KR102216459B1 - 면역크로마토그래피법에서의 광 반사재를 사용한 검출광의 증강 방법 - Google Patents

면역크로마토그래피법에서의 광 반사재를 사용한 검출광의 증강 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 피검출 물질의 고감도 검출과, 간소한 시험편의 구조라는 통상 양립되기 어려운 항목에 대하여, 양립을 가능하게 하는 면역크로마토그래피법시험편의 제공을 목적으로 한다.
피검출 물질에 결합하는 리간드인 포착 물질을 고정화한 멤브레인을 포함하고, 피검출 물질에 결합하는 리간드를 결합시킨 불용성 담체 입자를 사용하고, 상기 불용성 담체 입자를 멤브레인 상에 고정화한 포착 물질에 포착시킴으로써 집적시키고, 멤브레인에 광을 조사하여, 상기 불용성 담체 입자가 집적된 부위 또는 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하는 면역크로마토그래피 시험편으로서, 멤브레인의 광이 조사되는 측과는 반대측에 광 반사재를 설치한, 면역크로마토그래피 시험편이다.

Description

면역크로마토그래피법에서의 광 반사재를 사용한 검출광의 증강 방법{METHOD OF AMPLIFYING DETECTION LIGHT USING A LIGHT-REFLECTING MATERIAL IN IMMUNOCHROMATOGRAPHY}
본 발명은, 검체 내의 피검출 물질을 특이적으로, 신속하게 검출하기 위한 방법 및 이것을 이용한 키트에 관한 것이다.
면역크로마토그래피법이란, 피검출(被檢出) 물질을 특이적으로 인식하는 리간드를 결합시킨 불용성 담체 입자를 사용하여, 이 담체 입자가 피검출 물질을 포착하고, 섬유 구조를 가지는 시험편 내를 모세관 현상을 이용하여 이동하고, 시험편 내의 소정의 위치에 고정화된 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 포착 물질과 결합함으로써, 시험편 내의 소정의 위치에, 응집한 불용성 담체 입자가 집적되는 것을 이용하여, 육안으로 또는 검출 장치에 의해 불용성 담체 입자의 집적의 유무를 검출하고, 피검출 물질의 유무를 분석하는 면역학적 방법이다. 그 간편함에 의하여, 실험실용이 아닌 POCT(Point Of Care Test)의 체외 진단용 의약품으로서 널리 이용되고 있다.
종래, 피검출 물질을 특이적으로 인식하는 리간드를 표식하는 대상인 입자로서는, 금 콜로이드, 백금-금 콜로이드, 착색 폴리스티렌 입자 등 불용성 담체 입자를 사용하고, 각종 입자의 색상을 이용하여, 육안으로 또는 전용 장치를 사용하여 입자의 집적의 유무가 판단되어 왔다.
또한, 고감도화를 과제로서, 형광을 발하는 미립자를 사용함으로써 면역학적 응집 반응에 의한 간편성을 살린 채로 감도를 향상시키는 것이 제안되어 있다(특허 문헌 1 참조).
또한, 형광을 발하는 미립자를 사용하는 경우는, 그 고감도 검출을 위해 전용의 장치가 필수로 된다. 그 가반성(可搬性)은 POCT로서의 이용을 고려했을 경우 매우 중요한 과제이다.
이 과제를 해결하기 위해, 극히 가반성이 있고, 저렴하며, 또한 강건하고 감도가 높은 형광 검출용의 장치도 제안되어 있다(특허 문헌 2 참조).
이와 같은 형광을 발하는 입자나 장치를 사용한 면역크로마토그래피법의 고감도 검출법을 위한 제안은 되어 있지만, 시험편 상의 소정 위치에 집적된 형광을 발하는 입자에 광을 조사하고, 여기(勵起)되어 상기 입자로부터 발생하는 광을 검출한다는 시험계에 있어서, 입자가 아니라, 그 시험편 및 시험편을 저장하는 케이스를 개량함으로써 고감도 검출을 가능하게 하는 기술은 제안되어 있지 않다.
[특허 문헌 1] 일본공개특허 제2012-32263호 공보 [특허 문헌 2] 일본공표특허 제2005-515429호 공보
전용의 검출 장치에 의한 고감도화에 있어서, 검출 장치측의 검출 기구는 적잖이 복잡화되지 않을 수 없는 반면, 피검출 물질을 함유하는 생체 유래 물질을 사용하여 시험을 행한 시험편(POCT 키트 본체)은, 사용 후는 폐기가 필수로 된다. 임상의 현장에서 널리 보급되고, 다양한 분야에 적응되기 위해서는, 시험편의 취급은 간편하고, 또한 저가인 것이 요구된다. 이를 위해서는 시험편의 구조는 간소하지 않으면 안된다.
본 발명은, 피검출 물질의 고감도 검출과, 간소한 시험편의 구조라는 통상 양립되기 어려운 항목에 대하여, 양립을 가능하게 하는 면역크로마토그래피 시험편의 제공을 목적으로 한다.
형광 검출 장치 등의 검출 장치를 사용한 측정에 있어서는, 검출 장치에 포함되는 광원으로부터 일정 파장의 여기광이 시험편으로 조사된다. 시험편 상의 집적된 형광을 발하는 입자는 상기 여기광을 받고, 특정한 파장의 형광을 발한다. 이 형광을 발하는 입자로부터 발해진 특정 파장의 광을 검출 장치에 의해 검출한다.
검출 장치로부터 조사되는 여기광은 시험편 상의 형광을 발하는 입자가 집적된 부위에 조사되지만, 이 때 모든 여기광이 입자에 조사되는 것이 아니고, 적잖은 광은 시험편 하부로 통과해 나가버려, 형광의 발생에 관여하지 않고 감광되어 버린다.
본 발명의 시험편은, 상기 시험편 하부로 통과해 나가는 조사광을, 시험편 하부에 조사광을 반사하는 광 반사재를 설치함으로써 반사시키고, 집적된 형광을 발하는 입자에, 조사광을 효율적으로 닿게 함으로써 발생하는 형광, 즉 최종적으로 검출하는 광을 증강시킨다. 본 발명의 시험편은 종래의 시험편과 크게 변함없이, 복잡한 구조를 갖지 않는 간소한 구조를 가지는 시험편이지만, 반사재를 설치함으로써 고감도로 피검출 물질을 검출하는 것을 가능하게 하였다.
또한, 형광을 발하는 입자가 아니라, 가시역의 색으로 착색된 입자를 사용하는 경우도, 시험편 하부에 조사광을 반사하는 광 반사재를 설치함으로써, 입자가 집적된 부위에서 조사된 광의 반사광이 입자의 존재에 의해 감쇠하는 반면, 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에서 반사되어 검출되는 광의 강도가 증강하고, 최종적으로 검출되는 광이 증강하고, 고감도로 피검출 물질을 검출하는 것을 가능하게 하였다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 피검출 물질에 결합하는 리간드인 포착 물질을 고정화한 멤브레인(membrane)을 포함하고, 피검출 물질에 결합하는 리간드를 결합시킨 불용성 담체 입자를 사용하고, 상기 불용성 담체 입자를 멤브레인 상에 고정화한 포착 물질에 포착시킴으로써 집적시키고, 멤브레인에 광을 조사하여, 상기 불용성 담체 입자가 집적된 부위 또는 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광을 검출함으로써, 피검출 물질을 측정하는 면역크로마토그래피 시험편으로서, 멤브레인의 광이 조사되는 측과는 반대측에 광 반사재를 설치한, 면역크로마토그래피 시험편이다.
[2] 불용성 담체 입자가 형광 표식된 불용성 담체 입자이며, 조사광으로서 여기광을 조사하고, 불용성 담체 입자가 집적된 부위로부터 발하는 형광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하는, 상기 [1]의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[3] 불용성 담체 입자가 착색 불용성 담체 입자이며, 조사광을 조사하고 불용성 담체 입자가 집적된 부위 및 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에 있어서 반사되는 반사광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하는, 상기 [1]의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[4] 조사광의 전체 반사율이 85% 이상인 광 반사재를 사용하는, 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[5] 또한, 시료 첨가 부위, 흡수대 및 표식 부위를 가지고 있는, 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[6] 상기 광 반사재가 금속으로 만들어진 반사재인, 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[7] 상기 금속이 알루미늄 또는 구리인, 상기 [6]의 면역크로마토그래피 시험편.
[8] 상기 금속이 알루미늄인 경우에는 250㎚∼1000㎚의 조사광을 사용하고, 구리인 경우에는 600㎚∼1000㎚의 조사광을 사용하는, 상기 [7]의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[9] 상기 광 반사재가, 멤브레인의 조사광이 조사되는 측과는 반대측에 접촉하여 설치되는, 상기 [1]∼[8] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[10] 저장 용기에 수납된, 상기 [1]∼[9] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피 시험편으로서, 저장 용기의 내면으로, 멤브레인의 조사광이 조사되는 측과는 반대측의 저장 용기 내면에 광 반사재를 설치한, 면역크로마토그래피 시험편이다.
[11] 상기 광 반사재가, 반사된 조사광을 면역크로마토그래피 시험편의 검출부위 부근에 모으는 구조를 가지고 있는, 상기 [10]의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[12] 상기 저장 용기 자체가 광 반사재로 만들어진, 상기 [10] 또는 [11]의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[13] 피검출 물질과 피검출 물질에 결합하는 리간드가 항원과 항체이거나, 또는 항체와 항원인, 상기 [1]∼[12] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피 시험편이다.
