KR102226402B1 - 카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카테킨 배당체를 고함량 포함하는 느릅나무 식물의 초임계 추출박에 대한 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 추출물은 산화적 스트레스에 의해 유도되는 모유두 세포에서 세포사멸(apoptosis)를 억제하여 스트레스성 탈모증의 치료, 예방 또는 개선 용도의 활성물질로 이용될 수 있다.

Description

카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Improving, Preventing or Treating Stress-Related Alopecia Comprising Catechin Glycoside High-Content Extract As Active Ingredient}

본 발명은 카테킨 배당체 고함량 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

탈모는 다른 병리적 질환에 비해 병리 장애적 문제는 없지만, 외모에 영향을 미쳐 사회적, 심리적 문제로서 탈모를 겪는 사람에게 큰 영향을 끼친다. 과거에 탈모는 노화현상으로 인식되어 왔으나, 최근에는 유전적 요인과 함께 스트레스, 영양불균형, 사회활동의 변화, 질병, 출산, 식생활의 변화, 불규칙한 생활, 과도한 화학 정발제 사용 등 다양한 요인으로 인해 나타나고 있다. 탈모의 유형은 크게 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모, 산후 탈모, 지루성 두피염에 의한 탈모, 및 스트레스에 의한 탈모 등으로 분류될 수 있다.

스트레스에 의한 탈모는 원형 탈모증의 형태로 나타난다. 원형 탈모증은 몸의 일부 또는 모든 부위에서 털이 빠지는 질환이다. 흔히, 두피에 몇 개의 동전 크기 정도의 대머리 반점이 생기는데, 심리적 스트레스에 의해 발생할 수 있으며, 두피에 있는 털이나 수염이나 눈썹 등의 전신 털이 모두 없어져 영구적으로 탈모로 진행되는 경우도 있다.

또한, 스트레스에 의한 탈모는 휴지기 탈모의 형태로 나타날 수 있는데, 휴지기 탈모는 모발의 정상적인 성장 주기가 휴지기로 접어들면서 나타나는 탈모이다. 사람의 모발은 3-6년 주기로 생장과 소멸을 반복하는데, 3-6년 가량 성장한 모발은 약 3-4주에 걸쳐 퇴화한 후, 3-5개월가량 모발이 빠진 상태가 지속되는 휴지기로 접어든다. 보통 휴지기로 접어드는 모발은 전체 모발의 10%(약 1만가닥) 정도인데, 이런 형태로 모발이 휴지기에 접어들면서 머리카락이 빠지는 형태의 탈모를 휴지기 탈모라고 한다.

IGF-1은 배양중인 상피계 세포의 증식을 촉진하며, 모낭 조직의 길이를 증가시킴으로써 모발의 성장을 촉진하는 요인으로 작용하고 모발성장의 조절에 관여하는 중요한 성장인자이다(Itami et al., 1995; Hibino & Nishiyama, 2004).

IGF-1 성장인자는 남성호르몬에 의해 발현이 증가하여 testosterone의 모발에 대한 작용에 관여하고 안로겐성 탈모증(androgenetic alopecia)을 일으키는 작용기전에 중요한 역할을 할 것으로 보고되고 있으며(신부섭, 2014), 노화방지, 치매와 우울증 개선, 당뇨병이나 고혈압 등의 생활 습관병 예방, 면역력 증가 및 골밀도 상승, 피부노화 방지에 도움이 되며, 모발의 휴지기 상태에서 성장기 상태로 변환을 유도하여 탈모치료에 사용된다(편주리, 2012).

마우스 뒷면 피부에 퇴행기 개발을 유도하는 TGF-β1 주입 시 모낭 증식하여 각화 세포의 수가 감소하고, TUNEL 세포의 수가 대조군과 비교 시 TGF-β1 투여 마우스에서 증가 하였으며, TGF-β 유형 II 수용체 (TGFRIl) 및 TUNEL 반응성의 이중 시각화 퇴행기 모낭의 세포 사멸 핵 및 TGFRII의 colocalization을 한 것으로 밝혀져 TGF-βRII 작용제와 길항제는 조기 또는 지연 퇴행기 탈모, 다모증 기반으로 인간의 모발 성장 질환에 대한 유용한 치료로 제공될 수 있다고 하였다(Foitzik et al., 2000).

