KR20200124017A

KR20200124017A - Pdk2 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20200124017A
Application number: KR1020190047346A
Authority: KR
Inventors: 석경호; 이인규; 라흐만하비부르
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 경북대학교병원
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2020-11-02

Abstract

본 발명은 PDK2 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물에 대한 것으로, 본 발명에서는 고지방 식이로 유도된 비만-관련 제2형 당뇨병성 마우스의 해마에서 PDK2의 발현 및 활성이 증가되었고, PDK2를 결핍시키면 인지기능 장애가 개선되는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에서는 PDK2 억제제가 비만 또는 당뇨병의 주요 합병증인 인지기능 장애 예방 및 치료제로 활용될 수 있다는 가능성을 제시하였다.

Description

PDK2 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물{Composition for improving cognitive decline comprising PDK2 inhibitor}

본 발명은 피루브산 디하이드로게나제 키나제 2(pyruvate dehydrogenase kinase 2; PDK2) 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물에 대한 것이다.

피루브산 디하이드로게나제 키나제 2(pyruvate dehydrogenase kinase 2; PDK2)는 글루코스 대사에 중요한 역할을 하는 미토콘드리아 효소 피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase; PDH) 복합체의 주요 조절자 중 하나이다. 또한, PDK 이성질체(PDK1-4) 및 피루브산 디하이드로게나제 포스파타제는 PDH의 가역성 인산화를 통해 피루브산 디하이드로게나제 복합체 활성을 주로 조절한다. PDK 이성질체는 여러 말초 및 중추 신경 조직에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 또한, PDKs는 뉴런, 신경교세포(glia) 및 면역세포의 당분해 대사 조절에 있어, 중요한 역할을 담당하는데, 알츠하이머, 뇌 노화, 교모세포종(glioblastoma) 및 허혈성 뇌질환을 포함하는 여러 신경 대사 장애에서의 병리학적 역할이 밝혀졌다. 본 발명자들은 이전 연구에서 쥐 당뇨병 모델을 사용하여, PDK가 통증성 말초 당뇨병성 신경병증의 병리 기전에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 하지만, 해마에서의 PDK2에 대한 병리학적 역할이나, 비만 및 당뇨병과 관련된 인지기능 손상과의 관련성에 대해서는 현재까지 알려진 바 없다.

한국공개특허 제10-2017-0108967호 (2017.09.27. 공개)

이에, 본 발명에서는 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.

본 발명은 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

도 1은 비만에 따른 해마 내 PDK2 및 인산화 PDH의 발현 결과를 나타낸다. (A) HFD/CD 식이 제공 8, 16 및 24주 후, 마우스 뇌의 해마에서 Pdk2 mRNAs의 발현을 실시간 RT-PCR로 측정한 결과이다. (B) HFD 식이 제공 8 및 16주 후, 해마에서 PDK2 및 인산화-PDH(p-S293-PDH 및 p-S300-PDH)의 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 측정한 결과이다. *, p < 0.05 versus CD. (C) HFD/CD 식이 제공 8주 후, 해마와 해마 내부 CA1, CA2 및 CA3 영역에서 PDK2 발현을 나타내는 면역형광분석 결과이다. 스케일 바: 100 ㎛ (해마) 및 200 ㎛ (해마 내부 영역), w: 주(week(s)), CD: 대조군 식이(control diet), HFD: 고지방 식이(high-fat diet), SEM: 평균의 표준편차(standard error of mean).
도 2는 HFD 유도-비만 마우스의 해마 내에서 전염증성 사이토카인의 발현 증가, 신경교세포 증식(gliosis) 및 신경퇴행이 Pdk2 결핍시 감소된다는 결과를 나타낸다. (A) HFD 식이 제공 8주 후, 해마 내 Tnf -α, Il - 1β 및 Il -6 mRNAs의 상대적 발현을 실시간 RT-PCR로 측정한 결과이다. (B) GFAP[성상세포(astrocytes) 마커] 및 (C) Iba-1[미세아교세포(microglia) 마커] 면역염색분석을 통해, HFD-유도에 의한 해마 내 신경교세포 증식 변화를 측정한 결과이다. 스케일 바: 400 ㎛. (D) 해마 내 신경퇴행에 대한 비만의 영향을 HFD 식이 제공 8주 후 마우스에서 fluoro-jade C 염색을 통해 측정한 결과이다. 스케일 바: 100 ㎛. *, p<0.05 versus STZ-처리 WT 동물. #, p<0.05 versus indicated groups, Student's t test, n =3. WT: 야생형(wild type), KO: 녹아웃(knockout), w: 주(week(s)), CD: 대조군 식이(control diet), HFD: 고지방 식이(high-fat diet), FJC: fluoro-jade C, NS: 유의성 없음, SEM: 평균의 표준편차(standard error of mean).
도 3은 Pdk2 유전자의 유전적 결핍이 HFD-유도 인지기능 손상을 개선시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 신물질 탐색(novel object recognition; NOR) 시험을 사용하여, HFD-식이 제공 마우스에서의 기억 손상을 측정한 결과이다. (B) Y-미로 시험을 사용하여 공간 인지기능 손상을 측정한 결과이다. *, p<0.05 versus the CD; #, p<0.05 between the indicated groups, Student's t-test, n= 5-6. WT: 야생형(wild type), KO: 녹아웃(knockout), w: 주(week(s)), CD: 대조군 식이(control diet), HFD: 고지방 식이(high-fat diet), DI: 판별지수(differentiation index), NS: 유의성 없음, SEM: 평균의 표준편차(standard error of mean).