[14] 피검출 물질에 결합하는 리간드인 포착 물질을 고정화한 멤브레인을 포함하고, 피검출 물질에 결합하는 리간드를 결합시킨 불용성 담체 입자를 사용하고, 상기 불용성 담체 입자를 멤브레인 상에 고정화한 포착 물질에 포착시킴으로써 집적시키고, 멤브레인에 광을 조사하여, 상기 불용성 담체 입자가 집적된 부위 또는 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하는 면역크로마토그래피법에 있어서, 멤브레인의 광이 조사되는 측과는 반대측에 광 반사재를 설치함으로써, 검출광을 증강하는 방법이다.
[15] 불용성 담체 입자가 형광 표식된 불용성 담체 입자이며, 조사광으로서 여기광을 조사하고, 불용성 담체 입자가 집적된 부위로부터 발하는 형광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하는, 상기 [14]의 검출광을 증강하는 방법이다.
[16] 불용성 담체 입자가 착색 불용성 담체 입자이며, 조사광을 조사하고 불용성 담체 입자가 집적된 부위 및 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에 있어서 반사되는 반사광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하는, 상기 [14]의 검출광을 증강하는 방법이다.
[17] 조사광의 전체 반사율이 85% 이상인 광 반사재를 사용하는, 상기 [14]∼[16] 중 어느 하나의 검출광을 증강하는 방법이다.
[18] 상기 광 반사재가 금속으로 만들어진 반사재인, 상기 [14]∼[17] 중 어느 하나의 검출광을 증강하는 방법이다.
[19] 상기 금속이 알루미늄 또는 구리인, 상기 [18]의 검출광을 증강하는 방법이다.
[20] 상기 금속이 알루미늄인 경우에는 250㎚∼1000㎚의 조사광을 사용하고, 구리인 경우에는 600㎚∼1000㎚의 조사광을 사용하는, 상기 [19]의 검출광을 증강하는 방법이다.
[21] 피검출 물질과 피검출 물질에 결합하는 리간드가 항원과 항체이거나, 또는 항체와 항원인, 상기 [14]∼[20] 중 어느 하나의 검출광을 증강하는 방법이다.
형광 색소로 표식된 불용성 담체 입자 또는 착색된 불용성 담체 입자를 사용하고, 상기 입자를 면역크로마토그래피 시험편 상에 집적시켜, 상기 입자로부터 발해지는 형광을 검출하거나, 또는 착색된 불용성 담체 입자를 사용하고, 상기 입자를 면역크로마토그래피 시험편 상에 집적시켜, 상기 입자가 집적된 부위 및 집적된 부위 이외의 주위의 부위를 포함하는 부위에서 반사광을 검출하는, 면역크로마토그래피 시험에 있어서, 본 발명에 있어서는, 면역크로마토그래피 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적하는 부위의 하측에 광 반사재를 설치한다. 그러므로, 형광 색소로 표식된 불용성 담체 입자를 사용한 경우, 형광 색소로 표식한 불용성 담체 입자가 집적된 부위에 조사한 여기광이 멤브레인을 투과한 경우라도, 광 반사재에서 반사되어, 형광 색소에 닿고, 형광 색소를 여기할 수 있다. 또한, 발생한 형광의 일부는 광 반사재에서 반사되어 검출광으로서 검출된다. 그 결과, 형광인 검출광의 강도가 증강된다. 또한, 착색된 불용성 담체 입자를 사용한 경우, 조사광은 불용성 담체 입자에 흡수되므로, 조사한 광의 반사광이 불용성 담체 입자에 의해 감쇠하고, 그 반면, 조사광이 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에서 반사되고, 반사된 광이 증강한 검출광으로서 검출된다. 이 결과, 피검출 물질의 검출 감도를 높게 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 광 반사재를 구비한 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 경우의 검출광의 증강의 원리를 나타낸 도면이다. 도 1의 A는 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용한 경우를 나타내고, 도 1의 B는 착색 불용성 담체 입자를 사용한 경우를 나타낸다.
도 2는 각종 금속의 전체 반사율을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 광 반사재를 포함하는 면역크로마토그래피 시험편, 디바이스에서의, 광 반사재의 위치 및 형상을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 광 반사재를 포함하는 면역크로마토그래피 시험편 및 종래의 면역크로마토그래피법 시험편의 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 광 반사재를 포함하는 면역크로마토그래피 시험편 및 종래의 면역크로마토그래피법 시험편의 검출 부위에서의 형광를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 광 반사재를 포함하는 면역크로마토그래피 시험편 및 종래의 면역크로마토그래피법 시험편의 구조, 및 실시예 2에서의 절단 부위를 나타낸 도면이다.
도 7은 광 반사재로서 각종 금속박을 사용한 경우의 반사 효과를 나타낸 도면이다.
도 8은 광 반사재로서 각종 금속박을 사용한 경우의 반사 효과를 나타낸 도면이다.
도 9(a)는 착색 폴리스티렌 입자를 사용한 경우의 광 반사재를 사용한 반사 효과를 나타낸 도면이다.
도 9(b)는 착색 폴리스티렌 입자를 사용한 경우의, 조사한 광의 반사광의 입자에 의한 감쇠를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 면역크로마토그래피법에 의한 피검출 물질의 검출에 사용하는 시험편이다. 면역크로마토그래피법에 있어서는, 피검출 물질을 특이적으로 인식하고 결합하는 리간드를 고정화한 시험편과 피검출 물질을 특이적으로 인식하는 리간드를 결합시키고, 또한 불용성 담체 입자를 사용하여, 상기 불용성 담체 입자가 피검출 물질과 결합하고, 섬유 구조를 가지는 시험편 내를 모세관 현상을 이용하여 이동하고, 시험편 내의 소정의 부위에 고정화된 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 포착 물질과 결합함으로써, 시험편 상의 소정의 부위에, 포착 물질-피검출 물질-불용성 담체 입자의 복합체를 형성하고, 응집한 불용성 담체 입자가 집적되는 것을 이용하고, 불용성 담체 입자가 집적된 부위를 포함하는 시험편 상에 광을 조사하고, 시험편 상의 부위에서 발해지는 광을 검출광으로서 검출 장치 또는 육안에 의해 측정하고, 불용성 담체 입자의 집적의 유무를 검출하고, 피검출 물질의 유무를 분석한다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편은, 시험편 상의 광을 조사하는 측과 반대측에 광 반사재를 구비한 것을 특징으로 한다. 피검출 물질이 존재하는 경우, 불용성 담체 입자는 시험편 상의 포착 물질이 고정화된 부위, 즉 검출 부위에 집적된다. 광 반사재를 구비함으로써, 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위에서 발해지고, 광검출 장치 또는 육안에 의해 검출되는 검출광이 증강된다. 즉, 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위에서 발하는 광이 증강되고, 또는 상기 검출 부위에서 발하는 광과 비교하여 상기 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광의 강도가 증강하고, 그 결과, 검출광의 강도가 증강된다. 여기서, 검출광이란, 시험편 상에 광을 조사한 후에, 시험편 상으로부터 발해져, 광검출 장치 또는 육안에 의해 검출되는 광을 말한다. 구체적으로는, 광 반사재를 구비하고 있는 면역크로마토그래피 시험편을 사용함으로써, 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위에서 발하는 광의 강도와 상기 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광의 강도의 콘트라스트가 커지고, 그 결과, 검출 부위에 집적된 불용성 담체 입자의 존재를 검출할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위에서 발하는 광」이라는 경우, 검출 부위에 집적된 불용성 담체 입자 자체로부터 발생하는 광도, 검출 부위에서 반사하는 광, 또는 시험편의 광을 조사하는 측과는 반대측에 구비된 광 반사재에서 반사되어 검출 부위를 통하여 검출되는 광도 포함된다. 또한, 「시험편 상의 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광」이란, 검출 부위의 주위의 부위, 즉 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적되어 있지 않은 부위에서 반사하는 광, 또는 시험편의 광을 조사하는 측과 반대측에 공급된 광 반사재에서 반사되어 검출부 이외의 부위를 통하여 검출되는 광이 포함된다.
불용성 담체 입자란, 입자 자체가 액체에 불용성이며, 항원이나 항체를 결합시켜 유지하는 담체로 되는 입자를 말한다. 본 발명에 있어서는, 검사약 등의 기술 분야에서 사용되는 라텍스 입자를 사용할 수 있다. 라텍스 입자란, 콜로이드상으로 수중에 분산된 유탁액을 형성하는 입자를 말한다. 입자의 재질은 한정되지 않지만, 검사약 등의 기술 분야에서 항체, 항원, 리간드, 리셉터 등의 단백질을 결합하는 고상 담체의 재료로 이용되는 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리스티렌, 스티렌-아크릴산 공중합체 등의 스티렌 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리메틸렌메타아크릴레이트(PMMA), 폴리비닐톨루엔 등의 수지, 실리카, 셀룰로오스 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 스티렌을 베이스로 하는 입자가 바람직하다. 스티렌을 베이스로 하는 입자란, 폴리스티렌이나 스티렌 또는 스티렌의 유도체와 중합성 불포화 카르본산이나 중합성 불포화 술폰산 등과의 공중합체를 말한다. 스티렌의 유도체로서는, 클로로메틸스티렌, 디비닐벤젠 등을 들 수 있고, 중합성 불포화 카르본산으로서는, 아크릴산, 메타크릴산 등을 들 수 있고, 중합성 불포화 술폰산으로서는, 스티렌술폰산 소다 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 스티렌을 베이스로 하는 라텍스 입자를 폴리스티렌 라텍스 입자라고 한다.
사용하는 입자의 입경은, 10㎚∼수백㎚, 바람직하게는 30㎚∼500㎚이다.
불용성 담체 입자에는, 형광 색소로 표식된 형광 표식 불용성 담체 입자와 착색 색소로 착색된 착색 불용성 담체 입자가 포함된다.