Shin et al. (2013)은 안드로겐 성 탈모증은 TGF-β1 분비와 밀접하게 관련되어 있다고 한다. 안드로겐 수용체가 형질 전환된 쥐 방광 유두 세포 (DP-6)는 안드로겐 치료 후에 증가된 ROS 생성을 보였으며, TGF-β1 분비가 DP-6에서 안드로겐 치료에 의해 증가되는 반면 안드로겐 유도 성 TGF-β1은 N- 아세틸 시스테인에 의해 유의하게 억제됨을 확인하여 안드로겐에 의한 TGF-β1의 유도가 모낭 DPCs의 ROS에 의해 매개되는 것으로 안드로겐성 탈모증의 치료를 위한 항산화제 치료의 사용을 제안한다고 보고되고 있다.

성장인자의 모발성장에 미치는 영향에 관해서는 표피성장인자(EGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 섬유아세포성장인자(FGF), 혈관내피성장인자(VEGF) 등의 성장 인자들은 여러 실험을 통하여 모낭의 특정 장소에 작용하여 모발 성장에 관여한다고 이미 밝혀진 바 있다(Tsuboi, 1997). 1994년에는 Hervert 연구팀에서 섬유아세포 성장인자(FGF)-5 유전자가 결핍된 쥐가 비정상적으로 활동기(anagen phase)가 길어져 모발이 상대적으로 길어지며, FGF-7, IGF-1, HGF는 모발성장을 촉진시키는 주변 분비 성장인자(paracrine growth factor)라고 보고하였다(Hervert et al., 1994).

Jiang et al. (1995)은 발모 및 탈모에 영향을 미치는 내분비계인자 중 TGF-β1은 모발의 성장기 단계(anagen stage)의 성장을 방해하여 정상보다 빨리 퇴행기 단계(catagen stage)로 접어들게 하여 탈모를 유도하고 IGF-1, TGF-β2, EGF, FGF 등의 성장 인자는 모발의 성장을 촉진하고 모발세포의 퇴화를 방지하여 탈모를 방지한다고 하였다.

나현욱 등(2006)의 연구에서는 털의 성장이 혈액순환에 보다 밀접한 관계를 가지면서 호르몬의 일종인 인슐린과 growth factor인 IGF-1, EGF들이 털의 성장을 촉진시켜 모낭성장에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.

미녹시딜(minoxidil)은 1970년대 초에 고혈압치료를 위한 혈관확장제로 개발되었으나, 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모 촉진제로 사용되었다. 발모효과에 대한 기전은 정확하게 밝혀져 있지 않지만, 혈관 확장으로 인한 영양공급 증가로 모발성장을 유도한다고 보고 되었다. 그러나, 미녹시딜은 이미 대머리가 되어버린 두피의 앞쪽에서는 효과가 없으며, 6-12개월간 하루 두 차례씩 꾸준히 두피에 도포하지 않으면 효과를 볼 수 없다. 미녹시딜의 부작용으로는 부종, 빈맥, 국소박리, 피부염, 투여 부위에 대한 쓰라림, 홍반, 피부 벗겨짐, 가려움증, 건조증, 피부낙설, 접촉피부염 등이 보고되었고, 다모증이 유발될 수 있다고 보고된 바가 있다. 또한, 미녹시딜이 모발 주기에 영향을 주어 휴지기 모발탈락(shedding)의 증가로 인해 탈모가 더 심해지는 현상이 있을 수 있으며, 투역을 중지하는 경우 치료 전의 상태로 환원되는 기간이 짧은 단점이 있다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

대한민국 등록특허 제10-2016002호 대한민국 등록특허 제10-1659516호 대한민국 공개특허 제10-2013-0123626호

본 발명자들은 보다 안전하고 부작용 없는 천연물 유래의 탈모 방지제를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 느릅나무속 식물의 초임계 추출박으로부터 유래된 카테킨 배당체를 고함량으로 포함하는 추출물이, 인간 모유듀 세포의 산화적 스트레스에 의한 세포사멸(apoptosis)을 효과적으로 억제함을 실험적으로 증명하고, 상기 추출물이 스트레스성 탈모증의 치료제로 개발될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트레스성 탈모증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물은 (a) 느릅나무속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 추출물을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것이다.

