KR102224661B1

KR102224661B1 - Pdk2 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 조절용 조성물

Info

Publication number: KR102224661B1
Application number: KR1020190047347A
Authority: KR
Inventors: 석경호; 이인규; 라흐만하비부르
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 경북대학교병원
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2021-03-08
Also published as: KR20200124018A

Abstract

본 발명은 PDK2 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 조절용 조성물에 대한 것으로, 본 발명에서는 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨병 모델 및 고지방식이로 유도된 비만 모델의 시상하부에서 PDK2의 발현 및 활성이 증가되었고, PDK2 유전자 결핍 생쥐 및 PDK2 억제제에 의해 음식 섭취 행동이 감소되는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에서는 PDK2 억제제 및 PDH 활성제가 식욕 조절을 위한 예방 및 치료제로 활용될 수 있다는 가능성을 제시하였다.

Description

PDK2 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 조절용 조성물{Composition for preventing increased feeding behavior comprising PDK2 inhibitor}

본 발명은 피루브산 디하이드로게나제 키나제 2(pyruvate dehydrogenase kinase 2; PDK2) 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 조절용 조성물에 대한 것이다.

피루브산 디하이드로게나제 키나제 2(pyruvate dehydrogenase kinase 2; PDK2)는 시트르산 회로 및 산화적 인산화와 관련된 해당과정 및 당신생과정에서의 글루코스 대사에 중요한 역할을 하는 미토콘드리아 게이트키핑 효소 피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase; PDH) 복합체의 주요 조절자 중 하나이다. 또한, PDK 이성질체(PDK1-4) 및 피루브산 디하이드로게나제 포스파타제는 PDH의 가역성 인산화를 통해 피루브산 디하이드로게나제 복합체 활성을 주로 조절한다. PDK 이성질체는 여러 말초 및 중추 신경 조직에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. PDK-매개 인산화 및 이후 PDH 불활성화는 당분해 대사를 변경시켜, 최종산물로서 젖산(lactate)를 생산한다. 이러한 변경된 당분해 대사는 암, 비만, 심장질환, 간질환 및 당뇨병을 포함하는 여러 병리학적 조건과 관련되어 있다. 또한, PDKs는 뉴런, 신경교세포(glia) 및 면역세포의 당분해 대사 조절에 있어, 중요한 역할을 담당한다. 비록 젖산이 뉴런의 최우선 에너지원인데도 불구하고, 증가된 젖산 축적 또는 젖산 산증(lactic acidosis)은 알츠하이머, 뇌 노화, 교모세포종(glioblastoma) 및 허혈성 뇌질환을 포함하는 신경 대사 장애와 관련되어 있다고 보고되고 있다. 상기 보고와 유사하게, 본 발명자들의 이전 연구에서도 PDK-PDH-젖산 축(axis)이 프로인트 완전 애쥬번트(complete Freund's adjuvant)-유도 만성 염증 및 관련 통증 과민반응을 매개하여, 대사반응 및 염증성 통증 사이를 연결시키는 것으로 밝혀졌다.

시상하부 내 만성 염증이 당뇨병 및 비만을 포함하는 여러 대사 장애와 관련되어 있다는 연구 결과가 많이 보고되고 있다. 이는 신경 내분비 시스템의 기능을 조절하고, 비정상적인 음식 섭취 및 에너지 균형으로 인한 질병을 야기한다. 식이 조절은 환자의 당뇨병 및 비만을 예방하는데 중요한 역할을 한다. 하지만, 당뇨병 및 비만에서의 시상하부 염증 발병과 관련하여, PDK2의 역할 및 변경된 미토콘드리아 대사 반응에 대해서는 현재까지 알려진 바 없다.

한국등록특허 제10-1836466호 (2018.03.02. 공개)

이에, 본 발명에서는 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 억제용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명에서는 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 섭식 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.