형광 표식 불용성 담체 입자로서는, 형광 색소를 형광 표식제로서 결합시킴으로써, 형광 색소로 표식한 것을 사용할 수 있다. 결합시키는 형광 색소의 종류는 한정되지 않고, 검사약 등의 분야에서 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다.
예를 들면, 형광 표식에 사용하는 형광 색소로서는, 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 쿠마린, Cy 염료(dye), 알렉사[Alexa(등록상표)], 플루오르(Fluor), 에보블루(EvoBlue), 옥사진, 카르보피로닌(Carbopyronin), 나프탈렌(naphthalene), 비페닐(biphenyl), 안트라센(anthracene), 페넨스렌(phenenthrene), 피렌(pyrene), 카르바졸(carbazole) 등을 기본 골격으로서 가지는 유기 형광 색소나 그 형광 색소의 유도체를 들 수 있다. 또한, 유로피움(EU3+) 킬레이트나 테르비움(Tb3 +) 킬레이트 등의 희토류 착체도 사용할 수 있다. 유로피움(EU3+) 킬레이트로서 아미노기를 가지는 ATBTA-EU3+ 등을 사용할 수 있다. 또한, Green Fluorescent Protein(GFP) 등의 형광 단백질도 사용할 수 있다.
형광 색소에 의한 불용성 담체 입자의 표식은, 미리 상기한 불용성 담체 입자에 카르복실기, 아미노기, 술폰산기, 티올기, 알데히드기 등의 작용기를 도입하여 두고, 상기 형광 색소에도 작용기를 도입하여, 작용기끼리의 결합 반응에 의해 형광 색소를 불용성 담체 입자에 결합시킴으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 아미노기와 카르복실기를 아미드 결합에 의해 결합시키거나, 티올기끼리 디술피드 결합에 의해 결합시킬 수 있다. 또한, 작용기끼리 가교 시약을 사용하여 결합시켜도 된다. 가교 시약로서, N-하이드록시숙신이미드에스테르, 말레이미드, EDAC(N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염), 글루타르알데히드 등을 들 수 있다. 또한, 형광 색소로서 희토류 착체를 사용하는 경우, 아미노기를 도입한 ATBTA-EU3+ 등을 이용하면 된다. 또한, 형광 단백질을 사용하는 경우에는, 작용기끼리의 결합을 이용해도 되지만, 형광 단백질을 불용성 담체 입자에 물리적 흡착을 이용하여 결합시킬 수도 있다. 아미노기나 카르복실기를 도입한 형광 색소는 시판 중인 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 이용할 수 있는 형광 색소를 이하에 나타낸다. 각각의 형광 색소의 여기 파장(㎚) 및 형광 파장(㎚)을 괄호 내에 여기 파장/형광 파장으로 나타낸다. 여기 파장 및 형광 파장은 측정 조건 등에 의하여, 전후한다. 하기 파장의 ±수십㎚, 예를 들면, ±25㎚의 범위에서 측정할 수 있다. 이들의 형광 색소는 일례이며, 이들에는 한정되지 않고, 각종 형광 색소를 그 형광 파장에 기초하여 사용할 수 있다.
<유기 형광 색소>
Dylight(등록상표) 405(400/420), DY-405(400/420), Cascade Blue(400/420), Alexa Fluor(등록상표) 405(401/421), AMCA(353/440), Alexa-350(346/442), AMCA-X(347/447), Pacific Blue(상표)(405/455), Marine Blue(365/460), DY-415(418/467), Royal Blue(426/480), ATTO425(436/484), Cy(상표) 2(489/505), ATTO465(453/508), DY-475 XL(492/509), Northern Lights(상표) 493(493/514), BODIPY(등록상표) 505/515(505/515), DY-490(490/516), DyLight(등록상표) 488(493/518), Alexa-488(495/519), 5-FITC(494/519), FAM(495/520), DY-495-X5(495/520), DY-495(493/521), 플루오레세인(Fluorescein)(494/521), FITC(플루오레세인이소티오시아네이트)(498/522), ATTO488(501/523), HiLyte Flour(상표) 488(499/523), MFP488(501/523), ATTO495(495/527), OG-488(496/524), Rhodamine110(500/525), OG-514(511/530), Oyster(등록상표) 500(505/530), Spectrum Green(497/538), Alexa-430(431/541), ATTO520(525/545), ATTO532(532/553), Cas Y(402/554), Alexa-532(530/554), DY-500XL(505/555), DY-485XL(485/560), Alexa-555(555/565), HiLyte Plus555(552/567), DyLight549(550/568), HiLyte Fluor555(553/568), Cy3(550/565), Dylight547(557/570), Rhodamine(550/570), TRITC(550/570), DY-548(558/572), DY-554(551/572), DY-555(547/572), Alexa Fluor 546(556/573), DY-556(548/573), Northern Lights557(557/574), Oyster 550(555/574), 5-TAMRA(547/574), DY-505-X5(505/574), DY-547(557/574), Oyster 556(562/575), DY-549(560/575), Alexa-546(556/575), ATTO550(554/576), PE(488/578), B-PE(545/578), R-PE(566/578), DY-560(559/578), TAMRA(555/580), Tetramethyl rhodamine(테트라메틸 로다민)(552/578), RITC/TMR(555/580), MFP555(560/585), Spectrum Orange(559/588), DY-510XL(509/590), Rhodamine B(570/590), ATTO565(563/592), Cy3.5(581/596), ROX(Rhodamine Red X)(587/599), DY-590(580/599), 5-ROX(573/602), Alexa-568(578/603), BODIPY 580/605(580/605), Spectrum Red(587/612), ECD(488/613), Texas Red(등록상표)(596/615), DyLight594(593/618), Alexa Flour594(590/619), HiLyte Fluor TR(591/622), ATTO590(594/624), MFP590(597/624), DY-610(610/630), DY-480XL(500/630), ATTO610(615/634), DY-615(621/641), C-Phycocyanin(C-피코시아닌)(616/647), ATTO620(619/643), Alexa-633(632/647), Phycocianin(피코시아닌)(620/650), DY-481XL(515/650), ATTO633(629/657), DY-630(636/657), DY-632(637/657), DY-633(637/657), MFP631(633/658), DyLight633(638/658), Northern Lights637(637/658), DY-631(637/658), DY-634(635/658), APC(Allophycocyanin)(650/660), APC-XL(650/660), DY-520 XL(520/664), Alexa-647(650/668), Cy5(643/667), DY-521XL(523/668), Oyster 645(650/669), Quantum Red(488/670), DY-635(645/671), DY-636(645/671), DY-647(653/673), DyLight647(652/673), HiLyte Fluor(653/647), DyLight649(646/674), HiLyte Plus647(649/674), Oyster650(655/674), DY-648(653/674), DY-650(653/674), PerCP(488/675), DY-652(654/675), DY-649(655/676), DY-651(656/678), Oyster656(662/679), ATTO655(663/684), Alexa-660(663/690), Cy5.5(675/694), DY-677(673/694), DY-678(674/698), HiLyte Fluor680(678/699), DY-675(674/699), DY-676(674/699), IRDye(등록상표)(700) DX(689/700), Alexa-680(679/702), DY-681(691/708), DY-680(690/709), DY-682(690/709), DyLight680(682/715), Alexa Fluor700(702/723), DY-700(707/730), DY-701(706/731), DY-730(732/758), DY-732(736/759), DY-734(736/759), DY-731(736/760), DY-752(748/772), DY-750(747/776), DyLight750(752/778), HiLyte Fluor750(751/778), DY-749(752/778), HiLyte Plus750(751/779), DY-751(751/779), DyLight800(770/794), IRDye800CW(774/800), DY-780(782/800), DY-781(783/800), DY-782(784/800), DY-776(771/801), DY-777(771/801), IRDye800(778/806) 등
<희토류 착체>
ATBTA-EU3+(335/616) 등
<형광 단백질>
Sirius(355/424), CFP(452/505), AcGFP(475/505), EGFP(488/509), EYFP(513/527), YFP(514/527), ZsYellow(529/539), mOrange(548/562), DsRed2(563/582), AsRed2(576/592), mRFP1(584/607), mCherry(587/610), HcRed(588/618), mRasberry(598/625), mPlum(590/649) 등
또한, 형광을 발할 수 있는 물질로 이루어진 불용성 담체 입자도 사용할 수 있다. 이와 같은 입자로서, 예를 들면, 유로피움(Eu), 테르비움(Tb) 등의 희토류 원소가 부활된 MIMIIO4 또는 MIAl5O12(MI는 이트륨(Y), 란타늄(La) 또는 가돌리늄(Gd), MII는 니오븀(Nb), 인(P) 또는 바나듐(V)으로 이루어지는 입자를 들 수 있고, 일본공개특허 제2012-32263호 공보에 기재된 것을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 이들의 형광을 발할 수 있는 물질로 이루어진 불용성 담체 입자도 형광 색소로 표식된 불용성 담체 입자에 포함된다.
형광 표식 불용성 담체 입자는, 상기한 여기광을 조사광으로서 조사한 경우에 여기되고, 여기광과는 상이한 파장의 형광을 발한다. 따라서, 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 형광 색소가 발하는 광을 검출광으로서 검출한다. 즉, 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위에서 발하는 검출광이란, 형광 색소로부터 발생하는 형광을 말한다.
광 반사재를 구비한 시험편을 사용하여 시험할 때, 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위를 포함하는 시험편 상에, 여기광인 조사광을 조사하면, 여기광이 형광 표식 불용성 담체 입자의 형광 색소를 여기한다. 또한, 조사광의 일부는 일단 광 반사재에 닿아 반사되어 형광 표식 불용성 담체 입자의 형광 색소를 여기한다. 여기광이 닿은 형광 색소로부터 형광이 발생하고, 검출된다. 또한, 발생한 형광의 일부는 상기 광 반사재에서 반사되고, 검출된다. 이 결과, 형광인 검출광의 강도가 증강된다.
