KR102224032B1

KR102224032B1 - 피부노화 방지제 및 이를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102224032B1
Application number: KR1020200108354A
Authority: KR
Inventors: 유재덕; 심홍보; 김봉우; 강해영; 김진식
Original assignee: 주식회사 에이치앤비나인
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2021-03-08

Abstract

본 발명은 피부노화 방지제 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 피부노화 방지제는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 전구체; 눈조류(snow algae); 및 스피큘(spicule)을 포함한다.

Description

피부노화 방지제 및 이를 포함하는 화장료 조성물{ACTIVE INGREDIENT FOR SKIN ANTI-AGING AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 피부에 주름 생성, 피부의 거칠기 증가, 또는 피부의 탄력 상실 등에 의해 피부가 노화되는 것을 방지하는 피부노화 방지제 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화의 특징은 주름, 거칠기 증가, 탄력성 상실 등이며, 이는 주로 노화가 진행되는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 엘라스틴, 히알루론산 등과 같은 세포 외 기질(ECM, Extracellular matrix)의 변화에 의해 나타난다. 상기 세포 외 기질의 변화는 섬유아세포의 생물학적 기능의 변화와 관련이 있다. 구체적으로, 섬유아세포는 피부 결합 조직(진피)의 하부 구획에 존재하는 가장 흔한 세포 유형으로, 상기 세포 외 기질의 유지 및 손상된 피부 조직의 재구성에 중요한 역할을 한다. 이에 섬유아세포의 생물학적 기능의 저하는 피부 노화로 이어지게 된다.

한편, 시르투인(Sirtuin, Sir2)은 출아형효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 유전자침묵(gene silencing)의 필수적 기능 때문에 처음 발견되었으며, 이후, 모체 세포가 생산할 수 있는 딸세포의 수에 의해 정의되는 복제 수명(replicative lifespan)을 조절하는 것이 밝혀졌다. 이러한 시르투인(Sir2)은 염색질 압축을 초래하고 산화 환원 반응에 요구되는 보조인자인 NAD+를 필요로 하며, 영양소(nutrients) 및 스트레스(stress)에 반응하여 그 발현 수준이 조절된다.

상기 NAD+는 시르투인(Sir2)에 대한 활성 기질로, 이는 생체 내에서 생존의 전 경로의 주요 조절인자로 작용한다. 이에 피부 노화는 NAD+의 고갈과 관련이 있으며, NAD+의 효율적인 공급은 피부 노화를 방지할 수 있는 효과를 얻을 수 있다. 그러나 NAD+는 그 자체를 사람에게 직접 투여하기 어려워 피부 노화 방지 효과를 얻는데 한계가 있다.

이에 섬유아세포의 생물학적 기능의 저하를 방지하면서 피부 세포의 NAD+ 수준을 증가시킬 수 있는 기술에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.

대한민국공개특허공보 제2013-0027821호

본 발명은 피부 노화를 효율적으로 방지할 수 피부노화 방지제를 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 상기 피부노화 방지제를 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 전구체; 눈조류(snow algae); 및 스피큘(spicule)을 포함하는 피부노화 방지제를 제공한다.

상기 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체는 니코틴아미드 리보사이드(nicotinamide riboside), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산((nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 니코틴산 모노뉴클레오티드(nicotinic acid mononucleotide) 및 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinic acid adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 눈조류는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐릴트랜스퍼라제(nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase, Nmnat) 효소의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 스피큘은 가수분해 단백질 또는 친수성 물질로 코팅된 것일 수 있다.

이러한 본 발명의 피부노화 방지제는 타우린을 더 포함할 수 있다.

상기 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체:상기 눈조류:상기 스피큘:상기 타우린의 혼합 비율은 1:1 내지 50:1 내지 10:1의 중량비일 수 있다.

한편 본 발명은 상기 피부노화 방지제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 피부노화 방지제의 함량은 화장료 조성물 100 중량부를 기준으로, 0.05 내지 1 중량부일 수 있다.

