KR102230544B1 - 세포내 분석을 위한 나노피펫 장치 및 방법 - Google Patents

세포내 분석을 위한 나노피펫 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 살아있는 세포로부터의 세포 물질을 추출한 후에 이것을 용기에 배치하는 나노리터 규모의 장치 및 방법을 기재한다. 주사 이온 전도 현미경 (SICM)과 통합된 나노피펫을 사용함으로써, 인간 BJ 섬유모세포로부터의 미토콘드리아 DNA 및 HeLa/GFP 세포로부터의 녹색 형광 단백질 (GFP) 전사체의 추출이, 세포 환경의 파괴를 최소로 하고 단리된 샘플 수득 전의 화학적 처리 없이 달성되었다. 이러한 추출의 성공은 형광 현미경검사 및 추출된 물질의 PCR 분석로 확인되었다. 상기 방법 및 기기는 많은 상이한 세포 유형 및 세포내 표적에 적용될 수 있으며, 오직 단일 세포 분석만이 아니라 천연 상태로 추출된 물질의 단일 세포내 구획 분석도 가능하게 한다.

Description

세포내 분석을 위한 나노피펫 장치 및 방법 {NANOPIPETTE DEVICE AND METHOD FOR SUBCELLULAR ANALYSIS}
발명자: 파올로 액티스(Paolo Actis), 미쉘 엠. 말로프(Michelle M. Maalouf), 네이더 포어맨드(Nader Pourmand)
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 3월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 제61/781,841호를 우선권 주장하며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
정부 지원의 선언
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 계약 번호 HG000205, 및 미국 국립 암 연구소에 의해 수여된 계약 번호 U54CA143803 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
서열목록, 컴퓨터 프로그램, 또는 컴팩트 디스크에 대한 참고
본 출원은 ASCII 텍스트 파일로 제출된 서열목록을 포함하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 상기 텍스트 파일은 2014년 2월 18일에 파일명 "482_35_1_PCT_Seq_List.txt"로 생성되었고, 717 바이트 크기이다.
기술분야
본 발명은 세포내 내용물, 구체적으로는 미토콘드리아 DNA의 단일 세포 추출을 위한 나노장치 분야에 관한 것이다.
관련 분야
본 발명의 특정 측면에 대한 배경 정보가 하기에 제시되며, 이는 발명의 상세한 설명에서 언급되지만 반드시 상세하게 기재된 것은 아닌 기술적 특징에 관한 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 사용된 개개의 조성물 또는 방법은 하기 논의된 간행물 및 특허에서 보다 상세하게 기재될 수 있으며, 이는 청구된 본 발명의 특정 측면을 만들거나 사용하기 위해 통상의 기술자에게 추가의 지침을 제공할 수 있다. 하기 논의는 기재된 특허 또는 간행물과의 관련성 또는 선행 기술 효과에 대해 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
인체 내 생리적 및 병리적 과정은 역동적 미소환경의 맥락 내에서 복잡한 세포-세포 상호작용에 의해 제어된다. 전통적으로 세포의 생체분자 분석은 클로날 집단의 세포가 동일하게 행동한다는 가정 하에서 수행되고 있다. 이러한 가정은 실험적 증거로부터가 아니라 개개의 세포를 분석할 수 있는 도구의 부족으로부터 발생하였다. 추가로, 표현형 (즉 유전자 발현, 단백질 활성, 이온 변동, 신호전달)을 단일 세포 수준에서 역동적으로 측정하는 능력은 복잡한 환경에서 세포 거동을 이해하는 핵심이다 (1-4).
1990년에 제임스 에버윈(James Eberwine) 그룹은 유리 마이크로피펫을 사용하여 배양에서 단일-세포를 단리하고, 해당 세포로부터 추출된 RNA가 증폭되고 분석될 수 있음을 입증하였다 (5). 이 실험은 단일-세포 생물학 분야를 개척하였고, 에버윈 그룹은 이 기술을 뉴런 기능수행의 분자 기초를 이해하는데 성공적으로 적용하였다 (6). 지난 20년 동안, 생체분자 분석은 현재 연구원들에게 단일 해독으로 세포에서 활성 유전자의 수집을 얻게 하는 고처리량 서열분석의 발전으로 전방향으로 도약하였다 (7). 그러나, 단일 세포의 초기 포획은 주요한 기술적 쟁점으로 남아있다 (1). 유리 마이크로피펫을 사용한 에버윈의 성공 이후에, 과학자들은 효소 소화 (조직으로부터 세포를 방출함)부터 레이저 마이크로-해부 (조직 절편으로부터 무손상 세포의 동종 집단을 제거함)까지 단일 세포를 단리하는 다양한 기술을 사용해왔다. 그러나, 이러한 방법은 세포를 그의 천연 환경에서 조사할 수 없거나 또는 본래의 마이크로피펫으로 단리된 세포를 프로브하는 것으로 제한되었다 (8).
수술 도구로서의 나노장치
나노규모 장치는 고도의 공간적 및 일시적인 해상도 연구를 위한 그의 잠재성으로 인해 이상적인 단일-세포 수술 도구이다 (9-10). 최근 2개의 그룹이 단일 세포 분석을 위한 세포 나노내시경을 독립적으로 개발하였다. 문헌 [Singhal et al. (11)]은 탄소 나노튜브를 유리 마이크로피펫의 바로 팁에 부착하여, 세포를 조사하고, 유체를 수송하며, 단일 소기관 수준에 이르기까지 광학 및 전기화학적 진단을 수행하는데 잠재성을 보여주었다. 유사하게 문헌 [Yan et al. (12)]은 가시 광선을 살아있는 포유동물 세포의 세포내 구획으로 안내하고 세포내 영역으로부터 광학 신호를 검출할 수 있는 광학 섬유의 팁에 부착된 나노와이어 도파관을 개발하였다. 이들 나노내시경의 원통형상은 세포 내부 깊숙히 소기관의 검출을 가능하게 하지만 이들 기술은 임의의 자동화 능력이 부족하고; 이들 내시경은 세포에서 수동으로 위치시켜, 많은 수의 샘플 분석이 요구되는 이러한 복잡한 생물학적 문제의 연구를 불가능하게 한다.
이러한 나노내시경과 주사 프로브 기술의 통합은 이러한 한계를 극복할 수 있고, 잠재적으로는 자동화 및 고처리량 분석을 가능하게 한다. 2003년에, 오사다(Osada)와 동료들은 원자력 현미경 (AFM) 팁을 살아있는 세포에 삽입하여 mRNA를 추출하였다 (13). mRNA를 PCR 기술로 분석하여 추출 프로토콜을 입증하였다 (14). 보다 최근에는, 윅크라마시헤(Wickramasinghe) 그룹은 AFM 팁을 백금으로 코팅하여 유전영동을 통해 mRNA 분자의 추출을 가능하게 함으로써 이 방법을 최적화하였다. 윅크라마시헤의 기술은 표준 검정 기술과 성공적으로 동반되어 유방암 세포에서 RNA 분자를 검출하였다 (15-16).
단일 세포의 조작 및 분석은 세포의 기능 및 운명을 제어하는 프로세싱을 이해하는 데 있어 그 다음의 개척지이다. 고처리량 서열분석의 도입에 의해 현재 단일 세포 내에서 모든 활성 유전자의 수집을 수득하는 것이 가능하지만, 세포의 유전학 물질의 초기 포획은 여전히 주요한 도전으로 남아있다. 추가로, 단일-세포 조작을 위한 현재의 방법은 종종 분석물의 하나의 부류만을 검출할 수 있다.
구체적인 특허 및 간행물
문헌 [Seger et al., "Voltage controlled nano-injection system for single-cell surgery," Nanoscale 4(19): 5843-5846 (2012)]은 표지-무함유 감지 플랫폼으로서 나노피펫의 개발 (20-24) 및 배양에서 단일 세포의 다성분 주사를 가능하게 하는 ICM의 적합화 (25)를 개시한다.
문헌 [Laforge et al., "Electrochemical attosyringe," Proceedings of the National Academy of Sciences 104(29): 11895-11900 (2007)]은 미세량의 액체를 전기습윤(electrowetting)을 통해 살아있는 세포에 전달하는, 유리 나노피펫에 기초하는 전기화학적 아토시린지(attosyringe)를 개시한다 (26).
문헌 [Mirkin, et al., WO 2008/054488, 2008년 5월 8일 공개, 발명의 영문 명칭: "Electrochemical Attosyringe and Its Use as an Electrochemical Nanopump Driver,"]은 유기 용매 및 외부 전압으로 충전되어 수용액의 흡인 및 전달을 구동하는 나노피펫을 개시한다.
본 출원과 적어도 1명의 발명자가 공통적이고 양수인이 동일한 문헌 [Seger et al., US 2012/0225435, 2012년 9월 6일 공개, 발명의 영문 명칭 "Nanopipette apparatus for manipulating cells"]은 고처리량 방식 및 세포에 최소 손상으로 전기삼투압에 의해 세포에 물질을 주입하는 나노피펫의 구경에서 xyz 제어기 및 전압 차이의 전자 제어를 동반한 나노피펫을 개시한다. 세포로부터 물질의 추출 및 나노피펫으로부터 배출 후 이러한 물질의 분석은, 상기 출원에 개시되지 않으며, 추가 분석을 위한 천연 형태의 생물학적 물질의 제거도 기재되지 않는다.
문헌 [Seger et al., "Voltage controlled nano-injection system for single-cell surgery," Nanoscale 4:19 2012 Sep 28 pg 5843-6]은 상기 언급된 PG 간행물과 유사한 개시내용을 포함한다.
파블(Pavel) 등의 미국 20110131690 (6/2/2011 공개, 발명의 영문 명칭: "Scanning Ion Conductance Microscopy,")은 주사 이온 전도 현미경검사, 및 세포 및 난해한 매트릭스 구조의 연질 표면 및 계면을 비롯한 연질 표면 및 계면의 연구에서의 그의 사용을 개시한다. 상기 문헌에 개시된 바와 같이, 주사 이온 전도 현미경검사(scanning ion conductance microscopy; SICM)는 임의의 접촉 또는 어떠한 상호작용 없이 그리고 대상체의 정상적인 액체 환경에서 연질 표면의 고해상도 영상화를 가능하게 하는 주사 프로브 현미경검사 (scanning probe microscopy; SPM)의 형태이다.
본 발명의 간단한 개요
하기 간단한 개요는 본 발명의 모든 특징 및 측면을 포함하는 것으로 의도되지 않으며, 본 발명이 이 개요에서 논의된 모든 특징 및 측면을 포함해야 하는 것을 의미하는 것이 아니다.
특정 측면에서, 본 발명은 팁, 및 제1 전해질과 접촉하거나 또는 나노피펫의 내부에 인접하고, 전류 검출 회로에서 증폭기 입력에 연결되도록 배치된 제1 전극, 및 나노피펫의 외부 및 세포에서 제2 전해질을 포함하는 용액과 접촉하고, 제1 전극 및 전류 검출 회로에 연결되도록 배치된 제2 전극을 함유하는 나노피펫을 포함하며, 여기서 제1 전해질 및 제2 전해질은 이온성 전류가 전극 사이 및 팁의 나노규모 개구부를 통해 유동하도록 한다. 일부 측면에서, 나노피펫은 석영으로 제조되고, 팁의 구경은 10 내지 1000 nm, 바람직하게는 직경이 대략 50 내지 200 nm일 수 있다.
추가로, 나노피펫 장치는 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 방향으로 실행하고 상기 나노피펫의 움직임을 세포를 향하거나 세포로부터 멀어지는 z 방향으로 실행하도록 나노피펫에 부착되고 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어력을 추가로 갖는 xyz 제어기를 포함한다. 일부 측면에서, 나노피펫의 z 방향은 제1 전극과 제2 전극 사이의 이온성 전류 유동에 의해 생성된 신호에 의해 제어된다. 상기 장치는 세포 표면을 고해상도로 영상화할 수 있는 장치, 예를 들어 주사 이온 전도 현미경검사 (SICM)에 커플링된다.
이러한 장치는 본원에서 "나노피펫 SICM" 장치라 지칭되고, 상기 언급한 미국 2012/0225435에 추가로 기재된 바와 같이 전압을 제어하는 회로를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 나노피펫 장치 내의 제1 전극은 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (AgTBACI)이다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 전해질 용액은 예를 들어 이온성 물질, 예컨대 테트라헥실암모늄 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (THATPBCl)를 함유하는 소수성 액체, 예컨대 1-2 디클로르에탄이다.
특정 측면에서, 본 발명은 또한 생물학적 물질을 분석하기 위해서 단일 세포의 세포질 또는 소기관 내에서부터 미리 선택된 생물학적 물질의 추출을 행하기 위해 나노피펫 SICM 장치를 제어하는 방법을 포함한다. 이 방법은 본원에서 "나노생검"이라 칭한다. 통상적인 생검과는 달리, 본원의 나노생검은 단일 세포 내에서 수행되고; 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 바람직하게는 숙주 유기체로부터 추출되어 현미경으로 사용하기 위한 샘플 단계에 놓여진 동물 세포이다. 세포는 통상적인 생검에 의해 추출된 것일 수 있거나, 또는 다른 수단, 예컨대 혈액 채취, 골수 흡인 등에 의해 생체외에서 취해질 수 있다. 세포는 나노생검 이전 기간의 시간 동안 생체외 배양될 수 있다. 추출된 물질은 친화도 화합물 또는 화학적 처리에 의존하지 않고 수득될 수 있다. 상기 물질은 그의 천연 상태로 및 면역반응성, 서열 동일성 등에 기초한 임의의 선택 바이어스의 도입 없이 수득된다.
본 발명의 특정 측면에서, 나노피펫 기기는 다음과 같이 제어된다:
1. 액체 유기 용매, 및 나노피펫 외부의 또 다른 전극과 연결되어 있으나 분석할 세포와 접촉하는 용액 (매질) 중에 있는 내부 전극을 갖는 나노피펫을 제공한다.
2. 내부 전극을 양성 바이어스 (예를 들어 200 mV)로 분극화시켜서 매질이 세포 내로 유동하는 것을 방지한다.
3. 이온성 전도를 측정하여 나노피펫이 세포 표면으로 안내되고, 나노피펫이 세포 표면의 바로 위에 놓이면 신속하게 내려 세포를 찌른다(piercing). 이 단계는, 관심 세포 성분이 영상화될 수 있도록 하는 광학 현미경검사 또는 다른 현미경검사에 의해 안내될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아는 일반적으로 약 1 내지 10 μM 길이이며, 광학 현미경으로 볼 수 있다. 세포를 염색하여, 선택된 미토콘드리아를 가시적으로 확인할 수 있다.