착색 불용성 담체 입자는, 가시역 착색 불용성 담체 입자이며, 가시역 착색 불용성 담체 입자란, 사람이 눈으로 보고 인식할 수 있는 색으로 착색된 불용성 담체 입자를 말한다. 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자는, 특정한 파장의 가시광선을 반사함으로써, 사람이 그 반사된 가시광선에 의해 색을 인식할 수 있다. 가시광선은, 파장 380㎚∼750㎚ 정도의 광선이다. 착색 입자의 색은, 유채색으로서 색상으로 표현되고, 적색, 오렌지색, 황색, 녹색, 청색, 보라색 등이 있고, 각 색은 이하의 특정한 파장의 가시광선을 반사함으로써, 사람에게 그 색으로 착색되어 있다고 인식된다.
적색 : 620∼750㎚
오렌지색 : 590∼620㎚
황색 : 570∼590㎚
녹색 : 495∼570㎚
청색 : 450∼495㎚
가시역 착색 불용성 담체 입자는, 상기한 입자를 각 색의 색소로 염색함으로써 제조할 수 있다. 색소에 의한 염색은, 입자 표면의 염색이어도 되지만, 색소의 탈리(脫離)를 방지하기 위하여, 색소를 입자에 스며들게 함으로써 입자 내부도 염색하는 것이 바람직하다. 또한, 단독의 색소로 염색하는 것도 가능하지만, 복수의 색소로 염색함으로써 임의의 색으로 착색된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 얻을 수 있다. 예를 들면, 적색 입자, 청색 입자, 녹색 입자, 황색 입자, 핑크색 입자 등의 각 색의 착색 불용성 담체 입자를 제조할 수 있다. 착색에 사용하는 색소는 수지 등의 염색에 이용할 수 있는 공지의 색소를 사용할 수 있고, 예를 들면, 수단 블루( Sudan Blue), 수단 III, 수단 레드 IV(Sudan Red IV), 퀴니자린 그린(Quinizarine Green), 오일 오렌지 등의 염료나 안료를 사용하여 착색할 수 있다. 또한, 각종 재질로 이루어진 각종 색으로 착색된 입자가 시판되고 있고, 이들 시판 착색 불용성 담체 입자를 사용할 수도 있다.
가시역 착색 불용성 담체 입자는, 색에 따라, 상기한 파장역의 광을 반사하고, 한편, 상기한 파장역의 광과 보색 관계에 있는 파장역의 광을 흡수한다. 예를 들면, 적색 불용성 담체 입자는, 적색과 보색의 관계에 있는 색의 광을 흡수한다. 적색광의 파장은 620∼750㎚ 부근이다. 적색과 보색의 관계에 있는 색은 청색부터 녹색이며, 청색광의 파장은 450∼495㎚ 부근, 녹색광의 파장은 495㎚∼570㎚ 부근이다. 또한, 청색 불용성 담체 입자는, 청색과 보색의 관계에 있는 색의 광을 흡수한다. 청색광의 파장은 450∼495㎚ 부근이다. 청색과 보색의 관계에 있는 색은 오렌지색부터 적색이며, 오렌지색 광의 파장은 590∼620㎚ 부근, 적색광의 파장은 620㎚∼750㎚ 부근이다.
본 발명에 있어서, 착색 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 시험편 상의 착색 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위로부터 발하는 광과 검출 부위 이외의 주위의 부위로부터 발하는 광의 강도의 콘트라스트를 높이기 위하여, 착색 불용성 담체 입자가 흡수할 수 있는 파장역의 광, 즉 착색 불용성 담체 입자의 색과 보색 관계에 있는 색의 파장역의 광을 조사하는 것이 바람직하다. 그 결과, 조사한 광이 착색 불용성 담체 입자에 닿으면 광의 대부분은 반사되고 않고 흡수되어, 조사한 광의 반사광의 강도가 감쇠한다. 한편, 착색 불용성 담체 입자가 집적되어 있지 않은 검출 부위 이외의 주위의 부위에 닿은 광은 흡수되지 않고, 시험편을 투과하고 광 반사재에 닿아 반사된다. 반사된 광의 일부는 추가로 착색 불용성 담체 입자에 흡수되거나, 또는 착색 불용성 담체 입자에 의해 차단된다. 따라서, 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위에 있어서, 조사된 광의 반사광은 감쇠하고, 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 검출광이 증강된다. 달리 말하면, 검출부에서의 반사광은 약해지고, 검출부 이외의 그 주위의 부위에서의 반사광은 강해진다. 착색 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위로부터 발하는 광, 및 검출 부위 이외의 주위의 부위로부터 발하는 광이란, 조사된 광이 반사한 광을 말한다. 따라서, 조사광과 반사광의 파장은 동일하다.
도 1에 본 발명의 광 반사재를 구비한 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 경우의 검출광의 증강의 원리를 나타낸다. 도 1의 A는 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용한 경우이며, 도 1의 B는 착색 불용성 담체 입자를 사용한 경우이다. 또한, 도면 중의 그래프는 가로축에 시험편 상의 위치를 나타내고, 세로축에 시험편 상의, 어느 위치에서의 검출되는 광의 강도를 나타낸다. 도 1의 A의 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용한 경우의 광의 강도는 형광 강도이며, 도 1의 B의 착색 불용성 담체 입자를 사용한 경우의 광의 강도는 반사광 강도이다. 도면 중의 가로축 아래의 바는, 불용성 담체 입자가 집적된 부위를 나타낸다. 또한, 도면 중, 종래법은 광 반사재를 구비하지 않은 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 방법이며, 본 발명법은 광 반사재를 구비한 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 방법이다. 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용한 경우, 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 불용성 담체 입자가 집적된 부위에 있어서 형광이 강해지지만, 본 발명법에서는 종래법에 비하여, 상기 부위에서의 형광 강도가 증강된다. 또한, 착색 불용성 담체 입자를 사용한 경우, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 불용성 담체 입자가 집적된 부위에 있어서, 불용성 담체 입자의 존재의 영향으로 조사한 광의 반사광은 감쇠하고, 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에서 반사광이 강해진다. 본 발명법에서는, 종래법에 비하여, 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에 있어서 반사광이 보다 강해지고, 불용성 담체 입자가 집적된 부위에서의 조사한 광의 반사광은 감쇠된 채로 있으므로, 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에 있어서 반사광의 강도가 증강되고, 결과적으로 검출광이 증강된다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편은, 다공성의 흡수성 재질로 되어 있고, 검체 시료액이 모세관 현상에 의해 이동할 수 있는 재질로 된 부재를 가지고, 이 부재를 멤브레인이라 한다. 형광 표식 불용성 담체 입자 또는 착색 불용성 담체 입자가 집적되는 위치를 검출 부위라고 하고, 상기 멤브레인은, 피검출 물질과 결합할 수 있는 포착 물질을 고정화한 검출 부위를 포함한다. 멤브레인은, 니트로셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 이들의 혼합 섬유로 이루어지는 재질로 되어 있고, 바람직하게는 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 되어 있다. 멤브레인의 두께는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 100∼200㎛ 정도이다. 또한, 멤브레인은 직사각형의 스트립으로서 사용하고, 그 크기는 특별히 한정되지 않지만, 통상, 3㎜∼9㎜×40㎜∼60㎜ 정도이다.
멤브레인 상의 검출 부위는, 검출해야 할 피검출 물질과 특이적으로 결합하여 피검출 물질을 포착할 수 있는 리간드가 고정화되어 있다. 검출 부위를 포착 부위라 부르는 경우도 있다. 검출 부위에 있어서, 리간드는, 예를 들면, 라인형으로 고정화된다. 본 발명에 있어서 「시험편 상의 검출 부위 이외의 주위의 부위」란 검출 부위에 인접한 시험편 상의 부위를 말한다. 피검출 물질에 결합하는 리간드는, 전형적으로는 피검출 물질이 항원인 경우는, 이 항원에 특이적으로 결합하는 항체이며, 피검출 물질이 항체인 경우는, 이 항체가 특이적으로 결합하는 항원이다. 그 외에, 피검출 물질 리간드의 조합으로서, 수용체-리간드, 리간드-수용체 등의 조합을 들 수 있다. 면역크로마토그래피법이라 하는 경우, 통상은 항체와 항원의 결합을 이용한 시험법을 말하지만, 본 발명에 있어서 면역크로마토그래피법라 하는 경우, 넓은 의미로 해석하고, 항원과 항체의 조합이 아닌 피검출 물질-리간드의 조합을 이용한 시험법도 포함된다. 이하에 있어서는, 항원과 항체의 조합을 이용한 시험법에 대하여 설명한다. 피검출 물질이 항원인 경우에는, 이 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 고정화하고, 피검출 물질이 항체인 경우에는, 이 항체가 특이적으로 인식하는 항원을 고정화하면 된다. 항체 또는 항원은, 예를 들면, 라인형이나 도트형으로 고정화하면 되고, 바람직하게는 라인형으로 고정화한다. 고정화는, 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인 등의 고상(固相)으로 고정화하기 위한 공지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 흡착에 의한 방법, 아미노기, 카르복실기 등의 작용기를 이용하여 화학적으로 결합시키는 방법 등을 들 수 있다. 항체는, 정제한 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체가 사용된다. 항원은, 정제한 천연의 항원 또는 재조합(recombinant) 항원이 사용된다.