본 발명은 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 억제용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 억제용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 섭식 장애 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 섭식 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

도 1은 당뇨병에 따른 시상하부 내 PDK 및 인산화 PDH의 발현 결과를 나타낸다. (A) STZ 투여 1, 2, 3 및 6주 후, 시상하부에서 Pdk2 mRNAs의 발현을 실시간 RT-PCR로 측정한 결과이다. (B) STZ 투여 3주 후, 시상하부에서 PDK2 및 인산화-PDH(p-S293-PDH 및 p-S300-PDH)의 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 측정한 결과이다. (C) HFD 식이 제공 16주 후, 시상하부에서 Pdk2 mRNAs의 발현을 실시간 RT-PCR로 측정한 결과이다. (D) HFD 식이 제공 16주 후, 시상하부에서 PDK2 및 인산화-PDH(p-S293-PDH 및 p-S300-PDH)의 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 측정한 결과이다. (E) STZ 투여 3주 후, 시상하부 내 성상세포에서 PDK2 발현을 나타내는 면역형광분석 결과이다. (F) HFD 식이 제공 16주 후, 시상하부 내 성상세포에서 PDK2 발현을 나타내는 면역형광분석 결과이다. (G) STZ 투여 3주 후, 시상하부 내 뉴런에서 PDK2 발현을 나타내는 면역형광분석 결과이다. 화살표는 대표적인 이중 표지된 세포를 나타낸다. (H) 뇌 연속 절편의 DAB 염색 결과, STZ 투여 3주 후, PDK2 및 AgRP 양성 세포가 동시-위치화하는 것을 나타낸다. *, p < 0.05 versus 이동액-처리 대조군 동물. Student's t test, n = 3; 평균 ± SEM. w: 주(week(s)).
도 2는 당뇨병/비만-유도 음식/칼로리 섭취 증가 및 고혈당증(hyperglycemia) 심각성이 Pdk2 결핍시 감소된다는 결과를 나타낸다. 마우스에 STZ 투여/HFD 식이 후, 표시된 시점에서의 음식/칼로리 섭취(A 및 E), 공복 혈당(B 및 F) 및 CSF 글루코스 수준(C)을 측정한 결과이다. (D) STZ 투여 후, 대조식이 조건하에서 공복 혈당 수준을 측정한 결과이다. *, p < 0.05 versus 당뇨병성 KO 동물. Student's t test, n = 5-6; 평균 ± SEM. w: 주(week(s)), d: 일(day(s)).
도 3은 시상하부 PDK2의 기능적 억제가 당뇨성 마우스에서 음식 섭취 및 혈당 수준을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 자세한 실험 모식도를 나타낸다. (B) STZ 투여 3주 후와 아데노바이러스 주입 4주 후, 마우스 뇌에서 분리된 시상하부 조직 내 인산화된-PDH(p-S293-PDH 및 p-S300-PDH) 및 PDK2의 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅 분석한 결과이다. *, p < 0.05 versus STZ-처리 대조군 동물; Student's t test, n = 3; 평균 ± SEM. (C) STZ 및 아데노바이러스 투여 후, 음식 섭취를 측정한 결과이다. (D) STZ 및 아데노바이러스 투여 후, 공복 혈당 수준을 측정한 결과이다. 화살표는 아데노바이러스(Ad)/STZ 투여 시점을 나타낸다. *, p < 0.05 versus Ad-PDK2 DN-처리 당뇨병 KO 동물. Student's t test, n = 5; 평균 ± SEM.
도 4는 마우스에서 시상하부 PDK2 또는 젖산 생산에 대한 약물 억제가 당뇨병-유도된 과도한 음식 섭취를 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) PDK2 억제 약물(AZD7545) 및 젖산 디하이드로게나제 억제 약물(GSK2837808A 또는 Oxamate)을 마우스 뇌의 제3 뇌실에 주입하는 실험 모식도를 나타낸다. (B) AZD7545/GSK2837808A (6.4 nM/2μM of total CSF concentration) 주입 후, 음식 섭취를 측정한 결과이다. (C) Oxamate (25 μg of total CSF concentration) 주입 후, 음식 섭취를 측정한 결과이다. *, p < 0.05 versus 대조군 처리 당뇨병 동물. Student's t test, n = 5-6; 평균 ± SEM.