4. 나노피펫 팁이 일단 세포 내부에 놓이면, 나노피펫 바이어스를 소정의 시간 동안 양성에서 음성 바이어스 (예를 들어 -500 mV 또는 -200 내지 -1000 mV의 범위)로 전환시켜서 표적화된 생물학적 물질이 나노피펫으로 유입되도록 한다. "표적화된 세포내 내용물", 즉 생물학적 물질은 세포 내의 물리적 위치 및 수집될 분자, 예를 들어 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, mRNA, rRNA, 세포질 단백질, 핵 단백질, 리소좀 단백질 또는 막, 폴리사카라이드 등의 특성에 의해 표적화된다.
5. 단계 4 이후에는 예를 들어 200 mV 또는 200 mV 내지 500 mV의 범위의 양성 전압으로 전환시켜서 유입은 중지시키지만 나노피펫의 내용물이 유출되지는 않게 한다.
6. 나노피펫을 신속하게 올리고, 세포 및 주위의 매질로부터 제거하고, 이동 용기로 이동시키며, 이때 전압을 다시 양성 (예를 들어 +1V 또는 500 내지 1000mV의 범위)으로 전환시켜서 흡인된 내용물을 분석용 샘플 용기로 유출시킨다. 샘플 용기는 핵산 저장 완충제, 예컨대, 예를 들어 PBS의 뉴클레아제-무함유 용액, 또는 예를 들어 US 2012/0171685에 개시된 다양한 완충제를 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 단계 6으로부터 흡인된 내용물을 분석하여 샘플에서 DNA의 염기 서열을 결정하거나 또는 동정한다. 이는 실시간 PCR 또는 차세대 서열분석 (NGS)을 비롯한 다양한 방법에 의해 행할 수 있다.
따라서, 상기 장치는 xyz 제어기상에 탑재되고, 나노피펫 내부 내 제1의 소수성 전해질 용액과 함께 사용되도록 적합화된 제1 전극에 부착된 나노피펫; 세포의 외부와 접촉하는 제2의 상이한 전해질 용액과 접촉하도록 배치되고 적합화된, 나노피펫 외부의 제2 전극; 전극 사이의 이온성 전류를 검출하는 전류 검출 회로, 및 소정의 시간에 제1 전극과 제2 전극 사이의 전압을 역전시킴으로써 나노피펫 내부 및 외부로의 액체 유동을 제어하도록 구축된 전압 제어 회로를 포함하는, 단일 세포로부터 세포내 내용물을 추출하는 장치를 특징으로 할 수 있다.
상기 장치의 다양한 실시양태는 추가로 상기 xyz 제어기가 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 방향으로 실행하고 상기 나노피펫의 움직임을 세포를 향하거나 세포로부터 멀어지는 z 방향으로 실행하도록 상기 나노피펫에 부착되고, 상기 xyz 제어기가 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어력을 추가로 갖고, 상기 전압 제어력이 상기 xyz 제어기가 나노피펫 팁을 세포 내에 위치시켰을 때 전압을 역전시키도록 구성될 수 있다. 상기 장치의 다양한 실시양태는 추가로 나노피펫의 z 방향이 제1 전극과 제2 전극 사이의 이온성 전류 유동에 의해 생성된 신호에 의해 제어되도록 구성될 수 있다. 상기 장치의 다양한 실시양태는 추가로 제1 전극이 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (AgTBACI)이도록 구성될 수 있다. 상기 장치의 다양한 실시양태는 추가로 제1 전해질 용액이 소수성 액체, 예컨대 1-2 디클로르에탄 및 테트라헥실암모늄 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (THATPBCl)를 함유하는 이온성 물질을 포함하도록 구성될 수 있다. 상기 장치의 다양한 실시양태는 추가로 나노피펫이 석영이도록 구성될 수 있다.
상기 장치는 (a) 제1 바이어스 전압을 제공하여 제1 전해질을 나노피펫에 보유시키는 단계; (b) 제2의 상이한 바이어스 전압을 제공하여 세포 내의 물질이 유입되도록 하는 단계, 및 (c) 제3의 상이한 바이어스 전압을 제공하여 나노피펫의 유체가 유출되도록 하는 단계를 포함하는 단계에 따라 상기 장치를 작동시키는 프로그래밍된 지침을 포함할 수 있다.
상기 장치의 다양한 실시양태는 추가로 전류 검출 회로에 의해 감지되는 이온성 전류에서의 변화에 반응하여 상기 장치를 작동시키는 프로그래밍된 지침 세트를 포함하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 천연 형태로 추출된 세포로부터의 세포내 내용물은 소기관 또는 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 추출된 핵산은 게놈 DNA, RNA (리보솜으로부터의 mRNA 및 rRNA를 포함), 또는 미토콘드리아 DNA를 포함한다. 다른 측면에서, 소기관은 미토콘드리아이다. 추가로, 단백질, 소분자, 세포 프로세싱의 대사물을 함유하는 세포 세포질 또는 소포의 분획을 추출할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 또한 (a) 추출할 표적 세포내 내용물을 갖는 세포를 포함하는 용액을 제조하는 단계; (b) 본원에 기재된 바와 같은 SICM 나노피펫을 작동시켜 감지 이온성 전류에 의해 세포에 접근하는 단계; (c) 나노피펫을 사용하여 세포 표면을 관통시키는 단계; (d) 이온성 전류를 조정하여 소정의 시간 및 전압 동안 음성 바이어스를 생성하여 표적 세포내 내용물을 나노피펫으로 추출하는 조절된 유입을 일으키는 단계; 및 (e) 추가로 이온성 전류를 조정하여 양성 바이어스를 생성하여 추출된 내용물이 나노피펫을 이탈하는 것을 방지하고, 추가로 나노피펫의 내용물을 추가 분석을 위해 용기로 배출시키는 단계를 포함하는, 세포로부터 세포내 내용물을 기계적으로 추출하는 방법에 관한다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 추출할 표적 세포내 내용물을 갖는 하나 이상의 세포를 함유하는 용액을 제조하는 단계; xyz 제어기, 내부 전극 및 바이어스 전압 생성을 위한 외부 전극을 갖고, 추가로 소수성 용액을 함유하고 팁을 갖는 나노피펫을 갖는 나노피펫 SICM 장치를 제공하는 단계; 나노피펫 SICM 장치를 조작하여 팁을 통해 이온성 전류의 강하를 감지함으로써 상기 하나의 세포에 접근하는 단계를 포함하는, 개개의 세포로부터 표적화된 세포내 내용물을 추출하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 추가로 내부 전극과 외부 전극 사이에 양성 전압을 생성하여 세포로 삽입하는 동안 나노피펫에서 액체가 소수성 용액에 진입하는 것을 방지하는 단계; 나노피펫의 위치를 조정하여 소정의 세포 위치를 관통하고 세포 내로 삽입되도록 하는 단계; 전압을 조정하여 나노피펫으로 유입되도록 하고 표적 세포내 내용물을 추출하는 단계; 전압을 추가로 조정하여 추출된 표적 세포내 내용물이 나노피펫을 이탈하는 것을 방지하는 단계; 및 전압을 추가로 조정하여 추출된 표적 세포내 내용물이 샘플 용기로 유출되도록 하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 추출된 표적 세포내 내용물이 핵산을 포함하고, DNA 또는 RNA를 포함하고/하거나 미토콘드리아 DNA를 포함할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 전압이 (a) 표적 세포내 내용물이 나노피펫으로 유입되도록 하기 위한 -100 내지 -1000 mV; (b) 나노피펫으로의 유입을 중지시키고 나노피펫으로부터의 유출을 방지하기 위한 100 내지 500 mV; 및 (c) 추출된 표적 세포내 내용물이 유출되도록 하기 위한 +0.5 내지 2 V 중 하나 이상인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법의 다양한 실시양태는 단계 (a)에서의 유입이 1초 내지 5초 동안 지속되는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 유출이 핵산 저장 완충제를 함유하는 샘플 용기로의 유출인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법의 다양한 실시양태는 추출된 표적 세포내 내용물이 단일 미토콘드리아로부터의 DNA이고 미토콘드리아 DNA의 서열 일부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 (a) xyz 제어기, 바이어스 전압 생성을 위한 내부 전극 및 외부 전극을 갖고, 단일 세포를 찌르기(piercing) 위한 팁을 함유하는 나노피펫을 추가로 갖는 나노피펫 장치를 제공하는 단계; (b) 나노피펫 장치를 조작하여 세포의 표적 세포내 내용물이 나노피펫으로 유입되도록 하고 추출하는 단계; (c) 전압을 추가로 조정하여 추출된 표적 세포내 내용물이 나노피펫을 이탈하는 것을 방지하는 단계; (d) 전압을 추가로 조정하여 추출된 표적 세포내 내용물이 샘플 용기로 유출되도록 하는 단계, 및 (e) (i) 추출된 표적 세포내 내용물로부터의 mRNA 분석, 및 (ii) 추출된 표적 세포내 내용물로부터의 1종 이상의 선택된 단백질의 분석 중 하나 또는 둘다에 의해, 상기 추출된 표적 세포내 내용물을 분석하는 단계를 포함하는, 개개의 세포로부터 세포내 내용물을 추출하는 방법을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 상기 mRNA 분석이 세포로부터의 mRNA 500 pg 이상의 분석을 포함하거나, 또는 상기 mRNA 분석이 세포 내 mRNA 서열의 90% 이상의 분석을 포함하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시양태는 상기 단백질 분석이 특정 단백질을 검출하는 초민감(ultra-sensitive) 검정, 예를 들어 면역검정, 예컨대 근접성 라이게이션(proximity ligation) 방법을 추가로 포함할 수 있다. 상기 분석은 EGFR, MKK1, ERK1/2, JAK, AP1/Jun 및 STAT 중 적어도 하나를 분석하는 것을 포함하는 단백질 종을 분석하는 것; 인산화된 단백질을 인산화되지 않은 동일 단백질로부터 구별하는 것; 동일 세포에 대해 상이한 시점에 수회 분석을 수행하는 것; 인산화된 단백질을 인산화되지 않은 동일 단백질과 구별하는 것; 및/또는 동일 단백질로부터의 번역후 변형을 갖는 단백질을 그와 같이 변형되지 않은 단백질과 구별하는 것을 포함할 수 있다.
도 1A 내지 1D는 흡인후 분석을 위한 단일 세포 나노생검 및 단일 세포 소기관 또는 세포질 내용물의 이동을 보여주는 일련의 도면이다. 도 1A는 나노피펫 팁의 세포 표면으로의 자동화된 접근 (여기서 나노피펫 팁은 세포 함유 액체의 표면 바로 아래 놓임)을 보여주고; 도 1B는 팁의 세포 세포질로의 침투 후 세포질 물질의 제어된 흡인을 보여주고; 도 1C는 나노피펫의 회수(retraction)를 보여주며; 도 1D는 분석을 위해 생검된 물질을 튜브에 전달하는 것을 보여준다. 매질에서 외부 전극은 나타내지 않는다.
도 2는 나노피펫에서 전기습윤의 결과를 보여주는 결과이다. 생검동안, 나노피펫은 +100mV에서 바이어스되고, 이어서 -500mV로 전환된 후, +500mV로 된다. 얻어진 곡선은 15개의 "흡인-방출" 주기 결과의 평균이고, 상이한 전압 상태에서의 이온성 전류 유동 변화를 보여준다.
도 3은 단일 세포 나노생검 동안의 크로노암페로메트리를 보여준다. 나노피펫은 +100mV에서 바이어스되어 임의의 수용액이 나노피펫으로 진입하는 것을 방지한다. 바이어스가 -500mV로 전환되면, 나노피펫 배럴에서 세포 세포질의 도입으로 인해 이온 전류가 증가한다.
도 4는 단편 크기 결정 (∼250 염기쌍의 예상되는 크기에서)을 위해 SYBR®에 의해 염색한 겔, 및 GFP-HeLa 세포 (PC, 양성 대조군, 2벌로 수행) 및 인간 BJ 섬유모세포 (NC, 음성 대조군)에서 GFP 유전자를 위한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 후속하는 cDNA 합성의 영상이다.
도 5는 ~1,000 세포 용해물 (정량화 주기, Cq 20)로부터 전체 RNA의 양성 대조군, 단일 세포로부터의 생검 (정량화 주기 Cq 30), 및 음성 대조군으로서의 물 (정량화 주기 Cq 33)을 보여주는 HeLa 세포로부터 GFP RNA를 표적화하는 qPCR을 통한 생검후 분석을 보여주는 선 그래프이다.
도 6은 ~1000 GFP-HeLa 세포의 용해물로부터 추출된 전체 RNA로 이루어진 양성 대조군 (원형)을 보여주는 선 그래프이다. 나노생검 (박스)은 단일 세포의 표준 나노생검의 내용물로 출발하는 qPCR을 나타낸다. 음성 대조군 (삼각형)은 세포 침투 후에 -500mV의 인가없이 본원의 표준 프로토콜을 따르는 (따라서 흡인 단계 없음) 5개의 샘플, 4개의 나노생검 샘플을 나타내나, 다섯번째 샘플은 물을 출발 물질로서 사용한다. 본원의 나노생검 샘플 및 양성 대조군과 비교하여, 전압의 인가가 없는 4개의 샘플, 및 물을 갖는 샘플은 모두 음성 증폭된 결과가 얻어졌다.
도 7은 양성 대조군 및 5개의 음성 대조군 샘플 (샘플 #1-#5)의 qPCR을 통한 생검후 분석을 보여주는 선 그래프이다.
도 8은 단편 크기 결정 (~7000 염기쌍의 예상되는 크기에서)을 위해 Sybr gold로 염색한 겔, 및 미토콘드리아 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭의 영상이다. 레인 1 내지 5는 5개의 개개의 인간 BJ 섬유모세포 상의 미토콘드리아 생검. 샘플 레인 6은 생검이 수행되지 않은 음성 대조군 (입력 DNA 없음)이고, 레인 7은 양성 대조군 (입력 물질로서 미토콘드리아 PCR 생성물)이다.