본 발명에 따른 피부노화 방지제는 섬유아세포의 생물학적 기능의 저하를 방지하면서 피부 세포의 NAD+ 수준을 증가시킬 수 있는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체 및 눈조류와, 함께 이들 성분을 피부 깊숙이 침투시킬 수 있는 스피큘을 포함하기 때문에 피부 노화를 효율적으로 방지 및/또는 개선시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 피부노화 방지제를 화장료 조성물에 도입함으로써, 기능성(예를 들어, 피부노화 방지)이 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것에 기여할 수 있다.

도 1 내지 도 15는 본 발명에 따른 실험예들을 설명하기 위한 참고도이다.

본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명은 피부 노화를 방지하거나 피부상태를 유지 및 개선하는 기능을 할 수 있는 피부노화 방지제에 관한 것으로, 이에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 피부노화 방지제는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 전구체, 눈조류(snow algae) 및 스피큘(spicule)을 포함한다.

본 발명에 따른 피부노화 방지제에 포함되는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체는 세포 노화와 관련성이 높은 인자인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)를 체내에 공급하는 역할을 한다. 이러한 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체는 구체적으로 니코틴아미드 리보사이드(nicotinamide riboside), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산((nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 니코틴산 모노뉴클레오티드(nicotinic acid mononucleotide) 및 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinic acid adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체는 체내에 안전하게 투여될 수 있고, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 생성을 향상시킬 수 있는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 또는 니코틴아미드 리보사이드(NR)일 수 있다.

본 발명에 따른 피부노화 방지제에 포함되는 눈조류는 녹조류의 일종인 Chloromonas속에 속하는 것으로, 카로테노이드(carotenoid) 색소를 포함하여 자외선(UV-B)을 차단하는 역할을 한다. 또한 눈조류는 항노화 단백질로 알려진 클로토(Klotho) 유전자와 AMPK 효소의 활성을 높이는 역할도 한다.

여기서 본 발명은 상기 눈조류를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체와 결합함으로써 피부노화 방지 효과를 탁월하게 높일 수 있는 피부노화 방지제를 제공할 수 있다. 구체적으로 상기 눈조류는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)로 전환시키는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐릴트랜스퍼라제(nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase, Nmnat) 효소의 단백질 발현(유전자 발현)을 증가시키는 작용을 하게 되며, 이는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 생성이 증가되는 것으로 이어지게 된다. 이와 같이 본 발명은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체와 상호 작용을 하는 눈조류를 결합시켜 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 생성을 증가시키는 것으로, 이로 인해 피부노화 방지 효과가 우수한 피부노화 방지제를 제공할 수 있다.

여기서 상기 눈조류는 눈조류 그 자체(예를 들어, Chlamydomonas nivalis, Coenochloris signiensis 등) 또는 눈조류의 추출과정을 거쳐 얻어진 눈조류 추출물을 의미할 수 있다.

본 발명에 따른 피부노화 방지제에 포함되는 스피큘은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체와 눈조류를 피부 깊숙이 침투시키는 역할을 한다. 구체적으로 스피큘은 침상의 형태(예를 들어, 바늘형, 원뿔형, 피라미드형)를 갖는 것으로, 이러한 스피큘은 피부에 홀(hole)을 형성시켜 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체와 눈조류의 물리적 경피 흡수를 촉진시킬 수 있다. 또한 스피큘은 피부에 침투하여 피부에 쌓여 있는 각질을 밀어 올려 탈락시키는 기능도 수행할 수 있어 피부 재생 과정도 촉진시킬 수 있다.

이러한 스피큘은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체 및 눈조류와의 결합율(포접율)을 높이기 위해 가수분해 단백질 또는 친수성 물질로 코팅된 것일 수 있다. 상기 가수분해 단백질은 구체적으로 하이드롤라이즈드 콜라겐, 하이드롤라이즈드 실크, 하이드롤라이즈드 케라틴, 하이드롤라이즈드 엘라스틴, 하이드롤라이즈드 소이 프로테인, 하이드롤라이즈드 휘트 프로테인 및 하이드롤라이즈드 세리신으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 또한 상기 친수성 물질은 글리세롤, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜(DEG) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 피부노화 방지제는 피부노화 방지 효율을 보다 높이기 위해 타우린을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부노화 방지제가 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체(a), 눈조류(b), 스피큘(c) 및 타우린(d)을 포함할 때, 이들의 혼합비율(a:b:c:d)은 1:1 내지 50:1 내지 10:1의 중량비일 수 있고, 구체적으로는 1:20 내지 50:5 내지 10:1의 중량비일 수 있다. 이들의 혼합비율(a:b:c:d)이 상기 범위 내일 경우, 상호 간의 유기적인 작용이 잘 이루어져 피부노화 방지효율을 높일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 피부노화 방지제는 분산매질로써 통상적인 용매를 더 포함할 수 있다.

