KR20210150436A - 화학식 (i)의 화합물 및 glp-1 수용체 효현제를 포함하는 병용 요법 - Google Patents

화학식 (i)의 화합물 및 glp-1 수용체 효현제를 포함하는 병용 요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PPAR 효현제 및 GLP-1 수용체 효현제를 포함하는 병용 요법에 관한 것이다.

Description

화학식 (I)의 화합물 및 GLP-1 수용체 효현제를 포함하는 병용 요법
본 발명은 PPAR 효현제 및 GLP-1 수용체 효현제를 포함하는 병용 요법에 관한 것이다.
글루카곤-유사 펩티드-1 수용체 효현제 (또는 GLP-1R 효현제)는 대사성 질환 예컨대 비만 및 2형 당뇨병의 치료를 위해 제안된 화합물 부류이다. 이러한 부류의 몇몇 화합물, 예컨대 세마글루티드, 리라글루티드, 엑세나티드, 릭시세나티드, 알비글루티드 및 둘라글루티드는 약물로서 승인되었다. 그들 승인에도 불구하고, 이러한 부류의 화합물은 그들의 치료적 효과를 개선시키기 위해 다른 부류의 화합물과 이의 병용을 통해서 이득을 얻을 수 있다. 또한, GLP-1R 효현제는 유해 효과 예컨대 위장 유해 효과를 유발시킨다. 예를 들어, 세마글루티드 및 리라글루티드의 공통 부작용은 구역, 구토, 설사, 복통 및 변비를 포함한다. 이들 유해 효과를 감소시키기 위한 방법이 유리할 것이다.
본 발명은 GLP-1R 효현제를 PPAR 효현제 예컨대 엘라피브라노와 병용한 결과로 지방증, 인슐린 수준 및 혈당증, 체중 조절 및 유해 효과 감소에 대한 상승 작용같은 몇몇 유리한 효과를 일으킨다는 결과를 근간으로 한다. 또한, 이러한 병용이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 GLP-1R 효현제의 양을 감소시킬 가능성을 열어주어서, GLP-1R 효현제와 연관된 유해 효과를 더욱 감소시킨다는 것을 본 명세서에서 확인하였다.
따라서, 본 발명은
(i) PPAR 효현제, 특히 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
(ii) 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 수용체 효현제를 포함하는 병용 산물에 관한 것이다.
Figure pct00001
식에서,
Y1은 할로겐 원자, Ra, 또는 Ga-Ra 기를 나타내고;
A는 CH=CH 또는 CH2-CH2 기를 나타내고;
Y2는 Gb-Rb 기를 나타내고;
Ga 및 Gb는 동일하거나 또는 상이하게, 산소 또는 황의 원자를 나타내고;
Ra는 수소 원자, 미치환 (C1-C6)알킬 기, (C6-C14)아릴 기 또는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되는 (C1-C6)알킬 기, (C1-C6)알콕시 또는 (C1-C6)알킬티오 기, (C3-C14)시클로알킬 기, (C3-C14)시클로알킬티오 기 또는 복소환 기를 나타내고;
Rb는 적어도 -COORc 기로 치환되는 (C1-C6)알킬 기를 나타내고, 여기서 Rc는 수소 원자, 또는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 미치환되는 (C1-C6)알킬 기, (C3-C14)시클로알킬 기, 또는 복소환 기를 나타내고;
Y4 및 Y5는 동일하거나 또는 상이하고, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 치화되지 않는 (C1-C6)알킬 기, (C3-C14)시클로알킬 기 또는 복소환 기를 나타내고;
본 발명의 특정 구현예에서, Y1은 Ga-Ra 기를 나타낸다.
다른 특정 구현예에서, Ra는 (C1-C6)알킬 기 또는 (C3-C14)시클로알킬 기를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 미치환되는 (C1-C6)알킬을 나타내거나, 또는 Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 미치환되는 (C3-C14)시클로알킬 기를 나타낸다.
본 발명의 추가 구현예에서, Rb는 -COORc 기로 치환된 (C1-C6)알킬 기를 나타내고, 여기서 Rc는 수소 원자 또는 1개 내지 4개 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타낸다. 다른 구현예에서, Rc는 수소 원자를 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 구현예에서,
A는 CH=CH 기를 나타내고;
Ra는 (C1-C6)알킬 또는 (C3-C14)시클로알킬 기, 특히 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 미치환되는 (C1-C6)알킬 또는 (C3-C14)시클로알킬 기를 나타내고;
Rb는 -COORc 기로 치환되는 (C1-C6)알킬 기를 나타내고, 여기서 Rc는 수소 원자 또는 1개 내지 4개 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고;
Y4 및 Y5는 독립적으로 (C1-C4)알킬 기를 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 구현예에서,
A는 CH2-CH2 기를 나타내고;
Ga는 산소 또는 황의 원자를 나타내고 Gb는 산소의 원자를 나타내고;
Ra는 (C1-C6)알킬 또는 (C3-C14)시클로알킬 기를 나타내고;
Rb는 적어도 -COORc 기로 치환되는 (C1-C6)알킬 기를 나타내고, 여기서 Rc는 수소 원자 또는 (C1-C4)알킬 기를 나타내고;
Y4 및 Y5는 독립적으로 (C1-C4)알킬 기를 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 구현예에서,
A는 CH2-CH2 기를 나타내고;
Ga는 산소 또는 황의 원자를 나타내고 Gb는 산소의 원자를 나타내고;
Ra는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되는 (C1-C6)알킬 또는 (C3-C14)시클로알킬 기를 나타내고;
Rb는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 치환되지 않고, 적어도 -COORc 기로 치환되는 (C1-C6)알킬 기를 나타내고, 여기서 Rc는 수소 원자 또는 (C1-C4)알킬 기를 나타내고;
Y4 및 Y5는 (C1-C4)알킬 기를 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 구현예에서, Gb는 산소 원자이고 Rb는 -COORc 기에 의해 치환되는 (C1-C6)알킬 기이고, 여기서 Rc는 수소 원자 또는 미치환 선형 또는 분지형 (C1-C4)알킬 기를 나타낸다. 이러한 구현예의 특정 별형에서, Rc는 수소 원자를 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 구현예에서, Y1은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 미치환되는 선형 또는 분지형인 (C1-C6)알킬 기를 포함하는 (C1-C6)알킬티오 기이다. 이러한 구현예의 별형에서, Y1은 메틸티오 기이다.
특정 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카르복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온 (엘라피브라노, ELA 또는 GFT505), 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-이소프로필옥시카르보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카르보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카르보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카르복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸 옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카르보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카르복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸프로판산, 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸-프로판산 이소프로필 에스테르, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 성분 (i)은 엘라피브라노 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본 발명의 문맥에서, 표현 "글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 수용체 효현제"는 GLP-1 유사체 및 GLP-1 유사체가 아닌 GLP-1 수용체 효현제를 의미한다. GLP-1 수용체 효현제 (GLP-1R 효현제라고도 표시)는 GLP-1 수용체에 결합하여 활성화시키는 화합물이다. 예시적인 GLP-1 수용체 효현제는 세마글루티드, 리라글루티드, 엑세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드, 릭시세나티드, 록세나티드, 에프페글레나티드, 타스포글루티드, MKC-253, DLP-205, ORMD-0901, LY-3305677, 옥신토모듈린 장기 지속형, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 성분 (ii)는 세마글루티드, 리라글루티드, 엑세나티드, 릭시세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드, 또는 이들 화합물 중 하나의 약학적으로 허용가능한 염이다.
특정 구현예에서, 성분 (ii)는 세마글루티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
다른 특정 구현예에서, 성분 (ii)는 리라글루티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본 발명에 따라서 성분 (i) 및 (ii)는 상기 화합물의 병용이 상승적 작용을 제공하도록 선택될 수 있다. 이러한 상승작용은 당분야에 충분히 공지된 방법에 따라서, 예컨대 블리스 초과 (Excess Over Bliss) (EOB, 또는 최고 단일 작용제 초과 (Excess over Highest Single Agent)) 방법을 사용하여, 결정할 수 있다. 병용 약물 산물의 승인을 위해서 FDA가 적용하는 이러한 방법은 기대 병용 효과가 개별적으로 복용 시 병용물의 최선의 성분으로 수득되는 효과보다 우수하다고 가정한다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 엘라피브라노 및 GLP-1R 효현제 예컨대 세마글루티드 또는 리라글루티드의 병용이 지방증 (간 지방), 트리글리세리드 수준, 체중 감량, 인슐린 수준 및 혈당증에 대해 상승적 작용을 일으킨다.
따라서, 특정 구현예에서, 성분 (i)은 엘라피브라노 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이고, 성분 (ii)는 세마글루티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
다른 특정 구현예에서, 성분 (i)은 엘라피브라노 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이고, 성분 (ii)는 리라글루티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 병용 산물은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 성분 (i) 및 (ii) 둘 모두를 포함하는 약학 조성물이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 병용 산물은 순차적, 별도 또는 동시 사용을 위한, 성분 (i) 및 성분 (ii)를 포함하는 부분의 키트이다. 이러한 구현예에서, 각각의 성분은 상이한 약학 조성물로 제제화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 약학 조성물은 약학적 상황 내에서 허용가능한, 하나 또는 몇몇의 부형제 또는 비히클 (예를 들어, 약학 용도와 상용성이고 당업자에게 충분히 공지된, 염수 용액, 생리적 용액, 등장성 용액 등)을 포함한다. 이들 조성물은 또한 분산제, 가용화제, 안정화제, 보존제 등에서 선택되는 하나 또는 몇몇의 작용제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 이들 제제 (액상 및/또는 주사용 및/또는 고형)에 유용한 작용제 또는 비히클은 특히 메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리솔베이트 80, 만니톨, 젤라틴, 락토스, 식물성 오일, 아카시아, 리포솜 등이다. 본 발명에서 사용되는 화합물은 장 또는 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 경구, 혈관내 (예를 들어, 정맥내 또는 동맥내), 근육내, 복강내, 피하, 경피 또는 비강 투여를 위해 제제화될 수 있다. 제제는 고형 또는 액상 제형일 수 있다. 예시적인 제제는 제한없이, 주사용 현탁제, 또는 경구 섭취용 현탁제, 겔, 오일, 알약, 정제, 좌제, 분말, 캡슐, 에어로졸, 연고, 크림, 패치, 또는 장기간 및/또는 지연 방출을 위한 생약 형태의 수단을 포함한다. 이러한 종류의 제제 경우에, 셀룰로스, 카보네이트 또는 전분같은 작용제가 유리하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 구현되는 화합물은 약학 용도와 상용성인 약학적으로 허용가능한 염, 특히 산 또는 염기 염으로서 제제화될 수 있다. 본 명세서에서 구현되는 화합물의 염은 약학적으로 허용가능한 산 부가 염, 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염, 약학적으로 허용가능한 금속 염, 암모늄 염 및 알킬화 암모늄 염을 포함한다. 이들 염은 화합물의 최종 정제 단계 동안 또는 이전에 정제된 화합물에 염을 도입시켜서 수득될 수 있다.