도 9A 및 도 9B는 흡인물의 RNA 서열분석의 판독 범위를 보여주는 UCSC 게놈 브라우저에서 디스플레이된 일련의 영상이다. 게놈 위치는 X 축을 따라 디스플레이되고, 범위의 깊이는 Y 축으로 나타낸다. 도 9A는 유전자 PABPC1에서의 대안적인 3' 엑손의 사용을 보여준다. 앙상블 유전자 예측은 하단에서 디스플레이되고, 여기서 선은 인트론을 나타내고 직사각형은 엑손을 나타낸다. 이들 유전자 예측은 역전된 가닥에서 있고, 3'→5' 방향으로 디스플레이된다. 유전자 PABPC1에서 대안적인 3' 엑손 사용은 M3 및 M7 대 M8로 보여진다. M8은 더 긴 이소형의 3' 영역에 걸친 범위를 보여주는 반면 M3 및 M7은 더 짧은 이소형에 걸친 범위를 보여준다. 도 9B는 유전자 MCCC2의 전체 길이를 따라 연장된 판독 범위를 보여주고, 나노생검에 의해 단리된 전사체로부터 전장 cDNA를 생성하는 가능성을 입증한다. 유전자 MCCC2는 하단에서 5'→3' 방향으로 디스플레이된다.
도 10은 단일 세포로부터의 2개의 미토콘드리아 흡인물, 및 또한 세포 집단으로부터 추출된 DNA의 서열분석 결과를 도시하는 플롯이다. 서열분석 결과는 흡인물에서 이상조직 빈도의 가변적 보존을 입증한다. 5% 내지 99% 빈도로 추정되는 이상조직 변이체는 원형으로 디스플레이되고, 여기서 원형의 구역은 관측 빈도에 비례한다. 변이체의 뉴클레오티드는 원형 근처 또는 원형 내의 문자 'A', 'C', 'T' 또는 'G'로 표시된다. 14713 A->T 변이체는 흡인물 및 집단을 가로질러 유사한 빈도를 보여주는 반면, 16278 C->T 변이체는 흡인물에서 이상조직 빈도의 큰 분산을 보여준다. 낮은 빈도의 변이체는 또한 흡인물에서 발견되나 집단에서는 발견되지 않는다.
도 11은 특정 단백질이 정량되는 본원의 나노피펫 방법을 사용한 단일 세포의 단백질 분석의 도식 표현이다.
바람직한 실시양태에 관한 상세한 설명
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 학술적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 개시된다. 일반적으로, 세포 및 분자 생물학 및 화학의 기술과 관련하여 사용되는 용어는 관련 기술분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 구체적으로 정의되지 않은 특정 실험 기술은 해당 기술분야에 널리 공지되고, 본원 명세서에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 명확하게 하기 위해, 하기 용어들은 이하와 같이 정의한다.
용어 "전기습윤"은 인가된 전기장에 사용되어 액적 및 필름을 이동시키는 효과를 지칭하는 통상적인 의미로 본원에서 사용된다. 본원에서 음성 전압이 인가되었을 때 세포 용액이 나노피펫으로 유동하도록 하고, 바이어스가 역전되었을 때 유출되도록 하는데 사용된다. 예를 들어, 라포즈(Laforge) 및 동료들은 형광 염료를 배양에서 살아있는 세포에 주입하는 나노피펫에서의 전기습윤을 개발하였다 (26).
용어 "이온 전도 현미경검사 (ICM)" 또는 "주사 이온 전도 현미경검사 (SICM)"는 고도의 공간적 (17) 및 일시적 해상도 (18)를 갖는 살아있는 세포의 영상화 능력을 지칭하는 것으로서 본원에서 사용된다. ICM은 나노피펫 구멍을 통해 이온 유동을 생성하도록 바이어스된 전해질 용액으로 충전된 유리 나노피펫에 의존한다. 이어서 나노피펫은 표면에 걸쳐 스캐닝되고, 측정된 이온 전류의 크기 변화는 샘플 연구의 지형 변화를 반영한다 (18-19). 팁이 샘플을 가로질러 스캐닝되면, 영상이 제공될 수 있다 (28).
용어 "나노피펫"은 나노규모, 즉, 0.05 nm 내지 약 500 nm, 바람직하게는 약 (+ 또는 - 20%) 50 nm의 원뿔형 팁 개구부 (즉, 나노공극)를 갖는 공동 자립형의 불활성 비-생물학적 구조를 나타내는 통상적인 의미로 본원에서 사용된다. 공동 구조는 유리 또는 석영일 수 있고, 이는 그의 내부에 또는 나노공극의 한 측면 상에 나노공극 개구부를 통과하는 유체를 보유하기에 적합하다. 나노피펫의 내부는 분석물의 비-특이적 결합을 최소화하도록 선택 또는 변형된다. 내부는 나노피펫 내 용액과 접촉하는 전극의 삽입을 가능하게 하는 크기이다. 나노피펫은 바람직하게는 유리 또는 석영 모세관의 레이저 흡인(laser pulling)에 의해 제작된다. 나노피펫은 대략 10 내지 100 nm의 내경, 대략 200 내지 800 nm의 외경, 및 약 10 ㎛의 전형적인 길이를 갖는다. 이러한 치수는 특정 용도에 적합하게 하는 크기이며, 나노공극 크기의 제어는 중요한 고려사항이다. "다중-배럴형 나노피펫"은 통상 공통의 벽을 공유하는 둘 이상의 평행한 구경을 갖는 나노피펫이다. 상기 구경은 통상 방사상으로 이격된 동축이지만, 동심일 수 있다. 이는 시판되는 다중구경 모세관으로부터 제작될 수 있다.
용어 "마이크로조작기" 또는 "xyz 제어기"는 전형적으로 평평한 표면인 x 및 y 치수, 및 전형적으로 수직인 z 방향으로 알려진 3차원으로 움직이는 기계적 장치를 지칭한다. xyz 제어기는 다양한 마이크로-규모의 사용, 예컨대 원자 탐침 현미경에서의 용도가 공지되어 있고, 예를 들어, 예시적인 xyz 제어기에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 US 5,394,741 (Kajimura et al., 발명의 영문 명칭 "Atomic probe microscope")을 참조한다.
용어 "전류 검출 회로" 또는 "전압을 제어하는 회로"는 제어가능한 증폭기 및 민감한 전압 및 전류 검출기를 포함하는 공지된 전자 회로 및 장치를 지칭한다. 이들은 10-10000 피코 암페어의 기준선 전류를 기준으로 대략 1-10 피코 암페어의 변화를 검출하고 추가로 이러한 변화에 대한 반응으로 전압 및/또는 전류를 변화시키는 임의의 민감한 장치를 포함할 수 있다. 상기 용어는 시간 반응성이고 비교적 온도 독립적이거나 또는 보상을 위해 온도 변화를 가능하게 하는 회로를 추가로 지칭한다. 공지된 전압이 공급되는 회로에서 입력을 가져야 한다. 민감한 검출 회로는 전압 클램프 증폭기 및 트랜스임피던스 증폭기를 포함하여 공지되어 있다.
용어 나노피펫 SICM 장치는 프로브로서 나노피펫을 사용하는 주사 이온 현미경검사 장치를 의미한다. 이는 나노피펫의 구경 내에서, 구경으로, 또는 구경으로부터 유체를 보유하고, 입력하고, 배출하기 위한 내부 바이어스 전압을 효과적으로 셋팅하는 제어 회로를 갖는다. 바이어스 전압은 나노피펫의 구경 내에서 전해질 용액 내의 내부 전극 및 나노피펫 외부이지만 작동 중에 나노피펫과 접촉되는 도전성 용액 내의 외부 전극에 의해 셋팅된다. 용어 "바이어스" 전압은 일반적인 의미로 사용되지만 바람직하게는 고정 DC 전압이다.
용어 "초민감 검정"은 하기 정의되는 바와 같은 PLA, 및 단백질 및 다른 세포 비-핵산 거대분자, 바람직하게는 단백질을 검출할 수 있는 검정을 포함한다. 초민감은 단일 세포의 내용물을 기준으로 의미있는 결과 (단백질 변형 및/또는 정량화)를 얻는 능력을 지칭한다. 이는 특히 세포질 및 분비 단백질에 적용가능하다. 초민감 감정은 특정 단백질의 펨토그램 양만큼 낮은 양을 검출할 수 있다.
초민감 면역검정의 예는 US 20130273667 ("Wide range luminescent immunoassays"), US 20120289428 ("Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects") 및 US 4289748 A (ultrasensitive enzymatic radioimmunoassay method)를 포함한다
용어 "번역후 변형"은 관능기 또는 단백질의 공유 첨가, 조절성 서브유닛의 단백질분해 절단, 또는 전체 단백질의 분해에 의해 변형된 단백질을 지칭한다. 이들 변형은 인산화, 글리코실화, 유비퀴틴화, 니트로실화, 메틸화, 아세틸화, 지질화 및 단백질분해를 포함하고, 정상적인 세포 생물학 및 발병의 거의 모든 측면에 영향을 준다. 이러한 방식으로 변형되지 않은 단백질은 변형되지 않은 단백질로 칭할 수 있다.
용어 "PLA"는 본원에 기재된 바와 같은 근접성 라이게이션 검정을 의미하고, 여기서 항체는 올리고뉴클레오티드가 항체에 부착되어 상호작용하도록 하는 거리 내의 공간적으로 근접한 에피토프에 결합한다. 이러한 올리고뉴클레오티드 상호작용은 폴리뉴클레오티드 검출, 예컨대 PCR을 기초로 민감 검출을 가능하게 한다. 더욱 명확하게 하기 위해서, PLA의 예는 문헌[He J, Evers DL, O'Leary TJ. et al. Immunoliposome-PCR: a generic ultrasensitive quantitative antigen detection system. J Nanobiotechnology. J Nanobiotechnology. 2012;10:26, 및 "Ultrasensitive immunoassays, US 6878515, to Ulf Landegren]에 주어진다.
용어 "EGFR"는 "표피 성장 인자 수용체", 예를 들어 인간 표피 성장 인자 수용체를 의미하며, 추가로 Uniprot Q504U8 (Q504U8_인간)에 기재되어 있다.
용어 "MKK1"은 MAP 키나제 skh1/pek1, 예를 들어, Uniprot Q02750 (MP2K1_인간)을 의미한다.
용어 "ERK1/2"는 세포외 신호-조절된 키나제, 예를 들어 Uniprot P27361 (MK03_인간)을 의미한다.
용어 "JAK"는 Janus 키나제 2, 예를 들어 Uniprot O60674 (JAK2_인간)를 의미한다.
용어 "AP1/Jun"은 c-Fos, c-Jun, ATF 및 JDP 부류에 속하는 단백질로 이루어진 이종이량체 단백질인 전사 인자인 활성자 단백질 1 (AP-1)의 부류를 의미한다. JUN 인자로도 공지된 AP-1 (활성자 단백질-1) 전사 인자는 많은 유도가능한 유전학 반응을 조절하는 광범위하게 작용하는 인자이다. 예는 PELI3, Uniprot Q8N2H9 (PELI3_인간)이고, 이는 AP1/JUN 및 ELK1를 활성화한다.
용어 "STAT"는 활성화될 때까지 세포질에 있는 전사 잠재적 전사 인자의 부류인 신호 변환기 및 활성자를 의미한다. 7가지의 포유동물 STAT는 JAK에 의해 인산화되는 C-말단 근처의 보존된 티로신 잔기를 갖는다. 예는 Uniprot P42226 (STAT6_인간)이다.
개관
주사 이온 전도 현미경 (SICM)으로 통합하여 소기관 및 소기관 내용물을 비롯한 세포로부터의 세포내 내용물을 추출하는 나노피펫을 사용하는 시스템을 위한 장치 및 방법이 본원에 개시된다. 이 기술은 단일-세포 서열분석 기술 (32)과 함께 적용되어 공간적 및 일시적 정보를 갖는 살아있는 조직에서의 이질성의 상세한 연구를 가능하게 한다. 단일-세포 조작을 위한 현재의 방법은 종종 분석물의 하나의 부류만을 검출할 수 있지만, 본원에 기재된 나노생검 플랫폼은 유전체학, 단백질체학, 및 대사체학 분석 (33)에 적용할 수 있다. 이 기술은 프로그래밍된 지침을 포함하는 컴퓨터 및 컴퓨터 해독가능한 형태로 구현된 본 발명의 방법을 실행하는 프로그래밍된 지침에 의해 이행될 수 있다.
통합된 나노피펫 SICM 장치
나노피펫을 이하에서 추가로 상세하게 기재하는 바와 같이 제작하고, 세포 위 수백 나노미터에 자동화된 위치 조정을 가능하게 하는 SICM 셋-업으로 통합하였다 (25). SICM 장치는 연질 비동작 표면의 정밀사진를 영상화하기 위해 이전에 고안된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Hansma, P.K., et al., The Scanning Ion-Conductance Microscope. Science, 1989. 243(4891): p. 641-643] 참조. 이러한 선행 기술의 장치는 XYZ 스캐닝, Z 피드백 및 제어 로직을 사용한다 (Z는 스캐닝하는 표면에 직교하는 방향인 것으로 고려된다).
간략하게 설명하면, 일반적인 SICM 배열은 소수성 전해질 용액으로 후방 충전되고 전해조에 침지된 나노피펫으로 이루어진다. 전극은 나노피펫에 위치하고 접지 전극은 전해조에서 어느 정도 떨어져 위치한다. 나노피펫이 유기 용액으로 충전되고 수성 용액에 침지되면, 액체-액체 계면이 나노피펫 개구부에 형성된다. 이어서, 전압이 이 계면을 가로질러 인가되면, 수용액의 나노피펫 안으로/밖으로의 유동을 유도할 수 있는 힘이 생성된다 (28). 또한 이온성 전류는 피드백 신호로서 작용하여 세포의 표면 위 소정의 위치에서 나노피펫의 높이를 정확하게 제어한다.
일부 실시양태에서, 나노피펫의 팁은 추출되는 표적 세포내 물질의 크기에 따라 제작되거나 조정된다. 추가로, 팁은 세포 벽 및 막을 관통시키기에 충분하게 내구성있고 견고하게 디자인된다.
추가로, 이 장치의 특징은 단일 세포로부터 대상체를 추출하거나 또는 단일 세포 내에서 분자 결합을 측정하기 위한 관련 장치와 혼입될 수 있다.