한편 본 발명은 상술한 피부노화 방지제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 이러한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상술한 피부노화 방지제를 포함함에 따라 피부노화를 방지하는 기능이 우수할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 포함되는 피부노화 방지제의 함량은 화장료 조성물 100 중량부를 기준으로, 0.05 내지 1 중량부일 수 있고, 구체적으로는 0.07 내지 0.1 중량부일 수 있다. 상기 피부노화 방지제의 함량이 상기 범위 내일 경우, 피부노화 방지효율이 우수하면서 경제성 등을 확보할 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 정제수, 항산화제, 안정화제, 안료, 또는 향료 등을 더 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 제형으로 제조될 수 있다. 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이들 만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[ 실험예 1] NMN에 의한 섬유아세포의 활성 증가 평가

NMN(니코틴아미드 모노뉴클레오티드)이 섬유아세포의 활성에 영향을 주는지 확인하기 위해 인간진피 섬유아세포인 Detroit 551 세포와 CCD986-sk 세포에 NMN을 농도별로 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 측정 조건 및 과정은 다음과 같이 하였다.

Cell culture

Human dermal fibroblast Detroit 551과 CCD96-sk는 ATCC(American Type Culture Collection 사)로부터 구입하였다. 구입한 Detroit 551과 CCD96-sk는 10 % fetal bovine serum(FBS, Gibco사), 100 U/mL 페니실린 및 100 ug/mL 스트렙토마이신이 함유된 DEEM(Hyclone 사)에서 배양하였다. 모든 배양은 37 ℃에서 5 % CO₂의 가습 인큐베이터에서 수행되었다.

Cell proliferation

Cell proliferation은 제조사의 메뉴얼에 따라 Quanti-MAX-WST-8 세포 생존 어세이 키트(Biomax Inc사)를 사용하여 수용성 테트라졸륨염-8(WST-8) 분석에 의해 측정하였다. 이때, 섬유아세포를 96-well 플레이트에서 2x10⁴ 세포/㎠로 분주하고, 24 시간 동안 성장 배지에서 배양하였다. 구체적으로 Serum starvation을 위해 세포를 24 시간 동안 무혈청 DMEM에서 배양한 후, 10 ul의 WST-8 용액을 각 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 배양하였다. 이후 450 nm에서의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(Biotek사)로 측정하였다.

도 1을 참조하면, Detroit 551 세포에 NMN을 농도별로 처리하였을 때, 6.25 ug/ml 이상의 농도에서 세포 증식이 135.1% 정도 증가하였고, CCD986-sk 세포에 NMN을 농도별로 처리하였을 때, 1 ug/ml 농도에서 세포 증식이 139.6% 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 2] NR에 의한 섬유아세포의 활성 증가 평가

NR(니코틴아미드 리보사이드)이 섬유아세포의 활성에 영향을 주는지 확인하기 위해 인간진피 섬유아세포인 Detroit 551 세포에 NR을 농도별로 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때, 측정 조건 및 과정은 실험예 1과 동일하게 적용하였다.

도 2를 참조하면, Detroit 551 세포에 NR을 농도별로 처리하였을 때, 500 ug/ml 농도에서 세포 증식이 121.6% 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.

[ 준비예 1]

Mibelle Biochemistry 사(프랑스)로부터 눈조류 파우더를 구입하여 다음의 과정을 거쳐 눈조류(눈조류 추출물)를 준비하였다. 구체적으로, 눈조류 파우더 100g을 70% 에탄올 1L에 넣어 4시간 동안 교반한 후, 0.45μm 시린지필터(Merck 사)로 상층액을 필터링하여 추출물을 얻었다. 이후 동결건조기(일신랩 사)를 이용하여 알코올이 제거된 눈조류 추출물을 얻었다.