이에, 본 발명자들은 고지방 식이(high-fat diet; HFD) 유도한 제2형 당뇨병 마우스의 해마에서 PDK2의 발현 및 활성이 증가하는 것을 확인하였는데, 이는 PDK2가 해마 병리학 및 이와 연관된 인지기능 장애와 긴밀히 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 비만 마우스에서 Pdk2 유전자를 제거하면, 인지기능 장애가 개선되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 해마의 PDK2가 비만 및 당뇨병과 관련된 인지기능 손상에 잠재적인 치료 표적이 될 수 있다는 것을 뒷받침한다. 따라서, PDK2 억제제는 비만 및 당뇨를 포함한 여러 대사 질환의 주요 합병증인, 당뇨병성 뇌병증과 관련된 인지기능 손상 예방 또는 치료에 유용한 약물로서 고려될 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상세하게는, 상기 PDK2 발현 억제제는 PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 PDK2 활성 억제제는 PDK2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 인지기능 장애는 비만 또는 당뇨병으로 인한 인지기능 장애일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 마우스 사육 및 관리

모든 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회에서 승인된 동물 프로토콜 및 가이드라인에 따라 수행되었다(Approval No., KNU-2012-73/66). 사용된 동물의 수 및 동물의 고통을 최소화시키기 위해 모든 노력을 다하였다. 6주령 수컷 야생형(WT, Pdk2+/+) 및 Pdk2 녹아웃 마우스가 사용되었다. Pdk2 KO 마우스는 이전에 보고된 대로 제작하였다(Biochem J, 2012, 443(3), 829-839). C57BL/6J 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 연령을 일치시킨 WT 마우스를 생산하였는데, 이는 Pdk2 KO의 유전적 배경을 안정화시키는데 사용되었다. 유전형은 이전에 보고된 바에 따라, 게노믹 DNA를 PCR 분석하여 확인하였다. 동물들은 12 시간의 명암 주기(lights on 07:00-19:00)로, 23 ± 2 ℃의 일정한 온도 조건하에서, 음식 및 물은 마음대로 먹을 수 있도록 제공하여 사육되었다. 단일 실험 목적에 따라 각각의 개별적인 동물들을 사용하였다.

2. 고지방 식이 모델

고지방 식이(High-fat diet; HFD) 마우스는 비만 및 제2형 당뇨병에 대한 효과적인 모델로서, 비만 및 제2형 당뇨병의 기작 연구에 흔히 사용되며, 새로운 치료제를 개발하기 위한 도구로서 사용된다. 6주령 수컷 WT (C57BL/6J)에 고지방 식이가 제공되었는데, 탄수화물로부터 칼로리의 20% 및 지방으로부터 칼로리의 60%가 제공되었다(D12492 pellets; Research Diets, Inc.). 대조군 동물에는 동일 칼로리의 저지방 식이/대조 식이(control diet; CD)가 제공되었는데, 탄수화물로부터 칼로리의 70% 및 지방으로부터 칼로리의 10%가 제공되었다(D12450B pellets; Research Diets, Inc.). 마우스들은 12 hr의 명암 주기로, 22 ± 2 ℃의 온도 조건을 유지하면서 사육되었다. 실험 시간 시점에 따라 마우스들을 희생시켜, 조직을 빠르게 수집하였고, 이후 실험을 위해 샘플들은 즉시 -80 ℃에 보관하였다.