이에, 본 발명자들은 STZ 처리를 통해 유도한 당뇨병 마우스 및 고지방 식이(high-fat diet; HFD) 유도한 비만 마우스에서 PDK2의 발현 및 활성이 증가하는 것을 확인하였는데, 이는 PDK2가 음식/칼로리 섭취 행동 증가로 인한 시상하부 병리학과 긴밀히 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 마우스에서 시상하부의 Pdk2 유전자를 제거하거나, 관련 당분해 대사반응을 약물로 억제하면, 당뇨병 또는 비만 관련 음식/칼로리 섭취 행동 증가 및 고혈당증(hyperglycemia)을 감소시킬 수 있었다. 상기 결과는 시상하부의 PDK2가 비만 및 당뇨병에서의 과잉 섭취 및 관련 대사 합병증을 예방하기 위한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있다는 것을 뒷받침한다. 따라서, PDK2 특이적 억제제는 비만 및 당뇨병과 같은 여러 대사 질환의 치료 뿐만 아니라, 건강한 사람에서의 과잉 섭취 관련 위험성을 예방할 수 있는 유용한 약물로서 사용될 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상세하게는, 상기 PDK2 발현 억제제는 PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 PDK2 활성 억제제는 PDK2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하게는, 상기 PDK2 활성 억제제는 4-[3-클로로-4-[[(2R)-3,3,3-트리플루오로-2-하이드록시-2-메틸프로파노일]아미노]페닐]설포닐-N,N-디메틸벤즈아미드(4-[3-chloro-4-[[(2R)-3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropanoyl]amino]phenyl]sulfonyl-N,N-dimethylbenzamide; AZD7545)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상세하게는, 상기 약학조성물은 피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase; PDH) 활성을 촉진할 수 있다.

바람직하게는, 상기 섭식 장애는 비만 또는 당뇨병으로 인한 섭식 장애일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 섭식 장애는 폭식증 또는 습관성 과식증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 마우스 사육 및 관리

모든 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회에서 승인된 동물 프로토콜 및 가이드라인에 따라 수행되었다(Approval No., KNU-2012-73/66). 사용된 동물의 수 및 동물의 고통을 최소화시키기 위해 모든 노력을 다하였다. 8-10 주령 수컷 야생형(WT, Pdk2+/+) 및 Pdk2 녹아웃 마우스가 사용되었다. Pdk2 KO 마우스는 이전에 보고된 대로 제작하였다(Biochem J, 2012, 443(3), 829-839). C57BL/6J 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 연령을 일치시킨 WT 마우스를 생산하였는데, 이는 Pdk2 KO의 유전적 배경을 안정화시키는데 사용되었다. 유전형은 이전에 보고된 바에 따라, 게노믹 DNA를 PCR 분석하여 확인하였다. 동물들은 12 시간의 명암 주기(lights on 07:00-19:00)로, 23 ± 2 ℃의 일정한 온도 조건하에서, 음식 및 물은 마음대로 먹을 수 있도록 제공하여 사육되었다. 단일 실험 목적에 따라 각각의 개별적인 동물들을 사용하였다.

2. 스트렙토조토신 -유도 제1형 당뇨병 모델

대조군 마우스(C57BL/6J)로부터 연령을 일치시킨 Pdk2 KO 및 WT 마우스를 당뇨병 유도를 위해 사용하였다. 당뇨병 마우스 모델은 이전에 보고된 2 종류의 실험 프로토콜을 사용하여 제작하였다. 첫째, 0.1 M 시트르산 완충액 (pH 4.5)에 녹인 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 150 mg/kg body weight)을 고용량으로 복막 주사하여 전형적인 제1형 당뇨병을 유도하였다. 둘째, 0.1 M 시트르산 완충액 (pH 4.5)에 녹인 STZ를 저용량으로 여러 차례 복막 주사(MLDS, 40 mg/kg body weight)하여 경증 제1형 당뇨병을 유도하였다. 단일 STZ 주사 3일 후와, MLDS 주사 7일 후, 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였고, SD CodeFreeTM glucometer (SD Biosensor Inc., Korea)를 사용하여 혈당을 측정하였다. 공복 혈당 검사 수치가 260 mg/dL 이상인 동물을 당뇨병이라고 판단하였다. 본 발명에서, 2 종류 유전형의 모든 STZ-주사 동물들은 당뇨병이 유발되는 것을 확인하였고, 이전에 보고된 대로 행동 시험에 사용하였다.

3. 고지방 식이 모델

고지방 식이(High-fat diet; HFD) 마우스는 비만 및 제2형 당뇨병에 대한 효과적인 모델로서, 비만 및 제2형 당뇨병의 기작 연구에 흔히 사용되며, 새로운 치료제를 개발하기 위한 도구로서 사용된다. 6주령 수컷 WT (C57BL/6J) 및 Pdk2 KO 마우스에 고지방 식이가 제공되었는데, 탄수화물로부터 칼로리의 20% 및 지방으로부터 칼로리의 60%가 제공되었다(D12492 pellets; Research Diets, Inc.). 대조군 WT 및 Pdk2 KO 마우스에는 동일 칼로리의 저지방 식이/대조 식이(control diet; CD)가 제공되었는데, 탄수화물로부터 칼로리의 70% 및 지방으로부터 칼로리의 10%가 제공되었다(D12450B pellets; Research Diets, Inc.). 마우스들은 12 hr의 명암 주기로, 22 ± 2 ℃의 온도 조건을 유지하면서 사육되었다. 본 발명에서, 모든 HFD 식이 WT 마우스는 식이 8주 후, CD 식이 마우스에 비해 상당한 몸무게 증가를 나타냈고, 공복 혈당 수준이 증가된 것을 확인하였다. 실험 시간 시점에 따라 마우스들을 희생시켜, 조직을 빠르게 수집하였고, 이후 실험을 위해 샘플들은 즉시 -80 ℃에 보관하였다.