[ 준비예 2]

스폰질라 라쿠스트리스 엘(Spongilla lacustris L.)로부터 얻은 스피큘(J2KBIO 사)를 사용하여 다음의 과정을 거쳐 스피큘을 준비하였다. 구체적으로 스피큘에 잔존하는 불순물을 제거하기 위해 건조된 스피큘 20g을 35% 과산화수소수(H₂O₂)(삼천화학 사) 200ml에 넣고 초음파세정기(성동초음파 사)를 이용하여 300 W 및 40 kHz 조건에서 1시간 동안 초음파로 처리하였다. 그 다음, 400 mesh 폴리에틸렌(PE) 거름망으로 거른 후, 거름망에 남겨진 스피큘을 정제수 500ml로 세척하는 과정을 3회 반복하였다. 세정이 완료된 스피큘을 35% 과산화수소수(H₂O₂)(삼천화학 사) 200ml에 넣고 16시간 동안 반응시킨 후 다시 거름망에서 정제수로 세척하였다. 정제된 스피큘 1g에 20ml의 정제수를 넣고 형광물질이 결합된 하이드롤라이즈드 콜라겐(Sigmaaldrich 사) 10mg을 넣어 1시간 동안 교반하고, 거름망으로 거른 후 건조시켜 하이드롤라이즈드 콜라겐이 코팅된 스폰지 스피큘을 얻었다.

얻어진 스폰지 스피큘을 광학현미경과 형광현미경으로 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

[ 실시예 1]

NMN　1 중량부, 준비예 1의 눈조류 추출물　20 중량부, 준비예 2의 스폰지 스피큘　5 중량부, 타우린　1 중량부, 정제수 73 중량부를 혼합하여 제조된 피부노화 방지제(복합물)를 적용하였다.

[ 실시예 2]

NR　1 중량부, 준비예 1의 눈조류 추출물　20 중량부, 준비예 2의 스폰지 스피큘　5 중량부, 타우린　1 중량부, 정제수 73 중량부를 혼합하여 제조된 피부노화 방지제(복합물)를 적용하였다.

[ 비교예 1]

정제수를 적용하였다.

[ 비교예 2]

NMN 50 ug/ml를 적용하였다.

[ 비교예 3]

NMN 1 ug/ml를 적용하였다.

[ 비교예 4]

NR 500 ug/ml를 적용하였다.

[ 비교예 5]

준비예 1의 눈조류 추출물　20 중량부, 준비예 2의 스폰지 스피큘　5 중량부, 타우린　1 중량부, 정제수 74 중량부를 혼합하여 제조된 피부노화 방지제(복합물)를 적용하였다.

[ 실험예 3] 섬유아세포의 활성 증가 평가 1

섬유아세포의 활성에 얼마만큼의 영향을 주는지 확인하기 위해 인간진피 섬유아세포인 Detroit 551 세포에 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2 및 비교예 5의 시료를 각각 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 측정 조건 및 과정은 실험예 1과 동일하게 적용하였다.

도 4를 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 1을 Detroit 551 세포에 처리하였을 때, 세포증식이 174.1%로 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 4] 섬유아세포의 활성 증가 평가 2

섬유아세포의 활성에 얼마만큼의 영향을 주는지 확인하기 위해 인간진피 섬유아세포인 Detroit 551 세포에 실시예 2, 비교예 1, 비교예 4 및 비교예 5의 시료를 각각 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, 측정 조건 및 과정은 실험예 1과 동일하게 적용하였다.

도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 2를 Detroit 551 세포에 처리하였을 때, 세포증식이 154.1%로 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 5] 섬유아세포의 활성 증가에 따른 상처 치유 평가

섬유아세포의 활성 증가 및 이동의 검증을 통해 상처 치유에 효능이 있는지 확인하기 위해 wound-healing assay를 수행하였다. 구체적으로 Detroit 551 세포에 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 각각 처리한 후 48 시간 동안 배양하였다. 이후 광학현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 1은 세포의 이동이 221.3% 증가하여 상처 치유 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 6] 콜라겐 및 엘라스틴 생성 여부 평가 1

섬유아세포의 콜라겐 및 엘라스틴의 생성에 영향을 주는지 확인하기 위해 인간진피섬유아세포인 Detroit 551 세포에 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 5의 각 시료를 처리한 후 ELISA 어세이를 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이때, 측정 조건 및 과정은 다음과 같이 하였다.

