을 얻을 수 있기 때문에, 내부의 정보를 얻을 수 있으므로, 바람직하다.

(플라즈모닉 칩상의 결정의 자가 형광 화상 진단)

또한, 양성 질환(식도 아카라시아, 위간잎계종양, 십이지장양성종양)의 환자로부터 얻은 혈청과 암 환자(위암), 대장암, 췌장암)으로부터 얻은 혈청의 플라즈모닉 칩상의 자가 형광을 형광 현미경으로 관찰하면, 도 20에 도시한 바와 같이 양성 질환과 암 환자 사이에는 자가 형광이 관측되는지의 여부로 명확한 식별을 할 수 있는 것을 알 수 있다.

(플라즈모닉 칩상의 결정의 라만분석)

플라즈모닉 칩상에 흡착한 암 관련 물질의 결정은 육안으로는 관측할 수 없지만, 현미경(500배)으로 관측하면, 점 형상으로 분산한 결정덩어리가 관측된다(도 18). 이 결정덩어리 중 하나에 대해 레이저(파장 532nm) 조사하고 그로부터의 라만 스펙트럼을 검지함으로써, 표면 증강 라만 산란(SERS)의 강도에 의해 암 질환을 판단할 수 있다. 도 3(a), (b), (c)는 양성 질환, 위암, 및 대장암의 경우의 플라즈모닉 칩상의 결정에 대해 레이저(파장 532nm) 조사하고 그로부터 얻은 라만 스펙트럼을 도시한다. 특히, 도 4는 위암의 경우의 라만 스펙트럼의 확대도로, 이에 도시한 바와 같이, 히스톤 테일의 화학 수식은 라만 스펙트럼의 1300cm^-1 이하 625cm^-1 이상의 지문 영역이라고 하는 영역에 나타나는 피크에 의해 판별할 수 있는 것이 도시되어 있다.

혈청중의 암 관련 물질로서는, 암세포 유래의 히스톤에 감긴 DNA, DNA가 한번 감긴 히스톤(뉴클레오솜), 그들이 모여 끈 형상이 된 구조의 크로마틴(섬유)을 포함한다. 글로불린은 양전하를 띠지만, 그 증가는 다른 암 관련 물질에 비해 최대 2배 이하이므로, 본 발명으로 검지되는 물질은 암 진행에 수반하는 증가가 100배 이상에 이르므로 글로불린 이외의 증가(암 관련 물질)가 검지되고 있는 것을 말하고 있다. 또한, 정상세포로부터 나오는 DNA, 아세틸화하여 히스톤으로부터 해리한 DNA, 그리고 알부민은 혈청중의 약 60%를 차지하지만, 음전하를 띠기 때문에, 본 발명에서는 흡착되지 않는다. 따라서, 암 관련 물질의 화상 진단에는 안성맞춤이고, 라만 분광법에 의해 히스톤 테일의 화학 수식을 분석하는데 안성맞춤이다.

또한, 본 발명의 침상 나노 결정(과산화은을 포함하는 은산화물의 메소 결정)은, 과산화은을 포함하는 은산화물이 수용액중에서 음전하를 띠기 쉽고, 시료(타겟 분자)와 접촉하여 전하 이동 착체를 형성한다고 생각된다. 게다가, 은산화물은 광에너지를 받아 환원되며, 금속은을 석출하기 때문에, 규칙적으로 배열하는 금속 나노 입자가 갖는 국소 표면 플라즈몬 공명 증강 효과를 가지게 된다. 따라서, 본 발명의 침상 나노 결정(메소 결정)은 비금속이지만 금속 성질과 이온화 성질을 겸비하기 때문에, 표면 증강 라만 산란(SERS) 측정용에 바람직한 플라즈모닉 칩이 되며, 암 진단 칩으로서 안성맞춤이다.

