KR102212997B1 - 우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 nlrp3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 nlrp3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.

Description

우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating of chronic inflammation diseases caused by excessive NLRP3 inflammasome activation comprising burdock extract}
본 발명은 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증(inflammation) 반응은 생리학적 숙주 방어의 중요한 구성요소로서, 생체에 있어서 물리적, 기계적, 화학적 및 생물학적 자극 등의 해로운 자극에 대한 방어 반응으로, 자극이 가해지고 난 후 회복과정까지의 모든 경과를 가리킨다. 다시 말해서, 염증은 개체의 면역계가 침입 병원균과 같은 유해 성분에 대응하고자 할 때, 발생한다.
면역조절 세포, 사이토카인, 세포자살(apoptosis) 등이 관여하는 면역조절 기작이 유해 성분을 막기 위한 과도한 반응으로 발생하는 면역 반응을 조절한다. 이러한 조절 매커니즘이 결핍될 경우, 부적절한 염증 반응은 자가면역 질환, 천식, 동맥경화, 당뇨병, 알츠하이머 질환 등과 같은 광범위한 질병을 유발한다. 따라서, 염증 반응을 조절하여 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 항염증 조성물에 대한 연구가 요구되고 있는 상황이다.
인플라마좀(inflammasome) 복합체는 다양한 세포질 병원체 또는 위험요소-관련 분자 패턴의 감지에 따라 만들어지고 활성화된다(Schroder K et al., Cell, 140:821-832, 2010; Franchi L et al., Nat Immunol, 13:325-332, 2012). 인플라마좀 복합체의 형성은 IL-1β 및 IL-18와 같은 염증성(proinflammatory) 사이토카인의 성숙 및 분비를 유도하는 카스파제-1의 활성화를 유도한다(Schroder K et al., Cell, 140:821-832, 2010).
미생물 감염 또는 조직 손상 부위에 인플라마좀 신호가 숙주 항상성을 유지하기 위하여 사이토카인을 분비함으로써 국소염증반응을 개시한다. 그러나, 최근 인플라마좀이 죽상동맥경화증, 비만 및 유형 Ⅱ 당뇨병을 포함하는 많은 대사성 질환의 병인기전에 중요한 역할을 하고 있음이 보고되었다(Henao-Mejia J et al., Annu Rev Physiol, 76:57-78, 2014; Wen H et al., Nat Immunol, 13:352-357, 2012). 이러한 측면에서, 인플라마좀 신호의 활성화는 숙주 방어에 필요하지만 과도한 활성은 만성적인 염증질환을 유도하므로 적절히 조절되어야 한다.
밝혀진 인플라마좀 구성요소 중에서 NOD-유사 수용체 족(family)인, 피린 도메인-함유 3(NOD-like receptor family, pyrin domaincontaining 3; NLRP3)는 주요한 관심 기술분야인데, 이는 만성적인 염증 질환에서 잠재적인 원인이기 때문이다(Wen H et al., Nat Immunol, 13:352-357, 2012).
실제로, NLRP3결손 마우스는 죽상동맥경화증 및 유형 Ⅱ 당뇨병의 진행을 눈에 띄게 감소시킨다는 것이 밝혀졌다(Duewell P et al., Nature, 464:1357-1361, 2010; Vandanmagsar B et al., Nat Med, 17:179-188, 2011). 게다가, 콜레스테롤 결정, 포화지방산, 요산 결정 및 아밀로이드 β와 같은, 만성적인 대사 질환을 유도하는 많은 자극제들이 골수-유래 대식세포(BMMs) 내에서 NLRP3 인플라마좀을 활성화시키는 것으로 나타났다(Duewell P et al., Nature, 464:1357-1361, 2010; Wen H et al., Nat Immunol, 12:408-415, 2011; Martinon F et al., Nature, 440:237-241, 2006; Halle A et al., Nat Immunol, 9:857-865, 2008).
최근 NLRP3 인플라마좀의 생리학적 중요성이 알려지고 있음에도 불구하고, 다양한 자극에 대한 반응으로 NLRP3가 활성화되고 조절되는 분자적 메커니즘은 아직도 잘 알려져 있지 않다. 특히, 숙주의 면역 항상성을 유지하는데 필수적일 수 있는, NLRP3 인플라마좀의 숙주 내재적인 억제 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다.
대식세포는 IL-1β 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 분비를 통한 염증 반응을 유발하는데 중요한 역할을 한다. 흥미롭게도, 대식세포는 주변의 사이토카인 상황(context)에 따라 고전적으로 활성화된 대식세포(M1) 및 대체적으로 활성화된 대식세포(M2)로 분극화된다(Martinez FO et al., Annu Rev Immunol, 27:451-483, 2009).
Th1 사이토카인인 IFN-γ는 M1 대식세포 분극화를 촉진하여, 항균 및 염증반응을 강화시키고, Th2 사이토카인인 IL-4는 M2 대식세포 분극화를 유도하여 기생충 면역, 알레르기 반응 및 조직 복구 기능을 촉진한다(Martinez FO et al., Annu Rev Immunol, 27:451-483, 2009; Van Dyken SJ et al., Annu Rev Immunol, 31:317-343, 2013). 또한, IL-4 처리는 LPS 자극에 의한 대식세포 내 염증성 사이토카인의 생산을 감소시키는데(Te Velde AA et al., Blood, 76:1392-1397, 1990; Vannier E et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89:4076-4080, 1992), 이는 M2 분극화를 포함하는 유형 2 면역 반응이 대사 항상성을 유지하기 위하여 과도한 염증을 억제할 수 있다는 것을 암시한다. 잠재적인 항-염증 기능에 더하여, IL-4는 유형 Ⅱ 당뇨병 및 알츠하이머 질환과 같은, 대사성 질환의 발병을 약화시키는 것으로 알려져 있다(O'Connor JC et al., J Immunol, 178:6886-6893, 2007; Kiyota T et al., FASEB J, 24:3093-3102, 2010). 그러나, 염증성 유전자의 전사억제에 대한 역할을 제외하고 IL-4의 항-염증 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다.
