KR102196424B1 - Hsp90 병용요법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 대상체로부터의 암 세포를 함유하는 샘플을 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 암 경로 성분이 Hsp90 억제제 또는 Hsp90 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체에 결합하도록 하는 조건 하에서 Hsp90의 억제제 또는 Hsp90의 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체와 접촉시키고; (b) Hsp90 억제제 또는 Hsp90 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체에 결합된 경로 성분을 검출하고; (c) 단계 (b)에서 검출된 성분 및 이러한 경로의 추가의 성분을 포함하는 경로를 확인하기 위해서 단계 (b)에서 검출된 경로 성분을 분석하고; (d) 단계 (b)에서 확인된 경로 또는 경로 성분의 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체에게 Hsp90의 억제제와 공동-투여하기 위한 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분의 억제제를 선택하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, Hsp90의 억제제 및 암-연루된 경로 또는 그의 성분의 억제제를 공동-투여함으로써 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

Hsp90 병용요법 {HSP90 COMBINATION THERAPY}
본 명세서에 기술된 본 발명은 적어도 부분적으로 National Cancer Institute, Department of Health and Human Services로부터의 Grant No. ROI CA 155226으로부터 지원을 받아 이루어졌으며, 미국 정부가 이러한 본 발명에 대해서 권리를 갖는다.
본 출원 전체에 걸쳐서, 허여되고 계류 중인 특허출원, 출판물 등을 포함한 다수의 공문서들이 확인되었다. 이들 문서는 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이, 온전히 이에 의해 본 기술분야의 상태를 정의하는데 도움을 주기 위해서 본 출원에 참고로 포함된다.
암 세포의 악성 표현형을 유지시키는 분자 이상을 이해하여야 하는 큰 필요성이 있다. 이러한 이해는 종양-촉진 분자의 더 선택적인 표적화를 가능하게 할 수 있으며, 더 효과적이고 독성이 덜한 항암 치료의 개발에 도움을 줄 수 있다. 대부분의 암은 다수의 분자 병변으로부터 일어나며, 마찬가지로 생성된 잉여물은 시그날링 분자의 특정한 억제제의 활성을 제한한다. 활성 경로의 조합된 억제가 더 나은 임상적 결과를 약속하지만, 현재 종양원성 경로의 포괄적인 확인은 아직 미치지 못하고 있다.
대규모 게놈 서열결정 (sequencing)을 포함한 게놈 기술의 적용은 다양한 암에서 이 질환의 복잡성을 강조하는 다수의 유전자 돌연변이의 확인을 이끌어 내었다 (Ley et al., 2008; Parsons et al., 2008). 그러나, 이들 유전자 분석이 종양의 유전적 구성에 대한 정보를 제공하는데 유용한 반면에, 이들은 본질적으로 유전자 결함(들)의 결과로 이상 활성화된 시그날링 네트워크의 기능적 복잡성을 설명하는 능력은 결여하고 있다. 따라서, 환자- 및 질병 단계-특이적 방식에서 종양에 대해 고유한 분자 병변을 확인하기 위한 상보적 프로테오믹 (proteomic) 방법의 개발이 이어져야 한다.
대부분의 프로테오믹 전략은 특정한 종양에서 단백질 발현을 측정하고, 병리학적 상태와 연관된 새로운 단백질의 확인을 허용하는 것으로 제한되지만, 이러한 발견의 기능적 중요성에 대한 정보를 제공할 수는 없다 (Hanash & Taguchi, 2010). 몇 가지의 기능적 정보는 특정 단백질 또는 해독-후 변형에 대해 지시된 항체를 사용하고, 특정 효소의 활성 부위에 대해 지시된 소분자를 사용한 활성-기본 단백질 프로파일링에 의해서 수득될 수 있다 (Kolch & Pitt, 2010; Nomura et al., 2010; Brehme et al., 2009; Ashman & Villar, 2009). 이들 방법은 특정한 경로 또는 해독-후 변형을 묻는데 유용한 것으로 입증된 반면에, 이들은 악성 상태에 관한 더 전반적인 정보를 수집하는데는 꽤 적합하지 않다 (Hanash & Taguchi, 2010). 더구나, 현재의 프로테오믹 방법은 비용이 많이 들며, 시간 소모적이다. 예를 들어, 프로테오믹 시험은 종종 고가의 SILAC 표지 또는 샘플의 이차원 겔 분리를 필요로 한다.
따라서, 악성 상태에 관한 중요한 정보를 수집하는 더 간단하며, 더 비용 효율적인 프로테오믹 방법을 개발할 필요성이 존재한다. 분자 샤페론 (chaperone) 단백질인 열 충격 단백질 (Hsp90)이 가-안정 상태에서 다수의 종양단백질을 유지하는 것으로 인정되었기 때문에 (Zuehlke & Johnson, 2010; Workman et al., 2007), Hsp90은 새로운 프로테오믹 방법을 개발하는데 중요한 단백질일 수 있다.
이러한 가설을 지지하여, 그들의 활성 입체형태에 다수의 단백질을 적절하게 폴딩 (fold)시키는 기능을 하는 샤페론 단백질인 열 충격 단백질 (Hsp90)은 변형된 표현형을 유지시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 인정되고 있다 (Zuehlke & Johnson, 2010; Workman et al., 2007). Hsp90 및 그의 연관된 공동-샤페론 (co-chaperones)은 대부분이 세포 성장, 분화, DNA 손상 반응 및 세포 생존을 조절하는 시그날 변환 경로의 효과기로서, 종합적으로 "클라이언트 (client) 단백질"로 불리는 세포 단백질의 정확한 입체형태적 폴딩에 도움을 준다. 따라서, 탈조절된 단백질에 대한 종양 세포 탐닉 (addiction) (즉, 돌연변이, 이상 발현, 부적절한 세포 전좌 등을 통해서)은 Hsp90에 대해서 매우 의존적으로 될 수 있다 (Workman et al., 2007). Hsp90은 대부분의 세포 타입 및 조직에서 발현되며, 카말 (Kamal) 등에 의한 연구는 정상 및 암 세포 Hsp90 사이의 중요한 차이를 입증하였다 (Kamal et al, 2003). 특이적으로, 이들은 종양이 특정의 Hsp90 억제제에 대해서 큰 친화성을 갖는 멀티-샤페론 복합체화된 Hsp90을 특징으로 하는 반면에 정상 조직은 이들 억제제에 대해서 낮은 친화성을 갖는 잠복성의 비복합체화된 Hsp90을 포함하는 것을 나타내었다.
Hsp90의 클라이언트 단백질의 대부분은 또한 암을 포함한 몇 가지의 병리학에서 질병 발현 및 진행에 두드러진 역할을 한다 (Whitesell and Lindquist, Nat Rev Cancer 2005, 5, 761; Workman et al., Ann NY Acad Sci 2007, 1113, 202; Luo et al., Mol Neurodegener 2010, 5, 24). 결과적으로, 암의 치료에서 Hsp 억제제의 적용에 상당한 관심이 있다 (Taldone et al., Opin Pharmacol 2008, 8, 370; Janin, Drug Discov Today 2010, 15, 342).
상기에 제시된 일련의 증거를 기초로 하여, 본 발명자들은 Hsp90과 연관된 주요 단백질을 확인할 수 있는 프로테오믹 방법이 개별적인 종양의 생물학에 대한 전반적인 통찰을 제공할 수 있고, 새로운 암 치료법의 개발을 향한 광범한 적용성을 가질 수 있다고 가정한다. 따라서, 본 발명은 Hsp90과 연관된 종양단백질을 확인하는 도구 및 방법을 제공한다. 더구나, 본 발명은 암 환자에 대한 치료 레지멘을 확인하는 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 종양-풍부 Hsp90 복합체 (예를 들어, Hsp90 억제제)를 표적화할 수 있는 소분자를 사용하여 Hsp90-의존적 종양원성 클라이언트 단백질을 친화성-포획할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 생물정보 분석 (bioinformatic analysis)과 조합된 후속 확인은 변형-특이적 병변의 상세한 분자 지도를 창출할 수 있게 한다. 이 지도는 특정 환자에 대해서 최적으로 효과적인 병용요법의 개발을 유도할 수 있다. 대부분의 항암제는 유전자가 아닌 단백질을 표적으로 하는 소분자이기 때문에 이러한 분자 지도는 더 통상적인 유전자 서명방법 (genetic signature approach)에 비해서 특정의 이점을 가지며, 특정의 분자 변화를 표적화한 다수의 소분자가 현재 약제학적으로 개발 중에 있다.
따라서, 본 발명은 종양원성 단백질 및 경로를 발견하기 위한 생물정보 분석과 통합된 Hsp90 억제제-기본 화학적 생물학/프로테오믹스 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 상기 방법이 다수의 주요 시그날링 네트워크를 포함하며, 기능적 악성 프로테옴의 상당한 분획을 나타내는 것으로 생각되는 종양 세포에서 Hsp-의존성 프로테옴의 종양별 전반적인 개관을 제공할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 Hsp90-의존적 종양원성 클라이언트 단백질을 친화성-포획할 수 있는 소분자 프로브를 제공한다. 추가로, 본 발명은 Hsp90-의존적 종양원성 클라이언트 단백질을 친화성-포획하는 분자 프로브의 능력을 이용하여, 생물정보 경로 분석과 조합하는 경우에 다양한 타입의 암에서 조절부전 시그날링 네트워크 및 주요 종양단백질을 확인하는 프로테오믹 방법을 디자인하는 방법을 제공한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 퓨린 및 퓨린-유사 (예를 들어, PU-H71, MPC-3100, Debio 0932), 이속사졸 (예를 들어, NVP-AUY922) 및 인다졸-4-온 (예를 들어, SNX-2112) 화학적 클래스를 기초로 하는 Hsp90 억제제로부터 유도된 소분자 프로브를 제공한다 (참조: 도 3). 한가지 구체예에서, Hsp90 억제제는 PU-H71 8-(6-요오도-벤조[1,3]디옥솔-5-일설파닐)-9-(3-이소프로필아미노-프로필)-9H-퓨린-6-일아민이다 (참조: 도 3). PU-H71 분자는 테터 (tether) 또는 링커 (linker)를 통해서 고체 지지체 (예를 들어, 비드)에 연결될 수 있다. 부착의 부위 및 테터의 길이는 분자가 Hsp90에 대한 높은 친화성을 유지하는 것을 보장하도록 선택되었다. 특별한 구체예에서, PU-H71-기본 분자 프로브는 도 30에 나타낸 구조를 갖는다. 고체 지지체에 부착된 Hsp90 억제제의 다른 구체예는 도 32-35 및 38에 나타내었다. 분자가 하우스키핑 Hsp90 복합체보다 종양원성 Hsp90 복합체 종에 대해서 더 큰 친화성을 유지한다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인식될 것이다. 두 개의 Hsp90 종은 문헌 (Moulick et al, Nature chemical biology (2011))에서 정의한 바와 같다. Hsp90에 결합하는 경우에, Hsp90 억제제는 클라이언트-단백질 결합된 입체형태에 Hsp90을 트랩핑 (trap)한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 암의 발생 및 진행에 연루된 Hsp90과 연관된 특정의 종양단백질을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 암을 앓고 있는 대상체로부터의 암 세포를 함유하는 샘플을 Hsp90의 억제제와 접촉시키고, Hsp90의 억제제에 결합된 종양단백질을 검출하는 것을 포함한다. 특별한 구체예에서, Hsp90의 억제제는 비드와 같은 고체 지지체에 연결된다. 이들 구체예에서, 고체 지지체에 결합된 Hsp90 단백질에 의해서 수용된 종양단백질은 완충제 내에 용출되고, 표준 SDS-PAGE에 제시될 수 있으며, 용출된 단백질은 전통적인 방법에 의해서 분리 및 분석될 수 있다. 방법의 일부의 구체예에서, 종양단백질의 검출은 질량 분광분석법의 사용을 포함한다. 유리하게는, 본 발명의 방법은 고가의 SILAC 표지 또는 샘플의 이차원적 분리를 필요로 하지 않는다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 경로 성분의 분석은 예를 들어, 이러한 성분의 네트워크의 성분들을 정의하기 위한 생물정보 컴퓨터 프로그램의 사용을 포함한다.