세포내 추출
도 1A 내지 1D에 나타낸 바와 같이, 세포로부터 세포내 내용물을 추출하는 방법은 본원에 기재된 나노피펫 장치를 하기 단계로 사용하는 것을 포함한다:
1) 세포 표면으로의 접근 (도 1A); 세포는 핵 (102) 및 미토콘드리아 (104)를 갖는 것으로 보여질 수 있다. 이 단계는 바람직하게는 세포 표면에 나노피펫 팁 (106)의 근접을 검출하는 감지 회로를 사용하여 수행한다. 상기한 바와 같이, 이는 세포를 함유하는 샘플 표면을 따라 팁이 스캐닝되면서 나노피펫 팁 (106)을 통해 유동하는 이온성 전류의 변화를 측정함으로써 행해질 수 있다. 세포 함유 액체의 표면은 101에 나타내었다. 도 1A은 피펫에서 작은 양성 바이어스가 유입을 방지하는 것을 보여준다.
2) 세포 표면의 관통 (도 1B); 여기서 관심 소기관이 위치하고 나노피펫의 팁을 그 바로 위에 위치시킨다. 이어서 예를 들어 xyz 조작기에 의해 신속하게 아래쪽으로 이동시켜 외부 세포 막을 관통시키고 소기관의 막을 관통시킨다. 침투 깊이는 공지된 세포 치수를 기초로 미리 프로그래밍할 수 있다. 예를 들어, 인간 림프구는 직경이 6-12 μm 범위일 수 있다. 전형적인 인간 세포는 직경이 약 10 μm이다. 섬유모세포는 다양한 형태 및 크기 뿐 아니라 활성화 및 비활성화 형태로 들어온다. 박테리아는, 예를 들어, 전형적으로 크기가 0.5 내지 1.5 μm 범위이다. 도 1B는 세포내로부터 유입을 일으키는데 사용되는 피펫에서의 음성 바이어스를 보여준다.
3) 표적 세포내 물질의 흡인 (추출) (도 1B); 여기서 나노피펫 바이어스 전압이 음성 전위로 전환되어 세포 물질이 나노피펫에 진입한다. 디클로로에탄(DCE)-충전된 나노피펫이 수용액으로 함침되면, DCE의 소수성 성질로 인해 액체-액체 계면이 나노공극 루멘에 형성된다. 이 계면을 가로지르는 전압의 인가는 DCE 표면 장력에 변화를 유도한다. 전기습윤으로 불리는 이 효과는 음성 전압이 인가되었을 때 수용액을 나노피펫에서 유동시키고 바이어스가 역전되면 유출시킨다. 다른 소수성 용매, 예컨대 물에서의 용해도가 0.5g/110g 미만인 용매, 예를 들어 http://murov.info/orgsolvents.htm에 나열된 것을 사용할 수 있다.
4) 나노피펫의 회수 (도 1C); 이 시점에, 투명한 세포 함유 액체까지 보유 상태로 나노피펫을 바이어스시킨다; 도 1C는 유출을 방지하는 피펫에서의 보유 잠재성을 보여준다;
5) 추출된 물질의 분석 (도 1D). 여기서, 나노피펫을 양성 상태로 바이어스하여 내용물을 배출시킨다. 도 1D는 샘플 용기로 유출을 일으키는 피펫에서의 강력한 양성 바이어스를 보여준다.
사용 전에, 나노피펫을 전해질을 함유하는 소수성 액체로 먼저 충전시키고 코팅된 와이어 전극을 나노피펫의 배럴 내에서 전해질 용액에 위치시킨다. 반복하기 위해서, SICM 또는 광학 현미경검사 및 나노규모 움직임이 가능한 xyz 제어기를 사용하여 나노피펫 팁을 관심 세포 성분 위에 위치시킨다. 세포(들)를 둘러싼 용액, 바람직하게는 제2 전해질 및 성장 매질을 포함하는 용액으로 나노피펫 팁을 내린다. 여기서, 나노피펫의 배럴 내부의 전해질은 양성 바이어스로 분극화되어 원치않는 용액이 배럴로 유동하는 것을 방지한다. 이 바이어스는 나노피펫 배럴에서의 전극과 세포를 둘러싼 매질에서의 전극 사이의 잠재적인 차이에 의해 생성된다. 이하 기재하는 바와 같이, 전압 제어 회로는 전극을 연결하고 바람직하게는 컴퓨터 제어 하의 다양한 바이어스 전압을 제공한다. 이 바이어스는 피드백 루프로의 입력으로서 사용되는, 예컨대 피드백 증폭기 또는 패치 클램프 증폭기 배열에 의해 제공되는 액체-액체 계면을 통해 이온 전류를 생성한다.
상기 계면을 가로지르는 전압의 인가는 전기습윤을 통해 전해질 표면 장력에 변화를 유도한다. 전기습윤은 비혼화성 액체, 예를 들어 소수성 및 친수성 (수성) 액체 사이의 계면에 관여한다.
전기습윤은 나노피펫 구경에서 다른 비극성 액체와 함께 수행될 수 있다. 이를 확인하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Maillard et al., "Two liquids wetting and low hysteresis wetting on dielectric applications," Langmuir 25(11) 6162-6167 (2009)]을 참조할 수 있다.
예시적인 비수성 전해질 용액은: 0.01 mol/L (또는 그 이상)의 테트라부틸암모늄 테트라페닐보레이트 (TBA-TPB) 전해질을 함유하는 니트로벤젠 용매, 또는 0.01 mol/L (또는 그 이상)의 TBA-TPB를 함유하는 1,2-디클로로에탄 용매이다. 비수성 전해질 용액은 또한 어느 한쪽의 용매로 형성될 수 있지만, TBA 대신 또 다른 테트라-알킬화된 암모늄 양이온, 예컨대 TEA, 테트라펜틸암모늄 등으로 대체될 수 있다.
TBA-TPB 음이온은 추가로 관능화된 페닐보레이트, 예컨대 테트라키스[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]보레이트, 또는 단순히 할라이드, 예를 들어 아이오다이드 음이온으로도 유사하게 교환될 수 있다. 본원에 나열된 용매 및 전해질은 비수성 전해질 용액의 포괄적 목록을 제공하지 않지만, 예시적인 용매의 적어도 하나, 예시적인 양이온의 적어도 하나, 및 예시적인 음이온의 적어도 하나의 임의의 조합을 사용하여 전기습윤 효과를 뒷받침하기에 적합할 수 있는 비수성 전해질 용액을 생성할 수 있다. 문헌 [Monroe et al., "Electrowetting devicees," WO 2008/142378]을 참조한다.
실시예의 나노피펫은 10 mM 테트라헥실암모늄 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (THATPBCl)를 함유하는 1-2 디클로르에탄 (DCE) 용액으로 충전된다. 이는 PBS (인산염 완충 염수) 배쓰에 침지된다. 도 2에서, 나노피펫이 +100mV에서 바이어스되어 임의의 수용액이 나노피펫 구경 내부에서 유동하는 것을 방지한다. 수동 또는 자동 조작에 의해, 임계치의 이온성 전류가 검출될 때까지 나노피펫을 생검될 대상체 (이 경우 세포) 위로 낮춘다. 일단 이온성 전류에서 특이적 임계값이 검출되면, 이어서 세포 막의 침투가 일어나기 위한 높은 속도로 나노피펫을 더 낮춘다. 예시 장치에서, 고객 작성 소프트웨어는 제어 회로가 이온성 전류에서 0.5% 강하를 검출할 때까지 나노피펫을 세포쪽으로 향하게 한다. 이는 세포 표면으로의 근접을 가리킨다. 이 지점에서, 소프트웨어는 접근을 중지시키고 나노피펫을 1 uM로 신속하게 낮추어 세포를 찌른다.
세포 막을 찌른 후, 이어서 회로를 음성 바이어스로 전환하여 세포 세포질 내의 세포 내용물의 나노피펫으로의 흡인을 제어하게 한다. 다시 도 2를 참조하여, 바이어스가 -500mV로 전환되면 나노피펫 배럴을 초기에 채운 유기 액체보다 더 높은 전도를 갖는 나노피펫 배럴에 수용액이 도입됨으로 인해 측정된 이온성 전류가 증가한다.
그 다음 바이어스는 양성 바이어스로 다시 전환되어, 세포 내용물의 나노피펫으로의 유입을 중지시킨다. 양성 바이어스는 이미 흡인된 내용물이 나노피펫 밖으로 유동하는 것을 방지하기에 충분히 강력하다. 다시, 도 2는 전압이 +500mV로 전환되면, 흡인된 수용액이 배출되어 측정된 이온성 전류를 감소시키고, 세포내 내용물의 샘플을 제공하는 것을 보여준다.
그 다음 세포로부터 추출된 세포 내용물을 공지된 분자 생물학 기술을 이용하여 분석한다. 나노생검 플랫폼은 질환, 예컨대 암 및 신경변성 질환의 연구를 위한 큰 영향을 갖는 미토콘드리아를 비롯한 소기관의 샘플링을 가능하게 한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 다중-배럴형 나노피펫은 별개의 배럴에서 적어도 2개의 전극으로 사용된다. 하나의 배럴은 세포 내용물을 회수하기 위해 사용될 수 있고, 또 다른 배럴은 동일 조작동안 물질을 세포로 주사하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 배럴이 단일 주사 동안 상이한 시점에서 상이한 샘플을 수집하기 위해 또한 사용될 수 있다.
세포내 내용물: 미토콘드리아 DNA
미토콘드리아 DNA (mtDNA)는 단일 세포 및 미토콘드리아로부터 추출되고 분자 생물학 기술을 사용하여 분석된다. DNA는 세포에 적용되는 임의의 종류의 화학적 처리 없이 및 세포의 용해없이 추출된다.
mtDNA는 진핵 생물의 미토콘드리아에서 발견되는 DNA이다. 미토콘드리아는 세포의 에너지 공급원으로 사용되는 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 세포 공급의 생성을 담당하는 소기관이다. mtDNA는 단일 가닥 또는 보다 일반적으로는 이중 가닥일 수 있고, 통상적으로 원형 또는 선형의 형태이다. 미토콘드리아 게놈은 37개의 유전자 (이 중 13개는 전자 수송을 위한 것이고, 22개는 tRNA, 2개는 rRNA를 위한 것임)를 코딩하는 16,596개의 핵산 염기쌍으로 이루어진다. mtDNA는 모계 유전적이기 때문에 mtDNA 분석은 모계 계통을 역추적하는데 사용될 수 있다. 이는 유전성 미토콘드리아 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, OXPHOS 시스템의 컴플렉스(Complex) III, IV 및/또는 V의 핵산에서의 미스센스 돌연변이를 대상체에서 동정하는 것을 기재하고 있는 문헌 [EP 1841884 A2, "Inherited mitochondrial dna mutations in cancer"]을 참조한다. 따라서 본원에서 수행되는 분석에 의해 검출할 수 있는 이러한 돌연변이는 상기 기술된 바와 같이 C5911T, G5913A, A5935G, G5949A, G5973A, G6081A, G6150A, T6124C, T6253C, G6261A, G6267A, G6285A, C6340T, G6480A, A6663G, G6924T, G7041A, T7080C, A7083G, A7158G, A7305C, A14769G, C8932T 및 T7389C를 포함한다. 돌연변이는 OXPHOS (산화적 인산화)를 억제하고 ROS (반응성 산소 종)를 증가시키는 효과를 가질 수 있다.
세포의 핵에서 발견되는 핵 DNA는 mtDNA보다 더 많은 염기를 함유한다. 그러나, 세포 내에 훨씬 많은 미토콘드리아가 존재하기 때문에, 핵 DNA보다 더 많은 mtDNA의 카피가 존재하고, 본 발명의 방법에 의한 분석을 위한 mtDNA를 매우 우수한 표적으로 만든다.
실시예의 방법 및 물질
나노피펫 제작
외경 1.0 mm, 내경 0.70 mm 및 길이 7.5 cm의 필라멘트를 갖는 석영 모세관으로부터 나노피펫을 제작하였다 (슈터 인스트루먼트 코.(Sutter Instrument Co.), Item # QF100-70-7.5). 평균 직경 = (106±16) nm (편차 15%).
SICM 셋업
주사 이온 전도 현미경 (SICM)은 나노피펫 바이어스 및 전류 측정을 위한 저-노이즈 증폭기 (악소패치 200B, 몰레큘라 디바이시즈, 써니베일, CA), X, Y 및 Z 방향으로 코스 제어를 위한 마이크로조작기 (MP-285, 슈터 인스트루먼트 컴퍼니, 노바토, CA), X, Y 및 Z 방향으로의 미세 제어를 위한 피에조 작동기 (나노-큐브(Nano-cube), 피직 인스트루먼츠(Physik Instruments)), 및 시스템의 하드웨어 제어를 위한 필드 프로그래머블 게이트 어레이(Field Programmable Gate Array; FPGA) (PCIe-7851R, 내셔널 인스트루먼츠(National Instruments))로 이루어진다. 시스템은 LabVIEW로 작성된 소비자 코딩된 소프트웨어를 사용하여 제어된다 (1).
세포 배양물
BJ 인간 섬유모세포를 스템건트(Stemgent) 카탈로그 # 08-0027로부터 구입하고 페놀-레드를 갖지 않는 보충제 (Lonza Cat. # CC-4181)를 갖는 간질 세포 기초 매질(SCBM) (Lonza Cat. # CC-3204)에서 배양하였다. 녹색 형광 단백질을 발현하는 HeLa 세포 (셀 바이오랩스, 인크.(Cell Biolabs, INC.), 카탈로그 # AKR-213)를 공급자로부터 제안된 바와 같이 10% 태아 소 혈청, 0.1 mM 필수 아미노산, 2mM L-글루타민 및 1% 펜-스트렙(Pen-Strep)으로 보충된 70% DMEM 매질에서 배양하였다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 중에서 배양하였다. 세포를 1% 젤라틴으로 코팅된 비격자 및 격자 플레이트 양쪽에 플레이팅하였다 (이비디 μ-디쉬 35mm, 하이그리드(highGrid)-500 비코팅, 멸균). 세포를 디쉬 1개 당 약 5×104개 세포로 플레이팅하였다.
THATPBCl 염 합성
테트라헥실암모늄 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (THATPBCl)를 테트라헥실브로민화암모늄 (알드리치(Aldrich), #263834) 및 칼륨 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (플루카(Fluka), 60591)의 치환에 의해 합성하였다. 양쪽 생성물을 물/메탄올 (1:3)의 혼합물에 용해하고 에탄올에서 재결정화하였다 (2).