상기한 항원 또는 항체가 고정화된 검출 부위가 존재하는 시험편에, 피검출 물질을 포함하는 액체 시료와 상기 피검출 물질에 결합하는 항체 또는 항원을 결합시킨 불용성 담체 입자의 혼합물을 시험편 상의 검출 부위 이외의 부분에 첨가함으로써, 불용성 담체 입자와 피검출 물질은, 항원-항체 반응에 의해 복합체를 형성하면서, 시험편 상을 모세관 현상에 의해 이동한다. 불용성 담체 입자와 항원 또는 항체를 통하여 결합한 피검출 물질이, 검출 부위에 고정화된 항체 또는 항원과 결합하고, 검출 부위에 있어서, 고정화 항체 또는 고정화 항원-피검출 물질-불용성 담체 입자의 복합체가 형성된다. 상기 불용성 담체 입자의 존재를, 광을 조사하고, 시험편상의 검출 부위 또는 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광을 측정함으로써 검출할 수 있고, 그 결과 피검출 물질의 유무를 검출할 수 있다.
멤브레인 상에는, 또한 대조 표시 부위가 존재하고 있어도 된다. 대조 표시 부위는 시험이 정확하게 실시된 것을 나타내는 부위이다. 예를 들면, 대조 표시 부위는, 검출 부위의 하류에 존재하고, 검체 시료가 검출 부위를 통과하고, 대조 표시 부위에 도달했을 때 착색 등에 의해 시그널을 발한다. 대조 표시부에는, 불용성 담체 입자에 결합시킨 리간드에 결합하는 물질을 고정화하여 두어도 되고, 검체 시료가 도달했을 때 색이 변화하는 pH 인디케이터(indicator)등의 시약을 고정화하여 두어도 된다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편은, 추가로 시료 첨가 부위, 흡수대, 표식 부위를 가지고 있어도 된다.
시료 첨가 부위는, 검체 시료액을 첨가하는 부위에서, 검체 시료액을 상기한 멤브레인 상에 직접 첨가해도 되지만, 흡수성이 있는 재질, 예를 들면, 스펀지, 유리 섬유 등의 부직포 등의 패드를 시험편 상에 설치하고 그 부분에 첨가해도 된다. 패드를 사용하는 경우, 상기 패드를 샘플 패드이라 부를 수가 있다. 시료 첨가 부위는 시험편 상의 일단에 설치하는 것이 바람직하다.
흡수대는, 흡수 패드 부위라고도 부르고, 본 발명의 면역크로마토그래피 시험편의 시료 첨가 부위와는 상이한 일단에 설치되고, 시료 첨가 부위에 첨가한 후, 시험편 상을 이동하는 시료 액체를 흡수함으로써 시험편 상의 시료 액체의 흐름을 촉진한다. 흡수대는, 다량의 용액을 흡수할 수 있도록, 흡수성 재질로 되어 있고, 예를 들면, 셀룰로오스, 유리 섬유 등으로 된 부직포 등이 사용된다. 또한, 그 크기는, 특별히 한정되지 않지만, 통상, 3㎜∼15㎜×10㎜∼40㎜, 두께 0.5㎜∼3㎜ 정도이다.
표식 부위는, 형광 표식 불용성 담체 또는 착색 불용성 담체가 함유된 부위이다. 표식 부위는 흡수성 재질, 예를 들면, 스펀지 및 유리 섬유 등으로 된 부직포 등의 재질이 사용되고, 그 크기는 특별히 한정되지 않지만, 통상, 3㎜∼10㎜×3㎜∼10㎜, 두께 0.5㎜∼3㎜ 정도이며, 불용성 담체 입자가 건조 상태로 함유되어 있다. 표식 부위로서 상기한 흡수성 재질에 표식된 불용성 담체 입자를 함유시켜 사용하는 경우, 이 표식 부위를 콘쥬게이트(conjugate) 패드라고 부를 수 있다. 표식 부위는, 상기한 흡수성 재질에 불용성 담체 입자를 함침시키고, 건조시키면 된다. 시험편 상을 검체 시료액이 시료 첨가 부위로부터 흡수대에 흐를 때의 시료 첨가 부위측을 상류, 흡수대측을 하류로 한 경우, 표식 부위는 시료 첨가 부위의 하류로서, 검출 부위의 상류에 설치하면 된다. 이 경우, 시료 첨가 부위의 샘플 패드와 표식 부위의 콘쥬게이트 패드는 접촉하고 있지 않아도 된다.
시험편의 시료 검체 부위에 액체 시료를 첨가하면, 액체 시료는 모세관 현상에 의해 표식 부위로 이동하고, 표식 부위에 함유되어 있는 불용성 담체 입자가 액체 시료 중에 용해되고, 불용성 담체 입자에 결합시킨 항원 또는 항체가 액체 시료 중의 피검출 물질과 결합하여, 복합체를 형성하면서, 시험편의 멤브레인 상을 하류로 이동한다. 불용성 담체 입자에 항원 또는 항체를 통하여 결합한 피검출 물질이 검출 부위에 고정화한 항체 또는 항원과 결합함으로써, 불용성 담체 입자와 피검출 물질의 복합체가 검출 부위에 고정화된 항체 또는 항원에 의해 포착되어 검출 부위에 있어서, 불용성 담체 입자가 집적된다. 나머지의 액체 시료는 검출 부위를 통과하고, 흡수대에 흡수된다.
본 발명의 시험편은 백킹 시트를 가지고 있어도 된다. 백킹 시트는 지지 시트라 할 수도 있고, 상기한 멤브레인, 시료 첨가 부위, 흡수대, 표식 부위를 라이닝( lining)하기 위해 사용된다. 멤브레인, 시료 첨가 부위, 흡수대, 표식 부위는, 백킹 시트에 부착해도 된다. 백킹 시트는, 액체를 투과하지 않는 플라스틱 등으로 된 시트이며, 멤브레인이나 그 외의 시료 첨가 부위 등의 부재가 일정한 구조나 강도를 유지하도록 지지하고, 또한 시료 검체가 시험편으로부터 유출되어 버리는 것을 방지할 수 있다. 백킹 시트가 있는 경우, 백킹 시트도 포함하여 시험편이라고 부른다. 백킹 시트는 멤브레인과 후술하는 광 반사재의 사이에 존재하고 있어도 되고, 광 반사재의 하측에 존재하고 있어도 된다. 백킹 시트가 광 반사재의 하측에 존재하는 경우, 백킹 시트는 광을 투과하지 않는 소재로 되어 있어도 되지만, 백킹 시트가 멤브레인과 광 반사재의 사이에 존재하는 경우, 백킹 시트는 광을 현저하게 감쇠시키지 않고 투과시키는 소재, 예를 들면, 투명한 플라스틱으로 되어 있을 필요가 있다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편은, 저장 용기 내에 수용되고 있어도 되고, 이 저장 용기에 의하여, 예를 들면, 자외선이나 공기 중의 습기에 의한 열화를 방지할 수 있다. 또한, 검체 시료로서 바이러스나 세균 등의 감염성 미생물을 포함할 수 있는 것을 사용하는 경우, 저장 용기에 의해 시금(assay)을 행하는 시험자가 이들의 미생물과 접촉하는 것을 방지할 수 있다. 예를 들면, 적당한 크기의 수지제 케이스를 저장 용기로서 사용하고, 이 케이스 내에 본 발명의 장치를 수납하면 된다. 또한, 항원 또는 항체를 고정화한 시험편의 표면을 수지제 필름 등(탑 라미네이트)으로 덮어도 된다. 저장 용기와 그 중에 저장된 시험편을, 일체로서 면역크로마토그래피 디바이스라고 하는 경우가 있다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편에 있어서는, 불용성 담체 입자가 집적하는 검출 부위를 포함하는 시험편 상의 광이 조사되는 측과 반대측에 광 반사재를 설치하여 둠으로써, 본래라면, 시험편을 투과하여 버릴 조사광이 광 반사재에 닿아, 반사된다.
광 반사재는, 조사광을 반사할 수 있는 재질인 한, 어떠한 재질의 것도 사용할 수 있다. 또한, 광 반사재가 광을 반사하는 물질로 형성되어 있어도 되고, 본래는 광을 반사하지 않는 재질을 광을 반사하는 물질로 피복해도 된다. 광을 반사하는 물질로서, 금속이나 유리, 마이카, 실리카 등의 무기물을 들 수 있다. 광을 반사하는 물질은, 바람직하게는 금속이며, 광 반사재 자체가 금속으로 되어 있는 것이 바람직하다. 금속으로서는, 광의 반사율이 높은 것이 바람직하고, 알루미늄, 탄탈, 니켈, 텅스텐, 구리, 황동, 니켈티탄, 금, 백금 등이나 이들의 합금을 들 수 있다. 광 반사재의 표면은, 광이 경면 반사되도록 광택을 갖게 처리해도 되고, 광이 확산 반사되도록 표면에 거칠함이 남도록 처리해도 되지만, 경면 반사되도록 처리하는 것이 바람직하다. 또한, 본래는 광을 반사하지 않는 재질을 광을 반사하는 물질로 피복하는 예로서, 수지 등의 물질로 형성된 것의 표면을 금속으로 코팅한 것을 들 수 있다. 또한, 표면을 금속 분말로 코팅하여, 금속막을 형성시켜도 된다. 금속 박막을 표면에 형성하기 위해서는, 도금, 스퍼터링, 증착 등의 방법에 의해 행할 수 있다. 또한, 무전해 니켈-인 도금에 의해 두꺼운 막(예를 들면, 막 두께 5∼20㎛)을 형성할 수도 있다.