3. 정량적 실시간 역전사 PCR

깊게 마취시킨 마우스는 혈액을 제거하기 위해서 0.1 M PBS로 대동맥 관류시켰고, 해마 조직을 재빨리 절단하였다. 그 후, 총 RNA를 분리하기 위해서, 샘플들을 즉시 액체질소에 동결시켰고, 곧바로 TRIzol reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA)로 균질화시켰다. first strand cDNA synthesis kit (MBI Fermentas, Hanover, Germany)를 사용하여, 각각의 샘플로부터 총 RNA (2 μg)를 cDNA로 역전사시켰다. one-step SYBR®PrimeScriptTM RT-PCR kit (Perfect Real-Time; Takara Bio Inc., Tokyo) 및 ABI Prism® 7000 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여, 제조사의 지시에 따라 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 유전자 발현의 상대적 차이를 계산하기 위하여, 2-ΔΔCT 방법을 사용하였고, 내부 대조군으로 Gapdh을 사용하였다. 실시간 RT-PCR에 사용된 프라이머들의 염기 서열은 다음과 같다. Pdk1, 정방향(forward), 5′-CAC CAC GCG GAC AAA GG-3′, 역방향(reverse), 5′-GCC CAG CGT GAC GTG AA-3′; Pdk2, 정방향(forward), 5′-CCC CGT CCC CGT TGT C-3′, 역방향(reverse), 5′-TCG CAG GCA TTG CTG GAT-3′; Pdk3, 정방향(forward), 5′-GGA GCA ATC CCA GCA GTG AA-3′, 역방향(reverse), 5′-TGA TCT TGT CCT GTT TAG CCT TGT-3′; Pdk4, 정방향(forward), 5′-CCA TGA GAA GAG CCC AGA AGA-3′, 역방향(reverse), 5′-GAA CTT TGA CCA GCG TGT CTA CAA-3′; Tnf -α, 정방향(forward), 5′-ATG GCC TCC TCA TCA GTT C-3′, 역방향(reverse), 5′-TTG GTT TGC TAC GAC GTG-3′; Il - 1β, 정방향(forward), 5′-AAG TTG ACG GAC CCC AAA AGA T-3′, 역방향(reverse), 5′-TGT TGA TGT GCT GCT GCG A-3′; Il -6, 정방향(forward), 5′-AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA-3′, 역방향(reverse), 5′-TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC-3′; Gapdh, 정방향(forward), 5′-TGG GCT ACA CTG AGC ACC AG-3′, 역방향(reverse), 5′-GGG TGT CGC TGT TGA AGT CA-3′.

4. 웨스턴 블랏 분석

마우스 해마 조직은 절단하여, 얼음으로 차게 한 PBS로 씻어냈고, Halt™ protease inhibitor (1×) 및 phosphatase protease inhibitor cocktails (1×) (Thermo Scientific)가 포함된, 300 μL 용해 완충액(150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mMTris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA; GenDEPOT, Barker, TX)에 넣어 두었다. 검체는 각각 균질화시킨 후, 13,400 ×g로 4 ℃에서 15분 동안 원심분리시켰다. 단백질 농도는 Bio-Rad Laboratories Protein Assay Kit으로 측정하였고, 표준액으로는 소혈청알부민을 사용하였다. 각 샘플 유래 단백질(20-30 μg)은 8% 또는 15% SDS-PAGE 젤 상에서 분리하였고, 반건조 전사-블롯팅(semi-dry electro-blotting) 방법을 통해 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 멤브레인은 5% 스킴 밀크로 차단시켰고, PDK2 (rabbit polyclonal antibody, 1:1000; Abgent, San Diego, CA), phospho-Ser293-PDH-E1α (pyruvate dehydrogenase E1α) (rabbit polyclonal antibody, 1:1000; Calbiochem), phospho-Ser300-PDH-E1α (pyruvate dehydrogenase E1α) (rabbit polyclonal antibody, 1:1000; Calbiochem), PDH-E1 (rabbit monoclonal antibody, 1:1000; Cell Signaling) 및 α-tubulin (mouse monoclonal antibody, 1:2000; Sigma-Aldrich)에 대한 1차 항체로 반응시켰고, 연속적으로 horseradish peroxidase-접합 2차 항체 (anti-rabbit and anti-mouse IgG antibody; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)로 반응시킨 후, 향상된 화학발광 검출 분석(Amersham Biosciences)을 수행하였다. 웨스턴 블랏팅은 각 조건에 대해 3번 반복하였다(n = 3).