이에, NLRP3 인플라마좀의 활성을 억제하여 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의해 발생되는 만성 염증질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 천연물질이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제1805601호 대한민국 등록특허 제1878830호
본 발명의 목적은 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome)의 과활성에 의한 만성 염증질환의 예방 또는 치료용 항염증 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome)의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 예방 또는 치료용 항염증 약학 조성물은 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 우엉의 지상부는 우엉의 잎과 줄기가 1 : 1 내지 3의 중량비로 혼합된 혼합물일 수 있다.
상기 추출물은 탄소수 1 내지 5의 저급알코올 또는 물과 탄소수 1 내지 5의 저급알코올의 혼합용매로 추출될 수 있다.
상기 혼합용매는 60 내지 90 부피%의 메탄올 또는 에탄올 수용액이며, 상기 탄소수 1 내지 5의 저급알코올은 에탄올일 수 있다.
상기 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환은 동맥경화, 2형 당뇨 또는 퇴행성 뇌질환일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물은 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 대식세포에서 유도된 NLRP3 인플라마좀의 과활성화에 의한 IL-1β의 분비를 억제시키는 등 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환에 대한 개선, 예방 또는 치료 효과가 매우 뛰어나 경쟁력 있는 식품 조성물 및 의약 조성물의 제조에 효과적이다.
또한, 본 발명의 조성물은 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용된 우엉의 잎, 줄기 및 뿌리를 촬영한 사진이다.
도 2는 LPS로 자극 후 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 추출물로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 우엉 잎과 줄기의 혼합 메탄올 추출물로 처리시의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 LPS로 자극 후 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 추출물, zVAD 및 ATP로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이며, 도 4b는 LPS로 자극 후 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 추출물, zVAD 및 니게리신(Nig)으로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이고, 도 4c는 LPS로 자극 후 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 추출물, zVAD 및 실리카 결정(silica)으로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이다.
도 5a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 ATP로 처리 시 세포사멸을 나타낸 그래프이며, 도 5b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 니게리신(Nig)으로 처리 시 TNF-α 농도를 측정한 그래프이다.
도 6a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 ATP 처리로 나타낸 면역블롯이며, 도 6b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 니게리신(Nig) 처리로 나타낸 면역블롯이고, 도 6c는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 실리카 결정(silica) 처리로 나타낸 면역블롯이다.
도 7a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 플라젤린(Fla)로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이며, 도 7b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 폴리(dA : dT)로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이다.
도 8a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물로 처리 시 혈장 내 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이며, 도 8b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물로 처리 시 TNF-α 농도를 측정한 그래프이다.
도 9a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물을 이용 시 ASC를 면역블롯으로 분석한 것이며, 도 9b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물을 이용 시 ASC 올리고머화를 면역블롯으로 분석한 것이고, 도 9c는 LPS와 니게리신(Nig)으로 자극 시 ASC 입자를 나타낸 도면이며, 도 9d는 상기 도 9c의 ASC 입자를 갖는 세포를 정량화한 그래프이다.
도 10a는 니게리신(nig) 및 H89의 존재 또는 부재하에서 실시예 4의 추출물 또는 포스콜린으로 처리된 LPS 처리 BMDM의 배양 상등액의 IL-1β 및 카스파제-1을 면역 블롯으로 분석한 것이며, 도 10b는 LPS 처리된 BMDM 글루타티온(GSH)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 배양 상등액을 면역 블롯으로 분석한 것이고, 도 10c는 LPS 처리된 BMDM L-시스테인(L-cys)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 배양 상등액을 면역 블롯으로 분석한 것이며, 도 10d는 LPS 처리된 BMDM L-시스테인(L-cys)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 가교 결합된 용해물을 면역 블롯으로 분석한 것이고, 도 10e는 LPS 처리된 BMDM 글루타티온(GSH)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 가교 결합된 용해물을 면역 블롯으로 분석한 것이다.
도 11a는 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 추출물의 존재 또는 부재하에서 NLRP3의 ATPase 활성을 ADP-Glo 분석을 사용하여 발광에 의해 측정한 그래프이며, 도 11b는 실시예 4 추출물로 처리 후 LPS로 지시된 세포 용해물 중 phospho-IκB-α와 IκB-α를 면역 블롯으로 분석한 것이고, 도 11c는 실시예 4 추출물의 존재 또는 부재하에서 니게리신으로 처리된 BMDM에서의 미토콘드리아 ROS의 수준을 MitoSOX 라벨링으로 분석한 유동 혈구 계측 그래프이며, 도 11d는 실시예 4 추출물의 존재 또는 부재하에서 니게리신으로 처리된 BMDM에서의 미토콘드리아 ROS의 수준을 MitoSOX 라벨링으로 분석한 평균 형광 강도의 정량 분석 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 혼합 추출물을 HPLC으로 측정한 그래프이다.
본 발명은 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유하는 NLRP3 인플라마좀(inflammasome)의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유한다.
상기 우엉(Arctium lappa)은 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 두해살이풀로서 뿌리채소이다. 상기 우엉은 주로 뿌리를 이뇨제, 발한제, 인후통과 독충(毒蟲)의 해독제로 사용된다.
이러한 우엉은 도 1에 도시된 바와 같이, 잎, 줄기 및 잎으로 나뉘며, 구체적으로 곧은 뿌리가 30 내지 60 cm 자라고 뿌리 끝에서 줄기가 나오며, 상기 뿌리에 잎이 무더기로 나오는 형태로 성장한다. 일반적으로 시중에서 판매되는 우엉은 뿌리로서 장아찌, 조림, 차 등으로 섭취된다.
