KR102199383B1 - Pdgf 수용체에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PDGF 수용체에 대한 항체, 상기 PDGF 수용체에 대한 항체에 화학 요법제를 접합한 항체-약물 접합체 및 이를 이용한 혈관신생성 질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.

Description

PDGF 수용체에 대한 항체 및 이의 용도{Antibody against PDGF receptor beta and use thereof}
본 발명은 PDGF 수용체에 대한 항체, 상기 PDGF 수용체에 대한 항체에 화학 요법제를 접합한 항체-약물 접합체 및 이를 이용한 안구의 혈관신생성 질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
혈관신생(neovascularization)이라 불리기도 하는 혈관형성(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 돌출부가 형성되고 이들이 주변 조직으로 침윤하는 단계를 수반한다. 이와 연관이 있는 과정인 맥관형성(vasculogenesis)은, 조직 전체에 이미 존재하고 있는 내피 세포와 혈관모세포가 분화하고 이후에는 이들이 함께 연결되면서 혈관이 형성되는 단계를 수반한다. 혈관형성은 발생 동안에 광범위하게 이루어지며, 또한 건강한 신체에서도 손상이나 상해 후에 조직으로의 혈류 복구를 위한 창상 치유 동안에 이루어진다. 그러나, 혈관형성은 암 및 종양 형성과도 연관이 있다.
각종 안구 장애는 혈관형성에서의 변경을 수반한다. 예를 들어, 성인 실명의 원인 중 하나인 당뇨병성 망막병증은 과도한 혈관형성과 관련이 있다. 비증식성 망막병증은 망막 내 혈관주위세포의 선택적 소실을 수반하고, 이러한 소실로 인해 관련 모세관이 확장되어 혈류가 증가한다. 확장된 모세관에서는 내피 세포가 증식하고 낭상돌출을 형성하여 미세동맥류가 되고 인접 모세관이 차단되어 이들 미세동맥류 주변의 망막 영역에서 관류가 일어나지 않는다. 실제로, 미세동맥류의 인접 영역 사이에서는 단락 혈관이 나타나고, 초기 당뇨병성 망막병증의 임상적 상은 미세동맥류 및 관류되지 않는 망막 영역이 있는 것으로 나타난다. 미세동맥류에서 누출이 일어나고 모세 혈관이 터지는 수가 있어서 삼출과 출혈을 일으킬 수 있다. 증식성 당뇨병성 망막병증은, 망막의 일부 영역이 계속 모세 혈관을 소실하고 관류되지 않는 상태가 되어 디스크 및 망막상의 다른 영역에서 새로운 혈관이 나타나게 될 때 발생한다. 이러한 새로운 혈관은 유리질 및 출혈 부위로 쉽게 성장하여 망막앞 출혈을 일으킨다. 증식성 당뇨병성 망막병증이 진전되면, 과도한 유리질 출혈이 유리질강의 대부분을 채우는 수가 있다. 또한, 새로운 혈관은 견인성 망막 박리를 일으킬 수 있는 섬유상 조직 증식을 수반한다.
황반 부종 및 증식성 당뇨병성 망막병증의 조기 치료는 95％의 환자에서 5년 동안 실명을 예방하지만, 치료가 늦어지면 단지 50％의 환자에서만 실명이 예방된다. 따라서, 조기 진단 및 조기 치료가 필수적이다.
혈관신생을 수반하는 또다른 안구 장애는, 노인성 황반 변성 (AMD)이다. AMD는 망막의 중앙 영역인 황반에서 일어나는 일련의 병리 변화를 특징으로 하며, 특히 중심부 시력에 영향을 미치는 시력 문제를 수반한다. 망막 색소 상피는, AMD에서 두꺼워지고 경화되는 기저막 복합체인 브루크막 상에 존재한다. 새로운 혈관은 풍부한 혈관층을 함유하는 아래쪽 맥락막으로부터 브루크막을 지나면서 생성될 수 있다. 이어서, 이들 혈관은 망막 색소 상피 아래쪽뿐만이 아니라 망막 색소 상피와 감각성 망막 사이에서 유액을 누출시키거나 출혈을 일으킬 수 있다. 이후의 섬유상 반흔형성은 광수용체 세포로의 영양분 공급을 차단하여 이들 세포를 사멸시켜서 중심부 시력의 상실을 초래한다. 이러한 유형의 노인성 황반병증은 누출 혈관 및 망막하 부종 또는 혈액 때문에 "습성(wet type)"이라 불린다. "건성(dry type)" 노인성 황반병증은 망막 색소 상피가 그 위에 존재하는 광수용체 세포의 소실과 더불어 붕괴되는 것을 수반한다. 이러한 건성은 시력을 저하시킨다.
이러한 혈관형성 조절자 중에서, 신호전달 분자의 PDGF 족에 속하는 PDGF-B 구성원의 역할이 연구되고 있는데, 이들이 때로는 벽재성 세포, 예를 들어 혈관 평활근, 혈관사이세포 및 혈관주위세포라고 지칭되기도 하는 혈관주위 세포의 형성, 증식 및 적당한 기능수행에 있어서 소정의 역할을 수행한다고 여겨지기 때문이다.
PDGF 패밀리 (family) 은 단량체 PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 및 PDGF-D와 이합체 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, 및 PDGF-DD로 구성되어 있다. PDGF 이합체의 결합에 따라, PDGF는 PDGF 수용체 α와 β에 결합한다. 상기 PDGF 수용체는 타이로신 인산화 효소의 일 종으로, αα, ββ 및 αβ 이합체로서 3가진 조합을 형성할 수 있다. PDGF 수용체의 세포 외 영역은 5개의 면역글로불린 유사 영역으로 구성되어 있으며, 세포 내 영역은 티로신 인산화 영역을 포함하고 있다. 수용체의 리간드 결합 부위는 처음 3 개의 면역글로불린 유사 영역에 위치한다. PDGF는 PDGF 수용체의 면역 글로불린 유사 도메인 2와 3에 결합하여 수용체의 이합체화를 유도하고, 추가적인 안정화를 위해 면역 글로불린 유사 도메인 4와 5를 포함하는 직접적인 수용체-수용체 상호작용을 유도한다.
PDGF-CC는 특별히 PDGF 수용체-αα 및 PDGF 수용체-αβ과 상호 작용하지만 PDGFR-ββ과는 상호 작용하지 않으므로 PDGF-AB와 유사하다. PDGF-DD는 PDGFR-ββ와 높은 친화력으로 결합하고 PDGF 수용체-αβ와는 훨씬 낮은 정도로 결합하므로, PDGFR-ββ에 특이적이라고 간주된다. PDGF-AA는 오직 PDGF 수용체-αα와만 결합하며, PDGF-BB는 유일하게 모든 3 가지 조합의 수용체와 높은 친화력으로 결합한다.
PDGF와 PDGF 수용체 사이의 과도한 신호는 신장세포암종, 폐암, 아교모세포종, 만성 림프성 백혈병, 전립선암과 같은 많은 암에서 중요한 역할을 한다. PDGF 수용체는 종양 성장, 관련 혈관, stromal fibroblast (체성 섬유아세포) 등에 직접 영향을 주어 종양 지속력을 촉진함으로써 종양 성장을 촉진한다.
PDGF와 PDGF 수용체의 신호전달을 표적으로 하는 단클론 항체로서, Olaratumab (IMC-3G3, LartruvoTM) 은 PDGF 수용체α와 특이적으로 결합하고 PDGF-AA, PDGF-BB, 및 PDGF-CC의 결합 및 수용체 활성화를 막으며 PDGFR-β와 교차 반응하지 않는 α-PDGFR에 대한 재조합형 인간 IgG1 항체이다. Olaratumab과 독소루비신의 병용 요법이 독소루비신 단독 사용에 비해 전체 평균 생존율을 상당히 향상시켰다는 후기 연부조직육종의 Ib/II 단계 연구 결과를 바탕으로 Olaratumab은 2016년 10월 미국에서 처음으로 암 치료 승인을 받았다.
항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugates, ADCs)는 세포독성제 (cytotoxic drug)- 단일 항체 (monoclonal antibodies)를 포함한 치료제로서 비표적 (off-target) 독성을 최소화 하면서 표적 항원을 발현하는 암세포에 독성제를 전달하는 치료제이다.
최적화 항체-약물 접합체 개발을 위해서는 항체, 링커, 결합 부위, 종양 종류, 항원 발현률, 독성물, 약물-항체 비율 (drug to antibody ratio, DAR) 등 복잡한 고려사항들이 있다. 예를 들면, 결합 부위는 결합률, 친화력, 안정성에 영향을 준다. 약물-접합체는 세포 내로 내재화 (Internalize) 하여 약물을 방출하기 때문에 독성 효능은 약물을 얼마나 효과적으로 세포 내로 전달하는지가 중요하다. 또한, 세포 표면에 있는 동일 타겟 항원에 붙는 항체들끼리도 내재화 효율성이 다르다. 그리하여, 효율적으로 내재화하는 항체를 선별하는 것은 항체-약물 복합체 효능에 매우 중요하다. 약물의 세포 독성 효능은 표적 항원에 대한 항체-약물 접합체의 재순환 (recycle) 과 세포내 수송 (intracellular trafficking) 등 많은 요인들이 있기때문에 내재화 하는 항체들의 독성률을 정밀하게 측정하는 방법들은 실제 항체-약물 접합체를 제작 후 확인 할 수 있다. 유감스럽게도, 여러 종류의 항체들을 이용한 항체-약물 접합체 후보물질을 만드는데 많은 노력과 시간이 사용되고 있다.
현재 나와있는 PDGFR-β 치료제는 PDGF 리단드의 대항 (antagonistic) 효과에 집중되어 있고 PDGFR-β 내재화에 효율적으로 내재화 하지 못한다. 이에 PDGFRβ에 효율적으로 내재화하여 PDGFR-β를 발현하는 세포 내부로 항체 또는 항체와 약물 접합체를 전달할 수 있는 항체 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 예는 항-PDGF 수용체, 자세하게는 PDGF 수용체-β를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일 예는 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 상기 항체-약물 접합체는 항-PDGF 수용체 항체에 약물이 비공유적 또는 공유적 결합으로 결합된 결합체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 항-PDGF 수용체 항체 또는 이들 항체의 항원 결합 단편은 약물과 접합할 수 있는 헵텐을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 특이적 항체일 수 있다.
상기 항체의 항원 결합 단편은 항원결합부위는 적어도 하나의 CDR을 가진 항체의 부위를 뜻하며, 이는 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' and F(ab')2 일 수 있다.
본 발명의 일 예는 항-PDGF 수용체 항체를 포함하는, PDGF 수용체, 자세하게는 PDGF 수용체-β를 세포 표면에 가지며 세포 또는 조직에 약물을 전달하는 약물 전달체 용도에 관한 것이다. 상기 약물 전달체는 항-PDGF 수용체 항체 또는 이들 항체의 항원 결합 단편은 약물과 접합할 수 있는 헵텐을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 특이적 항체일 수 있다. 상기 약물 전달체가 헵텐을 인식하는 항체 또는 이의 항원결합 단편이 결합된 것인 경우, 상기 약물은 헵텐과 결합되어 헵텐을 통해 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하여 표적 세포 또는 조직으로 전달되는 것일 수 있다. 상기 표적 세포로 전달되는 약물은 PDGF 또는 PDGF 수용체 관련 질환, 예를 들면 혈관신생성 질환에 예방, 개선 또는 치료용 약물일 수 있다. 상기 약물은 면역요법제 또는 화학요법제일 수 있으며, 상기 면역요법제는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 예는 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체, 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 헵텐을 통해 약물이 접합된 항체-약물 접합체를 포함하는, 혈관신생성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 혈관신생성 질환을 앓는 것으로 진단되거나 혈관신생성 질환의 발병 위험이 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 상기 대상에게 1차 치료제 또는 보조 치료제로서 상기 질환을 예방, 개선 또는 치료하기에 충분한 양으로, 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체, 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 헵텐을 통해 약물이 접합된 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는, 항-PDGF 수용체, 자세하게는 PDGF 수용체-β(PDGFR-β)를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 "항체"는 항원 자극을 통해 만들어지는 물질이다. 항체의 예시로는 동물 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
또한, 분리된 항원결합부위도 본 발명의 항체의 범주 안에 속한다. 상보성 영역(complementary-determining region, CDR) 은 항원 특이성에 중요한 항체의 가변 부위 (variable region)를 의미한다. 위에 설명된 항원결합부위는 적어도 하나의 CDR을 가진 항체의 부위를 뜻하며, 이는 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' and F(ab')2 일 수 있으며, 바람직하게는 scFv일 수 있다. 상기 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)에서 선택된 것일 수 있다. 상기 IgG 형태의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 예컨대 IgG1 또는 IgG2 서브타입 형태일 수 있다.
본 발명에 사용된, 항체 또는 면역글로불린의 사슬 (중쇄 또는 경쇄)의 "항원 결합 단편"은 전장 사슬과 비교하여 일부 아미노산이 결여되었지만, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부를 포함하는 것이다. 이러한 항원 결합 단편 은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 또는 다른 항체 또는 항원 결합 단편과 특정 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다는 측면에서 생물학적으로 활성이 있다고 할 수 있다. 구체적으로, 상기 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 이러한 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 예를 들면 온전한 항체를 효소적 또는 화학적 절단하여 생산될 수 있다. 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편에는 이로 제한하는 것은 아니다.
비-인간 (예를 들어, 닭, 마우스, 래트 등) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소의 서열을 함유하는 특이적인 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab)2 또는 항체의 기타 항원-결합 결과물)이다. 대체로, 인간화 항체는 수용자 항체의 상보적 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 사례에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 FR 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 도입된 CDR 또는 FR 서열에서도 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다. 상기 변형을 행하여 항체 성능을 추가로 정련하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 이뮤노글로불린의 영역과 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기가 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 잔기인 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다.
본 발명은 PDGFR-β isoform의 세포외 영역(extracellular domain)에 대한 항체이다. PDGF 수용체는 타이로신 인산화 효소의 일 종으로 PDGFR-α 및 PDGFR-β의 두 가지 isoform이 있으며, 이들은 αα, ββ 및 αβ 이합체로서 3가진 조합을 형성할 수 있다. PDGF 수용체의 구조는 5개의 면역글로불린 유사 도메인으로 구성된 세포 외 영역, 막관통 영역, 및 세포 내 영역(티로신 인산화 영역)을 포함하고 있다. 수용체의 리간드 결합 부위는 세포외 영역을 구성하는 5개 면역글로불린 유사 도메인(immunoglobulin-like) 중에서 앞쪽에 의치하는 3 개의 면역글로불린 유사 영역에 위치한다. PDGF는 PDGF 수용체의 면역 글로불린 유사 도메인 2와 3에 결합하여 수용체의 이합체화를 유도하고, 추가적인 안정화를 위해 면역 글로불린 유사 도메인 4와 5를 포함하는 직접적인 수용체-수용체 상호작용을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 항체는 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., (1990) Nature, 348: 552-553])을 사용하여, 시험관내에서 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
본 발명은 PDGFR-β 에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그 항원결합 단편에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 항원결합단편은 중쇄의 상보성 결정부위와 경쇄의 상보성 결정부위를 포함하여, PDGFR-β에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
구체적인 일 예는, 항-PDGFR-β 항체 및 이의 항원결합단편은,
(i) H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(ii) L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
추가적으로, 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합에서, 상기 중쇄 가변 영역은 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 프레임워크를 포함할 수 있으며, 상기 경쇄 가변영역은 L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 프레임워크를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 (i) H-CDR1, H-CDR2 또는 H-CDR3의 중쇄 상보성 결정부위는 하기 표 1 및 표 2에 기재된 아미노산 서열중에서 선택되거나 상기 선택된 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, (ii) L-CDR1, L-CDR2 또는 L-CDR3의 경쇄 상보성 결정부위는 하기 표 1 및 표 2에 기재된 아미노산 서열중에서 선택되거나, 상기 선택된 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 단쇄 Fv는 중쇄 및 경쇄 가변영역이 직접 또는 링커에 의해 연결된 항원 결합 영역의 단일 폴리펩타이드 사슬로서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 단일 사슬 형태로 연결된 scFv, scFv 다이머와 같은 구조(di-scFv), 및 중쇄가변영역, 경쇄가변영역, 및 Fc가 단일사슬 형태로 연결된 scFv-Fc 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 단쇄 Fv는 중쇄 및 경쇄 가변영역이 링커에 의해 연결될 수 있으며 링커는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 하기 표 2의 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 링커 서열일 수 있다.
본 발명에서 표적 항원의 일 예로서, 마우스 또는 인간의 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타 (platelet-derived growth factor receptor beta, mPDGFR-β)에 대한 항체를 포함하며, 상기 항체의 scFv를 이중 특이 항체의 제조에 사용할 수 있다. 예를 들면 scFv는 항체의 CDR1 내지 CDR3를 가진 heavy chain과 CDR1 내지 CDR3를 가진 light chain이 링커로 연결되어있는 항체일 수 있다. 추가적으로, 이중 특이 항체로서, (항-PDGFR-β 항체의 scFv)-Cκ- (항-코티닌 항체의 scFv)의 융합 단백질은 각 항체의 heavy chain의 3개 CDR 및 light chain의 3개 CDR를 포함할 수 있으며 이는 하기 표 2에 명시된 것처럼 Cκ 으로 연결될 수 있다.
구체적인 일 예에서, 본 발명에 따른 표적 항원의 일 예인 마우스 PDGFR-β(mPDGFR-β)에 대한 항체의 구체적인 일 예는, PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 및 PRb-CC03이며 이들의 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역 및 이들 영역의 CDR 서열을 하기 표 1에 나타낸다.