금속에 따라 반사율이 높은 광선의 파장이 상이하다. 따라서, 광 반사재로서 금속을 사용하는 경우, 조사광의 파장에 따라, 금속의 종류를 선택하면 된다. 즉, 검출 부위에 조사하는 조사광의 파장의 광의 반사율이 높은 금속을 선택하면 된다. 금속의 광의 파장에 대한 반사율은, 금속의 반사 스펙트럼을 분광 광도계 등으로 측정함으로써 결정할 수 있다. 따라서, 각 금속의 반사 스펙트럼을 측정하고, 이용하는 조사광의 파장의 광의 반사율이 높은 금속을 사용하면 된다. 도 2에 알루미늄, 구리 등의 금속의 전체 반사율을 나타낸다(이 도면은, Mc Leed. "Thin film optical filters", A. Hilger, London, 1985로부터의 인용임). 도 2에 있어서, 가로축은 파장을 나타내고, 세로축은 전체 반사율을 나타낸다. 예를 들면, 이 도면을 참조로 하여, 조사광의 파장과 금속의 조합을 선택할 수 있다.
예를 들면, 45도 입사의 전체 반사율이 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 파장과 금속의 조합을 이용하면 된다.
예를 들면, 알루미늄은, 250㎚∼1000㎚의 범위에서의 전체 반사율은 85% 이상이므로, 250㎚∼1000㎚의 조사광에 대하여 사용할 수 있다. 또한, 구리는, 600㎚ 이상의 파장의 광의 전체 반사율이 90% 이상이므로, 600㎚∼1000㎚의 조사광을 이용하는 경우에는, 구리를 사용해도 된다.
그리고, 면역크로마토그래피 시험편은 1회 사용하고 버리므로, 장치의 제조 비용을 낮게 하기 위하여, 금속도 저비용으로 입수할 수 있는 것이 바람직하고, 이 점에서 알루미늄이나 구리가 바람직하다.
면역크로마토그래피 시험편에 있어서, 광 반사재는 시트형, 또는 호일형인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 광 반사재로서, 알루미늄박이나 구리박(銅箔)을 사용할 수 있고, 시판 중인 것을 사용하면 된다.
광 반사재는, 면역크로마토그래피 시험편의 검출 부위에 조사된 조사광이 시험편을 투과한 경우에, 그 조사광을 반사시키기 위해 사용된다. 따라서, 광 반사재는, 면역크로마토그래피 시험편에 대하여, 광이 조사되는 측, 즉 광원이 존재하는 측과 반대측에 설치한다. 통상, 면역크로마토그래피 시험편은, 항체 또는 항원이 고정화된 면을 위로 하여, 수평으로 두고 사용된다. 따라서, 광 반사재는, 면역크로마토그래피 시험편의 하측에 설치한다. 본 발명에 있어서, 광 반사재를 설치하는 위치를 시험편의 하측이라고 하는 경우가 있지만, 시험편의 하측이란, 중력장이 향하는 방향을 기준으로 한 상하에 기초하여 정해지는 것이 아니고, 광이 조사되는 측과 반대측을 말한다.
광 반사재는, 적어도 시험편 상의 검출 부위의 하측 또는 하부에 설치한다. 광 반사재의 크기는 적어도 시험편 상의 검출 부위를 커버할 수 있는 크기이면 되지만, 바람직하게는 검출 부위 이외의 주위의 부위를 투과한 조사광도 반사 가능하도록, 검출 부위의 크기보다 크게 하고, 예를 들면, 시험편의 멤브레인 전체를 커버하는 크기의 것을 사용한다.
광 반사재는, 시험편과 일체로서, 시험편의 저장 용기와 일체이어도 되고, 또한, 시험편의 저장 용기 중에 시험편과 함께 저장되어 있어도 된다. 또한, 상기한 백킹 시트 자체가 광 반사재이어도 되고, 예를 들면, 알루미늄박이나 구리박을 백킹 시트로서 사용하면 된다.
도 3에 본 발명의 면역크로마토그래피 시험편, 또는 저장 용기를 포함하는 면역크로마토그래피 디바이스에서의 광 반사재를 설치하는 위치나 광 반사재의 형상을 바꾼 형태예를 나타낸다. 도 3에 있어서, a는 흡수대를, b는 멤브레인을, b'는 멤브레인 상의 검출 부위를, c는 콘쥬게이트 패드를, d는 샘플 패드를, e는 백킹 시트를, f는 광 반사재를, g는 광을 투과하는 백킹 시트를, h는 저장 용기를 나타낸다.
도 3의 A는, 광 반사재를 사용하지 않는 종래의 면역크로마토그래피법에서 사용하는 형태예를 나타낸다. 도 3의 B1 및 도 3의 B2가 광 반사재를 설치한 본 발명의 면역크로마토그래피 시험편의 형태예 1 및 형태예 2를 나타낸 도면이며, 광 반사재는 시험편와 일체로 되어 있다. 도 3의 B3, 도 3의 B4 및 도 3의 B5는 광 반사재가 장착된 저장 용기에 수용된 시험편의 형태예 3, 4, 5를 나타낸 도면이며, 도 3의 B3 및 도 3의 B4에 나타낸 디바이스에 있어서는, 광 반사재는 저장 용기에 시험편과 함께 저장되고, 도 3의 B5에 나타낸 장치에 있어서는, 광 반사재는 저장 용기와 일체로 되어 있다. 도 3의 B1에 나타낸 면역크로마토그래피 시험편은, 멤브레인(b)의 검출 부위(b')의 하측에 광 반사재(f)가 멤브레인(b)에 접촉하도록 설치되고, 또한 그 하측에 백킹 시트(e)가 부착되어 있다. 도 3의 B2에 나타낸 면역크로마토그래피 시험편은, 멤브레인(b)의 하측에 백킹 시트(g)가 부착되고, 또한 그 하측에 광 반사재(f)가 설치되어 있다. 도 3의 B1에 나타낸 장치에 있어서는, 백킹 시트(e)는 광을 차단하는 재질이어도 되지만, 도 3의 B2에 나타낸 장치에 있어서는, 백킹 시트(g)는 투명하며 광을 투과하는 재질로 되어 있을 필요가 있다.
도 3의 B3, 도 3의 B4 및 도 3의 B5는, 시험편이 저장 용기 내에 수용된 디바이스를 나타내고, 저장 용기(h)의 내면에 광 반사재(f)가 설치되어 있다. 도 3의 B3에 나타낸 면역크로마토그래피 디바이스에 있어서는, 시험편의 검출 부위(b')의 하측 부분에 상당하는, 저장 용기(h)의 내면에 광 반사재(f)가 설치되어 있다. 도 3의 B4에 나타낸 면역크로마토그래피 디바이스에 있어서는, 도 3의 B3에 나타낸 장치와 동일한 위치에 광 반사재(f)가 장착되어 있지만, 광 반사재(f)는 곡면을 가지도록 가공되어 있고, 이 곡면의 존재에 의해 반사된 광이 시험편 상의 검출 부위(b')와 그 주위의 부위에 모인다. 즉, 도 3의 B3에 나타낸 장치의 광 반사재(f)는 반사된 광이 시험편 상의 검출 부위(b')와 그 주위의 부위에서 초점을 연결하는 같은 곡면을 가지고 있다. 광 반사재의 형상은 한정되지 않고, 반구(半球)형, 반원기둥형이어도 되고, 다면 구조를 가지고 있어도 되며, 그 구조에 의하여, 조사광이 효율적으로 검출 부위를 포함하는 면역크로마토그래피 시험편에 닿도록, 반사되면 된다. 또한, 도 3의 B5에 나타낸 면역크로마토그래피 디바이스에 있어서는, 저장 용기(h)의 내면 자체가 광 반사재로 되어 있다. 이 경우, 저장 용기 내면의 전체가 광 반사재로 되어 있어도 되고, 일부가 광 반사재로 되어 있어도 된다. 또한, 저장 용기 자체가 알루미늄이나 구리의 광 반사재로 형성되어 있어도 되고, 또는 저장 용기의 내면을 알루미늄이나 구리로 코팅해도 된다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편을 사용하여 검출하는 피검출 물질이나 검체 시료는 한정되지 않는다. 예를 들면, 검체 시료액은, 인두 또는 비강 클리닝액, 비강 흡인액, 인두 또는 비강 세정액, 타액, 혈청, 혈장, 전혈(全血), 변 현탁액, 소변, 배양액 및 이들을 완충액으로 희석한 것 등을 사용할 수 있다. 피검출 물질도 전혀 한정되지 않고, 검출하려고 하는 어떠한 물질이어도 된다. 예를 들면, 인플루엔자바이러스, 아데노바이러스, RS바이러스, 노로바이러스 등의 바이러스 항원, 레지오넬라속균, 용련균, MRSA 등의 세균 항원, 호르몬 등의 항원을 들 수가 있고, 또한 상기 세균, 바이러스 등에 대한 항체를 들 수 있다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 검출 방법에 있어서는, 면역크로마토그래피 시험을 행하고, 시험편 상의 검출 부위에 집적한, 형광 표식 불용성 담체 입자 또는 착색 불용성 담체 입자에 광을 조사한다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 시금에 있어서, 형광 표식 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위를 포함하는 시험편 상에 시험편 상부로부터 여기광을 조사한다. 조사한 여기광은 시험편 상의 검출 부위에 집적된 형광 표식 불용성 담체 입자의 형광 색소를 여기하여 형광을 발생시킨다. 본 발명의 면역크로마토그래피법 시험편에 있어서는, 시험편 상의 여기광을 조사하는 측과 반대측에 광 반사재가 구비되어 있으므로, 조사한 여기광이 광 반사재에서 반사되고, 검출 부위에 집적된 불용성 담체 입자의 형광 색소에 닿는 여기광의 강도를 증강시킬 수 있다. 또한, 여기광의 조사에 의해 발생한 형광도 일부는 광 반사재에서 반사되어, 검출광으로서 검출된다. 그러므로, 효율적으로 형광 색소를 여기하고, 형광을 발생시켜, 시험편 상의 검출부에 있어서 발하는 형광의 강도가 증강된다. 형광 표식 불용성 담체 입자가 존재하지 않는, 검출 부위 이외의 주위 부위에는, 형광 색소가 존재하지 않으므로, 형광이 발하는 일이 없고, 검출부에 있어서 발하는 형광과 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 형광의 콘트라스트가 높아지고, 검출되는 광이 증강되어, 시험편 상의 검출부에서의 형광 표식 불용성 담체 입자의 집적을 고감도로 검출할 수 있다. 그 결과, 피검출 물질을 고감도로 검출하는 것이 가능해진다.