Procollagen type I, elastin ELISA assay

섬유아세포인 Detroit 551(1x105 세포/well)를 6-well 플레이트에 분주하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 각 시료가 보충된 새로운 배지로 변경하고 24 시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 각각의 well로부터 수집하고, elastin 및 type I procollagen의 발현양을 ELISA 분석 키트(R&D Systems 사)를 사용하여 측정하였다.

도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 1은 콜라겐 생성이 202.3%로 증가하여 가장 높은 콜라겐 생성 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 7] 콜라겐 및 엘라스틴 생성 여부 평가 2

섬유아세포의 콜라겐 및 엘라스틴의 생성에 영향을 주는지 확인하기 위해 인간진피섬유아세포인 Detroit 551 세포에 실시예 2, 비교예 1, 비교예 4, 비교예 5의 각 시료를 처리한 후 ELISA 어세이를 수행하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이때, 측정 조건 및 과정은 실험예 6과 동일하게 적용하였다.

도 8을 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 2는 콜라겐 생성이 151.5%로 증가하여 가장 높은 콜라겐 생성 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 8] 피부 노화에 따른 세포 활성 복귀 평가 1

외부 환경적 요인에 의하여 노화가 진행된 진피섬유아세포의 세포 활성이 복귀되는지 확인하기 위해 Detroit 551 세포의 노화를 유도하고 각 시료를 48시간 동안 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 이때, 세포 노화는 다음의 과정으로 이루어졌다.

H ₂ O ₂ exposure

섬유아세포인 Detroit 551(1x105 세포)를 60-mm dish에 분주한 후 DMEM 배지에서 72 시간 동안 세포를 배양하였다. 배지를 무혈청 DMEM으로 변경하고, PBS로 희석된 14.2 μL의 H₂O₂ 용액(최종 농도: 0, 50, 100, 250 및 500 μmol/L)을 첨가하여 세포 노화를 유도하였다.

도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 1 및 2는 세포 증식이 각각 551.5% 및 512.7%로 높아 세포 활성의 복귀가 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 9] 피부 노화에 따른 세포 활성 복귀 평가 2

외부 환경적 요인에 의하여 노화가 진행된 진피섬유아세포의 세포 활성이 복귀되는지 확인하기 위해 20nM doxorubicin(Doxo)으로 Detroit 551 세포의 노화를 유도하고 각 시료를 48시간 동안 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10을 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 1 및 2는 세포 증식이 각각 351.0% 및 311.1%로 높아 세포 활성의 복귀가 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 10] 피부 노화에 따른 세포 활성 복귀 평가 3

외부 환경적 요인에 의하여 노화가 진행된 진피섬유아세포의 콜라겐 생성이 복귀되는지 확인하기 위해 250 uM H₂O₂로 Detroit 551 세포의 노화를 유도하고 각 시료를 48 시간 동안 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11을 참조하면, 본 발명에 따른 피부노화 방지제인 실시예 1 및 2는 콜라겐 생성이 각각 452.5% 및 412.7%로 높게 증가하여 콜라겐 생성의 복귀가 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 11] 피부 노화에 따른 세포 활성 복귀 평가 4

외부 환경적 요인에 의하여 노화가 진행된 진피섬유아세포의 콜라겐 생성이 복귀되는지 확인하기 위해 20nM doxorubicin(Doxo)으로 Detroit 551 세포의 노화를 유도하고 각 시료를 48 시간 동안 처리한 후 세포 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12를 참조하면, 본 발명에 따른 복합물인 실시예 1 및 2는 콜라겐 생성이 각각 222.4% 및 220.4%로 높게 증가하여 콜라겐 생성의 복귀가 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 12] Nmnat 단백질 발현양 평가

눈조류 추출물이 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐릴트랜스퍼라제 효소의 단백질 발현에 영향을 주는지 확인하기 위해 인간진피섬유아세포인 Detroit 551 세포에 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 4, 비교예 5의 각 시료를 처리한 후 Nmnat, GAPDH의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13을 참조하면, 눈조류 추출물이 함유된 비교예 5, 실시예 1 및 2는 Nmnat의 단백질 발현이 각각 254%, 247% 및 241%로 높게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 눈조류 추출물이 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐릴트랜스퍼라제 효소의 발현을 증가시킨다는 것을 뒷받침하는 것이다.