Clone/name Part 아미노산 서열 (N->C) SEQ ID NO
PRb-CN01 CDR1-VH GFTFSDRAMH 1
PRb-CN01 CDR2-VH LITNTGGSTNYGAAVKG 2
PRb-CN01 CDR3-VH GVGSWAHGGRIDA 3
PRb-CN01 CDR1-VL SGGSGSYG 4
PRb-CN01 CDR2-VL SNNQRPS 5
PRb-CN01 CDR3-VL GTRDSSYVGI 6
PRb-CN01 VH AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSDRAMHWVRQAPGKGLEWVGLITNTGGSTNYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCTRGVGSWAHGGRIDAWGHGTEVIVSS 7
PRb-CN01 VL LTQPSSVSANPGETVKITCSGGSGSYGWFQQKSPGSAPVTVIYSNNQRPSDIPSRFSGSKSGSTNTLTITGVQAEDEAIYYCGTRDSSYVGIFGAGTTLTVL 8
PRb-CC01 CDR1-VH SGFTFSSYNMG 9
PRb-CC01 CDR2-VH GISAADNSTAYGAAVDG 10
PRb-CC01 CDR3-VH GGGSIDA 11
PRb-CC01 CDR1-VL SGGGSYYG 12
PRb-CC01 CDR2-VL YNDKRPS 13
PRb-CC01 CDR3-VL GAWDNSAGYAG 14
PRb-CC01 VH AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKGSGFTFSSYNMGWVRQAPGKGLEFVAGISAADNSTAYGAAVDGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCIRGGGSIDAWGHGTEVIVSS 15
PRb-CC01 VL LTQPSSVSANLGGTVKITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTLIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFCGAWDNSAGYAGFGAGTTLTVL 16
PRb-CC02 CDR1-VH GFTFSSYGMF 17
PRb-CC02 CDR2-VH GIDTGSGTNYGSAVKG 18
PRb-CC02 CDR3-VH GYAGTIDA 19
PRb-CC02 CDR1-VL SGGGGSYG 20
PRb-CC02 CDR2-VL YNDKRPS 21
PRb-CC02 CDR3-VL GSYNSSDSL 22
PRb-CC02 VH AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYGMFWVRQAPGKGLEWVAGIDTGSGTNYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGYAGTIDAWGHGTEVIVSSTS 23
PRb-CC02 VL LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFCGSYNSSDSLFGAGTTLTVL 24
PRb-CC03 CDR1-VH GFTFSSYAMG 25
PRb-CC03 CDR2-VH GIDTAGGTAYGPAVKG 26
PRb-CC03 CDR3-VH SSYIDT 27
PRb-CC03 CDR1-VL SGGTYNYG 28
PRb-CC03 CDR2-VL WNDKRPS 29
PRb-CC03 CDR3-VL GSSDSSGLI 30
PRb-CC03 VH AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKASGFTFSSYAMGWVRQAPGKGLEWVAGIDTAGGTAYGPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCTRSSYIDTWGHGTEVIVSSTS 31
PRb-CC03 VL LTQPSSVSANPGETVKITCSGGTYNYGWYQQKSPGSAPVTVIYWNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSSDSSGLIFGAGTTLTVL 32
상기 PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 및 PRb-CC03 항체 중에서, PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03는 mPDGF-BB와 경쟁하여 결합부위가 PDGFR-β의 면역글로블린 유사 도메인 2 및/또는 3으로 간주되며, PRb-CN01 는 mPDGF-BB와 경쟁하지 않아 PDGFR-β의 면역글로블린 유사 도메인 도메인 1,4 또는 5에 결합할 것으로 예상된다. PRb-CN01와 PRb-32는 모두 mPDGF-BB 유/무에 상관없이 동일한 독성을 보이며, PRb-CN01 및 PRb-32는 대리 항체(surrogate)임을 확인하였다(도 20a, 도 20b).
본 발명에 따른 신규한 항체, 예를 들면 PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 및 PRb-CC03 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체는, 항-코티닌 항체와 이중 항체를 제조한 경우에, PDGF 수용체에 대해 1 x 10-7 M 내지 1 x 10-10 M의 범위의 결합 친화성을 갖는다.
상기 PRb-CN01, PRb-CC02 및 PRb-CC03 항체는 엔도좀을 통해 세포 내재화를 함을 확인하였으나, PRb-CC01는 내재화 되지 않음을 확인하였다. 약물-접합체는 세포 내로 내재화 (Internalize) 하여 약물을 방출하기 때문에 독성 효능은 약물을 얼마나 효과적으로 세포 내로 전달하는지가 중요하다. 또한, 세포 표면에 있는 동일 타겟 항원에 붙는 항체들끼리도 내재화 효율성이 다르다. 그리하여, 효율적으로 내재화하는 항체를 선별하는 것은 항체-약물 복합체 효능에 매우 중요하다.
또한, 상기 PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 및 PRb-CC03 항체는 세포 독성을 나타내며, 4개 항체 중에서 특히 PRb-CN01이 cotinine-duocarmycin와 complex를 형성하는 경우 가장 높은 세포 독성(cytotoxicity)을 나타내므로, duocarmycin과 같은 약물의 가장 효과적인 표적화 전달체로 고려될 수 있다. mPDGF-BB를 추가한 후에도 cot-duo 또는 cot-duo-cot와 복합체를 이룬 PRb-CN01 함유 이중항체의 세포 독성은 여전히 높았지만, mPDGF-BB를 추가하면 mPDGF-BB와 경쟁하는 cot-duo 또는 cot-duo-cot와 복합체를 이룬 3개의 항체 (PRb-CC01, PRb-CC02 및 PRb-CC03) 의 독성이 약간 감소하였다. 본 발명에서, PRb-CN01 포함 이중 항체는 PDGF-BB와 경쟁하지 않고 PDGF-BB와 무관하게 세포독성을 유발하였다(도 5a 내지 도 5d).
본 발명에 따른 표적 항원의 일 예인 인간 PDGFR-β(hPDGFR-β)에 대한 항체의 구체적인 일 예는, PRb-CN16, PRb-CN32, 및 PRb-CN26이며 이들의 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역 및 이들 영역의 CDR 서열을 하기 표 2에 나타낸다.
Clone/name Part Sequence 서열
번호
PRb-CN16 CDR1-VH GFTFSSFNMA 33
PRb-CN16 CDR2-VH EISNTAGSTFYAPAVKG 34
PRb-CN16 CDR3-VH AAGTCYSHSCTGYIDA 35
PRb-CN16 CDR1-VL SGSSSSYG 36
PRb-CN16 CDR2-VL ENNQRPS 37
PRb-CN16 CDR3-VL GNADRSNSAGT 38
PRb-CN16 VH AVTLDESGGGLQTPGTALSLVCKASGFTFSSFNMAWVRQAPGKGLEFVGEISNTAGSTFYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTAIYYCAKAAGTCYSHSCTGYIDAWGHGTEVIVSSTS 39
PRb-CN16 VL LTQPSSVSANPGETVKITCSGSSSSYGWYQQKSPGSAPVTLIYENNQRPSNIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGNADRSNSAGTFGAGTTLTVL 40
PRb-CN32 CDR1-VH GFTFSSFNMF 41
PRb-CN32 CDR2-VH GISTTGRYTGYGSAVQG 42
PRb-CN32 CDR3-VH SAGSTYSYWDSDAGLIDA 43
PRb-CN32 CDR1-VL SGGSNAGSYYYG 44
PRb-CN32 CDR2-VL SNNQRPS 45
PRb-CN32 CDR3-VL GSGDSSSIAA 46
PRb-CN32 VH AVTLDESGGGLQTPRGTLSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEFVAGISTTGRYTGYGSAVQGRGTISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAGSTYSYWDSDAGLIDAWGHGTEVIVSSTS 47
PRb-CN32 VL LTQPSSVSANLGETVKITCSGGSNAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNQRPSDIPSRFSGSTSGSTSTLTITGVQVDDEAVYFCGSGDSSSIAAFGAGTTLTVL 48
PRb-CN26 CDR1-VH GFTFSDRGIH 49
PRb-CN26 CDR2-VH GIGNTGSYTAYAPAVKG 50
PRb-CN26 CDR3-VH RGFMDAGGIDA 51
PRb-CN26 CDR1-VL SGGGSYAGSYYYG 52
PRb-CN26 CDR2-VL DNTNRPS 53
PRb-CN26 CDR3-VL GGYDGISDTGI 54
PRb-CN26 VH AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSDRGIHWVRQAPGKGLEWVAGIGNTGSYTAYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCAKRGFMDAGGIDAWGHGTEVIVSSTS 55
PRb-CN26 VL LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSLSGSTDTLTITGVQAEDEAVYFCGGYDGISDTGIFGAGTTLTVL 56
Linker
(scFv 제조용)		 VL-VH GQSSRSSGGGGSSGGGGS 57
Kappa constant (Ck) * RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGES 58
Linker(이중항체 제조용) scFv-Ck (GGGGS)3 59
상기 PRb-CN16, PRb-CN32, 및 PRb-CN26 항체는 모두 hPDGF-BB와 경쟁하지 아니하며, 이에 hPDGFR-β의 면역글로블린 유사 도메인 1,4 또는 5에 결합할 것으로 예상된다. 상기 PRb-CN16, PRb-CN32, 및 PRb-CN26 항체는 모두 hPDGFR-β, mPDGFRβ, 레서스 PDGFRβ, 사이노몰구스 PDGFRβ 및 수스스크로파 PDGFR-β에 결합하는 것으로 확인된다.PRb-CN01와 PRb-32는 모두 mPDGF-BB 유/무에 상관없이 동일한 독성을 보이며, PRb-CN01 및 PRb-32는 대리 항체(surrogate)임을 확인하였다(도 20a, 도 20b).
본 발명에 따른 신규한 항체, 예를 들면 PRb-CN16, PRb-CN32, 및 PRb-CN26 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체는, 항-코티닌 항체와 이중 항체를 제조한 경우에, PDGF 수용체에 대해 1 x 10-7 M 내지 1 x 10-11 M의 범위의 결합 친화성을 갖는다.
본 발명에 따른 표적 항원의 일 예인 인간 PDGFR-β(hPDGFR-β)에 대한 항체의 세포 내재화 성능 평가에서, hPDGF-BB가 없는 경우 PRb-CN32가 human pericyte 세포에 내재화를 가장 잘하며, 그 다음으로 PRb-CN16이며 PRb-CN26은 내재화 하지 않는다. 또한, 세포 내재화 성능 평가에서 hPDGF-BB를 함께 처리한 경우, PRb-CN16, PRb-CN32, 및 PRb-CN26 항체는 모두 세포 내재화 성능이 우수하다. 약물-접합체를 제조할 경우 세포 내로 내재화 (Internalize) 하여 약물을 방출하기 때문에, 본 발명에 따른 hPDGFR-β 항체가 표적 세포로 이동하여 내재화가 잘 되므로, 상기 항체를 이용하여 약물-접합체를 제조할 경우 세포 내로 내재화 (Internalize) 하여 세포 내로 약물을 방출하기 때문에 약물의 효능 증가에 기여한다. Wet type AMD 및 PDGFR-β가 문제가 되는 질환을 가진 환자는 PDGFR-β 발현 수준 증가 및/또는 PDGF-BB의 발현 수준이 증가하며, 이러한 증가된 발현 수준으로 인해 항체의 내재화 또는 효능이 억제되는 경향이 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 항-PDGFR-β 항체는 PDGF-BB의 발현 수준이 증가하더라도 항체의 내재화 수준이 억제되지 않거나 내재화가 더욱 증가하는 장점이 있다.
상기 PRb-CN16, PRb-CN32, 및 PRb-CN26 항체 중에서 특히 PRb-CN32 와 PRb-CN26이 cotinine-duocarmycin와 complex를 형성하는 경우 가장 높은 세포 독성(cytotoxicity)을 나타내므로, duocarmycin과 같은 약물의 가장 효과적인 표적화 전달체로 고려될 수 있다.
상기 PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26 모두는 PDGFR-β 발현 세포주에서 hPDGF-BB 유/무에 상관없이 대조 항-mCD154 x cotinine scFv-Cκ-scFv 대비 높은 독성을 나타내며, 특히 PRb-CN26과 PRb-CN32가 세포 독성이 높게 나타낸다(도 14a 및 14b). 또한, 상기 PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26 모두는 hPDGFR-β을 발현하지 않는 세포주에서 대조 항-mCD154 x cotinine scFv-Cκ-scFv 대비 세포 독성이 동등하다. 이에, hPDGFRb 비발현 세포주와 hPDGFRb 발현 세포주에 대한 이중항체-약물의 독성 (IC50)의 차이를 가지고, hPDGFRb 를 발현하는 세포에 더 낮은 농도에서 독성을 보여, 해당 농도에서는 정상 세포 또는 정상 조직에는 독성을 최소화 하면서 hPDGFR-β가 많이 발현 되는 병적인 세포 또는 조직에 특이적으로 더 많은 독성을 보인다. 또한, Wet type AMD 및 PDGFR-β가 문제가 되는 질환을 가진 환자는 PDGFR-β 발현 수준 증가(C. Zehetner et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2014) 337-44) 및/또는 PDGF-BB의 발현 수준이 증가하며(C. Zehetner, R. Kirchmair, S.B. Neururer, M.T. Kralinger, N.E. Bechrakis, G.F. Kieselbach, Systemic upregulation of PDGF-B in patients with neovascular AMD, Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2014) 337-44)), 이러한 증가된 발현 수준으로 인해 항체의 내재화 또는 효능이 억제되는 경향이 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 항-PDGFR-β 항체는 PDGF-BB의 발현 수준이 증가하더라도 항체의 내재화 수준이 억제되지 않거나 내재화가 더욱 증가하는 장점이 있다.
더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 항체는, 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타 (platelet-derived growth factor receptor beta, PDGFR-β)을 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
상기 항-PDGF 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 2, 10, 18, 26, 34, 42 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 서열번호 3, 11, 19, 27, 35, 43 또는 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3를 포함하며,
상기 항-PDGF 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 4, 12, 20, 28, 36, 44, 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 5, 13, 21, 29, 37, 45, 또는 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 서열번호 6, 14, 22, 30, 38, 46 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3를 포함한다.
상기 항체는 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, PDGF-BB와 비-경쟁적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예를 들면 중쇄 가변영역은 서열번호 1, 33, 41, 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 2, 34, 42 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 서열번호 3, 35, 43 또는 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3를 포함하며,
경쇄 가변영역은 서열번호 4, 36, 44, 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 5, 37, 45, 또는 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 서열번호 6, 38, 46 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3를 포함하는 것일 수 있다.
상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PDGFR-β을 발현하는 세포에 의해 내재화되는 것일 수 있으며, 예를 들면,
중쇄 가변영역은 서열번호 1, 17, 25, 33, 41, 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 2, 18, 26, 34, 42 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 서열번호 3, 19, 27, 35, 43 또는 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3를 포함하며,
경쇄 가변영역은 서열번호 4, 20, 28, 36, 44, 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 5, 21, 29, 37, 45, 또는 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 서열번호 6, 22, 30, 38, 46 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
(a)서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH-CDR1 내지 VH-CDR3과 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR1 내지 VL-CDR3을 포함,
(b)서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH-CDR1 내지 VH-CDR3과 서열번호 12 내지 14의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR1 내지 VL-CDR3을 포함,
(c)서열번호 17 내지 19의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH-CDR1 내지 VH-CDR3과 서열번호 20 내지 22의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR1 내지 VL-CDR3을 포함,
(d)서열번호 25 내지 27의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH-CDR1 내지 VH-CDR3과 서열번호 28내지 30의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR1 내지 VL-CDR3을 포함,
(e)서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH-CDR1 내지 VH-CDR3과 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR1 내지 VL-CDR3을 포함,
(f)서열번호 41 내지 43의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH-CDR1 내지 VH-CDR3과 서열번호 44 내지 46의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR1 내지 VL-CDR3을 포함, 또는
(g)서열번호 49 내지 50의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH-CDR1 내지 VH-CDR3과 서열번호 52 내지 54의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR1 내지 VL-CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예는 항-PDGF 수용체 항체를 포함하는, PDGF 수용체, 자세하게는 PDGF 수용체-β를 세포 표면에 가지며 세포 또는 조직에 약물을 전달하는 약물 전달체 용도에 관한 것이다. 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합단편은 항-PDGF 수용체를 갖는 타겟 세포로 표적화하고 타겟 세포의 내부로 내재화(internlization)되어 타겟 세포 내부로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된 물질을 효율적으로 전달할 수 있다. 상기 전달 가능한 약물은 항-PDGF 수용체 항체에 직접 또는 링커를 통해 결합하여 항체-약물 접합체를 형성할 수 있거나, 합텐-약물 접합체를 형성하여 합텐을 통해 항-PDGF 수용체 항체에 결합할 수 있는 약물일 수 있다.
본 발명의 일 예는 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원결합 단편은 화학요법 약물, 효소, 펩타이드, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 또는 검출 표지와 같은 접합 화합물을 접합한 항체 또는 그의 항원결합 단편과 접합 화합물을 포함하는 복합체를 제공한다. 상기 접합 화합물의 종류에 따라, 상기 복합체는 질병의 진단 또는 치료에 다양하게 적용될 수 있다.
본 발명의 추가 일 예는 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 상기 항체-약물 접합체는 항-PDGF 수용체 항체에 약물이 비공유적 또는 공유적 결합으로 결합된 결합체일 수 있다.
본원에서 "접합체" 또는 "컨쥬게이트"는 본원에 개시된 항체 또는 그 항원결합 단편과 다른 분자, 특히 후술하는 치료제와의 키메라 분자를 일컫는 것이다. 컨쥬게이트에서 본원에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편은 다른 분자와 예를 들면 공유결합 또는 반데스발스 또는 소수성 상호작용에 의한 물리적 힘, 캡슐화, 매립화(embedding) 또는 상기 조합을 포함하는 방법에 의해 물리적으로 결합된다. 일 구현예에 따른 컨쥬게이트에서 본원에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편은 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 항-PDGF 수용체 항체 또는 이들 항체의 항원 결합 단편은 약물과 접합할 수 있는 헵텐을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 특이적 항체일 수 있다. 상기 항체의 항원 결합 단편은 항원결합부위는 적어도 하나의 CDR을 가진 항체의 부위를 뜻하며, 이는 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' and F(ab')2 일 수 있다. 본 발명에서 "다중 특이 항원 결합 단백질" 또는 "다중 특이 항체"는 두 개 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것으로, 두 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 본 발명에서 "이중 특이" 또는 "이중 특이적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이러한 이중 특이적 항체는 다중 특이적 항원 결합 단백질 또는 다중 특이적 항체의 일종으로, 공지된 다양한 방법 예를 들면 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결에 의해 생산될 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달체가 헵텐을 인식하는 항체 또는 이의 항원결합 단편이 결합된 것인 경우, 상기 약물은 헵텐과 결합되어 헵텐을 통해 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하여 표적 세포 또는 조직으로 전달되는 것일 수 있다. 상기 표적 세포로 전달되는 약물은 PDGF 또는 PDGF 수용체 관련 질환, 예를 들면 혈관신생성 질환에 예방, 개선 또는 치료용 약물일 수 있다.