칼슘 영상화
나노생검 플랫폼의 침윤을 나노수술적 절차 이전에, 동안에 및 이후에 [Ca2+]를 모니터링하여 시험하였다. 인간 BJ 섬유모세포를 시험 전에 상기 세포 배양물 란에 기재한 바와 같이 매질에서 5μM Fluo-4AM (인비트로젠(Invitrogen))으로 염색하였다. 이어서 세포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 성장 배지로 2회 세척하였다.
분자 생물학 기술
SYBR 녹색 I (Cat. No. 697676)을 사용하는 실시간 qPCR 마스터 Mix-SYBR 어드밴티지 qPCR 프리믹스를 이하의 제조업제 추천에 따라 사용하였다.
iScript™ cDNA 합성 키트 (Cat. Nos. 639505 & 639506)를 이하의 제조업제 추천에 따라 사용하였다.
PCR 프라이머: HeLa-GFP
역방향 프라이머: GCGCCGAGGTGAAGTTCGAGG (서열 1)
전방향 프라이머: GCCGTCGCCGATGGGGGTGTT (서열 2)
미토콘드리아 DNA에서 증폭을 수행하는데 사용되는 프라이머쌍, 30 주기
프라이머: 3,968개 염기 쌍
겔 전기영동
2% 겔 (100 ml TAE 완충제 중 2 g 아가로스)에서 수행
조건: 30분 동안 95 볼트
미토콘드리아의 가시화
미토콘드리아를 미토트랙커(MitoTracker) 녹색 FM (인비트로젠) (여기 파장 490nm, 방출 파장 516 nm)으로 표지하였다. 미토트랙커 녹색을 1 mM의 농도에서 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에 용해하고 -20℃에서 보관하였다. 부착 섬유모세포를 매질에서 최종 농도가 500 nM인 1 mM 미토트랙커 녹색의 희석된 용액으로 염색하였다. 세포를 37℃ 인큐베이션하에 30분 동안 두고 2회 세척하였다. 이어서, 실험 작업을 위해 매질 1 mL를 세포에 첨가하였다. 페트리 접시를 형광 램프하에 두었을 때 미토콘드리아만이 현저히 염색되었다.
단백질 및 단백질체학의 세포내 분석을 위한 나노피펫 장치 및 방법
상기 적용에 추가로, 본원의 기기장치는 단일 세포 내에서 특정 단백질 종 및 단백질 상호작용의 검출 및 정량화에 사용할 수 있다. 본 출원은 상기 기재된 바와 같이 개개의 세포로부터의 세포질의 소량 샘플 (15 피코리터 (전체 세포의 ~1%))을 회복하고 전달할 수 있는 팁에서 50 nm 공극을 갖는 나노피펫을 사용한다. 나노피펫은 상기 기재된 바와 같이 단일-세포 해상도를 위해 팁을 위치시키는 스캐닝 피드백 기술과 통합된다. 나노피펫 팁에서 이온성 전류를 모니터링함으로써, 나노피펫의 정확한 위치를 세포 막의 ~200nm 내에서 결정하고 제어할 수 있다. 세포 위에 처음 위치시킨 후, 세포내 내용물을 샘플링하기 원하는 경우, 나노피펫을 제어된 속도, 각도 및 깊이로 세포에 삽입한다. 이어서 나노피펫을 신속하게 (100μm/s) 1μm 낮추고 세포 막에 관통시킨다. 일단 삽입되면, 나노피펫은 소량의 세포 내용물을 주입 또는 흡인하는데 사용할 수 있다.
나노피펫은 주사 이온 전도 현미경검사를 사용하여 개개의 살아있는 세포를 표적화하여, 사용자가 일시적 해상도를 갖는 단일 세포의 분자 생물학을 모니터링하게 한다. 단일 세포에서 유전자 발현의 변화를 분석하기 위해, 단일 세포에서 전사체의 복수 측정을 가능하게 하는 핵산 증폭 및 서열분석을 위한 기재된 고도로 효율적인 방법을 사용할 수 있다 ([Tariq MA, Kim HJ, Jejelowo O, Pourmand N. Whole-transcriptome RNAseq analysis from minute amount of total RNA. Nucleic Acids Res 2011;39:e120])
본 발명의 방법의 중요한 특징은 멀티플렉스된 근접 리간드 검정 (PLA)이다. 이것은 추가로 예를 들어 하기 문헌에도 기재되어 있다:
Figure 112015096989416-pct00001
단백질 분석이 동일 세포에서 복수의 단백질 반응을 측정하기에 충분히 민감한 것이 중요하다. PLA는 올리고뉴클레오티드에 융합된 하이브리드 항체를 사용한다. 항체-항원 결합은 단백질 수준의 고도로 민감한 정량적 측정치를 제공하는 qPCR을 이용하여 검출된다. PLA의 다양한 실시양태는 문헌 [Landegren US 6878515, "Ultrasensitive immunoassays"]에 추가로 기재되어 있다.
예를 들어, 암에 관여하는 수립된 세포 신호전달 경로인 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 이용할 수 있다. 표피 성장 인자 (EGF)가 EGFR에 결합하면 암 세포에서 단백질 키나제 경로의 캐스케이드가 활성화되어 세포 증식에 영향을 미치는 유전자 발현의 변화가 야기된다는 것은 공지되어 있다. 이러한 이론의 증거로서, 멀티플렉스 PLA 검정은 따라서 삼중 음성 유방암 (TNBC) 세포주 MDA-MB-231에서 유전자 발현의 EGF 자극을 매개하는 수많은 단백질 인산화 사건을 측정한다. 이들 세포는 EGFR 신호전달 연구에 광범위하게 사용되고, 본 발명자들은 단일 MDA-MB-231세포에서 유전자 발현을 연구하는데 이미 나노피펫을 사용하기 시작하였다.
멀티플렉스된 EGFR PLA는 본원의 나노피펫 기기장치에 통합되고 PLA의 감도는 동일 세포에서 EGF 자극 이전 및 이후에 키나제 활성화 경로를 측정하게 한다. 시간이 흘러 동일 세포에서 EGF 신호전달을 측정하는데 있어서 나노피펫 단일 세포 PLA 및 온전한 전사체 분석 (WTA)을 추가로 통합할 수 있다. 이는 시간이 흘러 단일 암 세포에서 동시 단백질 번역후 및 게놈 판독을 할 수 있는 신규 나노피펫 기술을 제공한다.
실시예
실시예 1: 나노생검 플랫폼 셋업
115±15 nm의 공극 직경을 갖는 석영 나노피펫 (영상은 제시되지 않음)을 통상적인 레이저-풀러 (P2000, 셔터 인스트루먼트)를 사용하여 제작하고, 10 mM 테트라헥실암모늄 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (THATPBCl)를 함유하는 1-2 디클로르에탄 (DCE)의 용액으로 충전하였다.
단일-세포 생검 플랫폼으로서 SICM을 적합화하기 위해, 나노피펫을 DCE 중 10 mM THATPBCl 용액으로 충전하고, 나노피펫의 배럴에 은 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (AgTBACl)로 코팅된 은 와이어를 장착하였다. DCE-충전된 나노피펫이 수용액에 침지하는 경우, DCE의 소수성으로 인해 액체-액체 계면이 나노공극 루멘(lumen)으로 형성되었다. 이 계면을 가로지르는 전압의 인가는 DCE 표면 장력의 변화를 유도한다. 나노피펫 내의 소수성 액체와 나노피펫의 외부에 있는 전해질 용액 사이의 계면을 가로지르는 전압의 인가는 소수성 액체 표면 장력의 변화를 유도한다. 이러한 전기습윤 효과는, 음성 전압이 인가되었을 때 수용액이 나노피펫 내부로 유동되게 하고, 전압 바이어스가 역전되었을 때는 수용액이 나노피펫에서 흘러나오도록 한다.
충전된 나노피펫을, 세포가 배양되는 성장 매질로 충전된 페트리 접시 내에 침지시켰다. 세포 배양 매질 중에 있는 동안, 나노피펫을 양성 바이어스로 분극화시켜 매질이 배럴 내부로 유입되지 못하도록 하였다. 이 바이어스는 액체-액체 계면을 통해 이온 전류를 생성하며, 이는 피드백 루프로의 입력정보로서 사용된다. 사용자 지정된 소프트웨어는 0.5%의 이온성 전류 강하가 검출될 때까지 나노피펫을 세포 쪽으로 유도한다. 이 시점에서, 소프트웨어는 xyz 제어기에 접근을 중지하고, 세포 막을 찔러 나노피펫 팁을 세포 세포질로 삽입하기 위해 나노피펫을 고속도 (100 μm/s)로 1 μm 신속하게 낮추라고 지시한다.
이 단계에서, 나노피펫 바이어스를 소프트웨어에 의해 5초 동안 -500 mV로 전환시켰으며, 이는 나노피펫 내부로의 세포 세포질의 제어된 유입을 유발한다 (도 3).
이어서, 바이어스를 소프트웨어에 의해, 유입을 중지시키고 흡인된 내용물의 유출의 시작을 막기에 충분한 전압인 200 mV로 전환시켰다. 이어서, 나노피펫을 소프트웨어에 의해 신속하게 상승시키고, 흡인된 내용물을 2분 동안 +1 V를 인가함으로써 (다시 소프트웨어 제어 하에) 5 uL의 RNase-무함유 H2O 액적으로 xyz 제어에 의해 이동시켜 4℃로 유지하였다.
실시예 2: 녹색 형광 단백질 전사체의 생검
본 발명자들은 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 HeLa 세포에 대하여 생검을 수행하고, PCR 방법을 이용하여 GFP 전사체의 선택적 증폭을 표적화함으로써 프로토콜의 성공을 입증하였다 (도 4). 본 발명자들은 iScript™ cDNA 합성 키트 (바이오래드(BioRad))를 사용하여 단일 세포 내부로부터의 흡인된 내용물에 대해 cDNA 합성을 수행하였다. 이는, 상기 생검 내 존재하는 역전사된 모든 RNA를 cDNA로 프로세싱한다. 이어서, 상기 cDNA에 대해 실시간-PCR을 수행하여 GFP 전사체의 존재를 확인하였다. 실시간-PCR 실험에서, 충분한 증폭된 생성물이 축적되어 검출가능한 형광 신호를 얻을 때까지, 형광을 백그라운드 수준으로 유지하였다 (주기 1 내지 18, 도 5). 이것이 일어나는 주기 횟수를 정량화 주기 또는 Cq라고 지칭한다. 2 가지 반응의 Cq 값에서의 차이 X는 출발 물질의 양에 있어서 2X 차이를 반영한다.
실시간 PCR 증폭 플롯은 HeLa-GFP 세포 용해물로부터의 전체 RNA가 cDNA 합성 반응에서 방해되는 양성 대조군에 대해 20의 Cq 값을 나타내고, 유입 RNA가 생검된 내용물인 경우 30의 Cq 값을 나타내고, RNA가 cDNA 합성을 위해 첨가되지 않는 경우인 음성 대조군에 대해 33의 Cq 값을 나타낸다. 양성 대조군과 같이, 본 발명자들은 약 1000개의 HeLa-GFP 세포로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였다. PC 및 생검된 샘플로부터의 Cq 값의 차이는 10이었으며, 이는 유입 물질에서의 1024 (210) 배 차이에 상응한다. 따라서, 본 발명자들은 증폭 플롯이 단일 세포 내부로부터 추출된 RNA의 양과 일치한다고 결론을 내릴 수 있었다. 실시간 PCR 프로토콜은, 이중 가닥 DNA를 삽입할 때 형광을 변환시키는 형광 염료 (Sybr 금)에 의존적이다. 음성 대조군에서의 형광 증가는 프라이머 이량체의 형성에 의해 야기된다. 본 발명자들은 나노생검 프로토콜의 재현성을 부지런히 연구하였다. 개개의 세포는 상이한 유전자 발현 패턴을 갖는 것으로 공지되어 있으며, 이에 따라 본 발명자들은 약 1000개의 GFP HeLa 세포 용해물을 함유하는 용액 중에의 흡인을 수행함으로써 나노생검 프로토콜의 재현성을 시험하였다. qPCR을 통한 흡인후 분석 (도 6)에 의해 나노생검 프로토콜의 높은 재현성이 확인되었다.
생검은 유전학 물질의 전압 제어된 흡인에 의존적이고, 나노피펫 측벽 상의 물리 흡착에 대해서는 비의존적이다. 세포 내부로의 삽입 후 전압이 나노피펫에 인가되지 않은 경우 및 흡인이 벌크 용액에서 수행되는 경우에 증폭은 관찰되지 않았다 (도 7). 이는, 나노생검 기술을 AFM 기재 플랫폼과 구별하는 핵심 요소이다. 위크라마싱헤(Wickramasinghe) 및 오사다(Osada) 그룹 둘 다 AFM 프로브를 사용하여, 물리 흡착 또는 프로브 (14-15) 상에 고정된 상보적 RNA의 혼성화를 기초로 배양물 중의 세포로부터 RNA를 추출하였다. 이와 대조적으로, 나노피펫 프로브의 중공 특성은 유체 흡인을 가능하게 하여, 이의 적용이 RNA 추출로 제한되지 않는다.
실시예 3: 인간 BJ 섬유모세포 미토콘드리아의 생검
나노생검 플랫폼은 단일 세포로부터의 RNA 추출로 제한되지 않으며, 또한 세포 소기관의 샘플링에 사용될 수 있다. 인간 BJ 섬유모세포 (피부 섬유모세포, ATCC CRL 2522)를 미토콘드리아에 대한 형광 표지인 미토트랙커 (인비트로젠) (데이터는 제시되지 않음)를 사용하여 염색하였다. 나노피펫을 미토콘드리아가 풍부한 영역 위에 배치하고, 상기 기재된 동일한 프로토콜을 사용하여 생검을 수행하였다 (데이터는 제시되지 않음). 나노피펫의 팁 내의 형광은 미토콘드리아의 성공적인 흡인을 나타낸다 (데이터는 제시되지 않음). 생검된 미토콘드리아의 PCR 분석을 사용하여 미토콘드리아 DNA의 존재를 확인하였다. 미토콘드리아 DNA를 미토콘드리아 게놈에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 증폭된 미토콘드리아 DNA의 겔 전기영동은 획득한 모든 5개의 샘플이 인간 미토콘드리아 DNA에 대해 정확한 길이의 밴드를 나타내는 것을 보여준다 (도 8).