상기 제공되는 바와 같이, 활성 성분 (즉, 병용 산물의 성분 (i) 및 성분 (ii))은 하나 이상의 약학 조성물(들)로서, 예컨대 경구 섭취가 의도된 알약 또는 정제의 형태로, 투여를 위한 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 활성 성분은 하나 이상의 약학 조성물(들)로서, 예컨대 주사용 용액의 형태로, 투여를 위한 것이다.
추가의 특정 구현예에서, 활성 성분은 별도 조성물로서 투여를 위한 것이다.
다른 구현예에서, 성분 (i)은 경구 조성물의 형태이고, 성분 (ii)는 경구 조성물의 형태이다.
본 발명의 특정 구현예에서,
- 성분 (i)은 경구 투여를 위해, 엘라피브라노 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 고형 조성물 형태, 특히 알약 또는 정제, 보다 특히 정제의 형태이고;
- 성분 (ii)는 경구 투여를 위해, GLP-1R 효현제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 고형 제형, 특히 알약 또는 정제, 보다 특히 정제의 형태이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 성분 (ii)는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2012080471에 기술된 바와 같이, GLP-1R 효현제 및 N-(8-(2-히드록시벤조일)아미노)카프릴산의 염을 포함하는, 경구 투여를 위한 고형 제형이고, 다른 구현예에서, 성분 (ii)는 GLP-1 R 효현제 및 소듐 N-(8-(2-히드록시벤조일)아미노)카프릴산 (달리 SNAC 또는 살카프로제이트 소듐이라고 함)을 포함하는 경구 투여를 위한 고형 제형이다. 또 다른 구현예에서, 성분 (ii)는 세마글루티드 및 N-(8-(2-히드록시벤조일)아미노)카프릴산의 염, 예컨대 SNAC를 포함하는 경구 투여를 위한 고형 제형이다. 특정 구현예에서, 성분 (ii)는 정제의 형태이다.
추가 구현예에서, 성분 (i)은 경구 조성물의 형태이고 성분 (ii)는 주사용 용액의 형태이다.
또 다른 구현예에서, 성분 (i)은 주사용 용액의 형태이고 성분 (ii)는 경구 조성물의 형태이다.
추가 구현예에서, 성분 (i)은 주사용 용액의 형태이고 성분 (ii)는 주사용 용액의 형태이다.
투여에 대한 빈도 및/또는 용량은 치료하려는 대상체, 치료하려는 질환, 질환의 병기, 투여의 형태 등의 기능에 따라서, 당업자가 조정할 수 있다. 전형적으로, 성분 (i), 예컨대 ELA 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 0.01 mg/일 내지 4000 mg/일의 엘라피브라노, 예컨대 1 mg/일 내지 2000 mg/일, 특히 25 내지 1000 mg/일, 특히 50 내지 200 mg/일, 및 보다 더 특히 80 내지 120 mg/일의 엘라피브라노를 포함하는 용량으로 투여될 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 성분 (ii), 예컨대 세마글루티드 또는 루라글루티드, 특히 세마글루티드, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 0.001 mg/일 내지 200 mg/일, 예컨대 0.01 mg/일 내지 150 mg/일, 특히 0.1 mg/일 내지 100 mg/일을 포함하는 용량으로 투여될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 병용 산물의 성분의 용량은 다음과 같다:
- 성분 (i)은 0.01 mg/일 내지 4000 mg/일, 예컨대 1 mg/일 내지 2000 mg/일, 특히 25 내지 1000 mg/일, 특히 50 내지 200 mg/일, 및 보다 더 특히 80 내지 120 mg/일을 포함하는 용량으로 경구 투여를 위한 엘라피브라노의 고형 제형이고;
- 성분 (ii)는 1 내지 20 mg/일, 예컨대 3 내지 14 mg/일의 용량으로 경구 투여를 위한 세마글루티드의 고형 제형이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 병용 산물의 성분의 용량은 다음과 같다:
- 성분 (i)은 80 내지 120 mg/일을 포함하는 용량으로 경구 투여를 위한 엘라피브라노의 고형 제형이고;
- 성분 (ii)는 3 내지 14 mg/일을 포함하는 용량으로 경구 투여를 위한 세마글루티드의 고형 제형이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 병용 산물의 성분의 용량은 다음과 같다:
- 성분 (i)은 80 내지 120 mg/일을 포함하는 용량으로 경구 투여를 위한 엘라피브라노의 고형 제형이고;
- 성분 (ii)는 3 mg/일, 7 mg/일 또는 14 mg/일의 용량으로 경구 투여를 위한 세마글루티드의 고형 제형이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 병용 산물의 성분의 용량은 다음과 같다:
- 성분 (i)은 80 내지 120 mg/일을 포함하는 용량으로 경구 투여를 위한 엘라피브라노의 고형 제형이고;
- 성분 (ii)는 3 mg/일, 7 mg/일 또는 14 mg/일의 용량으로 경구 투여를 위한 세마글루티드의 고형 제형이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 병용 산물의 성분의 용량은 다음과 같다:
- 80 내지 120 mg의 엘라피브라노를 포함하는 정제는 1일 1회 투여되고;
- 3 mg, 7 mg 또는 14 mg의 세마글루티드를 포함하는 정제는 1일 1회 투여된다.
추가 구현예에서, 본 발명의 병용 산물의 성분의 용량은 다음과 같다:
- 80 mg의 엘라피브라노를 포함하는 정제는 1일 1회 투여되고;
- 3 mg, 7 mg 또는 14 mg의 세마글루티드를 포함하는 정제는 1일 1회 투여된다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 병용 산물의 성분의 용량은 다음과 같다:
- 120 mg의 엘라피브라노를 포함하는 정제는 1일 1회 투여되고;
- 3 mg, 7 mg 또는 14 mg의 세마글루티드를 포함하는 정제는 1일 1회 투여된다.
경구 세마글루티드의 용량은 당업자가 조정할 수 있다. 세마글루티드의 경구 제형은 Rybelsus®의 상표명으로 최근에 미국 식약청 및 유럽 의약청에 의해 승인받았다. 따라서 당업자는 2형 진성 당뇨병을 갖는 성인에서 혈당 제어의 개선을 위해 명시되는 바와 같이, 이러한 약물에 제공되는 처방 정보에 개시된 권고 용량을 기반으로 투여를 위한 세마글루티드의 용량을 결정할 수 있다. 간략하게,
- 경구 세마글루티드의 투여는 30일 동안 1일 1회 3 mg으로 시작될 수 있고;
- 3 mg 용량으로 30일 이후에, 용량은 1일 1회 7 mg까지 증가되며;
- 용량은 부가 효과, 예컨대 혈당 제어의 개선을 위한 투여 상황에서 부가적 혈당 제어가 7 mg 용량에서 적어도 30일 이후에 필요하다면 1일 1회 14 mg까지 증가될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 약물로서 사용을 위한, 본 발명의 병용물에 관한 것이다.
본 발명의 병용물은 체중을 감소시키기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 비만의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 본 발명의 병용물에 관한 것이다.
본 발명의 병용물은 또한 간 지방 (달리 "지방증"이라고 함)을 감소시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 본 발명의 병용물에 관한 것이다. 추가의 특정 구현예에서, NAFLD는 섬유화 NAFLD이고, 다시 말해서, 대상체는 간 섬유증을 수반하는 NAFLD를 갖는다. 다른 특정 구현예에서, NAFLD는 NASH이다. NASH는 또한 섬유화 NASH일 수 있고, 다시 말해서, 대상체는 간 섬유증을 수반하는 NASH를 갖는다.
본 발명의 병용물은 또한 혈당증을 감소시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 혈당증을 감소시키기 위한 방법에서 사용을 위한 본 발명의 병용물에 관한 것이다. 본 발명의 병용물은 또한 인슐린 수준을 제어하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 인슐린 수준을 제어하기 위한 방법에서 사용을 위한 본 발명의 병용물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 병용물은 당뇨병, 특히 2형 당뇨병의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 병용물은 2형 당뇨병을 갖는 대상체에서 혈당 제어를 개선시키기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
음식물 섭취는 본 발명의 병용물의 투여에 의해 영향받지 않는다는 것을 또한 본 명세서에서 확인하였다. 음식물 섭취의 감소는 GLP-1R 효현제의 유해 효과의 지시자이다. 따라서, 본 발명의 병용물은 GLP-1R 효현제의 유해 효과를 감소 또는 억제시키는데 유리하게 사용될 수 있다는 것이 본 명세서에서 확인된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 병용물은 감소 또는 억제된 유해 효과로, 체중 또는 체지방량을 감소시키기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다. 본 발명의 문맥에서, 표현 "감소 또는 억제된 유해 효과로"는 GLP-1R 효현제 단독 섭취와 일반적으로 연관된 적어도 하나 또는 모든 유해 효과, 예컨대 위-장 유해 효과, 예를 들어 구역, 구토, 설사, 복통 및/또는 변비의 감소 또는 억제를 의미한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 병용물은 감소 또는 억제된 유해 효과로, 비만의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 병용물은 감소 또는 억제된 유해 효과로, NAFLD의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 것이다. 특별한 별형에서, 병용물은 섬유화 NAFLD, NASH, 또는 섬유화 NASH의 치료를 위해 사용된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 병용물은 감소 또는 억제된 유해 효과로, 혈당증을 감소시키기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 병용물은 감소 또는 억제된 유해 효과로, 인슐린 수준을 감소시키기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 병용물은 감소 또는 억제된 유해 효과로, 당뇨병의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 감소 또는 억제된 유해 효과로, 2형 당뇨병의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한, 본 발명의 병용물에 관한 것이다.