본 발명의 일 예는 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체, 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 헵텐을 통해 약물이 접합된 항체-약물 접합체를 포함하는, 혈관신생성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 혈관신생성 질환을 앓는 것으로 진단되거나 혈관신생성 질환의 발병 위험이 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 상기 대상에게 1차 치료제 또는 보조 치료제로서 상기 질환을 예방, 개선 또는 치료하기에 충분한 양으로, 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체, 항-PDGF 수용체 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 헵텐을 통해 약물이 접합된 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 것이다.
또 다른 일 예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 안구의 혈관신생성 질환를 예방, 개선, 억제하거나 치료하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 의해 치료 또는 억제될 수 있는 안구의 혈관신생성 질환(ocular neovascular disorder)은 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 홍채 혈관신생(iris neovascularization), 안내 혈관신생(intraocular neovascularization), 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration), 각막 혈관신생(corneal neovascularization), 망막 혈관신생(retinal neovascularization), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 당뇨병성 망막 허혈(diabetic retinal ischemia) 또는 증식성 당뇨병성 망막병증(proliferative diabetic retinopathy) 등이 있다.
구체적으로, 산소 유도 망막병 동물 모델은 미숙아 망막증의 동물 모델이며 (A. Hellstrφm, L.E. Smith, D. Dammann, Retinopathy of prematurity, Lancet. 382 (2013) 1445-57), 레이저 유도 맥락막혈관 신생 동물모델은 습성 노인성 황반변성의 동물모델이며 (V. Lambert, J. Lecomte, S. Hansen, S. Blacher, ML. Gonzalez, et al, Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice, Nat Protoc. 8 (2013) 2197-211) 이 둘은 모두 혈관 신생합성이 중요한 기전으로 발병하는 질환임을 알 수 있다. 또한 증식성 당뇨망막병 (Proliferative diabetic retinopathy) 처럼 혈관 신생합성이 중요한 기전으로 발병하는 병의 치료제로도 사용할 수 있다(Y. Qazi, Mediators of ocular angiogenesis, J. Genet. 88 (2009) 495-515).
또 다른 일 예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 혈관신생성 질환, 예를 들면 암 또는 종양을 예방, 개선, 억제하거나 치료하기 위한 수단을 제공한다. 상기 암은 PDGFR-β가 문제되는 암으로서, 망막 모세포종, 신경교종, 고환암, 유방암, 난소암, 흑색종, 페암, 및 전립선 암을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
또한, mPDGFRb를 발현하는 NIH3T3 과 hPDGFR-β를 발현하는 인간 주피세포(Human pericyte cell)에서 세포 독성을 보여준 것으로 PDGFR-β가 문제되는 질환으로는, 망막 모세포종(retinoblastoma) (Z.K. Goldsmith et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 59 (2018) 4486-4495), 신경교종(glioma) (I. Nazarenko et al., J. Med. Sci. 117 (2012) 99-112), colorectal cancer (S. Fujino et al., Oncol. Rep. 39 (2018) 2178-2184), 고환암 (S. Basciani et al., Endocrinology. 149 (2008) 6226-35), 유방암 (J. Paulsson et al., J. Pathol. Clin. Res. 3 (2017) 38-43), 난소암 (S. Avril et al., Oncotarget. 8 (2017) 97851-97861), 흑색종 (Melanoma), 폐암(lung cancer) 및 전립성암(prostate cancer) (M. Raica et al., Pharmaceuticals (Basels). 3 (2010) 572-599)등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈관신생" 및 "혈관형성"은 서로 바꾸어 쓸 수 있다. 혈관신생 및 혈관형성은 새로운 혈관이 세포, 조직, 또는 기관 내로 발생되는 것을 지칭한다. 혈관형성의 조절은 전형적으로는 특정 질환 상태에서 변화하며, 많은 경우에서, 이 질환과 관련된 병리학적 손상은 변화되거나, 조절되지 않거나 제어되지 않는 혈관형성과 관련된다. 지속적이며 조절되지 않는 혈관형성이 내피 세포에 의한 비정상적 성장을 특징으로 하는 것들을 비롯한 다수의 질환 상태에서 일어나며, 혈관의 누출 및 투과성을 비롯한 이들 상태에서 관찰되는 병리학적 손상을 뒷받침한다.
본 명세서에서 "안구의 혈관신생성 장애" 또는 "안구의 혈관신생성 질환"은 대상(subject)의 눈에서 변화되거나 조절되지 않는 혈관형성을 특징으로 하는 장애를 의미한다. 예시적인 안구의 혈관신생성 장애로는 허혈성 망막병증, 홍채 혈관신생, 안내 혈관신생, 노인성 황반 변성, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 당뇨병성 망막 허혈 또는 증식성 당뇨병성 망막병증 등이 있다.
본 명세서에서 "PDGF" 또는 "혈소판-유래 성장 인자"는 혈관형성 또는 혈관형성 과정에 영향을 주는 포유동물 혈소판-유래 성장 인자를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로 용어 "PDGF"는 반응성 세포 유형에 대한 혈소판-유래 성장 인자 세포 표면 수용체 (즉, PDGF 수용체)의 결합 및 활성화를 통해 DNA 합성 및 유사분열을 유도하는 성장 인자 부류의 구성원들을 지칭한다.
본 발명에서 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타 (platelet-derived growth factor receptor beta, mPDGFR-β)에 대한 항체의 단쇄 가변 단편(single-chain variable fragment, scFv)-카파 불변 영역(kappa constant region, Cκ)-scFv 융합 단백질과 코티닌-듀오카마이신이 항체-약물 접합체 복합체를 형성해 PDGFR-β를 발현하는 세포에 대항하여 세포독성을 유도할 수 있다는 것을 관찰한다. 다수의 항 mPDGFR-Β 항체 후보 물질들을 이중 특이성 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 포맷으로 제조하고 코티닌- 결합 세포 독성 약물을 전달하는 능력을 시험함으로써 항체-약물 접합체 제조에서 항체 선택을 위한 개선된 접근법을 제공한다.
본 발명의 일 예는 합텐(hapten)-약물 접합체 및 이중 특이 항체를 이용하여 약물을 타겟 세포 내로 효율적으로 전달하는 항체를 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예는 상기 선별된 항체와 약물을 포함하는 약물-항체 접합체, 또는 상기 선별된 항체와 약물-헵텐을 포함하는 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 합텐(hapten)-약물 접합체는 표적 세포로 전달하고자 하는 대상 약물과 합텐이 결합된 접합체를 말한다. 상기 합텐은 세포와 결합하는 것을 방지하기 위하여 생체 내에 본래 존재하지 않는 물질이며, 체내에서 생합성 (de novo biosynthesis) 되지 않으며, 생리적 활성도 유발하지 않으며, 접합물질과의 효과적인 결합을 위하여 화학작용기(chemical functional group)를 가져야 한다. 본 발명에 사용 가능한 헵텐은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 코티닌, small molecular weight organic molecules 인 DNP (2,4-dinitrophenol), TNP (2,4,6- trinitrophenol), biotin, 및 digoxigenin 중에서 선택될 수 있다.
상기 합텐의 일 예로서 코티닌은 니코틴 (nicotine) 의 주요대사물로서 외생성 (exogeneity), 비독성, 생리 불확성 (physiological inertness) 때문에 본 플랫폼에서 사용될 이상적인 합텐이며, 시판되는 트랜스-4-코티닌카복실산 (trans-4-cotininecarboxylic) 은 여러 물질에 결합할 수 있다. 코티닌-약물 접합체는 손쉽게 합성 가능하며 순도 또한 기존 항체-약물 접합체보다 높고 다양한 약물과 링커를 가진 코티닌-약물 접합체 조합으로의 합성이 가능 하다. 또한, 약물이 항체에 직접 접합되지 않아, 항체의 친화력과 안정성에 영향을 주지 않는다. 항체-약물 접합체는 이중 항체와 코티닌-약물 접합체를 간단히 반응하는 것으로 만들어진다.
본 발명에 적용 가능한 약물은 항체를 이용하여 표적으로 전달할 대상이며 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 DNA synthesis inhibitor (예, calicheamicin, pyrrolobenzodiazepine (PBD), duocarmyin derivative, anthracycline/Nemorubicin, doxorubicin, Irinotecan, amatoxin), Microtubule inhibitors (예, auristatin, maytansine, tubulysin), Topo-isomerase inhibitor (SN-38), photosensitizer (예, 5-Aminolaevulinic acid (ALA), Benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA), Chlorins, Tetra (m-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC), Lutetium texaphyrin) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 광민감제는 단독으로 약효를 발휘하지는 못하나, 표적 세포나 조직으로 국소적으로 전달되거나 전신에 전달되고, 특정 부위, 예를 들면 안구 또는 눈 등의 병변 부위에 레이저를 조사하여 전달된 약물을 활성화하여 약물의 효능을 발휘시킨다. 따라서, 상기 광민감제는 항체에 접합하여 이를 필요로 하는 대상에 투여한 후에, 레이저를 조사하여 약효를 발휘하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 표적 항원에 결합하는 이중 특이 항체는 약물을 전달할 대상 조직 또는 세포에 존재하는 표적 항원에 특이적으로 결합하고, 합텐-약물 접합체에 포함된 합텐에도 특이적으로 결합할 수 있는 이중 특이 항체일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 적용 가능한 이중항체는, 제1항체-링커-제2항체의 구조를 가질 수 있으며, 상기 제1항체 및 제2항체는 각각 합텐 또는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 제1항체-링커-제2항체 구조는 갖는 이중 특이 항체는, 제1항체(scFv)-Cκ(kappa constant)-제2항체(scFv)의 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, N말단부터 VH-GQSSRSSGGGGSSGGGGS-VL 순서로 결합되며, 상기 링커는 VH의 C말단가 VL의 N말단을 연결한 것이다. (항-PDGFR-β 항체의 scFv)-(GGGGS)3-Cκ-(GGGGS)3-(항-코티닌 항체의 scFv)구조일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 코티딘의 아미노산 서열 또는 염기서열은 본 기술분야에서 널리 알려져 있으며, 예를 들면 US8008448B 등을 참고할 수 있다.
본 발명의 일 예로서, 상기 표적 항원이 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타 (platelet-derived growth factor receptor beta, PDGFR-Β)이고 합텐이 코티닌인 경우, 상기 이중 특이 항체는 표적 항원에 대한 항체 (항-PDGFR-β 항체)와 합텐 (항-헵텐 항체)에 대한 항체를 링커로 연결할 수 있으며, 더욱 자세하게는 제1항체 (항-PDGFR-β 항체의 scFv)- Cκ - 제2항체 (항-헵텐 항체의 scFv) 의 구조를 갖는 융합 단백질일 수 있다.
본 발명자들은 본 플랫폼의 유용성 (feasibility) 을 확인하기 위해 (항-mPDGFR-β 항체의 scFv) - Cκ- (항-코티닌 항체의 scFv) 이중 항체 융합 단백질을 이용한다. 본 발명자들은 일가 (monovalent) 와 이가(bivalent) 코티닌- 듀오카마이신을 제작한다. 이는 코티닌-듀오카마이신 (cot-duo) 과 코티닌-듀오카마이신-코티닌 (cot-duo-cot)으로 명칭한다 (도 1B). 본 발명에서 기존 플랫폼들 대비 항체-약물 접합체 개발을 위한 최적의 항체와 약물 조합을 선별할 수 있음을 확인하였다.
이중 항체 (예, 항-PDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv) 와 합텐-약물 접합체(예, 코티닌-듀오카마이신 접합체)를 포함하는 복합체는, 표적 항원 (예, mPDGFR-β)를 발현하는 NIH3T3 세포주에 특이적 독성을 발휘한다. 본 발명이 항체-약물 접합체 개발에서 바람직한 내재화 항체와 독성 약물의 조합을 선별할 수 있다. 예를 들어, 4개의 항체 클론들은 바닥에 코팅된 mPDGFR-β에 농도 의존적으로 결합하였으며 (도 3a), 음성 대조군으로 코팅된 사람 Fc 단백질에는 결합하지 않았다. 본 발명자들은 유세포측정기를 이용하여 각각 클론들이 mPDGFR-β를 발현하는 NIH3T3 세포 결합능을 확인하였고, 비오틴 (biotin)-mPDGF-β가 세포에 결합하는 것을 확인하였다 (도 4b).
본 발명에 따른 3종류의 마우스 항원에 대한 항체 클론 (PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03)은 mPDGFR-β 의 리간드인 mPDGF-BB와 경쟁하여 mPDGFR-β 의 도메인 2 또는 3에 결합할 것이다. 하나의 항체 클론 (PRb-CN01) 은 mPDGF-BB와 경쟁하지 않아, 도메인 2 및 3 대신에 도메인 1,4, 또는 5에 결합할 것이다. mPDGFR-β 에 대한 PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03의 결합능은 mPDGF-BB가 억제하였으나(도 4a), PRb-CN01의 결합능은 mPDGF-BB가 억제하지 못하였다. 본 발명자들은 유세포측정법을 이용하여 mPDGFR-Β를 발현하는 NIH3T3 세포에 mPDGF-BB가 존재할 때 각 클론들의 세포 결합능을 측정하였고, 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 비오틴-mPDGF-BB가 세포에 결합하는 것을 확인하였다. 경쟁 효소면역측정법과 동일하게, PRb-CN01만 mPDGF-BB-biotin이 있을 시 mPDGFR-β에 결합이 가능하였으며 (도 4b), 다른 3종류 클론들의 결합능은 mPDGF-BB에 의해 방해되었다.
본 발명에 있는 항체들이 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 형태로 발현되었을 때, 이중 항체는 mPDGFR-Β 와 코티닌 2개 모두 결합 가능하다. 또한, 이중 항체는 코티닌-듀오카마이신 (cot-duo) 과 코티닌-듀오카마이신-코티닌 (cot-duo-cot) 과 같은 여러 코티닌 약물과 접합체를 만들 수 있다. Cot-duo와 cot-duo-cot와 같은 복합체들로 독성 실험을 진행할 시, 복합체들은 독성을 지닌다. 4 개의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (PRb-CC01, PRb-CN01, PRb-CC02, PRb-CC03) 은 대조 이중 항체와 다르게 mPDGFR-Β와 코티닌에 동시 결합 가능하였다 (도 3d).
4 종류의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv와 코티닌-듀오카마이신 접합체들의 독성을 평가하기 위해, NIH3T3 세포는 접합체들과 mPDGF-BB의 유/무 2가지 조건으로 배양하였고 세포 내 삼인산아데노신 (ATP) 으로 상대적 세포 생존력을 측정하였다. PRb-CN01와 cot-duo 또는 cot-duo-cot 복합체의 독성은 mPDGF-BB를 넣었을 때도 높았지만, mPDGF-BB와 경쟁하는 (PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03) 융합 단백질과 cot-duo 또는 cot-duo-cot 복합체의 독성률은 mPDGF-BB를 넣었을 때 줄어들었다 (도 5).
발명은 scFv-Cκ-scFv 이중 항체 융합 단백질와 코티닌-듀오카마이신 (cot-duo)을 각각 제조하고(도. 1b). 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 와 코티닌-듀오카마이신 접합체를 제조하고 독성 실험을 수행한 결과, hPDGFR-β를 발현하는 인간 주피세포에서 특징적 독성을 발휘하였다. 본 발명의 결과는 기존 플랫폼들 대비 항체-약물 접합체 개발을 위한 최적의 항체와 약물 조합을 선별할 수 있음을 나타낸다.
예를 들어, 본 발명에 따른 표적 항원의 일 예인 hPDGFR-β에 결합하는 3개의 항체 클론들은 hPDGFR-β에 농도 의존적으로 결합한다는 것을 보여주었다. 3개의 융합 단백질들은 바닥에 코팅된 hPDGFR-β에 농도 의존적으로 결합하였으며 (도. 12a), 음성 대조군으로 코팅된 사람 Fc 단백질에는 결합하지 않았다 (도. 12b). 본 발명은 각각 클론들이 hPDGF-BB가 존재할 때 hPDGFR-β를 발현하는 인간 주피세포 결합능을 유세포측정기를 이용하여 확인하였고, 비오틴 (biotin)-hPDGF-BB 가 세포에 결합하는 것을 확인하였다(도 13b).
본 발명에 따른 3종류의 hPDGFR-β에 대한 항체 클론 (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26)은 hPDGFR-β의 리간드인 hPDGF-BB와 경쟁하지 않아 도메인 2,3 대신 도메인 1,4,5 에 결합할 것이다. hPDGFR-β에 대한 PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26의 결합능은 hPDGF-BB가 억제하지 못하였다 (도. 13a).
본 발명은 hPDGFR-Β를 발현하는 인간 주피세포에 hPDGF-BB가 존재할 때 각 클론들의 세포 결합능을 유세포측정법을 이용하여 측정하였고, 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 비오틴-hPDGF-BB가 세포에 결합하는 것을 확인하였다. 경쟁 효소면역측정법과 동일하게, 3종류의 항체 클론 (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26) 이 hPDGF-BB-biotin이 있을 시 hPDGFR-Β에 결합이 가능하였다 (도. 13b).
본 발명에 따른 표적 항원에 대한 항체는, 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 형태로 발현되었을 때, 이중 항체는 표적 항원과 합텐에 모두 결합가능 하며, 구체적으로 항원인 hPDGFR-β 와 합텐인 코티닌에 모두 결합 가능하다. 또한, 이중 항체는 코티닌-듀오카마이신 (cot-duo) 과 같은 여러 코티닌-약물 접합체와 복합체를 만들 수 있다. Cot-duo와 같은 접합체들로 독성 실험을 진행할 시, 상기 복합체들은 독성을 지닌다.
