CN113677336B - 包含式(i)化合物和glp-1受体激动剂的组合疗法 - Google Patents
包含式(i)化合物和glp-1受体激动剂的组合疗法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含PPAR激动剂和GLP‑1受体激动剂的组合疗法。
Description
本发明涉及包含PPAR激动剂和GLP-1受体激动剂的组合疗法。
胰高血糖素样肽-1受体激动剂(或GLP-1R激动剂)是一类被提议用于治疗代谢性疾病如肥胖症和2型糖尿病的化合物。该类的几种化合物被批准用作药物，例如索马鲁肽(semaglutide)、利拉鲁肽(liraglutide)、艾塞那肽(exenatide)、利西拉肽(lixisenatide)、阿必鲁肽(albiglutide)和度拉糖肽(dulaglutide)。尽管获得了批准，但此类化合物可以从其与其他类别化合物的组合中受益，以提高其治疗效果。此外，GLP-1R激动剂引起副作用，例如胃肠道副作用。例如，索马鲁肽和利拉鲁肽的常见副作用包括恶心、呕吐、腹泻、腹痛和便秘。减少这些副作用的方法将是有利的。
本发明源于观察到将GLP-1R激动剂与PPAR激动剂(例如伊拉非诺(elafibranor))组合产生若干有益效果，例如对脂肪变性、胰岛素水平和血糖、体重调节和副作用减少的协同作用。此外，本文显示该组合开启了减少施用于有需要的对象的GLP-1R激动剂的量的可能性，从而进一步减少与GLP-1R激动剂相关的副作用。
因此，本发明涉及一种组合产品，其包含：
(i)PPAR激动剂，特别是式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
Y1表示卤素原子、Ra或Ga-Ra基团；
A表示CH＝CH或CH2-CH2基团；
Y2表示Gb-Rb基团；
Ga和Gb相同或不同，表示氧原子或硫原子；
Ra表示氢原子，未取代的(C1-C6)烷基基团，被一个或多个卤素原子取代的(C6-C14)芳基基团或(C1-C6)烷基基团，(C1-C6)烷氧基或(C1-C6)烷硫基基团，(C3-C14)环烷基基团，(C3-C14)环烷硫基基团或杂环基团；
Rb表示至少被-COORc基团取代的(C1-C6)烷基基团，其中Rc表示氢原子，或被一个或多个卤素原子取代或未被一个或多个卤素原子取代的(C1-C6)烷基基团，(C3-C14)环烷基基团，或杂环基团；并且
Y4和Y5相同或不同，表示被一个或多个卤素原子取代或未被一个或多个卤素原子取代的(C1-C6)烷基基团，(C3-C14)环烷基基团或杂环基团；
和
(ii)胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂。
在本发明的一个特定的实施方式中，Y1表示Ga-Ra基团。
在另一个特定的实施方案中，Ra表示(C1-C6)烷基基团或(C3-C14)环烷基基团。在又一个实施方式中，Ra表示被一个或多个卤素原子取代或未被一个或多个卤素原子取代的(C1-C6)烷基，或者Ra表示被一个或多个卤素原子取代或未被一个或多个卤素原子取代的(C3-C14)环烷基基团。
在本发明的另一个实施方式中，Rb表示被-COORc基团取代的(C1-C6)烷基基团，其中Rc表示氢原子或具有一至四个碳原子的烷基基团。在另一个实施方式中，Rc表示氢原子。
在式(I)化合物的一个特定的实施方式中：
A表示CH＝CH基团；
Ra表示(C1-C6)烷基或(C3-C14)环烷基基团，特别是被一个或多个卤素原子取代或未被一个或多个卤素原子取代的(C1-C6)烷基或(C3-C14)环烷基基团；
Rb表示被-COORc基团取代的(C1-C6)烷基基团，其中Rc表示氢原子或具有一至四个碳原子的烷基基团；并且
Y4和Y5独立地表示(C1-C4)烷基基团。
在式(I)化合物的一个特定的实施方式中：
A表示CH2-CH2基团；
Ga表示氧原子或硫原子并且Gb表示氧原子；
Ra表示(C1-C6)烷基或(C3-C14)环烷基基团；
Rb表示至少被-COORc基团取代的(C1-C6)烷基基团，其中Rc表示氢原子或(C1-C4)烷基基团；并且
Y4和Y5独立地表示(C1-C4)烷基基团。
在式(I)化合物的一个特定的实施方式中：
A表示CH2-CH2基团；
Ga表示氧原子或硫原子并且Gb表示氧原子；
Ra表示被一个或多个卤素原子取代的(C1-C6)烷基或(C3-C14)环烷基基团；
Rb表示被一个或多个卤素原子取代或未被一个或多个卤素原子取代并至少被-COORc基团取代的(C1-C6)烷基基团，其中Rc表示氢原子或(C1-C4)烷基基团；并且
Y4和Y5表示(C1-C4)烷基基团。
在式(I)化合物的一个特定的实施方式中，Gb是氧原子并且Rb是被-COORc基团取代的(C1-C6)烷基基团，其中Rc表示氢原子或未取代的直链或支链的(C1-C4)烷基基团。在该实施方式的一个特定变体中，Rc表示氢原子。
在式(I)化合物的一个特定的实施方式中，Y1是(C1-C6)烷硫基基团，其包含被一个或多个卤素原子取代或未被一个或多个卤素原子取代的直链或支链的(C1-C6)烷基基团。在该实施方式的一个变体中，Y1是甲硫基基团。
在一个特定的实施方式中，式(I)化合物选自1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮(伊拉非诺、ELA或GFT505)、1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸、2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸异丙酯及其药学上可接受的盐。
在本发明的一个特定的实施方式中，组分(i)是伊拉非诺或其药学上可接受的盐。
在本发明的上下文中，表述“胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂”是指GLP-1类似物和并非GLP-1类似物的GLP-1受体激动剂。GLP-1受体激动剂(也称为GLP-1R激动剂)是结合并活化GLP-1受体的化合物。说明性的GLP-1受体激动剂包括但不限于索马鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利西拉肽、洛塞那肽(loxenatide)、依格列那肽(efpeglenatide)、他司鲁肽(taspoglutide)、MKC-253、DLP-205、ORMD-0901、LY-3305677、长效胃泌酸调节素及其药学上可接受的盐。
在一个特定的实施方式中，组分(ii)是索马鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、度拉糖肽或这些化合物之一的药学上可接受的盐。
在一个特定的实施方式中，组分(ii)是索马鲁肽或其药学上可接受的盐。
在另一个特定的实施方式中，组分(ii)是利拉鲁肽或其药学上可接受的盐。
根据本发明，可选择组分(i)和(ii)使得所述化合物的组合提供协同作用。这种协同作用可以根据本领域众所周知的方法来确定，例如通过使用Excess Over Bliss(EOB，或超过最高单一药剂)方法。这种方法被FDA用于批准组合药物产品，假设预期的组合效果优于单独服用组合中最佳组分所获得的效果。如实施例所示，伊拉非诺和GLP-1R激动剂(例如索马鲁肽或利拉鲁肽)的组合对脂肪变性(肝脂肪)、甘油三酯水平、体重减轻、胰岛素水平和血糖产生协同作用。
因此，在一个特定的实施方式中，组分(i)是伊拉非诺或其药学上可接受的盐，并且组分(ii)是索马鲁肽或其药学上可接受的盐。
在另一个特定的实施方式中，组分(i)是伊拉非诺或其药学上可接受的盐，并且组分(ii)是利拉鲁肽或其药学上可接受的盐。