실시예 4: 나노피펫의 최소 침윤성
Ca2+의 세포질 농도의 조정은 외래 물체 (11, 30-31)의 삽입에 의해 유발되는 기계적 스트레스의 지표인 것으로 여겨진다. 단일-세포 생검 플랫폼의 낮은 침윤성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 나노생검 이전, 동안 및 이후에 세포내 [Ca2+]를 측정하였다 (데이터는 제시되지 않음). 인간 BJ 섬유모세포를 Fluo4 AM으로 표지하였다 (데이터는 제시되지 않음). 광학 마이크로그래프에 의해, 나노생검 동안에 간신히 검출가능한 Ca2+ 유입을 야기하는 최소로 침습적인 절차를 확인하였다. 세포를 흡인후 5초 이내에 완전히 회수하여 흡인전 수준과 매칭되는 [Ca2+]에 도달하였다.
실시예 5: 내인성 mRNA 발현 분석을 위한 나노생검
나노피펫에서의 전기습윤
P-2000 레이저 풀러 (미국 캘리포니아주 노바토 소재의 셔터 인스트루먼트)를 사용하여 석영 캐필러리 (미국 캘리포니아주 노바토 소재의 셔터 인스트루먼트)로부터 나노피펫을 제작하였다. 평균 직경 = (106±16) nm. 석영 나노피펫을 10 mM 테트라헥실암모늄 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (THATPBCl)를 함유하는 1-2 디클로르에탄 (DCE)의 용액으로 충전하였다. 이어서, 은 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (AgTBACl)로 코팅된 은 와이어를 나노피펫의 배럴 내에 삽입하고, Ag/AgCl 와이어를 표준/상대 전극으로서 작용하는 배스 용액 중에 침지시켰다.
SICM 셋업
주사 이온 전도 현미경 (SICM)은 나노피펫 바이어스 및 전류 측정을 위한 악소패치 200B 저-노이즈 증폭기 (미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘라 디바이시즈), X, Y 및 Z 방향의 개략적인 제어를 위한 MP-285 마이크로조작기 (미국 캘리포니아주 노바토 소재의 셔터 인스트루먼트), X, Y 및 Z 방향의 미세한 제어를 위한 나노-큐브 피에조 작동기 (미국 캘리포니아주 어바인 소재의 피직 인스트루먼트), 및 시스템의 하드웨어 제어를 위한 PCIe-7851R 필드 프로그램 작동가능한 게이트 어레이 (FPGA) (네셔널 인스트루먼트)로 이루어진다. 시스템은 LabVIEW8로 기록된 사용자 지정 코드화된 소프트웨어를 사용하여 작동시킨다.
세포 배양물
BJ 인간 섬유모세포를 스템전트로부터 입수하여, 페놀-레드를 함유하지 않는 보충물 (미국 조지아주 알파레타 소재의 론자)을 갖는 간질 세포 기본 배지 (SCBM) (미국 조지아주 알파레타 소재의 론자) 중에서 배양하였다. 녹색 형광 단백질을 발현하는 HeLa 세포 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 셀 바이오랩스)를 공급업체로부터의 지침에 따라 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM 필수 아미노산, 2 mM L-글루타민 및 1% 펜-스트렙으로 보충된 70% DMEM 매질 중에서 배양하였다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2에서 배양하였다. 세포를 1% 젤라틴으로 코팅된 비-그리드 및 그리드 플레이트 (이비디 μ-디쉬 35 mm, 하이그리드-500 비코팅, 멸균) 상에 플레이팅하였다. 세포를 디쉬 당 약 5×104개 세포로 플레이팅하였다.
cDNA 합성 및 qPCR
제조업체의 권고에 따라 iScript™ cDNA 합성 키트 (미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오래드)를 사용하여 세포로부터 나노생검된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 정량적 PCR (qPCR)을 사용하여, 제조업체의 권고에 따라 클론테크 어드밴티지(Clontech's Advantage) qPCR 프리믹스 SYBR 그린 I 마스터 믹스 (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 클론테크)를 사용함으로써 나노생검 프로토콜의 성공을 확인하였다. PCR 프라이머: HeLa-GFP, 역방향 프라이머:
Figure 112015096989416-pct00002
(서열 1), 전방향 프라이머:
Figure 112015096989416-pct00003
(서열 2)를 사용하여 흡인된 미토콘드리아 DNA를 증폭시켜 겔 전기영동에 의해 가시화되는 3968 염기쌍을 증폭시켰다.
cDNA 합성 및 RNA 서열분석
흡인된 RNA 샘플을 오베이션(Ovation)® RNA-Seq 시스템 (미국 캘리포니아주 산카를로스 소재의 누진 테크놀로지스(NuGEN Technologies))을 사용하여 cDNA로 프로세싱하였다. cDNA를 개개의 흡인물에 대해 제조하여 라이브러리를 제조하였다. 단일-세포 cDNA의 품질 및 수량은 애질런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer) 2100 DNA 고감도 칩 (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 애질런트)을 사용하여 평가하였다.
페어드-엔드(paired-end) 온전한 전사체 라이브러리 제조를 위해, 각각의 샘플의 cDNA 약 0.5 내지 1.0 μg을 제조업체의 권고된 프로토콜에 따라 코바리스(Covaris)-S2 초음파발생장치 (미국 매사추세츠주 우번 소재의 코바리스)를 사용하여 200 내지 300 bp 범위의 크기로 전단하였다. 절단된 cDNA 샘플은 TruSeq v1 멀티플렉스 샘플 제조 키트 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나(Illumina))를 사용한 RNA-Seq 라이브러리의 제조를 위해 사용하였다. 간략하게 설명하면, cDNA 단편을 말단 복구하고, dA-테일링하고, 제조업체의 지침에 따라 멀티플렉스 연결기에 라이게이션시켰다. 라이게이션 후, 150 bp보다 작은 DNA 단편을 암퓨어(AmPure) XP 비드 (미국 매사추세츠주 댄버스 소재의 벡만 콜터 제노믹스(Beckman Coulter Genomics))를 사용하여 제거하였다. 폴리머라제 연쇄 반응 (14 주기)을 사용하여 정제된 연결기 라이게이션된 생성물을 농축시켰다. 최종 증폭된 라이브러리를 2.0% 아가로스 겔에서 분할하고, 칼리퍼(Caliper) XT 시스템 (미국 매사추세츠주 소재의 월섬 소재의 퍼킨엘머(PerkinElmer))을 사용하여 350 내지 380 bp의 범위로 크기-선별하였다. 최종 RNA-Seq 라이브러리를 애질런트 바이오애널라이저 2100을 사용하여 정량하고, 서열분석을 위해 동일한 농도로 함께 풀링하였다. 풀링된 멀티플렉스 라이브러리를 서열분석하고, 생성된 2× 150 bp 페어드-엔드를 MiSeq (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나) 상에서 판독하였다.
미토콘드리아 DNA 증폭 및 서열분석
흡인된 미토콘드리아 DNA를 하기 프라이머 쌍을 사용하여 긴 범위의 PCR로 증폭시켜서 약 8K bp 단편을 생성하였다: 전방향
Figure 112015096989416-pct00004
(서열 3) 및 역방향
Figure 112015096989416-pct00005
(서열 4). 흡인된 미토콘드리아 게놈을 길고 정밀한 폴리머라제 연쇄 반응 (LA-PCR) LA PCR 키트 버전 2.1 (타카라 바이오(Takara Bio))을 사용하여 증폭시켰다. 미토콘드리아 게놈 증폭을, 흡인된 주형 DNA, 10X 에피센터 부스팅 2.5 μL, 10X LA PCR 완충제 II (Mg2+ 추가) 2.5 μL, dNTP (2.5 mM) 4.0 μL, 각각의 프라이머 (10 μM) 1.25 μL, LA Taq DNA 폴리머라제 0.125 μL, 및 멸균 증류수 11.4 μL를 함유하는 반응 혼합물 25 μL 중에서 수행하였다. 유전자 증폭기의 조건은 2분 동안 95℃, 이후 각각이 15초 동안 94℃에 이어서 8분 동안 68℃로 이루어지는 30 주기, 및 13분 동안 68℃로의 최종 신장이었다. 미토콘드리아 앰플리콘을 코바리스 S2 시스템에 의해 전단하여 300 내지 400 bp 단편이 생성되었으며, 이를 로봇 상의 자동화된 일루미나 멀티플렉스 페어드-엔드 라이브러리의 제조에 적용하였다. 고유 인덱스 서열을 각각의 미토콘드리아 샘플에 대해 사용하고, 단일 일루미나 HiSeq 2000 레인에서 서열분석하였다.
바이오인포매틱스 방법
미토콘드리아 실험으로부터의 단편 리드(read)를 예비프로세싱하여 리드의 3' 말단으로부터 서열분석 연결기를 제거하였다. 미토콘드리아 리드를 비-스플라이싱된 정렬기를 사용하여 수정된 캠브릿지(Cambridge) 미토콘드리아 참조 서열로 정렬하였다. 5% 내지 99%의 이종세포질 변이체가 보고되었다. RNA-서열분석 실험으로부터의 단편 리드를 예비프로세싱하여 리드의 3' 말단으로부터 서열분석 연결기를 제거하였다. 바이어스를 제거하기 위해 RNA-seq 리드의 5' 말단으로부터의 10개 염기를 cDNA의 제2 가닥 합성 동안에 도입하였다. 스플라이싱된 정렬 도구를 사용하여 RNA-seq 리드를 hg19 UCSC 인간 참조 게놈33 및 UCSC 공지된 유전자로 정렬하였다. 유전자는 적어도 하나의 리드가 주석이 달린 전사체에 유일하게 맵핑되는 경우에 발현된 것으로 간주한다. 유전자설정 농축도 분석을 검출된 유전자에 대해 수행하여, 과다표현된 유전자 온톨로지를 보고하였다. 상세한 바이오인포매틱스 방법은 지원 정보의 방법론 부분에서 이용가능하다.
나노생검 플랫폼을 사용하여 단일의 살아있는 세포로부터 내인성 mRNA 발현을 분석할 수 있다. 성숙 mRNA의 cDNA를 생성하고, 서열분석하고, 리드를 인간 참조 게놈에 맵핑하였다. 세포질 폴리-A 결합 단백질 (PABPC1)에서의 차별적인 3' 비번역 영역 (UTR) 사용이 관찰되었으며, 여기서 2개의 흡인물이 비-정규 이소형의 우세한 발현을 나타내는 반면, 제3 흡인물은 정규 이소형의 발현을 나타낸다 (도 9A). 본 발명자들은 또한 커버리지가 단지 3' UTR보다는 전체 전사체에 걸쳐 획득되는 경우를 관찰하였다. 메틸크로토노일-CoA 카르복실라제 2 (MCCC2)의 전체 길이에 걸친 리드 커버리지의 예가 도 9B에 제시되어 있다. 나노생검을 사용하여 내인성 RNA를 분석할 수 있다는 또 다른 입증에 따라, 본 발명자들은 가장 과다표현된 유전자 온톨로지를 강화하였으며, 2개의 흡인물이 번역과 관련된 조직을 우세하게 발현시키는 반면, 1개는 대사 및 형태형성과 관련된 프로세싱용으로 강화되었음을 발견하였다.
실시예 6: 나노생검된 미토콘드리아 게놈의 서열분석
실시예 5에서와 같이 미토콘드리아의 생검 후, 차세대 서열분석을 수행하여 생검된 미토콘드리아의 게놈을 서열분석하였다. 미토콘드리아 DNA를 미토콘드리아 게놈에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 이러한 접근법은 신규이며, 보다 풍부한 핵 DNA로부터 미토콘드리아 핵산을 분리할 필요없이 미토콘드리아 게놈의 선택적인 서열분석을 가능하게 하기 때문에 중요하다. 단일 세포로부터의 2개의 미토콘드리아 흡인물로부터의 서열분석 결과, 및 세포 집단으로부터 추출된 DNA는, 일부 이종세포질 변이체의 빈도가 세포내 수준에서 보다 보존된다는 것을 나타낸다 (도 10). 예를 들어, 2개의 이종세포질 변이체 (14713 A->T 및 16278 C->T)는 세포내 흡인물 및 전체 (풀링된) 미토콘드리아 집단으로부터의 샘플 둘 다에서 발견되었다. 14713 A->T 변이체의 빈도는 모든 샘플에 대해 83%, 87% 및 79% 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 16278 C->T 변이체는 풀링된 미토콘드리아 대 선택된 미토콘드리아 각각에 대해 62%, 98% 및 38% 빈도로 실질적인 빈도의 편차를 보였다. 평균 이종세포질 빈도는 집단-기재의 서열분석에서 관찰가능한 반면, 세포내 서열분석만이 세포 내 변이체의 이질성을 나타내었다. 세포내 흡인물 중에서 이종세포질 빈도의 차이 이외에도, 본 발명자들은 또한 서열분석 리드의 > 5%인 수많은 변이체를 검출할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 나노피펫과 신규 미토콘드리아 유도된 게놈 기술의 조합에 의해, 단일 세포의 미토콘드리아 게놈의 작은 하위집단이 서열분석될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5 및 6에서, 나노생검은 세포내 물질의 전압-제어된 흡인에 의존적이고, 나노피펫 측벽에의 흡착에는 비의존적이다. 음성 전압이 세포 내부로의 삽입 후 나노피펫에 인가되지 않는 경우 및 흡인이 벌크 용액에서 수행되는 경우 증폭은 관찰되지 않는다. 이는, 나노생검 기술을 AFM 기재 플랫폼과 구별하는 하나의 핵심 요소이다.
실시예 7: MDA-MB-231 세포에서 EGFR 신호전달을 측정하기 위한 나노피펫-PLA 기재 기기
EGFR 활성화는 MAPK 및 JNK 경로의 인산화 및 자극, 다중 전사 인자 (TF) 및 궁극적으로 유전자 전사 및 세포 증식의 변화를 야기한다. 기저 조건 하에, 이들 단백질 키나제 경로에서 많은 효소들은 비활성이다. 그러나, EGF 자극은 그의 인산화 상태를 전환시켜 이들 단백질을 활성화시킨다. MAPK 및 JMNK EGFR 신호전달 경로의 상이한 성분의 인산화를 측정하기 위하여 멀티플렉스 근접 리간드 검정 (PLA)를 사용하였다. 이는, MAPK ERK1/2의 인산화를 촉진시키고 이어서 TF AP- 및 Fos-Jun을 인산화시켜 세포 성장에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 MKK1의 인산화를 포함한다.