본 발명에 따른 인간 PDGFR-β에 대한 3 개의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26) 은 대조 이중 항체와 다르게 hPDGFR-β와 코티닌에 동시 결합 가능하였다 (도 12d). 3 종류의 hPDGFR-β 항체를 이용한 이중 항체 scFv-Cκ-scFv와 코티닌-듀오카마이신 접합체들의 독성을 평가하기 위해, 인간 주피세포는 접합체들과 hPDGF-BB의 유/무 2가지 조건으로 배양하였고 세포 내 삼인산아데노신 (ATP) 으로 상대적 세포 생존력을 측정하였다. 상기 항-hPDGFR-β 항체인, PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26와 cot-duo 복합체의 독성은 hPDGF-BB를 넣었을 때도 높았다 (도 14a, 및 도 14b).
본 발명자들은 최적의 항체-약물 접합체 항체와 약물을 선별하기 위한 과정을 단순화하는 이중 특이성 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 코티닌-세포독성 약물로 구성된 새로운 항체-약물 접합체 개발 플랫폼을 시험하였다. 이상적으로는, 효율적인 내재화와 세포독성 약물 방출을 보장하는 항체를 선택하는 것이 실용적이다. 그러나 후보 항체를 이용한 개별 항체-약물 접합체 분자의 생성은 DAR (약물-항체 비율)을 포함해 최적화 및 특성화 하기 위한 상당한 작업이 필요하기 때문에, 항체는 초기 선별 단계에서 내재화의 속도와 효율성을 기준으로 선별되어 왔다. 더욱이, 항체-약물 접합체가 세포에 작용하는 과정에 대한 이해가 증가하면서 항체의 내재화가 항체-약물접합체의 효능을 결정하는 유일한 요인이 아님을 알 수 있다.
코티닌은 독성이 없으며 쥐에서 4 ± 0.1 g/kg의 LD50 값을 갖는다. 게다가, 4일 연속 최대 1,800 mg의 코티닌을 처리한 사람에게서 해로운 부작용은 유발되지 않았다. 본 발명자들은 생체 외 환경에서 자유 듀오카마이신과 코티닌-듀오카마이신 접합체의 세포독성 사이에는 약간의 차이가 있음을 관찰했다. 항-HER2 x 코티닌 scFv-cκ-scFv 융합 단백질과 코티닌-듀오카마이신 결합체 사이의 복합체 형성은 생체 외 환경에서 듀오카마이신의 독성을 낮춰 이중 항체가 약물과 함께 복합체를 형성하여 세포로의 약물 흡수를 감소시켰음을 암시한다. 이전 연구에서 듀오카마이신이 마우스에게 상당한 체중감소를 유도한다고 보고된 바 있으나, 본 발명에 따른 4 가의 이중 특이성 항체를 사용하는 생체 내 실험에서는 음성 대조군 IgG와 혼합된 코티닌-듀오카마이신 결합체를 주입한 마우스에게서 유의미한 체중 감소를 보이지 않았다. 이러한 사실은 코티닌과 독성 약물(듀오카마이신) 사이에 다양한 형태의 링커를 도입하고, 종양 환경에서만 metalloprotease (금속단백질분해효소) 와 같이 코티닌으로부터 독소를 방출할 수 있는 가능성을 열어준다. 코티닌-약물 접합체는 종양 환경에서 분해 없이 방출되기 때문에 정상 세포를 손상시키지 않고 혈류에서 빠르게 제거될 것이다.
mPDGF-BB를 추가한 후에도 cot-duo 또는 cot-duo-cot와 복합체를 이룬 PRb-CN01 함유 이중항체의 세포 독성은 여전히 높았지만, 세포 증식을 촉진하는 mPDGF-BB를 추가하면 mPDGF-BB와 경쟁하는 cot-duo 또는 cot-duo-cot와 복합체를 이룬 3개의 항체 (PRb-CC01, PRb-CC02 및 PRb-CC03) 의 독성이 약간 감소하였다. mPDGF-BB는 이미 PRb-CN01에 결합된 PDGFR-β에 결합하여 수용체의 내재화를 강화하여 cot-duo와 cot-duo-cot의 세포독성 효과를 촉진했을 수 있다. 본 발명에서, PRb-CN01 구조물은 PDGF-BB와 경쟁하지 않고 PDGF-BB와 무관하게 세포독성을 유발하였다(도 5a 내지 도 5d). PDGFR-β는 혈관 신생과 높은 관련이 있으며, 주로 외막 세포 (pericyte) 에서 과발현되어 있다.
본 발명에 따른 PDGF 수용체에 대한 항체, 상기 PDGF 수용체에 대한 항체에 화학 요법제를 접합한 항체-약물 접합체 및 이를 이용한 안구의 혈관신생성 질환의 예방 또는 치료용도에서, PDGF 수용체에 대한 항체는 해당 농도에서는 정상 세포 또는 정상 조직에는 독성을 최소화 하면서 hPDGFR-β가 많이 발현 되는 병적인 세포 또는 조직에 특이적으로 더 많은 독성을 보여 우수한 치료제로 사용될 수 있으며, 또한 PDGFR-β 발현 수준 증가 및/또는 PDGF-BB의 발현 수준이 증가하더라도 항체의 내재화 수준이 억제되지 않거나 내재화가 더욱 증가하는 장점이 있다.
도 1a 및 도 1b은 본 발명의 일 예에 따른 항-mPDGFR-β항체에 관한 이중 항체와 코티닌-듀오카마이신를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 항-mPDGFR-β 항체에 관한 이중 특이 항체를 SDS-polyacrylamide 겔 전기영동의 결과를 나타낸다. Lane 1, reduced PRb-CC03 x 코티닌; Lane 2, non-reduced PRb-CC03 x 코티닌; Lane 3, reduced PRb-CC01 x 코티닌; Lane 4, non-reduced PRb-CC01 x 코티닌; Lane 5, reduced PRb-CN01 x 코티닌; Lane 6, non-reduced PRb-CN01 x 코티닌; Lane 7, reduced PRb-CC02 x 코티닌; Lane 8, non-reduced PRb-CC02 x 코티닌; Lane 9, reduced 항-HER2 x 코티닌 (대조군); Lane 10, non-reduced 항-HER2 x 코티닌 (대조군). M:분자량 마커.
도 3a는 본 발명의 일 예에 따른 항-mPDGFR-β항체에 관한 이중 항체의 결합능을 나타내는 그래프로서 mPDGFR-β 키메라가 코팅된 판에 이중 항체인 PRb-CC01 (●); PRb-CN01 (■); PRb-CC02 (▲); PRb-CC03 (▼); negative control (◆)을 반응하였다. 각 웰에는 HRP-항 사람 Cκ 항체 그리고 TMB 를 반응하였다. 결과는 2 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다. 도 3b는 TNF-α 수용체 세포 외 영역-사람 Fc 융합 단백질은 효소면역측정법의 음성 대조 항원으로 사용되었다. 도 3c는 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 코티닌에 대한 결합능을 확인하기 위해, 코티닌-BSA가 코팅된 판에 이중 항체 scFv-Cκ-scFv를 반응하였고, HRP- 항 사람 Cκ 항체와 TMB를 처리하였다. 도 3d는 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 코티닌과 mPDGFR-β에 대한 동시 결합능을 확인하기 위해, 코티닌-BSA가 코팅된 판에 mPDGFR-β-Fc 키메라를 반응하고, HRP- 항 사람 Fc 항체 그리고 TMB를 처리하였다. 결과는 3 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다. 대조군에 비교하여 ***p < 0.001 이다.
도 4a 내지 도 4c는 PDGF-BB와 항-mPDGFR-β항체에 관한 이중항체의 경쟁과 세포 내로 내재화를 확인한 그래프이다. 도 4a는 PDGFR-β-Fc 키메라가 코팅된 판에 scFv-Cκ-scFv를 mPDGF-BB (100 nM) 를 첨부하지 않았거나 (왼쪽) 첨부하여 (오른쪽) 반응한 다음, 결합하고 있는 이중 항체 융합 단백질은 HRP-항-사람 Cκ 항체와 TMB로 측정하였다. 도 4b는 mPDGFR-β를 발현하는 NIH3T3 세포에 유세포 분석 버퍼에 있는 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (100 nM) 을 mPDGF-BB-biotin 유/무로 반응하였다. 세포에는 APC-항 사람 Cκ 항체와 streptavidin-PE를 처리하였다. 이중 항체인 항-HER2 x cotinine scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다. 공초점현미경은 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 내재화를 영상화하였다. NIH3T3 세포에 융합 단백질을 처리 후, 세포 표면에 결합하고 있는 항체들을 제거하였다. 세포 고정 후, 융합 단백질은 FITC- 항 사람 Cκ 항체 (초록색) 로 염색하였다. 초기 엔도좀을 이미지화하기 위해, 세포들은 항-Rab5 항체와 Alexa Fluor 546-염소 항-토끼 항체 IgG (빨간) 로 염색되었다. 화살표로 표시된 부분은 확대된 부분을 보여주면서 항-PDGFR-β x 코티닌의 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 초기 엔도좀의 형광이 공동화 되어있는 부분을 보여준다. DNA는 DAPI (파란색) 로 염색되었다 (Scale bar, 10 μm).
도 5a 내지 도 5d는 PDGFR-β를 발현하는 세포에 대해 항-mPDGFR-β 에 대한 이중 항체와 코티닌-듀오카마이신 복합체들의 세포 독성능을 확인한 그래프이다. 도 5a는 NIH3T3 세포들은 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 cot-duo 복합체를 mPDGF-BB 없이 처리하였다. 세포 ATP는 상대적 세포 생존률을 평가하기 위해 측정하였다. 이중 항체 항-HER2 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다. 도 5b는 mPDGF-BB가 있는 조건으로 실험이 반복되었다. 도 5C는 NIH3T3 세포는 이중 항체와 cot-duo-cot의 복합체를 mPDGF-BB 없이 처리하였다. 도 5d는 mPDGF-BB가 있는 조건으로 실험이 반복되었다. DMSO는 cot-duo와 cot-duo-cot의 복합체 대조군으로 사용되었다. 결과는 3 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다.
도 6는 PDGFR-β를 발현하지 않는 MOLT-4 세포에 대한, 본 발명에 따른 항-mPDGFR-Β항체에 관한 이중 항체의 결합능을 유세포분석기로 실험한 그래프이다. MOLT-4 세포에 이중 항체 (100 nM)를 처리하고 APC- 항 사람 Cκ 항체 (clone TB28-2, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 염색하였다.
도 7는 PDGFR-β를 발현하지 않는 세포에 대해 항-mPDGFR-Β항체에 관한 이중 항체와 cot-duo 복합체들의 세포 독성능을 확인한 그래프이다. 도 7의 (A)에서 MOLT-4 세포에 이중 항체 및 cot-duo의 복합체 (DAR4)를 반응했다. 상대적 세포 생존률을 평가하기 위해 세포 ATP를 측정하였다. 도 7의 (B)에서 MOLT-4 세포에 이중 항체 및 cot-duo의 복합체 (DAR2) 를 반응하였다. 이중 항체인 항-HER2 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 는 음성 대조군으로 사용되었다. DMSO는 코티닌-듀오카마이신의 부형체 대조군으로 사용되었다. 결과는 3 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따른 항-mPDGFR-β 항체에 관한 이중 항체의 크기배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) 결과이다. 본 발명에 따른 이중 항체, 이중 항체 및 cot-duo의 복합체, 이중 항체 및 cot-duo-cot의 복합체들은 Sepax SRT-C SEC-300 칼럼이 장착되어있는 Dionex Ultimate 3000을 이용한 크기배제 크로마토그라피-HPLC로 분석하였다. 이동상은 PBS로 사용하고 15분 동안 1mL/min으로 이동용매를 용출 하였다. 자외선 검출기는 254 nm로 조절되어 있고 결과는 mAU로 모니터링하였다. HMW는 high molecular weight species이다.
도 9는 본 발명에 따른 항-mPDGFR-β항체에 관한 이중 항체 및 cot-duo 복합체들이 산소 유도 망막병 동물모델에서 신생혈관증식을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 항-mPDGFR-Β항체에 관한 이중 항체 및 cot-duo 복합체들이 레이저 유도 맥락막혈관신생 동물모델에서 신생혈관증식을 억제함을 보여준다.
도 11은 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체로서 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 SDS-polyacrylamide 겔 전기영동한 결과이다: Lane 1, reduced PRb-CN16 x 코티닌; Lane 2, non-reduced PRb-CN16 x 코티닌; Lane 3, reduced PRb-CN26 x 코티닌; Lane 4, non-reduced PRb-CN26 x 코티닌; Lane 5, reduced PRb-CN32 x 코티닌; Lane 6, non-reduced PRb-CN32 x 코티닌; Lane 7, reduced 항-mCD154 x 코티닌 (대조군); Lane 8, non-reduced 항- mCD154 x 코티닌 (대조군). M, molecular weight marker.
도 12a는 hPDGFR-β 키메라가 코팅된 판에 여러 농도의 이중 항체인 PRb-CN16 (●); PRb-CN32 (■); PRb-CN26 (▲); negative control (◆) 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 반응하였다. 도 12b는 각 웰에는 HRP-항 사람 Cκ 항체 그리고 TMB 를 반응한 결과로서, 결과는 2 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다. 도 12c는 TNF-α 수용체 세포 외 영역-사람 Fc 융합 단백질은 효소면역측정법의 음성 대조 항원으로 사용되었다. 도 12d는 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체의 코티닌에 대한 결합능을 확인하기 위해, 코티닌-BSA가 코팅된 판에 이중 항체 scFv-Cκ-scFv를 배양하였고, HRP- 항 사람 Cκ 항체와 TMB를 처리하였다. 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체의 코티닌과 hPDGFR-β에 대한 동시 결합능을 확인하기 위해, 코티닌-BSA가 코팅된 판에 hPDGFR-Β-Fc 키메라를 배양하고, HRP- 항 사람 Fc 항체 그리고 TMB를 처리하였다. 결과는 3 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다. 대조군에 비교하여 ***p < 0.001 이다.
도 13a 내지 도 13d는 PDGF-BB와 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체의 경쟁과 세포 내로 내재화를 확인한 그래프이다. 도 13a는 hPDGFR-β-Fc 키메라가 코팅된 판에 scFv-Cκ-scFv를 hPDGF-BB (100 nM) 를 첨부하지 않았거나 (왼쪽) 첨부하여 (오른쪽) 배양한 다음, 결합하고 있는 이중 항체 융합 단백질은 HRP-항-사람 Cκ 항체와 TMB로 측정하였다. 도 13b는 hPDGFR-β를 발현하는 인간 주피세포에 유세포 분석 버퍼에 있는 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (100 nM) 을 hPDGF-BB-biotin 유/무로 배양하였다. 세포에는 APC-항 사람 Cκ 항체와 streptavidin-PE를 처리하였다. 이중 항체 항-mCD154 x cotinine scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다. 도 13c는 공초점현미경은 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 내재화를 영상화 하였다. 인간 주피세포에 융합 단백질을 처리 후, 세포 표면에 결합하고 있는 항체들을 제거하였다. 세포 고정 후, 융합 단백질은 FITC- 항 사람 Cκ 항체 (초록색) 로 염색하였다. 초기 엔도좀을 이미지화하기위해, 세포들은 항-Rab5 항체와 Alexa Fluor 546-염소 항-토끼 항체 IgG (빨간색) 로 염색되었다. 화살표로 표시된 부분은 확대된 부분을 보여주면서 항-hPDGFR-Β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 초기 엔도좀의 형광이 공동화 되어있는 부분을 보여준다. DNA는 DAPI (파란색) 로 염색되었다. Scale bar, 10 μm. 도 13d는 hPDGF-BB를 넣고 반복되었다.
도 14a 및 도 14b는 PDGFR-β를 발현하고 있는 세포에 대해 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체/cot-duo 복합체들의 세포 독성능을 확인한 그래프이다. 도 14a의 그래프는 인간 주피세포들은 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 cot-duo 복합체를 처리하였다. 도 14b의 그래프는 hPDGF-BB가 있는 조건으로 실험이 반복되었다. 세포 ATP는 상대적 세포 생존률을 평가하기 위해 측정하였다. 이중 항체 항-mCD154 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다. DMSO는 cot-duo의 부형체 대조군으로 사용되었다. 결과는 3 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다.
도 15는 hPDGFR-β를 발현하지 않는 세포에 대한 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체의 결합능을 유세포분석기로 실험한 그래프이다. A-431 세포는 이중 항체(항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질) (100 nM) 을 처리하고 APC- 항 사람 Cκ 항체 (clone TB28-2, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 염색하였다.
도 16은 hPDGFR-β를 발현하지 않는 세포에 대해 본 발명에 따른 항-hPDGFR-Β항체에 관한 이중 항체와 cot-duo 복합체들의 세포 독성능을 실험한 그래프이다. A-431 세포에 이중 항체/cot-duo 복합체 (DAR4) 를 반응하였다. 세포 ATP 는 상대적 세포 생존률을 평가하기 위해 측정되었다. 이중 항체 항-mCD154 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 는 음성 대조군으로 사용되었다. DMSO는 코티닌-듀오카마이신의 부형체 대조군으로 사용되었다. 결과는 3 번 반복 실험의 평균값 ± 표준오차를 보여준다.
도 17은 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체의 종간 반응을 실험한 그래프이다. hPDGFR-β, mPDGFR-β, 레서스 PDGFR-β, 사이노몰구스 PDGFR-β, 수스스크로파 PDGFR-β 및 대조군 Fc 코팅된 마이크로타이터 플레이트에, 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체(100nM)와 반응하고, 결합된 이중 항체의 양을 HRP 접합된 항-사람 Cκ 항체 및 TMB를 사용하여 측정하였다.
도 18은 mPDGFR-β를 발현하는 NIH3T3 세포에 유세포 분석 버퍼에 있는 이중 항체 scFv-C
Figure 112019102151712-pat00001
-scFv 융합 단백질 (100 nM) 을 배양하였다. 세포에는 APC-항 사람 Cκ 항체를 처리하였다. 이중 항체인 항-HER2 x cotinine scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다.