상기 우엉의 잎 또는 우엉의 지상부는 각각 추출용매와 1 : 10 내지 25, 바람직하게는 1 : 20의 중량비로 혼합하여 40 내지 50 ℃에서 40 내지 48시간 동안 추출한 후 감압농축을 수행하여 추출물을 제조한다. 상기 우엉의 잎 또는 우엉의 지상부와 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 우엉의 잎 또는 우엉의 지상부의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
추출온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 우엉의 잎 또는 우엉의 지상부의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 독성물질이 발생할 수 있다.
상기 각 추출물을 추출하는 추출용매는 탄소수 1 내지 5의 저급알코올 또는 물과 탄소수 1 내지 5의 저급알코올의 혼합용매이다. 상기 혼합용매로는 60 내지 90 부피%의 메탄올 또는 에탄올 수용액을 들 수 있다.
상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 100 부피%의 에탄올 또는 메탄올로 추출된 추출물이 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료에 바람직하게 작용한다. 추출용매가 물인 경우에는 다른 용매를 사용한 경우보다 가장 낮은 효과를 보인다.
본 발명의 우엉의 지상부는 우엉의 잎과 줄기가 혼합된 혼합물로서, 상기 우엉의 잎과 줄기의 혼합물은 잎과 줄기를 1 : 1 내지 3의 중량비, 바람직하게는 1 : 1 내지 1.5의 중량비로 혼합한다. 잎을 기준으로 줄기의 함량이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 잎을 단독으로 사용하는 경우보다 5배 이상 효과가 저하될 수 있다.
본 발명의 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환으로는 동맥경화, 2형 당뇨 또는 퇴행성 뇌질환을 들 수 있다.
본 명세서에서 우엉의 잎 또는 우엉의 지상부를 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 우엉 잎 추출물 또는 우엉 지상부 추출물은 광의로는 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 우엉 잎 또는 우엉의 지상부 가공물, 예컨대, 우엉 잎 또는 우엉 지상부의 혼합 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 우엉의 잎 또는 우엉의 지상부로 실험을 진행하긴 하였으나, 우엉의 잎 또는 우엉의 지상부 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 함유하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효성분으로 포함하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물은 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 투여하는 것을 포함하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 목단피, 백복령, 택사 및 단삼의 혼합 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 우엉 잎 추출물 또는 우엉의 지상부 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 우엉 잎 추출물_에탄올 추출
우엉 잎과 100 부피% 에탄올을 1 : 20의 중량비로 혼합하여 45 ℃에서 48시간 동안 추출하여 우엉 잎 에탄올 추출물을 수득하였다. 상기 수득된 추출물은 여과 및 감압 농축을 거쳐 동결건조로 분말화하여 이용하였다.
실시예 2. 우엉 잎 추출물_메탄올 추출
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 에탄올 대신 100 부피% 메탄올을 이용하여 우엉 잎 메탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 3. 우엉 잎과 줄기의 혼합 추출물_에탄올 추출
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 우엉의 잎 대신 우엉의 잎과 줄기를 1 : 1의 중량비로 혼합하여 우엉 잎과 줄기의 혼합 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 4. 우엉 잎과 줄기의 혼합 추출물_메탄올 추출
상기 실시예 3과 동일하게 실시하되, 에탄올 대신 100 부피% 메탄올을 이용하여 우엉 잎과 줄기의 혼합 메탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 5. 우엉 줄기 추출물_에탄올 추출
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 우엉의 잎 대신 우엉의 줄기를 이용하여 우엉 줄기 에탄올 추출물을 수득하였다.
실시예 6. 우엉 줄기 추출물_메탄올 추출
상기 실시예 5와 동일하게 실시하되, 에탄올 대신 100 부피% 메탄올을 이용하여 우엉 줄기 메탄올 추출물을 수득하였다.
비교예 1. 우엉 뿌리 추출물_에탄올 추출
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 우엉의 잎 대신 우엉의 뿌리를 이용하여 우엉 뿌리 에탄올 추출물을 수득하였다.
비교예 2. 우엉 뿌리 추출물_메탄올 추출
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 에탄올 대신 100 부피% 메탄올을 이용하여 우엉 뿌리 메탄올 추출물을 수득하였다.
<시험예>
시험예 1. 우엉의 부위 및 용매에 따른 인플라마좀 억제활성 측정
LPS로 미리 자극한 마우스 대식세포 세포주(mouse macrophage cell line, J774A)에 상기 실시예 및 비교예에 따라 제조된 각 시료를 30분간 전처리하고 ATP 를 처리하여 인플라마좀 활성화를 유도하였고, 15분후에 세포배양액을 취하여 분비된 IL-1β의 농도를 측정하였다.
도 2는 LPS로 자극 후 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조된 추출물로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에 따라 제조된 우엉 잎 추출물 및 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제조된 우엉 잎과 줄기의 혼합 추출물은 용매에 상관없이 농도가 20 pg/ml 이상이면 NLRP3 인플라마좀 활성에 의해 유도된 IL-1β의 방출을 우수한 수준으로 억제하는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1의 우엉 잎 에탄올 추출물 및 실시예 4의 우엉 잎과 줄기의 혼합 메탄올 추출물이 다른 군에 비하여 더욱 우수한 IL-1β의 방출 억제 효과를 보였으며, 더욱이 실시예 1의 우엉 잎 에탄올 추출물이 다른 군에 비하여 가장 우수한 IL-1β 방출 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다.
반면, 실시예 5, 실시예 6, 비교예 1 및 비교예 2의 추출물은 IL-1β 방출을 억제하는 능력이 우수하지 못한 것을 확인하였다.
하기 실험부터는 실시예 4의 추출물을 이용하여 시험을 수행하였다.
마우스 처리 방법
C57BL/6 마우스(7 주령, OriGent Bio, 성남, 한국)은 표준조건(온도 22±2 ℃, 습도 55±5%, 12시간의 명암주기) 하에서 음식과 증류수를 공급하여 임의로 5 그룹으로 나누었다. 모든 실험은 건국 대학교 동물 관리위원회(허가 번호 : KU17050)의 지침에 따라 수행되었다.