[제조예 1]

실시예 1의 피부노화 방지제를 이용하여 화장료 조성물을 제조하였다. 구체적으로, 1,2-헥산다이올 2.0 중량부, 아데노신 0.4 중량부, 글리세린 10.0 중량부, 1,3-부틸렌글라이콜 8.0 중량부, 잔탄검 0.1 중량부, 히알루론네이트 1.0 중량부를 정제수 71.32 중량부에 넣어 1,000 rpm으로 10분 동안 교반하여 수상 용해물을 제조하였다. 다음, 유상 용해물을 제조하기 위해 세틸에틸헥사노에이드(오일) 4.0 중량부, 시아버터 0.5 중량부, 세틸팔미테이트 0.8 중량부, 솔비탄 팔미테이트 0.6 중량부, 에틸헥실올리베이트 0.2 중량부, 칸데릴라악스 1.0 중량부를 80 ℃ 가온 용해하였고, 제조된 수상 용해물을 넣고 1,000 rpm으로 교반하여 유상 용해물을 제조하였다. 이후, 실시예 1의 피부노화 방지제 0.08 중량부(베타 니코틴아마이드 모노뉴클레오티드 0.01 중량부, 스피큘 0.05 중량부, 눈조류 추출물 0.01 중량부, 타우린 0.01 중량부)를 추가로 투입하고 2,000 rpm으로 60 ℃에서 5분 동안 교반하는 과정을 거쳐 크림 제형의 화장료 조성물을 제조하였다.

[실험예 13] 눈가주름 개선 평가

제조예 1에서 얻어진 화장료 조성물이 피부 노화를 방지하는 효능이 있는지 확인하기 위해 세명대학교 화장품임상연구지원센터의 표준운영지침(SOP)에 근거하여 눈가주름개선 여부를 평가하였으며, 그 결과를 도 14 및 15에 나타내었다. 구체적으로, 만 20~55세의 여성 시험 대상자 20명(평균연령 42.9 )이 4주 동안 매일 오전 오후 2회 제조예 1의 화장료 조성물을 적당량 취하여 눈가에 발랐다. 이후 눈가주름 분석을 위해 항온항습(22±2℃, RH40~60%)조건에서 2주, 4주 후에 시험 대상자의 눈가를 Antera 3D(Miravex, Ireland)로 영상화한 후 기기에서 제공하는 분석 프로그램(Antera 3D software, Miravex, Ireland)를 사용하여 기기적 분석 값을 측정하였다. 또한 진피치밀도 평가는 DermaScan C Ver 3.USB(Cortex technology, Denmark)를 이용하여 눈가 분위를 측정하였다. 측정된 이미지는 DermaScan C Ver 3. USB program을 이용하여 B-scan measurements의 Total Intensity를 이용해 분석하였으며, 분석 값이 높을수록 진피가 치밀한 것을 의미한다.

도 14 및 15를 참조하면, 제조예 1의 화장료 조성물을 사용함에 따라 눈가주름 개선율이 12.9% 증가하였으며, 진피 치밀도가 6.6% 증가한 것을 확인할 수 있었다.

Claims

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 전구체; 눈조류(snow algae); 가수분해 단백질로 코팅된 스피큘(spicule); 및 타우린을 포함하고,
상기 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체:상기 눈조류:상기 스피큘:상기 타우린의 혼합 비율이 1:1 내지 50:1 내지 10:1의 중량비인 것인 피부노화 방지제.
제1항에 있어서,
상기 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 전구체는 니코틴아미드 리보사이드(nicotinamide riboside), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산((nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 니코틴산 모노뉴클레오티드(nicotinic acid mononucleotide) 및 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinic acid adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인 피부노화 방지제.
제1항에 있어서,
상기 눈조류는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐릴트랜스퍼라제 효소의 발현을 증가시키는 것인 피부노화 방지제.
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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 피부노화 방지제를 포함하는 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 피부노화 방지제의 함량이 화장료 조성물 100 중량부를 기준으로, 0.05 내지 1 중량부인 것인 화장료 조성물.