5. 면역조직화학분석

마우스를 깊게 마취시킨 후, 0.1 M 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 대동맥 관류시켰고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde; PFA)로 고정시켰다. 전체 뇌 조직을 수집하였고, 동일한 PFA로 밤새도록 후-고정시켰으며, 0.1 M PBS에 녹인 30% 수크로스를 이용하여, 4 ℃에서 밤새도록 저온보관하였다. 뇌조직의 20-μm 두께 관상면 절편(coronal sections)을 제조하기 위해서 저온유지장치(cryostat)를 사용하였다. 절편된 뇌조직을 젤라틴-코팅된 슬라이드에 마운팅시켰고, 조직 절편은 0.1 M PBS에 넣어 두었다. 그 후, 절편들은 0.3% Triton X-100에 녹인 4% 정상 혈청으로 상온에서 90분 동안 차단시켰다. 면역형광 염색을 위해, 절편들은 PDK2 (rabbit, 1:200; Abgent, San Diego, CA), Iba-1 (goat, 1:200; Novus biologicals, Littleton, CO) 또는 GFAP (mouse, 1:500; Novus biologicals, Littleton, CO)에 대한 1차 항체로 4 ℃에서 밤새도록 반응시킨 후, FITC-접합 2차 항체(1:200; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로 반응시켰다. 슬라이드를 씻어냈고, Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 커버슬립하였고, 형광현미경 하에서 가시화시켰다.

6. Fluoro -Jade C 염색

슬라이드를 포함하는 마우스 뇌 절편을 fluoro-jade C (FJC)로 염색하였다. 간단히 설명하면, 조직 슬라이드를 100% 에틸 알코올에 3분 동안 담근 후, 70% 알코올에 1분 동안, 그리고 증류수에 1분 동안 담갔다. 그 후, 슬라이드를 0.06% 과망간산 칼륨(potassium permanganate) 용액에 옮기고, 회전 플랫폼에서 15분 동안 천천히 흔들었다. 슬라이드를 증류수로 1분 동안 헹군 후, FJC 염색 용액(증류수에 녹인 0.1% 아세트산 함유 10mg FJC 저장 용액으로부터 0.001%를 사용 용액으로 제조)으로 옮겼고, 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 염색 후, 절편은 증류수로 1분 동안 각각 3번 헹구었다. 잔여 증류수를 떨어내고, 슬라이드를 재빨리 슬라이드 워머(slide warmer) 또는 핫-에어 건(hot-air gun)으로 공기 건조시켰다. 건조시, 슬라이드를 자일렌에 담그고, permount mounting media (Fisher Chemical, U.S.A)로 커버슬립하였다. 염색된 조직은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC)를 가시화하기 위한 적절한 필터 시스템을 사용하여 형광현미경으로 관찰하였다.

7. 신물질 탐색 시험(Novel object recognition test)