실험을 수행하기 전에 동물을 실험실 환경에 5-7일간 적응시켰다. LPS로 유발된 전신 인플라마좀 실험에서, 마우스에 LPS(20 mg/kg)를 주사하기 2시간 및 12시간 전에 20 또는 40 mg/kg 실시예 4의 추출물 또는 증류수(대조군)를 복강내 투여하고, LPS 시험 2시간 후에 혈액 샘플을 채취하였다.
C57BL/6 마우스의 골수 세포를 무균 PBS로 대퇴골 및 경골을 플러싱하여 수득하였다. 이들 세포를 10% 소태아혈청(FBS), 30% L929 세포 조건 배지(LCM), 100 μM 2-머캅토에탄올, 100 unit/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 배양 3일째 동일한 배양 배지를 첨가하고 6일째에 배양 배지의 50%를 새로운 배지로 교체하였다. 7일째, 비부착성 세포를 제거하고 부착세포를 분리한 후 6-웰 플레이트에 1x106 세포의 밀도로 접종하였다. 특별한 언급이 없는 한, 인플라마좀의 활성화는 LPS(100 ng/mL)로 3시간 동안 자극한 다음, 배지를 Opti-MEM으로 대체하고 세포를 실시예 4의 추출물 또는 억제제인 zVAD 또는 KCl(150 mM)으로 30분 동안 예비 배양하여 수행하였다.
그 후 세포를 ATP(5 mM) 및 니게리신(10 μM)으로 1시간 및 실리카 결정(150 ㎍/ml)으로 3시간 동안 자극하였다; 플라젤린(1.5 μg/ml) 또는 폴리(dA:dT)(2 μg/ml)를 각각 3 시간 또는 1 시간 동안 형질 감염시켰다.
시약
IL-1β 및 TNF-α ELISA 키트는 eBioscience(San Diego, CA, USA) 또는 R & D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
Silica crystals(nano-SiO2), 니게리신(nigericin), poly(dA:dT), 플라젤린(flagellin) 및 carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketone(zVAD-FMK)은 InvivoGen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, LPS(0111 : B4), ATP, L-시스테인, 글루타티온 및 포르스콜린은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입 하였다.
H89는 Alexis Biochemicals(SanDiego, CA, USA)에서 구입하였으며, Lipofectamine 2000과 disuccinimidyl suberate(DSS)는 Thermo Fisher Scientific(Rockford, IL, USA)에서 구입하였고, G5는 EMD Millipore(Bedford, MA, USA)로부터 구입하였다.
젖산 탈수소효소(LDH) 검출 키트는 Dogen EINNOTEC(Dae Jeon, Korea)에서 구입하였으며, MCC950은 AdipoGen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
다음 항체를 웨스턴 블롯에 사용하였다: 항 IL-1β(AF-401-NA, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA); NLRP3 (Cryo-2), ASC (AL-177), and caspase-1 (AG-20B-0042-C100)는 AdipoGen(San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였으며; ASC (N-15), caspase-1 (SC-514), 및 β-actin은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)로부터 구입하였다.
ELISA
사이토카인(IL-1β 및 TNF-α)의 측정은 제조사의 지시에 따라 ELISA 키트(eBioscience 또는 R & D Systems)를 사용하여 측정하였다. 생성된 색상을 분광 광도계 마이크로 플레이트 판독기(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
면역 블롯
면역 블롯은 표준 시스템을 사용하여 수행하였다. 단백질 용해물은 RIPA 완충액 [50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1% Nonidet P-40, 150 mM 염화나트륨, 0.5% 염화데옥시콜레이트, 0.1% 황산도데실나트륨(SDS) 및 프로테아제 억제제 칵테일] 또는 Triton X-100 용해 완충액 [50mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 150 mM 염화나트륨 및 프로테아제 억제 칵테일]을 첨가하여 SDS-PAGE로 처리하고, 니트로 룰로스 막에 흡착시킨 후, 순차적으로 1차 항체 및 겨자무과산화효소-(HRP-)가 결합된 항체로 조사한다. 강화된 화학발광검출키트(Thermo Fisher Scientific)는 Luminescent Image Analyzer(LAS-3000, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 2차 항체를 시각화하는데 사용되었다.
ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) 올리고머화 분석
Triton X-100 불용성 분획의 단리 및 DSS를 사용한 화학적 가교는 일부 변형을 가하여 수행하였다. 세포를 용해 완충액 A[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 % Triton X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일]를 사용하여 얼음에서 20분 동안 용해시켰다. 원심분리(600 Xg, 4 ℃, 15분)에 의해 제조된 용해물 및 침전된 펠릿을 각각 Triton X-100 가용성 분획 및 Tritoninsoluble 분획하였다.
ASC 올리고머화 분석을 위해, Triton X-100 불용성 침전물을 차가운 PBS로 2회 세척하고 실온에서 30분 동안 2 mM DSS/PBS로 가교결합시켰다. 펠릿을 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 수득하고, 추가 웨스턴 블롯 분석을 위해 SDS 샘플 완충액에 용해시켰다.
ASC 입자 형성물의 평가
세포(3X105 cells/well)를 12-웰 플레이트에서 커버슬립 상에 씨딩하고 지시된 자극으로 자극하였다. 이어서 세포를 차가운 PBS로 세척하고 4 ℃에서 20분 동안 4%(v/v) 파라포름알데히드로 고정시킨 다음 PBS로 세척한 후 -20 ℃에서 10분 동안 아세톤으로 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 실온에서 1시간 동안 Tween 20(PBST)을 함유한 PBS로 10%(v/v) 말 혈청을 블로킹한 후, 토끼 항-ASC(1 : 200) 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 세포를 PBST로 세척하고 어두운 곳에서 실온으로 1시간 동안 Cy3-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG(1 : 300)로 배양한 다음, 세포핵을 DAPI(1 : 50000)로 염색하였다.
