CN113945623A - 单细胞分析方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明提出单细胞分析方法和系统，该方法包括：将注有电解质溶液的纳米管置于含有待测细胞样本的电解质溶液中；将工作电极的一端插入纳米管内的电解质溶液中，将对电极的一端插入纳米管外的电解质溶液中，工作电极的另一端与对电极的另一端通过电源相连；接头电源以使工作电极和对电极之间形成离子电流通路，记录施加的电压值和电流值；细胞在电场力的作用下向纳米管的管口运动，在距离管口预定距离时会受到阻力以使单个细胞远离管口，会形成电流降信号，基于电流降信号参数，实现单细胞分析。由此，可以准确地实现单细胞分析，例如尺寸、浓度、类型等，对细胞不会造成损伤，有助于细胞组学研究，为肿瘤细胞临床诊断和治疗奠定基础，应用前景广泛。

Description

单细胞分析方法和系统

技术领域

本发明涉及生物化学分析领域。具体地，本发明涉及单细胞分析方法和系统。

背景技术

细胞是生物体的基本结构和功能单位。人们为了揭示生命活动的规律，往往以细胞的研究为基础，深入探索生命过程的化学性质和规律。即使是同一类型的细胞在相同的生理条件或外部刺激下表现出细胞间的差异，包括大小、生长速度和形态，以及不同生物分子的表达水平。然而传统的检测结果大多基于细胞的整体响应，而无反映出单个细胞的异质性。因此建立单细胞的分析手段具有重要意义。

长久以来，人们建立起各种单细胞分析方法在医药、生命科学、临床诊断等领域的研究做出巨大的突破。传统的单细胞检测手段例如：流式细胞术，通常需要对细胞进行标记处理，并且对于原位活细胞检测仍面临有较大挑战。近几年其他的单细胞分析技术将流式细胞术与光谱、质谱、光学成像等技术结合，使得单细胞分析手段具有更高的通量、时空分辨率。然而，这些方法往往需要对细胞进行前处理，并且耗时较长，同时需要复杂昂贵的仪器，这也是传统的单细胞分析技术急需解决的问题。因此非常有必要发展一种简易，高效，无损伤的单细胞分析手段。

电化学方法作为一种具有高时空分辨率的方法在单细胞分析领域具有很大潜力。经典的电化学分析方法是利用超微电极检测单个细胞内的电活性物质或者神经递质。然而微电极的插入，会对细胞带来一定的损伤。近年来，微纳米孔技术得到了大力发展，基于电阻脉冲的传感技术实现了单颗粒、单细胞水平的分析检测。然而，基于这种穿孔事件的分析方法会受到检测物质尺寸与孔尺寸的限制。

因此，目前针对单细胞的分析方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种单细胞分析方法和系统，利用该方法和系统可以准确地实现单细胞分析，例如确定单细胞尺寸、浓度、鉴定单细胞类型等，并且对细胞不会造成损伤，有助于细胞组学研究，为肿瘤细胞临床诊断和治疗奠定基础，应用前景广泛。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种单细胞分析方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将注有电解质溶液的纳米管置于含有待测细胞样本的电解质溶液中，所述纳米管内外的电解质溶液相同；将工作电极的一端插入所述纳米管内的电解质溶液中，将对电极的一端插入所述纳米管外的电解质溶液中，所述工作电极的另一端与所述对电极的另一端通过电源相连；接头电源以使工作电极和对电极之间形成离子电流通路，记录施加的电压值和电流值；细胞在电场力的作用下向所述纳米管的管口运动，在距离所述管口预定距离时会受到阻力以使单个细胞远离管口，此时会形成电流降信号，基于所述电流降信号参数，以便实现单细胞分析。