단계 (a): 느릅나무속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계

본 발명의 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 제조하기 위해, 먼저 느릅나무속 식물의 초임계 추출박을 제조한다.

본 발명에서 느릅나무속 식물의 초임계 추출박(supercritical extract residue)은 느릅나무속 식물을 초임계 추출방법에 의해 추출하고 남은 잔여물(residue)을 의미한다.

본 발명의 초임계 추출박 제조에 사용되는 느릅나무속(Ulmus) 식물은 장미목 느릅나무과의 식물을 포함하며, 예를 들어 당느릅나무(Ulmus davidiana), 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica), 혹느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica for. Suberosa), 참느릅나무(Ulmus parvifolia), 비술나무(Ulmus pumila), 난티나무(Ulmus laciniata), 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa) 등을 포함한다. 가장 대표적으로는 당느릅나무(Ulmus davidiana), 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica)를 사용할 수 있다.

상기 느릅나무속 식물은 느릅나무속 식물의 전체; 또는 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매, 및 씨앗으로 구성된 군에서 선택된 느릅나무속 식물의 일부를 사용할 수 있다. 바람직하게는 느릅나무속 식물의 가지, 줄기 또는 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출 공정 전에 느릅나무속 식물의 전체 또는 일부를 건조 및/또는 분쇄하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출(supercritical extraction) 방법은 초임계 상태의 유체를 사용하여 천연물에 함유된 향, 색소, 유지류 또는 기능성 물질을 변성 없이 추출하는 방법을 의미한다.

상기 초임계 상태의 유체는 임계점(supercritical point)의 일정한 고온 고압의 한계점을 넘어 기체와 액체의 구별이 되지 않는 상태의 유체를 의미한다. 상기 초임계 유체는 초임계이산화탄소(supercritical carbon dioxide)를 예로 들 수 있다. 상기 초임계이산화탄소는 임계온도(31℃) 및 임계압력(7.5 MPa)을 초과한 상태의 이산화탄소로서 기체와 액체의 성질을 동시에 가진 유체이다.

본 발명에서의 초임계 추출법은 예를 들어 초임계 유체와 용질의 혼합물을 추출온도와 같은 온도에서 감압하여 팽창시켜 초임계 유체의 용해력이 감소되면서 용질이 분리되는 압력변화법 방식; 또는 초임계 유체의 온도를 높여서 용해력을 감소시킴으로서 초임계 유체와 용질을 분리하는 온도 변화법 방식으로 행해질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 상기 초임계유체와 함께 보조용매를 사용할 수 있으며, 보조용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 극성 용매를 포함하며, 바람직하게는 알코올, 물, 에틸렌 글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜, 프로필렌카보네이트, 포름산, 아세트산, 아세토니트릴, 클로로디프루오로메탄 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 초임계 추출용 용기는 온도와 압력이 조절될 수 있으며, 추출원료와 초임계 유체가 접촉하도록 구성된 용기이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 초임계 추출에서의 압력은 100-600 bar 범위일 수 있고, 초임계 추출에서의 온도는 10-100℃ 범위일 수 있으며, 초임계 추출에서의 초임계 유체 및 보조용매의 유속은 10-100 g/분일 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 초임계 추출에서 압력, 온도, 유체 및 보조용매의 유속을 상기 범위 내에서 적절하게 조절하여 사용할 수 있다.

상기와 같이 느릅나무속 식물을 초임계 추출한 뒤 발생하는 진여물인 초임계 추출박을 수집하고, 수집된 초임계 추출박을 다음의 용매 추출의 원료로 사용한다.

단계 (b): 상기 얻어진 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 얻는 단계

상기 수집한 느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 용매 추출 방법을 통해 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 얻는다.

본 명세서에서 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 언급하면서 사용되는 용어 “추출물”은 느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물 뿐만 아니라, 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물 자체를 대상자(subject)에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 추출물의 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.

느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 추출용매를 처리하여 추출물을 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 구체적으로는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ⅱ) 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (ⅲ) 아세트산, (ⅳ) DMFO (dimethylformamide) 및 (v) DMSO (dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF (tetrahydrofuran)를 포함한다.

보다 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 알코올, (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다.

일 구현예에 따르면, 상기 알코올은 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올 등)일 수 있다.