NLRP3의 ATPase 활성 측정
NLRP3의 ATPase 활성은 인간 재조합 NLRP3(BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)을 반응 완충액으로 37 ℃에서 20분 동안 DMSO 또는 실시예 4의 추출물과 함께 예비 배양하였다. 반응 완충액은 20 mM Tris-HCl pH 7.8, 133 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 3 mM KCl 및 0.56 mM EDTA를 함유한 후 ultra-pure-ATP(250 μM)를 첨가하고 혼합물을 37 ℃에서 40분간 더 배양했다. NLRP3에 의한 ATP의 가수분해는 제조자의 지시에 따라 ADP-Glo Kinase Assay(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 ADP를 측정하여 결정하였다.
미토콘드리아 반응 산소 종(mROS)의 측정
mROS 수준은 MitoSOX(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 세포를 염색함으로써 결정되었다. 세포를 37 ℃에서 30분 동안 2.5 μM MitoSOX와 함께 배양하고, 미리 가온된 PBS 용액으로 세척하고, FACS 분석을 위해 2% FBS 및 Topro-3(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)을 함유하는 차가운 PBS에 재현탁 하였다.
고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석
실시예 4의 추출물을 80% 메탄올에 용해시키고 3,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 측정용 분석시료로 사용하였다.
실시예 4 추출물의 성분은 Prominence LC-20A (Shimadzu, Kyoto, Japan)로 측정하였다. HPLC 시스템에는 CMA-20A 통신버스모듈, LC 20AD 액체크로마토그래피, SPD-M20A 다이오드어레이 검출기, SIL-20AC 자동 샘플러, DGU-20A3 탈기 장치 및 CTO-20AC 컬럼 오븐이 장착되었다. Shim-pack VP-ODS(3 x 75 mm, 2.2 μm, Shimadzu, Japan)를 사용하여 HPLC 분석을 수행 하였으며, 이동상의 유속은 0.15 ml/min이고, 크로마토그램을 330 nm에서 모니터링 하였다. 주입 부피는 10 μL이고, 칼럼 온도는 30 ℃로 유지하였다.
100 % 아세토니트릴(A)과 0.1% 포름산(B)이 포함된 물로 구성된 이동상을 표 1에 표시된 그라디언트 프로그램으로 실행하였으며, LC/MS-IT-TOF는 표 1에 표시된 그래디언트 프로그램으로 실행되었다. LC/MS-IT-TOF는 분무기 가스 유속 1.5 ml/min, 검출기 전압 1.53 kV 및 프로브 전압 450 kV로 작동되었으며, 질량 범위(m/z)는 100-1500 amu이다.
Figure 112018124165192-pat00001
통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 편차(SD) 또는 표준 오차(SEM)로 나타내었다. 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA), GraphPad PRISM5 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 Dunnett의 post hoc 테스트로 평가하였으며, p <0.05의 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
시험예 2. 세포 생존율 측정
골수 유래 대식세포(BMDMs)를 지시된 농도의 실시예 4의 추출물로 6시간 동안 처리한 다음, 37 ℃에서 2시간 동안 MTT 용액(0.5 mg/ml)으로 항온 배양 하였다. 이어서, 불용성 포르마잔을 DMSO(100 ul/well)로 가용화시키고 광학 밀도를 이용하여 550 nm에서 측정하였다. 세포 생존력은 하기 [수학식 1]에 따라 측정하였다.
[수학식 1]
생존 세포(%) = (약물 처리된 시료의 OD/미처리 시료의 OD)X100
도 3은 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 우엉 잎과 줄기의 혼합 메탄올 추출물로 처리시의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3에 도시된 바와 같이, LPS로 자극된 골수 유래 대식세포(BMDMs)에 실시예 4에 따라 제조된 우엉 잎과 줄기의 혼합 메탄올 추출물을 처리시 독성이 없는 것을 확인하였다.
시험예 3. NLRP3 인플라마좀 매개 IL-1β 분비 억제
도 4a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 ATP로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이며, 도 4b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 니게리신(Nig)으로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이고, 도 4c는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 실리카 결정(silica)으로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이다. 상기 zVAD(pan-caspase 억제제)를 카스파제-1(caspase-1) 활성화를 억제하는 양성 대조군으로 사용하였다.
도 4a 내지 4c에 도시된 바와 같이, 2.5 내지 10 μg/ml의 실시예 4의 추출물은 농도 의존적으로 NLRP3 인플라마좀 활성에 의해 유도된 IL-1β의 방출을 억제할 수 있음을 확인하였다.
시험예 4. 세포사멸 및 TNF-α 측정
카스파제-1(caspase-1) 매개 프로그램된 세포사멸은 인플라마좀이 활성되는 동안 일어난다는 것이 보고되었다. 이에, 배양 상등액에서 lactate dehydrogenase(LDH)의 방출을 측정함으로써 인플라마좀 활성이 유도된 세포 사멸에 대한 실시예 4 추출물의 영향을 조사하였다.
도 5a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 ATP로 처리 시 세포사멸을 나타낸 그래프이며, 도 5b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 니게리신(Nig)으로 처리 시 TNF-α 농도를 측정한 그래프이다.
도 5a에 도시된 바와 같이, 예상대로 실시예 4 추출물의 투여는 ATP 유도된 세포사멸을 농도 의존적으로 억제하였다.
또한 도 5b에 도시된 바와 같이, 동일한 조건 하에서 TNF-α의 방출이 실시예 4의 추출물에 의해 억제되지 않았기 때문에 실시예 4의 추출물이 LPS가 유도된 단계보다 인플라마좀의 활성화 단계를 억제할 수 있음을 암시한다.
시험예 5. IL-1β 및 카스파제-1의 활성화 억제 측정
인플라마좀은 카스파제-1을 활성화시키는 다중 단백질 복합체로서 IL-1 계열의 처리와 분비를 유도한다. 따라서, 실시예 4의 추출물에 의한 IL-1β 방출의 억제가 인플라마좀 활성화의 조절에 의해 유발된 것인지를 확인하기 위해, pro-caspase-1 및 pro-IL-1β의 절단에 대한 실시예 4 추출물의 처리로 발생하는 현상을 조사하였다.