根据本发明实施例的方法中，带负电性的细胞在电场力的作用向管口处靠近。当细胞接近到管口一定程度时，会受到明显的由管内向管外的电渗流(粘性应力)和介电泳力作用，这两种作用力会驱使靠近管口的细胞远离管口。即，细胞在管口处的动力学过程实际上是由在纳米管施加的电压与细胞在管口处所受的多种力来控制的，这种细胞靠近和离开管口是在单细胞水平上发生的。在细胞接近管口时造成离子阻塞会形成电流降信号，而细胞离开后电流信号又恢复，如此，基于电流降信号可以实现单细胞分析。由此，利用根据本发明实施例的方法可以准确地实现单细胞分析，例如确定单细胞尺寸、浓度、鉴定单细胞类型(如何种肿瘤细胞)等，并且对单细胞不会造成损伤，有助于细胞组学研究，为肿瘤细胞临床诊断和治疗奠定基础，应用前景广泛。

根据本发明的实施例，所述单细胞分析方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述纳米管的内径为150～250nm。由此，可以实现单细胞水平上的分析。

根据本发明的实施例，所述纳米管的管口具有突出的锥形尖端，半锥角为3～4°。由此，可以实现单细胞水平上的分析。

根据本发明的实施例，所述纳米管是通过将外径为1.5mm、内径为1.1mm的硼硅酸盐玻璃进行拉制所获得的，所述拉制的条件如下：第一循环：温度为325℃，聚焦范围为5，速度为20，延时128，拉力为50；第二循环：温度为350℃，聚焦范围为4，速度为15，延时130，拉力为175。由此，可以获得内径为150～250nm的纳米管，从而实现单细胞分析。

根据本发明的实施例，所述电解质溶液选自磷酸盐缓冲液。由此，可以维持细胞正常的生命活性。

根据本发明的实施例，所述单细胞分析包括：确定尺寸、浓度和/或鉴定单细胞类型。

针对不同尺寸大小的细胞，每次单细胞事件引起电流降的大小与细胞直径成正比，并且每个峰的持续时间也随细胞尺寸增加而增加，细胞尺寸越大，电流下降的比值越大，持续时间越长。可以采用电流降的大小与基线电流值的比值(ΔI/I)作为判断细胞尺寸的参数。通过对多个已知尺寸的细胞进行分析，获得细胞尺寸与电流降信号之间的关系图谱，在检测未知细胞时，将未知细胞的电流降信号与构建的图谱进行比对分析，从而可以确定未知细胞的尺寸。

针对不同浓度的同种细胞，由于每次单细胞事件是由细胞在体相溶液扩散到管口附近电场进行电迁所引起的，因此在相同检测时间内发生单细胞事件的次数是与体相溶液中细胞浓度(数量)成正相关的。基于此，该方法将电信号的出现频率与细胞浓度建立定量关系用于检测不同样本溶液中的细胞浓度。

针对不同类型的细胞(如肿瘤细胞)，由于细胞膜表面的蛋白表达不同，细胞膜的带电荷量和分布会出现不均匀的情况。这样就使得每个单细胞在经过管口时，不均匀的细胞膜会引起管口电流的短暂的震荡性变化也就是多峰的出现。而对于每种肿瘤细胞来说，多峰的电流信号反应的就是他们各自特有的电化学特性，所以我们把不同的峰形图案的作为各种肿瘤细胞的电化学指纹图谱，可以用来特异性识别每种肿瘤细胞。此外，不同肿瘤细胞的指纹图谱识别也是基于利用机器学习的方法来分析峰形图案中的4种参数(单峰个数、整体峰的延迟时间、单峰延迟时间和单峰的电流降)从而达到肿瘤细胞识别的目的。

根据本发明的实施例，所述细胞为肿瘤细胞。需要说明的是，本发明对于肿瘤细胞的分析方法不包括对疾病的诊断和治疗，可以用于对肿瘤细胞的科学研究。

根据本发明的实施例，所述细胞选自HeLa细胞、MCF-7细胞或A549细胞。

根据本发明的实施例，所述电流降信号参数包括：单峰个数、整体峰的延迟时间、单峰延迟时间和单峰的电流降。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种单细胞分析的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括：储液装置，所述储液装置中设置有储液空间，所述储液空间内适于存储含有待测细胞样本的电解质溶液；纳米管，所述纳米管的一端设置于所述储液空间内，所述纳米管内形成有容纳空间，所述容纳空间内适于存储电解质溶液；工作电极，所述工作电极的一端设置于所述容纳空间内；对电极，所述对电极的一端设置于所述储液空间内，所述对电极的另一端与所述工作电极的另一端通过电源相连。