금속 기판 또는 금속 입자상에 형성된 양자 결정은 금속 착체 결정으로서 수용액중에서는 정극성을 가지기 쉬운 것이라고 생각되며, 생체 시료중의 단백질을 흡착 고정하기 위해서는, 할로겐 이온의 존재하에서 알칼리 처리, 예를 들면 pH11 이상의 차아염소산 탄산수 용액을 적하하여 극성을 조정하는 것이 바람직하다. 양자 결정은 재결정하여 수용액중에서 음극성이 될 뿐만 아니라, 은산화물의 복합 침상 나노 결정은 과산화물을 형성하기 때문에, 시료 중 암 관련 물질이 양전하를 갖는 히스톤의 고정화를 촉진할 수 있다.

(히스톤 테일의 화상 진단)

뉴클레오솜은 크로마틴의 기본적 구성 단위로, 4종의 히스톤(H2A, H2B, H3, H4)으로 이루어진 히스톤 8량체에 DNA가 감긴 구조를 하고 있지만, 히스톤은 DNA를 패키징한다는 역할은 물론, DNA의 접근성을 조절하는 것 및, 유전자 제어에도 중요한 역할을 하고 있다. 히스톤의 번역 후 수식에 의해, DNA나 그 외의 핵단백질과의 상호작용이 제어되어, 가역적인 유전자 발현에 영향을 미친다. 히스톤 수식의 종류로서 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, SUMO화, 시트룰린화, ADP리보실화가 주로 알려져 있다. 히스톤의 배열 중, 어느 부위가 이들 수식을 받을지에 따라, 주위의 유전자 발현은 활성화 또는 억제되지만, 이러한 히스톤의 번역 후 수식 부위의 조합과 유전자 발현에의 영향을 도 18에 도시한 각종 히스톤 코드 관련 항체(Genetex사 항히스톤 항체)를 사용하면, 본 발명의 플라즈모닉 칩으로 포착된 히스톤 코드의 수식된 상태를, 형광 화상으로 관측함과 동시에 라만 분광 분석에 의해, 히스톤 코드 가설의 검증을 실시할 수 있다.

또한, 히스톤 코드 가설에서는 다음과 같이 설명되어 있다.

(히스톤 코드 가설)

록펠러 대학의 앨리스 박사 등의 그룹에 의해 히스톤 코드 가설이 크로마틴 리모델링과의 관계로 제창되고 있다. 즉, 크로마틴 리모델링이란 크로마틴 구조의 변화를 통해 유전자의 발현 레벨을 조절하는 분자 기구, 유도에 수반하여, 1) 히스톤 수식의 변화, 2) 게놈 DNA의 메틸화 상태의 변화, 그에 수반하는 3) DNase에 대한 고감수성 영역의 변화가 일어나는 현상을 말한다. 본 발명자들은, 히스톤 코드 가설에 기초하여, 암 발생의 기전을 해명하기 위해 연구한 결과, 암 관련 물질로서, 히스톤 및 이와 관련한 뉴클레오솜 및 크로마틴을 선택적으로 포착하여, 이것을 검증하려고 했다. 게놈 DNA의 대부분은 코어 히스톤에 감겨, 크로마틴으로서 격납되어 있다. 그 때문에 게놈 DNA 에서 직접 일어나는 전사, 복제, 수복 등의 핵내 현상은 어떠한 형태로의 크로마틴 구조 변화를 수반한다. 이 광의의 크로마틴 리모델링은 반대로 핵내 현상을 제어하고 있다. 예를 들면 전사 활성은 크로마틴 구조에 의존하여 약 2500배의 범위에서 변화한다. 네이키드 DNA(naked DNA)에 있어서의 전사 인자의 활성화의 범위는 10배 정도이므로, 전사 제어의 대부분은 크로마틴 리모델링으로 실시되게 된다. 이 크로마틴 리모델링에 관여하는 인자 중에서, 히스톤 수식 인자는 아세틸화, 인산화, 메틸화, 유비퀴틴화나 그들의 제거를 실시함으로써, 히스톤 H3, H4의 아미노 말단측의 테일에 특유한 화학 수식 패턴을 형성한다. 이것이 인식 코드로서 작용함으로써 한층 더 리모델링에 관여하는 인자가 리크루트된다는 것이 "히스톤 코드 가설"이다.