在一个特定的实施方式中，本发明的组合产品是在药学上可接受的载体中包含组分(i)和(ii)两者的药物组合物。
在另一个实施方式中，本发明的组合产品是包含组分(i)和组分(ii)的试剂盒，所述组分(i)和组分(ii)用于顺序、分开或同时使用。在该实施方式中，每种组分可以配制在不同的药物组合物中。
本发明中使用的药物组合物可以包含在药学范围内可接受的一种或几种赋形剂或媒介物(例如与药物用途相容并且为本领域普通技术人员所熟知的盐水溶液、生理溶液、等渗溶液等)。这些组合物还可包含一种或几种选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的试剂或媒介物。可用于这些制剂(液体和/或注射剂和/或固体)的试剂或媒介物特别是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露糖醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯树胶、脂质体等。本发明中使用的化合物可以配制成肠内或肠胃外施用。例如，可以将化合物配制成口服、血管内(例如静脉内或动脉内)、肌肉内、腹膜内、皮下、透皮或经鼻施用。制剂可以是固体或液体剂型。说明性制剂包括但不限于注射悬浮液或口服悬浮液、凝胶剂、油剂、丸剂、片剂、栓剂、粉剂、胶囊剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、或用于延长和/或缓慢释放的盖仑形式。对于这种制剂，可以有利地使用例如纤维素、碳酸盐或淀粉的试剂。
本文实施的化合物可配制成药学上可接受的盐，特别是与制药用途相容的酸或碱盐。本文实施的化合物的盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的碱加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。这些盐可以在化合物的最终纯化步骤期间获得，或者通过将盐并入先前纯化的化合物中来获得。
如上文所提供，活性成分(即组合产品的组分(i)和组分(ii))可以作为一种或多种药物组合物施用，例如以预期用于口服的丸剂或片剂的形式。
在另一个实施方式中，活性成分作为一种或多种药物组合物施用，例如以可注射溶液的形式。
在另一个特定的实施方式中，活性成分作为单独的组合物施用。
在另一个实施方式中，组分(i)是口服组合物的形式并且组分(ii)是口服组合物的形式。
在本发明的一个特定的实施方式中：
-组分(i)是用于口服施用的伊拉非诺或其药学上可接受的盐的固体组合物形式，特别是丸剂或片剂的形式，更特别是片剂；并且
-组分(ii)是用于口服施用的GLP-1R激动剂或其药学上可接受的盐的固体剂型，特别是丸剂或片剂的形式，更特别是片剂。
在本发明的一个特定的实施方式中，组分(ii)是用于口服施用的固体剂型，其包含GLP-1R激动剂和N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，如申请WO2012080471中所述。在另一个实施方式中，组分(ii)是用于口服施用的固体剂型，其包含GLP-1R激动剂和N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(也称为SNAC或沙波立沙钠)。在又一个实施方式中，组分(ii)是用于口服施用的固体剂型，其包含索马鲁肽和N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，例如SNAC。在一个特定的实施方式中，组分(ii)是片剂的形式。
在另一个实施方式中，组分(i)是口服组合物的形式并且组分(ii)是可注射溶液的形式。
在又一个实施方式中，组分(i)是可注射溶液的形式并且组分(ii)是口服组合物的形式。
在另一个实施方式中，组分(i)是可注射溶液的形式并且组分(ii)是可注射溶液的形式。
关于施用的频率和/或剂量可以由本领域普通技术人员根据待治疗的对象、待治疗的疾病、疾病的阶段、施用形式等进行调整。典型地，组分(i)，例如ELA或其药学上可接受的盐，对于伊拉非诺可以以在0.01毫克/天至4000毫克/天之间的剂量，例如对于伊拉非诺1毫克/天至2000毫克/天、特别是25至1000毫克/天、特别是50至200毫克/天并且甚至更特别是80至120毫克/天的剂量施用。在另一个特定的实施方式中，组分(ii)，例如索马鲁肽或利拉鲁肽，特别是索马鲁肽，或其药学上可接受的盐，可以以在0.001毫克/天和200毫克/天之间，例如0.01毫克/天至150毫克/天、特别是0.1毫克/天至100毫克/天的剂量施用。
在又一个特定的实施方式中，本发明的组合产品的组分的剂量如下：
-组分(i)是用于口服施用的伊拉非诺固体剂型，其剂量在0.01毫克/天至4000毫克/天之间，例如1毫克/天至2000毫克/天，特别是25至1000毫克/天，特别是50至200毫克/天并且甚至更特别是80至120毫克/天；并且
-组分(ii)是用于口服施用的索马鲁肽固体剂型，其剂量为1至20毫克/天，例如剂量为3至14毫克/天。
在本发明的另一个实施方式中，本发明的组合产品的组分的剂量如下：
-组分(i)是用于口服施用的伊拉非诺固体剂型，其剂量在80至120毫克/天之间；并且
-组分(ii)是用于口服施用的索马鲁肽固体剂型，其剂量在3至14毫克/天之间。
在本发明的又一个特定的实施方式中，本发明的组合产品的组分的剂量如下：
-组分(i)是用于口服施用的伊拉非诺固体剂型，其剂量在80至120毫克/天之间；并且
-组分(ii)是用于口服施用的索马鲁肽固体剂型，其剂量为3毫克/天、7毫克/天或14毫克/天。
在另一个实施方式中，本发明的组合产品的组分的剂量如下：
-组分(i)是用于口服施用的伊拉非诺固体剂型，其剂量在80至120毫克/天；并且
-组分(ii)是用于口服施用的索马鲁肽固体剂型，其剂量为3毫克/天、7毫克/天或14毫克/天。
在另一个实施方式中，本发明的组合产品的组分的剂量如下：
-每天施用一次包含80至120mg伊拉非诺的片剂；和
-每天施用一次包含3mg、7mg或14mg索马鲁肽的片剂。
在另一个实施方式中，本发明的组合产品的组分的剂量如下：
-每天施用一次包含80mg伊拉非诺的片剂；和
-每天施用一次包含3mg、7mg或14mg索马鲁肽的片剂。
在另一个特定的实施方式中，本发明的组合产品的组分的剂量如下：
-每天施用一次包含120mg伊拉非诺的片剂；和
-每天施用一次包含3mg、7mg或14mg索马鲁肽的片剂。
本领域技术人员可以调整口服索马鲁肽的剂量。索马鲁肽的一种口服剂型最近获得了美国食品和药物管理局(US Food and Drug administration)以及欧洲药品管理局(European Medicine Agency)的批准，商标为因此，本领域技术人员可以根据与该药物一起提供的处方信息中公开的推荐剂量来确定要施用的索马鲁肽的剂量，如用于改善患有2型糖尿病的成人的血糖控制所指示的。简要来说：
-口服索马鲁肽的施用可以从每天一次3mg开始，持续30天；
-服用3mg剂量30天后，剂量增加至每天一次7mg；并且
-如果在服用7mg剂量至少30天后需要额外的效果，例如在为改善血糖控制而施用的情况下需要额外的血糖控制，则剂量可增加至每天一次14mg。
在另一方面，本发明涉及用作药物的本发明的组合。
本发明的组合可以用于减轻体重的方法中。例如，本发明涉及用于治疗肥胖症的方法中的本发明组合。
本发明的组合还可以用于减少肝脏脂肪(也称为“脂肪变性”)。因此，本发明涉及用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法中的本发明组合。在另一个特定的实施方式中，NAFLD是纤维化NAFLD，即对象患有伴有肝纤维化的NAFLD。在另一个特定的实施方式中，NAFLD是NASH。NASH也可以是纤维化NASH，即对象患有伴有肝纤维化的NASH。