다른 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 상기 용매 추출물에 대해 다시 용매를 사용하여 추가 분획하여 얻은 분획물도 포함할 수 있다.

바람직하게는 상기 용매 추출은 느릅나무속 식물의 초임계 추출박을 추출용매와 접촉시키는 공정을 통해 수행된다.

본 발명에서 용매 추출 공정은 추출 용매를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 통해 완성되며, 부분적 제거는 상당한 양의 유기용매가 없는 수성 농축물이 얻어질 때까지 농축하는 것을 의미하며, 완전한 제거에 의해서는 건조 잔류물을 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어 "추출물" 은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함하는 의미이다. 상기 용매에 의한 분획은 상기 용매를 사용한 추가적인 추출 공정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명에서 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물은 하기 화학식 1로 표시되는 카테킨 배당체, 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 포함한다.

[화학식 1]

본 발명에서 느릅나무속 식물의 초임계박의 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 30 - 200 ㎍/㎖의 함량으로 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 40 - 200 ㎍/㎖, 50 - 190 ㎍/㎖, 60 - 190 ㎍/㎖, 60 - 180 ㎍/㎖, 70 - 180 ㎍/㎖, 80 - 180 ㎍/㎖, 80 - 170 ㎍/㎖, 90 - 170 ㎍/㎖, 90 - 160 ㎍/㎖, 100 - 160 ㎍/㎖, 100 - 150 ㎍/㎖, 또는 100 - 140 ㎍/㎖의 함량으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “유효성분으로 포함하는”이란 본 발명의 추출물이 스트레스성 탈모증의 예방, 개선 또는 치료의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명 조성물에 포함되는 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물은 모유두세포(HFDPC)가 산화적 스트레스에 의해 세포사멸(apoptosis)되는 것을 저해함으로써, 스트레스성 탈모의 예방, 치료, 개선 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 추출물은 스트레스성 탈모증의 개선, 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “탈모”는 비정상적인 모발의 유실로 인해 정상적으로 모발이 존재해야할 부위에 모발이 없는 상태를 의미하며, 용어 “탈모증”은 상기와 같은 탈모로 인하여 야기되는 상태(condition)를 의미한다.

본 발명에서 “스트레스성 탈모증”은 심리적 또는 육체적 스트레스에 의해 발생되는 탈모증을 의미하며, 스트레스성 원형 탈모증과 스트레스성 휴지지 탈모증을 포함한다.

본 발명에서 “스트레스성 탈모증”은 인간의 스트레스성 탈모증 뿐만 아니라 인간을 제외한 동물에서 발생되는 스트레스성 탈모증을 포함한다.

본 발명의 조성물은 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 형태로 제공될 수 있으며, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “예방”은 탈모로 인한 증상 또는 탈모의 합병증으로 인한 증상의 발생의 억제를 의미하며, 용어 “치료”는 이미 발생된 탈모로 인한 증상 또는 탈모의 합병증으로 인한 증상의 경감 또는 제거를 의미한다.

본 발명의 조성물에서 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물 은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10,000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모증의 예방 또는 개선용 기능성 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 기능성 화장품 조성물에 포함되는 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물과 관련하여, “추출물”, “용매”, “추출공정”, “초임계추출방법” 및 “유효성분으로 포함하는”에 관한 내용은 본 발명의 다른 양태인 약학적 조성물에서 설명된 바와 동일하다.

본 명세서에서 용어 “개선”은 탈모로 인한 증상 또는 탈모의 합병증으로 인한 증상의 경감 또는 완화를 의미한다.

본 발명의 기능성 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 기능성 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물은 모유두 세포에서 산화적 스트레스로 인한 세포 사멸(apoptosis)를 억제함으로써, 스트레스성 탈모증의 치료, 예방 또는 개선 용도의 활성물질로 이용될 수 있다.