본 발명의 방법은 유방암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함한 폐암, 경부암, 결장암, 융모암, 방광암, 경부암, 기저 세포 암종, 융모암, 결장암, 결장직장암, 내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 급성 림프구암 (ACL), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 만성 골수성 백혈병 (CML)을 포함한 골수성 백혈병, 다발성 골수종, T-세포 백혈병 림프종, 간암, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 림프구성 림프종, 신경아세포종, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종을 포함한 림프종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 흑색종과 같은 피부암, 고환암, 갑상선암, 신장암, 골수증식성 장애, 위장 기질 종양을 포함한 위장암, 식도암, 위암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함한 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종을 포함한 림프종을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 타입의 암과 연관된 종양단백질을 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 특정한 암과 연관된 조절부전 시그날링 네트워크를 확인하는 프로테오믹 방법을 제공한다. 또한, 이 방법을 사용하여 새로운 종양단백질 및 기전을 확인할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명의 방법은 암 환자에 대한 개인 맞춤형 치료법을 디자인하기 위한 합리적 기준을 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 암에 대한 개인 맞춤형 치료학적 방법은 개별적인 암 환자가 질병의 발생 및 진행에 기여하는 상이한 인자들을 가질 것이라는 전제를 기초로 한다. 예를 들어, 현재 이용가능한 방법에 의해서 측정되는 바와 같이 동일한 타입의 암을 갖고 동일한 진행 단계에 있는 환자를 고려하는 경우에 조차도 상이한 종양원성 단백질 및/또는 암-연루된 경로가 질병의 발현 및 후속 진행에 책임이 있을 수 있다. 더구나, 종양단백질 및 암-연루된 경로는 종종, 질병이 진행함에 따라 개별적인 암 환자에게서 변화된다. 따라서, 암 치료 레지멘은 개별화된 기준에 따라 환자를 치료하도록 이상적으로 표적화되어야 한다. 이러한 개별화된 방법을 사용하여 결정된 치료학적 레지멘은 낮은 독성을 가지고, 더 적은 화학요법 또는 방사선을 사용하여, 증진된 항종양 활성을 허용할 것이다.
따라서, 한가지 관점에서 본 발명은 개별화된 기준에 따른 암 환자에 대한 치료학적 레지멘을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 암을 앓고 있는 대상체로부터의 암 세포를 함유하는 샘플을 Hsp90의 억제제와 접촉시키고, Hsp90의 억제제에 결합된 종양단백질을 검출하고, Hsp90의 억제제에 결합된 종양단백질 중의 적어도 하나를 표적으로 하는 암 치료법을 선택하는 것을 포함한다. 특정의 관점에서는, Hsp90에 결합된 종양단백질을 확인한 후에 약물의 조합이 선택될 수 잇다. 본 발명의 방법은 유방암, 폐암, 뇌암, 경부암, 결장암, 융모암, 방광암, 경부암, 융모암, 결장암, 내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 급성 림프구암 (ACL), 골수성 백혈병, 다발성 골수종, T-세포 백혈병 림프종, 간암, 호지킨병 및 림프구성 림프종을 포함한 림프종, 신경아세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 피부암, 고환암, 갑상선암 및 신장암을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 상이한 암에 대한 치료 레지멘을 확인하기 위해서 사용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 방법은 암을 앓고 있는 대상체로부터의 암 세포를 함유하는 샘플을 Hsp90의 억제제와 접촉시키고, Hsp90의 억제제에 결합된 종양단백질을 검출하고, 이들 종양단백질과 연관된 단백질 네트워크(들)를 결정하고, Hsp90의 억제제에 결합된 종양단백질의 네트워크로부터의 분자 중의 적어도 하나를 표적으로 하는 암 치료법을 선택하는 것을 포함한다.
특정의 관점에서는, Hsp90에 결합된 종양단백질을 확인한 후에 약물의 조합이 선택될 수 있다. 다른 관점에서, 약물의 조합은 Hsp90에 결합된 종양단백질과 연관된 네트워크를 확인한 후에 선택될 수 있다. 본 발명의 방법은 유방암, 폐암, 뇌암, 경부암, 결장암, 융모암, 방광암, 경부암, 융모암, 결장암, 내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 급성 림프구암 (ACL), 골수성 백혈병, 다발성 골수종, T-세포 백혈병 림프종, 간암, 호지킨병 및 림프구성 림프종을 포함한 림프종, 신경아세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 육종, 피부암, 고환암, 갑상선암 및 신장암을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 상이한 암에 대한 치료 레지멘을 확인하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 암 환자에 대한 개인 맞춤형 치료 레지멘을 상술한 방법을 사용하여 확인한 후에, 선택된 약물 또는 약물의 조합을 환자에게 투여한다. 선택된 약물 또는 약물 조합을 복용한 지 충분한 시간 후에 또 다른 샘플을 환자로부터 채취할 수 있으며, 본 시험을 다시 실행하여 환자의 종양원성 프로필이 변화되었는지 여부를 결정할 수 있다. 필요하다면, 약물(들)의 투약량을 변화시킬 수 있거나, 새로운 치료 레지멘이 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명은 시간의 경과에 따라 암 환자의 진행을 모니터링하고, 필요에 따라 치료 레지멘을 변화시키는 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명의 방법은 Hsp90 억제제를 중심으로 만들어진 암 환자에 대한 개인 맞춤형 병용요법을 디자인하는 합리적인 근거를 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 치료학적 레지멘은 더 적은 독성을 갖고, 더 적은 화학요법을 사용하여 증진된 항종양 활성을 허용할 수 있다. 데이터의 몇 개의 라인은 종양원성 표적이 억제되는 완전성이 약물 저항성에 적응하고 발전하는 종양의 능력을 동시에 제한하면서 치료학적 활성에 결정적이 될 수 있기 때문에, Hsp90 및 상보적 종양-구동 경로를 표적화하는 것은 더 우수한 항종양 전략을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은
(a) 대상체로부터의 암 세포를 함유하는 샘플을 (i) Hsp90이 샘플 내에 존재하는 암 경로 성분에 결합하는 경우에 이러한 Hsp90에 결합하는 Hsp90의 억제제; 또는 (ii) 이러한 Hsp90이 샘플 내의 이러한 암 경로 성분에 결합하는 경우에 Hsp90에 결합하는 이러한 Hsp90의 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체와 접촉시키고;
(b) Hsp90에 결합된 경로 성분을 검출하고;
(c) 단계 (b)에서 검출된 성분 및 이러한 경로의 추가의 성분을 포함하는 경로를 확인하기 위하여 단계 (b)에서 검출된 경로 성분을 분석하고;
(d) 단계 (c)에서 확인된 경로 성분 또는 경로의 억제제를 선택하는 단계를 포함하는,
암을 앓고 있는 대상체에게, Hsp90의 억제제와 공동-투여하기 위한, 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분의 억제제를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명과 관련하여, 암-염루된 경로는 표 1에 열거된 모든 경로를 포함한 대사, 유전자 정보 처리, 환경적 정보 처리, 세포 과정, 또는 유기체 시스템에 포함된 경로이다.
본 발명을 실행함에 있어서, 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분은 결장직장암, 췌장암, 갑상선암, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 포함한 백혈병, 기저 세포 암종, 흑색종, 신세포암, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함한 폐암, 유방암, 신경아세포종, 골수증식성 장애, 위장 기질성 종양을 포함한 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함한 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종을 포함한 림프종, 및 난소암, 경부암 및 내막암을 포함한 부인과 암으로 구성된 그룹으로부터 선택된 암과 연관된다. 예를 들어, 암-연루된 경로의 성분 및/또는 경로는 도 1에서 확인된 모든 성분일 수 있다.
단계 (a)에서 개인 맞춤형 의약을 포함하는 바람직한 구체예에서, 대상체가 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분의 억제제가 투여될 동일한 대상체이지만, 단계 (a)에서의 발명은 또한 대상체가 암 기준 대상체인 것을 고려한다.
본 발명을 실행함에 있어서, 단계 (a)에서 샘플은 모든 종양 조직 또는 모든 생물학적 유체, 예를 들어, 혈액을 포함한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 샘플에는 파괴된 암 세포, 용해된 암 세포, 및 초음파처리된 암 세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 실행과 관련하여, 대상체에게 투여될 Hsp90의 억제제는 (a) 사용된 Hsp90의 억제제, 또는 (b) 단계 (a)에서의 Hsp90의 억제제, 사용된 Hsp90의 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체와 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 대상체에게 투여될 Hsp90의 억제제는 PU-H71 또는 PU-H71의 활성을 갖는 PU-H71의 유사체, 동족체 또는 유도체이다.
또 다른 구체예에서는, PU-H71이 사용된 Hsp90의 억제제이거나, 단계 (a)에서의 Hsp90의 억제제, 사용된 Hsp90의 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체이다. 대신으로, Hsp90의 억제제는 도 3에 나타낸 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한가지 구체예에서는, 단계 (a)에서 Hsp90의 억제제 또는 Hsp90의 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체가 바람직하게는 비드와 같은 고체 지지체 상에 고정화된다.
특정의 구체예에서, 단계 (b)에서 경로의 검출은 질량 분광분석법의 사용을 포함하며, 단계 (c)에서 경로 성분의 분석은 생물정보 컴퓨터 프로그램의 사용을 포함한다.