本发明的组合还可用于降低血糖。因此，本发明还涉及在用于降低血糖的方法中使用的本发明组合。本发明的组合还可用于控制胰岛素水平。因此，本发明还涉及在控制胰岛素水平的方法中使用的本发明组合。
在一个特定的实施方式中，本发明的组合用于治疗糖尿病、特别是2型糖尿病的方法中。
在另一个实施方式中，本发明的组合用于改善患有2型糖尿病的对象的血糖控制的方法中。
在本文中还显示食物摄入量不受本发明组合的施用的影响。食物摄入量的减少是GLP-1R激动剂的副作用的一个指标。因此，本文显示本发明的组合可有利地用于减少或抑制GLP-1R激动剂的副作用。
在一个特定的实施方式中，本发明的组合用于具有减少或抑制副作用的降低体重或体脂肪量的方法中。在本发明的上下文中，表述“具有减少或抑制的副作用”指示通常与单独摄入GLP-1R激动剂相关的至少一种或所有副作用(例如胃肠道副作用，例如恶心、呕吐、腹泻、腹痛和/或便秘)的减少或抑制。
在另一个实施方式中，本发明的组合用于具有减少或抑制的副作用的治疗肥胖症的方法中。
在另一个特定的实施方式中，本发明的组合用于具有减少或抑制的副作用的治疗NAFLD的方法中。在特定变体中，所述组合用于治疗纤维化NAFLD、NASH或纤维化NASH。
在又一个实施方式中，本发明的组合用于具有减少或抑制的副作用的降低血糖的方法中。
在另一个实施方式中，本发明的组合用于具有减少或抑制的副作用的降低胰岛素水平的方法中。
在另一个实施方式中，本发明的组合用于具有减少或抑制的副作用的治疗糖尿病的方法中。更特别地，本发明涉及本发明的组合，其用于具有减少或抑制的副作用的治疗2型糖尿病的方法中。
本文还表明，本发明的组合有利地允许调节体重。因此，本发明还涉及在调节体重的方法中使用的本发明的组合。
在一个特定的实施方式中，本发明的组合用于在治疗肥胖症的方法的情形下调节体重的方法中。
在另一个特定的实施方式中，本发明的组合用于在减少肝脏脂肪的方法的情形下，例如在用于治疗NAFLD的方法的情形下调节体重的方法中。在特定变体中，所述组合用于在治疗纤维化NAFLD、NASH或纤维化NASH的方法的情形下调节体重。
在又一个实施方式中，本发明的组合用于在降低血糖的方法的情形下调节体重的方法中。
在另一个实施方式中，本发明的组合用于在降低胰岛素水平的方法的情形下调节体重的方法中。
在另一个实施方式中，本发明的组合用于在治疗糖尿病例如2型糖尿病的方法的情形下调节体重的方法中。
令人惊讶的是，除了本发明的组合提供的协同作用之外，本文还表明组合产品的组分(i)和(ii)的所述组合导致在降低的组分(ii)剂量下观察到的有益效果。换言之，组分(i)可以用于减少组分(ii)的量，同时仍受益于组分(i)和组分(ii)两者的期望效果。因此可以在不影响或不显著影响所需治疗效果的情况下，获得通常使用GLP-1R激动剂时观察到的副作用的减少或抑制。因此，本发明还涉及一种PPAR激动剂，例如式(I)的化合物，其与GLP-1受体激动剂组合用于治疗需要施用GLP-1受体激动剂的病症的方法中，从而减少GLP-1受体激动剂的副作用。在这方面，与单独施用GLP-1受体激动剂时的施用量相比，GLP-1受体激动剂可以减少的量施用。例如，施用于对象的GLP-1受体激动剂的量的减少可以是至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍或甚至至少10倍。
因此，本发明还进一步涉及本发明的组合，其用于治疗需要施用GLP-1受体激动剂的病症的方法中，从而减少与GLP-1受体激动剂相关的副作用。由于本发明而减少的说明性副作用可以是以下副作用中的至少一种或全部：恶心、呕吐、腹泻、腹痛和便秘。
本发明还涉及本发明的组合，其用于治疗需要施用GLP-1受体激动剂的病症的方法中，其中施用于对象的GLP-1受体激动剂的量与单独施用时所需的GLP-1受体激动剂的量相比减少。例如，施用于对象的GLP-1受体激动剂的量的减少可以是至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍，至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍或甚至至少10倍。
在又一个实施方式中，本发明涉及如本文公开的组合产品，其用于治疗需要施用GLP-1受体激动剂的病症的方法中，其中施用组分(i)以增强组分(ii)的活性。与单独施用时所需的GLP-1激动剂的量相比，这种增强作用可有利地导致GLP-1受体激动剂的剂量减少。例如，施用于对象的GLP-1受体激动剂的量的减少可以是至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍，至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍或甚至至少10倍。
当然，上面提到的所有GLP-1受体激动剂的剂量减少也可以用相对于单独使用GLP-1受体激动剂时通常使用的剂量的百分比来表示。例如，由于本发明，减少可以是在单独使用GLP-1受体激动剂时通常使用剂量的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或甚至超过50％。
上述减少量的GLP-1受体激动剂的说明性实施可以是，例如，基于上文公开的处方信息中公开的方案，经口施用的索马鲁肽的剂量减少。下面提供了非限制性施用方案的说明，特别是用于治疗NASH(例如伴有纤维化的NASH)或改善患有2型糖尿病的对象的血糖控制的施用方案，其中GLP-1受体激动剂的剂量减少50％：
-口服索马鲁肽的施用可以从每天一次1.5mg开始，持续30天；
-服用3mg剂量30天后，剂量增加至每天一次3.5mg；并且
-如果在服用3.5mg剂量至少30天后需要额外的效果，例如在为改善血糖控制而施用的情形下需要额外的血糖控制，则剂量可增加至每天一次7mg。
在本发明的上下文中，表述“GLP-1受体激动剂适用的病症”包括但不限于其治疗将受益于GLP-1受体激动剂的施用的病症或疾病。这些病症或疾病包括但不限于糖尿病如2型糖尿病、肥胖症、NAFLD和NASH。
在本发明的上下文中，缩写ELA是指伊拉非诺。
在本发明的上下文中，缩写SEMA是指索马鲁肽。
在本发明的上下文中，缩写LIRA是指利拉鲁肽。术语“治疗”是指对有需要的对象的疾病的治愈性或预防性治疗。治疗包括将本发明的组合施用至患有已宣布疾病的对象，以预防、治愈、延迟、逆转或减缓疾病的进展，从而改善对象的状况。组合产品也可以施用于健康或有患病风险的对象。待治疗的对象是哺乳动物，优选人类。可基于与寻求治疗的特定疾病相关的若干标准，例如先前的药物治疗、相关病理、基因型、对风险因素的暴露、病毒感染，以及基于与疾病相关的任何生物标志物的检测，来选择根据本发明治疗的对象。
如果需要，可以每天一次或甚至每天数次进行施用。治疗的持续时间将取决于要治疗的具体疾病。例如，可以在一天或几天内进行施用，例如在至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少七天内。或者，施用可以进行至少一周、至少两周、至少四周。对于慢性疾病，可以考虑施用超过四周，例如至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或超过六个月，例如至少一年或几年。在一些情况下，本发明的组合产品可以在对象中终生施用。
参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
附图说明
图1：治疗40天后，10毫克/千克/天的伊拉非诺(ELA)和10纳摩尔/千克/天的索马鲁肽(SEMA)的组合对体重的影响。