도 1는 본 발명의 일 실시예인 느릅나무 가지의 초임계 추출박에 대한 에탄올 추출물(USCFR)을 추출하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2a는 표준물질인 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드의 HPLC 분석결과이다.
도 2b는 느릅나무 가지 초임계 추출박에 대한 에탄올 추출물내에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 HPLC 정량분석한 결과이다.
도 3은 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물이 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 모유두세포에서 Bax 단백질의 발현을 억제하고, Bcl-2 단백질 발현을 증가시키며, PARP-1 단백질 발현을 억제함을 보여주는 실험 결과이다.
도 4a는 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물이 과산화수소 처리된 모유두 세포에서 IGF의 발현을 농도 의존적으로 촉진하는 효과를 보여주는 그래프이다. *P<0.001 vs normal group. **P<0.005 vs H2O2 control group.
도 4b는 느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물이 과산화수소 처리된 모유두 세포에서 TGF-β1의 발현을 농도 의존적으로 억제하는 효과를 보여주는 그래프이다. *P<0.001 vs normal group. **P<0.005 vs H2O2 control group.

하기 본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

실시예

1. 실험 방법

(1) 느릅나무의 초임계 추출박의 알코올 추출물

느릅나무(Ulmus) 가지를 서울약령시장에서 구입하여 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다. 느릅나무 가지의 초임계 추출은 초임계유체 추출 생산용 장비(SCFE-P400, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)를 사용하여 행하였다. 느릅나무 가지를 서울약령시장에서 구입하여 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다. 건조된 시료 100 kg을 200 메쉬(mesh)의 분쇄망을 통과하도록 분쇄하고, 분쇄된 느릅나무 가지를 추출조의 온도를 50℃로 조절하여 온도를 유지시켰다. 온도가 안정화되면 느릅나무 가지 시료를 넣고 CO₂ 가스를 등압으로 유지시킨 후, 고압펌프를 이용하여 라인(line)을 통해 실험압력 조건인 400 bar에 도달할 때까지 컨트롤 밸브(Control valve)를 조절하여 주입하였다. 설정 압력에 도달 후 추출조 하부로 에탄올(주정: 식용 알콜)을 분당 0.5~0.6L씩 160분 동안 총 60~80L를 투입하여 추출을 진행하였으며, 시료에 남아있는 잔존 에탄올을 제거하기 위해 설정된 압력과 온도로 60~120분 동안 고압펌프를 이용하여 CO₂를 흘려보내며 추출을 완료하였다.

위와 같이 느릅나무 가지를 초임계 추출을 하고 난 후에 얻어진 느릅나무 초임계 추출박 시료 100kg을 음건하여 60％ 에탄올로 실온에서 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 실시해 최종 4.81 kg을 확보한 후 실험에 사용하였다. 본 명세서에서 느릅나무 가지의 초임계 추출박 에탄올 추출물은 “USCFR”으로 표기하였다(도 1 참조).

(2) HPLC 분석

느릅나무 가지의 초임계 추출박 에탄올 추출물내에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드의 함량을 HPLC로 분석 하기 위해, Waters 2695 separation module을 사용하였고, 검출기로는 Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector를 사용하였다. 컬럼은 SkyPak C18 column(250 X 4.6mm)을 사용하였고, 컬럼 온도는 25℃로 세팅하였다. 이동상으로는 D.W.(A), 아세토니트릴(B)이고, 다음과 같은 Gradient program을 사용하여 분석을 진행하였다.

Time(분)	% A	% B
0	95	5
5	90	10
7	85	15
30	75	25
31	95	5
35	95	5

(3) 세포 배양

본 실시예에서 사용한 모유두 세포(hair follicle dermal papilla cells, HFDPC)는 모발의 성장 및 유지의 특성을 나타내는 세포로써 PromoCell (Heidelberg, Germany)에서 구입하여 사용하였다. HDFPC 세포는 공급처에서 추천하는 papilla cell 전용 배지(PromoCell, Heidelberg, Germany or Cell biologics Inc, IL, USA)에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24 - 48시간 계대 배양하여 실험에 사용하였다.

(4) 모유두 세포내 세포사멸 억제 효과

느릅나무 가지의 초임계 추출박의 추출물이 모유두 세포에서 산화적 스트레스에 의한 세포사멸을 억제할 수 있는지를 실험하였다. 본 실험에서 H₂O₂로 유도한 모유두 세포(HDFPC)의 산화적 스트레스 억제 효과는 MTT 실험을 통해 측정하였다. HDFPC 세포는 96 웰 플레이트에 5 X 10⁵ cell/mL로 분주하고 12시간 후 H₂O₂를 600 μM 및 시료를 4시간 동안 동시에 처리하였다. 이 상태의 HDFPC 세포에 MTT stock solution을 최종농도 0.2 mg/ml로 되도록 처리하여, 37℃에서 4시간 동안 방치한 후, 보라색으로 염색된 formazan을 DMSO로 용해시켜 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률은 대조구에 대한 %값으로 나타내었다.