도 19a 내지 도 19b는 PRb-CN01 대리 항체(surrogate antbody)에 관한 경쟁을 확인한 결과이다. 도 19a는 mPDGFR-β-hFc 키메라 단백질이 코팅된 판에 3% BSA/PBS에 희석된 여러 농도의 PRb-CN01-토끼Fc (0.01 nM - 1μM)과 PRb-CN01, 항-HER2 대조 항체, PRb-CN32 이중항체 scFv-Cκ-scFv (100 nM)을 각 웰에 37 ℃ 온도에서 2시간동안 반응한 다음, 결합하고 있는 PRb-CN01-토끼 Fc 단백질은 HRP-항 토끼 Fc 항체와 ABTS로 측정하였다. 도 19b는 mPDGFR-β를 발현하는 NIH3T3 세포에 PRb-CN01-토끼 Fc (50 nM)과 PRb-CN01, 대조 항체, PRb-CN32 이중항체 scFv-Cκ-scFv (1μM)를 반응하였다. 세포에는 FITC-항 토끼 Fc 항체를 배양하였다. 이중 항체인 항-HER2 x cotinine scFv-Cκ다.
도 20a 내지 도 20b는 PDGFR-β를 발현하는 세포에 대해 PRb-CN01과 PRb-CN32 이중 항체와 코티닌-듀오카마이신 복합체들의 세포 독성능 차이를 확인한 그래프이다. 도 20a는 NIH3T3 세포들은 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 cot-duo 복합체를 mPDGF-BB 없이 처리하였다. 세포 ATP는 상대적 세포 생존률을 평가하기 위해 측정하였다. 이중 항체 항-HER2 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다. 도 20b는 mPDGF-BB가 있는 조건으로 실험이 반복되었다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. mPDGFR-β 및Cκ 융합 단백질의 발현 및 정제
mPDGFR-β의 세포 외 영역은 하기 표에서 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이며 이를 암호화하는 염기서열을 제조하고, 상기 염기서열의의 말단 쪽에 SfiI 제한효소 서열을 넣어 합성하였고 (진스크립트 바이오택, 장수썽, 중국), SfiI 효소로 절단하여 pCEP4 벡터에 클로닝하여 재조합 pCEP4 발현 벡터를 제조하고, 기존에 보고된 방법으로 발현하였다 [Y. Lee, H. Kim et al., Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114].
명칭 아미노산 서열정보 SEQ ID NO
hPDGFR-β MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFSGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFK 60
mPDGFR-β LVITPPGPEFVLNISSTFVLTCSGSAPVMWEQMSQVPWQEAAMNQDGTFSSVLTLTNVTGGDTGEYFCVYNNSLGPELSERKRIYIFVPDPTMGFLPMDSEDLFIFVTDVTETTIPCRVTDPQLEVTLHEKKVDIPLHVPYDHQRGFTGTFEDKTYICKTTIGDREVDSDTYYVYSLQVSSINVSVNAVQTVVRQGESITIRCIVMGNDVVNFQWTYPRMKSGRLVEPVTDYLFGVPSRIGSILHIPTAELSDSGTYTCNVSVSVNDHGDEKAINISVIENGYVRLLETLGDVEIAELHRSRTLRVVFEAYPMPSVLWLKDNRTLGDSGAGELVLSTRNMSETRYVSELILVRVKVSEAGYYTMRAFHEDDEVQLSFKLQVNVPVRVLELSESHPANGEQTIRCRGRGMPQPNVTWSTCRDLKRCPRKLSPTPLGNSSKEESQLETNVTFWEEDQEYEVVSTLRLRHVDQPLSVRCMLQNSMGGDSQEVTVVPHSLPFK 61
사이노몰구스 PDGFR-β MRLPGAMPALALKGQLLLLPLLLLLEPQVSQGLVITPPGPELILNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQELPQEMAKAQDNTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTYNDSRGLEPDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDIALPVPYDHQRGFSGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWMYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGALQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPMLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDMQEVIVVPHSLPFK 62
수스스크로파 PDGFR-β MQLPRAVPASVLIGQVLLLPPLLLLGPQASWGLVITPPGPELVLNLSSTFVLTCSGPAPVVWERMSQKPPQEMTGTQDGTFSSVLTLANVTGLDTGEYFCTYKGSPGLEASERKRLYIFVPDPAVGFLPVDPEELFIFLTEITETTIPCRVTDPRLVVTLHEKKVDVPLPISYDHQRGFSGTFEDKTYVCKTTIGDREVDSDAYYVYSLQVSSINVSVGAVQTVVRQGENITVMCIVTGNEVVNFEWTYPRLETGRLVEPVTDFLFEMPHIRSILHIPSAELGDSGTYICNVSESVSDHRDEKAINVTVVESGYVRLIGELDAVQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVIWFKDNRTLGDSGAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGRYTMRAFHEDAEAQISFQLQVNVPVRVLELSESHPASGEQTVRCRGRGMPQPHLTWSTCSDLKRCPRELPPTPLGNSSEEESQLETNVTYWPQEQEFEVVSTLRLRRVDQPLSVRCTLHNLLGHDAQEVTVVPHSLPFQ 63
구체적으로, 상기 재조합 pCEP4 발현 벡터는 기존에 보고된 방법으로 [S.E. Reed et al., J. Vriol. Methods. 138 (2006) 85-98] polyethyleneimine (Polysciences, Warrington, PA, USA) 을 이용하여 사람 태아 신장 293F 세포주 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 에 형질 도입 하였다. 형질 도입된 세포들은 10,000 IU/L 페니실린과 100mg/L 스트렙토마이신을 포함한 GIBCO Freestyle 293 발현 배지에서 배양되었다 [S. Yoon et al., J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 140 (2014) 227-33]. 형질 도입 6일 후, 배양 상층액을 수집해서 제조사의 지시대로 KappaSelect 레진 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 을 이용하여 친화성 크로마토그래피 방법으로 mPDGFR-β-Cκ 융합 단백질을 정제하였다. 상기 융합단백질에서 mPDGFR-β 아미노산 서열은 mPDGFR-β의 32번째Leu 내지 530번째 Lys이며 이는 세포외 영역에 해당하며, mPDGFR-β 아미노산 서열의 C말단에 C
Figure 112019102151712-pat00002
는 링커-(GGGGS)3를 통해 연결된 구조를 갖는다.
실시예 2. 이중 항체 (scFv-Cκ-scFv)의 발현 및 정제
2-1: 복합 scFv를 발현하여 파지 라이브러리 제작 및 바이오 패닝
항-mPDGFR-β 항체는 면역된 닭에서 만들어진 scFv를 표면에 발현하는 파지 라이브러리에서 선별되었다.
상기 실시예 1에서 얻은mPDGFR-β-Cκ 융합 단백질로 닭을 총 4번 면역하였다. 면역 전과 면역 도중에 날개 정맥에서 채혈하여 얻은 혈청으로 효소면역측정법과 유세포측정기로 동물의 면역 상태를 확인하였다. 4번째 면역화 1주일 후 희생하고, 비장, 파브리시우스낭 및 골수를 수확하여 TRI reagent (Invitrogen) 를 이용하여 RNA를 분리하였다.
상기 분리된 RNA를 주형으로 하여Superscript® III First-Strand Synthesis system (Invitrogen) 을 이용하여 cDNA를 합성한 후 scFv를 발현하는 파지 라이브러리를 기존에 보고한 방법대로 제작하였다 [M.S. Lee et al., Hybridoma (Larchmt). 27 (2008) 18-24]. 즉, 해당 cDNA를 이용하여 7.5 Х 108, 6.9 Х 108, 2.1 Х 109, 2.2 Х 109 scFv를 발현하는 파지 라이브러리를 총 4개 제작하였다. 해당 라이브러리로 mPDGFR-β-Cκ 가 결합되어있는 자성비드에 총 5회의 바이오 패닝을 진행하였다 [Y. Lee et al., Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114].
5차 배출가 (output titer) 에서 scFv 클론들을 무작위로 선별하여 mPDGFR-β-Cκ 가 코팅된 마이크로티터 판 (3690; Corning Life Sciences, Corning, NY, USA) 에 대하여 파지 효소면역측정법을 진행하였다[C.F. Barbas III, D.R. Burton, J.K. Scott, G.J. Silverman, Phage display- a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001].
mPDGFR-β-Cκ에 결합능 (A405 > 1.5) 이 있는 클론들은 마크로젠에 의뢰하여OmpSeq 프라이머로 서열분석을 진행하였다 [W. Yang et al., Exp. Mol. Med. 49 (2017) e308]. 아미노산 서열을 확인한 후, 총 9 종류의 항체 클론들을 찾았다(표 3). 발현률과 결합능을 고려하여 총 4 개의 클론(PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03)을 선택하고 선택된 클론들에 대해 추후 실험들을 진행하였다.
하기 표 4는 항-mPDGFR-β scFv 클론들의 H-CDR3 아미노산 서열이다. 상기 얻어진 4가지 클론에 대한 VH 및 VL과 이들의 CDR 아미노산 서열 정보를 상기 표 1에 나타낸다.
Clone H-CDR3 sequences 서열번호
PRb-CN01 GVGSWAHGGRIDA 3
PRb-CC01 GGGSIDA 11
PRb-CC02 GYAGTIDA 19
PRb-CC03 SSYIDT 27
2-2: 이중 항체 (scFv-C
Figure 112019102151712-pat00003
-scFv)의 발현 및 정제
실시예 1에서 제조한 항-mPDGFR-β scFv 클론을 이용하여, (항-mPDGFR-β scFv)-Cκ(항-코티닌 scFv) 이중 특이 항체를 암호화하고 있는 유전자를 포함하는 pCEP4 발현 벡터가 제작되었다.
제조된 (항-mPDGFR-β scFv)-Cκ(항-코티닌 scFv) 이중 특이 항체의 구체적 구조와 각각 링커의 결합 위치는 도 1a에 나타낸다. 구체적으로, 항-mPDGFR-β scFv 및 항-코티닌 scFv 는 각각 N 말단부터 VL-GQSSRSSGGGGSSGGGGS (표 2의 서열번호 57)-VH 순서로 결합되며, 즉 VL 의 C 말단과 VH의 N말단을 연결한 것이다. N 말단부터 항-mPDGFR-β scFv, Ck 및 항-코티닌 scFv이 각각 링커를 이용하여 연결되며, 상기 scFv을 연결한 링커는 표 2의 서열번호 59를 갖는 (GGGGS)3를 사용하고, Ck 아미노산 서열은 표 2의 서열번호 58을 갖는 것을 사용하였다.
이중 특이 항체인 융합 단백질을 제조하는 구체적인 방법으로서, 항-mPDGFR-βscFv을 암호화하는 유전자와 항-코티닌 scfv를 암호화하는 유전자는 SfiI, AgeI, NotI (New England Biolabs) 으로 절단하여 발현 벡터에 연결되었다. 상기 항-mPDGFR-βscFv을 암호화하는 유전자는 N-말단에서 C-말단쪽으로 상기 표 1의 VL -링커-VH 순으로 연결하고 상기 링크는 상기 표 2의 서열번호 57에 기재된 서열을 사용하여 펩타이드를 제조하고 이를 암호화하는 유전자 서열을 얻었다. 상기 항-코티닌 scfv를 암호화하는 유전자는 US8008448B에 기재된 내용에 근거하여 얻었으며, 얻어진 코티딘의 아미노산 서열은 하기 표와 같다.
Part Sequence SEQ ID NO
CDR1-VH GHLRRRDWM 64
CDR2-VH IGRSGDT 65
CDR3-VH IPYFGWNNGDI 66
CDR1-VL QSSQSPYSNEWLS 67
CDR2-VL RISTLAS 68
CDR3-VL AGGYNFGLFLFG 69
VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHLRRRDWMNWVRQAPGKGLEWVAAIGRSGDTYYATWAKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRIPYFGWNNGDIWGQGTLVTVSS 70
VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSPYSNEWLSWYQQKPGKAPKLLIYRISTLASGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGYNFGLFLFGQGTKVEIK 71
항-mPDGFR-β scFv의 대조군으로서 Trastuzumab scFv를 발현 벡터에 클로닝하였다. 이황화 결합 (disulfide bond)에 의한 이합체화 (dimerization)를 배제하기 위해 C
Figure 112019102151712-pat00004
의 C-말단 부분에 있는 시스테인은 배제하였다. 상기 얻어진 DNA 구조물을 HEK293F 세포에 형질도입한 후 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 생산하고, KappaSelect 레진을 이용한 친화 크로마토그래피 방법으로 이중 항체 (scFv-Cκ-scFv)를 정제하였다.
발현된 이중항체의 단백질 순도를 확인하기 위해, NuPage 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지시대로 SDS-polyacrylamide 겔 전기 영동을 진행하였다. 단백질 1 μg을 환원제 유무인 LDS 샘플 버퍼에 넣은 후 95 ℃에서 10분 동안 반응하였다. 그런 후 전기 영동을 진행하고, 단백질을 가시화하기 위해 겔을 Ezway Protein-Blue II staining solution (고마바이오텍, 서울, 한국)으로 염색하였다. SDS-polyacrylamide 겔 전기 영동을 실시하였다(도 2). 상기 전기영동 결과 사진을 도 2에 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 환원제를 사용하여 환원된(reduced) 단백질은 67 kDa이고, 비환원(non-reduced) 단백질은 60 kDa 에서 염색되었다. 컴퓨터로 계산한 융합 단백질의 분자량은 66.77 kDa 이었다. 다량체(Multimeric) 밴드는 보이지 않았다. 비환원 단백질은 촘촘한 고유 형태 때문에 겔 상에서 이동 시 저항을 덜 받아 환원단백질보다 빨리 이동하였을 것이라고 예상된다.
본 발명의 일 예에 따른 항-mPDGFR-β 항체에 관한 이중 항체의 크기배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) 결과인SEC-HPLC (도 8) 에서, PRb-CN01와 다르게 PRb-CC01, PRb-CC02 및 PRb-CC03는 전부 monomeric 과 trimeric밴드가 보였다. Cot-duo과 접합체를 형성하였을 때, PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03 전부 많은 양의 high molecular weight species (HMWs) 가 관찰되었다. PRb-CN01 같은 경우 HMW가 조금 관찰되었다. Cot-duo-cot는 4 개의 클론 전부에게 HMWs를 만들지 않았다.
실시예 3. 항체의 mPDGFR-β 및 코티닌에 대한 결합능 분석(효소면역측정법)
코팅 버퍼 (0.1 M 중탄산염나트륨, pH 8.6) 에 들어있는 100ng의 mPDGFR-β -Fc 키메라 또는TNF-α 수용체 세포 외 영역-사람 Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 판에 4°C O/N 코팅하였다. 각 웰에 3% (w/v) BSA (bovine serum albumin) / PBS 150 μL를 37°C에서 1시간동안 차단제로 배양하였다. 3% BSA/PBS 에 희석된 여러 농도의 닭 혈청 (1:500- 1:62,500) 을 처리한 후 37°C에서 2시간동안 배양하였다. 마이크로타이터 판은 0.05% PBST로 3번 세척 후 horseradish perixodase (HRP)-항 닭 IgY 항체 (Millipore, Billerica, MA, USA) 를 처리하여 37°C에서 1시간동안 배양하였다. 마이크로타이터 판은 다시 한번 0.05% PBST로 세척 후, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid solutions (ABTS) (Pierce, Rockford, IL, USA) 를 이용하여 배양하였다. 그 후 Multiscan Ascent 마이크로플레이트 기기 (Labsystems, Helsinki, Finland) 로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
코팅 버퍼에 들어있는 100ng의 mPDGFR-β-Fc 키메라 또는 TNF-α 수용체의 세포 외 영역-사람 Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 판에 4°C O/N 코팅하였다. 각 웰에 3% (w/v) BSA (bovine serum albumin) / PBS 150 μL를 37℃ 온도 에서 1시간 동안 차단제로 배양하였다. 3% BSA/PBS에 희석된 여러 농도의 이중 항체 (0.06 nM- 1μM) 을 처리한 후 37 ℃ 온도에서 2시간동안 배양하였다. 판은 PBST로 3 번 세척 후 HRP-항 사람 Cκ 항체 (Millipore) 를 사용하여 37 ℃ 온도에서 1시간동안 배양하였다. 판을 PBST로 3 번 세척 후 3,3',5,5'enzidine substrate solution (TMB) (GenDEPOT, Barker, TX, USA) 을 배양하였다. 그 후 Multiscan Ascent 마이크로플레이트기기 (Labsystems) 로 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 발명에 따른 이중 항체와 mPDGF-BB 경쟁을 확인하기 위해서 위에 언급한 것과 같이 마이크로타이터 판에 mPDGFR-β-Fc 키메라를 코팅한 후 블로킹하였다. mPDGF-BB (100 nM) 유/무인 조건에서 여러 농도의 이중 항체 (0.06 nM- 1 μM) 를 판에 처리한 후 2시간동안 37℃ 온도에서 배양하였다. 세척, 배양, 검출은 위에 설명된 효소면역측정법과 동일하게 진행되었다.
mPDGFR-β와 코티닌에 대한 이중 항체 scFv-C
Figure 112019102151712-pat00005
-scFv 융합 단백질 동시 결합능을 확인하기 위해 효소면역측정법을 사용하였다. 4 종류의 이중 특이 항체들은 대조-사람 Fc 단백질에는 결합하지 않고 (도 3b), 농도 의존적으로 mPDGFR―β -Fc 키메라 단백질에 결합하였다 (도 3a).
본 발명에 따른 항-mPDGFR-β항체를 포함하는 이중 항체는 단백질은 코티닌-BSA에 결합능이 있었지만, 대조 이중 항체로서 항-HER2 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 항-HER2 x HER2 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 결합능이 없었다 (도 3c).