图2：治疗40天后，10毫克/千克/天的ELA和10纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对体重的影响，表示为相对于第0天的相对体重增加。
图3：治疗40天后，10毫克/千克/天的ELA和10纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对肝脏甘油三酯含量的影响。
图4：治疗40天后，10毫克/千克/天的ELA和10纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对血糖的影响。
图5：治疗40天后，10毫克/千克/天的ELA和10纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对胰岛素血症的影响。
图6：治疗40天后，10毫克/千克/天的ELA和10纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对脂肪变性的影响。
图7A：治疗28天后，10毫克/千克/天的ELA和0.3或1纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对食物摄入量的影响。
图7B：治疗28天后，10毫克/千克/天的ELA和0.3或1纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对体重的影响。
图8A：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠的NAFLD活动性评分的影响。
图8B：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠的脂肪变性的影响。
图8C：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠的活动指数(气球样变和炎症评分总和)的影响。
图8D：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠中的小叶炎症的影响。
图9A：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠中的肝脏甘油三酯含量(TG)的影响。
图9B和图9C：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠中的血浆转氨酶(ALT(图9B)和AST(图9C))的影响。
图9D：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠中的CRP的影响。
图9E：治疗12周后，10毫克/千克/天的ELA和0.3纳摩尔/千克/天的索马鲁肽的组合对DIO-NASH小鼠中的肝脏羟脯氨酸的影响。
图10A：图10A显示了用于RNAseq分析的算法以在用ELA(10毫克/千克/天)、SEMA(0.3纳摩尔/千克/天)及其组合在DIO-NASH小鼠中治疗12周后在肝脏转录组学分析中鉴定病理特征、化合物的作用和受调节的途径。
图10B：在用ELA(10毫克/千克/天)、SEMA(0.3纳摩尔/千克/天)及其组合在DIO-NASH小鼠中治疗12周后，在肝脏转录组学分析中涉及ELA/SEMA组合的基因的维恩图。
图10C：在用ELA(10毫克/千克/天)、SEMA(0.3纳摩尔/千克/天)及其组合在DIO-NASH小鼠中治疗12周后，在肝脏转录组学分析中对于ELA/SEMA组合富集的前10种途径的列表。
图10D：点图显示了在用ELA(10毫克/千克/天)、SEMA(0.3纳摩尔/千克/天)及其组合在DIO-NASH小鼠中治疗12周后，ELA/SEMA组合对肝脏转录组学分析中涉及炎症途径的基因的协同作用。
图10E：在用ELA(10毫克/千克/天)、SEMA(0.3纳摩尔/千克/天)及其组合在DIO-NASH小鼠中治疗12周后，肝脏转录组学分析中纤维化基因的表达。
图11：伊拉非诺与GLP-1受体激动剂的组合协同抑制LPS活化的巨噬细胞中的TNFα分泌。(A-B)剂量-反应矩阵的TNFα分泌的抑制百分比，(C-D)根据Excess Over Bliss(EOB)相加性模型进行分析，以及(E,F)以条形图绘制的TNFα分泌，一方面是伊拉非诺与索马鲁肽之间的代表性协同组合(A-C-E)，另一方面是伊拉非诺与利拉鲁肽之间的代表性协同组合(B,D,F)。数据表示为平均值(一式四份)±标准偏差(SD)。
图12：伊拉非诺与GLP-1受体激动剂的组合协同抑制TGFβ刺激的肝星状细胞中的αSMA产生。组合以剂量-反应矩阵形式进行测试，并根据Excess Over Bliss(EOB)相加性模型进行分析。αSMA产生以用于代表性协同组合的条形图表示绘制。数据表示为平均值(一式四份)±标准偏差(SD)。
图13A：3毫克/千克/天的ELA和0.02毫克/千克/天的利拉鲁肽的组合在治疗8周后对NASH-B6小鼠肥胖的影响。每只小鼠中附睾脂肪组织(EAT)重量被表示为与体重(BW)的比率。
图13B：3毫克/千克/天的ELA和0.02毫克/千克/天的利拉鲁肽的组合在治疗8周后对NASH-B6小鼠中能量消耗的影响。
图14：3毫克/千克/天的ELA和0.02毫克/千克/天的利拉鲁肽的组合在治疗8周后对NASH-B6小鼠中肝脏胶原蛋白含量的影响。
图15：3毫克/千克/天的ELA和0.02毫克/千克/天的利拉鲁肽的组合在治疗8周后对NASH-B6小鼠中肝脏中纤维化基因表达的影响。
图16：3毫克/千克/天的ELA和0.02毫克/千克/天的利拉鲁肽的组合对NASH-B6小鼠治疗8周前后血糖演变的影响。
图17：伊拉非诺增强索马鲁肽将血浆ALT浓度降低至与高剂量索马鲁肽相似的水平的作用。治疗组中的ALT水平相对于AMLN喂养媒介物组表示。
图18：伊拉非诺增强索马鲁肽将血浆CRP浓度降低至与高剂量索马鲁肽相似的水平的作用。治疗组中的CRP水平相对于AMLN喂养媒介物组表示。
图19：伊拉非诺增强索马鲁肽对肝脏的影响，重现了高剂量索马鲁肽的肝脏基因特征。呈现了每个处理的基因本体(GO)类别富集的-log10(调整p值)。高值表示在处理下GO类别的高度富集，即GO类别中的许多基因受到处理的影响。值“0”表示GO类别中只有少数基因通过处理解除调节。
实施例
化合物
伊拉非诺是在Genfit合成的。索马鲁肽和利拉鲁肽可商购获得。
将伊拉非诺溶解在1％CMC+0.1％Tween 80中。
将索马鲁肽溶解在1％CMC+50mM Na2HPO4+70mM NaCl+0.05％Tween 80中。
将利拉鲁肽溶解在含有BSA 0.1％的磷酸盐缓冲盐水(PBS 1X)中中。
统计分析
对于统计方法，对所有原始数据应用Shapiro-Wilk正态性检验。
在正态分布的情况下，饲料与媒介物(Veh)的比较在单尾student t检验(#)中进行。如有必要，可以应用韦尔奇(¤)校正。
对于多重比较检验，应用单因素ANOVA和Fisher最小显著差异(LSD)事后检验(*)。
在其他情况下，饲料与媒介物(Veh)的比较在单尾Mann-Whitney($)中进行，并应用Kruskall Wallis未校正的Dunn事后检验(§)进行多重比较检验。
Fisher精确检验用于比较分布(￡)。
使用超过最高单一药剂(HSA)模型(单尾统计检验)评价药物组合的治疗协同作用。
#/¤/*/$/§/￡/°:p<0.05
##/¤¤/**/$$/§§/￡￡/°°:p<0.01
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实施例1：用单独伊拉非诺或与索马鲁肽组合的伊拉非诺治疗40天对雄性DIO-