본 발명의 병용물이 유리하게 체중의 조절을 허용한다는 것이 또한 본 명세서에서 확인된다. 따라서, 본 발명은 또한 체중을 조절하기 위한 방법에서 사용을 위한 본 발명의 병용물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 병용물은 비만의 치료를 위한 방법의 상황에서 체중을 조절하기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 병용물은 간 지방을 감소시키기 위한 방법의 상황에서, 예컨대 NAFLD의 치료를 위한 방법의 상황에서, 체중을 조절하기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다. 특별한 별형에서, 병용물은 섬유화 NAFLD, NASH, 또는 섬유화 NASH의 치료를 위한 방법의 상황에서, 체중을 조절하는데 사용된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 병용물은 혈당증을 감소시키기 위한 방법의 상황에서, 체중을 조절하기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 병용물은 인슐린 수준을 감소시키기 위한 방법의 상황에서 체중을 조절하기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 병용물은 당뇨병, 예컨대 2형 당뇨병의 치료를 위한 방법의 상황에서 체중을 조절하기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
놀랍게도, 본 발명의 병용물이 제공하는 상승적 효과 이외에도, 병용 산물의 성분 (i) 및 (ii)의 상기 병용물은 성분 (ii)의 감소된 용량에서 관찰되는 유리한 효과를 야기시킨다는 것이 또한 본 명세서에서 확인된다. 달리 말해서, 성분 (i)은 성분 (i) 및 성분 (ii) 둘 모두의 바람직한 효과로부터 여전히 이익을 얻으면서 성분 (ii)의 양을 감소시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 일반적으로 GLP-1R 효현제에서 관찰되는 유해 효과의 감소 또는 억제는 바람직한 치료적 효과에 영향을 미치지 않거나, 또는 유의하게 영향을 미치지 않고, 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 GLP-1 수용체 효현제의 투여를 필요로 하여서, GLP-1 수용체 효현제의 부작용을 감소시키는, 병태의 치료를 위한 방법에서 GLP-1 수용체 효현제와 병용하여 사용을 위한, PPAR 효현제, 예컨대 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다. 이러한 양태에서, GLP-1 수용체 효현제는 GLP-1 수용체 효현제가 단독으로 투여될 때 투여되는 양과 비교하여 감소된 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 GLP-1 수용체 효현제의 양의 감소는 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 3-배, 적어도 3.5-배, 적어도 4-배, 적어도 4.5-배, 적어도 5-배, 적어도 5.5-배, 적어도 6-배, 적어도 6.5-배, 적어도 7-배, 적어도 7.5-배, 적어도 8-배, 적어도 8.5-배, 적어도 9-배, 적어도 9.5-배, 또는 심지어 적어도 10-배일 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 GLP-1 수용체 효현제의 투여를 필요로 하여서, GLP-1 수용체 효현제와 연관된 부작용을 감소시키는, 병태의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한, 본 발명의 병용물에 관한 것이다. 본 발명 덕분에 감소되는 예시적인 부작용은 하기 부작용 중 적어도 하나, 또는 전부일 수 있다: 구역, 구토, 설사, 복통 및 변비.
본 발명은 또한 GLP-1 수용체 효현제의 투여를 필요로 하는 병태의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한, 본 발명의 병용물에 관한 것으로서, 대상체에게 투여되는 GLP-1 수용체 효현제의 양은 단독으로 투여될 때 요구되는 GLP-1 수용체 효현제의 양과 비교하여 감소된다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 GLP-1 수용체 효현제의 양의 감소는 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 3-배, 적어도 3.5-배, 적어도 4-배, 적어도 4.5-배, 적어도 5-배, 적어도 5.5-배, 적어도 6-배, 적어도 6.5-배, 적어도 7-배, 적어도 7.5-배, 적어도 8-배, 적어도 8.5-배, 적어도 9-배, 적어도 9.5-배, 또는 심지어 적어도 10-배일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 GLP-1 수용체 효현제의 투여가 필요한 병태의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 병용 산물에 관한 것으로서, 성분 (i)은 투여되어 성분 (ii)의 활성을 강화시킨다. 이러한 강화는 단독으로 투여될 때 요구되는 GLP-1 효현제의 양과 비교하여 감소된 GLP-1 수용체 효현제의 용량을 유리하게 야기시킬 수 있다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 GLP-1 수용체 효현제의 양의 감소는 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 3-배, 적어도 3.5-배, 적어도 4-배, 적어도 4.5-배, 적어도 5-배, 적어도 5.5-배, 적어도 6-배, 적어도 6.5-배, 적어도 7-배, 적어도 7.5-배, 적어도 8-배, 적어도 8.5-배, 적어도 9-배, 적어도 9.5-배, 또는 심지어 적어도 10-배일 수 있다.
물론, 상기 언급된 모든 GLP-1 수용체 효현제 용량 감소는 또한 GLP-1 수용체 효현제가 단독으로 사용될 때 정상적으로 사용되는 용량에 대한 백분율로서 표시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명 덕분에, 감소는 GLP-1 수용체 효현제가 단독으로 사용될 때 정상으로 사용되는 용량의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 심지어 50% 초과일 수 있다.
GLP-1 수용체 효현제의 상기 언급된 감소된 양의 예시적인 구현예는, 예를 들어, 상기 개시된 바와 같이 Ryblesus® 처방 정보에 개시된 용법에 따라서 경구로 투여되는 세마글루티드의 용량의 감소일 수 있다. GLP-1 수용체 효현제의 용량의 50% 감소와 함께, NASH (예컨대 섬유증 수반 NASH)의 치료, 또는 2형 당뇨병을 갖는 대상체에서 혈당 제어의 개선을 위한, 비제한적인 투여 용법의 예시가 하기에 제공된다:
- 경구 세마글루티드의 투여는 30일 동안 1일 1회 1.5 mg에서 출발할 수 있고;
- 3 mg 용량에서 30일 이후에, 용량은 1일 1회 3.5 mg 까지 증가되며;
- 용량은 부가 효과, 예컨대 혈당 제어의 개선을 위한 투여의 상황에서 부가적 혈당 제어가 3.5 mg 용량에서 적어도 30일 이후에 필요하면 1일 1회 7 mg 까지 증가될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 표현 "GLP-1 수용체 효현제가 명시되는 병태"는 제한없이, 그의 치료가 GLP-1 수용체 효현제의 투여로부터 이익을 얻게되는 병태 또는 질환을 포함한다. 이들은 제한없이, 당뇨병, 예컨대 2형 당뇨병, 비만, NAFLD 및 NASH를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 약어 ELA는 엘라피브라노를 지칭한다.
본 발명의 문맥에서, 약어 SEMA는 세마글루티드를 지칭한다.
본 발명의 문맥에서, 약어 LIRA는 리라글루티드를 지칭한다. 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료적 또는 예방적 처치를 지칭한다. 치료는 질환의 진행을 예방, 치유, 지연, 반전, 또는 둔화시켜서, 대상체의 병태를 개선시키기 위해, 선언된 질환을 갖는 대상체에게 본 발명의 병용물의 투여를 포함한다. 병용 산물은 또한 건강하거나 또는 질환이 발병될 위험성이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료하려는 대상체는 포유동물, 바람직하게 인간이다. 본 발명에 따라서 치료하려는 대상체는 그의 치료가 추구하는 특정 질환과 연관된 몇몇 기준 예컨대 이전 약물 치료, 연관 병리, 유전자형, 위험 인자에 대한 노출, 바이러스 감염을 기반으로 할 뿐만 아니라, 질환과 관련된 임의의 생물마커의 검출을 기반으로 선택될 수 있다.
투여는 매일 또는 필요하다면, 심지어 1일 당 수 회 수행될 수 있다. 치료의 지속기간은 치료하려는 특정 질환에 의존적일 것이다. 예를 들어, 투여는 1일 또는 수 일 동안, 예컨대 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 6일 또는 적어도 7일 동안 수행될 수 있다. 대안적으로, 투여는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 4주 동안 수행될 수 있다. 만성 질환의 경우, 투여는 4주 초과 동안, 예컨대 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 동안, 또는 6개월 초과, 예컨대 적어도 1년 또는 수년 동안 고려될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 병용 산물은 대상체의 생애 동안 투여될 수 있다.
본 발명은 하기의 비제한적인 예를 참조하여 더욱 설명된다.
도 1: 치료 40일 후 체중에 대한 10 mg/kg/일의 엘라피브라노 (ELA) 및 10 nmol/kg/일의 세마글루티드 (SEMA)의 병용 효과.
도 2: 0일 대비 상대적 체중 증량으로 표시되는, 치료 40일 후 체중에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 10 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 3: 치료 40일 후 간 트리글리세리드 함량에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 10 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 4: 치료 40일 후 혈당증에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 10 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 5: 치료 40일 후 인슐린혈증에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 10 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 6: 치료 40일 후 지방증에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 10 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 7A: 치료 28일 후 음식물 섭취에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 또는 1 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 7B: 치료 28일 후 체중에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 또는 1 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 8A: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에서 NAFLD 활성 점수에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 8B: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에서 지방증에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 8C: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에서 활성 지수 (풍선화 및 염증 점수의 총합)에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 8D: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에서 소엽 염증에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 9A: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에 간 트리글리세리드 함량 (TG)에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 9B 및 도 9C: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에서 혈장 트랜스아미나제 (ALT (도 9B 및 AST (도 9C))에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 9D: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에서 CRP에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 9E: 치료 12주 후 DIO-NASH 마우스에서 간 히드록시프롤린에 대한 10 mg/kg/일의 ELA 및 0.3 nmol/kg/일의 세마글루티드의 병용 효과.
도 10A: 도 10A는 DIO-NASH 마우스에서 ELA (10 mg/kg/일), SEMA (0.3 nmol/kg/일) 및 그들 병용물로 치료 12주 후 간의 전사체 분석에서 병리적 서명, 화합물의 효과 및 조절된 경로를 확인하기 위한 RNAseq 분석에 사용되는 알고리즘을 도시한다.
도 10B: DIO-NASH 마우스에서 ELA (10 mg/kg/일), SEMA (0.3 nmol/kg/일) 및 그들 병용물로 치료 12주 후 간의 전사체 분석에서 ELA/SEMA 병용에 관여되는 유전자의 벤 다이어그램.
도 10C: DIO-NASH 마우스에서 ELA (10 mg/kg/일), SEMA (0.3 nmol/kg/일) 및 그들 병용물로 치료 12주 후 간의 전사체 분석에서 ELA/SEMA로 강화된 상위 10개 경로의 목록.
도 10D: 점 도표는 DIO-NASH 마우스에서 ELA (10 mg/kg/일), SEMA (0.3 nmol/kg/일) 및 그들 병용물로 치료 12주 후 간의 전사체 분석에서 염증 경로에 관여되는 유전자에 대한 ELA/SEMA 병용의 상승작용을 도시한다.