이 화학 수식을 받은 히스톤 테일이 리모델링 인자 등의 인식 코드로서 일한다고 하는 "히스톤 코드 가설"의 검증에 대해, 구조 생물학의 역할은 크다고 한다. 예를 들면, HAT, ATP 의존적 리모델링 인자, 코액티베이터(coactivator), TFD 서브유닛 TAF 등의 대부분은, 110 아미노산 정도로 이루어진 상동성이 낮은 브로모 도메인(bromodomain)을 가진다. 코액티베이터 P/CAF 의 브로모 영역의 구조가 NMR에 의해 결정되며, 특징적인 소수성 포켓이 발견되고 있다. NMR를 사용한 결합 실험의 결과, 이 포켓은 아세틸화된 히스톤 H3 테일의 펩티드와 결합하는 것이 나타났다. 또한 기본 전사 인자 TFD의 최대 서브유닛인 TAF 250 의 텐덤에 늘어선 2개의 브로모 도메인의 결정 구조도 얻고 있다. 이것은 아세틸화를 받은 히스톤 H4의 테일에 결합하는 활성을 가진다. 또한 heterochromatin protein 1의 크로모 도메인(chromodomain)이 메틸화된 히스톤 H3 테일에 결합하는 것으로 나타나 있다. 마우스 chromatinmodifier protein 1의 크로모 도메인의 NMR 구조가 보고되어 있다. 이 크로마틴 리모델링 인자는 히스톤 테일의 코드를 브로모 영역 등이 인식하여 직접적으로 특정한 뉴클레오솜 부위에 액세스하는 것도 있지만, DNA 결합성의 전사 인자에 의해 간접적으로 리크루트되는 경우도 많다. bHLH(basic helix-loophelix)-Zip를 DNA 결합 도메인으로서 갖는 전사 리프레서 Mad는, 히스톤 탈아세틸화 효소를 서브유닛으로서 포함하는 Sin3 복합체를 크로마틴에 리크루트한다. Sin3의 PAH2 도메인과 Mad의 전사 억제 도메인의 복합체가 NMR에 의해 해석되며, 탈아세틸화 복합체의 크로마틴 부위에의 리크루트 기구가 논의되고 있다.

이 크로마틴 구조 제어에 DNA 메틸화가 깊게 관여한다고 생각된다. DNA 메틸화가 고밀도로 보여지는 게놈 DNA 부위에서는, 일반적으로 크로마틴 구조가 강고하게 되어, 전사 억제나 DNA 변이율의 저감을 볼 수 있다. 또한 게놈 DNA의 메틸화 패턴과 게놈각인(genomic imprinting), X염색체 불활성화나 세포의 종양화에는 명확한 상관을 볼 수 있기 때문이다(비특허문헌 2). 따라서, 히스톤 및 크로마틴의 구조 해석은 암과의 관련을 설명할 열쇠를 쥐고 있으며, 히스톤 테일을 화학 수식하는 인자를 해석하는 것은 중요한 의의를 가지고 있다고 말할 수 있다. 본 발명에서는 히스톤 및 크로마틴을 선택적으로 포착할 수 있기 때문에, 히스톤 코드의 화학 수식 상태를 형광 표지화함과 동시에, 표면 증강 라만분석(SERS)을 이용하여 해석하는 수단을 제공한다.