본 발명의 한가지 예에서, 암은 림프종이고, 단계 (c)에서 확인된 경로 성분은 Syk이다. 또 다른 예에서, 암은 만성 골수성 백혈병 (CML)이고, 단계 (c)에서 확인된 경로 또는 경로 성분은 도 15에 나타낸 네트워크 중의 어느 하나에 나타낸 경로 또는 성분, 예를 들어, 도 15에서 확인된 다음의 경로 성분 중의 하나, 즉 mTOR, IKK, MEK, NFκB, STAT3, STAT5A, STAT5B, Raf-1, bcr-abl, Btk, CARM1, 또는 c-MYC이다. 이러한 한가지 예에서, 단계 (c)에서 확인된 경로 성분은 mTOR이며, 단계 (d)에서 선택된 억제제는 PP242이다. 또 다른 이러한 예에서, 단계 (c)에서 확인된 경로는 다음의 경로들로부터 선택된 경로이다: PI3K/mTOR-, NFκB-, MAPK-, STAT-, FAK-, MYC 및 TGF-β 매개된 시그날링 경로. 또 다른 예로서, 암은 림프종이고, 단계 (c)에서 확인된 경로 성분은 Btk이다. 또한 추가의 예로서, 암은 췌장암이고, 단계 (c)에서 확인된 경로 또는 경로 성분은 도 16의 네트워크 1-10 및 도 24의 네트워크 중의 어느 하나에 나타낸 경로 또는 경로 성분이다. 또 다른 예로서, 단계 (c)에서 확인된 경로 및 경로 성분은 mTOR이고, 그의 예로서 단계 (d)에서 선택된 mTOR의 억제제는 PP242이다. 본 발명은 추가로 대상체에게 (A) Hsp90의 억제제 및 (B) 암-연루된 경로의 성분의 억제제를 공동-투여하는 것을 포함하여 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 (B)는 본 발명에 기술된 방법에 의해서 선택될 수 있지만 그렇게 할 필요는 없다. 따라서, 본 발명은 공동-투여가 (A)에서의 억제제와 (B)에서의 억제제를 동시에, 수반하여, 순차적으로, 또는 보조적으로 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법의 한가지 예는 대상체에게 (A) Hsp90의 억제제 및 (B) Btk의 억제제를 공동-투여하는 것을 포함한다. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법의 또 다른 예는 대상체에게 (A) Hsp90의 억제제 및 (B) Syk의 억제제를 공동-투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법에서, 암은 림프종일 수 있다. 만성 골수성 백혈성 (CML)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법의 또 다른 예는 대상체에게 (A) Hsp90의 억제제 및 (B) mTOR, IKK, MEK, NFκB, STAT3, STAT5A, STAT5B, Raf-1, bcr-abl, CARM1, CAMKII, 또는 c-MYC 중의 어느 하나의 억제제를 공동-투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 구체예에서, (B)에서의 억제제는 mTOR의 억제제이다. 상술한 방법의 추가의 구체예에서, (a)에서 Hsp90의 억제제 또는 이러한 Hsp90 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체의 결합은 Hsp90을 암 경로 성분-결합된 상태로 트랩핑한다. 또한, 본 발명은 대상체에게 (A) Hsp90의 억제제 및 (B) 도 16 및 24에 나타낸 네트워크 중의 어느 하나에 나타낸 경로 또는 경로 성분의 억제제를 공동-투여하는 것을 포함하는, 췌장암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 대상체에게 (A) Hsp90의 억제제 및 (B) 도 22에 나타낸 네트워크 중의 어느 하나에 나타낸 경로 또는 경로 성분의 억제제를 공동-투여하는 것을 포함하는, 유방암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 대상체에게 (A) Hsp90의 억제제 및 (B) 도 23에 나타낸 네트워크 중의 어느 하나에 나타낸 경로 또는 경로 성분의 억제제를 공동-투여하는 것을 포함하는, 림프종을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 직전의 방법에서, (B)에서의 억제제는 mTOR의 억제제, 예를 들어, PP242일 수 있다. 또한 추가로, 본 발명은 대상체에게 CARM1의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 (CML)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은
(a) 대상체로부터의 암 세포를 함유하는 샘플을 (i) Hsp90이 샘플 내에 존재하는 암 경로 성분에 결합하는 경우에 이러한 Hsp90에 결합하는 Hsp90의 억제제; 또는 (ii) 이러한 Hsp90이 샘플 내의 이러한 암 경로 성분에 결합하는 경우에 Hsp90에 결합하는 이러한 Hsp90 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체와 접촉시키고;
(b) Hsp90에 결합된 경로 성분을 검출함으로써 암-연루된 경로 또는 상기의 하나 이상의 경로 성분를 확인하는 것을 포함하는,
암을 앓고 있는 대상체에서 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 하나 이상의 성분을 확인하는 방법을 제공한다. 이 구체예에서, 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분은 결장직장암, 췌장암, 갑상선암, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 포함한 백혈병, 기저 세포 암종, 흑색종, 신세포암, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함한 폐암, 유방암, 신경아세포종, 골수증식성 장애, 위장 기질성 종양을 포함한 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함한 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종을 포함한 림프종, 및 난소암, 경부암 및 내막암을 포함한 부인과 암으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어떤 암과도 연관될 수 있다. 추가로, 단계 (a)에서 샘플은 종양 조직, 또는 생물학적 유체, 예를 들어, 혈액을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 단계 (a)에서 샘플은 파괴된 암 세포, 용해된 암 세포, 또는 초음파처리된 암 세포를 포함할 수 있다. 그러나, 다른 형태의 세포가 사용될 수도 있다.
본 방법을 실행함에 있어서, PU-H71이 현재 바람직한 억제제이지만, Hsp90의 억제제는 PU-H71 또는 PU-H71의 유사체, 동족체 또는 유도체일 수 있다. 그러나, 본 발명을 실행함에 있어서, Hsp90의 억제제는 도 3에 나타낸 화합물들로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 구체예에서, 단계 (a)에서의 Hsp90의 억제제 또는 Hsp90의 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체는 비드와 같은 고체 지지체 상에 고정화되고/되거나, 단계 (b)에서의 경로 성분의 검출은 질량 분광분석법의 사용을 포함하고/하거나, 단계 (c)에서의 경로 성분의 분석은 생물정보 컴퓨터 프로그램의 사용을 포함한다.
본 발명의 한가지 바람직한 구체예에서, 단계 (a)에서의 Hsp90의 억제제 또는 이러한 Hsp90의 억제제의 유사체, 동족체 또는 유도체의 결합은 암 경로 성분-결합된 상태로 Hsp90을 트랩핑한다.
본 발명은 추가로, 비드와 같은 고체 지지체 상에 고정화된 Hsp90의 억제제를 포함하는, 상기 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 전형적으로, 이러한 키트는 추가로 대조 비드, 완충 용액, 및 사용 설명서를 더 포함할 것이다. 본 발명은 추가로, 고체 지지체 상에 고정화된 Hsp90의 억제제를 제공하며, 여기에서 상기 억제제는 본 발명에 기술된 방법에서 유용하다. 한가지 예에서 억제제는 PU-H71이다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 다음의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
또한 추가로, 본 발명은 암-연루된 경로 또는 이러한 경로의 하나 이상의 성분을 기술된 방법에 따라 확인한 다음에, 이러한 경로 또는 이러한 성분의 억제제를 선택하는 것을 포함하는, 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분의 억제제를 선택하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 기술된 방법에 따라 억제제를 선택하고, 억제제를 대상체에게 단독으로, 또는 경로 성분의 억제제를 투여하는 것과 함께 투여하는 것을 포함하여 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 더욱 전형적으로, 상기의 투여는 반복적으로 수행될 것이다. 또한 추가로, 경로 성분을 확인하거나 억제제를 선택하는 기술된 방법은 동일한 대상체에 대해서 적어도 2회 수행될 수 있다. 아직 또 다른 구체예에서, 본 발명은 이러한 암에 연루된 경로의 성분인 바이오마커 (biomarker)에서의 변화를 측정하는 것을 포함하는, Hsp90 억제제를 이용한 암의 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 사용된 바이오마커는 본 발명에 기술된 방법에 의해서 확인된 성분일 수 있다. 또한, 본 발명은 암에 연루된 경로의 성분인 바이오마커에서의 변화를 모니터링하는 것을 포함하는, Hsp90 억제제 및 Hsp90이 억제하는 암에 연루된 경로의 성분의 제2 억제제 둘 다를 이용한 암의 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 사용된 바이오마커는 제2 억제제에 의해서 억제되는 경로의 성분일 수 있다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명에 기술된 방법에 의해서 암에 연루된 경로의 성분을 확인 (여기에서, 이렇게 확인된 성분은 이전에는 이러한 암에 연루되지 않았음)하는 것을 포함하는, 암의 치료법을 위한 새로운 표적을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 암을 앓고 있는 대상체에게 Hsp90의 억제제와 공동-투여하기 위한 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분의 억제제를 선택하는 방법, 및 Hsp90의 억제제 및 암-연루된 경로 또는 그의 성분의 억제제를 공동-투여함으로써 암 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
도 1은 인간에게서의 예시적인 암-연루된 경로 및 그의 성분을 도시한 것이다.
도 2는 단백질 키나제 억제제의 몇 가지 예를 나타낸다.
도 3은 PU-H71 및 몇 가지 다른 공지된 Hsp90 억제제의 구조를 나타낸다.
도 4. PU-H71은 암 세포에 더 풍부한 제한된 분획과 상호작용한다. (a) 항-Hsp90 항체인 H9010과의 순차적인 면역-침강 단계는 MDA-MB-468 세포 추출물에서 Hsp90을 고갈시킨다. 용해물 = 대조 세포 추출물. (b) MDA-MB-468 추출물로부터의 Hsp90은 순차적인 화학적- 및 면역-침강 단계를 통해서 분리되었다. 각각의 풀 (pool)에서 Hsp90의 양은 밀도측정법 (densitometry)에 의해서 정량되었으며, 값은 내부 표준에 대해서 표준화되었다. (c) 포화 시험은 지시된 세포에서 131I-PU-H71을 사용하여 수행하였다. 모든 분리된 세포 샘플을 계수하고, 131I-PU-H71의 특이적 흡수를 측정하였다. 이들 데이터를 131I-PU-H71의 농도에 대비하여 플롯팅 (plotted)하여 포화 결합 곡선을 제공하였다. 4 개의 별개의 반복시험의 대표적인 데이터를 나타낸다 (하부). 지시된 세포에서 Hsp90의 발현은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다 (상부).
도 5. PU-H71은 종양단백질 및 공동-샤페론과의 복합체에서 Hsp90에 대해 선택적이며, Hsp90을 분리시킨다. (a) K562 추출물 내의 Hsp90 복합체는 비-특이적 IgG인 H9010에 의한 침강에 의해서, 또는 PU-H71- 또는 대조-비드에 의해서 리되었다. 대조 비드는 Hsp90-불활성 물질인 에탄올아민을 함유한다. 풀-다운 (pull-downs) 내의 단백질은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. (b,c) 지적된 바와 같은 단일 또는 순차적 면역- 및 화학적-침강을 지시된 바와 같은 빈도, 및 제시된 순서로 H9010 및 PU-비드를 사용하여 K562 추출물 내에서 수행하였다. 풀-다운 내 및 잔류하는 상등액 내의 단백질을 WB에 의해서 분석하였다. NS = 비-특이적. (d) K562 세포를 24 시간 동안 비히클 (-) 또는 PU-H71 (+)로 처리하고, 단백질을 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. (e) Hsp70-녹다운 세포에서 단백질의 발현은 웨스턴 블럿 (좌측), 및 상대적 발광 유니트 (RLU)에서 나타난 단백질 수준에서의 변화 (우측)에 의해서 분석하였다. 대조군 = 스크램블 (scramble) siRNA. (f) 지시된 바와 같은 순차적인 화학적-침강은 지시된 빈도 및 제시된 순서로 GM-, SNX- 및 NVP-비드를 사용하여 K562 추출물 내에서 수행하였다. 풀-다운 내 및 잔류하는 상등액 내의 단백질은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. (g) K562 세포 내의 Hsp90은 이상 Bcr-Abl 및 정상 c-Abl 단백질 둘 다와의 복합체로 존재한다. H9010이 아닌 PU-H71은 Bcr-Abl 종양단백질 결합된 Hsp90 집단을 선택한다.
도 6. PU-H71은 CML 세포에서 이상 시그날로좀 (signalosome)을 확인한다. (a) 단백질 복합체는 K562 추출물을 PU-비드와 배양함으로써 화학적 침강을 통해서 분리되었으며, 단백질의 동일성은 MS에 의해서 프로브화되었다. 이들 단백질 사이의 연결성은 IPA에 의해서 분서고디었으며, 단백질 네트워크를 생성시켰다. PU-비드에 의해서 확인된 단백질 네트워크 (네트워크 1 내지 13)는 공지된 기본적인 골수성 백혈병 시그날링 (IPA에 의해서 제공됨)과 꽤 중복된다. 확인된 단백질 네트워크 및 성분 단백질의 상세한 리스트는 표 5f 및 도 15에 나타내었다. (b) PU-비드를 강조한 경로 다이어그램은 네트워크 1 (Raf-MAPK 및 PI3K-AKT 경로), 2 (NF-κB 경로) 및 8 (STAT5-경로) 상에 초점을 맞추어 CML 시그날로좀을 확인하였다. 확인된 네트워크에서 주요 노드 단백질 (nodal proteins)은 황색으로 도시된다. (c) MS 결과는 웨스턴 블럿에 의해서 입증되었다. (좌측) 단백질 복합체는 K562 추출물을 PU- 또는 대조-비드와 배양함으로써 화학적 침강을 통해서 분리되었고, 단백질은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. 대조-비드 풀-다운에서 단백질은 검출되지 않았으며, 이들 데이터는 제시의 단순성을 위해서 삭제되었다. (우측) K562 세포는 24 시간 동안 비히클 (-) 또는 PU-H71 (+)로 처리하였으며, 단백질을 WB에 의해서 분석하였다. (d) 단일 화학적-침강은 일차 CML 세포 추출물에서 PU- 및 대조-비드를 사용하여 수행하였다. 풀-다운 내의 단백질은 WB에 의해서 분석하였다.