도 10E: DIO-NASH 마우스에서 ELA (10 mg/kg/일), SEMA (0.3 nmol/kg/일) 및 그들 병용물로 치료 12주 후 간의 전사체 분석에서 섬유증 유전자의 발현.
도 11: 엘라피브라노와 GLP-1 수용체 효현제의 병용은 LPS-활성화 마크로파지에서 TNFα 분비를 상승적으로 억제한다. (A-B) 용량-반응 매트릭스의 TNFα 분비의 억제율, (C-D) 블리스 초과 (EOB) 부가작용 (additivism) 모델에 따른 분석, 및 (E,F) 한편으로는 엘라피브라노 및 세마글루티드 (A-C-E) 간, 그리고 다른 한편으로는 엘라피브라노 및 리라글루티드 (B,D,F) 간 대표적인 상승적 병용에 대해 막대 그래프로 그래프작성된 TNFα 분비. 데이터는 평균 (4중) ± 표준 편차 (SD)로서 표시된다.
도 12: 엘라피브라노와 GLP-1 수용체 효현제의 병용은 TGFβ-자극된 간 성상 세포에서 αSMA 생산을 상승적으로 억제한다. 병용물은 용량-반응 매트릭스 형식으로 시험되었고 블리스 초과 (EOB) 부가작용 모델에 따라서 분석되었다. αSMA 생산은 대표적인 상승적 병용물에 대한 막대 그래프 표시로 그래프 작성되었다. 데이터는 평균 (4중) ± 표준 편차 (SD)로서 표시된다.
도 13A: 치료 8주 후 NASH-B6 마우스에서 지방도에 대한 3 mg/kg/일의 ELA 및 0.02 mg/kg/일의 리라글루티드의 병용 효과. 부고환 지방 조직 (EAT) 중량은 각 마우스에서 체중 (BW)에 대한 비율로서 표시된다.
도 13B: 치료 8주 후 NASH-B6 마우스에서 에너지 소비에 대한 3 mg/kg/일의 ELA 및 0.02 mg/kg/일의 리라글루티드의 병용 효과.
도 14: 치료 8주 후 NASH-B6 마우스에서 간 콜레간 함량에 대한 3 mg/kg/일의 ELA 및 0.02 mg/kg/일의 리라글루티드의 병용 효과.
도 15: 치료 8주 후 NASH-B6 마우스에서 간 중 섬유증 유전자 발현에 대한 3 mg/kg/일의 ELA 및 0.02 mg/kg/일의 리라글루티드 병용의 효과.
도 16: NASH-B6 마우스에서 치료 8주 전 및 후에 혈당 전개에 대한 3 mg/kg/일의 ELA 및 0.02 mg/kg/일의 리라글루티드의 병용 효과.
도 17: 엘라피브라노는 고용량 세마글루티드와 유사한 수준까지 혈장 ALT 농도를 감소시키는 세마글루티드의 효과를 부양시킨다. 처치 그룹에서 ALT 수준은 AMLN-공급 비히클 그룹에 대해서 표시된다.
도 18: 엘라피브라노는 고용량 세마글루티드와 유사한 수준까지 혈장 CRP 농도를 감소시키는 세마글루티드의 효과를 부양시킨다. 처치 그룹에서 CRP 수준은 AMLN-공급 비히클 그룹에 대해서 표시된다.
도 19: 엘라피브라노는 고용량 세마글루티드의 간 유전자 서명을 요약한 간에 대한 세마글루티드의 효과를 부양시킨다. 각 처치에 대한 유전자 존재론 (GO) 범주 강화의 -log10(adj p값)이 표시된다. 높은 값은 처치에 의한 GO 범주의 높은 강화를 의미하는데, 즉 GO 범주에서 많은 유전자들은 처치에 의해 영향받는다. 값 "0"은 GO 범주로부터 오직 소수의 유전자가 처치에 의해 탈조절되었다는 것을 의미한다.
실시예
화합물
엘라피브라노는 Genfit에서 합성하였다. 세마글루티드 및 리라글루티드는 상업적으로 입수하였다.
엘라피브라노는 1% CMC + 0.1% Tween 80 중에 용해시켰다.
세마글루티드는 1% CMC + 50 mM Na2HPO4 + 70 mM NaCl + 0,05% Tween 80 중에 용해시켰다.
리라글루티드는 포스페이트 완충 염수 (PBS 1X) 중 BSA 0.1% 중에 용해시켰다.
통계 분석
통계 방법의 경우, 샤피로-윌크 (Shapiro-Wilk) 정규성 검정이 모든 미가공 데이터에 적용되었다.
정규 분포의 경우에, 사료 대 비히클 (Veh)의 비교는 단측 스튜던트 t-검정 (#)으로 수행된다. 웰치 (welch) (¤) 교정이 필요하면 적용될 수 있다.
다중 비교 검정의 경우, 일원 ANOVA 및 피셔 (Fisher)의 최소 유의차 (LSD) 사후 검정 (*)을 적용하였다.
다른 경우에, 사료 대 비히클 (Veh)의 비교는 단측 만-위트니 (Mann-Whitney) ($) 및 크루스칼 왈리스 (Kruskall Wallis) 비교정 던 (Dunn) 사후 검정 (§)이 다중 비교 검정에 적용되었다.
피셔의 정확 검정을 사용하여 분포 (￡)를 비교하였다.
약물 병용의 치료적 상승작용은 최고 단일 작용제 (highest single agent)(HSA) 초과 모델 (단측 통계 검정)을 사용하여 평가하였다.
#/¤/*/$/§/￡/°: p<0.05
##/¤¤/**/$$/§§/￡￡/°°: p<0.01
###/¤¤¤/***/$$$/§§§/￡￡￡/°°°: p<0.001
실시예 1: 숫컷 DIO-NASH 마우스에서 음식물 섭취 및 체중 조절에 대한 엘라피브라노 단독 또는 세마글루티드와의 병용물의 40일 처치의 효과
동물 모델
엘라피브라노 단독, 세마글루티드 단독 및 둘 모두의 병용물의 효과는 DIO-NASH 마우스 (아밀린 간 NASH 모델 식이 (AMLN) (연구 식이, 40% 지방 (18% 트랜스-지방), 40% 탄수화물 (20% 프룩토스), 및 2% 콜레스테롤))이 공급된 C57BL6JRj 마우스 (연구 시작 전 36주))에서 평가하였다. 41주령 숫컷 DIO-NASH 마우스는 비히클 (n=12), 또는 엘라피브라노 (10 mg/kg/일), 또는 세마글루티드 단독 (10 nmol/kg) (0.08 mg/mL의 증분을 사용해 5일 동안 최종 용량으로 적정) 또는 병용물 (그룹 당 n=12)이 보충된 비히클이 공급되었다.
체중은 1일 1회 모니터링되었다. 음식물 및 물 섭취는 1주 내지 2주 동안 1일 1회에 이어서, 후속 주간 동안 1주 1회 모니터링되었다.
꼬리 정맥으로부터 샘플 채취가 혈당, 혈장 인슐린, 알라닌 트랜스아미나제, 아스파테이트 트랜스아미나제, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤 용량에 대한 프로토콜 동안 수행되었다.
처치 마지막 날에, 혈장 샘플은 심장 천자 혈액 샘플 채취 후에 수득하였고 마우스를 희생시켰다. 생화학 및 조직학 분석을 위해 간을 신속하게 절제하였다.
모든 동물 절차는 표준 프로토콜에 따르고 실험 동물의 적절한 관리 및 사용에 대한 표준 권고에 따라서 수행하였다.
체중 및 음식물 섭취
체중은 1일 1회 모니터링되었다. 음식물 및 물 섭취는 1주 내지 2주 동안 1일 1회에 이어서, 후속 주간 동안 1주 1회 모니터링되었다.
40일에 최종 절대 체중이 도 1에 도시되어 있다. 0일과 비교된 40일에 상대적 체중이 또한 도 2에 도시되어 있다. 체중은 엘라피브라노 및 세마글루티드의 병용으로 유의하게 감소되었다.
생화학적 분석
간 트리글리세리드 함량의 측정
대략 100 mg의 냉동 간 조직을 15.4 mM NaN3을 함유하는, 150 mM NaCl 완충액 중에서 조직 균질화기 (Precellys®24, Bertin Technologies, France)를 사용해 균질화시켰다. 균질물 중 지질 분획을 클로로포름-메탄올 (2:1, v/v)로 추출하고 나서 트리글리세리드 (Biolabo cat #80019)의 측정을 후속하였다.
세마글루티드 (10 nmol/kg/일)의 처치는 이 모델에서 간 지방에 대한 유의하게 유리한 효과를 가졌다 (도 3). 세마글루티드와 엘라피브라노의 병용은 간 트리글리세리드 함량에 대해 유의한 효과를 야기시켰다.
혈당증의 측정
혈장 포도당 수준은 제조사의 권고에 따라서 Daytona 자동화용 Randox 키트 (Randox, cat# GL 3815)를 사용해 측정하였다. 이러한 방법은 샘플의 임의의 단백제거없이 비색 어세이를 기반으로 하였다. 간략하게, 샘플의 포도당 옥시다제 분해는 과산화수소 합성을 초래하였다. 페놀 및 4-아미노페나졸의 존재 하에서, 과산화수소는 퍼옥시다제에 의해 촉매되어서 염료: 퀴논이민을 형성하였다. 착색 강도는 포도당 농도에 직접적으로 비례하였고 505 nm에서 측정하였다. 결과는 mg/dL로 표시하였다.
엘라피브라노 (10 mg/kg/일) 단독 및 세마글루티드 (10 nmol/kg/일) 단독 처치는 이러한 모델에서 혈당증에 유익한 효과를 갖지 않았다 (도 4). 세마글루티드와 엘라피브라노의 병용은 혈당증에 유의한 효과를 야기하였다 (도 4).
인슐린혈증의 측정
혈장 인슐린은 Crystal Chem Inc.의 고체상 2-부위 효소 면역어세이 (cat#90010)를 사용해 측정하였다. 간략하게, 95 μL의 기니피그 항-인슐린 혈청 및 5 μL의 희석 샘플 (또는 표준물)은 96웰 플레이트에 웰 당 분배하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션 및 세척 후에, 100 μL의 퍼옥시다제에 접합된 항-기니피그 항체를 첨가하였고 1시간 동안 실온에서 추가 인큐베이션하여 반응을 발생시켰다. 이후에, 100 μL의 효소 기질을 분배하고 나서, 실온의 암실에서 30분의 추가 인큐베이션 기간을 후속하였다. 다음으로 반응은 100 μL의 중지 용액을 첨가하여 중단시켰고 450 nm에서 즉시 흡광도를 측정하였다 (파장 차감: 630 nm). 착색 강도는 샘플 중에 초기에 존재하는 인슐린의 양에 비례하였고 표준 혈청을 사용해 계산하였다. 결과는 ng/mL로 표시하였다.