도 6a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 ATP 처리로 나타낸 면역블롯이며, 도 6b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 니게리신(Nig) 처리로 나타낸 면역블롯이고, 도 6c는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 실리카 결정(silica) 처리로 나타낸 면역블롯이다.
도 6a 내지 6c에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 4 추출물은 IL-1β 및 카스파제-1의 활성화를 억제하는 것을 확인하였다. 상기 실시예 4의 추출물은 세포 용해물에서 NLRP3, 카스파제-1, pro-IL-1β, β-actin 또는 ASC의 발현에 영향을 미치지 않았다.
시험예 6. 플라젤린 또는 폴리(dA : dT)로 자극 시 IL-1β, 카스파제 방충 영항 및 NLRC4 또는 AIM2 인플라마좀 활성 측정
도 7a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 플라젤린(Fla)로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이며, 도 7b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물, zVAD 및 폴리(dA : dT)로 처리 시 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이다. 또한, 배양 상등액을 면역블롯으로 분석하였다.
실시예 4의 추출물에 의한 인플라마좀의 억제가 NLRP3 인플라마좀에 특이적인지를 조사하기 위해, NLRC4 및 AIM2 인플라마좀 활성화에 대하여 측정하였다. 시토졸(Cytosolic) 박테리아 플라젤린과 dsDNA는 각각 NLRC4와 AIM2 인플라마좀 활성화를 유발할 수 있다. 따라서, 플라젤린 또는 폴리(dA : dT)로 자극 시 BMDM에서 IL-1β 및 카스파제-1 절단의 과정 및 방출에 대한 실시예 4 추출물의 영향을 평가하였다.
도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, 실시예 4의 추출물은 NLRP3 작용 매개된 카스파제-1 및 IL-1β의 방출을 억제하지만, 이와 달리 플라젤린 또는 폴리(dA : dT)로 유도된 경우에는 방출을 억제하지 못하였다. 이는 실시예 4의 추출물이 NLRP3 인플라마좀 활성화의 조절을 통해 IL-1β 및 카스파제-1의 방출을 억제하지만 NLRC4 또는 AIM2 인플라마좀 활성화를 억제하지 않음을 의미한다.
시험예 7. 혈장 내 IL-1β 및 TNF-α 농도 측정
도 8a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물로 처리 시 혈장 내 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이며, 도 8b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물로 처리 시 TNF-α 농도를 측정한 그래프이다. NLRP3 특이적 억제제인 MCC950을 양성 대조군으로 처리하였다.
혈장 내 IL-1β 방출에 대한 실시예 4 추출물의 억제 작용의 in vivo 관련성을 확인하기 위해, 실시예 4 추출물의 처리가 LPS 유도된 마우스 복막 모델에서 혈장 내 IL-1β 농도를 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다.
도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, 실시예 4 추출물의 투여는 혈장에서 IL-1β 농도를 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다. 그러나, 동일한 조건에서 혈장 내 TNF-α의 농도는 실시예 4의 추출물 처리에 의해 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.
시험예 8. NLRP3가 유도된 ASC 전좌(translocation), 올리고머화에 대한 실시예 4 추출물의 억제 효과
본 발명의 실시예 4 추출물은 NLRP3 유도된 ASC 전좌, 올리고머화 및 입자 형성을 억제한다. 인플라마좀 활성화를 억제하는 실시예 4 추출물의 작용 메커니즘을 연구하기 위해 카스파제-1 및 IL-1β 과정의 상류 분자 현상을 분석하였다.
인플라마좀 활성화에 따라, ASC 분자는 세정 불용성 분획에 재분배되고, 올리고머화 및 ASC 입자의 후속 조립을 형성하는 것으로 나타났다. 따라서, 실시예 4의 추출물이 NLRP3 작용제로 자극시 ASC 전좌, 올리고머화 및 입자 형성에 영향을 미치는지, 그리고 칼륨 채널 억제제인 KCl이 인플라마좀 활성화를 억제하는 양성으로 사용되었는지 여부를 조사하였다.
도 9a는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물을 이용 시 ASC를 면역블롯으로 분석한 것이며, 도 9b는 LPS로 자극 후 실시예 4의 추출물을 이용 시 ASC 올리고머화를 면역블롯으로 분석한 것이고, 도 9c는 LPS와 니게리신(Nig)으로 자극 시 ASC 입자를 나타낸 도면이며, 도 9d는 상기 도 9c의 ASC 입자를 갖는 세포를 정량화한 그래프이다.
도 9a 내지 9d에 도시된 바와 같이, 니게리신 처리는 ASC의 재분배와 BMDMs에서의 올리고머화를 유도한다. 실시예 4 추출물의 전처리는 농도 의존적으로 ASC의 세정 불용성 부분 및 그의 올리고머화로의 전이를 농도 의존적으로 유의하게 막았다(도 9a 및 9b).
또한, 실시예 4의 추출물은 니게리신으로 유도된 BMDMs에서 ASC 입자의 형성을 실질적으로 감소시켰다(도 9c 및 9d).
종합적으로, 상기 데이터는 실시예 4의 추출물이 NLRP3 인플라마좀 활성화에 필요한 ASC 재분배, 올리고머화 및 입자 형성의 방지에 의해 NLRP3 인플라마좀을 억제한다는 것을 의미한다.
시험예 9. ATPase 활성 억제 및 미토콘드리아 ROS 생성 억제를 통한 NLRP3 인플라마좀 활성화 억제
본 발명의 실시예 4 추출물은 ATPase 활성 억제 및 미토콘드리아 ROS 생성 억제를 통해 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제한다. 실시예 4의 추출물은 NLRP3 매개 인플라마좀에 대한 저해 활성을 나타내지만, NLRC4 및 AIM2 매개된 인플라마좀에는 억제 활성이 나타내지 않았다.