형광의 측정은, 여기광을 조사하는 광조사 수단과 발생한 형광을 검출하는 광검출 수단을 포함하는 형광 검출 장치를 사용하여 행할 수 있다. 이와 같은 장치로서 공지의 형광 검출 장치를 사용할 수 있다. 또한, 시험편 또는 수납 용기를 포함하는 디바이스를 수납하는 부위를 가지고, 상기 부위에 시험편 또는 디바이스를 설치함으로써 형광을 검출하는 장치도 적절히 설계할 수 있다. 또한, 육안으로 측정할 수도 있다. 피검출 물질로서 특정한 항원을 측정하는 경우, 미리 항원 농도를 바꾼 경우에 얻어지는 형광 강도를 측정해 두고, 이 측정값에 기초하여 검량선을 작성함으로써, 얻어진 형광 강도로부터 검체 시료 중에 포함되는 항원의 농도를 결정할 수 있다.
또한, 착색 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위를 포함하는 시험편 상의 시험편 상부로부터 광을 조사한다. 조사한 광의 일부는 착색 불용성 담체 입자에 의해 흡수된다. 또한, 조사한 광의 일부는, 시험편을 투과하고 시험편 상의 광을 조사하는 측과 반대측에 구비된 광 반사재에서 반사된다. 반사된 광이 착색 불용성 담체 입자에 닿으면 다시 불용성 담체 입자에 의해 흡수되거나, 또는 불용성 담체 입자에 의해 차단된다. 한편, 조사한 광의 일부는, 불용성 담체 입자가 집적되어 있는 검출 부위 이외의 주위의 부위에 조사되고, 이 광은, 시험편을 투과하고 시험편 상의 광을 조사하는 측과 반대측에 구비된 광 반사재에서 반사되어, 불용성 담체 입자에 닿지 않고, 검출광으로서 검출된다. 그러므로, 조사한 광의 반사광은, 시험편 상에 집적된 불용성 담체 입자에 의해 감쇠하고, 상기 검출 부위에서 발하는 광, 즉 반사하는 광의 강도는 낮아지고, 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적한 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광, 즉 반사하는 광의 강도는 높아진다. 그 결과, 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위에서 발하는 광과 시험편 상의 불용성 담체 입자가 집적된 검출 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광의 콘트라스트가 높아지고, 검출되는 광이 증강되어, 시험편 상의 검출부에서의 착색 불용성 담체 입자의 집적을 고감도로 검출할 수 있다. 그 결과, 피검출 물질을 고감도로 검출하는 것이 가능해진다.
반사한 조사광의 측정은, 광을 검출하는 광검출 수단을 포함하는 광검출 장치를 사용하여 행할 수 있다. 이와 같은 장치로서, 예를 들면, 면역크로마토그래피 전용 리더를 사용할 수 있다. 또한, 육안으로 측정할 수도 있다. 피검출 물질로서 특정한 항원을 측정하는 경우, 미리 항원 농도를 바꾼 경우에 얻어지는 광 강도를 측정해 두고, 상기 측정값에 기초하여 검량선을 작성함으로써, 얻어진 광 강도로부터 검체 시료 중에 포함되는 항원의 농도를 결정할 수 있다.
이하, 본 발명의 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 피검출 물질의 검출의 일례로서, 도 3의 B2에 나타낸 본 발명의 시험편과 형광 표식 불용성 담체 입자를 조합하여 사용하고, 혈청 중의 바이러스 항원을 검출하는 방법에 대하여 설명한다.
멤브레인(b) 상에는, 항바이러스 항원/항바이러스 항체를 라인형으로 고정화한 검출 부위(b')가 존재한다. 콘쥬게이트 패드(c)는, 형광 표식 불용성 담체 입자로서, 항바이러스 항원/항바이러스 항체를 결합시킨 불용성 담체 입자를 함침시켜 건조시키고 있다. 검출하고자 하는 바이러스 항원을 포함하는 검체 시료 액체를 샘플 패드에 수십㎕∼수백㎕ 첨가한다. 검체 시료 액체는 샘플 패드로부터 콘쥬게이트 패드로 흐르고, 콘쥬게이트 패드 내에 건조 함침시킨 불용성 담체 입자를 용해한다. 검체 시료 액체는 불용성 담체 입자를 용해시켜 하류로 흐르고, 이 때, 불용성 담체 입자에 결합시킨 항바이러스 항원/항바이러스 항체와 바이러스 항원이 결합하고, 불용성 담체 입자-바이러스 항원의 복합체를 형성한다. 이 복합체가 멤브레인 상의 검출 부위에 도달하면 바이러스 항원이 검출 부위에 고정화된 항바이러스 항원/항바이러스 항체에 포착되고, 검출 부위에, 항바이러스 항원/항바이러스 항체-바이러스 항원-불용성 담체 입자의 복합체가 형성된다. 나머지 검체 시료 액체는, 검출 부위를 통과하고, 멤브레인 상을 하류로 이동하여, 흡수대에 흡수된다. 불용성 담체 입자의 형광 색소에 여기광을 닿게 하면 형광 색소가 형광을 발한다. 이 때, 멤브레인을 통과한 여기광은 멤브레인 하측에 설치된 광 반사재에서 반사되고, 다시 형광 색소를 여기하여, 형광 강도가 증강된다.
착색 불용성 담체 입자를 사용하는 경우도, 마찬가지로 검출 부위에, 항바이러스 항원/항바이러스 항체-바이러스 항원-불용성 담체 입자의 복합체를 형성시켜, 시험편에 광을 조사하면 된다.
본 발명은, 또한 본 발명의 면역크로마토그래피 시험편 또는 면역크로마토그래피 디바이스를 포함하는 면역크로마토그래피 키트도 포함한다.
[실시예]
본 발명을 이하의 실시예에 따라서 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예의 기재에 있어서, %는 중량%를 나타낸다.
실시예 1 : 면역크로마토그래피 시험편 하부에 설치한 금속(알루미늄)박에 의한 형광 폴리스티렌 입자로부터 발해지는 검출광의 증강
1. 프로테인 A 컬럼을 사용한 친화 크로마토그래피법(affinity chromatography)에 의해 정제된 마우스 IgG를, 1.0mg/mL로 되도록 정제수로 희석하고, 여기에 유로피움(EU3+) 킬레이트를 포함하는 형광 폴리스티렌 입자(Thermo scientific 사제: 제품명;FluoroMax)를 0.1%가 되도록 더하여, 교반한 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 더하여, 더 교반한다. 원심 조작에 의해 상청을 제거하고, 50 mM Tris(pH9.0), 3%BSA에 다시 부유시켜, 마우스 유래 항체 표식 형광 폴리스티렌 입자를 얻었다.
2. 항마우스 IgG 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화
항마우스 IgG 항체를 1.0mg/mL이 되도록 정제수로 희석한 액을 PET 필름으로 라이닝(lining)된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 소정의 부위에 선형으로 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켜, 항체 고정화 멤브레인을 얻었다(이하, 항체 고정화 멤브레인으로 함).
3. 면역크로마토그래피법에 의한 표식 입자의 고정 부위에서의 집적
2.에서 얻은 항체 고정화 멤브레인과 백킹 시트, 흡수대, 콘쥬게이트 패드, 샘플 패드를 부착하여 시험편으로 한, 광 반사재를 포함하지 않는 것을 종래 시험편으로 하였다(도 4의 A). 또한, 항체 고정화 멤브레인의 아래와 백킹 시트의 위에 알루미늄 호일 금속박을 광 반사재로서 협지하여 붙여 시험편으로 한, 광 반사재를 포함하는 것을 본 발명법 시험편으로 하였다(도 4의 B).
검체 부유액(10mM Tris(pH7.0), 3%BSA, 0.2%Triton X-100)을 시험편의 샘플 패드에 50㎕ 적하하였다. 15분간 정치 후, UV 트랜스일루미네이터(Benchtop 2UV transilluminator; UVP사제) 상에서, 형광을 육안에 의해 확인하였다.
그 결과, 항체가 고정화된 부위 상에 형광 폴리스티렌 입자의 집적을 확인할 수 있었다. 그 발하는 광의 강도는, 육안으로 종래 시험편에 비해 본 발명법 시험편에서 분명하게 증가하고 있음을 확인할 수 있었다(도 5).
이상의 결과로부터, 본 방법을 이용하여 작성한 시험편을 사용함으로써 검출광의 증강이 가능해진다. 본 실시예에서는 형광을 육안으로 판정하고 있지만, 장치를 사용하여 검출함으로써 보다 고감도로 검출할 수 있다고 생각된다.