NASH小鼠的食物摄入量和体重调节的影响
动物模型
在DIO-NASH小鼠(用胰淀素肝NASH模型饮食(AMLN)(研究饮食，40％脂肪(18％反式脂肪)、40％碳水化合物(20％果糖)和2％胆固醇)(研究开始前36周)喂养的C57BL6JRj小鼠)中评估单独的伊拉非诺、单独的索马鲁肽和两者的组合的作用。向41周龄的雄性老年DIO-NASH小鼠喂食媒介物(n＝12)，或补充有伊拉非诺(10毫克/千克/天)的媒介物，或单独的索马鲁肽(10纳摩尔/千克)(使用0.08毫克/毫升的增量经5天滴定至最终剂量)或组合(每组n＝12)。
每天监测一次体重。在第1-2周期间每天监测一次食物和水的摄入量，然后在接下来的几周内每周监测一次。
在方案期间从尾静脉取样以测量血糖、血浆胰岛素、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、甘油三酯、总胆固醇剂量。
在治疗的最后一天，在心脏穿刺采血后获得血浆样品并处死小鼠。迅速切除肝脏以用于生化和组织学分析。
所有动物程序均根据标准方案并按照实验动物适当护理和使用的标准建议进行。
体重和食物摄入量
每天监测一次体重。在第1-2周期间每天监测一次食物和水摄入量，然后在接下来的几周内每周监测一次。
第40天的终末绝对体重显示在图1中。第40天相较于第0天的相对重量也显示在图2中。伊拉非诺和索马鲁肽的组合使体重显著降低。
生化分析
肝脏甘油三酯含量的测量
用组织匀浆器(24，Bertin Technologies，法国)在含有15.4mM NaN3的150mM NaCl缓冲液中将约100mg冷冻肝组织匀浆化。用氯仿-甲醇(2:1，v/v)提取匀浆中的脂质部分，然后测量甘油三酯(Biolabo目录#80019)。
在该模型中，索马鲁肽(10纳摩尔/千克/天)治疗对肝脏脂肪有显著的有益影响(图3)。索马鲁肽与伊拉非诺的组合对肝脏甘油三酯含量产生显著影响。
血糖测量
根据制造商的建议，使用用于Daytona自动装置的Randox试剂盒(Randox，目录#GL3815)测量血浆葡萄糖水平。该方法是基于比色测定，无需对样品进行任何脱蛋白处理。简而言之，样品的葡萄糖氧化酶消化导致过氧化氢合成。在苯酚和4-氨基吩酮存在下，过氧化氢被过氧化物酶催化并形成染料：醌亚胺。着色强度与葡萄糖浓度成正比，并在505nm下测量。结果以mg/dL表示。
在该模型中，单独使用伊拉非诺(10毫克/千克/天)和单独使用索马鲁肽(10纳摩尔/千克/天)处理对血糖没有有益影响(图4)。索马鲁肽与伊拉非诺的组合对血糖产生显著影响(图4)。
胰岛素血症的测量
使用来自Crystal Chem Inc.(目录#90010)的固相双位点酶免疫测定法来测量血浆胰岛素。简而言之，将95μL豚鼠抗胰岛素血清和5μL稀释样品(或标准品)分配到96孔板的每孔中。在4℃下温育过夜并洗涤后，加入100μL与过氧化物酶缀合的抗豚鼠抗体，并通过在室温下额外温育1小时来产生反应。此后，分配100μL酶底物，然后在室温下在黑暗中进一步温育30分钟。然后通过加入100μL终止溶液来终止反应，并立即在450nm(减去波长：630nm)下测量吸光度。着色强度与样品中最初存在的胰岛素量成正比，并使用标准血清进行计算。结果以ng/mL表示。
在该模型中，索马鲁肽(10纳摩尔/千克/天)治疗对胰岛素血症具有显著的有益作用(图5)。索马鲁肽与伊拉非诺的组合对胰岛素血症产生显著影响(图5)。
组织学
组织包埋和切片：
首先将肝切片在福尔马林4％溶液中固定12小时。然后，将肝片在PBS中洗涤30分钟，并在乙醇溶液(在70％、80％、95％和100％乙醇的连续浴)中脱水。将肝片在三种不同的二甲苯(Sigma-Aldrich目录#534056)浴中温育，然后在两个液体石蜡浴中温育(56℃)。然后将肝片置于样品架中，用轻轻填充以完全覆盖所述组织。从架子上取出含有组织片的石蜡块并在室温下储存。肝块被切成3μm的切片。
苏木精/曙红/番红染色
将肝切片脱石蜡化、重新水化并在Mayer苏木精(Microm，目录#F/C0303)中温育3分钟。然后，将所述肝切片在水中漂洗，并在乙醇性曙红Y 0.5％(VWR，目录#1.02439.0500)和赤藓红0.5％溶液(VWR，目录#1.15936.0010)中温育1分钟，并用乙醇漂洗。然后将切片在番红中温育2分钟，并最终脱水并使用CV封片介质(Leica，目录#046430011)封片。
组织学检查
对每个肝样本的来源不知情的技术员进行组织学检查。使用来自3D Histech的Pannoramic 250扫描仪生成虚拟载片。对于每只动物，根据NASH临床研究网络(Kleiner2005,Brunt 1999)赋予概述了NASH的主要组织学病变的评分。对脂肪变性进行评分(0-3)。
在DIO-NASH小鼠中诱发NASH。干预组中的动物在整个研究期间接受伊拉非诺或索马鲁肽或这两种化合物。NASH发展通过组织学进行评估。还对不同的相关生物标志物进行了额外的生化和分子分析。
DIO-NASH小鼠发展NASH相关的组织学，对严重疾病的渗透率高。所有动物都存在严重脂肪变性。
索马鲁肽与伊拉非诺的组合导致脂肪变性显著减少(图6)。
实施例2：用单独的伊拉非诺和与索马鲁肽组合的伊拉非诺治疗4周对雄性DIO-
NASH小鼠的食物摄入量和体重调节的影响
动物模型
在DIO-NASH小鼠中评估了单独的伊拉非诺、单独的索马鲁肽和两者组合的作用。42-44周龄的老年雄性DIO-NASH小鼠被喂食媒介物(n＝6)，或补充有伊拉非诺(10毫克/千克/天)的媒介物，或单独或组合的索马鲁肽(每组n＝6)，持续4周。使用2种剂量的索马鲁肽来评价组合：
-索马鲁肽0.3纳摩尔/千克
-索马鲁肽1纳摩尔/千克
每天监测一次体重、食物和水的摄入量。
在治疗的最后一天，从眶后采血获得血浆样品，并在6小时禁食期后处死小鼠。迅速切除肝脏以用于生化和组织学分析。
所有动物程序均根据标准方案并按照实验动物适当护理和使用的标准建议进行。
体重和食物摄入量
每天监测一次体重。在28天内每天监测一次食物和水的摄入量。
累积食物摄入量的平均值示于图7A中。对于所有治疗组，在所述时段内注意到稳定的食物摄入量，特别是对于伊拉非诺与剂量为0.3或1纳摩尔/千克的索马鲁肽的组合。这种作用表明，伊拉非诺与索马鲁肽的组合减少了索马鲁肽的副作用。
28天时期结束时的终末绝对体重示于图7B中。在两种测试剂量下，伊拉非诺和索马鲁肽的组合使体重显著降低。
我们发现在索马鲁肽的剂量降低3至10倍的情况下，伊拉非诺和索马鲁肽的组合对体重减轻的显著影响。此外，伊拉非诺和索马鲁肽的组合对包括NASH在内的许多疾病具有治疗意义，并减少了索马鲁肽的副作用。
实施例3：用单独的伊拉非诺和与索马鲁肽组合的伊拉非诺治疗12周对雄性DIO-
NASH小鼠中的NASH的影响
动物模型
在研究开始前35周，雄性C57BL/6JRj小鼠被喂食AMLN饮食(DIO-NASH模型)。活检证实脂肪变性(评分≥2)和纤维化(评分≥1)的小鼠被随机分入治疗组(每组n＝12-14)。小鼠接受了媒介物、伊拉非诺(10毫克/千克/天，口服)、索马鲁肽(0.3纳摩尔/千克/天，SC)或伊拉非诺和索马鲁肽两者，持续12周。本研究中使用了次优的药物剂量。为了避免SEMA引起的食欲减退，在治疗的前3周期间应用递增滴定方案。
在治疗的最后一天，在心脏穿刺采血后获得血浆样品并处死小鼠。迅速切除肝脏以进行组织学以及生化和转录组学分析。
所有动物程序均根据标准方案并按照实验动物适当护理和使用的标准建议进行。
NASH的组织学评估