ASC가 NLRP3 및 AIM2 인플라마좀의 활성화에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에, ASC 올리고머화만으로는 실시예 4의 추출물이 NLRP3 인플라마좀을 어떻게 특이적으로 억제하는지 설명할 수 없다. 실시예 4의 추출물에 의한 NLRP3 인플라마좀의 억제가 NLRP3 자체 또는 NLRP3 활성화와 관련된 상류 또는 하류 분자의 표적화를 통한 것일 수 있다고 가정하였다.
NLRP3 인플라마좀 활성화는 인산화, 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 알킬화와 같은 NLRP3의 번역 후(posttranslational) 조절에 의해 조정될 수 있다고 보고되었다. NLRP3의 인산화와 유비퀴틴화로 유도된 단백질 kinase A- (PKA-)는 NLRP3 인플라마좀 활성화에서 음성 조절 메커니즘으로 확인되었고, PKA 억제제, H89는 NLRP3 유도된 인플라마좀 활성화에 PKA의 억제 효과를 중화시키는 것으로 알려져 있다. 최근 연구들은 NLRP3의 시스테인 변형이 NLRP3 모집 및 ASC 올리고머화의 저해를 통한 인플라마좀 활성화에 대한 억제 효과를 가지고 있음을 보여 주었다. 또한, 과량의 자유 L-시스테인 또는 글루타티온(GSH)은 시스테인 변형에 의한 억제 효과를 방지하였다.
따라서 실시예 4의 추출물이 NLRP3의 변형에 영향을 미치는지 조사하기 위해 실시예 4의 추출물과 결합된 다양한 저해제로 세포를 처리하였다.
도 10a는 니게리신(nig) 및 H89의 존재 또는 부재하에서 실시예 4의 추출물 또는 포스콜린으로 처리된 LPS 처리 BMDM의 배양 상등액의 IL-1β 및 카스파제-1을 면역 블롯으로 분석한 것이며, 도 10b는 LPS 처리된 BMDM 글루타티온(GSH)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 배양 상등액을 면역 블롯으로 분석한 것이고, 도 10c는 LPS 처리된 BMDM L-시스테인(L-cys)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 배양 상등액을 면역 블롯으로 분석한 것이며, 도 10d는 LPS 처리된 BMDM L-시스테인(L-cys)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 가교 결합된 용해물을 면역 블롯으로 분석한 것이고, 도 10e는 LPS 처리된 BMDM 글루타티온(GSH)의 존재 또는 부재하에 니게리신을 첨가한 가교 결합된 용해물을 면역 블롯으로 분석한 것이다.
도 10a 내지 10e에 도시된 바와 같이, H89는 포스콜린에 의해 유도된 인플라마좀 활성화의 억제 효과를 손상시켰지만, 실시예 4 추출물의 억제 효과에는 영향을 미치지 않은 것을 확인하였으며(도 10a), 이는 NLRP3 활성화에 대한 실시예 4 추출물의 억제 활성이 PKA 신호 전달 경로를 통한 것이 아님을 의미한다.
그러나 실시예 4 추출물과, L-시스테인 또는 GSH의 예비 배양은 IL-1β 방출, 카스파제-1 활성화 및 ASC 올리고머화에 대한 실시예 4 추출물의 억제 기능을 농도 의존적으로 배제한 것이다(도 10d 및 10e).
이러한 결과는 실시예 4의 추출물이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하는 NLRP3 인플라마좀 신호 전달 경로와 관련된 단백질에 시스테인 변형을 유도할 수 있음을 나타낸 것이다.
시스테인 변형에 대한 L-시스테인 및 GSH의 특정 효과를 확인하기 위해, 시스테인 변형 또는 G5(디유비퀴틴화 억제제)를 통한 인플라마좀 활성화를 억제하는 Bay11-7082 및 KCl(칼륨 배출 억제제)을 실험 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 모든 억제제가 BMDM에서 IL-1β와 카스파제-1의 방출을 억제시키지만 Bay11-7082만이 IL-1β와 카스파제-1에 대한 실시예 4 추출물의 억제 활성을 감소시켰다(도 10b와 10c).
시험예 10. NLRP3의 ATPase 활성 억제, NF-κB 활성 억제 및 mROS 측정
도 11a는 실시예 4 추출물의 존재 또는 부재하에서 NLRP3의 ATPase 활성을 ADP-Glo 분석을 사용하여 발광에 의해 측정한 그래프이며, 도 11b는 실시예 4 추출물로 처리 후 LPS로 지시된 세포 용해물 중 phospho-IκB-α와 IκB-α를 면역 블롯으로 분석한 것이고, 도 11c는 실시예 4 추출물의 존재 또는 부재하에서 니게리신으로 처리된 BMDM에서의 미토콘드리아 ROS의 수준을 MitoSOX 라벨링으로 분석한 유동 혈구 계측 그래프이며, 도 11d는 실시예 4 추출물의 존재 또는 부재하에서 니게리신으로 처리된 BMDM에서의 미토콘드리아 ROS의 수준을 MitoSOX 라벨링으로 분석한 평균 형광 강도의 정량 분석 그래프이다.
최근 보고서는 NLRP3의 ATPase 활성이 ASC 올리고머화에 없어서는 안된다는 것을 확인시켰다. 따라서, 실시예 4의 추출물이 NLRP3의 ATPase 활성을 억제할 수 있는지 여부를 측정하였다.
그 결과를 도 11a에 도시한 바와 같이, 실시예 4의 추출물은 농도 의존적으로 NLRP3의 ATPase 활성을 억제하는 것을 확인하였다.
일부 항-인플라마좀 약물은 NF-κB 활성화를 억제할 수 있는 IKKβ 및 P65의 시스테인 잔기를 변형시킨다. 따라서, 실시예 4의 추출물이 NF-κB 활성화를 억제하기 위해 IKKβ를 표적으로 하는지 여부를 측정하였다.