도 7. PU-H71 확인된 단백질 및 네트워크는 악성 표현형에 중요한 것이다. (a) K562 세포를 72 시간 동안 지시된 억제제로 처리하고, 세포 성장을 알라마르 블루 시험 (Alamar Blue assay)에 의해서 분석하였다. 데이터는 평균±SD (n = 3)로 제시된다. (b) 지시된 바와 같은 순차적인 화학적-침강을 지시된 빈도로 PU-비드를 사용하여 K562 추출물에서 수행하였다. 풀-다운 내 및 잔류하는 상등액 내의 단백질은 WB에 의해서 분석하였다. (c) 트립판 블루 (좌측) 또는 아크리딘 오렌지/에티듐 브로마이드 (우측) 염색을 사용한 세포 생존도에 대한 CARM1 녹다운의 효과를 K562 세포에서 평가하였다. (d) 선택된 잠재적 Hsp90-상호작용 단백질의 발현은 K562 백혈병 및 Mia-PaCa-2 췌장암 세포에서 WB에 의해서 분석하였다. (e) 각각 K562 및 Mia-PaCa-2 세포 추출물로부터 PU-비드 상에 분리시키고, 이어서 MS에 의해서 확인된 선택 단백질을 표로 만들었다. +++, 매우 높음; ++, 높음; +, 중간, 및 -, 확인 펩타이드 없음이 MS 분석에서 발견되었다. (f) 단일 화학적-침강은 PU- 및 대조-비드를 사용하여 Mia-PaCa-2 세포 추출물에서 수행되었다. 풀-다운 내의 단백질은 WB에 의해서 분석하였다. (g) Mia-PaCa-2 세포 성장에 대한 선택 억제제의 효과는 패널 (a)에서와 같이 분석되었다.
도 8. Hsp90은 CML에서 증진된 STAT5 활성을 용이하게 한다. (a) K562 세포를 지시된 시간 동안 PU-H71 (5 μM), 글리벡 (Gleevec) (0.5 μM) 또는 DMSO (비히클)로 처리하고, 단백질을 WB에 의해서 분석하였다. (b) 순차적인 화학적-침강을 지시된 바와 같이 PU- 및 대조-비드를 사용하여 K562 세포에서 수행하였다. 풀-다운 내 및 잔류하는 상등액 내의 단백질은 WB에 의해서 분석하였다. (c) 비히클 또는 PU-H71로 전-처리된 세포로부터의 STAT5 면역-복합체를 지시된 시간 동안 트립신으로 처리하고, 단백질을 WB에 의해서 분석하였다. (d) K562 세포를 지시된 시간 동안 PU-H71 (5 μM)의 존재 및 부재 하에서 바나데이트 (1 mM)로 처리하였다. 단백질은 WB에 의해서 분석하고 (상부), 밀도측정법에 의해서 정량화하고, 처리 시간에 대해서 그래프화하였다 (하부). 데이터는 평균±SD (n = 3)로 제시된다. (e) STAT5a 및 STAT5b의 DNA-결합능은 지시된 농도의 PU-H71로 24 시간 동안 처리된 K562 세포에서 ELISA-기본 시험에 의해서 시험하였다. (f) 정량적 크로마틴 면역침강 시험 (QChIP)은 두 개의 공지된 STAT5 표적 유전자 (CCND2 및 MYC )에 대해 STAT5 또는 Hsp90 항체 대 IgG 대조군을 사용하여 수행하였다. 유전자간 지역을 증폭시키는 프라이머를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 각각의 IgG 대조군에 대비하여 특정 항체 (STAT5 또는 Hsp90)에 대한 투입량 (input)의 백분율로 표현된다. (g) CCND2 및 MYC의 전사물 풍부성은 1 μM의 PU-H71에 노출된 K562 세포에서 QPCR에 의해서 측정되었다. 결과는 기준선 (시간 0 h)과 비교한 폴드 변화 (fold change)로 표현되며, RPL13A에 대해 표준화되었다. HPRT가 음성 대조군으로 사용되었다. 실험은 실험적 이중으로 하여 생물학적 5 배로 수행되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. (h) CML에서 Hsp90-촉진된 증가된 STAT5 시그날링 및 그에 대해 제안된 기전. Hsp90은 STAT5의 입체형태에 결합하여 그에 영향을 미치며, STAT5-함유 전사 복합체 내에서 직접 활성 입체형태로 STAT5를 유지시킨다.
도 9. 종양 종양단백질을 조사하기 위한 화학적-프로테오믹 방법의 개략적 표현. Hsp90은 암 세포 내에서 생화학적으로 뚜렷한 복합체를 형성한다. 암 세포 Hsp90의 주된 분획은 정상 세포와 유사한 "하우스 키핑" 샤페론 기능을 유지하며 (녹색), 그 반면에 암 세포에서 풍부화되거나 팽창된 기능적으로 뚜렷한 Hsp90 풀은 종양 세포 생존을 유지시키는데 필요한 종양원성 단백질과 특이적으로 상호작용한다 (황색). PU-H71은 Hsp90과 특이적으로 상호작용하며, WT 단백질 (녹색)/Hsp90 종이 아닌 종양단백질 (황색)/Hsp90 종을 우선적으로 선택하며, 클라이언트 결합 입체형태 내에 Hsp90을 트랩핑한다. 따라서, PU-H71 비드를 사용하여 종양단백질/Hsp90 종을 분리시킬 수 있다. 초기 단계에서는, 암 세포 추출물을 PU-H71 비드와 배양한다 (1). 이 초기 화학적 침강 단계는 PU-비드 결합된 Hsp90 복합체의 일부분으로서 이상 단백질 집단을 정제 및 풍부하게 한다 (2). 그 후, PU-비드 풀-다운으로부터의 단백질 카고 (cargo)를 SDS 완충액 내에 용출시키고, 표준 SDS-PAGE에 제공하고 (3), 그 후에 분리된 단백질을 LC/MS/MS 분석을 위해서 추출 및 트립신 처리한다 (4). 초기 단백질 확인은 마스코트 (Mascot) 탐색 엔진을 사용하여 수행되며, 스캐폴드 프로테옴 소프트웨어 (Scaffold Proteome Software)를 사용하여 더 평가된다 (5). 그 후, IPA (Ingenuity Pathway Analysis)를 사용하여 확인된 단백질로부터 생물학적 네트워크를 구성한다 (6,7). 창출된 단백질 네트워크 지도는 특정의 종양에 대해서 최적으로 효과적인 개인 맞춤형 치료법을 개발하기 위한 매우 유용한 주형을 제공한다. 방법은 (a) 종양별 방식으로 분자 변화의 지도를 설정하고, (b) 새로운 종양단백질 및 암 기전을 확인하고, (c) Hsp90에 대해 상보적인 치료학적 표적을 확인하고, 이상적인 병용 표적화 요법을 개발하고, (d) Hsp90 치료법으로부터의 이득과 같은 환자의 선택을 위한, 및 임상실험 중에 Hsp90 억제제 효능의 약동학적 모니터링을 위한 종양-특이적 바이오마커를 확인할 수 있다.
도 10. (a, b) 유방암 및 CML 세포 추출물 (120 ㎍)로부터의 Hsp90을 지시된 바와 같이 일련의 화학적 및 면역-정제 단계를 통해서 분리시켰다. 상등액을 분리하여 잔류하는 Hsp90을 분석하였다. 각각의 분획 내의 Hsp90을 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. 용해물 = 내인성 단백질 함량; PU-, GM- 및 대조-비드는 특정한 비드 상에 분리된 단백질을 나타낸다. H9010 및 IgG는 특정한 Ab에 의해서 분리된 단백질을 나타낸다. 대조 비드는 Hsp90 불활성 분자를 함유한다. 데이터는 다수의 반복 실험 (n ≥ 2)으로부터 수득된 것과 일치한다. (c) 순차적인 화학적 및 면역-정제 단계를 말초혈액 백혈구 (PBL) 추출물 (250 ㎍)에서 수행하여 PU-H71 및 H9010-특이적 Hsp90 종을 분리시켰다. 모든 샘플은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. (상부). PBL 내의 Hsp90에 대한 결합은 Hsp90-PE 항체 및 PU-H71-FITC를 사용한 유동 세포분석에 의해서 평가하였다. FITC-TEG = 비-특이적 결합에 대한 대조군 (하부).
도 11. (a) 정상 세포 내에서, Hsp90의 구성적 발현은 세포 단백질이 그들의 적절한 세포 구획으로 폴딩 및 전좌하는 진화적으로 보존된 하우스키핑 기능을 위해서 필요하다 ("하우스키핑 복합체"). 악성 변형 시에, 세포 단백질은 부정확한 세포 구획에서의 돌연변이, 활동항진, 체류, 또는 다른 방법을 통해서 동요된다. 이들 기능적으로 변화된 단백질의 존재는 악성 표현형을 개시시키고 유지시키는데 필요하며, 이것은 스트레스 변형된 Hsp90 ("종양원성 복합체")의 서브세트에 의해서 특이적으로 유지된 종양원성 단백질이다. PU-H71은 종양원성 단백질을 동반하는 Hsp90의 분획 ("종양원성 복합체")에 특이적으로 결합한다. (b) Hsp90 및 그의 상호작용성 공동-샤페론은 PU- 및 대조-비드, 및 H9010 및 IgG-고정화된 항체를 사용하여 K562 세포 추출물에서 분리되었다. 대조 비드는 Hsp90 불활성 분자를 함유한다. (c) K562 세포 추출물로부터의 Hsp90은 H9010 Hsp90 특이적 항체를 사용한 3 개의 일련의 면역-정제 단계를 통해서 분리되었다. 잔류하는 상등액을 분리시켜 잔류하는 단백질을 분석하였다. 각각의 분획 내의 단백질은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. 용해물 = 내인성 단백질 함량. 데이터는 다수의 반복 실험 (n ≥ 2)으로부터 수득된 것과 일치한다.