세마글루티드 (10 nmol/kg/일) 처치는 이 모델에서 인슐린혈증에 대해 유의하게 유익한 효과를 가졌다 (도 5). 세마글루티드와 엘라피브라노의 병용은 인슐린혈증에 대해 유의한 효과를 야기시켰다 (도 5).
조직학
조직 포매 및 절편화:
간 조각을 먼저 포르말린 4% 용액 중에 12시간 동안 고정시켰다. 다음으로, 간 조각을 PBS에서 30분간 세척시키고 에탄올 용액 (70%, 80%, 95% 및 100% 에탄올의 연속 수조)에서 탈수시켰다. 간 조각은 크실렌 (Sigma-Aldrich cat# 534056)의 3개의 상이한 수조에 이어서, 액체 파라핀 중 2개 수조 (56℃)에서 인큐베이션되었다. 다음으로 간 조각은 완전하게 조직을 덮도록 Histowax®가 조심스럽게 충전된 랙에 넣었다. 조직 조각을 함유하는 파라핀 블록을 랙으로부터 제거하였고 실온에서 저장하였다. 간 블록을 3 μm 슬라이스로 절단하였다.
헤마톡실린/에오신/사프라닌 염색
간 절편을 탈파라핀화시키고, 재수화시켰으며 3분 동안 메이어 헤마톡실린 (Microm, cat #F/C0303)에서 인큐베이션시켰다. 다음으로, 간 절편은 물에서 세정하였고 1분 동안 에오신 Y 0.5% 알콜 (VWR, cat# 1.02439.0500) 및 에리트로신 0.5% 용액 (VWR, cat#1.15936.0010)에서 인큐베이션시켰으며, 에탄올로 세정하였다. 이어서 절편을 2분 동안 사프라닌에서 인큐베이션시켰고, 결국에 탈수시키고 CV 고정 매질 (Leica, cat #046430011)을 사용해 고정시켰다.
조직학적 검사
각각의 간 표본 출처에 맹검인 기술자가 조직학적 검사를 수행하였다. 3D Histech의 Pannoramic 250 스캐너를 사용해 가상 슬라이드를 생성시켰다. 각각의 동물에 대해서, NASH의 주요 조직학적 병변을 요약한 점수는 NASH 임상 연구 네트워크 (Kleiner 2005, Brunt 1999)에 따라서 부여되었다. 지방증을 채점하였다 (0-3).
NASH가 DIO-NASH 마우스에서 유도되었다. 중재 그룹의 동물은 전체 연구 기간 동안 엘라피브라노 또는 세마글루티드 또는 양쪽 화합물을 투약받았다. NASH 발생은 조직학을 통해서 평가하였다. 추가의 생화학적 및 분자적 분석이 또한 상이한 관련 생물마커에 대해 수행되었다.
DIO-NASH 마우스는 중증 질환이 높게 침투된 NASH-관련 조직학이 발생되었다. 진행성 지방증이 모든 동물에서 존재하였다.
세마글루티드와 엘라피브라노의 병용은 유의한 지방증 감소를 야기시켰다 (도 6).
실시예 2: 숫컷 DIO-NASH 마우스에서 음식물 섭취 및 체중 조절에 대한 엘라피브라노 단독 및 세마글루티드와의 병용물의 4주 처치의 효과
동물 모델
엘라피브라노 단독, 세마글루티드 단독 및 둘 모두의 병용물의 효과를 DIO-NASH 마우스에서 평가하였다. 42-44주령 숫컷 DIO-NASH 마우스는 비히클 (n=6), 또는 엘라피브라노 (10 mg/kg/일), 또는 세마글루티드 단독 또는 병용물 (그룹 당 n=6)이 보충된 비히클을 4주 동안 공급받았다. 병용물은 2 용량의 세마글루티드와 평가되었다:
- 세마글루티드 0.3 nmol/kg
- 세마글루티드 1 nmol/kg
체중, 음식물 및 물 섭취는 1일 1회 모니터링되었다.
처치 마지막 날에, 혈장 샘플은 안구 후면 혈액 샘플채취로부터 수득하였고 마우스는 6시간-금식 기간 이후에 희생시켰다. 간은 생화학적 및 조직학적 분석을 위해 신속하게 절제되었다.
모든 동물 절차는 표준 프로토콜에 따라서 실험 동물의 적절한 관리 및 사용에 관한 표준 권고에 따라서 수행되었다.
체중 및 음식물 섭취
체중은 1일 1회 모니터링되었다. 음식물 및 물 섭취는 28일 동안 1일 1회 모니터링되었다.
누적 음식물 섭취 평균은 도 7A에 도시되어 있다. 안정한 음식물 섭취는 모든 처치된 그룹에 대해서, 특히 0.3 또는 1 nmol/kg 용량의 세마글루티드와 엘라피브라노의 병용물에 대해서 그 기간 동안 목격되었다. 이러한 효과는 엘라피브라노와 세마글루티드의 병용물이 세마글루티드의 유해 효과를 감소시킨다는 것을 입증한다.
28일 기간의 종료 시에 최종 절대 체중은 도 7B에 도시되어 있다. 체중은 시험된 2개 용량에서 엘라피브라노 및 세마글루티드의 병용물에 의해 유의하게 감소되었다.
우리는 3 내지 10배 더 낮은 세마글루티드 용량에서 체중 감량에 대한 엘라피브라노 및 세마글루티드의 병용물의 유의한 효과를 확인하였다. 게다가, 엘라피브라노 및 세마글루티드의 병용물은 NASH를 포함한, 수많은 질환에 대한 치료적 관심을 제시하고, 세마글루티드의 유해 효과를 감소시킨다.
실시예 3: 숫컷 DIO-NASH 마우스에서 NASH에 대한 엘라피브라노 단독 및 세마글루티드와의 병용물의 12주 처치의 효과
동물 모델
숫컷 C57BL/6JRj 마우스는 연구 시작 전 35주간 AMLN 식이를 공급받았다 (DIO-NASH 모델). 지방증 (점수 ≥ 2) 및 섬유증 (점수 ≥ 1)이 생검 확인된 마우스를 처치 그룹 (그룹 당 n=12-14)으로 임의 추출하였다. 마우스는 비히클, 엘라피브라노 (10 mg/kg/일, 구강), 세마글루티드 (0.3 nmol/kg/일, SC) 또는 엘라피브라노 및 세마글루티드를 12주 동안 투약받았다. 최적 이하 약물 용량이 이 연구에서 사용되었다. SEMA-유도 절식을 피하기 위해서, 상향-적정 프로토콜이 처치의 처음 3주 동안 적용되었다.
처치 마지막 날에, 혈장 샘플은 심장 천자 혈액 샘플채취 이후에 수득되었고 마우스를 희생시켰다. 조직학 및 생물학적 및 전사체 분석을 위해 간을 신속하게 절제하였다.
모든 동물 절차는 표준 프로토콜에 따르고 실험 동물의 적절한 관리 및 사용에 대한 표준 권고에 따라서 수행하였다.
NASH의 조직학적 평가
실시예 1에 기술된 바와 같이 간 절편을 준비하고 헤마톡실린 에오신 사프라닌 (HES)으로 염색하였다. NASH의 조직학적 특성 (지방증, 풍선화, 소엽 염증 및 섬유증)은 실험 그룹에 맹검인 조작자가 NASH 임상 연구 네트워크 채점 체계를 사용해 평가하였다 (Kleiner 2005, Brunt 1999). 지방증 점수, 활성 지수 (간세포 풍선화 + 소엽 염증) 및 NAFLD 활성 점수 (NAS)를 계산하였다. 염증 병소의 개수는 200x 배율을 사용해 시야 당 계측하였다.
포함 시에, 마우스는 5 내지 7의 중증 NASH 표현형 (NAFLD 활성 점수 (NAS), 및 적어도 2의 섬유증 병기를 가졌다. ELA/SEMA 병용물로 12주 처치 이후에, NAS는 마우스의 14%에서 3병기만큼 감소되었고, 마우스의 44%에서 2병기만큼 감소되었다 (도 8A). 저용량의 ELA 또는 저용량의 SEMA를 투약받은 어떠한 마우스도 1병기가 넘게 NAS 감소를 보이지 않았다. 이러한 하락은 지방증 (도 8B) 및 활성 지수 (도 8C) 둘 모두에서의 감소로 설명되었다. 간 염증 병소의 수는 특히 병용물 처치로 하락되었다 (-59%) (도 8D).
생화학적 분석
간 샘플을 균질화시켰고, 가열하여 5% NP-40 중에 트리글리세리드 (TG)를 추출하였다. 간 TG 함량을 비롯하여 혈장 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준은 제조사의 설명서에 따라서 상업적 키트 (Roche Diagnostics) 및 Cobas™ C-501 자동분석기를 사용해 측정하였다. 혈장 C-반응성 단백질 (CRP) 농도는 ELISA (마우스 C-반응성 단백질/CRP 면역어세이 MCRP00, R&D Systems)를 통해서 측정하였다. 간 콜라겐은 콜라겐의 주요 성분인, 히드록시프롤린의 비색 검출을 사용해 평가하였다 (QZBhypro, Quickzyme).
ALT 및 AST는 간세포 손상의 경우에 혈장에서 농도가 증가되는 간 효소이다. 혈장 CRP는 전형적으로 낮은 등급 염증을 수반하는 물질대사 질환 예컨대 NASH에서 상승되는 간 염증의 마커이고, 임상에서 심혈관 위험성과 상관있다. 예상대로, 혈장 ALT, AST 및 CRP 수준은 47주의 AMLN 식이 이후에 상승되었다. 흥미롭게도, 혈장 ALT (-60%), AST (-56%) 및 CRP (-56%)를 비롯하여, 간 트리글리세리드 (-56%)의 강력한 감소가 또한 ELA/SEMA 부문에서 관찰되어서, 간 조직학에 대한 효과를 확증하였다 (도 9 A-D). 섬유증 개선이 ELA를 투약받은 동물에서 관찰되었고 SEMA와의 병용물은 간 콜라겐 함량을 더 감소시키는 경향이 있었다 (도 9E).