如实施例1中所述制备肝切片并用苏木精曙红番红(HES)染色。NASH的组织学特征(脂肪变性、气球样变、小叶炎症和纤维化)由对实验组不知情的操作者使用NASH临床研究网络评分系统评估(Kleiner2005,Brunt 1999)。计算脂肪变性评分、活动指数(肝细胞气球样变+小叶炎症)和NAFLD活动性评分(NAS)。使用200x放大倍数计算每个视野的炎症病灶数量。
纳入时，小鼠具有严重的NASH表型(NAFLD活动性评分(NAS)介于5和7之间，并且纤维化阶段至少为2)。使用ELA/SEMA组合治疗12周后，14％的小鼠NAS降低3个阶段，并且44％的小鼠NAS降低2个阶段(图8A)。接受低剂量ELA或低剂量SEMA的小鼠均未表现出超过1个阶段的NAS减少。这种下降是由于脂肪变性(图8B)和活动指数(图8C)均降低。肝脏炎症病灶的数量随着组合治疗显著下降(-59％)(图8D)。
生化分析
将肝样品匀浆化，并通过加热在5％NP-40中提取甘油三酯(TG)。使用商业试剂盒(Roche Diagnostics)和CobasTM C-501自动分析仪根据制造商的说明测量肝脏TG含量以及血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平。通过ELISA(小鼠C反应蛋白/CRP免疫测定MCRP00，R&D Systems)测量血浆C反应蛋白(CRP)浓度。使用羟脯氨酸的比色检测来评估肝脏胶原蛋白，羟脯氨酸是胶原蛋白的主要组分(QZBhypro,Quickzyme)。
ALT和AST是肝酶，在肝细胞损伤的情况下，它们在血浆中的浓度增加。血浆CRP是肝脏炎症的标志物，其通常在具有低度炎症如NASH的代谢性疾病中升高，并与临床心血管风险相关。正如预期的那样，AMLN饮食47周后血浆ALT、AST和CRP水平升高。有趣的是，在ELA/SEMA组中也观察到血浆ALT(-60％)、AST(-56％)和CRP(-56％)以及肝脏甘油三酯(-56％)的强烈下降，证实了对肝脏组织学的影响(图9A-D)。在接受ELA和与SEMA的组合的动物中观察到纤维化改善，所述改善趋于进一步降低肝脏胶原蛋白含量(图9E)。
转录组学分析
使用96RNA试剂盒(Macherey Nagel)按照制造商的说明从小鼠肝脏中分离总RNA。Illumina NexSeq 500测序技术用于生成肝脏RNAseq数据(每组n＝5)。原始FASTQ文件根据其质量评分(Phred评分)在3'端进行修剪。使用的参数是最终最低质量水平为25并且最小读段长度为50。未对齐的读段使用软件STAR版本2.5.3与小家鼠(Musmusculus)mm10参考基因组对齐。使用默认参数。使用具有默认参数的featureCountsv1.5.3产生计数表。为了鉴定差异表达的基因(DE基因)，我们使用了R(版本3.5.3)和DESEq2库(版本1.22.2)。简而言之，由FeatureCounts生成的计数矩阵依次由DESeqDataSetFromMatrix()函数和来自DESeq2库的DEseq()函数分析。对于每个条件(即比较ELA/SEMA与AMLN)，使用来自DESeq2的results()函数检索倍数变化和p值。调整后的p值<0.01并且|倍数变化|>1.5的基因被认为是DE基因。使用Ensembl ID作为键来合并不同的表。使用biomaRt库(v.2.38.0)检索基因注释。在依据条件选择DE基因后，使用Metascape进行基因本体分析。
记录了深刻的肝脏转录组重塑。一组2194个基因在ELA/SEMA组合组中被差异调节，而在ELA和SEMA单一疗法组中分别为1140个和55个基因(图10A-B)。SEMA处理仅轻微影响脂质代谢相关基因的表达。令人惊讶的是，肝脏中ELA/SEMA组合的转录组学特征特别富集炎症途径，尤其是在接受所述组合的动物中，髓系细胞标志物选择性减少(图10C-D)。此外，一些纤维化基因在组合治疗后选择性减少(图10E)，表明所述组合有减缓纤维化进展的治疗益处。
低剂量的伊拉非诺和索马鲁肽的组合减轻了AMLN饮食诱发的疾病模型中严重的NASH表型和肝损伤标志物。转录组学分析揭示ELA和SEMA协同作用以特异性减少肝脏中的炎症浸润并减弱纤维发生。
实施例4：伊拉非诺与GLP-1受体激动剂的组合协同抑制免疫细胞的活化
LPS活化的巨噬细胞的组合治疗
将人THP-1单核细胞以每孔25,000个细胞的密度接种在384孔板中补充有10％FBS、1％青霉素-链霉素(Gibco,15140122)和25mM Hepes(Gibco,15140122)的RPMI1640(Gibco,21875)中，并使用最终浓度为100ng/ml的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，Sigma，P8139)分化为巨噬细胞持续24小时。
制备2组分组合矩阵。ELA和GLP-1受体激动剂原液在DMSO中在96孔板的行中以3点系列(ELA)并且在96孔板的列中以8点系列(GLP1RA)连续稀释。随后，通过1:1混合所有单一药剂浓度生成3×8组合矩阵。
使用PMA 24小时后，去除培养基，并用无血清RPMI代替。然后，将血清剥夺的THP1巨噬细胞与化合物一起预温育24小时，然后加入脂多糖LPS(大肠杆菌055 B5)(Sigma,L6529)持续另外6小时时段。
基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)技术，使用均相时间分辨荧光(Homeogenoeus Time Resolved Fluorescence，HTRF)技术(Cisbio 62HTNFAPEG)对上清液中的人TNFα进行定量。将细胞上清液、样品和标准品直接分配到测定板中以供通过试剂检测。将用HTRF供体和受体标记的抗体预先混合并在单个分配步骤中添加。在665nm下检测到的信号强度与所形成的抗原-抗体复合物的数量成正比，因此与TNFα浓度成正比。通过用4参数Logistic模型拟合数据而获得七点标准曲线(从39pg/ml至2500pg/mL，用提供的人TNFα)。
使用Excess Over Bliss(EOB)方法确定化合物之间的协同作用。
在TNFαHTRF测定中获得的值首先转化为相比于LPS对照的抑制百分比。然后，使用这些抑制百分比，计算EOB。预期Bliss相加性评分(E)首先由以下公式确定：
E ＝(A+ B)-(A×B)，其中A和B是给定剂量下伊拉非诺(A)和GLP-1类似物(B)的抑制百分比。Bliss预期值与观察到的相同剂量下组合ELA/GLP-1类似物的抑制作用之间的差异是“Excess over Bliss”评分。
-Excess Over Bliss评分＝0表示组合治疗是加和性的(正如对独立途径效应所预期的那样)；
-Excess Over Bliss评分>0表示活性大于加和性(协同作用)；并且
-Excess Over Bliss评分<0表示组合小于加和性(拮抗作用)。
通过将所有EOB相加计算总Bliss评分。
代谢性疾病如NAFLD/NASH与低度炎症相关。免疫细胞的活化产生细胞因子，这些细胞因子改变肝脏和外周器官(脂肪组织、胰腺……)的代谢功能。在代谢和肝脏疾病中描述的肠道通透性导致循环细菌组分如LPS增加，LPS活化肝脏和外周器官(脂肪组织)中的巨噬细胞。鉴于实施例3中伊拉非诺与索马鲁肽之间对炎症途径的协同作用，我们研究了伊拉非诺和不同的GLP-1受体激动剂是否可以协同抑制LPS引起的巨噬细胞活化。在分化为巨噬细胞的THP1单核细胞中，LPS处理活化巨噬细胞，如通过TNFα分泌所测量的，LPS处理使TNFα分泌增加约4倍(图11E-F)。在1μM的剂量下观察到单独的伊拉非诺的最大作用，并达到TNFα分泌的85％抑制(图11B)。相反，对于索马鲁肽和利拉鲁肽，GLP-1受体激动剂的最大作用分别是29％和38％的TNFα抑制(图11A-B)。如在体内所观察到的(实施例3)，伊拉非诺和索马鲁肽的组合在低剂量下协同作用以减少炎症：0.07μM的伊拉非诺与0.7nM的索马鲁肽协同作用，使TNFα分泌减少56％(图11E)。令人惊讶的是，0.1μM的伊拉非诺也与利拉鲁肽(0.003nM)协同作用，使TNFα分泌减少83％(图11F)。