도 12. GM 및 PU-H71은 이상 단백질/Hsp90 종에 대해서 선택적이다. (a) Bcr-Abl 및 Abl 결합된 Hsp90 종은 일정한 용적의 PU-H71 비드 (80 ㎕)를 지시된 양의 K562 세포 용해물로 프로브화한 실험 (좌측), 또는 일정한 용적의 용해물 (1 ㎎)을 지시된 용적의 PU-H71 비드로 프로브화한 실험 (우측)에서 모니터링하였다. (b) (좌측) PU- 및 GM-비드 (80 ㎕)는 SKMel28 흑색종 세포 추출물 (300 ㎍)에서 Hsp90-돌연변이 B-Raf 복합체를 인식하지만, 정상 결정 섬유아세포 CCD18Co 추출물 (300 ㎍) 내에서 발견되는 Hsp90-WT B-Raf 복합체와 상호작용하는 데는 실패하였다. H9010 Hsp90 Ab는 Hsp90 종 둘 다를 인식한다. (c) MDA-MB-468 세포 추출물 (300 ㎍) 내에서, PU- 및 GM-비드 (80 ㎕)는 HER3 및 Raf-1 키나제와 상호작용하지만, 비-종양원성 티로신-단백질 키나제 CSK, c-Src 관련된 티로신 키나제, 및 p38과는 상호작용하지 않는다. (d) (우측) PU-비드 (80 ㎕)는 v-Src/Hsp90과 상호작용하지만, c-Src/Hsp90 종과는 상호작용하지 않는다. c-Src 검출을 촉진시키기 위해서, v-Src보다 더 낮은 풍부성의 단백질, 더 고량의 c-Src 발현 3T3 세포 용해물 (1,000 ㎍)을 사용하여, v-Src 변형된 3T3 세포 (250 ㎍)와 비교하는 경우에 3T3 세포 (용해물, 3T3 섬유아세포 대 v-Src 3T3 섬유아세포)에서 검출된 더 높은 Hsp90 수준에 대한 설명을 제공하였다. 용해물 = 내인성 단백질 함량; PU-, GM- 및 대조-비드는 특정한 비드 상에서 분리된 단백질을 나타낸다. Hsp90 Ab 및 IgG는 특정한 항체에 의해서 분리된 단백질을 나타낸다. 대조 비드는 Hsp90 불활성 분자를 함유한다. 데이터는 다수의 반복 실험 (n ≥ 2)으로부터 수득된 것과 일치한다.
도 13. 단일 화학적-침강은 Bcr-Abl-발현 CML 세포주 (a)에서, 및 일차 CML 세포 추출물 (b)에서 PU- 및 대조-비드를 사용하여 수행되었다. 풀-다운 내의 단백질은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. 몇 개의 Bcr-Abl 분해 생성물은 보고된 바와 같이 일차 CML 샘플에서 알려져 있다 (Dierov et al., 2004). N/A = 이용할 수 없음.
도 14. PU-H71은 Hsp90에 대해서 선택적이다. (a) 몇 개의 Hsp90 억제제 비드-풀다운의 쿠마시 염색된 겔. K562 용해물 (60 ㎍)을 25 ㎕의 지시된 비드와 함께 배양하였다. 지시된 완충액으로 세척한 후에, 풀-다운 내의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 적용하였다. (b) PU-H71 (10 μM)을 359 키나제에 대해 스캔맥스 스크린 (scanMAX screen; Ambit)에서 시험하였다. PU-H71에 대한 TREEspot™ 상호작용 지도가 제시된다. 단지 SNARK (NUAK 패밀리 SNF1-양 키나제 2) (키나제 나무 상의 적색 도트)만이 소분자의 잠재적인 저친화성 키나제 히트로 보인다.
도 15. PU-비드 상에 풍부하고, IPA (Ingenuity Pathways Analysis) 소프트웨어의 사용에 의한 생물정보 경로 분석에 의해서 생성된 것으로서 높은 점수의 네트워크. 분석은 K562 만성 골수성 백혈병 세포에서 수행되었다. (a) 네트워크 1; 점수 = 38; mTOR/PI3K 및 MAPK 경로. (b) 네트워크 2; 점수 = 36; NFκB 경로. (c) 네트워크 8; 점수 = 14; STAT 경로. (d) 네트워크 12; 점수 = 13; 병소 유착 네트워크. (e) 네트워크 7; 점수 = 22; c-MYC 종양원 구동 경로. (f) 네트워크 10; 점수 = 18; TGFb 경로. 2 또는 그 이상의 점수는 무작위 기회 만에 의해서는 생성되지 않는 적어도 99% 신뢰성을 갖는다.
유전자 발현, 세포 주기 및 세포 조립 개별 단백질은 단백질이 본 시험에서 확인되었음을 나타내도록 회색을 이용하여 노드 (node)로서 표시된다. IPA에 의해서만 확인된 단백질은 백색 노드로 나타낸다. 상이한 형상을 사용하여 유전자 생성물의 기능적 클래스를 나타낸다. 단백질은 네트워크에서, 본체가 복합체의 일부분인 경우에는 두 개의 원으로; 단지 하나의 유니트가 존재하는 경우에는 단일 원으로; 포스파타제 또는 키나제를 각각 기술하기 위해서 상향 또는 하향하는 위치의 삼각형으로; 전사 인자를 기술하기 위해서 수평 타원체 (horizontal oval)에 의해서; 및 "다른" 기능을 도시하기 위해 원으로 도시된다. 가장자리는 노드 사이의 관계의 성질을 설명한다: 화살촉이 있는 가장자리는 단백질 A가 단백질 B 상에 작용하는 것을 의미하는 반면에 화살촉이 없는 가장자리는 단지 두 개의 단백질 사이의 결합을 나타낸다. 직접적인 상호작용은 네트워크 다이아그램에서 실선으로 나타나는 반면에 간접적인 상호작용은 점선으로 나타난다. 일부의 경우에, 관계는 하나의 분자로부터 나와서 동일한 분자로 다시 돌아가는 원형 화살표로 존재할 수 있다. 이러한 관계는 "자기-지시성 (self-referential)"으로 칭하며, 그 자체에 작용하는 분자의 능력으로부터 발생한다.
도 16. PU-비드 상에 풍부하고, IPA (Ingenuity Pathways Analysis) 소프트웨어의 사용에 의한 생물정보 경로 분석에 의해서 생성된 것으로서 높은 점수의 네트워크. 분석은 MiaPaCa2 췌장암 세포에서 수행되었다.
도 17. mTOR 억제제 PP242는 Mia-PaCa-2 세포에서 Hsp90 억제제 PU-H71과 상승적으로 작용한다. 췌장 세포 (Mia-PaCa-2)를 72 시간 동안 단일 작용제 또는 PP242 및 PU-H71의 조합으로 처리하고, 세포독성을 알라마르 블루 시험에 의해서 결정하였다. 약물 조합시험에서 상승작용 및/또는 길항작용의 컴퓨터화된 시뮬레이션 (computerized simulation)은 차우-탈라레이 (Chou-Talalay) 방법을 사용하여 분석하였다. (a) 중앙-효과식 (median-effect equation)에서, fa는 영향을 받은 세포의 분율, 예를 들어, 분획 억제이고; fu=(1-fa)는 영향을 받지 않은 세포의 분율이며; D는 fa를 제공하는데 필요한 용량이다. (b) 실제 실험 데이터를 기초로 하여, 일련의 CI 값을 효과 수준 (Fa)의 전체 범위에 대해서 계산하여 Fa-CI 플롯을 생성시켰다. CI < 1, = 1, 및 > 1은 각각 상승작용, 상가효과 및 길항작용을 나타낸다. (c) 약물 1 (PU-H71) 및 약물 2 (PP242)의 표준화된 용량을 나타내는 표준화된 아이소볼로그램 (isobologram).　 PU = PU-H71, PP = PP242.
mTOR 및 Hsp90 억제제 사이의 상승작용의 정량적 분석: pp242 (mTOR 억제제)와 PU-H71 (Hsp90 억제제) 사이의 약물 상호작용을 측정하기 위해서, 전술한 바와 같이 차우-탈라레이의 병용지수 (combination index; CI) 아이소볼로그램 방법을 사용하였다. 질량 작용의 법칙의 중앙-효과 원리에 기초한 이 방법은 각각의 약물의 기전과는 관계없이 컴퓨터화된 시뮬레이션에 의해서 두 개 또는 그 이상의 약물 조합에 대한 상승작용 또는 길항작용을 정량화한다. 알고리즘을 기초로 하여, 컴퓨터 소프트웨어는 중앙-효과 플롯, 병용지수 플롯 및 표준화된 아이소볼로그램을 표시한다 (여기에서는 2 개의 약물의 비 정수비 조합이 사용된다).　 PU-H71 (0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.0125 μM) 및 pp242 (0.5, 0.125, 0.03125, 0.0008, 0.002, 0.001 μM)를 언급된 농도의 단일 작용제로 사용하거나, 비-정수비 (PU-H71:pp242; 1:1, 1:2, 1:4, 1:7.8, 1:15.6, 1:12.5)로 조합하였다. Fa (사멸 세포 분율)는 수학식 Fa=1-Fu를 사용하여 계산하였으며; Fu는 영향을 받지 않은 세포의 분율이고, 컴퓨터 소프트웨어 (CompuSyn, Paramus,New Jersey, USA)를 사용한 용량 효과 분석을 위해서 사용하였다.
도 18. Bcl-6은 Bcl-6 의존적 DLBCL 세포에서 Hsp90의 클라이언트이며, Hsp90 억제제와 Bcl-6 억제제의 조합은 각각의 억제제 단독인 경우보다 더 효과적이다. a) 세포를 24 시간 동안 지시된 농도의 PU-H71로 처리하고, 단백질을 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. b) PU-H71 비드는 Hsp90이 핵 내에서 Bcl-6과 상호작용하는 것을 나타낸다. c) Hsp90 억제제 PU-H71과 Bcl-6 억제제 RI-BPI의 조합은 Bcl-6 의존적 DLBCL 세포에서 각각의 억제제 단독인 경우보다 더 효과적이다.
도 19. 본 발명의 방법의 몇 번의 반복은 OCI-Ly1 세포에서의 주요 경로로서 B 세포 수용체 네트워크를 확인하여 상기 방법의 견고성 및 정확성을 증명하고 입증한다.
도 20. OCI-LY1 및 OCI-LY7 DLBCL 세포에서 Hsp90 의존적 네트워크로서 B 세포 수용체 네트워크의 입증. a) 세포를 Hsp90 억제제 PU-H71로 처리하고, 단백질을 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. b) PU-H71 비드는 Hsp90이 OCI-LY1 및 OCI-LY7 DLBCL 세포에서 BTK 및 SYK와 상호작용하는 것을 나타낸다. c) Hsp90 억제제 PU-H71과 SYK 억제제 R406의 조합은 Bcl-6 의존적 OCI-LY1, OCI-LY7, Farage 및 SUDHL6 DLBCL 세포에서 각각의 억제제 단독인 경우보다 더 효과적이다.
도 21. CAMKII 억제제 KN93 및 mTOR 억제제 PP242는 K562 CML 세포에서 Hsp90 억제제 PU-H71과 승승적으로 작용한다.
도 22. PU-비드 상에 풍부하고, IPA (Ingenuity Pathways Analysis) 소프트웨어의 사용에 의한 생물정보 경로 분석에 의해서 생성된 것으로서 높은 점수의 네트워크. 분석은 MDA-MB-468 삼중-음성 유방암 세포에서 수행하였다. 방법에 의해서 확인된 주요 시그날링 네트워크는 PI3K/AKT, IGF-IR, NRF2-매개된 산화적 스트레스 반응, MYC, PKA 및 IL-6 시그날링 경로였다. (a) PU-비드 프로테오믹스 및 생물정보 방법에 의해 MDA-MB-468 유방암 세포에서 확인된 네트워크의 단순화된 표현. (b) IL-6 경로. MDA-MB-468 유방암 세포에서 PU-비드 방법에 의해서 확인된 주요 네트워크 성분은 회색으로 도시된다.
도 23. PU-비드 상에 풍부하고, IPA (Ingenuity Pathways Analysis) 소프트웨어의 사용에 의한 생물정보 경로 분석에 의해서 생성된 것으로서 높은 점수의 네트워크. 분석은 OCI-Ly1 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 세포에서 수행하였다. 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 세포주 OCI-LY1에서, 방법에 의해서 확인된 주요 시그날링 네트워크는 B 수용체, PKC테타, PI3K/AKT, CD40, CD28 및 ERK/MAPK 시그날링 경로였다. (a) B 세포 수용체 경로. PU-비드 방법에 의해서 확인된 주요 네트워크 성분은 회색으로 도시된다. (b) CD40 시그날링 경로. PU-비드 방법에 의해서 확인된 주요 네트워크 성분은 회색으로 도시된다. (c) CD28 시그날링 경로. PU-비드 방법에 의해서 확인된 주요 네트워크 성분은 회색으로 도시된다.