실시예 2 : 면역크로마토그래피 시험편 하부에 설치한 각종 금속박에 의한 형광 폴리스티렌 입자로부터 발해지는 검출광의 증강
1. 프로테인 A 컬럼을 사용한 친화 크로마토그래피법에 의해 정제된 마우스 IgG를, 1.0mg/mL이 되도록 정제수로 희석하고, 여기에 유로피움 킬레이트를 포함하는 형광 폴리스티렌 입자를 0.1%가 되도록 더하여, 교반한 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 더하여, 더 교반한다. 원심 조작에 의해 상청을 제거하고, 50 mM Tris(pH9.0), 3%BSA에 다시 부유시켜, 마우스 유래 항체 표식 형광 폴리스티렌 입자를 얻었다.
2. 항마우스 IgG 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화
항마우스 IgG 항체를 1.0mg/mL가 되도록 정제수로 희석한 액을 PET 필름으로 라이닝된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 소정의 부위에 선형으로 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켜, 항체 고정화 멤브레인을 얻었다(이하, 항체 고정화 멤브레인이라 함).
3. 면역크로마토그래피법에 의한 형광 폴리스티렌 입자의 고정화 부위에서의 집적
2.에서 얻은 항체 고정화 멤브레인과 백킹 시트, 흡수대, 콘쥬게이트 패드, 샘플 패드를 부착하여 시험편으로 한, 광 반사재를 포함하지 않는 것을 종래 시험편(도 6의 A)으로 하였다. 또한, 항체 고정화 멤브레인의 아래와 백킹 시트의 위에 광 반사재로서 금속(알루미늄, 구리, 스테인레스)박을 협지하여 붙여 시험편으로 한, 광 반사재를 포함하는 것을 본 발명법 시험편으로 하였다(도 6의 B).
검체 부유액(10 mM Tris(pH7.0), 3%BSA, 0.2%Triton X-100)을 시험편의 샘플 패드에 50㎕ 적하하였다. 15분간 정치 후, 시험편의 항체 고정 부위를, 도 6의 사각으로 둘러싼 부위(h)를 절단하고, 형광 플레이트 리더(MTP-650 FA MICROPLATE READER; CORONA사제)로 조사광(365㎚)을 조사하고, 형광 폴리스티렌 입자로부터 발해진 검출광(615㎚)의 강도를 측정하였다.
그 결과, 발해진 형광의 강도는, 종래 시험편에 비해 알루미늄박을 사용함으로써 명확하게 증강하고 있고, 구리, 스테인레스박에 있어서도 증강이 보여졌다. 3자를 비교하면 검출광의 증강의 정도는 알루미늄박이 가장 현저했다(도 7).
광 반사재 고유의 파장마다 반사율이 존재한다(도 2). 본 실시예에 있어서 사용한 알루미늄은 365㎚의 조사광을 약 90%로 효율적으로 반사하는 반면, 구리는 365㎚의 조사광의 반사율이 40% 이하이다.
본 실시예에 있어서 알루미늄이 구리에 비해 검출광의 증강의 정도가 큰 것은, 광 반사재가 가지는 조사광에 대한 반사 효율이 본 방법에 있어서 중요함을 나타내고 있다.
본 실시예에 있어서는 365㎚를 조사광으로서 이용하고 있지만, 조사광의 파장은 365㎚로 한정되는 것은 아니다. 600㎚를 조사광으로서 이용하는 경우에는, 구리는 알루미늄과 동등하게 약 90%로 효율적으로 반사되고, 600㎚의 조사광에 대하여 구리는 광 반사재로서 효과적이라고 할 수 있다. 570㎚에서 여기되어 600㎚의 형광을 발하는 입자를 사용하여, 조사광 490㎚를 조사하고 615㎚의 형광을 검출했을 때, 구리는 알루미늄과 동등하게 검출광을 증강시키고 있었다(도 8).
이용하는 조사광의 파장을 불문하고, 그 파장을 효율적으로 반사하는 소재를 선택하는 것이 중요하다.
실시예 3 : 착색 폴리스티렌 입자를 사용한 경우의 면역크로마토그래피 시험편 하부에 설치한 광 반사재에 의한 검출광의 증강
1. 프로테인 A 컬럼을 사용한 친화 크로마토그래피법에 의해 정제된 마우스 IgG를, 1.0mg/mL가 되도록 정제수로 희석하고, 여기에 적색으로 착색된 폴리스티렌 입자를 0.1%가 되도록 더하여, 교반한 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 더하고, 더 교반한다. 원심 조작에 의해 상청을 제거하고, 50 mM Tris(pH9.0), 3%BSA에 다시 부유시켜, 마우스 유래 항체 표식 착색 폴리스티렌 입자를 얻었다.
2. 항마우스 IgG 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인로의 고정화
항마우스 IgG 항체를 1.0mg/mL로 되도록 정제수로 희석한 액을 PET 필름으로 라이닝된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 소정의 위치에 선형으로 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켜, 항체 고정화 멤브레인을 얻었다(이하, 항체 고정화 멤브레인으로 함).
3. 면역크로마토그래피법에 의한 착색 폴리스티렌 입자의 고정화 부위에서의 집적
2.에서 얻은 항체 고정화 멤브레인과 백킹 시트, 흡수대, 콘쥬게이트 패드, 샘플 패드를 부착하여 시험편으로 한, 광 반사재를 포함하지 않는 것을 종래 시험편(도 4의 A)으로 하였다. 또한, 항체를 고정화한 멤브레인의 아래와 백킹 시트의 위에 광 반사재를 멤브레인과 협지하여 붙여 시험편으로 한, 광 반사재를 포함하는 것을 본 발명법 시험편으로 하였다(도 4의 B).
검체 부유액(10 mM Tris(pH7.0), 3%BSA, 0.2%Triton X-100)을 시험편의 샘플 패드에 50㎕ 적하하였다. 15분간 정치 후, 시험편의 항체 고정화 부위 및 그 주위 부위에, 면역크로마토그래피 전용 리더를 사용하여, 조사광(녹색 LED)을 조사하고 시험편 및 착색 폴리스티렌 입자에 의해 반사된 검출광의 강도를 측정하였다.
도 9(a)에, 면역크로마토그래피 시험편 상의 위치와 그 위치에서의 반사광의 강도의 관계를 나타낸다. 도 9(a)에는 종래법 시험편의 결과와 본 발명법 시험편의 결과를 나타내고 있다. 중앙의 반사광 강도가 낮은 부위(위치 201∼251 부근)는 착색 폴리스티렌 입자가 집적된 부위를 나타낸다. 또한, 도 9(b)는 도 9(a)의 그래프 중, 반사광이 착색 폴리스티렌 입자의 영향으로 감쇠하고, 반사광 강도가 저하되고 있는 부위의 피크 면적을 나타낸 도면이다. 도 9(a)에 나타낸 바와 같이, 착색 폴리스티렌 입자가 집적한 부위 이외의 주위의 부위에서 발해진 반사광의 강도는, 종래 시험편에 비해 본 발명법을 이용한 경우에 명확하게 증강하고 있다. 또한, 도 9(b)에 나타낸 바와 같이, 반사광이 착색 폴리스티렌 입자의 영향으로 감쇠하고, 반사광 강도가 저하되고 있는 부위의 피크 면적은 본 발명법으로 종래법보다 높아지고 있다. 이 결과는, 착색 폴리스티렌 입자에 의해 조사한 광의 반사광의 감쇠가 보다 명확하게 검출되는 것을 나타낸다.
a: 흡수대
b: 멤브레인
b': 검출 부위
c: 콘쥬게이트 패드
d: 샘플 패드
e: 백킹 시트
f: 반사재
g: 백킹 시트
h: 절단 부위

Claims (21)

  1. 피검출 물질에 결합하는 리간드인 포착 물질을 고정화한 멤브레인을 포함하고, 피검출 물질에 결합하는 리간드를 결합시킨 불용성 담체 입자를 사용하고, 상기 불용성 담체 입자를 멤브레인 상에 고정화한 포착 물질에 포착시킴으로써 집적시키고, 멤브레인에 광을 조사하여, 상기 불용성 담체 입자가 집적된 부위 또는 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에서 발하는 광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하는 면역크로마토그래피 시험편으로서,
    상기 불용성 담체 입자가 착색 불용성 담체 입자이며, 조사광을 조사하고 상기 불용성 담체 입자가 집적된 부위 및 불용성 담체 입자가 집적된 부위 이외의 주위의 부위에 있어서 반사되는 반사광을 검출함으로써 피검출 물질을 측정하고,
    광 반사재로 되어 있는 저장 용기에 수납되어 있으며, 상기 광 반사재에 의해 멤브레인의 광이 조사되는 측과는 반대측에 광이 반사되는,
    면역크로마토그래피 시험편.
  2. 제1항에 있어서,
    조사광의 전체 반사율이 85% 이상의 상기 광 반사재를 사용하는, 면역크로마토그래피 시험편.
  3. 제1항에 있어서,
    시료 첨가 부위, 흡수대 및 표식 부위를 더 가지고 있는, 면역크로마토그래피 시험편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 광 반사재가 금속으로 만들어진 반사재인, 면역크로마토그래피 시험편.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 금속이 알루미늄 또는 구리인, 면역크로마토그래피 시험편.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 금속이 알루미늄인 경우는 250㎚∼1000㎚의 조사광을 이용하고, 구리인 경우는 600㎚∼1000㎚의 조사광을 이용하는, 면역크로마토그래피 시험편.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 광 반사재는, 반사한 조사광을 상기 면역크로마토그래피 시험편의 검출 부위 부근에 모으는 구조를 가지고 있는, 면역크로마토그래피 시험편.
  8. 제1항에 있어서,
    피검출 물질과 피검출 물질에 결합하는 리간드가 항원과 항체이거나, 또는 항체와 항원인, 면역크로마토그래피 시험편.
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  21. 삭제
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