4. 정량적 실시간 역전사 PCR

깊게 마취시킨 마우스는 혈액을 제거하기 위해서 0.1 M PBS로 대동맥 관류시켰고, 시상하부 조직을 재빨리 절단하였다. 그 후, 총 RNA를 분리하기 위해서, 샘플들을 즉시 액체질소에 동결시켰고, 곧바로 TRIzol reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA)로 균질화시켰다. first strand cDNA synthesis kit (MBI Fermentas, Hanover, Germany)를 사용하여, 각각의 샘플로부터 총 RNA (2 μg)를 cDNA로 역전사시켰다. one-step SYBR®PrimeScriptTM RT-PCR kit (Perfect Real-Time; Takara Bio Inc., Tokyo) 및 ABI Prism® 7000 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여, 제조사의 지시에 따라 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 유전자 발현의 상대적 차이를 계산하기 위하여, 2-ΔΔCT 방법을 사용하였고, 내부 대조군으로 Gapdh을 사용하였다. 실시간 RT-PCR에 사용된 프라이머들의 염기 서열은 다음과 같다. Pdk1, 정방향(forward), 5′-CAC CAC GCG GAC AAA GG-3′, 역방향(reverse), 5′-GCC CAG CGT GAC GTG AA-3′; Pdk2, 정방향(forward), 5′-CCC CGT CCC CGT TGT C-3′, 역방향(reverse), 5′-TCG CAG GCA TTG CTG GAT-3′; Pdk3, 정방향(forward), 5′-GGA GCA ATC CCA GCA GTG AA-3′, 역방향(reverse), 5′-TGA TCT TGT CCT GTT TAG CCT TGT-3′; Pdk4, 정방향(forward), 5′-CCA TGA GAA GAG CCC AGA AGA-3′, 역방향(reverse), 5′-GAA CTT TGA CCA GCG TGT CTA CAA-3′; Tnf -α, 정방향(forward), 5′-ATG GCC TCC TCA TCA GTT C-3′, 역방향(reverse), 5′-TTG GTT TGC TAC GAC GTG-3′; Il - 1β, 정방향(forward), 5′-AAG TTG ACG GAC CCC AAA AGA T-3′, 역방향(reverse), 5′-TGT TGA TGT GCT GCT GCG A-3′; Il -6, 정방향(forward), 5′-AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA-3′, 역방향(reverse), 5′-TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC-3′; Npy, 정방향(forward), 5′-CTA CTC CGC TCT GCG ACA CT-3′, 역방향(reverse), 5′-AGT GTC TCA GGG CTG GAT CTC-3′; Agrp, 정방향(forward), 5′-CGG CCA CGA ACC TCT GTA G-3′, 역방향(reverse), 5′-CTCATCCCCTGCCTTTGC-3′; Pomc, 정방향(forward), 5′-GAG GCC ACT GAA CAT CTT TGT C-3′, 역방향(reverse), 5′-GCA GAG GCA AAC AAG ATT GG-3′; Gapdh, 정방향(forward), 5′-TGG GCT ACA CTG AGC ACC AG-3′, 역방향(reverse), 5′-GGG TGT CGC TGT TGA AGT CA-3′.