(5) 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)

HDFPC 세포에 H2O2 및 시료를 처리한 후 각 시간대로 세포들을 회수하여 세포용해 완충액(cell lysis buffer, RIPA buffer)에서 세포를 용해시켰다. 샘플은 13,000 g에서 약 10-15분간 원심분리한 후 상층액만을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Bio-Rad, CA, USA) 로 측정한 후 95 ℃에서 10분간 가열하였다. 준비된 샘플을 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 polyvinylidinedifluoride membrane (PVDF, Bio-rad, CA, USA)에 트랜스퍼(transfer)한 다음 5% BSA로 블로킹(blocking)하였고, 제시된 특이적 항체와 반응시켰다. 그리고 HRP 가 결합된 이차항체 (Santacruz, CA, USA)를 반응시킨 후 ECL system (Bio-Rad, MO, USA)으로 검출하였다. Bax-1, Bcl-2, PARP-1, β-actin에 대한 1차 항체는 Santacruz 항체 (CA, USA)를 사용하였다.

(6) ELISA 분석

발모촉진 및 탈모 억제 관련 면역화학정량분석을 실시하기 위해 ELISA 키트를 구입하여 사용하였다. TGF-β 및 IGF-1 kit는 R&D systems (CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 각 키트의 사용법은 공급자의 매뉴얼에 따라 시험을 실시하였으며 세포 용해액(cell lysate) 부피 (ml) 당 항원의 양 (pg or μg)을 농도 단위로 환산하여 결과를 도출하였다.

(7) 통계 처리

모든 실험은 3회 반복 실시하여 평균값과 표준편차를 제시하였다. 또한 SPSS(Statistical Package for Social Science, ver. 18, IBM, Chicago IL. USA)를 이용하여 P<0.05 수준에서 실험군과 대조군의 평균치를 Student’s t-test로 유의성을 검증하였다.

2. 실험결과

(1) HPLC 분석 결과 크로마토그램

본 발명의 느릅나무의 초임계 추출박에 대한 추출물에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 HPLC 정량분석하였다. 도 2a는 표준물질인 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드의 HPLC 분석결과이고, 도 2b는 느릅나무 가지 초임계 추출박에 대한 에탄올 추출물(USCFR)내에서 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 HPLC 정량분석한 결과이다. 본 발명의 추출물에서 측정된 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드 함량을 아래의 표 2에 기재하였다.

시료명	RT(min.)	함량(μg/ml)
카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드	14.449±0.14	-
느릅나무 가지 초임계 추출박의 에탄올 추출물(USCFR)	14.482±0.16	131.45±0.18

(2) Bax 단백질 발현 억제 효과

HDFDC 세포의 세포사멸성 세포독성(apoptotic cytotoxicity)를 유도하기 위해 처리한 과산화수소(H2O2)은 600 μM의 농도에서 50%의 사멸도를 보이는 것으로 확인되었고, 이에 상기 농도를 시험에 사용하였다. 세포사멸성 세포독성에서의 대표적인 세포사멸 유발 단백질로서의 Bax(Bcl-2-associated X protein)는 H2O2의 처리에 의해 Bax 분자의 발현을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다. 이에 반해 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물(USCFR)을 농도별로 전처리한 결과, 농도 의존적으로 Bax의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물이 모유두 세포가 스트레스에 의해 세포사멸되는 것을 효과적으로 억제한다는 것을 시사한다.

(3) Bcl-2 단백질 발현 증가 효과

Bax 발현 억제능 평가 방법과 동일한 방법으로 HDFDC의 세포사멸성 세포독성(apoptotic cytotoxicity)를 유발하기 위해 처리한 과산화수소(H2O2)에 의해 유도된 세포사멸을 평가하기 위하여 600μM의 H2O2를 세포에 처리하였다. Bcl-2는 대표적인 세포사멸 억제에 관여하는 단백질 분자로서, HDFDC에 대한 H2O2의 처리는 Bcl-2 분자의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 관찰하였다. 이에 반해, 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물(USCFR)을 농도별로 처리한 결과, 농도 의존적으로 Bcl-2의 발현을 유의하게 증가시키는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물이 모유두 세포가 스트레스에 의해 세포사멸되는 것을 효과적으로 억제한다는 것을 시사한다.