신물질 탐색(novel object recognition; NOR) 시험은 이전에 보고된 대로 수행하였다. NOR 시험은 각각의 마우스에 대해 습관화 단계(5분/1일), 훈련 단계(10분/1일) 및 시험 단계(10분/1일)를 포함하여 3일 동안 수행하였다. 금속 실린더(직경 7 cm; 높이 10 cm) 및 모래가 채워진 직사각형 플라스틱 육면체(5 cm × 5 cm × 10 cm)를 사용하여 시험을 수행하였다. 습관화 단계 동안, 마우스는 물체가 없는 시험 공간에 5분 동안 적응하도록 하였다. 훈련 단계 동안, 벽으로부터 3 cm 떨어진 공간의 반대편 구석에 놓인 두 개의 동일한 물체에 마우스를 노출시켰고, 마우스는 10분 동안 물체를 탐색하도록 하였다. 시험 단계 동안, 이전 위치 중 하나에는 익숙한 물체를 놓고, 나머지 위치에는 새로운 물체를 놓은 공간에 마우스를 넣었다. 각각의 물체를 탐색하는데 소요되는 총 시간을 10분 동안 기록하였다. 탐색은 물체로부터 3 cm 내에 있거나, 코로 물체를 만지는 것을 의미한다. 물체는 잔류 냄새를 제거하기 위하여 실험 사이에 깨끗하게 유지하였다. 상대 탐색 시간은 판별 지수(discrimination index)[(DI) = (새로운 물체에서의 소요 시간 - 익숙한 물체에서의 소요 시간)/(새로운 물체에서의 소요 시간 + 익숙한 물체에서의 소요 시간)]를 사용하여 측정하였다. N은 새로운 물체 근처에서의 소요 시간을 나타내고, F는 익숙한 물체 근처에서의 소요 시간을 나타낸다. 따라서, 양성 DI 수치는 마우스가 익숙한 물체보다 새로운 물체를 탐색하는데 더 많은 시간을 소요했다는 것을 나타내는 반면, DI가 0이면 마우스가 두 물체를 탐색한 시간이 동일하다는 것을 나타낸다.

8. Y-미로 시험

Y-미로 시험은 이전 보고된 방법에서 약간 변형하여 수행하였다. Y-미로 기구 내 자발적 교대 행동을 이용하여 공간 인지 능력을 확인하였다. Y-미로는 3개의 팔을 가진 수평 미로(길이, 40 cm; 너비, 3 cm; 벽 높이, 12 cm)로서, 3개의 팔은 서로 동일한 각도에 있다. 동물들을 미로의 중앙에 두고, 7분 동안 자유롭게 이동하도록 하였다. 일련의 팔 입장을 시각적으로 기록하였다. 마우스 뒷발이 팔 내에 완전히 위치했을 때, 팔 입장이 완료된 것으로 판단하였다. 자발적 교대 행동은 각각의 연속적인 선택에 따라 다른 팔 내로 입장하는 것을 의미한다(i.e., ABC, CAB 또는 BCA; 다만, BAB는 아님). 어떠한 잔류 냄새도 없애기 위해 각 실험 전에, 미로의 팔은 물로 깨끗하게 하였다. 교대의 백분율은 [교대수/전체 팔 입장]×100으로 정의하였다.

9. 정량화 및 통계 분석

웨스턴 블랏 밴드 세기를 정량화하기 위해서, ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하였다. 통계 분석은 GraphPad Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)로 수행하였다. 모든 결과는 평균 ± 표준편차(means ± standard errors; SE)로 나타냈다. 통계 비교는 Student's　t　test를 사용하여 수행하였다. 0.05 미만(p　< 0.05)의 p 수치에 따른 편차에 대해 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

< 실시예 1> 해마 내 PDK2의 발현 및 활성이 증가된 HFD -유도 비만 마우스

비만 및 당뇨병과 관련된 해마 병리학에 있어, PDKs의 역할을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 우선 HFD 식이를 제공한 마우스로부터 분리된 해마 조직에서 PDK 이성질체(PDK1-4)의 발현 및 활성을 실시간 RT-PCR, 웨스턴 블랏팅 및 면역염색분석을 사용하여 확인하였다. HFD 식이 제공 8, 16 및 24주 후에, 해마 조직에서 다른 Pdk 이성질체와 달리, Pdk2 mRNA의 발현이 상당히 증가하였다는 것을 밝혀냈다(도 1A). 유사하게도, CD-식이 동물에 비해 HFD 식이 제공 8주 후, 해마 내에서 PDK2 및 인산화된 PDH 단백질(p-S²⁹³-PDH 및 p-S³⁰⁰-PDH)의 수준도 눈에 띄게 증가하였다(도 1B). 다음으로, 본 발명자들은 해마 내에서 PDK2 발현을 관측하기 위해 면역염색분석을 수행하였는데, 이로 인해 PDK2가 CA2 및 CA3 영역에서 주로 발현된다는 점을 확인하였다(도 1C). 상기 결과는 해마 병리학과, 비만 및 당뇨병과 관련된 인지기능 손상에 있어, 해마 내 PDK2의 발현 및 활성 증가가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