参见图1和图2，储液装置100的储液空间中可以存储含有待测细胞样本的电解质溶液。对电极400可伸入该储液空间中，与电解质溶液接触。纳米管200的一端可伸入储液空间内，与电解质溶液接触，同时，纳米管内注有电解质溶液。工作电极300可伸入纳米管的电解质溶液中。如此，当对工作电极和对电极施加电压以形成电流通路后，带负电性的细胞在电场力的作用向管口处靠近。当细胞接近到管口一定程度时，会受到明显的由管内向管外的电渗流(粘性应力)和介电泳力作用，这两种作用力会驱使靠近管口的细胞远离管口。在细胞接近管口时造成离子阻塞会形成电流降信号，而细胞离开后电流信号又恢复，如此，基于电流降信号可以实现单细胞分析。由此，利用根据本发明实施例的方法可以准确地实现单细胞分析，例如确定单细胞尺寸、浓度、鉴定单细胞类型(如何种肿瘤细胞)等，并且对单细胞不会造成损伤，有助于细胞组学研究和肿瘤细胞临床诊断、治疗，应用前景广泛。

根据本发明的实施例，所述系统用于实施前面所述单细胞分析方法。前面针对单细胞分析方法所描述的特征和优点，同样适用于该系统，在此不再赘述。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1和图2分别显示了根据本发明一个实施例的单细胞分析系统结构示意图；

图3为根据本发明一个实施例的玻璃纳米管探针的SEM电镜图；

图4为根据本发明一个实施例的指纹图谱提取参数标准方式的示意图；

图5为根据本发明一个实施例的利用机器学习方法分析单细胞指纹图谱示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明提出了一种单细胞分析方法，具体包括：首先制备了玻璃纳米管作为该方法的检测探针，采用Ag/AgCl作为工作电极与对电极，在其两端施加电压以构成单细胞分析方法的实验装置。该方法利用电流时间曲线记录管外的单细胞事件，通过分析细胞接近管口时造成离子阻塞形成的电流降对单个细胞进行检测。一次检测时间通常为1000s，在电流时间曲线中出现尖峰型的电流信号的个数为发生单个细胞靠近并离开管口的事件次数。通过统计计算，峰信号的频率与悬浮液中细胞浓度成正比。同时对于不同尺寸大小的细胞，每次单细胞事件引起电流降的大小与细胞直径成正比，并且每个峰的持续时间也随细胞尺寸增加而增加。统计结果证明该方法可以用于单细胞的尺寸检测。另外，对于不同种类的肿瘤细胞，单细胞事件所产生的峰信号，表现出不同的峰型图案。在本方法中将这些不同种类细胞对应的特征峰型图案作为细胞的电化学指纹图谱，可用于肿瘤细胞的识别。该方法利用基于神经网络的机器学习方法分析从不同细胞峰信号中提取的4个参数(分别为：i.单峰个数；ii.整体峰的延迟时间；iii.单峰延迟时间；vi.单峰的电流降)，以达到数字化识别肿瘤细胞的功能。这种无损伤的，非标记的单细胞检测以及识别方法为将来的临床诊断，医药等领域提供了一种新的平台。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1.实验装置的搭建

利用外径1.50m，内径1.1mm的硼硅酸盐玻璃经CO2激光拉制仪(P-2000，Sutter仪器有限公司)拉制而成管径约为200nm、管口半锥角为3～4°的纳米玻璃管作为本方法的检测探针。纳米管探针SEM表征图如附图3所示。

具体拉制程序如下：

(循环1)温度＝325，聚焦范围＝5，速度＝20，延时＝128，拉力＝50；

(循环2)温度＝350，聚焦范围＝4，速度＝15，延时＝130，拉力＝175。

将一根Ag/AgCl电极作为工作电极插入注有电解质溶液的纳米管内，另外一根Ag/AgCl电极为对电极，浸入管外电解质溶液中。管内外的电解质溶液相同为磷酸缓冲溶液(PBS)。在两个电极之间施加电压形成离子电流的通路。电压的施加与离子电流的记录均由Axopatch 200B膜片钳记录系统完成。