이러한 구체적인 예로는, 세포 증식을 조절하는 STAT의 인산화를 자극하는 JAK의 인산화된 형태에 대해 PLA가 사용된다. 다양한 다른 인산화된 표적 매개 EGF 신호전달을 연구할 수 있으며, 시판되는 1차 및 2차 항체를 편리하게 획득하여 PLA에서 유용한 항체-올리고뉴클레오티드 하이브리드를 생성할 수 있다. PLA는 각각의 정제된 인산화 표적의 검출과 유사하게 발달되고 용액 중에서 검출되는 단백질의 양에 대해 최적화된다.
세포로부터의 세포질의 양을 다르게 한 샘플 (예를 들어, EGF로 처리된 개개의 MDA-MB-231 세포 또는 임상적 종양 세포)에 나노피펫을 사용할 수 있고, 각각의 PLA에 필요한 세포 샘플의 최저량을 평가할 수 있다. 또한, 멀티플렉스 PLA를 사용하여, 암 세포에서 EGF 처리 전후에 동일 세포에서의 EGF 신호전달 경로의 변화를 측정할 수 있다. 나노피펫 셋업을 사용하여, 기저 조건 하에 및 EGF 자극 후 PLA 및 WTA를 위해 상기 세포로부터 개별적 샘플을 단리한다. WTA는 EGF에 의해 활성화된 유전자 클러스터를 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 특이적 유전자 발현의 변화는 qPCR에 의해 정량화될 것이다. 상기 방법은 또한 개개의 인산화 사건 및 유전자 발현 변화를 특이적으로 차단하는 MAPK 또는 JNK의 선택적 억제제를 시험하는데 사용하여, 암 세포에서의 특이적 신호전달 경로를 선택적 유전자의 발현 조절에 연결시키는 특유의 방법을 제공할 수 있다.
이제 도 11을 참조하면, 기계적 플랫폼(110)을 사용하여 플랫폼(110) 상에 탑재된, 나노피펫 팁(115)을 세포(116) 내로 삽입하기 위한 현미경적 유도 시스템 및 xyz 제어기를 추가로 함유하는 나노피펫(112)을 지지, 유도 및 조작한다. 제시된 바와 같이, 세포(116)는 진핵이고, 팁(114)은 세포질 구획 내로 삽입된다. 다음으로, 화살표(118)로 제시된 바와 같이, 나노피펫 및 세포(116)로부터 흡인된 내용물을 화살표(120)로 제시된 바와 같이 용기(112)로 이동시킨다. 여기서, 단백질 또는 관심 단백질이 항체(124)에 결합되도록 하고, 이는 상기 단백질 상의 개별적 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 하나의 에피토프는 인산화된 아미노산으로 나타내어질 수 있고, 단백질의 다른 아미노산이다. 12로서 제시된 바와 같이, 단백질이 모든 항체에 결합하는 경우, 올리고 태그는 서로 접촉하여 서로끼리 라이게이션된다. 이어서, 프라이머(126)를 사용하여 올리고를 브릿지할 수 있고, 라이게이션된 올리고를 증폭시킨다. 128에서 제시된 바와 같이, 증폭된 다수의 단백질 분자를 검출하는 실시간 또는 정량적 PCR 프로세싱에 의해 증폭을 수행할 수 있다.
도 11에 제시된 바와 같이, 세포(X)를 탑재 및 현미경, 예를 들어 SICM (주사 이온 전도성 현미경)에 의해 유도되는 나노피펫에 의해 관통시켰다. 상기 기재된 바와 같이, 약 15 피코리터의 세포 내용물 (약 1%)을, 본 발명자들이 전체 RNA 중 약 1 pg에 상응하는 나노피펫을 사용할 때마다 흡인시켰다. 샘플을 RNA 증폭 (약 1000배)에 적용시키고, cDNA 합성 및 서열분석에 대해 사용하였다. 샘플은 추가로 또는 대안적으로, 단일 세포 분자 분석을 위한 나노피펫 기기가 상기 개개의 세포에서 게놈 분석 이외에 단백질체학 분석을 수행할 수 있도록 하는 것이다. PLA는, 개개의 단백질 표적을 선택적으로 검출하기 위해 항체를 사용하는 증폭 검정이다. 이는 PCR을 혼입하여 단백질을 정량화한다. 이는 PCR에서 단백질 항체로 사용되는 올리고뉴클레오티드를 주입함으로써 달성된다.
다시 도 11을 참조하면, 본 발명의 방법의 PLA 부분의 개요가 제시되어 있다. 동일한 단백질의 상이한 에피토프를 표적화하는 2개의 항체를 프라이머 또는 차단된 올리고뉴클레오티드에 커플링시킨다. 단백질에의 항체의 결합은 라이게이션 및 증폭을 가능케 하도록 매우 근접하여 각각의 올리고뉴클레오티드에서 일어난다. 이어서, 증폭된 생성물을 실시간 PCR에 의해 검출할 수 있다. PLA를 사용하여 PDGFR 및 EGFR을 비롯한 수많은 성장 인자 수용체를 측정할 수 있다.
PLA 절차는 추가로 EGFR 활성화의 중요한 제1 단계인 수용체 이량체화를 연구하기 위해 사용되는 EGFR에 대한 것이다. 광범위한 연구는 PLA가 시판되는 ELISA보다 1000배 넘게 더 민감하며, PCR로 인해 샘플에서 비교적 적은 표적 단백질을 검출할 수 있음을 제시한다. 계내 PLA는 고정된 단일 세포에서 인산화된 PDGFR β를 검출하기에 충분히 민감하며, 키나제 활성의 약물 유도 억제를 측정할 수 있다.
제1 접근법에서, 하나는 인산화된 표적에 대해 선택적이고, 다른 하나는 동일 단백질에 대해 보다 일반적인 에피토프를 갖는 2개의 상이한 항체를 사용한다. 각각의 항체 세트에 대해, 프라이머 올리고뉴클레오티드를 하나의 항체에 커플링시키고, 차단된 올리고뉴클레오티드는 다른 항체에 커플링될 것이다. 2개의 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 연결기 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 달성될 것이다. qPCR을 사용하여 각각의 PLA에서 증폭된 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있다.
제2 접근법은, PLA에서 사용되는 올리고뉴클레오티드가 2차 항체에 커플링되는 최근 기재된 기술 (문헌 [Weibrecht I, Grundberg I, Nilsson M, Soderberg O (2011) Simultaneous Visualization of Both Signaling Cascade Activity and End-Point Gene Expression in Single Cells. PLoS ONE 6(5): e20148. doi:10.1371/journal.pone.0020148])을 기초로 한다. 따라서, 동일 단백질의 상이한 에피토프를 표적화하는 2개의 항체를 제1 접근법과 같이 사용하나, 이들은 상이한 종이다. 상보적 종으로부터의 2차 항체는 프라이머 또는 차단된 올리고뉴클레오티드에 커플링된다. 이러한 접근법의 잠재적인 이점은, 올리고뉴클레오티드를 멀티플렉스 검정에서 사용되는 각각의 항체에 대해 합성해야만 하기보다는, 올리고뉴클레오티드에 커플링되는데 필요한 2차 항체에 대해서만 합성하고, 이러한 2차 항체는 각각의 PLA에 대해 공동으로 사용될 수 있다는 것이다. 제1 목적으로의 초기 연구는 어느 접근법이 검정 발달에 대해 가장 최적인지를 결정할 것이다.
멀티플렉스 검정이 사용될 수 있는 또 다른 실시양태에서, 세포 균질액 (흡인물)의 공동의 샘플에서 인단백질을 측정하기 위한 각 검정의 민감성을 결정한다. 나노피펫을 사용하여 연구될 단일 세포에 대해 증가되는 세포질의 양을 흡인하고, 모든 PLA가 그들의 표적 단백질을 정량화할 수 있는 세포 샘플의 최소량을 결정한다. 나노피펫 팁에 인가되는 전압을 변경함으로써 개개의 세포로부터의 샘플링의 양을 다르게 할 수 있다. 최적으로, 각각의 인단백질을 약 15 피코리터의 세포 내용물 (전체 세포의 약 1%)로 정량화할 수 있을 것인데, 이는, 본 발명자들이 상기 암 세포에서 WTA를 측정할 수 있고, 복수 샘플링된 상기 양의 세포질이 세포에 명백한 손상을 일으키지 않거나 또는 생존율을 악화시키지 않으면서 흡인될 수 있는 세포 샘플의 양이기 때문이다.
또한, 상기 방법을 사용하여, 세포 경로 활성자로 자극될 전후의 세포의 상태를 결정한다. 예를 들어, EGF (1 uM)로 처리하기 전 및 처리한 지 1시간 후에 개개의 MDA-MB-231 세포를 샘플링하는 것, 및 PLA가 EGFR, MAPK 및 JAK 경로 및 AP-1/Jun 및 STAT TF의 인산화의 예기되는 증가를 확인할지의 유무를 결정하는 것이다. 중요하게는, EGF는 MAPK-AP-1/Jun 및 JAK-STAT를 통해 다른 신호전달을 자극할 수 있다. 하나의 경로 차단이 다른 경로를 통한 EGF 신호전달에 영향을 끼치지 않도록 각각의 이들 경로의 선택적 억제제가 존재하여 인산화의 특이성을 확립한다.
인산화된 EGFR, MKK1, ERK1/2, JAK, AP1/Jun 및 STAT를 측정하기 위한 PLA를 개발시키기 위해, 미국 매사추세츠주 비벌리 소재의 셀 시그널링 (CS) 셀 시그널링 테크놀로지, 인크. (CST) 및 미국 텍사스주 달라스 소재의 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (SC)로부터 시판되는 항체를 사용할 수 있다. 각각의 표적에 대해, 하나는 인산화 부위를 선택적으로 표적화하고, 다른 항체는 동일 단백질의 상이한 에피토프를 표적화하는 2개의 항체가 사용되어진다. 항-EGFR 항체에 대해, 아미노산 1156-1186을 표적화하는 토끼 폴리클로날 06-847 (CS) 및 티로신 1197을 표적화하는 마우스 모노클로날 05-483 (CS)을 사용할 수 있다. MKK1에 대해, C-말단을 표적화하는 모노클로날 04-376 (CS) 및 pSer218/222를 표적화하는 항-포스포 폴리클로날 444995를 사용할 수 있다. ERK1/2에 대해, 잔기 325-345를 표적화하는 마우스 모노클로날 05-1152 (CS) 및 pThr202/Tyr204를 표적화하는 항-포스포 토끼 폴리클로날을 사용할 수 있다. JAK1에 대해, 잔기 785-815를 표적화하는 마우스 모노클로날 항체 A-9 (SC-1677) 및 토끼 항-포스포 항체 Tyr 1022 (SC-101716)를 사용할 수 있다. 인산화된 TF를 검출하기 위해, 항-c-Jun/AP-1 마우스 모노클로날 항체 OP55 (CS) 및 c-Jun의 인산화된 세린65를 표적화하는 토끼 항-포스포 모노클로날 Y172 (CS)를 사용할 수 있다. STAT1에 대해, 토끼 폴리클로날 SC-346 및 티로신701을 표적화하는 마우스 모노클로날 항-포스포-STAT1 (SC-8394)을 사용할 수 있다.
항체-올리고뉴클레오티드의 합성은 상기 인용된 바와 같은 이전의 절차를 사용할 수 있다. 항체는 30배를 초과하는 SMPB와 반응시킨다 (피어스(Pierce)). 과량의 SMPB를 G-50 컬럼 상에서 제거한다. 프라이머 올리고뉴클레오티드
Figure 112015096989416-pct00006
(서열 5) 및 차단된 올리고뉴클레오티드
Figure 112015096989416-pct00007
(서열 6)를 30분 동안 10 mM DTT와 반응시키고, DTT를 제거한 다음, 프라이머 올리고뉴클레오티드를 활성화된 항체들 중 하나에 첨가되도록 하고, 차단된 올리고뉴클레오티드는 각 세트의 다른 항체에 첨가되도록 한다. 항체-올리고뉴클레오티드를 HPLC에 의해 정제한다. 2차 항체-올리고뉴클레오티드 PLA 프로브를 시험하는 연구를 위해, 당나귀 항-토끼 IgG (711-005-152, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)) 및 당나귀 항-마우스 IgG (715-005-150, 잭슨 이뮤노리서치)를 이용하고, 항체에의 올리고뉴클레오티드의 접합을 기재된 것과 유사한 방식으로 행할 수 있다.
정제된 표적 (예를 들어, 인산화된 EGFR)은 항체 (SC 또는 CS)의 동일 공급원으로부터 입수할 수 있고, 이를 사용하여 PLA를 개발할 수 있다. 1시간 동안 PLA 프로브와 예비인큐베이션시킨 다음 프로브 라이게이션을 함유하는 혼합물과 반응시킨 단백질 표적은 연결기 올리고뉴클레오티드
Figure 112015096989416-pct00008
(서열 7) (유로젠텍(Eurogentec)) 및
Figure 112015096989416-pct00009
(서열 8)이다. 실시간 PCR에 대해, 80 μM ATP, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM 프라이머, 5' 뉴클레아제 검정용 200 nM 프로브, 및 1.5 유닛의 백금 TaqDNA 폴리머라제를 함유하는 혼합물을 첨가하였다. 반응물을, 2분 동안 95℃에 이어서 15초 동안 95℃ 및 60초 동안 60℃를 45회 반복하는 온도 사이클링 동안 실시간 PCR 기기로 이동시켰다.
2차 항체 PLA 프로브를 사용하는 PLA에 대해, 단백질 표적을 먼저 상기 기재된 1차 항체 (올리고뉴클레오티드에 커플링되지 않음)와 함께 인큐베이션시켰다. 미결합 항체를 세척에 의해 제거하고, 2차 항체 PLA 프로브 (항-토끼 및 항-마우스 둘 다)를 각각의 1차 항체 결합된 표적에 첨가하였다. 이어서, PLA는 기재된 것과 유사한 절차에 따를 것이다.
각각의 PLA는 사용되는 PLA 프로브의 양, 반응 시간, 세척 절차, 및 라이게이션 및 혼성화 반응에 대해 최적화될 수 있다. 또한, qPCR에 대한 최적의 단백질 농도를 확인하기 위해, 표적 단백질의 양을 다르게 할 수 있다. 유사한 연구는, PLA에 영향을 미칠 수 있는 임의의 세포 인자를 설명하기 위해 MDA-MB-231 세포 또는 인산화된 EGF 조절된 표적의 공급원으로서의 EGF로 자극된 시험 세포의 균질물을 사용한다. 특이성은 각각의 PLA를 항체 펩티드를 사용하여 차단함으로써 확립될 수 있다.
