KR102223021B1 - 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 고삼 발효 추출물은 세포 독성이 없으며, 항산화 활성이 우수하고, TRP1(tyrosinase related protein 1) 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease)의 생성을 저해하며, 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 생성을 증진시키는 효과가 우수하므로, 피부 미백 및 주름개선용 화장료 또는 피부 외용제 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
노령인구가 증가함에 따라 노화의 척도가 될 수 있는 피부미용 및 노화를 방지할 수 있는 항산화 분야가 주요 관심사로 떠오르고 있다. 노화로 인한 피부의 주름생성 및 체내의 항산화 활성 감소 등은 건강의 척도로 사용될 수 있다. 피부노화는 원인에 따라 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있다. 내인성 노화는 나이에 따른 피부 표피 및 진피의 생리적 기능 변화가 원인이며, 외인성 노화는 대기오염, 자외선 노출, 스트레스 등의 환경으로부터 발생하는 피부의 생리적 기능 변화가 원인으로 알려져 있다. 이러한 노화의 공통적 메커니즘은 산화적 스트레스(oxidative stress)에 지속적으로 노출되어 체내에 자유라디칼(free radical)이 증가되고, 진피의 결합조직인 엘라스틴(elastin)을 분해하는 엘라스타제(elastase)의 활성 증가, 히알루론산(hyaluronic acid)을 분해는 히알루로니다제(hyaluronidase)의 활성 증가로 설명될 수 있다. 즉, 피부노화란 엘라스틴 및 히알루론산이 파괴되어 진피를 무너뜨리고 피부를 건조하게 만들어 주름이 생기는 것으로 설명될 수 있다. 또한, 체내의 자유라디칼은 멜라닌 형성과정에 관여하여 티로시나제(tyrosinase)를 활성화시켜 기미와 주근깨를 생성하는 원인이 되기도 한다.
일상생활에서 우리는 활성산소(reactive oxygen)에 의해 일어나는 유해성에 항상 노출되어 있으며, 노화로 인한 유해성은 점진적으로 축적되며 항산화 능력이 점진적으로 감소된다. 일반적인 신체 조건에서 항산화 보호 시스템은 효소(예컨대, superoxide dismutase(SOD) 등) 반응과 비효소(예컨대, 폴리페놀, 플라보노이드 등) 반응의 경로로 활성산소를 제거한다. 따라서 항산화 활성을 나타내기 위해서는 SOD와 같은 항산화 효소반응을 활성화시키거나 직접적인 항산화 작용을 하는 비효소 물질을 섭취해야 한다.
피부건강 및 항산화에 대한 기전 연구가 활발히 진행되어 왔으며, 연구 수준의 발달 및 기술력 증가로 생화학적 효능, 효과를 가진 소재들을 개발하기 위한 다수의 연구가 진행되고 있다. 특히, 식물 유래 소재는 안전성 측면에서 우수함을 인정받아 오랫동안 이용되었으며, 국내의 경우, 민간에서 이용되거나 혹은 한방에서 이용되는 식물 및 생약 성분을 주로 한 기능성 소재 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히, 식물 유래 유용물질(카로티노이드, 페놀화합물, 비타민 등)을 이용한 피부 노화 방지, 탈모 방지, 항산화 등의 목적으로 화장품 분야에서 식물 소재에 대한 관심이 고조되고 있다.
고삼(Sophora flavescens)은 장미목 콩과의 여러해살이식물로 한국, 일본, 중국 등 아시아에서 자생하는데, 이 식물 뿌리의 맛은 쓰지만 인삼과 같은 효능이 있다고 하여 한방에서 고삼이라 불린다. 고삼은 항부정맥작용, 항종양 작용, 이뇨, 해열 등의 약리효과를 가지며 피부 상재균에 대한 항균, 항진균 작용, 신경성 피부염, 습진 등에도 효과가 있다고 알려져 있다.
한편, 한국등록특허 제1525873호에는 '산삼 배양근, 단너삼, 고삼 및 사삼을 포함하는 2단 발효추출물 제조방법 및 이를 이용한 피부 개선용 화장료 조성물'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1098527호에는 '기능성 화장료 조성물 및 이의 제조방법'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '고삼 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고삼 발효 추출물이 고삼 추출물에 비해 자유라디칼 소거능뿐 아니라, TRP1(tyrosinase related protein 1) 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease)의 생성 저해능과 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 생성능이 현저하게 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 피부 외용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 고삼 발효 추출물은 세포 독성이 없으며, 항산화 활성이 우수하고, TRP1(tyrosinase related protein 1) 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease)의 생성을 저해하며, 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 생성을 증진시키는 효과가 우수하므로, 피부 미백 및 주름개선용 화장료 또는 피부 외용제 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물의 B16F1 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 2는 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물의 HaCaT 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 3은 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물의 TRP1(tyrosinase related protein 1)의 생성능 저해 효과를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 군이며 IBMX는 멜라닌색소 생성 유도물질을 처리한 군을 나타낸다.