5. 웨스턴 블랏 분석

마우스 시상하부 조직은 절단하여, 얼음으로 차게 한 PBS로 씻어냈고, Halt™ protease inhibitor (1×) 및 phosphatase protease inhibitor cocktails (1×) (Thermo Scientific)가 포함된, 300 μL 용해 완충액(150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mMTris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA; GenDEPOT, Barker, TX)에 넣어 두었다. 검체는 각각 균질화시킨 후, 13,400 ×g로 4 ℃에서 15분 동안 원심분리시켰다. 단백질 농도는 Bio-Rad Laboratories Protein Assay Kit으로 측정하였고, 표준액으로는 소혈청알부민을 사용하였다. 각 샘플 유래 단백질(20-30 μg)은 8% 또는 15% SDS-PAGE 젤 상에서 분리하였고, 반건조 전사-블롯팅(semi-dry electro-blotting) 방법을 통해 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 멤브레인은 5% 스킴 밀크로 차단시켰고, PDK2 (rabbit polyclonal antibody, 1:1000; Abgent, San Diego, CA), phospho-Ser293-PDH-E1α (pyruvate dehydrogenase E1α) (rabbit polyclonal antibody, 1:1000; Calbiochem), phospho-Ser300-PDH-E1α (pyruvate dehydrogenase E1α) (rabbit polyclonal antibody, 1:1000; Calbiochem), PDH-E1 (rabbit monoclonal antibody, 1:1000; Cell Signaling) 또는 α-tubulin (mouse monoclonal antibody, 1:2000; Sigma-Aldrich)에 대한 1차 항체로 반응시켰고, 연속적으로 horseradish peroxidase-접합 2차 항체 (anti-rabbit and anti-mouse IgG antibody; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)로 반응시킨 후, 향상된 화학발광 검출 분석(Amersham Biosciences)을 수행하였다. 웨스턴 블랏팅은 각 조건에 대해 3번 반복하였다(n = 3).

6. 면역조직화학분석

마우스를 깊게 마취시킨 후, 0.1 M 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 대동맥 관류시켰고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde; PFA)로 고정시켰다. 전체 뇌 조직을 수집하였고, 동일한 PFA로 밤새도록 후-고정시켰으며, 0.1 M PBS에 녹인 30% 수크로스를 이용하여, 4 ℃에서 밤새도록 저온보관하였다. 뇌조직의 20-μm 두께 관상면 절편(coronal sections)을 제조하기 위해서 저온유지장치(cryostat)를 사용하였다. 절편된 뇌조직을 젤라틴-코팅된 슬라이드에 마운팅시켰고, 조직 절편은 0.1 M PBS에 넣어 두었다. 그 후, 절편들은 0.3% Triton X-100에 녹인 4% 정상 혈청으로 상온에서 90분 동안 차단시켰다. 면역형광 염색을 위해, 절편들은 PDK2 (rabbit, 1:200; Abgent, San Diego, CA), Iba-1 (goat, 1:200; Novus biologicals, Littleton, CO), GFAP (mouse, 1:500; Novus biologicals, Littleton, CO) 또는 β-III-tubulin (mouse, 1:200; SantaCruz Biotechnology INC)에 대한 1차 항체로 4 ℃에서 밤새도록 반응시킨 후, FITC-접합 2차 항체(1:200; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로 반응시켰다. 슬라이드를 씻어냈고, Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 커버슬립하였고, 형광현미경 하에서 가시화시켰다. 3,3′-디아미노벤지딘(3,3′-Diaminobenzidine; DAB) 염색을 위해, 절편을 PDK2 (rabbit, 1:200; Abgent, San Diego, CA), AGRP (rabbit, 1:200; Phoenix Pharmaceuticals Inc.), POMC (Rabbit, 1:200, phoenix Pharmaceutical Inc.)에 대한 1차 항체로 4 ℃에서 밤새도록 반응시킨 후, 비오틴-접합된 2차 항체로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후, avidin-biotin complex kit (Vector Laboratories)으로 1시간 동안 반응시킨 후, 시그널은 DAB kit (Vector Laboratories)를 통해 검출하였다. 염색된 조직은 명시야 현미경(bright-field microscopy)을 통해 분석하였다.

7. 음식 섭취 측정

음식 섭취는 이전에 보고된 대로 측정하였다. 간단히 설명하면, 마우스를 개별적으로 케이지에 넣고, 적응을 위해 적어도 3일 이상의 시간을 주었다. 미리 무게를 측정한 음식을 케이지 호퍼에 두었고, 명암 주기를 거친 24시간 후에 잔여 음식의 무게를 측정하였다. 유사하게, 암 주기를 거친 12시간 후, 음식 섭취를 측정하였다. 마우스가 엎지르거나 저장하는 특성으로 인한 일반적인 오류를 최소화하기 위하여, 사전에 주의를 기울였다. 따라서, 깨지거나 매우 작은 음식 조각도 수집하여, 오류를 최소화하고자 하였다. 시험 직전, 모든 시험 당일에 매번 새로 청소하였다. HFD 음식 섭취 측정에 있어서, 이동할 때 음식이 깨지는 것을 최소화하기 위해, 손가락의 압력을 이용하여 음식 펠렛을 단단하게 만들었다. 칼로리 섭취는 음식 그램당 Kcal를 계산하였다(회사 데이터 시트로부터 정보 수집, HFD, D12492 pellets; Research Diets; CD, D12450B pellets; Research Diet). 오류를 최소화하기 위해서, 상기 언급된 바를 엄격히 따르도록 사전에 주의를 기울였다.

