CN112345616B - 一种适于单细胞及亚细胞水平生物活性物质检测的高精度电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有高空间分辨率的封闭式电化学检测方法，特别是涉及一种适于单细胞、甚至亚细胞水平生物活性物质检测的高精度电化学检测技术。本发明还提供了用于实施所述封闭式电化学检测方法的一种电化学电极系统，其包括：微电极、碳纤电极、参比电极、电解液以及推进器。

Description

一种适于单细胞及亚细胞水平生物活性物质检测的高精度电 化学检测方法
技术领域
本发明属于电化学传感器技术领域。具体而言，本发明涉及一种具有高空间分辨率的封闭式电化学检测方法，特别是涉及一种适于单细胞、甚至亚细胞水平生物活性物质检测的高精度电化学检测技术。
背景技术
在现代医学与生物学的研究和应用中，单细胞水平的生物活性物质检测(例如递质量子化释放事件的检测，激素分泌事件的检测，以及疾病相关物质含量如过氧化氢的检测等)，对于复杂精细的细胞生命活动的更深层理解乃至临床诊断及预后判定等方面的发展都是极为重要的。而随着现代科技的快速发展，人们对于细胞生命活动相关活性物质的探索热情也开始逐步拓展至亚细胞水平，对于更小尺度的生物活性物质检测也成为近年来检测技术领域中备受关注的热点。
目前，已报道的可用于单细胞水平生物活性物质的检测技术包括：荧光探针技术、质谱技术以及电化学技术。而电化学技术凭借超高的时间和空间分辨率、便捷的操作与分析优势，成为最为主要的检测手段。针对这一用途而开发的电化学传感器，主要由微米尺度碳基或金属材料制成。实施方式通常是将传感器的电化学检测区与感兴趣细胞的特定细胞膜片相接触，或直接将传感器刺入细胞来进行记录。然而，就技术层面而言也面临着诸多的难题：首先，几乎所有的用于单细胞水平分析的电化学传感器都只能在培养细胞上操作，这意味着在更接近生理状态的脑片或在体条件中是很难实现单细胞电化学记录的；其次，由于绝大多数传感器都是在开放环境中进行记录的，在电化学检测区所记录到的生物活性物质信号通常存在一定程度的扩散丢失；与此同时，开放的记录环境也导致实验结果更易受到外界环境的干扰。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种具有高空间分辨率的封闭式电化学检测方法，特别是涉及一种适于单细胞、甚至亚细胞水平生物活性物质检测的高精度电化学检测技术。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1.一种电化学电极系统，其包括：微电极、碳纤电极、参比电极、电解液以及推进器，在工作状态下，所述微电极与细胞膜片形成松散式或巨阻式封接，形成局域性封闭式的电化学记录环境，所述碳纤电极与参比电极尖端均没入存于微电极尖端内的电解液中，形成微型电化学反应池，所述推进器用于精细化调控碳纤电极在微电极内的位置，从而使碳纤电极的尖端足够靠近所封接的细胞膜片，由此所述电化学电极系统可以在封闭式记录环境中对单细胞或亚细胞水平下的生物活性物质，如神经递质：谷氨酸，多巴胺，5-羟色胺等进行电化学检测，其中所述微电极由抗电磁干扰的材质制造。
2.项目1所述的电化学电极系统，其中所述微电极为玻璃微电极或塑料微电极。
3.项目1-2所述的电化学电极系统，其中所述微电极的外径为2-5mm，内径为1-4mm；尖端开口的内径范围在0.1-5μm。
4.项目1-3任一项所述的电化学电极系统，其中所述碳纤电极包括碳纤维、碳纤电极壳体、导线，例如铜丝，所述碳纤维和导线封装在所述碳纤电极壳体中，并且碳纤维末端和导线前端通过导电凝胶电导连，导线尾端与推进器相固定，所述碳纤维尖端的裸碳纤维暴露于壳体外。