(크로마틴 리모델링)

그런데, 유전 물질의 본체인 게놈 DNA는 장대하고, 사람에는 길이 2미터의 DNA가, 세포핵이라고 하는 불과 체적 100 펨토리터의 미소한 공간에 수납되어 있다. 이러한 게놈 DNA의 수납은, "크로마틴"으로 불리는 분자 복합체에 의해 완수할 수 있고, 크로마틴의 기반 구조는, 히스톤 단백질에 DNA가 감긴 "뉴클레오솜"으로, 그 뉴클레오솜이 염주 형상으로 연결된 것이, 단백질이나 RNA와 결합하여 더욱 고도로 작게 접어 “고차의 크로마틴"을 형성하고 있다고 하는 것이다. 그러나, 크로마틴에서 DNA가 풀리기 위해서는, 큰 에너지가 필요하고, 크로마틴은, 복제, 전사, 재조합 등의 DNA의 기능 발현에 저해적이다. 그러나 생물은, 크로마틴의 동적 변동을 통해, 아주 간단하게 복제, 전사, 재조합을 해낸다. 이 "동적 크로마틴 구조"는, 히스톤 베어리언트(variant)나 수식에 의한 다양한 뉴클레오솜 구조, 그 늘어선 방법의 다양성, 단백질이나 RNA 분자 복합체와의 상호작용 등에 의해 만들어지며, 세포핵 구조체, 핵막, 핵막공복합체 등과의 상호작용에 의해 제어되고 있다고 한다. 상기 현상을 설명하면, 진핵생물의 DNA는, 체내에서 합성된 히스톤이라고 하는 단백질과 강고하게 결합한, 뉴클레오솜 구조를 형성하고, 뉴클레오솜은, 더욱 나선이 되어 크로마틴 구조를 형성하지만, 이와 같이, 히스톤과 DNA가 확실히 결합한 상태에서는, RNA 폴리메라아제가 DNA에 결합하는 것이 어렵고, 한편, 전사가 활발해질 때는, 크로마틴 구조가 느슨해지고, 뉴클레오솜으로부터 히스톤이 벗어나 DNA가 네이키드에 가깝게 된다. 전사가 억제될 때에는, 반대로, 뉴클레오솜 구조가 확실하게 하여 크로마틴이 응집한다. 이러한 크로마틴의 구조의 재구축이나 재구성을 상술한 크로마틴 리모델링이라고 하지만, 프로모터나 엔핸서는 전사를 촉진하여, 유전자 발현을 높인다. 이들 역할 중 하나는, 히스톤과 DNA의 결합을 느슨하고, 가끔은 뉴클레오솜 구조를 파괴하여, RNA 폴리메라아제에 의한 RNA 합성을 촉진한다. 뉴클레오솜을 좀 더 자세하게 보면, 번역 후의 히스톤 단백질의 말단에 있는 히스톤 테일의 부분에, 염기성 아미노산(플러스 전하)이 많이 존재한다. 이것이, DNA의 인산기(마이너스 전하)와 정전적 결합을 한다. 히스톤과 DNA의 결합을 느슨하게 하려면, 히스톤의 강한 염기성을 느슨하게 하면 괜찮다. 크로마틴 리모델링에 의한 전사 조절은, 실제로는 많은 종류의 효소나 단백질이 관련된 복잡한 반응으로, 프로모터나 인핸서에 결합하는 전사 인자에는, 히스톤 아세틸화 효소(HAT: histone acetyltransferase)가 결합하고, 이 효소가 히스톤의 아미노기를 아세틸화한다. 아세틸화한 아미노기는, 염기성이 저하하여 DNA와의 결합이 약해지고, 이것을 계기로 하여 히스톤과 DNA의 해리가 진행되고, 더욱 주위의 뉴클레오솜에서 히스톤의 아세틸화가 진행되고, 얼마 후 프로모터가 노출되고, RNA 폴리메라아제가 결합하기 쉬워진다고 한다. 따라서, 히스톤 코드 가설에 따른 크로마틴 리모델링의 기전를 해명하기 위해서는 히스톤, 크로마틴 등의 암 관련 물질을 포함하는 체액으로부터 어떻게든 이들 암 관련 물질을 트랩하고, 분석할 수 있을지는 중요하다.