这些结果显示了伊拉非诺与不同GLP-1受体激动剂协同作用以减少在许多疾病(包括NASH和代谢性疾病)中观察到的炎症状况的能力。
实施例5：伊拉非诺与GLP-1受体激动剂的组合协同抑制肝星状细胞(HSC)活化
TGFβ刺激的HSC中的组合治疗
人原代肝星状细胞(hHSC)(Innoprot)在补充有2％胎牛血清(FBS，ScienCell目录#0010)、1％青霉素/链霉素(ScienCell目录#0503)和星状细胞生长补充剂(SteCGS；ScienCell目录#5352)的STeCM培养基(ScienCell目录#5301)中培养。细胞培养瓶涂有聚L赖氨酸(Sigma目录#P4707)以获得更好的粘附。
制备2组分组合矩阵。ELA和GLP-1受体激动剂原液在DMSO中在96孔板的行中以3点系列(ELA)并且在96孔板的列中以7点系列(GLP-1受体激动剂)连续稀释。随后，通过1:1混合所有单一药剂浓度生成3×7组合矩阵。
随后将细胞以6500个细胞/孔的密度接种到384孔板中。第二天，去除细胞培养基，并用PBS(Invitrogen目录#14190)洗涤细胞。hHSC在无血清和无SteCGS的培养基中被剥夺24小时。对于用ELA、GLP-1受体激动剂和各自组合的处理，将血清剥夺的hHSC与化合物一起预温育1小时，然后在无血清和无SteCGS的培养基中加入促纤维生成刺激物TGF-β1(PeproTech目录#100-21，3ng/mL)持续另外48小时时段。
基于(荧光共振能量转移)FRET技术，使用HTRF技术(均相时间分辨荧光)(Cisbio62HTNFAPEG)，对细胞裂解物中的人α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)进行定量。将稀释的细胞裂解物、样品和标准品直接分配到测定板中以通过试剂进行检测。将用抗体标记的HTRF供体和受体预先混合并在单个分配步骤中添加。在665nm下检测到的信号强度与620nm下信号强度的HTRF比率与所形成的抗原-抗体复合物的数量成正比，并因此与αSMA浓度成正比。
肝损伤后，静止的HSC经历一个活化过程，其特征是分化为α-SMA阳性的肌成纤维细胞。伊拉非诺在被促纤维生成细胞因子TGFβ1活化的hHSC中具有抗纤维化活性。利用3μM的ELA使α-SMA的产生减少了61％(未显示)。单独使用索马鲁肽和利拉鲁肽仅轻微降低α-SMA的产生(利用索马鲁肽的Emax-12％，利用利拉鲁肽的Emax-30％)。然而，伊拉非诺与索马鲁肽和利拉鲁肽协同作用，以减少活化HSC中的α-SMA产生(图12)。图12E显示了协同作用的最佳实施例之一，其中0.3μM的ELA和0.01μM的索马鲁肽达到αSMA产生的84％抑制。同样，虽然单独使用0.003μM的利拉鲁肽没有显示任何抗纤维化活性，但将其加入到0.1μM的伊拉非诺以协同方式降低了αSMA产生并达到了高达62％的抑制(图12F)。
这些结果证实伊拉非诺和GLP-1受体激动剂协同作用以减少纤维生成，提供对于纤维化NASH的治疗潜力。
实施例6：用单独的伊拉非诺和与利拉鲁肽组合的伊拉非诺治疗8周对饮食诱发的
NASH鼠类模型中肥胖、血糖和肝脏的影响
动物模型
在研究开始前31周向雄性C57BL/6NTac小鼠(Taconic，美国)喂食GAN饮食(D09100310研究饮食)以诱发NASH病(NASH-B6模型)。治疗前，在6小时禁食期后通过眶后窦穿刺收集血液以测量血浆ALT、AST、TIMP金属肽酶抑制蛋白1(TIMP1，肝纤维化的替代标志物)。在6小时禁食期后，使用WellionVet血糖仪(CALEA)直接从尾静脉测量血糖。还使用FreeStyle Optium Neo酮计直接从尾静脉测量酮体(KB)。根据体重、血糖、酮血症以及血浆ALT、AST和TIMP1，将小鼠随机分入治疗组(n＝10/组)。他们接受了媒介物、伊拉非诺(3毫克/千克/天，口服)、利拉鲁肽(0.01毫克/千克，BID，SC)或伊拉非诺和利拉鲁肽两者持续8周。为了避免GLP-1受体激动剂诱发的食欲减退，在治疗的前3周(从0.001毫克/千克BID开始)期间对利拉鲁肽应用递增滴定方案。媒介物给药的饲料喂养的小鼠作为额外的对照(R03-10 U8211G10R，SAFE)。
在治疗期间每天监测体重和食物摄入量。在治疗的最后一天，在眶后窦穿刺采血后获得血清样品并处死小鼠。迅速切除肝脏以进行组织学以及生化和转录组学分析。将附睾脂肪组织称重。
所有动物程序均根据标准方案并按照实验动物适当护理和使用的标准建议进行。
GAN喂养39周后，NASH-B6小鼠是肥胖的(48g)。用与利拉鲁肽组合或不与利拉鲁肽组合的伊拉非诺治疗八周使体重减轻15％(未显示)。伊拉非诺减少了肥胖，并且组合治疗进一步减少了肥胖(图13A)。由于本研究中使用的次优药物剂量，利拉鲁肽没有食欲减退作用(图13B)。
生化分析
使用合适的QuickZyme试剂盒(总胶原蛋白分析，目录#QZB-totcol2)测定肝脏胶原蛋白含量。所述测定是基于羟脯氨酸的检测，羟脯氨酸是一种主要存在于胶原蛋白的三螺旋中的非蛋白质氨基酸。因此，组织水解物中的羟脯氨酸可以用作组织中存在的胶原蛋白的量的直接量度(不区分前胶原蛋白、成熟胶原蛋白和胶原蛋白降解产物)。在定量羟脯氨酸之前，需要在95℃下在6M HCl中完全水解组织样品。所述测定导致生成在570nm下具有最大吸光度的色原。结果表示为μg胶原蛋白/mg肝脏。
NASH-B6小鼠出现肝脏病变，其特征在于所有小鼠的最大脂肪变性评分为3、小叶炎症和胶原蛋白沉积(未显示)。组合治疗显著降低了胶原蛋白含量，而单一疗法没有显著影响(图14)，表明在这些低剂量下，只有组合治疗才能够减轻肝损伤。
肝脏基因表达分析
使用96RNA试剂盒(Macherey Nagel)按照制造商的说明从小鼠肝脏中分离总RNA。使用M-MLV RT(莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶)(Invitrogen目录#28025)在5x RT缓冲液(Invitrogen)、10mM DTT(Invitrogen)、10mM dNTP(Promega)、200ng pdN6(Amersham)和40U的RNase抑制剂(Promega)，将总RNA逆转录成cDNA。然后使用CFX96TouchTM实时PCR检测系统(Biorad)进行定量PCR。简而言之，PCR反应以96-WP形式以25μl总体积进行，其含有5μL逆转录反应、0.5μL反向和正向引物(各10mmol)和12.5μl 2X iQ SYBRGreen Supermix(BioRad)，使用以下引物序列：
使用NONO基因的表达作为管家基因将样品中的表达水平归一化。通过选择最佳点(至少三个点)绘制标准曲线，以使PCR反应效率接近100％并且相关系数接近1。使用标准曲线方程确定管家基因和目标基因的表达水平(考虑到每个目标基因的特异性PCR效率)。
正如预期的那样，纤维化基因Col1a1的表达在用GAN喂养的NASH-B6小鼠中被诱导(图15)。Col1a1表达随伊拉非诺治疗而降低，并在伊拉非诺与利拉鲁肽组合时进一步降低。
在治疗8周之前和之后，在6小时禁食期后，使用WellionVet血糖仪(CALEA)直接从尾静脉评估血糖。图16显示了与喂食GAN饮食的媒介物组相比，治疗后血糖的演变。在这项研究中，ELA(3毫克/千克/天)和利拉鲁肽(0.02毫克/千克/天)对血糖没有影响。然而，组合治疗使血糖显著降低66％。