코티닌과 mPDGFR-β에 동시 결합능이 있는지 확인하기 위해서 항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 코티닌-BSA가 코팅된 웰에 배양하였다. 각각의 과정마다 세척을 하며 mPDGFR-β-Fc 키메라 단백질, HRP-항 사람 Fc 항체를 순서대로 배양하였다. 다른 대조군들과는 달리 4종류의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv (PRb-CC01, PRb-CN01, PRb-CC02, PRb-CC03)는 mPDGFR-β와 코티닌에 동시 결합하였다 (도 3d).
mPDGF-BB가 항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 결합능에 미치는 영향을 보기 위해 경쟁 효소면역측정법을 개발하였다. 연속 희석된 이중 항체 (항-mPDGFR-β scFv-Cκ 코티닌scFv)에 mPDGF-BB 유/무로 mPDGFR-β-Fc 키메라 융합 단백질이 코팅된 웰에 반응하였다. HRP-항-사람 C 항체를 배양한 다음 TMB를 넣었다. PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03의 mPDGFR-β에 대한 결합능은 mPDGF-BB가 있을 때 저해되었지만 (도 4a), PRb-CN01의 결합능은 저해되지 않아 mPDGF-BB와 비경쟁적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 항체의 세포 내재화 분석(공초점현미경 분석)
이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 내재화의 시각화를 위한 공초점현미경으로 분석하였다. NIH3T3 세포에 10% FBS가 첨가된 DMEM에 희석된 이중 항체 scFv-Cκ-scFv (10 μg/mL) 를 처리하여 30분 동안 37°C 에서 내재화 시켰다. 세포는 차가운 PBS로 3 번 세척 후 세포 표면에 결합해 있는 항체를 제거하기 위해 산성 버퍼 (0.2 M 아세트산, 0.5 M 염화나트륨) 를 5분동안 상온에서 처리하였다. 세포는 차가운 PBS로 2 번 세척하고 10분 동안 4% paraformaldehyde로 고정한 뒤, 사전에 설명 되어있는것과 같이 면역형광염색을 진행하였다 [J.M. Lim et al., J. Cell. Biol. 210 (2015) 23].
간략하게 설명하자면, 비특이반응을 가지는 항체를 차단하기 위해 세포는 5% 말 혈청을 포함한 PBS와 0.1% Triton X-100에 30분 동안 배양하였고, 2 μg/mL FITC-항 사람 Cκ 항체 (TB28-2, BD Biosciences) 를 상온에서 30분동안 첨가 하였다. 초기 엔도좀을 영상화하기 위해 세포들을 PBS로 3 번 세척하고 5% 말 혈청을 포함한 PBS와 0.1% Triton X-100을 30분동안 배양한 뒤, 30분 동안 1:200으로 희석된 항-Rab5 항체 (C8B1, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 배양하고 Alexa Fluor 546 염소 항-토끼 IgG (A-11035, Invitrogen) 를 순차적으로 처리하였다. DNA를 검출하기 위해 세포에 0.2 μg/mL DAPI를 처리하였다. 공초점현미경 영상은 Zeiss LSM 880 microscope을 이용하여 얻었고, 영상들은 Zen 소프트웨어 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 로 분석되었다.
세 가지 종류의 항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 엔도좀을 통해 세포 내재화를 함을 확인하였다.
이중 항체 scFv-Cκ-scFv의 세포 내재화를 측정하기 위해, 항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 NIH3T3 세포에 배양한 후, FITC-항 사람 Cκ 항체와 엔도좀 특이적 항체를 처리하여 공초점현미경을 이용해 영상화 하였다. 세포 내 형광은 PRb-CN01, PRb-CC02, PRb-CC03을 배양한 세포내에서만 확인 가능하였다 (도 4c). PRb-CC01는 내재화되지 않았다. 영상을 합병하였을 때, 본 발명자들은 3개의 항체 클론들과 엔도좀 특이적 항체의 형광이 공동화 한 것을 확인하였다.
실시예 5. 이중 항체의 mPDGFR-β 및 코티닌에 대한 결합능 분석 (유세포 분석)
NIH3T3은 유세포 분석 버퍼 (1% [w/v] BSA/ PBS에 0.05% [w/v] sodium azide) 에 1:100으로 희석된 닭 혈청을 4℃ 에 1시간 동안 배양하고 유세포 분석 버퍼로 4 번 세척하였다. 유세포 분석 버퍼에 있는 Alexa Fluor 488-항 닭 IgY 항체 (703-545-155, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) 를 세포에 처리하였다. 세척 후, FACS Canto II instrument (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 분류하여 분석하였다. 각 측정 때마다 10,000 세포를 확인하였고 결과는 FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA)로 분석하였다. 상기 NIH3T3 세포는 한국세포주은행에서 구매해 10% 소 태아 혈청 (FBS; GIBCO, Grand Island, NY, USA) 과 1% 페니실린, 스트렙토마이신[S. Park et el., Exp. Mol. Med. 44 (2012) 554-61] 을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Welgene, 서울, 한국) 배지에서 배양하여 준비한 것이다.
mPDGF-BB는 제조자 지시에 따라서 biotin-xx microscale 단백질 라벨링 키트 (Invitrogen) 를 이용하여 biotinylation하였다. NIH3T3 세포는mPDGF-BB-biotin (100 nM) 유/무인 2가지 조건에서 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (100 nM) 을 이용하여 4°C에 1시간동안 배양하였다. 세포는 유세포 버퍼로 4 번 세척 후 allophycocyanin (APC)-항 사람 Cκ 항체 (clone TB28-2; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 와 streptavidin-phycoerythrin (PE) (12-4317-87; eBioscience, ThermoFisher) 을 이용하여 배양하였다. 세척 후, FACS Canto II instrument (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 분류하여 분석하였다. 각 측정 때마다 10,000 세포를 확인하였고 결과는 FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) 로 분석하였다. 효소면역측정법과 비슷한 결과대로 mPDGF-BB를 같이 넣어줬을 경우 PRb-CN01만 세포 표면에 존재하는 PDGFR-β에 결합하였다(도 4b). 다른 3개 클론들의 결합능은 mPDGF-BB에 의해 저해되었다.
본 발명자들은 mPDGFR-β를 발현하지 않는 MOLT-4 세포에도 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질들의 결합능을 유세포 실험으로 확인하였다. MOLT-4 세포는 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (100 nM) 을 4 ℃ 온도에 1시간 동안 배양하였다. 위 설명과 같이 세척 후, 검출은 APC-항 사람 Cκ 항체를 처리하여 실험을 진행하였다. 상기 MOLT-4 세포는 한국세포주은행에서 구매해 10% 소태아혈청과 1% 페니실린, 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI-1640 (Welgene, 서울, 한국) 배지에서 배양하여 준비한 것이다. PRb-CN01와 항-HER2 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 항체 둘 다 해당 세포에 결합하지 않는 것으로 확인 하였다 (도 6).
실시예 6. 이중 항체와 코티닌-듀오카마이신 (cot-duo)의 복합체 형성
6-1: 코티닌-듀오카마이신의 복합체 합성
본 발명은 코티닌이 접합된 발린-시트룰린-PAB-듀오카마이신, 발린-시트룰린-PAB-모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 또는 발린-시트룰린-PAB-메일리미도메틸 사이클로헥세인-1-카르복시알레이트 (mcc) mertansine (DM1) 을 제조한다. 본 발명에서 DAR1과 DAR4의 코티닌-세포 독성 약물을 시험해 본 결과 DAR4 코티닌-세포독성 약물이 DAR1보다 더 강력하다는 것을 확인했으며, 또한 듀오카마이신은 코티닌에 결합되었을 때 가장 강력하다는 것을 발견했다. 이러한 이유로, 코티닌-듀오카마이신을 실험에 사용한다.
Trans-4-코티닌 carbonyl-(GSK)4 펩타이드는 펩트론 (대전, 한국) 에서 ASP48S auto peptide synthesizer를 이용하여 Fmoc solid phase peptide synthesis 9SPSS) 로 합성되었다. Trans-4-코티닌 carboxylic acid (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 는 Fmoc-amino acid coupling 방법을 이용하여 펩타이드의 N-말단에 부착되었다.
합성이 완료된 뒤 crude product는 TFA/EDT/thioanisole/TIS/DW (90/2.5/2.5/2,5/2.5 volume) 를 2시간 동안 처리하여 레진에서 떨어뜨렸다. 용액은 차가운 에테르를 사용하여 원심분리를 통해 침전시켰다. 침전물은 공기에 말렸다. Crude product는 ACE 10 C18-300 reverse phase 칼럼 (250 mm x 21.2 mm, 10 μM) 을 이용한 reverse phase HPLC로 정제하였다. 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (Alfa Aesar, Warm Hill, MA, USA) 를 포함한 물-아세토나이트릴 linear gradient (10~75% (v/v) 아세토나이트릴) 로 용출되었다. 정제된 펩타이드 (Cot-(GSK)4 펩타이드) 는 수집되어 건조하였다.
Valine-citrulline p-aminobenzyloxycarbonyl (PAB)-linked dimethylaminoethyl 듀오카마이신은 코티닌-(GSK)4에 존재하는 4개의 라이신의 자유 아미노산에 Levena Biopharma (San Diego, CA, USA)에 의해 연결되었다. Cot-(GSK)4 펩타이드 (3.5 mg, 2 μmol) 는 아세토나이트릴/물 (6/4, v/v, 1mL) 에 녹였다. PAB-dimethylaminoethyl 듀오카마이신 PEG3-valine-citrulline의 NHS ester를 추가하고, saturated aqueous NaHCO3 9 μL를 순차적으로 추가하였다. 혼합물은 상온에서 4시간 동안 혼합해주었고, Phenomenex Gemini® C18-100 Å column (100 mm x 2 mm x 5 μM) 을 이용하는 reverse phase HPLC 기법에 의해 정제되었다. 복합체 (코티닌-[GSK(듀오카마이신)]4, DAR4) 를 "cot-duo"로 명칭 하였다. 이가 코티닌-(GSK)4K는 사전에 설명한 방법으로 듀오카마이신에 연결되었다 [J. Jin et al., Exp. Mol. Med. 50 (2018) 67]. 간략하게, 펩트론사에서 2 개의 trans-4-코티닌 carboxylic acid molecule을 GSKGSKGSKGSKK 의 N-말단에 존재하는 자유 아미노산과 C-말단에 있는 라이신의 epsilon 아미노산에 basic Fmoc-amino acid coupling 방법을 이용하여 연결하였다. Levena Biopharma에서 4개의 PAB-듀오카마이신을 이가 코티닌-GSKGSKGSKGSKK 펩타이드 연결하여 코티닌-[GSK(duocarmycin)]4K-코티닌 (DAR2), cot-duo-cot으로 명칭된 복합체를 만들었다. 도 1a 는 이중 항체의 융합 단백질과 코티닌-듀오카마이신 접합체 (cot-duo, cot-duo-cot)를 나타내고, 도 1b는 cot-duo와 cot-duo-cot의 화학구조를 나타낸다. "R"은 valine-citrulline PAB-linked dimethyl aminoethyl 듀오카마이신이다.
6-2: 이중 항체와 복합체 제조
실시예 2에 따라 PBS에 녹아있는 항-PDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질(15 μM) 은 DMSO에 녹아있는 cot-duo (15 μM) 와 1:1, cot-duo-cot (7.5 μM) 와는 2:1으로 혼합했다. 상온에서 복합체를 형성한 30분 후에, 복합체들은 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지에 5배씩 희석되었다 (25.6 pM - 2 μM).
6-3: 이중 항체와 복합체 형성 확인 (크기배제 크로마토그라피)
복합체 형성을 확인하기 위해, 실시예 2에서 제조한 (항-mPDGFR-Å scFv)-Cκ(항-코티닌 scFv) 이중 항체와 코티닌-듀오카마이신 접합체들을 크기배제 크로마토그라피 및 HPLC를 이용하여 Y-biologics (대전, 한국)가 분석하였다.
상기 분석에는 5 μm 입자에 300 Å 크기의 구멍으로 메워져 있는 Sepax SRT-C SEC-300 칼럼 (7.8 x 300 mm) 이 장착된 Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA) 을 사용하였다. 이동상 (mobile phase) 는 PBS (phosphate-buffered saline)이고, 20 μL 의 샘플 (1mg/mL) 을 주입하고 15분 동안 1mL/min으로 용출액으로 용출하였다. 칼럼의 용출액은 254 nm 에서 mAU 값으로 자외선 검출기로 모니터링 하였다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따른 항-mPDGFR-β 항체에 관한 이중 항체의 크기배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) 결과이다. 본 발명에 따른 이중 항체, 이중 항체 및 cot-duo의 복합체, 이중 항체 및 cot-duo-cot의 복합체들은 Sepax SRT-C SEC-300 칼럼이 장착되어있는 Dionex Ultimate 3000을 이용한 크기배제 크로마토그라피-HPLC로 분석하였다. 이동상은 PBS로 사용하고 15분 동안 1mL/min으로 이동용매를 용출 하였다. 자외선 검출기는 254 nm로 조절되어 있고 결과는 mAU로 모니터링 하였다. HMW는 high molecular weight species이다.
실시예7. PDGFR-β의 발현 세포주에서 항증식성 분석 (세포 독성 실험)
10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 50 μL에 NIH3T3 세포를 넣어 96-웰 판 (CLS3595, Corning) 에 넣고 하룻밤 동안 5% CO2, 37°C 배양기에서 배양하였다. 세포 50 μL가 들어있는 각 웰에 실험예 10에서 얻어진 cot-duo 또는 cot-duo-cot와 복합체를 이룬 항-PDGFR- x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (25.6 pM - 2 μM) 을 50 μL 첨가하여 5% CO2, 37 ℃ 배양기에서 72시간 배양하였다. mPDGF-BB의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 와 코티닌-듀오카마이신 복합체들의 독성 효과를 보기 위해, mPDGF-BB (2 nM) 를 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 와 코티닌-듀오카마이신 복합체 50 μL에 같이 넣었다. 혼합된 복합체들은 NIH3T3 세포가 들어있는 50 μL에 첨부해 주었다.
이중 항체 항-HER2 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv는 대조군으로 사용되었다. 세포에 배양 72시간 후, 제조사의 지시대로 Cell Titer-Glo reagents (Promega Corp., Madison, WI, USA) 를 100 μL씩 모든 웰에 넣어주고, 루미노미터 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) 에서 발광을 측정하였다. 실험은 3 번 반복 진행되었다. 상대적 생존력은 해당 공식으로 계산하였다: [% 생존력 = (실험 웰의 발광- 배경 웰의 발광)/ (대조군의 발광 - 배경 웰의 발광) x 100]. 새로운 배지만 들어있는 웰을 배경 웰로 사용하였다.
항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 항체 코티닌 듀오카마이신 (cot-duo, cot-duo-cot) 복합체들은 PDGFR-β를 발현하는 쥐 섬유모세포에 항증식성 효과가 있음을 확인하였다.
항-mPDGFR-Å x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 이중항체와 코티닌 듀오카마이신 (cot-duo, cot-duo-cot) 복합체들의 독성을 평가하기 위해서, NIH3T3 세포에 복합체들은 mPDGF-BB 유/무 상태로 처리하였고, 세포의 삼인산아데노신을 측정하여 상대적 생존력을 측정하였다. 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 항체의 독성은 IC50 로 표 6 및 도 5에 나타냈다. 하기 표 6은 항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 항체 코티닌 듀오카마이신 복합체의 시험관내 역가와 95% 신뢰구간을 적용하였다.
Figure 112019102151712-pat00006
4 개의 실험된 항체 중, mPDGF-BB 유/무에 상관없이 대조 항-HER2 x cotinine scFv-C
Figure 112019102151712-pat00007
-scFv 대비 PRb-CN01가 가장 높은 독성을 보였다 (p < 0.01; 도 5). PRb-CC02와 PRb-CC03은 대조 항체와 내재화하지 않는 항체 (PRb-CC01)에 대비하여 독성을 보였으나 통계 유의성을 보이지는 않았다. 하지만, mPDGF-BB가 있는 경우 코티닌 듀오카마이신은 PRb-CN01와 복합체를 이룰 때 자유 듀오카마이신보다 통계적으로 유의미하게 독성이 높았다 (p < 0.01). 대조 실험으로 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질와 cot-duo 복합체들을 mPDGFR-β를 발현하지 않는 MOLT-4 세포에 독성 실험을 진행하였다. PRb-CN01는 대조 항체인 항-HER2 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 독성 차이가 없었다 (도 7).
도 5에 나타낸 바와 같이, scFv-Ck-scFv는 항체 농도가 올라가도 세포를 죽이지 않아 IC50값을 구할 수가 없으며, 표6에는 scFv-Ck-scFv 단독의 IC50값을 넣지 않고 scFv-Ck-scFv와 cot-duo 또는 cot-duo-cot을 같이 첨가한 결과를 나타낸다. 또한, MOLT-4세포는 mPDGFR-β를 발현하지 아니하므로 PRb-CN01-약물 복합체와 대조 항체-약물 복합체의 독성 차이가 없다.
실시예 8. 생체내 신생혈관증식능 분석
항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 항체에 cot-duo가 결합된 복합체는 생체 내에서 신생혈관증식을 억제하였음을 확인하였다.
8-1: 산소 유도 망막병 동물실험
출생 후 7 일째 되는 C57BL/6 마우스를 고농도 산소 (75%) 챔버에 5일 동안 사육하며, 12 일차에 정상 산소 사육 시설로 옮기게 되면 미숙아 망막병증의 환경을 조성하게 된다.
생후 14 일째에 이중 항체 scFv-Cκ-scFv, 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 cot-duo의 복합체를 각각 1 nM 및 10 nM 농도로 1 uL씩 유리체강 내로 주사하였다. 혈관을 표지하기 위해 망막 플랫마운트에 isolectin B4-594 (1:100; 121413, Invitrogen) 를 처리하였다.
산소 유도 망막병 동물모델에서 PRb-CN01 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 항체 cot-duo 복합체는 농도 의존적으로 신생혈관증식을 억제하였다 (도 9).
8-2: 레이저 유도 맥락막혈관신생 동물 모델
마우스를 마취시킨 후, 마우스의 망막에 300 um 점 크기로 400 mW 세기, 50 ms 지속시간, 810 nm 파장대의 indirect ophthalmoscope system (ILOODA) 레이저를 조사하여 부르크막 (Bruch's membrane) 의 파괴를 유도하였다.