5.项目4所述的电化学电极系统，其中所述碳纤维尖端的裸碳纤维长度为1-200μm，初始直径为5-10μm，碳纤维尖端为锥形或圆柱形，可形成尖端直径范围在50-1000nm的电化学检测区域。
6.项目1-3任一项所述的电化学电极系统，其中所述碳纤电极整体的直径范围为0.1-0.4mm。
7.项目1-6任一项所述的电化学电极系统，其中所述参比电极为细丝状，直径0.1-0.4mm，材质为金属，优选为氯化银-银。
8.项目1-7任一项所述的电化学电极系统，其中电解液的渗透压范围在250-350mOsm，pH值范围在5.0-10.0，例如6.8-7.8。
9.项目1-8任一项所述的电化学电极系统，其中所述推进器中包含一根金属材质驱动杆，用于驱动碳纤电极移动以及将碳纤电极所测得的电流传输至记录设备。
10.项目9所述的电化学电极系统，其中所述推进器的驱动方式为手动或电动式，最大行进距离为1-3cm，行进精度为1-1000nm。
11.一种对单细胞或亚细胞水平下的生物活性物质进行封闭式电化学检测方法，其包括用项目1-10任一项所述的电化学电极系统对待检测的细胞膜片进行检测，由此在封闭式记录环境中对所述单细胞或亚细胞水平下的生物活性物质进行电化学检测。
本文所述的微电极由抗电磁干扰的材质制造，例如，可以由玻璃、塑料等制造。
本文所述的碳纤电极壳体可以是本领域公知的任何壳体，例如可以是塑料壳体，例如聚乙烯(PE)塑料、聚丙烯、聚氯乙烯等制造的塑料壳体。
本文所述的参比电极可以为本领域已知的任何参比电极。优选地，所述参比电极为金属材质的电极，例如，氯化银-银电极、硫酸铜-铜电极等。
本文所述的导线可以为任何导线，如金属导线，如铜、银、铝等制造的导线。
本文所述的电解液可以为本领域已知的用于电极的电解液。优选地，电解液的渗透压范围在250-350mOsm，pH值范围在5.0-10.0，例如6.8-7.8。
附图说明
图1是本发明所涉及电化学电极系统一个实施方案的示意图。
图2是对嗜咯细胞分别做裸碳电极电化学检测(图a)、封闭式电化学检测(微电极与细胞膜片形成松散式封接，图b)和膜片钳电化学电流检测(同为封闭式电化学检测，但微电极与细胞膜片形成巨阻式封接即GΩ阻抗封接，图c)和电化学电流电荷量(图d)的结果图示。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1电化学电极系统
图1所示为一种电化学电极系统，包括：玻璃微电极1、纳米级碳纤电极2、参比电极3、电解液4以及推进器5。所述的碳纤电极2与参比电极3尖端均没入存于玻璃微电极1尖端内的电解液4中，形成微型电化学反应池。借助所述的玻璃微电极1，其尖端开口内径为0.1-5μm，可根据具体实验要求在细胞胞体或突触等结构的特定细胞膜片形成松散式或巨阻式封接，构筑成一个局域性的、封闭式的记录环境。通过所述的推进器5精细化调控碳纤电极2在玻璃微电极1内的位置，从而使其尖端足够靠近所封接的膜片，在封闭式记录环境中对单细胞、甚至亚细胞水平下的生物活性物质进行高精度的、无损失的电化学检测。
实施例2封闭式电化学检测方法
使用实施例1的电化学电极系统，对细胞膜片进行检测，具体操作为：利用推进器将尖端直径为纳米级的碳纤电极深入到玻璃微电极的尖端，并将碳纤电极电压控制在+500～+700mV。玻璃微电极开口尖端尺寸约为1微米并对被测细胞做松膜片钳方式的封接，封接阻抗约为十至几十兆欧姆，对面积约为微米见方膜上的囊泡融合递质释放产生的电流做检测，实验结果如图2所示，对野生型小鼠嗜咯细胞分别做裸碳电极电化学检测(即采用裸碳电极做电化学安培法检测)(图a)、封闭式电化学检测(微电极与细胞膜片形成松散式封接)(图b)和膜片钳电化学电流检测(同为封闭式电化学检测，但微电极与细胞膜片形成巨阻式封接即GΩ阻抗封接)(图c)。