도 24. PU-비드 상에 풍부하고, IPA (Ingenuity Pathways Analysis) 소프트웨어의 사용에 의한 생물정보 경로 분석에 의해서 생성된 것으로서 높은 점수의 네트워크. 분석은 Mia-PaCa-2 췌장암 세포에서 수행하였다. (a) PU-비드는 Mia-PaCa-2 암 세포에서 이상 시그날로좀을 확인한다. PU-비드에 의해서 확인된 단백질 경로 중에는 PI3K-Akt-mTOR-NFkB-경로, TGF-베타 경로, Wnt-베타-카테닌 경로, PKA-경로, STAT3-경로, JNK-경로 및 Rac-cdc42-ras-ERK 경로가 있다. (b) 세포 주기-G2/M DNA 손상 체크포인트 규정. PU-비드 방법에 의해서 확인된 주요 네트워크 성분은 회색으로 도시된다.
도 25. PU-H71은 MDA-MB-468 (상부 패널) 및 HCC1937 (하부 패널) 유방암 세포의 클론원성 생존 (clonogenic survival)을 억제하는데 있어서 PARP 억제제와 상승적으로 작용한다.
도 26. Hsp90 억제제의 구조.
도 27. A) Hsp90α (PDB ID: 2FWZ)와 PU-H71 (볼 (ball) 및 스틱 (stick) 모델) 및 화합물 5 (튜브 (tube) 모델)의 상호작용. B) Hsp90α (PDB ID: 2VCI)와 NVP-AUY922 (볼 및 스틱 모델) 및 화합물 10 (튜브 모델)의 상호작용. C) Hsp90α (PDB ID: 3D0B)와 화합물 27 (볼 및 스틱 모델) 및 화합물 20 (튜브 모델)의 상호작용. 수소 결합은 황색 점선으로 나타내며, 중요한 활성 부위 아미노산 잔기 및 물 분자는 스틱으로 표시된다.
도 28. A) K562 추출물 (250 ㎍) 내의 Hsp90은 PU-, SNX- 및 NVP-비드 또는 대조-비드 (80 ㎕)를 사용한 침강에 의해서 분리시켰다. 대조 비드는 Hsp90-불활성 분자인 2-메톡시에틸아민을 함유한다. 풀-다운 내의 단백질은 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. B) MDA-MB-468 세포 추출물 (300 ㎍)에서, PU-비드는 Hsp90을 그의 종양-클라이언트 (onco-client) 단백질 c-Kit 및 IGF-IR과의 복합체로 분리시킨다. Hsp90 종양-클라이언트 단백질의 정상-상태 수준에 대한 PU-H71의 효과를 평가하기 위해서, 세포를 24 시간 동안 PU-H71 (5 μM)로 처리하였다. C) K562 세포 추출물에서, PU-비드 (40 ㎕)는 Hsp90을 Raf-1 및 Bcr-Abl 종양-단백질과의 복합체로 분리시킨다. 용해물 = 내인성 단백질 함량; PU- 및 대조-비드는 특정한 비드 상에 분리된 단백질을 나타낸다. 데이터는 다수의 반복 실험 (n ≥ 2)으로부터 수득된 것과 일치한다.
도 29. A) 스트렙타비딘-고정화된 PU-H71-비오틴 구조물 또는 대조 스트렙타비딘-고정화된 D-비오틴을 함유하는 비드를 사용한 화학적 침강을 통해서 분리된, 알츠하이머병 유전자이식 마우스 모델인 JNPL3 마우스의 뇌로부터의 Hsp90-함유 단백질 복합체. 이상 타우 (tau) 종은 화살표로 지시된다. c1, c2 및 s1, s2, 각각 6-개월-령 암컷 JNPL3 마우스로부터 추출된 피질 및 피질하 뇌 균질물 (우측). 뇌 용해물 단백질 함량의 웨스턴 블럿 분석 (좌측). B) PU-H71-비오틴에 의해서 검출된 것으로서 MV4-11 백혈병 세포 내의 세포 표면 Hsp90. 데이터는 다수의 반복 실험 (n ≥ 2)으로부터 수득된 것과 일치한다.
도 30. PU-H71 비드의 합성 (6).
도 31. PU-H71-비오틴의 합성 (7).
도 32. NVP-AUY922 비드의 합성 (11).
도 33. SNX-2112 비드의 합성 (21).
도 34. SNX-2112의 합성.
도 35. 퓨린 및 퓨린-유사 Hsp90 억제제 비드의 합성. 피리미딘 및 이미다조피리딘 (즉, X= N 또는 CH) 타입 억제제 둘 다가 기술된다. 시약 및 조건: (a) Cs2CO3, 1,2-디브로모에탄 또는 1,3-디브로모프로판, DMF, rt; (b) NH2(CH2)6NHBoc, DMF, rt, 24 h; (c) TFA, CH2Cl2, rt, 1 h; (d) 아피겔 (Affigel)-10, DIEA, DMAP, DMF.
9-(2- 브로모에틸 )-8-(6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 ))-9H-퓨린-6-아민 (2a). DMF (0.6 ㎖) 중의 1a (29 ㎎, 0.0878 mmol), Cs2CO3 (42.9 ㎎, 0.1317 mmol), 1,2-디브로모에탄 (82.5 ㎎, 37.8 ㎕, 0.439 mmol)을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 그 후, 추가의 Cs2CO3 (14 ㎎, 0.043 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 추가로 20 분 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 건조시키고, 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH:AcOH, 15:1:0.5)에 의해서 정제하여 2a (24 ㎎, 63%)를 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 8.24 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.96 (s, 2H), 4.62 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.70 (s, 6H); MS (ESI) m/z 437.2/439.1 [M+H]+.
tert -부틸 (6-((2-(6-아미노-8-((6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일)티오)-9H-퓨린-9-일)에틸)아미노)헥실)카바메이트e (3a). DMF (7 ㎖) 중의 2a (0.185 g, 0.423 mmol) 및 tert-부틸 6-아미노헥실카바메이트 (0.915 g, 4.23 mmol)를 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 [CHCl3:MeOH:MeOH-NH3 (7N), 100:7:3]하여 0.206 g (85%)의 3a를 제공하였다; MS (ESI) m/z 573.3 [M+H]+.
(4a). 3a (0.258 g, 0.45 mmol)를 15 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 45 분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 고진공 하에서 밤새 건조시켰다. 이것을 DMF (12 ㎖)에 용해시키고, 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 25 ㎖의 아피겔 (Affi-Gel) 10 비드 (전세척됨, 3 x 50 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 225 ㎕의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 몇개의 DMAP 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 그 후, 2-메톡시에틸아민 (0.085 g, 97 ㎕, 1.13 mmol)을 첨가하고, 진탕을 30 분 동안 계속하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2:Et3N (9:1, 4 x 50 ㎖), DMF (3 x 50 ㎖), 펠츠 (Felts) 완충액 (3 x 50 ㎖) 및 i-PrOH (3 x 50 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드 4a를 -80℃에서 i-PrOH 내에 저장하였다 (비드:i-PrOH (1:2), v/v).
9-(3- 브로모프로필 )-8-(6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-6-아민 (2b). DMF (2 ㎖) 내의 1a (60 ㎎, 0.1818 mmol), Cs2CO3 (88.8 ㎎, 0.2727 mmol), 1,3-디브로모프로판 (184 ㎎, 93 ㎕, 0.909 mmol)을 실온에서 40 분 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 건조시키고, 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH:AcOH, 15:1:0.5)에 의해서 정제하여 2b (60 ㎎, 73%)를 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.26 (s, 1H), 6.84 (br s, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.92 (s, 2H), 4.35 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.68 (s, 6H), 2.34 (m, 2H); MS (ESI) m/z 451.1/453.1 [M+H]+.
tert -부틸 (6-((3-(6-아미노-8-((6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일)티오)-9H-퓨린-9-일)프로필)아미노)헥실)카바메이트 (3b). DMF (7 ㎖) 내의 2b (0.190 g, 0.423 mmol) 및 tert-부틸 6-아미노헥실카바메이트 (0.915 g, 4.23 mmol)를 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 [CHCl3:MeOH:MeOH-NH3 (7N), 100:7:3]하여 0.218 g (88%)의 3b를 제공하였다; MS (ESI) m/z 587.3 [M+H]+.
(4b). 3b (0.264 g, 0.45 mmol)를 15 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 45 분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 고진공 하에서 밤새 건조시켰다. 이것을 DMF (12 ㎖)에 용해시키고, 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 25 ㎖의 아피겔 10 비드 (전세척됨, 3 x 50 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 225 ㎕의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 몇 개의 DMAP 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 그 후, 2-메톡시에틸아민 (0.085 g, 97 ㎕, 1.13 mmol)를 첨가하고, 30 분 동안 진탕을 계속하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2:Et3N (9:1, 4 x 50 ㎖), DMF (3 x 50 ㎖), 펠츠 완충액 (3 x 50 ㎖) 및 i-PrOH (3 x 50 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드 4b를 -80도에서 i-PrOH (비드:i-PrOH (1:2), v/v) 내에 저장하였다.
1-(2- 브로모에틸 )-2-((6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-4-아민 (5a). DMF (2 ㎖) 중의 1b (252 ㎎, 0.764 mmol), Cs2CO3 (373 ㎎, 1.15 mmol), 1,2-디브로모에탄 (718 ㎎, 329 ㎕, 3.82 mmol)을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 그 후, 추가의 Cs2CO3 (124 ㎎, 0.38 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 추가로 20 분 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 건조시키고, 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH, 10:1)에 의해서 정제하여 5a (211 ㎎, 63%)를 제공하였다; MS (ESI) m/z 436.0/438.0 [M+H]+.
tert -부틸 (6-((2-(4-아미노-2-((6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일)티오)-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-1-일)에틸)아미노)헥실)카바메이트h (6a). DMF (7 ㎖) 중의 5a (0.184 g, 0.423 mmol) 및 tert-부틸 6-아미노헥실카바메이트 (0.915 g, 4.23 mmol)를 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 [CHCl3:MeOH:MeOH-NH3 (7N), 100:7:3]하여 0.109 g (45%)의 6a를 제공하였다; MS (ESI) m/z 572.3 [M+H]+.
(7a). 6a (0.257 g, 0.45 mmol)를 15 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 45 분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 고진공 하에서 밤새 건조시켰다. 이것을 DMF (12 ㎖)에 용해시키고, 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 25 ㎖의 아피겔 10 비드 (전세척됨, 3 x 50 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 225 ㎕의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 몇 개의 DMAP 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 그 후, 2-메톡시에틸아민 (0.085 g, 97 ㎕, 1.13 mmol)을 첨가하고, 30 분 동안 진탕을 계속하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2:Et3N (9:1, 4 x 50 ㎖), DMF (3 x 50 ㎖), 펠츠 완충액 (3 x 50 ㎖) 및 i-PrOH (3 x 50 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드 7a는 -80℃에서 i-PrOH (비드:i-PrOH (1:2), v/v) 내에 저장하였다.
비드 7b는 7a에 대해 상술한 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
도 36. 비오티닐화된 퓨린 및 퓨린-유사 Hsp90 억제제의 합성. 시약 및 조건: (a) EZ-Link® 아민-PEO3-비오틴, DMF, rt.