레이저 조사 4 일 후, 이중 항체 scFv-Cκ-scFv, 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 cot-duo복합체를 각각 10 nM 농도로 1 uL 씩 유리체강 내로 주사하였다. 레이저 조사 7 일 후 안구를 적출하여 망막색소상피-맥락막-공막 조직을 얻은 후 맥락막 신생혈관막의 범위를 확인하기 위하여 Alexa Fluor 594가 결합된 isolectin B4 항체로 면역형광염색을 실시하여, 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 cot-duo복합체에 의한 혈관형성 억제능을 확인하였다. 맥락막 신생혈관막의 범위를 정량적 분석하기 위해, ImageJ 프로그램 (NIH) 을 사용하였다.
레이저 유도 맥락막혈관신생 동물모델에서도 PRb-CN01 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 항체 cot-duo 복합체는 신생혈관증식을 억제하였다 (도 10).
이중 항체 scFv-Cκ-scFv의 독성은 IC50 (최대 억제능의 50%) 로 계산되었고, 통계는 unpaired Student's t-tests 또는 one-way analysis of variance를 사용하였다. Tukey's post hoc multiple comparison test는 이중 항체 scFv-Cκ-scFv끼리의 통계유의성을 보기 위해 사용되었다. p-value 0.05 이하는 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 모든 분석은 Prism v5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) 을 이용하였다.
실시예 9. hPDGFR-β-C
Figure 112019102151712-pat00008
융합 단백질 발현 및 정제
hPDGFR-β, 사이노몰구스 원숭이 PDGFR-β, 수스스크로파 PDGFR-β의 세포 외 영역에 대한 아미노산 서열은 상기 표 3의 서열번호 61, 62 및 63에 나타내며, 다만 레서스 PDGFR-β는 시판되는 항원(Cat: 90215-C02H)를 구매하여 사용하였다. 상기 제조된 염기서열의 말단에 SfiI 제한효소 서열을 넣어 합성하였고 (진스크립트 바이오택, 장수썽, 중국), SfiI 효소로 절단, pCEP4 벡터에 클로닝한 뒤 Cκ 또는 hFc 형태로 기존에 보고된 방법을 사용하여 발현하였다 [Y. Lee, H. Kim et al., Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114, S. Park, D. Lee et al., Clin Chim Acta 411 (2010) 1238].
형질 주입 및 정제는 실시예1의 mPDGFR-β에 따라 수행되었지만, 제조업자의 지시에 따라 단백질 A 겔 친화성 크로마토그래피를 사용하여 hFc 융합 단백질을 정제하도록 변형하였다 (Repligen Corp., Cambridge, MA). 상기 융합 단백질은 hPDGFR-β 아미노산 서열의 C말단에 Cκ는 링커-(GGGGS)3를 통해 연결된 구조를 갖는다.
실시예 10. 이중 항체 (scFv-Cκ-scFv)의 발현 및 정제
10-1: 복합 scfv를 발현하여 파지 라이브러리 제작 및 바이오 패닝
실시예 2의 mPDGFR-β scFv-발현 파지 라이브러리 및 바이오 패닝의 생성과 동일한 방법으로, 실시예 9에서 hPDGFR-β-Cκ 융합 단백질를 이용하여 항-hPDGFR- β scFv-발현 파지 라이브러리를 생성하고 바이오 패닝을 수행하였다.
5 차 배출가에서 scFv 클론들을 무작위하게 선별하여 hPDGFR-β-Cκ가 코팅된 마이크로 타이터 판에 대하여 파지 효소면역측정법을 진행하였다. 아미노산 서열을 확인한 후, 총 3 종류의 항체 클론들을 찾았다 (표 7). 하기 표 7은 항- hPDGFR-β scFv 클론들의 HCDR3 서열이다. 상기 얻어진 3가지 클론에 대한 VH 및 VL과 이들의 CDR 아미노산 서열 정보를 상기 표 2에 나타낸다.
클론 VH-CDR3의 아미노산 서열 서열번호
PRb-CN16 AAGTCYSHSCTGYIDA 35
PRb-CN32 SAGSTYSYWDSDAGLIDA 43
PRb-CN26 RGFMDAGGIDA 51
10-2: 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 발현 및 정제
실시예 2의 항-mPDGFR-β scFv 제작과 동일한 방법에 따라, 실시예 9에서 제조한 항-hPDGFR-β scFv 클론을 이용하여, (항-hPDGFR-β scFv)-Cκ(항-코티닌 scFv) 이중 특이 항체를 암호화하고 있는 유전자를 포함하는 pCEP4 발현 벡터가 제작되었다.
제조된 (항-hPDGFR-β scFv)-Cκ(항-코티닌 scFv) 이중 특이 항체의 구체적 구조와 각각 링커의 결합 위치는 도 1a에 나타낸다. 구체적으로, 항-hPDGFR-β scFv 및 항-코티닌 scFv 는 각각 N 말단부터 VL-GQSSRSSGGGGSSGGGGS (표 2의 서열번호 57)-VH 순서로 결합되며, 즉 VL 의 C-말단과 VH의 N-말단을 연결한 것이다. N 말단부터 항-mPDGFR-β scFv, Ck 및 항-코티닌 scFv이 각각 링커를 이용하여 연결되며, 상기 scFv을 연결한 링커는 표 2의 서열번호 59를 갖는 (GGGGS)3를 사용하고, Ck 아미노산 서열은 표 2의 서열번호 58 갖는 것을 사용하였다.
이중 특이 항체인 융합 단백질을 제조하는 구체적인 방법, 발현된 이중항체의 단백질의 정제 및 순도 확인방법 등은 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다. SDS-polyacrylamide 겔 전기 영동 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11은 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체로서 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 SDS-polyacrylamide 겔 전기영동한 결과이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 환원제를 사용하여 환원된(reduced) 단백질은 레인 1(PRb-CN16 x 코티닌 이중항체), 레인 3 (PRb-CN26 x 코티닌 이중항체), 레인 5 (PRb-CN32 x 코티닌 이중항체)에서 69.0 kDa이고, 환원 단백질은 67 kDa, 비환원 단백질은 60 kDa 에서 염색되었다. 컴퓨터로 계산한 융합 단백질 사이즈는 66.77 kDa 였다. Multimeric 띠는 보이지 않았다.
실시예 11. 이중 항체의 hPDGFR-β와 코티닌에 대한 결합능 분석(효소면역측정법)
코팅 버퍼 (0.1 M 중탄산염나트륨, pH 8.6) 에 들어있는 100ng의 hPDGFR-Å-Fc 키메라 또는 TNF-α 수용체 세포 외 영역-사람 Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 판에 4 ℃ O/N 코팅하였다. 각 웰에 3% (w/v) BSA (bovine serum albumin) / PBS 150 μL를 37 ℃에서 1시간동안 차단제로 배양하였고 항-mPDGFR-Å 면역 닭 혈청 결합능을 실험한 프로토콜을 동일하게 따랐다.
코팅 버퍼에 들어있는 100ng의 hPDGFR-β-Fc 키메라 또는TNF-α 수용체 세포 외 영역-사람 Fc 융합 단백질을 마이크로타이터 판에 4 ℃ O/N 코팅하였다. 각 웰에 3% (w/v) BSA (bovine serum albumin) / PBS 150 μL를 37 ℃ 온도에서 1시간동안 차단제로 배양하였다. 3% BSA/PBS에 희석된 여러 농도의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (0.01 nM- 1μM) 을 처리한 후 항-mPDGFR-β scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 용량-의존적 결합능을 측정한 프로토콜과 동일하게 실험을 진행하였다.
이중 항체 scFv-Cκ-scFv 와 hPDGF-BB 경쟁을 확인하기 위해서, 실시예 3과 같이 마이크로타이터 판에 hPDGFR-β-Fc 키메라를 코팅한 후 블로킹하였다. hPDGF-BB (100 nM; 220-BB; R&D systems) 유/무인 조건에서 여러 농도의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv (0.01 nM- 1 μM) 를 판에 처리한 후 2시간동안 37 ℃ 온도에서 배양하였다. 세척, 배양, 검출은 위에 설명된 효소면역측정법과 동일하게 진행되었다. PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26의 hPDGFR-Å에 대한 결합능은 hPDGF-BB가 있을 때 저해되지않았다 (도 12a).
항-hPDGFR-β scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 교차 종 결합을 시험하기 위해 마이크로타이터 플레이트에 100 ng의 hPDGFR-β, mPDGFR-β, 레서스 PDGFR-β (90215-C02H, Sino Biological Inc., 베이징, 중국), 사이노몰구스 원숭이 PDGFR-β, 수스스크로파 PDGFR-β-Fc 키메라 또는TNF-α 수용체 세포 외 영역-사람 Fc 융합 단백질로 4℃ 온도 O/N 코팅하였다. 웰을 블로킹한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 항-hPDGFR-β scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 및 HRP 접합된 항-사람 Cκ 항체의 순차적 배양이 이어졌다.
hPDGFR-β와 코티닌에 대한 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 동시 결합능을 확인하기 위해 효소면역측정법을 사용하였다. 3 종류의 융합 항체들은 대조-사람 Fc 단백질에는 결합하지 않고 (도 12b), 농도의존적으로 hPDGFR-Å-Fc 키메라 단백질에 결합하였다 (도 12a).
항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 모두와 대조 이중 항체 항-mCD154 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 코티닌-BSA에 결합능이 있었다 (도 12c). 코티닌과 hPDGFR-β에 동시 결합능이 있는지 확인하기 위해서 항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-C
Figure 112019102151712-pat00009
-scFv 융합 단백질을 코티닌-BSA가 코팅된 웰에 배양하였다. 각각의 과정마다 세척을 하며 hPDGFR-β-Fc 키메라 단백질, HRP-항 사람 Fc 항체를 순서대로 배양하였다. 3 종류의 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 hPDGFR-β와 코티닌에 동시 결합하였다 (도 12d).
항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 hPDGF-BB가 있을 경우에도 hPDGFR-β와 코티닌에 동시에 결합할 수 있음을 확인하였다 (도 13a).
항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 교차 종간 결합을 시험하기 위해 효소면역측정법을 사용하였다. 대조군 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 제외한 모든 3개의 클론은 hPDGFR-β, mPDGFR-β, 레서스 PDGFR-β, 사이노몰구스 PDGFR-β, 수스스크로파 PDGFR-β에 성공적으로 결합하였다 (도 17).
도 17은 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β 항체에 관한 이중 항체의 종간 반응을 실험한 그래프이다. hPDGFR-β, mPDGFR-β, 레서스 PDGFR-β, 사이노몰구스 PDGFR-Β, 수스스크로파 PDGFR-β 및 대조군 Fc 코팅된 마이크로타이터 플레이트에, 본 발명에 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체(100nM)와 반응하고, 결합된 이중 항체의 양을 HRP 접합된 항-사람 Cκ 항체 및 TMB를 사용하여 측정하였다.
실시예 12. 이중항체의 세포 내재화 분석(공초점현미경 분석)
인간 주피세포에 10% FBS가 첨가된 주피 생장 배지에 희석된 이중 항체 scFv-Cκ-scFv (10 μg/mL) 를 처리하여 30분 동안 37°C 에서 내재화 시켰다. 실시예 4의 항-mPDGFR-Å x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 공초점현미경의 프로토콜을 동일하게 따랐다. 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질에 hPDGF-BB (50 ng/mL) 를 첨가한 후 동일한 프로토콜을 따라서 공초점현미경 실험이 진행되었다.
항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 엔도좀을 통해 세포내재화를 확인하였다.
이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 내재화를 영상화 하였다. 인간 주피세포에 융합 단백질을 처리 후, 세포 표면에 결합하고 있는 항체들을 제거하였다. 세포 고정 후, 융합 단백질은 FITC- 항 사람 Cκ 항체 (초록색) 로 염색하였다. 초기 엔도좀을 이미지화하기위해, 세포들은 항-Rab5 항체와 Alexa Fluor 546-염소 항-토끼 항체 IgG (빨간색) 로 염색되었다. 화살표로 표시된 부분은 확대된 부분을 보여주면서 항-hPDGFR-Β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 초기 엔도좀의 형광이 공동화 되어있는 부분을 보여준다. DNA는 DAPI (파란색) 로 염색되었다. Scale bar, 10 μm. 도 13d는 hPDGF-BB를 넣고 반복되었다.
이중 항체 scFv-Cκ-scFv의 세포내재화를 측정하기 위해, 항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 인간주피세포에 배양한 후, FITC-항 사람 Cκ 항체와 엔도좀 특이적 항체를 처리하여 공초점현미경을 이용해 영상화 하였다. 세포 내 형광은 PRb-CN32, PRb-CN16을 배양한 세포내에서만 확인 가능하였다 (도 13c). 영상을 합병하였을 때, 본 발명자들은 2 개의 항체 클론들과 엔도좀 특이적 항체의 형광이 공동화 한 것을 확인하였다. PRb-CN32, PRb-CN16, PRb-CN26에 hPDGF-BB를 처리하였을 때 엔도좀 특이적 항체와 공동화한 것을 확인하였다 (도 13d). PRb-CN26은 PDGF-BB를 함께 처리한 경우 30분안에 많은 양이 내재화되었다. 항체의 내재화는 표적 세포 내로 약물 전달에 매우 중요하며, 몇몇 질병에는 PDGF-BB의 레벨이 올라가있는데, 본 발명에 따른 항체는 PDGF-BB의 레벨이 올라가도 항체가 내재화에 영향을 주지 않아, 병증이 있는 환자들한테 약물을 세포내로 전달하는데 유용하다.
실시예 13. 이중 항체의 hPDGFR-β 및 코티닌에 대한 결합능 분석 (유세포 분석)
인간 주피세포는 분석용 버퍼 (1% [w/v] BSA/ PBS에 0.05% [w/v] sodium azide) 에 1:100으로 희석된 닭 혈청을 4 ℃ 온도에 1시간동안 배양하고 유세포 분석 버퍼로 4 번 세척하였다. 실시예 4의 항-mPDGFR-β를 시험한 동일한 프로토콜을 따랐다. 상기 인간 주피세포는 PromoCell (Heidelberg, Germany) 에서 구매해 10% 소 태아 혈청 (FBS; GIBCO, Grand Island, NY, USA) 과 1% 페니실린, 스트렙토마이신을 첨가한 주피세포 생장 배지 (PromoCell) 에서 배양된 것이었다.
인간 주피세포는 hPDGF-BB-biotin (100 nM) 유/무인 2가지 조건에서 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (100 nM; BT220; R&D systems) 을 이용하여 4 ℃에 1시간동안 배양하였다. 세포는 유세포 버퍼로 4 번 세척 후 allophycocyanin (APC)-항 사람 Cκ 항체 (clone TB28-2; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 와 streptavidin-phycoerythrin (PE) (12-4317-87; eBioscience, ThermoFisher) 을 이용하여 배양하였다. 세척 후, FACS Canto II instrument (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 분류하여 분석하였다. 각 측정 때마다 10,000 세포를 확인하였고 결과는 FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) 로 분석하였다.
A-431 세포에 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (100 nM) 을 4°C에 1시간 동안 배양하였다. 위 설명과 같이 세척 후, 검출은 APC-항 사람 Cκ 항체를 처리하여 실험을 진행하였다. 상기 A-431 세포는 한국세포주은행에서 구매해 10% 소태아혈청 (GIBCO) 과 1% 페니실린, 스트렙토마이신을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Welgene, 서울, 한국) 배지에서 배양한 것이다.
본 발명자들은 또한 유세포 실험으로 hPDGF-BB가 있을 때 hPDGFR-β를 발현하는 인간 주피세포에 각 클론들의 결합능을 확인 하였고, 항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 hPDGF-BB-biotin은 세포에 결합하는 것으로 확인하였다. 효소면역측정법과 비슷한 결과대로 hPDGF-BB를 같이 넣어줬을 경우 모든 3개 클론들이 세포 표면에 존재하는 PDGFR-β에 결합하였다 (도 13b). 본 발명자들은 hPDGFR-β를 발현하지 않는 A-431 세포에도 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질들의 결합능을 유세포 실험으로 확인하였고, 항-hPDGFR-Å x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 모두와 대조 이중 항체 항-mCD154 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질이 해당 세포에 결합하지 않는 것으로 확인 하였다 (도 15).
실시예 14. 이중 항체와 코티닌-듀오카마이신 (cot-duo)의 복합체 형성
실시예 6과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하되, 항-mPDGFR-β항체에 관한 이중 항체를 대신하여 실시예 10에서 제조한 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체를 사용하였다. 실시예 6에 따른 항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 제작과 형질 도입에서 언급한 것과 같이 동일하게HEK293F 세포에 형질 도입하였다. 상층액으로부터 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질을 친화 크로마토그래피 방법으로 정제하고 SDS-polyacrylamide 겔 전기 영동을 실시하였다 (도 11).
실시예 15. PDGFR-β발현 세포주에서 항증식성 분석(세포 독성 실험)
10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 주피세포 생장 배지 50 μL에 인간 주피세포를 넣어 96-웰 판 (CLS3595, Corning) 에 넣고 하룻밤 동안 5% CO2, 37°C 배양기에서 배양하였다. 세포 50 μL가 들어있는 각 웰에 cot-duo와 복합체를 이룬 항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (25.6 pM - 2 μM) 을 50 μL 첨가하여 5% CO2, 37°C 배양기에서 72시간 배양하였다.
이중 항체 scFv-Cκ-scFv 와 cot-duo 복합체의 독성에 대한 hPDGF-BB의 영향을 분석하기 위해, hPDGF-BB (2 nM) 를 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 와 cot-duo 복합체 50 μL에 같이 넣었다. 혼합된 복합체들은 세포 함유 용액 50 μL에 첨가하였다. 이중 항체 항-mCD154 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv는 대조군으로 사용되었다. 그외 실험방법은 실시예 7의 항-mPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질의 프로토콜과 동일하게 실험을 진행하였다.