전사체 분석
총 RNA는 제조사의 설명서에 따라서 Nucleospin® 96 RNA 키트 (Macherey Nagel)를 사용해 마우스 간으로부터 단리하였다. Illumina NexSeq 500 시퀀싱 기술을 사용하여 간에 대한 RNAseq 데이터를 생성시켰다 (그룹 당 n=5). 미가공 FASTQ 파일은 그들 품질 점수의 함수에 따라서 3' 말단에서 정돈되었다 (프레드 (Phred) 점수). 사용된 매개변수는 25의 말단 최소 품질 수준 및 50의 최소 판독 길이이다. 비정렬된 판독치는 소프트웨어 STAR 버전 2.5.3을 사용하여 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) mm10 기준 게놈에 대해 정렬되었다. 디폴트 매개변수가 사용된다. 디폴드 매개변수로 featureCounts v1.5.3을 사용하여 계측표를 생성시켰다. 차등적으로 발현되는 유전자 (DE 유전자)를 확인하기 위해서, 우리는 R (버전 3.5.3) 및 DESEq2 라이브러리 (v. 1.22.2)를 사용하였다. 간략하게, FeatureCounts에 의해 생성된 계측 매트릭스는 DESeq2 라이브러리로부터의 DESeqDataSetFromMatrix() 함수에 이어서 DEseq() 함수를 통해서 분석하였다. 각 조건 (즉 ELA/SEMA 대 AMLN의 비교)의 경우에, 배수 변화 및 p-값은 DESeq2로부터 결과() 함수를 사용해 검색되었다. 조정된 p-값 < 0.01 및 |배수 변화| > 1.5를 갖는 유전자는 DE 유전자로서 간주되었다. 키로서 Ensembl ID를 사용해 상이한 표를 병합하였다. 유전자 주석은 biomaRt 라이브러리 (v. 2.38.0)를 사용해 검색되었다. 조건 당 DE 유전자의 선택 시, 유전자 존재론 분석은 메타스케이프 (Metascape)를 사용해 수행되었다.
심층 간 전사체 리모델링이 보고되었다. 2194개 유전자 세트는 각각 ELA 및 SEMA 단일요법 부문의 1140개 및 55개 유전자 대비 ELA/SEMA 병용물 부문에서 차등적으로 조절되었다 (도 10A-B). SEMA 처치는 지질 물질대사-관련 유전자의 발현에 오직 중간정도로 영향을 미쳤다. 놀랍게도, 간에서 ELA/SEMA 병용물의 전사체 서명은 염증 경로에 대해서 특히 강화되었고, 특히, 골수성 세포 마커는 병용물을 투약받은 동물에서 선택적으로 감소되었다 (도 10C-D). 게다가, 일부 섬유증 유전자는 병용물 처치에 의해 선택적으로 감소되어서 (도 10E), 섬유증 진행을 둔화시키는 병용물의 치료적 이득을 시사하였다.
저용량의 엘라피브라노 및 세마글루티드의 병용물은 AMLN 식이-유도 질환 모델에서 중증 NASH 표현형 및 간 손상 마커를 경감시킨다. 전사체 분석은 ELA 및 SEMA가 상승작용하여서 간에서 염증성 침윤을 특이적으로 감소시키고 섬유형성을 약화시킨다는 것을 밝혀주었다.
실시예 4: 엘라피브라노와 GLP-1 수용체 효현제의 병용물은 면역 세포의 활성화를 상승적으로 억제시킨다
LPS-활성화 마크로파지에서 병용물 처치
인간 THP-1 단핵구는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, 15140122) 및 25 mM Hepes (Gibco, 15630080)가 보충된 RPMI1640 (Gibco, 21875) 중에서 384-웰 플레이트의 웰 당 25,000 세포의 밀도로 파종되었고 PMA (포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, Sigma, P8139)를 100 ng/mL의 최종 농도로 24시간 동안 사용하여 마크로파지로 분화시켰다.
2 성분 병용물 매트릭스를 제조하였다. ELA 및 GLP-1 수용체 효현제 스톡은 GLP1RA에 대한 96웰 플레이트의 컬럼에서 8-점 시리즈 및 열에서 3-점 시리즈 (ELA)로 DMSO 중에 연속으로 희석되었다. 후속하여, 3X8 병용 매트릭스는 모든 단일 작용제 농도의 1:1 혼합으로 생성시켰다.
PMA와 24시간 이후에, 배지를 제거하였고, 무혈청 RPMI로 교체하였다. 다음으로, 혈청-고갈 THP1 마크로파지를 24시간 동안 화합물과 사전인큐베이션시킨 후에 추가 6시간의 기간 동안 리포폴라사카라이드 LPS (이. 콜라이 055 B5) (Sigma, L6529)를 첨가하였다.
인간 TNFα는 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRET 기술을 기반으로, HTRF 기술 (Homeogenoeus Time Resolved Fluorescence) (Cisbio 62HTNFAPEG)을 사용하여 상청액에서 정량하였다. 세포 상청액, 샘플, 및 표준물은 HTRF® 시약을 통한 검출을 위해 어세이 플레이트에 직접 분배되었다. HTRF 도너 및 억셉터로 표지된 항체는 사전 혼합하였고 단일 분배 단계로 첨가되었다. 665 nm에서 검출된 신호 강도는 형성된 항원-항체 복합체의 수 및 그러므로 TNFα 농도에 비례한다. 7점 표준 곡선 (39 pg/mL 내지 2500 pg/mL의 공급된 인간 TNFα 사용)은 4 매개변수 로지스틱 모델로 데이터를 적합화시켜서 수득하였다.
화합물 간 상승작용은 블리스 초과 (EOB) 방법을 사용해 결정하였다.
TNFα HTRF 어세이로 수득된 값은 먼저 LPS 대조군에 대한 억제율로 전환되었다. 다음으로, 이들 억제율을 사용하여, EOB를 계산하였다. 예상되는 블리스 부가작용 점수 (E)는 다음의 방정식을 통해서 먼저 결정하였다:
E = (A + B) - (A Х B) (식에서, A 및 B는 소정 용량에서 엘라피브라노 (A) 및 GLP-1 유사체 (B)의 억제율임). 동일한 용량에서 병용된 ELA/GLP-1 유사체의 관찰된 억제 및 블리스 기대 간 차이가 '블리스 초과' 점수이다.
- 블리스 초과 점수 = 0은 병용물 처치가 부가적 (독립 경로 효과에 대해 기대한 바와 같음)임을 의미하고;
- 블리스 초과 점수 > 0는 부가를 초과하는 활성 (상승작용)을 의미하고;
- 블리스 초과 점수 < 0는 병용물이 부가 미만 (길항작용)임을 의미한다.
총 블리스 점수는 모든 EOB의 부가에 의해 계산되었다.
물질대사 질환 예컨대 NAFLD/NASH는 저-등급 염증과 연관된다. 면역 세포의 활성화는 간 및 말초 장기 (지방 조직, 췌장...)의 물질대사 기능을 변경시키는 사이토카인을 생산한다. 물질대사 및 간 질환을 설명하는, 내장 투과성은 증가된 순환성 박테리아 성분, 예컨대 LPS를 야기시켜서, 간 및 말초 장기 (지방 조직)에서 마크로파지를 활성화시킨다. 염증 경로에 대한 실시예 3의 엘라피브라노 및 세마글루티드 사이의 상승작용을 고려하여, 엘라피브라노 및 상이한 GLP-1 수용체 효현제가 상승작용하여서 LPS에 의한 마크로파지 활성화를 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다. 마크로파지로 분화된 THP1 단핵구에서, LPS 처치는 LPS에 의해 대략 4-배 증가되는 TNFα 분비로 측정시, 마크로파지를 활성화시킨다 (도 11 E-F). 엘라피브라노 단독의 최대 효과는 1 μM의 용량에서 관찰되었고 TNFα 분비의 85% 억제에 도달하였다 (도 11B). 반대로, GLP-1 수용체 효현제의 최대 효과는 세마글루티드 및 리라글루티드의 경우에 각각이 TNFα 억제가 29% 및 38%였다 (도 11 A-B). 생체내 (실시예 3)에서 관찰된 바와 같이, 엘라피브라노 및 세마글루티드의 병용물은 저용량에서 염증을 감소시키도록 상승작용한다: 0.07 μM의 엘라피브라노가 0.7 nM 세마글루티드와 상승작용하여 TNFα 분비를 56% 까지 감소시켰다 (도 11E). 놀랍게도, 0.1 μM 엘라피브라노는 또한 리라글루티드 (0.003 nM)와 상승작용하여 TNFα 분비를 83% 까지 감소시켰다 (도 11F).
이들 결과는 NASH 및 물질대사 질환을 포함한, 다수의 질환에서 관찰되는 염증성 경향을 감소시키기 위해 상이한 GLP-1 수용체 효현제와 상승작용하는 엘라피브라노의 능력을 보여준다.
실시예 5: 엘라피브라노와 GLP-1 수용체 효현제의 병용물은 간 성상 세포 (HSC) 활성화를 상승적으로 억제한다
TGFβ-자극된 HSC에서 병용 처치
인간 초대 간 성상 세포 (hHSC) (Innoprot)는 2% 태아 소 혈청 (FBS, ScienCell cat# 0010), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (ScienCell cat# 0503) 및 성상 세포 성장 보충물 (SteCGS; ScienCell cat# 5352)이 보충된 STeCM 배지 (ScienCell cat# 5301)에서 배양하였다. 세포 배양 플라스크는 더 나은 부착을 위해서 폴리-L 리신 (Sigma cat# P4707)으로 코팅되었다.
2 성분 병용 매트릭스를 제조하였다. ELA 및 GLP-1 수용체 효현제 스톡은 GLP-1 수용체 효현제에 대해 96웰 플레이트의 컬럼에서 7-점 시리즈 및 열에서 3-점 시리즈 (ELA)로 DMSO에 연속으로 희석하였다. 후속하여, 3X7 병용 매트릭스는 모든 단일 작용제 농도의 1:1 혼합으로 생성되었다.
후속하여 세포를 6500 세포/웰의 밀도로 384-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날에, 세포-배양 배지를 제거하였고, 세포를 PBS (Invitrogen cat# 14190)로 세척하였다. hHSC는 무혈청 및 SteCGS-무함유 배지에서 24시간 동안 고갈시켰다. ELA, GLP-1 수용체 효현제 및 각 병용물 처치 경우에, 혈청-고갈 hHSC는 1시간 동안 화합물과 사전 인큐베이션된 이후에 추가 48시간 기간 동안 무혈청 및 SteCGS-무함유 배지에서 프로-섬유형성 자극 TGF-β1 (PeproTech cat# 100-21, 3 ng/mL)를 첨가하였다.