도 4는 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물의 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 생성능 촉진 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease)의 생성능 저해 효과를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 군이며 UV는 UV를 처리한 군을 나타낸다.
도 2는 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물의 HaCaT 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 3은 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물의 TRP1(tyrosinase related protein 1)의 생성능 저해 효과를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 군이며 IBMX는 멜라닌색소 생성 유도물질을 처리한 군을 나타낸다.
도 4는 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물의 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 생성능 촉진 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease)의 생성능 저해 효과를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 군이며 UV는 UV를 처리한 군을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 고삼 발효는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸 A( KFCC11611P)를 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 고삼 발효 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이의 혼합 용매 추출물일 수 있고, 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고삼 중량 대비 40~70%(v/v)의 에탄올을 10~30배 첨가하여, 2~7일 동안 실온추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 고삼 발효 추출물은 고삼 발효물을 추출처리하여 획득한 추출액; 추출액의 희석액 또는 농축액; 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물; 조정제물; 또는 정제물 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, '미백'이라 함은 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시키는 것을 말한다. 피부의 과다 색소 침착은 주근깨, 기미, 자외선 노출 후 과다 색소 침착, 염증 후 과다 색소 침착, 노인흑색점, 갈색반점 또는 검버섯 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, '주름개선'이라 함은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다. 본 발명에서 주름 생성은 콜라겐의 감소로 인해 발생하는 것이며, 상기 콜라겐의 감소는 과도한 산화 스트레스나 자외선 조사가 원인일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 TRP1(tyrosinase related protein 1), 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease) 생성 억제능 및 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 생성 촉진능의 효과를 가지는 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고 있으므로, 피부 미백 및 주름개선 기능을 가진 화장료 조성물이다.
또한, 본 발명의 상기 고삼 발효 추출물은 고삼 추출물에 비해 피부미백, 주름개선 및 항산화 활성이 우수한 것이 특징이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 고삼 발효 추출물은 화장품으로 제품화되는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도로 포함될 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 고삼 발효 추출물을 포함해도 무방할 것이다.
또한, 본 발명은 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 피부 외용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 피부 외용 약학 조성물에 있어서, 상기 고삼 발효는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 이용하여 발효하는 것일 수 있고, 상기 추출물은 고삼 발효물의 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "멜라닌 색소 과다 침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손·발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 또는 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물이 멜라닌 색소 과다 침착 질환을 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 주사제, 크림, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효량의 고삼 발효 추출물을 포함할 때 바람직한 피부 미백 및 주름개선 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, '유효량'이라 함은 색소 침착을 억제하거나, 주름개선 효과를 나타낼 수 있는 추출물의 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 고삼 발효 추출물의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태, 고삼 발효 추출물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 고삼 발효 추출물이 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 고삼 발효 추출물을 포함할 수 있을 것이다. 따라서, 일일 투여량은 고삼 발효 추출물의 양을 기준으로 0.1 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 80 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 60 mg/kg이며, 하루 1 ∼ 6 회 투여될 수 있다. 본 발명의 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 외용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 고삼 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt], 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase), IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine) 및 tBHP(tert-Butyl hydroperoxide solution)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, DMEM(Dulbecoos modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum) 및 RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 버퍼는 Invitrogen사(Waltham, MA, USA)에서 구입하였으며, EZ-Cytox는 Dogenbio사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 또한, TRP-1(tyrosinase related protein-1) 항체 및 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 및 타입 1 콜라겐(type 1 collagen) 항체는 abcam사(Cambridge, UK)에서 구입하였으며, β-액틴(β-actin)은 BD Biosciences사(CA, USA)에서 구입하였다.