본 발명의 플라즈모닉 칩을 이용하면, 암 관련 물질로서 히스톤 및 크로마틴을 트랩함으로써, 그 결정의 다소에 의해 암 증상의 존부를 형광 화상 진단에 의해 판단할 수 있다. 그리고, 그 암 증상이 어느 장기의 암이며, 그 진행 상태가 어느 정도인지를 히스톤 테일의 화학 수식, 리모델링 인자를 해석함으로써 판정할 수 있다. 그리고, 이 크로마틴 리모델링 사상을 통해 어떻게 암이 발생하고, 진행해 갈지에 관한 정보는, 그러한 암이 어떻게 특정한 화학요법제에 반응할 것 같은지를 임상의가 보다 정확하게 예측하는 것을 가능하게 하며, 이 방법으로, 종양의 화학 감수성의 지식에 따른 화학요법을 합리적으로 설계할 수 있다.

여기서, 검출해야 할 대상의 암 관련 물질은 DNA가 감긴 히스톤이라는 단백질로, 이 단위 구조는 뉴클레오솜으로 불리며, 뉴클레오솜이 모여 끈 형상이 된 구조는 크로마틴(섬유)으로 불린다. 그리고, 세포가 암화하고 분열을 반복할 때, 암이 증가하는데 상태가 나쁜 유전자(암 억제 유전자)가 나오지 않도록 확실히 히스톤에 감아 덮고, 히스톤에의 감는 방법을 더욱 강하게 하고, DNA가 간단하게는 풀리지 않도록 하여, 메틸화라고 하는 수식이 일어나고 있지만, 통상 히스톤은 (+), DNA는 (-)로 하전(charge)되어 있으며, 2개는 자석과 같이 서로 달라붙고, 게다가 메틸화하여 풀 수 없도록 되어 있어, 히스톤에 감긴 DNA는 (+)로 하전되어 있다(도 8(a) 참조). 한편, 아세틸화는 (-)로 하전되어 있기 때문에, 통상은 (+)의 히스톤이 아세틸화되면, (-)끼리가 되어 DNA와 반발한다. 그러면, DNA라고 하는 “실” 이 히스톤으로부터 풀려 유전자가 발현하는 메카니즘이 되어 있다(도 8(b) 참조). 따라서, 암세포 유래의 암 관련 물질을 선택적으로 흡착시키는 데는, 히스톤에 감긴 DNA는 (+)에 대전하고 있기 때문에, 흡착시키는 기판은 (-)로 하전되어 있는 것이 바람직하다고 생각할 수 있다.

따라서, 본 발명을 이용함으로써, 혈액 및 생체 시료중의 암 관련 물질을 선택적으로 검출하여, 국소 플라즈몬 증강 효과에 의해 자가 형광에 의해 이것을 검출할 수 있다. 그뿐만 아니라, 각종 형광 표지를 붙인 암 관련 물질을 선택적으로 포착하여 형광 현미경에 의해 간단하고 쉽게 암의 존부를 판정할 수 있다. 또한, 그 결정의 라만 스펙트럼보다 히스톤 테일의 화학 수식 상태를 표지를 붙여, 또는 붙이지 않고 판정할 수 있기 때문에, 암의 조기 발견, 암의 진행도에 관한 판정을 실시할 수 있다.

이에, 본 발명의 이용 방법을 총괄하면, 다음과 같다.

1. 은양자 결정을 이용하는 플라즈모닉 칩

항체 적하 및 항원 적하에 의해 자가 형광은 일어나지 않는다. 따라서, 형광 색소, 형광 단백을 붙임으로써 형광 관측이 가능해진다. 엔도톡신에서는 엔도톡신과의 결합 피크가 라만 산란 스펙트럼으로 확인할 수 있기 때문에, 형광 표지를 붙임으로써 보다 명확하게 식별할 수 있다. 따라서, 1) 항체측에 형광물질을 붙이는 경우, 금속 착체와 항체의 혼합액을 본 발명의 플라즈모닉 칩에 적하하고, 항원이 결합하면 발광하는 것을 관측한다. 한편, 2) 항원측에 형광물질을 붙이는 경우, 양자 결정에 항체를 적하하여 고상화하고, 항원측에 미리 형광물질을 붙여 항원 항체 반응에 의해 형광이 발광하기 때문에 이것을 측정한다.