< 실시예 2> Pdk2 결핍에 의한 HFD - 유도 해마 염증 및 신경퇴행 감소 효과

비만 마우스 해마에서의 PDK2 발현 및 활성 증가로 인해, 본 발명자들은 PDK2가 비만 및 당뇨병과 관련된 해마 병리학에 중요한 역할을 할 수도 있다고 추정하였다. 해마 내에서 HFD-유도 신경염증의 역할을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 우선 비만 마우스에서 전염증 사이토카인의 발현 및 신경교세포 특성 변화를 확인하였다. 유전자 발현 분석 결과, 마우스에 HFD 식이를 제공하면 해마에서 Tnf -α mRNA 발현이 증가하는 반면, Pdk2-결핍 마우스에서 상기 사이토카인 발현 수준은 상당히 감소되는 것으로 밝혀졌다(도 2A). 다음으로, 마우스 뇌 절편을 anti-GFAP 및 anti-Iba-1 항체로 면역염색하였는데, 이는 각각 성상세포(astrocytes) 및 미세아교세포(microglia)를 표지하기 위함이다. 면역형광분석 결과, HFD 식이 제공 8주 후, 비만 마우스 해마에서 GFAP 및 Iba-1의 면역반응성이 증가되는 것을 확인하였다(도 2B 및 도 2C). 본 발명자들은 비만 마우스의 해마 내에서 GFAP-양성 성상세포(astrocytes) 및 Iba-1-양성 미세아교세포(microglia)의 수가 상당히 증가하는 것을 확인하였는데, 이는 2종류의 세포 형태 모두 CD 식이 제공 마우스에 비해 면역반응성이 증가하는 것으로 나타났다. HFD 식이 제공 8주 후, 해마에서 신경교세포의 형태학적 특성 및 증가된 GFAP 면역반응성은 Pdk2 KO 마우스에서 감소되었다. 또한, 뇌 조직 절편의 Fluoro Jade C(퇴행성 뉴런의 마커) 염색 분석 결과, HFD 식이 제공 마우스는 CD 식이 제공 마우스에 비해 해마 내 퇴행성 뉴런의 수가 눈에 띄게 증가한 것으로 나타났다(도 2D). 하지만, HFD-유도 해마 신경퇴행은 Pdk2-결핍 마우스에서 완화되었다. 상기 결과는 HFD-유도 신경염증과 이후 비만 및 당뇨병 관련 인지기능 손상에 있어, 해마 PDK2가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

< 실시예 3> Pdk2 결핍에 의한 마우스의 HFD -유도 인지기능 손상 약화 효과

비만 마우스의 인지기능 손상이 Pdk2 결핍에 의해 개선될 수 있는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 NOR 시험을 이용하여 마우스의 인지기능을 조사하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, WT-비만 마우스의 판별 지수(discrimination index)는 CD 식이 제공 마우스 보다 상당히 낮게 나타났다. 하지만, Pdk2-결핍 비만 마우스는 WT-비만 마우스에 비해 판별 지수가 개선되었다. Pdk2 결핍이 HFD-유도 기억 손상을 개선할 수 있는지 확인하기 위한 대체 방법으로, 본 발명자들은 Y-미로 시험을 사용하였다. 비만 마우스는 대조군에 비해 자발적 교대 행동 백분율이 감소되는 것으로 나타났는데, 이는 공간 기억 기능이 손상되었다는 것을 나타낸다. 하지만, HFD 식이 제공 16주 후, Pdk2-결핍 마우스는 이러한 비만 유도 기억 장애가 개선되는 것으로 나타났다(도 4B). 상기 결과는 비만 및 당뇨병과 관련된 인지기능 손상 과정에 PDK2가 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 PDK2 발현 억제제는 PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인지기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 PDK2 활성 억제제는 PDK2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인지기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 인지기능 장애는 비만 또는 당뇨병으로 인한 인지기능 장애인 것을 특징으로 하는 인지기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
PDK2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 PDK2 발현 억제제는 PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 PDK2 활성 억제제는 PDK2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 인지기능 장애는 비만 또는 당뇨병으로 인한 인지기능 장애인 것을 특징으로 하는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.