(8a). DMF (0.2 ㎖) 중의 2a (3.8 ㎎, 0.0086 mmol) 및 EZ-Link® 아민-PEO3-비오틴 (5.4 ㎎, 0.0129 mmol)을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 [CHCl3:MeOH-NH3 (7N), 10:1]하여 2.3 ㎎ (35%)의 8a를 제공하였다. MS (ESI): m/z 775.2 [M+H]+.
(9a). DMF (0.2 ㎖) 중의 5a (3.7 ㎎, 0.0086 mmol) 및 EZ-Link® 아민-PEO3-비오틴 (5.4 ㎎, 0.0129 mmol)을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 [CHCl3:MeOH-NH3 (7N), 10:1]하여 1.8 ㎎ (27%)의 9a를 제공하였다. MS (ESI): m/z 774.2 [M+H]+.
비오티닐화된 화합물 8b 및 9b는 각각 2b 및 5b로부터 유사한 방식으로 제조하였다.
도 37. 비오티닐화된 퓨린 및 퓨린-유사 Hsp90 억제제의 합성. 시약 및 조건: (a) N-(2-브로모에틸)-프탈이미드 또는 N-(3-브로모프로필)-프탈이미드, Cs2CO3, DMF, rt; (b) 하이드라진 하이드레이트, MeOH, CH2Cl2, rt; (c) EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴, DIEA, DMF, rt; (d) EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴, DIEA, DMF, rt.
2-(3-(6-아미노-8-(6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-9-일)프로필)이소인돌린-1,3-디온. DMF (15 ㎖) 중의 1a (0.720 g, 2.18 mmol), Cs2CO3 (0.851 g, 2.62 mmol), 2-(3-브로모프로필)이소인돌린-1,3-디온 (2.05 g, 7.64 mmol)을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 건조시키고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH:AcOH, 15:1:0.5)에 의해서 정제하여 0.72 g (63%)의 표제 화합물을 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4): δ 8.16 (s, 1H), 7.85-7.87 (m, 2H), 7.74-7.75 (m, 2H), 6.87 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 5.88 (s, 2H), 4.37 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.69 (s, 6H), 2.37-2.42 (m, 2H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ C25H24N7O4S에 대한 계산치, 518.1610; 실측치 518.1601.
9-(3-아미노프로필)-8-(6- (디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-6-아민 (10b). CH2Cl2:MeOH (4 ㎖:28 ㎖) 중의 2-(3-(6-아미노-8-(6-(디메틸아미노)벤조[d][1,3]디옥솔-5-일티오)-9H-퓨린-9-일)프로필)이소인돌린-1,3-디온 (0.72 g, 1.38 mmol), 하이드라진 하이드레이트 (2.86 g, 2.78 ㎖, 20.75 mmol)를 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 건조시키고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 20:1)에 의해서 정제하여 430 ㎎ (80%)의 10b를 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.33 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 5.91 (s, 2H), 5.85 (br s, 2H), 4.30 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.69 (s, 6H), 2.65 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.89-1.95 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 154.5, 153.1, 151.7, 148.1, 147.2, 146.4, 144.8, 120.2, 120.1, 109.3, 109.2, 101.7, 45.3, 45.2, 40.9, 38.6, 33.3; HRMS (ESI) m/z [M+H]+, C17H22N7O2S에 대한 계산치, 388.1556; 실측치 388.1544.
(12b). DMF (0.5 ㎖) 중의 10b (13.6 ㎎, 0.0352 mmol), EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴 (22.0 ㎎, 0.0387 mmol) 및 DIEA (9.1 ㎎, 12.3 ㎕, 0.0704 mmol)를 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 10:1)에 의해서 정제하여 22.7 ㎎ (77%)의 12b를 제공하였다. MS (ESI): m/z 840.2 [M+H]+.
(14b). DMF (0.5 ㎖) 중의 10b (14.5 ㎎, 0.0374 mmol), EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴 (24.2 ㎎, 0.0411 mmol) 및 DIEA (9.7 ㎎, 13 ㎕, 0.0704 mmol)를 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 10:1)에 의해서 정제하여 24.1 ㎎ (75%)의 14b를 제공하였다. MS (ESI): m/z 861.3 [M+H]+.
비오티닐화된 화합물 12a, 13a, 13b, 14a, 15a 및 15b는 12b 및 14b에 대해 기술된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
도 38. 데비오 (Debio) 0932 타입 비드의 합성. 시약 및 조건: (a) Cs2CO3, DMF, rt; (b) TFA, CH2Cl2, rt; (c) 6-(BOC-아미노)카프로산, EDCI, DMAP, rt, 2 h; (d) 아피겔-10, DIEA, DMAP, DMF.
8-((6- 브로모벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9-(2-(피페리딘-4-일)에틸)-9H-퓨린-6-아민 (18). DMF (10 ㎖) 중의 16 (300 ㎎, 0.819 mmol), Cs2CO3 (534 ㎎, 1.64 mmol), 17 (718 ㎎, 2.45 mmol)을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에서 건조시키고, 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH, 10:1)하여 Boc-보호된 N9/N3 이성체의 혼합물을 제공하였다. 20 ㎖의 TFA:CH2Cl2 (1:1)를 실온에서 첨가하고, 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 건조시키고, 정제용 HPLC에 의해서 정제하여 18 (87 ㎎, 22%)을 제공하였다; MS (ESI) m/z 477.0 [M+H]+.
6-아미노-1-(4-(2-(6-아미노-8-((6- 브로모벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9H-퓨린-9-일)에틸)피페리딘-1-일)헥산-1-온e (19). CH2Cl2 (5 ㎖) 중의 18 (150 ㎎, 0.314 mmol)의 혼합물에 6-(Boc-아미노)카프로산 (145 ㎎, 0.628 mmol), EDCI (120 ㎎, 0.628 mmol) 및 DMAP (1.9 ㎎, 0.0157 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한 다음에 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 정제용 TLC [CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 15:1]에 의해서 정제하여 161 ㎎ (74%)의 19를 제공하였다; MS (ESI) m/z 690.1 [M+H]+.
(20). 19 (0.264 g, 0.45 mmol)를 15 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 45 분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 고진공 하에서 밤새 건조시켰다. 이것을 DMF (12 ㎖)에 용해시키고, 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 25 ㎖의 아피겔 10 비드 (전세척됨, 3 x 50 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 225 ㎕의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 몇 개의 DMAP 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 그 후, 2-메톡시에틸아민 (0.085 g, 97 ㎕, 1.13 mmol)을 첨가하고, 30 분 동안 진탕을 계속하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2:Et3N (9:1, 4 x 50 ㎖), DMF (3 x 50 ㎖), 펠츠 완충액 (3 x 50 ㎖) 및 i-PrOH (3 x 50 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드 20는 -80℃에서 i-PrOH (비드:i-PrOH (1:2), v/v) 내에 저장하였다.
도 39. 비오틴에 연결된 데비오 0932의 합성. 시약 및 조건: (a) EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴, DIEA, DMF, 35℃; (b) EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴, DIEA, DMF, 35℃.
(21). DMF (0.5 ㎖) 중의 18 (13.9 ㎎, 0.0292 mmol), EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴 (18.2 ㎎, 0.0321 mmol) 및 DIEA (7.5 ㎎, 10.2 ㎕, 0.0584 mmol)를 35℃에서 6 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 10:1)에 의해서 정제하여 7.0 ㎎ (26%)의 21을 제공하였다. MS (ESI): m/z 929.3 [M+H]+.
(22). DMF (0.5 ㎖) 중의 18 (13.9 ㎎, 0.0292 mmol), EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴 (18.9 ㎎, 0.0321 mmol) 및 DIEA (7.5 ㎎, 10.2 ㎕, 0.0584 mmol)를 35℃에서 6 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 10:1)에 의해서 정제하여 8.4 ㎎ (30%)의 22를 제공하였다; MS (ESI): m/z 950.2 [M+H]+.
도 40. 비오틴에 연결된 SNX 2112 타입 Hsp90 억제제의 합성. 시약 및 조건: (a) EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴, DIEA, DMF, rt; (b) EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴, DIEA, DMF, rt.
(24). DMF (0.5 ㎖) 중의 23 (16.3 ㎎, 0.0352 mmol), EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴 (22.0 ㎎, 0.0387 mmol) 및 DIEA (9.1 ㎎, 12.3 ㎕, 0.0704 mmol)를 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH, 10:1)에 의해서 정제하여 26.5 ㎎ (82%)의 24를 제공하였다; MS (ESI): m/z 916.4 [M+H]+.
(25). DMF (0.5 ㎖) 중의 23 (17.3 ㎎, 0.0374 mmol), EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴 (24.2 ㎎, 0.0411 mmol) 및 DIEA (9.7 ㎎, 13 ㎕, 0.0704 mmol)를 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH, 10:1)에 의해서 정제하여 30.1 ㎎ (78%)의 25를 제공하였다; MS (ESI): m/z 937.3 [M+H]+.
본 발명은 암-연루된 경로 및 암의 발생 및 진행에 연루된 Hsp90과 연관된 암-연루된 경로의 특정 성분 (예를 들어, 종양단백질)을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 암을 앓고 있는 대상체로부터의 암 세포를 함유하는 샘플을 Hsp90의 억제제와 접촉시키고, Hsp90의 억제제에 결합된 암-연루된 경로의 성분을 검출하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 특정의 용어는 다음과 같이 이러한 각각의 용어에 대해 제시된 의미를 갖는다:
"암-연루된 경로"는 정상으로부터 암 표현형으로의 변형에 포함되는 변이가 있는 모든 분자 경로를 의미한다. 암-연루된 경로는 대사, 유전자 정보 처리, 환경적 정보 처리, 세포 과정, 및 유기체 시스템에 수반된 경로를 포함할 수 있다. 이러한 다수의 경로의 리스트는 표 1에 제시되며, 이러한 경로에 대한 더 상세한 정보는 KEGG PATHWAY 데이터베이스 및 National Cancer Institute's Nature Pathway Interaction 데이터베이스에서 온라인으로 찾을 수 있다. 또한, Cell Signaling Technology, Beverly, Mass.; BioCarta, San Diego, Calif.; 및 Invitrogen/Life Technologies Corporation, Clarsbad, Calif의 웹사이트를 또한 참조한다. 또한, 도 1은 암에 수반되는 것으로 인식된 경로를 도시한다.
[표 1] 잠재적 암-연루된 경로의 예
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"암-연루된 경로의 성분"은 경로의 억제, 및 경로와 연관되고, 경로에서의 활성으로부터 야기되는 암 표현형에서의 변화를 일으키기 위해서 표적화될 수 있는 암-연루된 경로에 위치하는 분자 본체를 의미한다. 이러한 성분의 예는 도 1에 열거된 성분들을 포함한다.
"암-연루된 경로의 성분의 억제제"는 경로의 억제, 및 경로에서의 활성으로부터 야기되는 암 표현형에서의 변화를 일으키도록 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분과 상호작용하는 화합물 (Hsp90의 억제제는 아님)을 의미한다. 특정한 성분의 억제제의 예는 광범하게 공지되어 있다. 단순히 예를 들어, 다음의 미국 특허 및 미국 특허출원이 이하에 제시된 바와 같은 경로 성분의 억제제의 예를 기술하고 있다:
SYK: 미국 특허출원 공개 US 2009/0298823 A1, US 2010/0152159 A1, US 2010/0316649 A1
BTK: 미국 특허 6,160,010; 미국 특허출원 공개 US 2006/0167090 A1, US 2011/0008257 A1
EGFR: 미국 특허 5,760,041; US 7,488,823 B2; US 7,547,781 B2
mTOR: 미국 특허 US 7,504,397 B2; 미국 특허출원 공개 US 2011/0015197 A1
MET: 미국 특허 US 7,037,909 B2; 미국 특허출원 공개 US 2005/0107391 A1, US 2006/0009493 A1
MEK: 미국 특허 US 6,703,420 B1; 미국 특허출원 공개 US 2007/0287737 A1
VEGFR: 미국 특허 US 7,790,729 B2; 미국 특허출원 공개 US 2005/0234115 A1, US 2006/0074056 A1
PTEN: 미국 특허출원 공개 US 2007/0203098 A1, US 2010/0113515 A1
PKC: 미국 특허 5,552,396; US 7,648,989 B2
Bcr-Abl: 미국 특허 US 7,625,894 B2; 미국 특허출원 공개 US 2006/0235006 A1
또한 추가로, 단백질 키나제의 억제제의 몇 가지 예는 도 2에 나타내었다.