인간 α-평활근 액틴 (αSMA)은 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRET 기술을 기반으로, HTRF 기술 (Homeogenoeus Time Resolved Fluorescence) (Cisbio 62HTNFAPEG)을 사용해 세포 용해물에서 정량하였다. 희석된 세포 용해물, 샘플, 및 표준물은 HTRF® 시약으로 검출을 위해 어세이 플레이트에 직접 분배되었다. HTRF 도너 및 억셉터로 표지된 항체는 사전 혼합되고 단일 분배 단계에서 분배된다. 620 nm에서의 신호 대비 66 nm에서 검출된 신호 강도의 HTRF 비율은 형성된 항원-항체 복합체의 수 및 그러므로 αSMA 농도에 비례한다.
간 손상 이후에, 휴지기 HSC는 α-SMA-양성 근섬유아세포로 분화를 특징으로 하는 활성화 과정을 겪는다. 엘라피브라노는 프로섬유형성 사이토카인 TGFβ1로 활성화된 hHSC에서 항섬유증 활성을 갖는다. α-SMA 생산은 3 μM의 ELA에 의해 61%까지 감소되었다 (미도시). 세마글루티드 및 리라글루티드 단독은 α-SMA 생산을 오직 중간정도로 감소시켰다 (세마글루티드 경우 Emax -12%, 리라글루티드 경우 Emax -30%). 그러나, 엘라피브라노는 세마글루티드 및 리라글루티드와 상승작용하여서 활성화된 HSC에서 α-SMA 생산을 감소시킨다 (도 12). 상승작용의 최고 예 중 하나는 도 12E에 도시되어 있는데 0.3 μM의 ELA 및 0.01 μM의 세마글루티드는 αSMA 생산의 84% 억제에 도달하는데 반해서, 0.003 μM의 리라글루티드 단독은 임의의 항섬유증 활성을 보이지 않고, 0.1 μM의 엘라피브라노에 이의 첨가는 상승적 방식으로 αSMA 생산을 감소시켰고 최대 62%의 억제에 도달하였다 (도 12F).
이들 결과는 엘라피브라노 및 GLP-1 수용체 효현제가 상승작용하여 섬유형성을 감소시켜서, 섬유화 NASH에 대한 치료적 잠재성을 부여한다는 것을 확증한다.
실시예 6: 식이-유도 NASH의 마우스 모델에서 지방도, 혈당 및 간에 대한 엘라피브라노 단독 및 리라글루티드와의 병용의 8주 처치의 효과
동물 모델
숫컷 C57BL/6NTac 마우스 (Taconic, USA)는 NASH 병리를 유도하기 위해 연구 시작 전 31주에 GAN 식이 (D09100310 연구 식이)가 공급되었다 (NASH-B6 모델). 처치 전에, 혈액은 혈장 ALT, AST, TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1 (TIMP1, 간 섬유증의 대리 마커)을 측정하기 위해 6시간-금식 기간 이후에 안구 후면 부비동 천자를 통해 수집되었다. 혈당은 6시간-금식 기간 이후에 WellionVet 혈당계 (CALEA)를 사용해 꼬리 정맥으로부터 직접 측정하였다. 케톤 바디 (KB)는 또한 FreeStyle Optium Neo 케토미터를 사용해 꼬리 정맥으로부터 직접 측정하였다. 마우스는 체중, 혈당증, 케톤혈증 및 혈장 ALT, AST 및 TIMP1을 기반으로 처치 그룹 (n=10/그룹)으로 임의추출하였다. 그들은 비히클, 엘라피브라노 (3 mg/kg/일, 구강), 리라글루티드 (0.01 mg/kg, BID, SC) 또는 엘라피브라노 및 리라글루티드 둘 모두를 8주 동안 투약받았다. GLP-1 수용체 효현제-유도 절식을 피하기 위해서, 처음 3주 처치 (0.001 mg/kg BID에서 출발) 동안 리라글루티드에 상향-적정 프로토콜을 적용하였다. 비히클-투약 사료-공급 마우스가 추가 대조군으로서 제공되었다 (R03-10 U8211G10R, SAFE).
체중 및 음식물 섭취는 처치 기간 동안 매일 모니터링되었다. 처치의 마지막 날에, 혈청 샘플은 안구 후면 부비동 천자 혈액 샘플 채취 후에 수득되었고 마우스를 희생시켰다. 조직학 및 생화학 및 전사체 분석을 위해 간을 신속하게 절제하였다. 부고환 지방 조직을 칭량하였다.
모든 동물 절차는 표준 프로토콜에 따르고 실험 동물의 적절한 관리 및 사용에 대한 표준 권고에 따라서 수행하였다.
GAN 공급 39주 이후에, NASH-B6 마우스는 비만이었다 (48 g). 리라글루티드와 병용하거나 또는 그렇지 않은, 엘라피브라노의 처치 8주에 체중이 15% 까지 감소되었다 (미도시). 지방도는 엘라피브라노에 의해 감소되었고 병용 처치에 의해 더욱 감소되었다 (도 13A). 이 연구에서 사용된 최적 이하 약물 용량 덕분에, 리라글루티드는 절식 효과를 갖지 않았다 (도 13B).
생화학적 분석
간 콜라겐 함량은 적절한 QuickZyme 키트 (총 콜라겐 어세이, cat# QZB-totcol2)를 사용해 결정하였다. 어세이는 콜라겐 삼중 헬릭스에 주로 존재하는 비-단백원성 아미노산인, 히드록시프롤린의 검출을 기반으로 한다. 따라서, 조직 가수분해물 중 히드록시프롤린은 조직에 존재하는 콜라겐의 양의 직접 측정으로서 사용될 수 있다 (프로콜라겐, 성숙 콜라겐 및 콜라겐 분해 산물간 구별없음). 95℃에 6M HCl 중에서 조직 샘플의 완전한 가수분해가 히드록시프롤린을 적량하기 전에 요구된다. 어세이는 570 nm에서 최대 흡광도로 색소원의 발생을 야기시킨다. 결과는 콜라겐의 μg/간의 mg으로서 표시된다.
NASH-B6 마우스는 모든 마우스, 소엽 염증 및 콜라겐 침착에서 3의 최대 지방증 점수를 특징으로 하는 간 병변을 발생시켰다 (미도시). 병용물 처치는 콜라겐 함량을 유의하게 감소시켰지만 단일요법은 유의한 효과를 갖지 않아서 (도 14), 이들 저용량에서, 오직 병용물 처치만이 간 손상을 경감시킬 수 있었다는 것을 시사한다.
간 유전자 발현 분석
총 RNA는 제조사의 설명서에 따라서 Nucleospin® 96 RNA 키트 (Macherey Nagel)를 사용해 마우스 간으로부터 단리되었다. 총 RNA는 5x RT 완충액 (Invitrogen), 10 mM DTT (Invitrogen), 10 mM dNTP (Promega), 200 ng pdN6 (Amersham) 및 40 U의 RNase 억제제 (Promega) 중에서 M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) (Invitrogen cat# 28025)를 사용해 cDNA로 역전사되었다. 다음으로, 정량적 PCR을 CFX96 Touch™ 실시간 PCR 검출 시스템 (Biorad)을 사용해 수행하였다. 간략하게, PCR 반응은 하기 프라이머를 사용하여, 5 μL의 역전사 반응물, 0.5 μL의 역방향 및 전방향 프라이머 (각각 10 mmol), 및 12,5 μl의 2X iQ SYBR Green Supermix (BioRad)를 함유하는 25 μl의 총 부피에서 96-WP 형식으로 수행하였다:
Figure pct00002
발현 수준은 샘플 중 하우스키핑 유전자로서 NONO 유전자의 발현을 사용해 정규화하였다. 표준 곡선은 100%에 가까운 PCR 반응 효율 및 1에 가까운 상관 계수를 갖기 위해서 최고 점 (적어도 3개 점)을 선택하여 작성하였다. 발현 수준은 하우스키핑 유전자 및 표적 유전자 둘 모두에 대한 표준 곡선 방정식을 사용해 결정하였다 (각 표적 유전자의 특이적 PCR 효율을 고려).
예상대로, 섬유증 유전자 Col1a1의 발현은 GAN 공급된 NASH-B6 마우스에서 유도되었다 (도 15). Col1a1 발현은 엘라피브라노 처치로 감소되었고 리라글루티드 병용으로 더욱 감소되었다.
혈당은 치료 8주 전 및 후, 6시간 금식 기간 후에, WellionVet 혈당계 (CALEA)를 사용해 꼬리 정맥으로부터 직접 평가하였다. 도 16은 GAN 식이 공급된 비히클 그룹의 것과 비교하여 처치에서의 혈당의 전개를 도시한다. 이 연구에서, ELA (3 mg/kg/일) 및 리라글루티드 (0.02 mg/kg/일)는 혈당증에 대한 효과를 갖지 않았다. 그러나, 병용물 처치는 극적으로 혈당증을 66%까지 감소시켰다.
이들 결과는 엘라피브라노가 또한 리라글루티드와 상승작용하여 지방도를 감소시키고, 간 병변을 경감시키며, 섬유형성을 감소시키고 포도당 항상성을 개선시킨다는 것을 보여주어서, 2형 당뇨병 및 NASH를 갖는 환자를 치료하기 위한 엘라피브라노 및 GLP-1 수용체 효현제 간 병용 요법의 치료적 이득을 확증한다. 이러한 상승작용은 GLP-1 수용체 효현제의 치료적 용량의 감소를 가능하게 하므로, 그들 유해 효과를 제한한다.
실시예 7: 엘라피브라노는 저용량의 GLP1 수용체 효현제의 효과를 강화시킨다
동물 모델
엘라피브라노 단독, 세마글루티드 (저용량 및 고용량) 단독 및 그들 병용물의 효과는 DIO-NASH 마우스 (아밀린 간 NASH 모델 식이 (AMLN) (연구 식이, 40% 지방 (18% 트랜스-지방), 40% 탄수화물 (20% 프룩토스), 및 2% 콜레스테롤)가 공급된 C57BL6JRj 마우스) (연구 시작 전 35주)에서 평가되었다. 지방증 (점수 ≥ 2) 및 섬유증 (점수 ≥ 1)이 생검 확증된 마우스는 처치 그룹 (그룹 당 n=12)으로 임의 추출되었다. 마우스는 비히클, 엘라피브라노 (10 mg/kg/일, 구강), 저용량 세마글루티드 (0.3 nmol/kg/일, SC), 고용량 세마글루티드 (10 nmol/kg/일, SC) 또는 병용하여 엘라피브라노 (10 mg/kg/일) 및 세마글루티드 (0.3 nmol/kg/일)를 투약받았다.