그 결과를 도 11b에 도시한 바와 같이, 실시예 4의 추출물은 NLRP3 인플라마좀 활성화에 대한 억제 활성을 제공하는 동일한 농도에서 LPS 유도된 IκB-α 인산화 및 분해에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 따라서, 이들 데이터는 실시예 4 추출물의 억제 효과가 NF-κB 활성화의 억제에 기인한 것이 아니라는 것을 의미한다.
미토콘드리아 ROS는 인플라마좀 활성화를 위한 NLRP3 특이적 트리거(trigger)라는 것이 알려졌다. 실시예 4의 추출물은 항산화 활성이 있는 것으로 나타나므로, NLRP3 인플라마좀 활성화하는 동안 실시예 4의 추출물이 mROS 수준을 낮출 수 있는지 여부를 측정하였다.
그 결과를 도 11c 및 11d에 도시한 바와 같이, 실시예 4의 추출물은 LPS와 니게리신으로 유도된 mROS의 생성을 억제하여 실시예 4 추출물의 항산화 활성이 부분적으로 NLRP3 인플라마좀 활성화에 대한 억제 효과에 기여한다는 것을 확인하였다.
시험예 11. 실시예 4 추출물의 HPLC 분석
도 12는 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 혼합 추출물을 HPLC으로 측정한 그래프이다.
도 12에 도시된 바와 같이, 실시예 4의 추출물은 클로로겐산, 루틴 및 시닌을 주요 피크로 포함하고 있는 것을 확인하였다.
예컨대, 인플라마좀은 카스파제-1의 활성을 조절하며, 활성화는 IL-1β 또는 IL-18과 같은 전염증성 사이토카인의 성숙과 방출을 일으킨다. 상기 과정은 손상에 대한 숙주방어에 필수적이지만, 부적절한 활성화는 다양한 자가 면역 및 염증 질환의 발병에 기여한다. 몇 가지 인플라마좀 중에서 NLRP3 인플라마좀의 활성화는 대사성 질환 및 자가 염증 질환과 연관되어있다. 따라서 소분자, 인터페론, autophagy 유도제 및 microRNA와 같은 다양한 소스로부터 NLRP3 인플라마좀 활성화를 조절할 수 있는 억제제를 찾기 위한 많은 노력이 이루어져왔다.
우엉의 잎 추출물 또는 우엉의 잎과 줄기가 혼합된 혼합 추출물이 ATP, 니제리신 및 실리카 결정과 같은 전형적인 작용제에 의해 유도된 NLRP3 인플라마좀 활성화를 통해 IL-1β의 방출을 억제한다는 것을 확인하였다. 또한, IL-1β 방출의 저해는 LPS가 주입된 마우스의 혈장에서 더 확인되었다.
또한, NLRP3 인플라마좀이 활성화되는 동안 본 발명의 추출물(우엉의 잎 추출물 또는 우엉의 잎과 줄기가 혼합된 혼합 추출물)로 처리하면 아답터 분자 ASC의 세포이하의 위치, 트래피킹, 올리고머화 및 입자 형성이 억제되었다.
흥미롭게도, 본 발명의 추출물은 플라젤린 또는 폴리(dA : dT) 유도된 인플라마좀 활성화를 억제하지 못하여, 본 발명의 추출물이 NLRP3 인플라마좀에 특이적이고, NLRP3 자체 또는 NLRP3 특이적 신호 전달 경로를 표적할 수 있음을 암시한다.
종래 연구에서는 ATPase 활성과 미토콘드리아 ROS(mROS)와 같은 NLRP3 변형이 다른 유형의 인플라마좀에 영향을 미치지 않으면서 NLRP3 매개 인플라마좀 활성화를 조절할 수 있음을 나타내었다.
따라서 본 발명의 추출물이 NLRP3의 변형, 그의 ATPase 기능 및 인플라마좀 활성화 중 mROS 유도에 미치는 영향을 평가하였다. 실제로, 결과는 본 발명의 추출물의 항-인플라마좀 활성이 L-시스테인 또는 자유 글루타티온의 전처리에 의해 폐지됨으로써, NLRP3 인플라마좀에 대한 본 발명 추출물의 억제 효과가 단백질상의 시스테인 잔기를 변형시키는 능력에 기인한다는 것을 나타내었다.
또한, 본 발명의 추출물은 NLRP3의 ATPase 활성을 직접적으로 저해하고 세포의 mROS 수준을 감소시킴으로써 NLRP3의 기능을 조절하는 능력 외에도 항산화 작용으로 인해 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제시키는 것을 확인하였다.
또한, HPLC에 의해 본 발명의 추출물에서 확인된 활성성분은 클로로제닉산, 루틴 및 시나린인 것을 확인하였으며, 이들 화합물은 NLRP3 인플라마좀 활성화 억제에 시너지 효과를 위해 개별적으로 또는 조합하여 작용할 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 추출물은 인플라마좀 관련 메커니즘을 제공하며 이에 따라 NLRP3 인플라마좀 관련 만성염증 질환의 치료에 응용될 수 있다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 우엉의 잎과 줄기의 혼합물인 지상부 메탄올 추출물을 20 내지 100 ug/ml 농도로 함유하는, NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환인 동맥경화, 2형 당뇨 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 우엉의 잎과 줄기는 1 : 1 내지 3의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서, 상기 메탄올 추출물은 60 내지 90 부피%의 메탄올 수용액인으로 추출된 것을 특징으로 하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 우엉의 잎과 줄기의 혼합물인 지상부 메탄올 추출물을 20 내지 100 ug/ml 농도로 함유하는, NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환인 동맥경화, 2형 당뇨 또는 퇴행성 뇌질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 우엉의 지상부 추출물은 우엉의 잎과 우엉의 줄기를 1 : 1 내지 3의 중량비로 혼합하여 추출한 것을 특징으로 하는 NLRP3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  12. 삭제
KR1020180159125A 2018-12-11 2018-12-11 우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 nlrp3 인플라마좀의 과활성에 의한 만성 염증질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 KR102212997B1 (ko)

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