8. PDK2 우성-음성 재조합 아데노바이러스의 뇌혈관내 주사 및 시상하부 표적 감염

PDK2 우성-음성(dominant-negative; DN) 재조합 아데노바이러스(adenovirus; Ad) (Ad-PDK2 DN) 구조체는 이전에 보고된 대로 제작하였다. 간단히 설명하면, PDK2 DN 돌연변이 R157A는 Quick Change II site-directed mutagenesis kit (Stratagene)로 위치-지정 돌연변이를 통해 제작하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다. 정방향(forward), 5′-CCAGTACTTCCTGGACGCCTTCTACCTCAGC-3′ 및 역방향(reverse), 5′-GCTGAGGTAGAAGGCGTCCAGGAAGTACTGG-3′. PDK2 DN 돌연변이에 대한 재조합 아데노바이러스는 pAd-Track-CMV shuttle vector를 이용하여 제작하였다. Ad-PDK2 DN 및 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 아데노바이러스는 HEK-293 세포에서 증폭되었고, CsCl 차등 원심분리를 통해 정제되었다. 마우스에 STZ 투여 7일 전, PDK2 DN 및 GFP 구조체를 발현하는 Ad-PDK2 DN (1.0 × 10⁹ plaque-forming units)은 뇌혈관내(intracerebroventricular; ICV) 주사를 통해, 브레그마(bregma) 기준 0.5mm 후방 및 두개골 표면 기준 5mm 아래의 정중선(midline) 좌표로 제3 뇌실에 전달되었다. 아데노바이러스 감염 7일 후, STZ를 복막 내로 주사하였고, 당뇨병 유발 3주 후까지 음식 섭취 및 혈당 수준을 측정하였다. 아데노바이러스 감염 28일 후, 마우스를 희생시켰고, 시상하부 조직을 빠르게 수집하였으며, 뉴로펩타이드 및 전염증성 사이토카인 발현을 측정하기 위해 사용하였다.

9. 뇌실내 도관 삽입 및 시상하부 PDK2 및 젖산 생산 억제를 위한 약물 억제제 주입

연령을 일치시킨 수컷 WT (8-10-주령)를 마취시켰고, 가이드 도관(Plastics One)을 브레그마(bregma) 기준 0.5mm 후방 및 두개골 표면 기준 4.5mm 아래의 정중선(midline) 좌표로 제3 뇌실에 삽입하였다. 도관 삽입 후, 음식 및 물은 마음대로 먹을 수 있도록 제공하여 개별적으로 마우스를 사육하였고, 몸무게 및 음식 섭취는 매일 측정하였다. 적어도 수술 회복 1주일 후, 억제제가 첨가되지 않았거나 첨가된, 5μl 이동액(인공 뇌척수액; artificial cerebrospinal fluid; ACSF)을 도관을 통해 제3 뇌실에 주입하였다. 당뇨병에 따른 시상하부 염증 발병 및 이에 따른 음식 섭취 행동 변화에 있어, 시상하부 PDK2의 억제 및 젖산 생산 효과를 확인하기 위해서, 4-[3-chloro-4-[[(2R)-3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropanoyl]amino]phenyl]sulfonyl-N,N-dimethylbenzamide(AZD7545; a PDK2 억제제; 6.4 nM CSF 농도, 5 μl) 및 3-[[3-[(Cyclopropylamino)sulfonyl]-7-(2,4-dimethoxy-5-pyrimidinyl)-4-quinolinyl]amino]-5-(3,5-difluorophenoxy)benzoic acid(GSK2837808A; 젖산 디하이드로게나제의 저분자 억제제; 2μg CSF 농도, 5 μl) 또는 sodium oxamate(Oxamate; 젖산 디하이드로게나제의 저분자 억제제; 25μg CSF 농도, 5 μl); 또는 이동액(ACSF 또는 1% (v/v) DMSO, 5 μl)을 여러 차례 icv 주사하여 마우스의 제3 뇌실로 전달하였다. 밤 상태에서 12시간 마다 음식 섭취를 측정하였고, 몸무게는 주사시 측정하였다.