(4) PARP-1 단백질 발현 억제 효과

PARP-1은 세포내 NAD를 기질로 사용하여 세포의 핵에서 표적단백질을 poly-ADP ribosylation을 유도하고 이를 통해 하위 세포사멸(apoptosis)에 관여하는 신호전달을 활성화시킨다. 이로 인해 PARP-1의 활성화는 세포사멸의 선행 지표로 활용되며, 특히 세포사멸(apoptosis)에 관련된 대표적인 표지자로 사용되고 있다. 600 μM의 과산화수소(H2O2)의 처리는 HDFDC에서 유의하게 세포내 PARP-1의 발현을 증가시켰고, 이러한 결과는 세포의 세포사멸이 진행되고 있음을 증명하고 있다. 이에 반해, 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물(USCFR)을 농도별로 처리한 결과, 농도 의존적으로 PARP-1의 단백질 발현량을 유의하게 억제시키는 것이 증명되었다. 이러한 결과는 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물이 모유두 세포가 스트레스에 의해 세포사멸되는 것을 효과적으로 억제한다는 것을 시사한다.

(5) IGF-1의 발현 촉진 효과 및 TGF-β1의 발현 억제 효과

본 실험에서 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물이 모발성장에 도움이 되는 IGF-1의 발현을 촉진하는 효과(도 4a)와 모발의 성장을 방해함과 동시에 탈모를 가속화하는 TGF-β1의 억제 효능(도 4b)을 확인하였다.

이상과 같은 실험 결과는 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(Catechin 7-O-beta-D-apiofuranoside)를 포함하는 느릅나무의 초임계 추출박의 추출물은 산화적 스트레스에 의한 모유두세포의 세포사멸을 효율적으로 억제하여 스트레스성 탈모에 효능이 있을 것이 시사된다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

1. 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 포함하는 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 에탄올 용매 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물로서,
   상기 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 에탄올 용매 추출물은 (a) 느릅나무속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 에탄올 용매 추출물을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것이고,
   느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 에탄올 용매 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 70 - 180 ㎍/㎖의 함량으로 포함하는 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 청구항 1에 있어서, 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 에탄올 용매 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 100 - 150 ㎍/㎖의 함량으로 포함하는 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물.
   
7. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물인 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물.
   
8. 청구항 1에 있어서, 상기 스트레스성 탈모증은 스트레스성 원형 탈모증 또는 스트레스성 휴지기 탈모증인 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물.
   
9. 청구항 1에 있어서, 상기 스트레스성 탈모증은 동물에서 발생되는 스트레스성 탈모증인 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 치료용 조성물.
   
10. 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드(catechin 7-O-β-D-apiofuranoside)를 포함하는 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 에탄올 용매 추출물을 유효성분으로 포함하는 스트레스성 탈모증의 예방 또는 개선용 기능성 화장품 조성물로서,
    상기 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 에탄올 용매 추출물은 (a) 느릅나무속 식물을 초임계 추출하여 초임계 추출박을 얻는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 느릅나무속 식물의 초임계 추출박에 대해 에탄올 용매 추출물을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것이고,
    느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 에탄올 용매 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 70 - 180 ㎍/㎖의 함량으로 포함하는 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 개선용 기능성 화장품 조성물.
    
11. 삭제
12. 삭제
13. 청구항 10에 있어서, 느릅나무속 식물의 초임계 추출박의 추출물은 카테킨 7-O-β-D-아피오푸란노사이드를 100 - 150 ㎍/㎖의 함량으로 포함하는 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 개선용 기능성 화장품 조성물.
    
14. 청구항 10에 있어서, 상기 스트레스성 탈모증은 스트레스성 원형 탈모증 또는 스트레스성 휴지기 탈모증인 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 개선용 기능성 화장품 조성물.
    
15. 청구항 10에 있어서, 상기 스트레스성 탈모증은 동물에서 발생되는 스트레스성 탈모증인 것인, 스트레스성 탈모증의 예방 또는 개선용 기능성 화장품 조성물.

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