제조예 1. 고삼 발효 추출물의 제조
본 발명에 사용된 고삼은 전북 진안군 진안한방약초센터에서 구입한 후, 본 출원인(㈜에코파낙스)의 지식재산권인 한국등록특허 제1821121호의 증삼기를 활용하여 고삼을 발효하였다. 구체적으로, 증삼기를 이용하여 90~100℃에서 1~3시간 동안 증기로 고삼을 찐 후, 한국미생물보존센터로부터 분양 받은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) A 균주(KFCC11611P)를 접종하여 35~37℃에서 10~20일 동안 발효하였다. 발효가 끝난 증삼된 고삼을 건조기에서 60℃에서 12~24 시간 동안 건조하여 발효 고삼 원물을 얻었다. 이후에, 발효 고삼 원물 100g을 정량하고 50% 에탄올 2L를 넣고 실온에서 5일 동안 추출하였으며, 상기 발효 과정 없이 상기 동일한 방법으로 추출한 고삼 추출물을 비교대조군으로 사용하였다. 추출물의 상등액을 Advantec filter paper No. 2(Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하고 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)에서 농축한 다음 동결건조기(EYELA FDU- 2100, EYELA)에서 건조하여 회수한 후 -20℃에 보관하면서 하기 실시예에 사용하였다.
실시예 1. 세포독성 측정
상기 제조예 1에서 제조한 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물에 대하여 세포 독성을 측정하였다. 구체적으로, B16F1 및 HaCaT 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)사로부터 구입하여 사용하였다. B16F1 세포 및 HaCaT 세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제(penicillin & streptomycin)가 함유된 DMEM(Dulbecoos modified Eagle's medium) 배지를 사용하여 습도가 충분하고 37℃가 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 멜라닌생성 세포인 B16F1 세포와 인간 피부각질형성 세포인 HaCaT 세포를 96 웰 플레이트에 각각 4×104 cells/ml 및 2×105 cells/ml의 농도로 분주하여 배양한 후 농도별로 정량한 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물(이하 '시료'라 함)을 주입한 후 44시간 동안 배양한 후 10㎕의 EZ-Cytox를 주입 후 4시간뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 시료 무첨가군 대비 백분율로 계산하였다.
그 결과, B16F1 세포에 대해 고삼 발효 추출물은 세포 독성을 나타내지 않았으나, 고삼 추출물의 경우에 100㎍/ml 이상의 처리 농도에서 세포 생존율이 감소되는 것을 확인하였으며(도 1), HaCaT 세포에 대해서는 200㎍/ml의 고삼 발효 추출물의 처리군에서 세포 생존율이 다소 감소할 뿐, 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다(도 2).
실시예 2. 항산화 활성 분석
상기 제조예 1에서 제조한 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물에 대하여 항산화 활성을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물을 정량하여 96 웰 플레이트에 100㎕를 주입한 후 0.3mM DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 100㎕를 넣어 실온에서 20분간 반응시킨 후 분광광도계(Tecan Group Ltd., Mannedorf, Swizerland)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 계산하였으며, SC50값으로 나타내었다.
또한, ABTS 라디칼 소거 활성은 7.4mM의 ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] 및 2.6mM의 과황산칼륨(potassium persulphate)을 혼합한 후, 4℃의 암소에서 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성한 다음 732nm에서 흡광도가 ±0.04(±표준오차)가 되도록 증류수로 희석하여 사용하였다. 각 시료를 정량하여 E-tube에 50㎕ 주입 후 준비된 ABTS 용액 950㎕를 주입하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 96 웰 플레이트에 100㎕ 주입 후 732nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS의 소거활성은 시료 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 계산하였으며, SC50으로 나타내었다.
그 결과, 하기 표 1 및 표 2에 개시한 바와 같이 DPPH 라디칼 소거 활성(SC50)은 고삼 발효 추출물이 4080.85㎍/ml인 반면, 고삼 추출물은 5960.00㎍/ml이고, ABTS 라디칼 소거 활성(SC50)의 경우에 고삼 발효 추출물이 3117.21㎍/ml인 반면, 고삼 추출물은 3270.68㎍/ml으로, 고삼 발효 추출물이 고삼 추출물에 비해 자유 라디칼 소거능이 우수한 것을 알 수 있었다.