2. 은메소 결정을 이용하는 플라즈모닉 칩

1) 항체 측에 형광물질을 붙이는 경우, 메소 결정에 항체(표지 첨부)를 고상화하고, 항원을 적하하여 결합에 의한 형광을 측정한다. 2) 항원측에 형광물질을 붙이는 경우, 메소 결정에 항체를 고상화하고, 항원(표지 첨부)을 적하하여 결합에 의한 형광을 측정한다. 3) 자가 형광에 의한 측정한다. 이 경우에 형광 표지를 붙일 수도 있다.

3. 플라즈모닉 칩상의 결정을 확인하고, 레이저를 조사하여 라만 산란 스펙트럼에 의해 라만 분광 분석을 실시한다.

Claims

형광 현미경으로 형광 화상을 관찰하는 데 사용되는 플라즈모닉 칩으로,
플라즈몬 금속으로서 은 착체 수용액을 플라즈몬 금속 착체의 환원 전위 근방의, 보다 낮은 전극 전위를 갖는 금속 기판 상에 전극 전위차에 의해 형성된 금속 착체 양자 결정 영역을 가지며, 은 착체 수용액 중의 종양 마커, 항체 등의 흡착 물질을 금속 착체의 양자 결정과 함께 배위시키고, 암 관련 물질, 항원 등의 피흡착 물질을 선택적으로 포착하여, 국소 표면 플라즈몬 공명 기능으로 증강된 형광 화상의 관찰을 제공하는, 플라즈모닉 칩.
형광 현미경으로 자가 형광 화상을 관찰하는 데 사용되는 플라즈모닉 칩으로,
상기 플라즈모닉 칩은, 금속 기판상에 형성된 은 착체 양자 결정을 알칼리 처리하여 얻어진 과산화은을 포함하는 은산화물의 나노 결정으로 이루어진 메소 결정 영역을 가지며,
상기 메소 결정은 암 관련 물질을 포착할 수 있고 상기 결정 영역에 광 조사에 의해 국소 표면 플라즈몬 공명 기능으로 증강된 형광 화상을 제공하는, 플라즈모닉 칩.
청구항 1 또는 2에 따른 플라즈몬 칩을 제공하고,
상기 플라즈모닉 칩의 결정 영역에 혈청 또는 생체 시료액을 적하하여 시료 중의 암 관련 물질 또는 항원과 같은 흡착 물질을 선택적으로 흡착시키고,
상기 결정 영역에 광 조사하여 국소 표면 플라즈몬 공명에 의해 암 관련 물질의 자가 형광 또는 암 마커를 형광 현미경으로 형광 화상 관찰하여 암의 유무를 판단하는 것을 포함하는, 암 질환의 형광 화상 관찰 방법.
청구항 1 또는 2에 따른 플라즈몬 칩을 제공하고,
상기 플라즈모닉 칩의 결정 영역에 혈청 또는 생체 시료액을 적하하여 시료 중의 암 관련 물질 또는 항원과 같은 흡착 물질을 선택적으로 흡착시키고,
상기 결정 영역에 광 조사하여 국소 표면 플라즈몬 공명에 의해 암 관련 물질의 자가 형광 또는 암 마커를 형광 현미경으로 형광 화상 관찰하여 암의 유무를 판단한 후, 암 관련 물질 또는 암 마커를 조사의 표시로 형광 화상을 이용함으로써 레이저 광을 조사하여 라만 분광 분석하는 것을 포함하는, 암 질환의 라만 분광 분석 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 암 관련 물질이 DNA가 감긴 히스톤을 포함하는 뉴클레오솜 또는 크로마틴인 암 질환의 형광 화상 관찰 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 암 관련 물질이 DNA가 감긴 히스톤을 포함하는 뉴클레오솜 또는 크로마틴인 암 질환의 라만 분광 분석 방법.