从单个电化学电流事件的电荷量统计得到，采用封闭式电化学检测和膜片钳电化学检测方法得到的结果没有显著差异，但是裸碳电极电化学检测方法得到的电荷量显著小于封闭式电化学检测和膜片钳电化学检测方法得到的结果(图d)，图a-d中的单个电化学电流事件反映了单个囊泡神经递质的释放，而单个电化学电流事件积分得到的电荷量与被检测的活性物质分子数成正比，因此说明采用裸碳电极进行直接检测会丢失囊泡中的活性物质分子，而本发明中的封闭式电化学检测方法(微电极与细胞膜片形成松散式封接或巨阻式封接)得到的是完整的、无损的囊泡释放的活性物质所产生的递质信号。
上述结果表明，本发明的电化学电极系统可以实现具有高空间分辨率的封闭式电化学检测,在封闭式记录环境中对单细胞、甚至亚细胞水平下的生物活性物质进行高精度的、无损失的电化学检测。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种电化学电极系统，其包括：微电极、碳纤电极、参比电极、电解液以及推进器，在工作状态下，所述微电极与细胞膜片形成松散式或巨阻式封接，形成局域性封闭式的电化学记录环境，所述碳纤电极与参比电极尖端均没入存于微电极尖端内的电解液中，形成微型电化学反应池，所述推进器用于精细化调控碳纤电极在微电极内的位置，从而使碳纤电极的尖端足够靠近所封接的细胞膜片，由此所述电化学电极系统可以在封闭式记录环境中对单细胞或亚细胞水平下的生物活性物质进行电化学检测，其中所述微电极由抗电磁干扰的材质制造，其中所述微电极的外径为2-5mm，内径为1-4mm；尖端开口的内径范围在0.1-5μm，其中所述碳纤电极包括碳纤维、碳纤电极壳体、导线，所述碳纤维和导线封装在所述碳纤电极壳体中，并且碳纤维末端和导线前端通过导电凝胶电导连，导线尾端与推进器相固定，所述碳纤维尖端的裸碳纤维暴露于壳体外。
2.权利要求1所述的电化学电极系统，其中所述生物活性物质是神经递质。
3.权利要求2所述的电化学电极系统，其中所述神经递质是谷氨酸，多巴胺，5-羟色胺。
4.权利要求1所述的电化学电极系统，其中所述微电极为玻璃微电极或塑料微电极。
5.权利要求1所述的电化学电极系统，其中所述导线是铜丝。
6.权利要求5所述的电化学电极系统，其中所述碳纤维尖端的裸碳纤维长度为1-200μm，初始直径为5-10μm，碳纤维尖端为锥形或圆柱形，可形成尖端直径范围在50-1000nm的电化学检测区域。
7.权利要求1-4任一项所述的电化学电极系统，其中所述碳纤电极整体的直径范围为0.1-0.4mm。
8.权利要求1-4任一项所述的电化学电极系统，其中所述参比电极为细丝状，直径0.1-0.4mm，材质为金属。
9.权利要求8所述的电化学电极系统，其中所述参比电极为氯化银-银电极。
10.权利要求1-4任一项所述的电化学电极系统，其中电解液的渗透压范围在250-350mOsm，pH值范围在5.0-10.0。
11.权利要求10所述的电化学电极系统，其中pH值范围在6.8-7.8。
12.权利要求1-4任一项所述的电化学电极系统，其中所述推进器中包含一根金属材质驱动杆，用于驱动碳纤电极移动以及将碳纤电极所测得的电流传输至记录设备。
13.权利要求12所述的电化学电极系统，其中所述推进器的驱动方式为手动或电动式，最大行进距离为1-3cm，行进精度为1-1000nm。
14.一种对单细胞或亚细胞水平下的生物活性物质进行封闭式电化学检测方法，其包括用权利要求1-13任一项所述的电化学电极系统对待检测的细胞膜片进行检测，由此在封闭式记录环境中对所述单细胞或亚细胞水平下的生物活性物质进行电化学检测。
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