| 시료 | SC50 값(㎍/ml) |
| 고삼 발효 추출물 | 4080.85 |
| 고삼 추출물 | 5960.00 |
| 시료 | SC50 값(㎍/ml) |
| 고삼 발효 추출물 | 3117.21 |
| 고삼 추출물 | 3270.68 |
실시예 3. 피부미백 및 피부주름 효능 평가
상기 제조예 1에서 제조한 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 통해 피부미백 및 피부주름 효능을 확인하였다. 구체적으로, B16F1 세포를 6 웰 플레이트에 4×104 cells/ml의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물을 100㎍/ml의 농도로 주입 후 1시간뒤 100μM의 IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)로 자극 후 48시간 배양한 후 세포를 PBS로 2회 원심세척 후 RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 버퍼를 주입 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 또한, HaCaT 세포는 2×105 cells/ml의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 고삼 발효 추출물 및 고삼 추출물을 100㎍/ml의 농도로 주입하고 1시간뒤 UVB(100 mJ/cm2) 조사하여 24시간 배양한 후 세포를 PBS로 2회 원심세척 후 RIPA 버퍼를 주입 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 상기 추출한 각 단백질은 브래드포드 단백질 분석 시약(Bradford protein assay reagent)을 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리 후 100V로 1시간동안 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인(Bio-Rad)에 트랜스퍼하였다. 멤브레인은 5% BSA(bovine serum albumin)가 함유된 TBST(Tris buffered saline with 1% Tween 20)에 실온에서 블로킹 후 TBST로 10분간 3회 세척후 1차 항체로 anti-MMP1, anti-type 1 collagen 및 anti-β-actin을 사용하여 4℃에서 16시간 반응시켰다. 그 후 TBST로 10분간 3회 세척 후 2차 항체(goat anti-rabbit IgG HRP, rabbit anti-mouse IgG HRP)를 5% BSA에서 실온에서 2시간 반응 후 TBST로 10분간 3회 세척하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 IBMX 및 고삼 추출물 처리군에서는 TRP1(tyrosinase related protein 1)의 발현 감소 효과가 없는 반면, IBMX 및 고삼 발효 추출물 처리군에서는 TRP1의 발현량이 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 피부주름 개선 효능 결과, UVB 조사 처리한 HaCaT 세포에서는 UVB 무처리군에 비해 타입 1 콜라겐(type 1 collagen) 단백질의 생성이 현저하게 감소하였으며, 이렇게 감소된 타입 1 콜라겐 단백질의 생성량은 고삼 추출물(100㎍/ml) 보다 본 발명의 고삼 발효 추출물(100㎍/ml)을 처리하였을 때 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease)의 생성 저해능도 마찬가지로, 고삼 추출물에 비해 고삼 발효 추출물을 처리하였을 때 현저하게 증가되는 것을 알 수 있었다(도 4).
Claims (9)
- 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 발효한 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 고삼 발효 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 TRP1(tyrosinase related protein 1) 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease)의 생성을 저해하고, 타입 1 콜라겐(type 1 collagen)의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 삭제
- 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 발효한 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 또는 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 발효한 고삼(Sophora flavescens) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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| KR100966835B1 (ko) | 2008-02-19 | 2010-06-29 | 장문식 | 자외선에 대한 피부 보호 효과와 미백 및 항주름 효과를 가지는 감초, 승마, 하수오, 흑임자, 상황버섯, 당귀, 상백피, 백작약, 고삼, 황금으로 구성되어진 식물 혼합물의 추출물을 함유한 화장료 조성물 및 그의 제조방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080094459A (ko) * | 2007-04-20 | 2008-10-23 | 주식회사 엘지생활건강 | 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물 |
| KR20090123458A (ko) * | 2008-05-28 | 2009-12-02 | 주식회사 엘씨에스바이오텍 | 천연 식물소재 또는 한약재의 발효방법, 상기 방법에의해서 제조된 발효물 및 이를 함유하는 화장료 조성물,식료품 조성물 및 약학 조성물 |
| KR20110108686A (ko) * | 2010-03-29 | 2011-10-06 | 주식회사 케이씨아이 | 천연 원료 추출물을 포함하는 항산화제 및 이를 포함하는 사료, 식품, 또는 화장료 조성물 |
-
2019
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100966835B1 (ko) | 2008-02-19 | 2010-06-29 | 장문식 | 자외선에 대한 피부 보호 효과와 미백 및 항주름 효과를 가지는 감초, 승마, 하수오, 흑임자, 상황버섯, 당귀, 상백피, 백작약, 고삼, 황금으로 구성되어진 식물 혼합물의 추출물을 함유한 화장료 조성물 및 그의 제조방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Journal of the society of cosmetic scientists of Korea v.41 no.2, 2015년, pp.159 - 164* |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200138550A (ko) | 2020-12-10 |
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