10. 정량화 및 통계 분석

면역조직화학분석을 위해서, 3-4 조직 절편/동물에서의 시상하부 현미경 이미지를 얻었다(5, 10 또는 20 대물렌즈 사용). 통계분석을 위해, 전체 조직을 대표할 수 있는 결과를 얻기 위한, 적어도 3개 이상의 현미경 이미지를 임의로 선택하였다. 면역형광세기를 측정하기 위해서, 전체 이미지 영역을 선택하였고, 평균 세기는 ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 측정하였다. 마찬가지로, 웨스턴 블랏을 통해 얻어낸 밴드 세기는 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 또한, 밴드의 배경 세기도 측정하였고, 이를 얻어진 수치로부터 빼고 계산하였다. 그래프는 모든 이미지의 평균을 나타낸다. 통계 분석은 GraphPad Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)로 수행하였다. 모든 결과는 평균 ± 표준편차(means ± standard errors; SE)로 나타냈다. 통계 비교는 Student's　t　test를 사용하여 수행하였다. 0.05 미만(p　< 0.05)의 p 수치에 따른 편차에 대해 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

< 실시예 1> 당뇨병성 시상하부 내 PDK2의 발현 및 활성이 증가

당뇨병 유도 시상하부 병리학에 있어, PDKs의 역할을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 우선 STZ 투여 또는 HFD 식이를 제공한 마우스로부터 분리된 시상하부 조직에서 PDK 이성질체(PDK1-4)의 발현 및 활성을 실시간 RT-PCR, 웨스턴 블랏 분석 및 면역염색분석을 사용하여 확인하였다. STZ 투여 1, 2, 3 및 6주 후와, HFD 식이 제공 16주 후에, 대조군/CD 식이 제공 동물에 비해 당뇨병 및 비만 마우스 유래 시상하부 조직에서 다른 Pdk1, Pdk3 또는 Pdk4 mRNA와 달리, Pdk2 mRNA의 발현이 상당히 증가하였다는 것을 밝혀냈다(도 1A 및 도 1C). 유사하게도, 대조군 동물에 비해 STZ 투여/HFD 식이 제공 후, 마우스 시상하부 내에서 PDK2 및 인산화된 PDH 단백질(p-S²⁹³-PDH 및 p-S³⁰⁰-PDH)의 수준도 눈에 띄게 증가하였다(도 1B 및 도 1D). 다음으로, 본 발명자들은 전체 뇌 내에서 PDK2 발현을 관측하기 위해 면역염색분석을 수행하였는데, 이로 인해 STZ 투여 3주 후, PDK2가 시상하부 궁상핵(arcuate nucleus; ARC)에서 주로 발현된다는 점을 확인하였다. STZ 투여 3주 후와 HFD 식이 제공 16주 후에, 시상하부에서의 PDK2 및 GFAP(CNS 내 성상세포 마커), βIII-tubulin(뉴런 마커) 또는 Iba-1(CNS 내 미세아교세포 마커)의 이중 면역염색 결과, PDK2는 성상세포 및 뉴런에 주로 동시-위치화되는 것으로 나타났다(도 1E, 도 1F 및 도 1G). 이는 당뇨병/비만 동물의 해마에서 PDK2를 발현하는 주요 세포 형태가 성상세포 및 뉴런이라는 것을 나타낸다. 뇌의 연속적인 절편에서의 PDK2 및 AgRP 또는 POMC의 면역염색 결과, PDK2는 AgRP 양성 세포에서 대부분 발현되지만(도 1H), POMC 양성 세포에서는 발현되지 않는 것으로 나타났다. 상기 결과는 당뇨병/비만 유도시, 시상하부 성상세포 및 뉴런에서 PDK2 발현 및 활성을 증가시키는 것으로 나타났는데, 이는 PDK2가 당뇨병 및 비만과 관련된 시상하부 병리학에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

< 실시예 2> 마우스에서 당뇨병/비만-유도 음식/ 칼로리 섭취 증가 및 고혈당 증(hyperglycemia) 심각성을 감소시키는 Pdk2 결핍 효과