EGF로 처리된 개개의 세포로부터 세포질의 양을 다르게 한 샘플 (예를 들어, MDA-MB-231)에 나노피펫을 사용할 수 있고, 각각의 PLA에 필요한 세포 샘플의 최저량을 평가하여 각각의 표적 단백질의 인산화를 정량화할 수 있다. 세포 흡인물은 WTA에서 사용되는 양인 약 15 피코리터만큼 낮은 양에서부터 전체 세포질 함량까지 변동될 것이다. 각각의 PLA에 대해, 세포 내용물의 용량 반응성 대 qPCR에 의한 단백질의 정량화를 전개시킬 수 있다. 분석은 PLA 판독값의 가변성을 결정하기 위해 3 내지 4개의 상이한 세포에 대해 반복해야 한다.
시험 (예를 들어, MDA-MB-231) 세포에서 EGF 유도된 단백질 인산화를 정량화하기 위한 멀티플렉스 PLA
상기 개발된 PLA를 멀티플렉스할 수 있고, 최소량의 세포 샘플에 대해 관심 단백질 마커를 시험하여 세포에서 모든 단백질 표적의 인산화 (또는 다른 변형)을 측정할 수 있다. 나노피펫은 세포 샘플의 증가하는 양을 흡인시키는데 사용된다. 이어서, 각각의 샘플을 동등하게 구분하고, PLA에 첨가하여 각각의 표적 단백질을 측정하였다. 목적은, 세포에서 각각의 표적 단백질의 최적의 판독값을 제공하는데 필요한 세포 흡인의 최소량을 결정하기 위한 것이다. 이어서, 표준 검정에서 세포 흡인의 상기 양을 사용하여 EGF 신호전달 경로의 각각의 성분을 측정하였다. 이어서, 멀티플렉스 PLA를 사용하여, EGF 처리 전후에 암 세포에서의 EGF 신호전달 경로의 변화를 측정할 수 있다. 이를 위해, 나노피펫을 사용하여 개개의 암 세포로 카르복시형광물질을 주입할 것이다. 이어서, 표지된 세포를 EGF 처리 1시간 전 및 EGF (1 μM) 첨가 1시간 후에 샘플링할 것이다. 기저 조건 하에서 각각의 표적 단백질의 충분한 인산화가 존재하기 때문에, PLA는 표적 단백질의 인산화의 주요 증가를 검출할 것이다. 또한, 미처치 암 세포로부터 다수의 샘플을 흡인시킬 수 있어 세포 흡인 자체가 표적 단백질의 인산화를 유도하는지의 여부를 결정할 수 있다. 이를 유도하는 경우, EGF 자극의 효과를 결정하기 위한 기준 측정치로서 상기 자극을 이용할 수 있다.
EGF 신호전달을 측정하기 위한 PLA의 특이성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 EGF에 의해 조절된 일부 키나제의 억제제가 단일 MDA-MB-231 세포에서 하류 키나제 및 TF 인산화를 차단하는지의 여부를 결정할 것이다. 먼저, EGFR 키나제 억제제 게피티닙 (1 μM) (카이맨 유로페(Cayman Europe))이 EGFR, MKK1, ERK1/2, JAK, AP1/Jun 및 STAT의 인산화를 차단하는지의 여부를 결정할 수 있다. 또한, MKK1 억제제 PD0325901 (CS)이 EGFR, JAK 및 STAT 인산화에 영향을 끼치지 않으면서 MKK1, ERK1/2 및 AP1/Jun 인산화를 선택적으로 차단하는지를 시험할 수 있다. 이 화합물은 MKK1 활성 및 ERK1/2의 후속 인산화를 차단하지만, ERK1/2와 직접적으로 상호작용하지 않는다. 비특성화된 종양 세포에의 본 발명의 방법 적용의 추가의 측면에 따르면, ERK1/2 선택적 억제제 FR180204가 ERK1/2 및 AP1-Jun 인산화를 차단하지만, EGF 신호전달의 다른 성분은 차단하지 않는지를 시험할 수 있다. 추가로, JAK 억제제 INCB018424 (케미텍(Chemitek))가 JAK 및 STAT의 EGF 유도된 인산화를 차단하지만, MAPK 경로의 EGF 유도된 인산화는 차단하지 않는지를 시험할 수 있다.
EGFR, MKK1, ERK1/2, JAK, AP1/Jun 및 STAT 인산화를 검출하기 위한 PLA는 이들 단백질에 대해 시판되는 ELISA보다 약 1000배 더 높은 민감성을 가질 것이며, 추가로, 멀티플렉스 PLA 포맷은 이들 인단백질을 단일 세포로부터 15 내지 150 피코리터의 단일 흡인으로 검출할 수 있을 것으로 예상되고, 또한, 단일 종양 세포, 특히 삼중 음성 세포, 예를 들어 모델 세포 MDA-MB-231의 EGF 자극은 표적 단백질의 인산화에서 미처리 대조군에 비해 유의한 (P < 0.05) 증가를 유도할 것으로 예상된다.
결론
상기 특정 설명은 본 발명을 예시하고 설명하는 것으로 의도되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 안되며, 이는 첨부하는 특허청구범위의 내용 그대로의 동등한 범위로 정의된다. 본 명세서에서 언급된 임의의 특허 또는 간행물은, 명확하게 제시되지 않을 수 있지만 통상의 기술자에게 이해되는 본 발명의 특정 측면을 수행하는 데 유용한 방법 및 물질의 세부 사항을 전달하기 위한 것이다. 이러한 특허 또는 간행물은 언급된 방법 또는 물질을 기술하고 가능하게 하는 목적을 위해 필요하다면, 이들 각각이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되거나 본원에 포함된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
참고문헌
Figure 112015096989416-pct00010
Figure 112015096989416-pct00011
SEQUENCE LISTING <110> Actis, Paolo Maalouf, Michelle M Pourmand, Nader <120> NANOPIPETTE DEVICE AND METHOD FOR SUBCELLULAR ANALYSIS <130> 482.35-1PCT <150> US 61/781,841 <151> 2013-03-14 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <400> 1 gcgccgaggt gaagttcgag g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <400> 2 gccgtcgccg atgggggtgt t 21 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <400> 3 tcatttttat tgccacaact aacctcctcg gactc 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <400> 4 cgtgatgtct tatttaaggg gaacgtgtgg gctat 35 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <400> 5 aaaaaaaaaa tatgacagaa ctagacactc tt 32 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (33)..(35) <223> n = uridine <400> 6 aaaaaaaaaa gacgctaata gttaagacgc ttnnn 35 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <400> 7 ctattagcgt ccagtgaatg cgagtccgtc taagagagta gtacagcagc cgtcaagagt 60 gtcta 65 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetically prepared oligonucleotide sequence <400> 8 gttctgtcat atttaagcgt cttaa 25

Claims (26)

  1. (a) xyz 제어기 상에 탑재되고, 나노피펫 내부 내 제1의 소수성 전해질 용액과 함께 사용되는 제1 전극에 부착된 나노피펫,
    (b) 세포의 외부와 접촉하는 제2의 상이한 전해질 용액과 접촉하도록 배치된, 나노피펫 외부의 제2 전극,
    (c) 전극 사이의 이온성 전류를 검출하는 전류 검출 회로, 및 정해진 시점에 제1 전극과 제2 전극 사이의 전압을 역전시킴으로써 나노피펫 내부 및 외부로의 액체 유동을 제어하도록 구축된 전압 제어 회로, 및
    (d) 하기를 포함하는 단계에 따라 하기 장치를 작동시키는 프로그래밍된 지침 세트:
    (ⅰ) 제1 바이어스 전압을 인가하여 제1 전해질을 나노피펫에 보유시키는 단계,
    (ⅱ) 제2의 상이한 바이어스 전압을 인가하여 세포 내의 표적 물질이 나노피펫으로 유입되도록 하는 단계, 및
    (ⅲ) 제3의 상이한 바이어스 전압을 인가하여 나노피펫으로부터 유체가 유출되도록 하는 단계,
    를 포함하는, 단일 세포로부터 표적 세포내 내용물을 추출하는 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 xyz 제어기가, 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 방향으로 실행하고 상기 나노피펫의 움직임을 세포를 향하거나 세포로부터 멀어지는 z 방향으로 실행하도록 상기 나노피펫에 부착되고,
    상기 xyz 제어기가 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어력을 추가로 갖고,
    상기 xyz 제어기가 나노피펫 팁을 세포 내에 위치시켰을 때 상기 전압 제어 회로가 전압을 역전시키는 것인
    장치.
  3. 제2항에 있어서, 나노피펫의 z 방향이 제1 전극과 제2 전극 사이의 이온성 전류 유동에 의해 생성된 신호에 의해 제어되는 것인 장치.
  4. 제1항에 있어서, 제1 전극이 은, 또는 은 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (AgTBACI)인 장치.
  5. 제1항에 있어서, 제1 전해질 용액이 소수성 액체와, 보레이트를 포함하는 이온성 물질을 포함하는 것인 장치.
  6. 제1항에 있어서, 나노피펫이 석영인 장치.
  7. 제5항에 있어서, 소수성 액체가 1-2 디클로르에탄을 포함하고, 이온성 물질이 테트라헥실암모늄 테트라키스(4-클로로페닐)보레이트 (THATPBCl)를 포함하는 것인 장치.
  8. 제1항에 있어서, 전류 검출 회로에 의해 감지되는 이온성 전류에서의 변화에 반응하여 상기 장치를 작동시키는 프로그래밍된 지침 세트를 포함하는 장치.
  9. (a) 추출할 표적 세포내 내용물을 갖는 하나 이상의 세포를 함유하는 용액을 제조하는 단계,
    (b) xyz 제어기, 바이어스 전압 생성을 위한 내부 전극 및 외부 전극에 커플링되고 소수성 용액을 함유하고 팁을 갖는 나노피펫을 추가로 갖는 나노피펫 SICM (주사 이온 전도 현미경(scanning ion conductance microscopy)) 장치를 제공하는 단계,
    (c) 나노피펫의 팁을 통해 이온성 전류에서의 변화를 감지함으로써 나노피펫 SICM 장치가 상기 하나의 세포에 접근하도록 조작하는 단계,
    (d) 내부 전극과 외부 전극 사이에 양성 전압을 생성하여 세포로의 삽입 동안 액체가 나노피펫 내 소수성 용액에 진입하는 것을 방지하는 단계,
    (e) 나노피펫의 위치를 조정하여 표적 세포내 내용물을 포함하는 소정의 세포 위치를 관통하고 세포 내로 삽입되도록 하여 팁이 상기 소정의 세포 위치에 있게 하는 단계,
    (f) 내부 전극과 외부 전극 사이의 전압을 조정하여 나노피펫 유입을 일으키고 표적 세포내 내용물을 추출하는 단계,
    (g) 전압을 추가로 조정하여, 추출된 표적 세포내 내용물이 나노피펫을 이탈하는 것을 방지하는 단계, 및
    (h) 전압을 추가로 조정하여, 추출된 표적 세포내 내용물이 샘플 용기로 유출되도록 하는 단계
    를 포함하는, 개개의 세포로부터 표적 세포내 내용물을 추출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 추출된 표적 세포내 내용물이 핵산 또는 단백질을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 핵산이 DNA 또는 RNA를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, DNA가 미토콘드리아 DNA인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 전압이
    (a) 표적 세포내 내용물이 나노피펫으로 유입되도록 하는 단계에서 -100 내지 -1000 mV,
    (b) 나노피펫으로의 유입을 중지시키고 나노피펫으로부터의 유출을 방지하는 단계에서 100 내지 500 mV, 및
    (c) 추출된 표적 세포내 내용물이 유출되도록 하는 단계에서 +0.5 내지 2 V
    중 하나 이상인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계 (a)에서의 유입이 1초 내지 5초 동안 지속되는 것인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 유출이 핵산 저장 완충제를 함유하는 샘플 용기로의 유출인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 추출된 표적 세포내 내용물이 단일 미토콘드리아로부터의 DNA이고, 미토콘드리아 DNA의 서열 일부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. (a) xyz 제어기, 바이어스 전압 생성을 위한 내부 전극 및 외부 전극을 갖고, 단일 세포를 찌르기(piercing) 위한 팁을 함유하는 나노피펫을 추가로 갖는 나노피펫 장치를 제공하는 단계,
    (b) 나노피펫 장치를 조작하여 세포로부터 표적 세포내 내용물이 나노피펫으로 유입되도록 하고 추출하는 단계로서, 상기 조작이 내부 전극과 외부 전극 간의 전압을 조정하는 것을 포함하는 것인 단계,
    (c) 전압을 추가로 조정하여, 추출된 표적 세포내 내용물이 나노피펫을 이탈하는 것을 방지하는 단계,
    (d) 전압을 추가로 조정하여, 추출된 표적 세포내 내용물이 샘플 용기로 유출되도록 하는 단계, 및
    (e) (i) 추출된 표적 세포내 내용물로부터의 mRNA 분석, 및
    (ii) 추출된 표적 세포내 내용물로부터의 1종 이상의 선택된 단백질의 분석
    중 하나 또는 둘다에 의해, 상기 추출된 표적 세포내 내용물을 분석하는 단계
    를 포함하는, 개개의 세포로부터 표적 세포내 내용물을 추출하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 mRNA 분석이 세포로부터의 mRNA 500 pg 이상의 분석을 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 mRNA 분석이 세포 내 mRNA 서열의 90% 이상의 분석을 포함하는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 단백질 분석이 특정 단백질을 검출하는 초민감(ultra-sensitive) 검정을 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 검정이 근접성 라이게이션(proximity ligation)을 포함하는 것인 방법.
  22. 제17항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 종 분석이 EGFR, MKK1, ERK1/2, JAK, AP1/Jun, 및 STAT 중 적어도 하나를 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제17항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인산화된 단백질을 인산화되지 않은 동일 단백질과 구별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제17항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석이 동일 세포에 대해 상이한 시점에 수회 수행되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 인산화된 단백질을 인산화되지 않은 동일 단백질과 구별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제17항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포로부터의 단백질 종 분석이 동일 단백질로부터의 번역후 변형을 갖는 단백질을 그와 같이 변형되지 않은 단백질과 구별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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