항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 cot-duo 복합체들의 독성을 평가하기 위해서, 인간 주피세포에 복합체를 hPDGF-BB 유/무 상태로 처리하였고, 세포의 삼인산아데노신을 측정하여 상대적 생존력을 측정하였다. 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 의 독성은 IC50 로 나타냈다 (표 8). 하기 표 8은 항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질과 cot-duo 복합체의 시험관 내 역가를 나타내며, 95% 신뢰구간을 적용하였다.
Figure 112019102151712-pat00010
상기 표 8의 결과에 나타낸 바와 같이, 3 개의 실험된 항체 (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26) 모두는 hPDGF-BB 유/무에 상관없이 대조 항-mCD154 x cotinine scFv-Cκ-scFv 대비 높은 독성을 보였다 (p < 0.05; 도 14a, 및 도 14b). 대조 실험으로 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 cot-duo 복합체들을 hPDGFR-β을 발현하지 않는 A-431 세포에 독성 실험을 진행하였다. 항-hPDGFR-β x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 모두 대조 항체인 항-mCD154 x 코티닌 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질보다 독성이 높지 않았다 (도 16). 이에, 항증식성 결과 이중항체/cot-duo 복합체는 hPDGFR-β를 발현하는 인간 주피세포주에서 대조 항-mCD154 x cotinine scFv-Cκ-scFv 대비 세포독성이 높고, hPDGFR-β을 발현하지 않는 A-431 세포에서는 대조 항-mCD154 x cotinine scFv-Cκ-scFv 대비 세포 독성 차이가 없었다. 이러한 세포 독성 결과는, hPDGFR-β에 의해 전달된 두오카마이신의 효능에 의한 것이며, 이에 scFv-Cκ-scFv 이중 특이항체가 합텐-약물인 (cot-duo)를 효과적으로 표적 세포로 전달하고 세포 내로 약물을 효과적으로 방출하였음을 보여준 것이다.
실시예 16
먼저, 실시예 2에서 제조한 PRb-CN01 scFv 을 이용하여, scFv-토끼 Fc 항체를 암호화하고 있는 유전자를 포함하는 pCEP4 발현 벡터가 제작되었다. 상기 실험에 사용된 토끼 Fc 항체의 아미노산 서열은 첨부 서열목록의 SEQ ID NO: 72에 나타낸다.
구체적으로, 항-mPDGFR-β scFv의 C 말단에 hinge (QEPKSSDKTHTSPPSP: SEQ ID NO: 73)를 이용하여 토끼 Fc에 연결되었다. scFv-토끼-Fc을 제조하는 구체적인 방법으로서, 항- mPDGFR-β을 암호화하는 유전자는 SfiI (New England Biolabs) 으로 절단하여 발현 벡터에 연결되었다. 형질 주입 및 정제는 실시예 의 mPDGFR-β에 따라 수행되었지만, 제조업자의 지시에 따라 단백질 A 겔 친화성 크로마토그래피를 사용하여 토끼 Fc 융합 단백질을 정제하도록 변형하였다 (Repligen Corp., Cambridge, MA).
실시예 5의 항체 결합능에 대한 유세포분석법과 실직적으로 동일한 방법으로 수행하여, NIH3T3에 PRb-CN01와 PRb-CN32 이중항체 scFv-Cκ-scFv 둘 다 해당 세포에 결합하는 것으로 확인되었다 (도 18). 구체적으로, mPDGFR-β를 발현하는 NIH3T3 세포에 유세포 분석 버퍼에 있는 이중 항체 scFv-Cκ-scFv 융합 단백질 (100 nM) 을 배양하였다. 세포에는 APC-항 사람 Cκ 항체를 처리하였다. 이중 항체인 항-HER2 x cotinine scFv-Cκ-scFv 융합 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다.
실시예 3의 항체 결합능에 대한 효소면역 측정법과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하되, mPDGFR-β-hFc 키메라 단백질을 마이크로타이터 판에 4 ℃ 온도에서 O/N 코팅하였다. 각 웰에 차단제를 배양한 후, 3% BSA/PBS에 희석된 여러 농도의 PRb-CN01-토끼Fc (0.01 nM - 1μM)과 PRb-CN01, 항-HER2 대조 항체, PRb-CN32 이중항체 scFv-Cκ-scFv (100 nM)을 각 웰에 37 ℃ 온도에서 2시간동안 반응하였다. 판을 PBST로 3번 세척 후 HRP-항 토끼 Fc 항체를 37 ℃ 온도에서 1시간동안 반응, 세척 후 ABTS를 이용하여 반응하였다. 그 후 Multiscan Ascent 마이크로플레이트 기기 (Labsystems, Helsinki, Finland) 로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 19a). 도 19a는 PRb-CN01 대리 항체에 관한 경쟁을 확인한 결과이다. 도 19a 에 나타난 바와 같이, mPDGFR-β-hFc 키메라 단백질과 PRb-CN01-토끼 Fc의 결합능은 PRb-CN01과 PRb-CN32 이중항체 scFv-Cκ-scFv에 의해 저해되었다.
실시예 5과 실직적으로 동일한 방법으로 수행하여, PRb-CN01-토끼 Fc (50 nM)과 PRb-CN01, 대조 항체, PRb-CN32 이중항체 scFv-Cκ-scFv (1μM)를 NIH3T3 세포에 4°C 1시간동안 배양하였다. 세척 후 FITC-항 토끼 Fc 항체 (172-1506, KPL, Gaithersburg, Maryland, USA) 를 4 ℃에 1시간동안 배양하였다. 세척 후, FACS Canto II instrument (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 분류하여 분석하였다. 각 측정 때마다 10,000 세포를 확인하였고 결과는 FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) 로 분석하였다 (도 19b)
도 19b에 나타난 바와 같이 세포 표면에 존재하는 mPDGFR-β와 PRb-CN01-토끼 Fc의 결합능은 PRb-CN01과 PRb-CN32 이중항체 scFv-Cκ-scFv에 의해 저해되었다.
실시예 7과 동일한 방법으로 수행하되, 항-mPDGFR-β 항체에 관한 이중 항체와 실시예 10에서 제조한 따른 항-hPDGFR-β항체에 관한 이중 항체를 사용하였다. 도 20a 내지 도 20b는 PDGFR-β를 발현하는 세포에 대해 PRb-CN01과 PRb-CN32 이중 항체와 코티닌-듀오카마이신 복합체들의 세포 독성능 차이를 확인한 그래프이다. 도 20b는 mPDGF-BB가 있는 조건으로 실험이 반복되었다.
도 20a 및 20b에 나타난 바와 같이, 2 개의 실험된 항체 (PRb-CN01, PRb-32) 모두 mPDGF-BB 유/무에 상관없이 동일한 독성을 보였다. 따라서, PRb-CN01 및 PRb-32는 대리 항체(surrogate)임을 확인하였다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Antibody against PDGF receptor and use thereof <130> DPP20193937KR <150> US 62/741,733 <151> 2018-10-05 <160> 73 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VH of PRb-CN01 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg Ala Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VH of PRb-CN01 <400> 2 Leu Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Ala Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-VH of PRb-CN01 <400> 3 Gly Val Gly Ser Trp Ala His Gly Gly Arg Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VL of PRb-CN01 <400> 4 Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VL of PRb-CN01 <400> 5 Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 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Artificial Sequence <220> <223> VL of PRb-CN16 <400> 40 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Gln Arg 35 40 45 Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr 50 55 60 Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys Gly Asn Ala Asp Arg Ser Asn Ser Ala Gly Thr Phe Gly Ala 85 90 95 Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VH of PRb-CN32 <400> 41 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Asn Met Phe 1 5 10 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VH of PRb-CN32 <400> 42 Gly Ile Ser Thr Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Gln 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-VH of PRb-CN32 <400> 43 Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Ser Tyr Trp Asp Ser Asp Ala Gly Leu Ile 1 5 10 15 Asp Ala <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VL of PRb-CN32 <400> 44 Ser Gly Gly Ser Asn Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VL of PRb-CN32 <400> 45 Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-VL of PRb-CN32 <400> 46 Gly Ser Gly Asp Ser Ser Ser Ile Ala Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of PRb-CN32 <400> 47 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Arg Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Thr Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60 Gln Gly Arg Gly Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Ser Tyr Trp Asp Ser Asp Ala Gly 100 105 110 Leu Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr 115 120 125 Ser <210> 48 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of PRb-CN32 <400> 48 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Val Lys 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Ser 35 40 45 Asn Asn Gln Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr 50 55 60 Ser Gly Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Asp Asp 65 70 75 80 Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Ser Ile Ala Ala 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VH of PRb-CN26 <400> 49 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg Gly Ile His 1 5 10 <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VH of PRb-CN26 <400> 50 Gly Ile Gly Asn Thr Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Pro Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-VH of PRb-CN26 <400> 51 Arg Gly Phe Met Asp Ala Gly Gly Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VL of PRb-CN26 <400> 52 Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VL of PRb-CN26 <400> 53 Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-VL of PRb-CN26 <400> 54 Gly Gly Tyr Asp Gly Ile Ser Asp Thr Gly Ile 1 5 10 <210> 55 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of PRb-CN26 <400> 55 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Asn Thr Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Pro Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Gly Phe Met Asp Ala Gly Gly Ile Asp Ala Trp Gly His 100 105 110 Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser 115 120 <210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of PRb-CN26 <400> 56 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Leu Ser Gly Ser Thr Asp Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ile Ser Asp Thr 85 90 95 Gly Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker for VL-VH in scFv <400> 57 Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kappa constant (Ck) <400> 58 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser 100 105 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker for scFv-Ck <400> 59 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 60 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPDGFR-beta Extracellular domain <400> 60 Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Ile Ser Gln Gly 20 25 30 Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser 35 40 45 Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg 50 55 60 Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr 65 70 75 80 Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly 85 90 95 Glu Tyr Phe Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu 100 105 110 Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu 115 120 125 Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu 130 135 140 Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu 145 150 155 160 His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr 180 185 190 Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg 195 200 205 Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val 210 215 220 Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly 245 250 255 <210> 61 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mPDGFR-beta Extracellular domain <400> 61 Leu Val Ile Thr Pro Pro Gly Pro Glu Phe Val Leu Asn Ile Ser Ser 1 5 10 15 Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Met Trp Glu Gln 20 25 30 Met Ser Gln Val Pro Trp Gln Glu Ala Ala Met Asn Gln Asp Gly Thr 35 40 45 Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Val Thr Gly Gly Asp Thr Gly 50 55 60 Glu Tyr Phe Cys Val Tyr Asn Asn Ser Leu Gly Pro Glu Leu Ser Glu 65 70 75 80 Arg Lys Arg Ile Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Met Gly Phe Leu 85 90 95 Pro Met Asp Ser Glu Asp Leu Phe Ile Phe Val Thr Asp Val Thr Glu 100 105 110 Thr Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Glu Val Thr Leu 115 120 125 His Glu Lys Lys Val Asp Ile Pro Leu His Val Pro Tyr Asp His Gln 130 135 140 Arg Gly Phe Thr Gly Thr Phe Glu Asp Lys Thr Tyr Ile Cys Lys Thr 145 150 155 160 Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Thr Tyr Tyr Val Tyr Ser 165 170 175 Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val 180 185 190 Val Arg Gln Gly Glu Ser Ile Thr Ile Arg Cys Ile Val Met Gly Asn 195 200 205 Asp Val Val Asn Phe Gln Trp Thr Tyr Pro Arg Met Lys Ser Gly Arg 210 215 220 Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Tyr Leu Phe Gly Val Pro Ser Arg Ile 225 230 235 240 Gly Ser Ile Leu His Ile Pro Thr Ala Glu Leu Ser Asp Ser Gly 245 250 255 <210> 62 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFR-beta of Cynomolgus monkey <400> 62 Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Gln Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Val Ser Gln Gly 20 25 30 Leu Val Ile Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Ile Leu Asn Val Ser Ser 35 40 45 Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg 50 55 60 Met Ser Gln Glu Leu Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Asn Thr 65 70 75 80 Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly 85 90 95 Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Pro Asp Glu 100 105 110 Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu 115 120 125 Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu 130 135 140 Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu 145 150 155 160 His Glu Lys Lys Gly Asp Ile Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr 180 185 190 Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg 195 200 205 Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val 210 215 220 Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Met Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly 245 250 255 <210> 63 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFR-beta of Sus scrofa <400> 63 Met Gln Leu Pro Arg Ala Val Pro Ala Ser Val Leu Ile Gly Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gln Ala Ser Trp Gly 20 25 30 Leu Val Ile Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Leu Ser Ser 35 40 45 Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Pro Ala Pro Val Val Trp Glu Arg 50 55 60 Met Ser Gln Lys Pro Pro Gln Glu Met Thr Gly Thr Gln Asp Gly Thr 65 70 75 80 Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Gly Leu Asp Thr Gly 85 90 95 Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr Lys Gly Ser Pro Gly Leu Glu Ala Ser Glu 100 105 110 Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 115 120 125 Pro Val Asp Pro Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu 130 135 140 Thr Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Arg Leu Val Val Thr Leu 145 150 155 160 His Glu Lys Lys Val Asp Val Pro Leu Pro Ile Ser Tyr Asp His Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Ser Gly Thr Phe Glu Asp Lys Thr Tyr Val Cys Lys Thr 180 185 190 Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Ser 195 200 205 Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Gly Ala Val Gln Thr Val 210 215 220 Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Val Met Cys Ile Val Thr Gly Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Leu Glu Thr Gly 245 250 255 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VH of anti-Cotinine antibody <400> 64 Gly His Leu Arg Arg Arg Asp Trp Met 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VH of anti-Cotinine antibody <400> 65 Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr 1 5 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-VH of anti-Cotinine antibody <400> 66 Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-VL of anti-Cotinine antibody <400> 67 Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn Glu Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-VL of anti-Cotinine antibody <400> 68 Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-VL of anti-Cotinine antibody <400> 69 Ala Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Leu Phe Leu Phe Gly 1 5 10 <210> 70 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of anti-Cotinine antibody <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Leu Arg Arg Arg Asp 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Arg Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of anti-Cotinine antibody <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn 20 25 30 Glu Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Phe 85 90 95 Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 72 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody to rabbit Fc <400> 72 Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr 35 40 45 Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln 100 105 110 Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu 115 120 125 Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val 180 185 190 Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Ile Ser Arg Ser 210 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge of linking rabbit Fc and anti-PDGFR-beta antibody <400> 73 Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15

Claims (25)

  1. 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타 (platelet-derived growth factor receptor beta, PDGFR-β)을 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편로서,
    상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함, 또는
    서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함하는 것인,
    항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, PDGFR-β의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 것인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, PDGF-BB와 비-경쟁적으로 결합하는 것인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함,
    서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함,
    서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함,
    서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함,
    서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함,
    서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함, 또는
    서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것인,
    항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PDGFR-β을 발현하는 세포에 의해 내재화되는 것인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 항-PDGF 수용체 항체는 완전한 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형태인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체의 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체의 항원 결합 단편은 N-말단부터 C-말단 방향으로 순차적으로 경쇄 가변영역(VL), 링커 및 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 scFv인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제8항에 있어서, 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 화학요법 약물, 합텐(hapten), 효소, 펩타이드, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 또는 검출 표지가 접합된 것인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 합텐은 PDGFR-β에 특이적으로 결합하는 것인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제10항에 있어서, 상기 합텐은 코티딘, DNP (2,4-dinitrophenol), TNP (2,4,6- trinitrophenol), biotin, 또는 digoxigenin인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제10항에 있어서, 상기 합텐은 화학요법 약물이 결합된 것인 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타 (platelet-derived growth factor receptor beta, PDGFR-β)을 특이적으로 결합하는 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 화학요법 약물에 대한 합텐에 대한 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는, 항-PDGF 수용체와 상기 합텐을 특이적으로 결합하는 이중 특이 항체.
  15. 제14항에 있어서, 항-PDGF 수용체 항체의 항원 결합 단편과 합텐에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 이중 특이 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 이중 특이 항체는, 상기 항-PDGF 수용체 항체의 scFv와, 화학요법 약물에 대한 합텐에 대한 항체의 scFv이 직접 또는 제1링커를 통해 연결된 것인 이중 특이 항체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 이중 특이 항체는, 상기 항-PDGF 수용체 항체의 scFv의 C-말단과 화학요법 약물에 대한 합텐에 대한 항체의 scFv의 N-말단이 제1링커를 통해 연결된 것인 이중 특이 항체.
  18. 제17항에 있어서, 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 제2링커를 통해 연결된 scFv와, 항-코티닌 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 제3링커를 통해 연결된 scFv가, 제1링커를 통해 연결된 이중 특이 항체로서,
    상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함,
    서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함, 또는
    서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3과, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VL-CDR3를 포함하는 것인,
    이중 특이 항체.
  19. 제14항에 있어서, 상기 화학요법 약물은 duocarmycin, calicheamicin, pyrrolobenzodiazepine (PBD), anthracycline, nemorubicin, doxorubicin, Irinotecan, amatoxin, auristatin, maytansine, tubulysin, SN-38, 5-Aminolaevulinic acid (ALA), Benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA), Chlorins, Tetra (m-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC), 또는 Lutetium texaphyrin인 이중 특이 항체.
  20. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 PDGF 수용체를 발현하는 세포로 약물을 전달하는 약물 전달체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 약물은, 면역요법제 또는 화학요법제인 것인, 약물 전달체.
  22. 제20항에 있어서, 상기 항-PDGF 수용체 항체는 화학요법 약물에 대한 합텐에 대한 항체 또는 이의 항원결합 단편을 추가로 포함하여 항-PDGF 수용체와 상기 합텐을 특이적으로 결합하는 것인 약물 전달체.
  23. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 화학요법 약물에 대한 합텐에 대한 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 항-PDGF 수용체와 상기 합텐을 특이적으로 결합하는 이중 특이 항체와,
    화학요법 약물을 포함하는 안구의 혈관신생성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 안구의 혈관신생성 질환은 허혈성 망막병증, 홍채 혈관신생, 안내 혈관신생, 노인성 황반 변성, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 당뇨병성 망막 허혈 또는 증식성 당뇨병성 망막병증인 약학 조성물.
  25. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는 상기 항-PDGF 수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 화학요법 약물에 대한 약물에 대한 합텐에 대한 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는, 항-PDGF 수용체와 상기 합텐을 특이적으로 결합하는 이중 특이 항체와
    약물을 포함하는 암 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
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