시상하부 ARC에서의 PDK2 발현 및 활성 증가로 인해, 본 발명자들은 PDK2 상향조절이 시상하부 기능장애 및 당뇨병/비만에 의해 유도되는 식이 행동 및 고혈당증을 포함하여 이와 관련된 비정상적 증상 발병에 중요한 역할을 할 수도 있다고 추정하였다. 상기와 같은 추정은 Pdk2 KO 마우스를 사용하여 확인하였다. 본 발명자들은 STZ 투여 전부터 투여 3주 후 기간(도 2A 및 도 2B)과, HFD 식이 후 24주 기간(도 2E 및 도 2F)에 WT 및 Pdk2 KO 마우스의 식이 행동 및 혈당 상태를 비교하였다. 당뇨병/비만-유도 식이 증가 행동 및 고혈당증 심각성은 Pdk2 결핍시 상당히 감소되었다(도 2B, 도 2C 및 도 2F). 대조 식이 분석 결과, 당뇨병성 KO 마우스에서는 고혈당증 심각성이 감소되는 것으로 확인되었는데, 이는 음식 섭취가 줄어들었기 때문이다(도 2D). 상기 결과는 당뇨병/비만에 의해 유도되는 식이 행동 관련 시상하부 발병과 고혈당증 심각성에 있어, PDK2가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

< 실시예 3> 마우스에서 당뇨병-유도 음식 섭취 증가 및 고혈당증 심각성을 감소시키는 시상하부 Pdk2의 기능적 억제 효과

당뇨병에서 시상하부 PDK2의 역할을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 아데노바이러스-PDK2 우성 음성(adenovirus-PDK2 dominant negative; Ad-PDK2 DN)을 ICV 경로로 제3 뇌실에 주입하였다(도 3A). Ad-PDK2 DN 주입은 시상하부 내 p-S²⁹³-PDH 및 p-S³⁰⁰-PDH 단백질의 발현을 Ad-PDK2 DN 주입 4주 후와 STZ 투여 3주 후에 상당히 감소시켰다(도 3B). 흥미롭게도, 시상하부 PDK2를 기능적으로 억제하거나, Ad-PDK2 DN에 의해 PDH 활성을 향상시키면, 당뇨병-유도 음식 섭취 증가 및 고혈당증 심각성을 감소시켰다(도 3C 및 도 3D). 이와 유사하게, STZ 투여 3주 후, 당뇨병성 시상하부에서 PDH 활성화는 식욕자극(Npy 및 AgRP) 및 식욕억제(Pomc) 뉴로펩타이드 mRNA의 발현을 개선시켰고, 전염증성 사이토카인 mRNA 발현을 감소시켰다. 상기 결과는 당뇨병에 의해 유도되는 시상하부 염증 및 식이 행동과 관련된 뉴로펩타이드성 회로의 조절장애에 있어, 시상하부 PDK2가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

< 실시예 4> 마우스에서 당뇨병-유도 음식 섭취 증가를 감소시키는 시상하부 Pdk2 및 젖산 생산의 약물 억제 효과

시상하부 내에서 당뇨병 유도 상향 조절된 PDK2 및 젖산 생산이 비정상적인 식이 행동 발병에 중요한 영향을 미치는지에 대해, 시상하부 PDK2 및 젖산 디하이드로게나제를 약물로 억제하여 규명하였다. AZD7545는 PDK2를 억제하기 위해 사용되었고, 젖산 디하이드로게나제 억제제인 GSK2837808A 및 Oxamate는 젖산 생산을 억제하기 위해 사용되었다. AZD7545 (6.4 nM of CSF concentration/2 days) 또는 GSK2837808A (2 μM of CSF concentration/3 days) 또는 Oxamate (2 μg/2 days)를 여러 차례 icv 투여시, 당뇨병-유도 식이 섭취 증가가 상당히 감소하는 것을 확인하였다(도 4B 및 도 4C). 하지만, 대조군 단독 투여시에는 당뇨병-유도 식이 섭취 증가 행동에 변화가 없었다. 또한, 시상하부 PDK2 및 젖산 생산을 억제하는 약물 투여는 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현을 감소시켰다. 상기 결과는 당뇨병에서의 식이 행동 조절장애에 시상하부 PDK2가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 PDK2 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 억제용 약학조성물.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase; PDH) 활성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 식욕 억제용 약학조성물.
PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 PDK2 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 식욕 억제용 건강기능식품 조성물.
PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 PDK2 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 폭식증 또는 습관성 과식증 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
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삭제
제7항에 있어서, 상기 약학조성물은 피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase; PDH) 활성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 폭식증 또는 습관성 과식증 예방 또는 치료용 약학조성물.
제7항에 있어서, 상기 폭식증 또는 습관성 과식증은 비만 또는 당뇨병으로 인한 것을 특징으로 하는 폭식증 또는 습관성 과식증 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 PDK2 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 폭식증 또는 습관성 과식증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.