这些结果表明，伊拉非诺也与利拉鲁肽协同作用，以减少肥胖、减轻肝脏病变、减少纤维生成和改善葡萄糖稳态，证实了伊拉非诺和GLP-1受体激动剂组合疗法治疗2型糖尿病和NASH患者的治疗益处。这种协同作用允许减少GLP-1受体激动剂的治疗剂量，从而限制其副作用。
实施例7：伊拉非诺增强低剂量GLP1受体激动剂的作用
动物模型
在DIO-NASH小鼠(用胰淀素肝NASH模型饮食(AMLN)(研究饮食，40％脂肪(18％反式脂肪)、40％碳水化合物(20％果糖)和2％胆固醇)(研究开始前35周)喂养的C57BL6JRj小鼠)中评估单独的伊拉非诺、单独的索马鲁肽(低剂量和高剂量)及其组合的作用。活检证实脂肪变性(评分≥2)和纤维化(评分≥1)的小鼠被随机分入治疗组(每组n＝12)。小鼠接受媒介物、伊拉非诺(10毫克/千克/天，口服)、低剂量索马鲁肽(0.3纳摩尔/千克/天，SC)、高剂量索马鲁肽(10纳摩尔/千克/天，SC)或者伊拉非诺(10毫克/千克/天)和索马鲁肽(0.3纳摩尔/千克/天)的组合。
在治疗的最后一天，在心脏穿刺采血后获得血浆样品并处死小鼠。迅速切除肝脏以进行转录组学分析。
所有动物程序均根据标准方案并按照实验动物适当护理和使用的标准建议进行。
血浆标志物评估
根据制造商的说明，使用CobasTM C-501自动分析仪测量丙氨酸转氨酶(ALT)水平。通过ELISA(小鼠C反应蛋白/CRP免疫测定MCRP00，R&D Systems)测量C反应蛋白(CRP)浓度。
转录组学和基因本体分析
使用96RNA试剂盒(Macherey Nagel)按照制造商的说明从小鼠肝脏中分离总RNA。使用Illumina NexSeq 500测序技术生成肝脏RNAseq数据(每组n＝5)。原始FASTQ文件根据其质量评分(Phred评分)在3'端进行修剪。使用的参数是最终最低质量水平为25并且最小读取长度为50。未对齐的读段使用软件STAR版本2.5.3与小家鼠mm10参考基因组对齐。使用默认参数。使用具有默认参数的featureCounts v1.5.3产生计数表。为了鉴定差异表达的基因(DE基因)，我们使用了R(版本3.5.3)和DESEq2库(版本1.22.2)。简而言之，由FeatureCounts生成的计数矩阵依次由DESeqDataSetFromMatrix()函数和来自DESeq2库的DEseq()函数分析。对于每个比较(即SEMA-10与AMLN、SEMA-0.3与AMLN、ELA与AMLN、ELA+SEMA-0.3与AMLN)建立差异表达(DE)基因列表。为此，使用DESeq2的lfcshrink()函数，并且使用以下截止值来选择DE基因：|倍数变化|>1.5并且调整后的p值<0.05。将这些基因列表提交至使用默认参数的metascape分析(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。
每个metascape分析都导出为Excel文件。所述文件使用来自readxl库(版本1.3.1)的read_excel函数导入到R V中。将不同的文件组合在一起以生成一个表格，其含有对于每个比较的基因本体(GO)类别富集的-log10(调整p值)。此外，对于每个类别，将在RNA-seq分析中发现的DE基因数量与该GO类别中的基因总数进行比较。仅检索在至少一项比较中调整p值<0.01的GO类别。
正如预期的那样，GAN饮食增加了血浆ALT(临床上用作肝功能测试的肝损伤标志物)的水平。高剂量索马鲁肽(10纳摩尔/千克/天)使ALT显著降低74％，而低剂量索马鲁肽(0.3纳摩尔/千克/天)无效(图17)。令人惊讶的是，包含伊拉非诺和低剂量索马鲁肽的组合治疗将ALT水平降低到与高剂量索马鲁肽治疗相同的程度(-77％对-83％，p>0.05)，这表明在组合时，伊拉非诺增强了索马鲁肽作为低剂量使用时的作用(图17)。
类似地，利用高剂量索马鲁肽使炎症标志物CRP(也已知与人类心血管疾病的风险相关)的水平降低了43％，而低剂量索马鲁肽无效(图18)。再次，低剂量索马鲁肽与伊拉非诺的组合使CRP水平降低到与高剂量索马鲁肽相同的程度(-47％对-43％，p>0.05)。
为了理解这种协同作用，我们比较了伊拉非诺、高剂量索马鲁肽、低剂量索马鲁肽以及伊拉非诺与低剂量索马鲁肽的组合之间的肝脏基因特征。使用Metascape对肝脏进行RNAseq和途径分析。基因本体分析表明，高剂量索马鲁肽(10纳摩尔/千克/天)逆转了AMLN诱导的病理特征，特别是炎症反应、细胞因子(IL1、IL6)的产生、免疫细胞的活化和迁移(图19)。低剂量SEMA无法有效逆转这些途径。伊拉非诺(10毫克/千克/天)对与炎症相关的基因本体类别有轻微影响而对脂质代谢类别有相当的影响，这是PPAR激动剂的已知作用。然而，与低剂量索马鲁肽组合时，除了对脂质代谢的有益作用外，伊拉非诺还恢复了高剂量索马鲁肽的抗炎基因特征。
这些结果表明，伊拉非诺增强GLP-1受体激动剂对肝损伤和炎症的影响，并代表一种降低GLP1受体激动剂剂量从而限制其可导致治疗中断的副作用(恶心、腹泻)的有吸引力的治疗益处。
Claims (14)
1.一种包含(i)伊拉非诺或其药学上可接受的盐以及(ii)选自索马鲁肽、利拉鲁肽及其药学上可接受的盐的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂的组合产品在制备用于治疗非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化NASH、糖尿病或肥胖症或者用于减轻体重的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中组分(ii)是索马鲁肽或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1所述的用途，其中组分(ii)是利拉鲁肽或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的用途，其中所述组合产品是包含组分(i)和(ii)以及药学上可接受的载体的组合物。
5.根据权利要求1至3中的任一项所述的用途，其中将组分(i)和(ii)配制成悬浮液、凝胶剂、油剂、丸剂、片剂、栓剂、粉剂、胶囊剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、或用于延长和/或缓慢释放的盖仑形式。
6.根据权利要求1至3中的任一项所述的用途，其中所述组合产品是包含组分(i)和(ii)的试剂盒，所述组分(i)和组分(ii)用于顺序、分开或同时使用。
7.根据权利要求6所述的用途，其中组分(i)和(ii)是口服剂型。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述口服剂型是丸剂或片剂。
9.根据权利要求6所述的用途，其中组分(i)是口服剂型并且组分(ii)是可注射溶液。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于治疗非酒精性脂肪性肝炎。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于在治疗需要施用GLP-1受体激动剂的病症的情形下减轻体重。
12.根据权利要求1所述的用途，其中施用的GLP-1受体激动剂的量与当单独施用所述GLP-1受体时所需的GLP-1受体激动剂的量相比减少。
13.根据权利要求10所述的用途，其中所述GLP-1受体激动剂的至少一种副作用由此减少。
14.根据权利要求1所述的用途，其中至少一种与GLP-1受体激动剂相关的副作用与单独施用所述GLP-1受体激动剂时相比减少。
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