2.单细胞事件检测与电化学指纹图谱参数提取

利用上述实验装置检测单细胞。首先将待测细胞样品加入管外电解质溶液中，并用移液枪反复吹打搅匀，形成细胞悬浮液。在管两端施加200mV电压，细胞会受到电场力向纳米管口运动，阻塞离子传输，形成峰形的电流降信号，数据的采集和分析采用AxonDigidata 1440A Series数模转换器和pCLAMP 10电生理软件完成。对于不同种类细胞来说，电信号的峰形均有差异，因此将每种细胞所产生的电信号作为该种细胞的对每个峰形信号进行参数提取。分别选取4种参数，分别为：i.单峰个数ii.整体峰的延迟时间iii.单峰延迟时间vi.单峰的电流降(图4)。i.单峰个数为在一组指纹图谱中出现的小振幅的峰个数。ii.整体峰的延迟时间为从电流开始下降的时刻到离子电流上升到基线时的间隔时间。iii.单个峰的延迟时间为单个峰电流开始下降到上升会基线时的时间间隔。vi.单峰的电流降为每个峰开始时电流与峰电流最低值的差值。

3.机器学习数字化识别分类电化学指纹图谱

将上述参数数据作为不同种细胞的指纹图谱库，带入MATLAB的神经网络中进行深度学习(图5)，输入端为4种参数，输出端为细胞种类。经过反复几次学习，神经网络对指纹图谱库中的不同细胞参数有很好的识别能力。随机输入一组未知的细胞指纹图谱参数，通过机器学习识别模式，会得出该组数据属于细胞种类的可能性概率值。随后选取概率值最高的细胞种类，作为该组数据的识别结果。基于此，在实验中对于混合的细胞样品，将实验所得电化学指纹图谱代入神经网络，可以实现数字化的识别混合样品中的细胞种类。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种单细胞分析方法，其特征在于，包括：

将注有电解质溶液的纳米管置于含有待测细胞样本的电解质溶液中，所述纳米管内外的电解质溶液相同；

将工作电极的一端插入所述纳米管内的电解质溶液中，将对电极的一端插入所述纳米管外的电解质溶液中，所述工作电极的另一端与所述对电极的另一端通过电源相连；

接头电源以使工作电极和对电极之间形成离子电流通路，记录施加的电压值和电流值；

细胞在电场力的作用下向所述纳米管的管口运动，在距离所述管口预定距离时会受到阻力以使单个细胞远离管口，此时会形成电流降信号，基于所述电流降信号参数，以便实现单细胞分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米管的内径为150～250nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米管的管口具有突出的锥形尖端，半锥角为3～4°。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米管是通过将外径为1.5mm、内径为1.1mm的硼硅酸盐玻璃进行拉制所获得的，所述拉制的条件如下：

第一循环：温度为325℃，聚焦范围为5，速度为20，延时128，拉力为50；

第二循环：温度为350℃，聚焦范围为4，速度为15，延时130，拉力为175。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电解质溶液选自磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单细胞分析包括：确定尺寸、浓度和/或鉴定单细胞类型。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为肿瘤细胞；

任选地，所述细胞选自HeLa细胞、MCF-7细胞或A549细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电流降信号参数包括：单峰个数、整体峰的延迟时间、单峰延迟时间和单峰的电流降。

9.一种单细胞分析的系统，其特征在于，包括：

储液装置，所述储液装置中设置有储液空间，所述储液空间内适于存储含有待测细胞样本的电解质溶液；

纳米管，所述纳米管的一端设置于所述储液空间内，所述纳米管内形成有容纳空间，所述容纳空间内适于存储电解质溶液；

工作电极，所述工作电极的一端设置于所述容纳空间内；

对电极，所述对电极的一端设置于所述储液空间内，所述对电极的另一端与所述工作电极的另一端通过电源相连。

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述系统用于实施权利要求1～9任一项所述单细胞分析方法。

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