마지막 처치일에, 혈장 샘플은 심장 천자 혈액 샘플채취 후에 수득되었고 마우스를 희생시켰다. 전사체 분석을 위해서 간을 신속하게 절제하였다.
모든 동물 절차는 표준 프로토콜에 따르고 실험 동물의 적절한 관리 및 사용에 대한 표준 권고에 따라서 수행하였다.
혈장 마커 평가
알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준은 제조사의 설명서에 따라서 Cobas™ C-501 자동분석기를 사용해 측정하였다. C-반응성 단백질 (CRP) 농도는 ELISA (마우스 C-반응성 단백질/CRP 면역어세이 MCRP00, R&D Systems)로 측정하였다.
전사체 및 유전자 존재론 분석
총 RNA는 제조사 설명서에 따라서 Nucleospin® 96 RNA 키트 (Macherey Nagel)를 사용해 마우스 간으로부터 단리하였다. Illumina NexSeq 500 시퀀싱 기술을 사용하여 간에 대한 RNAseq 데이터를 생성시켰다 (그룹 당 n=5). 미가공 FASTQ 파일은 그들 품질 점수 (프레드 점수)의 함수에 따라서 3' 말단에서 정돈된다. 사용된 매개변수는 25의 말단 최소 품질 수준 및 50의 최소 판독 길이이다. 비정렬된 판독치는 소프트웨어 STAR 버전 2.5.3을 사용해 무스 무스쿨루스 mm10 기준 게놈에 대해 정렬되었다. 디폴트 매개변수가 사용된다. 디폴트 매개변수로 featureCounts v1.5.3을 사용하여 계측표를 생성시켰다. 차등적으로 발현되는 유전자 (DE 유전자)를 확인하기 위해서, 우리는 R (버전 3.5.3) 및 DESEq2 라이브러리 (v. 1.22.2)를 사용하였다. 간략하게, FeatureCounts에 의해 생성된 계측 매트릭스는 DESeq2 라이브러리로부터의 DESeqDataSetFromMatrix() 함수에 이어서 DEseq() 함수를 통해서 분석하였다. 차등적으로 발현된 (DE) 유전자의 목록을 각 비교를 위해 확립하였다 (즉, SEMA-10 vs AMLN, SEMA-0.3 vs AMLN, ELA vs AMLN, ELA+SEMA-0.3 vs AMLN). 이를 위해서, DESeq2의 lfcshrink() 함수를 사용하였고 하기 컷오프를 사용하여 DE 유전자를 선택하였다: |배수 변화| > 1.5 및 조정된 p-값 < 0.05. 이들 유전자 목록은 디폴트 매개변수를 사용하여 메타스케이프 분석 (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)에 제출되었다.
각각의 메타스케이프 분석은 엑셀 파일로서 내보냈다. 파일은 readxl 라이브러리 (버전 1.3.1)로부터 read_excel 기능을 사용해 R V에서 불러왔다. 상이한 파일을 함께 조합하여, 각각의 비교에 대해서, 유전자 존재론 (GO) 범주 강화의 -log10(adj p값)을 함유하는 표를 생성시켰다. 더 나아가서, 각 범주의 경우에, RNA-seq 분석에서 확인된 DE 유전자의 수는 이러한 GO 범주 내 유전자의 총 개수와 비교하였다. 적어도 하나의 비교에서 adj. p값 < 0.01인 GO 범주만을 검색하였다.
예상대로, GAN 식이는 간 기능 검사로서 클리닉에서 사용되는 간 손상의 마커인 혈장 ALT의 수준을 증가시켰다. 고용량의 세마글루티드 (10 nmol/kg/일)는 ALT를 74%까지 극적으로 감소시켰지만, 저용량 세마글루티드 (0.3 nmol/kg/일)는 효율적이지 않았다 (도 17). 놀랍게도, 저용량으로 엘라피브라노 및 세마글루티드를 함유하는 병용 처치는 ALT 수준을 고용량 세마글루티드 처치와 동일한 정도까지 감소시켜서 (-77 vs -83%, p>0.05), 병용하여, 엘라피브라노가 세마글루티드 효과를, 후자가 저용량으로 사용될 때 강화시킨다는 것을 시사한다 (도 17).
유사하게, 인간에서 심혈관 질환의 위험성과 연관된 것으로도 알려진, 염증 마커 CRP의 수준은 43%까지 고용량 세마글루티드에 의해 감소되었지만 저용량 세마글루티드는 비효율적이었다 (도 18). 다시, 저용량 세마글루티드와 엘라피브라노의 병용물은 고용량 세마글루티드와 동일한 정도까지 CRP 수준을 감소시켰다 (-47 vs -43%, p>0.05).
이러한 상승적 효과를 이해하기 위해서, 우리는 엘라피브라노, 고용량 세마글루티드, 저용량 세마글루티드, 및 엘라피브라노와 저용량 세마글루티드의 병용물 사이의 간 유전자 서명을 비교하였다. 메타스케이프를 사용한 RNAseq 및 경로 분석을 간에 대해 수행하였다. 유전자 존재론 분석은 고용량 세마글루티드 (10 nmol/kg/일)가 AMLN에 의해 유도된 병리학적 서명, 특히 염증 반응, 사이토카인 (IL1, IL6) 생산, 면역 세포의 활성화, 및 이동을 반전시켰다는 것을 보여준다 (도 19). 저용량 SEMA는 이들 경로를 반전시키는데 비효율적이었다. 엘라피브라노 (10 mg/kg/일)는 염증과 연관된 유전자 존재론 범주에 중간정도의 효과를 가졌고 그보다는 PPAR 효현제의 기지 효과인, 지질 물질대사 범주에 영향을 미쳤다. 그러나, 용량 세마글루티드와의 병용으로, 엘라피브라노는 지질 물질대사에 대한 이의 유리한 효과의 상위에서, 고용량 세마글루티드의 항-염증성 유전자 서명을 회복하였다.
이들 결과는 엘라피브라노가 간 손상 및 염증에 대한 GLP-1 수용체 효현제 효과를 강화시키고, GLP1 수용체 효현제 용량을 감소시키는 매력적인 치료적 이득을 나타내서, 치료 중단을 초래할 수 있는 그들 부작용 (구역, 설사)을 제한한다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> GENFIT <120> COMBINATION THERAPY <130> B2989PC00 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 1 aggcgaacaa ggtgacagag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 2 gccaggagaa ccagcagag 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 3 tgactgtgga gcctatggac ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 4 ctcaaaggag ccaggttgtg ca 22

Claims (19)

  1. (i) 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    (ii) 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 수용체 효현제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 병용 산물:
    Figure pct00003

    (식에서,
    Y1은 할로겐 원자, Ra, 또는 Ga-Ra 기를 나타내고;
    A는 CH=CH 또는 CH2-CH2 기를 나타내고;
    Y2는 Gb-Rb 기를 나타내고;
    Ga 및 Gb는 동일하거나 또는 상이하고, 산소 또는 황의 원자를 나타내고;
    Ra는 수소 원자, 미치환 (C1-C6)알킬 기, (C6-C14)아릴 기 또는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되는 (C1-C6)알킬 기, (C1-C6)알콕시 또는 (C1-C6)알킬티오 기, (C3-C14)시클로알킬 기, (C3-C14)시클로알킬티오 기 또는 복소환 기를 나타내고;
    Rb는 적어도 -COORc 기로 치환된 (C1-C6)알킬 기를 나타내고, 여기서 Rc는 수소 원자, 또는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 미치환되는 (C1-C6)알킬 기, (C3-C14)시클로알킬 기, 또는 복소환 기를 나타내고;
    Y4 및 Y5는 동일하거나 또는 상이하고, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 또는 미치환되는 (C1-C6)알킬 기, (C3-C14)시클로알킬 기 또는 복소환 기를 나타냄).
  2. 제1항에 있어서, 성분 (i)은 엘라피브라노 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 병용 산물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 성분 (ii)는 세마글루티드, 리라글루티드, 엑세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드, 릭시세나티드, 록세나티드, 에프페글레나티드, 타스포글루티드, MKC-253, DLP-205, ORMD-0901, LY-3305677, 옥신토모듈린 장기 지속형, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 병용 산물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (ii)는 세마글루티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 병용 산물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (ii)는 리라글루티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 병용 산물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 병용 산물은 성분 (i) 및 (ii) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물인 병용 산물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (i) 및 (ii)는 현탁제, 겔, 오일, 알약, 정제, 좌제, 분말, 캡슐, 에어로졸, 연고, 크림, 패치, 또는 장기간 및/또는 지연 방출을 위한 생약 형태의 수단 중에 제제화되는 것인 병용 산물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 병용 산물은 순차적, 별도 또는 동시 사용을 위한, 성분 (i) 및 (ii)를 포함하는 부분의 키트인 병용 산물.
  9. 제8항에 있어서, 성분 (i) 및 (ii)는 경구 제형인 병용 산물.
  10. 제9항에 있어서, 경구 제형은 알약 또는 정제인 병용 산물.
  11. 제8항에 있어서, 성분 (i)은 경구 제형이고 성분 (ii)는 주사용 용액인 병용 산물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물로서 사용을 위한 것인 병용 산물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, GLP-1 수용체 효현제의 투여가 필요한 병태를 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 것인 병용 산물.
  14. 제13항에 있어서, 병태는 비알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 (NASH), 섬유화 NASH, 당뇨병 및 비만으로부터 선택되는 것인 병용 산물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 병태는 비알콜성 지방간염인 병용 산물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 체중의 감소, 예컨대 GLP-1 수용체 효현제의 투여를 필요로 하는 병태의 치료를 위한 방법의 상황에서 체중의 감소를 위한 방법에서 사용을 위한 것인 병용 산물.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, GLP-1 수용체 효현제의 투여를 필요로 하는 병태의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 것이고, 투여되는 GLP-1 수용체 효현제의 양은 GLP-1 수용체가 단독으로 투여될 때 요구되는 GLP-1 수용체 효현제의 양과 비교하여 감소되는 것인 병용 산물.
  18. 제15항에 있어서, GLP-1 수용체 효현제의 적어도 하나의 부작용이 그에 의해 감소되는 것인 병용 산물.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, GLP-1 수용체 효현제의 투여를 필요로 하는 병태의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 것이고, GLP-1 수용체 효현제와 연관된 적어도 하나의 부작용은 GLP-1 수용체 효현제가 단독으로 투여될 때와 비교하여 감소되는 것인 병용 산물.
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