"Hsp90의 억제제"는 샤페론, 열 충격 단백질 90 (Hsp90)과 상호작용하고, 그의 활성을 억제하는 화합물을 의미한다. PU-H71을 포함한 몇 가지의 공지된 Hsp90 억제제의 구조는 도 3에 나타내었다. 다수의 추가의 Hsp90 억제제는 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 7,820,658 B2; US 7,834,181 B2; 및 US 7,906,657 B2를 참조한다. 또한 다음의 문헌을 참조한다:
Hardik J Patel, Shanu Modi, Gabriela Chiosis, Tony Taldone. Advances in the discovery and development of heat-shock protein 90 inhibitors for cancer treatment. Expert Opinion on Drug Discovery May 2011, Vol. 6, No. 5, Pages 559-587: 559-587;
Porter JR, Fritz CC, Depew KM. Discovery and development of Hsp90 inhibitors: a promising pathway for cancer therapy. Curr Opin Chem Biol. 2010 Jun; 14(3): 412-20;
Janin YL. ATPase inhibitors of heat-shock protein 90, second season. Drug Discov Today. 2010 May; 15(9-10): 342-53;
Taldone T, Chiosis G. Purine-scaffold Hsp90 inhibitors. Curr Top Med Chem. 2009; 9(15): 1436-46; 및
Taldone T, Sun W, Chiosis G. Discovery and Development of heat shock protein 90 inhibitors. Bioorg Med Chem. 2009 Mar 15; 17(6): 2225-35.
소분자 Hsp90 프로브
고체 지지체에 대한 소분자의 부착은 그들의 표적 및 표적의 상호작용 파트너를 프로브화하는 매우 유용한 방법이다. 실제로, 고체 지지체에 부착된 젤다나마이신은 그의 표적으로서 Hsp90의 확인을 허용하였다. 아마도, 이러한 화학적 프로브를 디자인하는데 가장 결정적인 관점은 소분자 리간드의 부착을 위한 적절한 부위를 결정하고, 분자와 고체 지지체 사이의 적절한 링커를 디자인하는 것이다. Hsp90 화학적 프로브를 디자인하는 본 발명자들의 전략은 몇 개의 단계를 수반한다. 첫째로, 최적 링커 길이 및 Hsp90 리간드에 대한 그의 부착 부위를 입증하기 위해서 링커-변형된 리간드를 Hsp90α의 적절한 X-선 결정 구조 상에 도킹시켰다. 둘째로, 링커-변형된 리간드를 암 세포 추출물로부터 유도된 Hsp90에 대한 경쟁적 결합을 측정하는 형광 분극화 (fluorescent polarization; FP) 시험에서 평가하였다. 이 시험은 FP-최적화 Hsp90 리간드로서 Cy3b-표지된 젤다나마이신을 사용한다 (Du et al., 2007). 이들 단계는 고체-지지체 고정화된 분자가 Hsp90에 대한 강력한 친화성을 유지하는 것을 보장하는데 중요하다. 마지막으로, 링커-변형된 소분자를 고체 지지체에 부착시키고, 그와 Hsp90의 상호작용을 Hsp90-함유 세포 추출물과의 배양에 의해서 입증하였다.
프로브가 그의 종양-클라이언트 단백질과의 복합체에서 Hsp90을 확인하기 위해서 필요한 경우에, 추가의 중요한 필요조건은 (1) 프로브가 "종양원성 Hsp90 종"에 대한 선택성을 유지하고, (2) Hsp90에 대해 결합하면, 프로브는 클라이언트-단백질 결합된 입체형태로 Hsp90을 가두는 것이다. "종양원성 Hsp90"의 개념은 본 출원에서뿐만 아니라 도 11에서 더 정의된다.
프로브가 질량 분광분석법 기술에 의해 그의 종양-클라이언트 단백질과의 복합체로 Hsp90을 확인하는데 필요한 경우에, 추가의 중요한 필요조건은 (1) 프로브가 충분한 단백질 물질을 분리시키며, (2) 각각 Hsp90 종양-클라이언트 및 비특이적으로 수지-결합된 단백질의 양에 의해서 정의되는 바와 같은 비에 대한 시그날이 질량 분광분석법에 의해서 확인할 수 있도록 충분히 커야 하는 것이다. 본 발명은 이러한 프로브의 생산의 예를 제공한다.
본 발명자들은 리간드 부착을 위해서 아피겔 (Affi-Gel®) 10 (BioRad)을 선택하였다. 이들 아가로즈 비드는 10C 스페이서 팔 (spacer arm)의 말단에서 N-하이드록시석신이미드 에스테르를 가지며, 따라서 각각의 링커는 원위 아민 작용기를 함유하도록 디자인되었다. PU-H71에 대한 링커 부착의 부위는 인간 Hsp90α (PDB ID: 2FWZ)의 N-말단 영역에 결합된 이것의 공-결정 구조에 의해서 도움을 받았다. 이 구조는 퓨린의 N9 아민이 단백질과의 직접적인 접촉을 만들지 않고, 용매쪽으로 유도됨을 나타낸다 (도 27A) (Immormino et al., 2006). 마찬가지로, 이전의 SAR은 이것이 이전에 수-가용화 그룹의 도입을 위해서 사용되었기 때문에, 이것이 매력적인 부위임을 나타내었다 (He et al., 2006). 화합물 5 (PU-H71-C6 링커)를 디자인하여 Hsp90 활성 부위 상에 도킹시켰다 (도 27A). PU-H71의 상호작용은 모두 보존되었으며, 컴퓨터 모델은 분명하게 링커가 용매 노출된 지역쪽으로 향하였음을 나타내었다. 따라서, 화합물 5는 고체 지지체에 대한 부착을 위한 즉시 전구체로서 합성되었다 (참조: Chemistry, 도 30). FP 시험에서, 5는 Hsp90에 대한 친화성 (IC50 = PU-H71에 대한 22.4 nM에 비해 19.8 nM, 표 8)을 유지하였으며, 이것은 따라서 본 발명자들이 아피겔 (Affi-Gel®) 10에 대한 부착에 의해서 고체 지지체 고정화된 PU-H71 프로브 (6)의 합성쪽으로 신뢰를 가지로 이동할 수 있도록 하였다 (도 30).
본 발명자들은 또한, PU-H71의 비오티닐화된 유도체를 디자인하였다. 고체 지지된 작용제에 비해서 비오티닐화된 작용제의 한가지 이점은 이들이 세포 내에서, 또는 생체내 시스템에서 직접적으로 결합을 프로브화하기 위해서 사용될 수 있다는 점이다. 그 후, 리간드-Hsp90 복합체는 비오틴-결합 아비딘 또는 스트렙타비딘 함유 비드 상에 포획될 수 있다. 전형적으로, 이 과정은 세포 추출물로부터의 화학적 침강과 연관된 비특이적 결합을 감소시킨다. 대신으로, 생체내 실험의 경우에 활성 부위 (이 경우에는 Hsp90)의 존재는 표지된-스트렙타비딘 컨주게이트 (즉, FITC-스트렙타비딘)를 사용함으로써 특이적 조직 (즉, 암에서 종양 매스)에서 검출될 수 있다. 비오티닐화된 PU-H71 (7)은 2와 비오티닐-3,6,9-트리옥사운데칸디아민 (EZ-Link® 아민-PEO3-비오틴)과의 반응에 의해서 수득되었다 (도 31). 7은 Hsp90에 대한 친화성 (IC50 = 67.1 nM)을 유지하였으며, 친화성 정제를 위해 스트렙타비딘과 상호작용할 수 있는 노출된 비오틴을 함유한다.
SAR로부터 뿐만 아니라 NVP-AUY922와 Hsp90α (PDB ID: 2VCI, 도 27B)의 이용가능한 공-결정 구조 및 관련된 3,4-디아릴피라졸과 Hsp90α의 공-결정 구조로부터, 4-아릴 환의 파라-위치에서의 치환에 대한 상당한 정도의 용인이 있었음이 명백하였다 (Brough et al., 2008; Cheung et al., 2005; Dymock et al., 2005; Barril et al., 2006). 4-아릴 치환체는 대부분 용매쪽으로 향하고, 파라-위치에서의 치환은 결합 친화성에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보이기 때문에, 본 발명자들은 분자를 이 위치에서 고체 지지체에 부착시키도록 결정하였다. 부착을 가능하게 하기 위해서, 모르폴린 그룹을 1,6-디아미노헥실 그룹으로 변화시켜 고체 지지체에 대한 부착을 위한 즉시 전구체로서 10을 제공하였다. 활성 부위 상에 10을 도킹시키는 것 (도 27B)은 이것이 NVP-AUY922의 상호작용을 모두 유지시키며, 링커는 용매 노출된 지역쪽으로 향하는 것을 나타낸다. 10을 결합 시험에서 시험한 경우에, 이것은 또한 친화성 (IC50 = NVP-AUY922에 대해서 4.1 nM인데 비해서 7.0 nM, 표 8)을 유지하였으며, 이어서 고체 지지체에 대한 부착을 위해서 사용되었다 (참조: Chemistry, 도 32).
비록 Hsp90과 SNX-2112의 공-결정 구조는 공공연하게 이용할 수 없지만, Hsp90α (PDB ID: 3D0B, 도 27C)에 결합된 관련된 테트라하이드로-4H-카바졸-4-온 (27)의 공-결정 구조가 있다 (Barta et al., 2008). 이것은 27에 대해 보고된 SAR과 함께 트랜스-4-아미노사이클로헥산올 치환체의 하이드록실에 대한 링커 부착을 시사한다. 에스테르 결합을 통한 6-아미노-카프로산의 직접적인 부착은 편재하는 에스테라제에 기인한 용해물 혼합물 내에서의 이러한 결합의 잠재적인 불안정성으로 인하여 바람직하지 않은 것으로 생각되었다. 따라서, 하이드록실은 아미노로 치환되어 트랜스-1,4-디아미노사이클로헥산 유도체 18 (도 33)을 제공하였다. 이러한 변화는 SNX-2112와 비교하여 효력에 있어서 거의 14-배 상실을 야기하였다 (표 8). 6-(Boc-아미노)카프로산을 18에 부착시키고, 탈보호한 후에 비드에 대한 부착을 위한 즉시 전구체로서 20을 수득하였다 (참조: Chemistry, 도 33). 도킹은 20이 27과 유사하게 상호작용하며 (도 27C), 링커는 용매 노출된 지역쪽으로 향하는 것을 시사한다. 20은 Hsp90에 대한 우수한 친화성 (IC50 = SNX-2112에 대한 15.1 nM 및 18에 대한 210.1 nM에 비해서 24.7 nM, 표 8)을 갖고, 18에 의해서 상실된 친화성을 거의 대부분 회복한 것으로 결정되었다. 화합물 20 (-C=O, 도 27C) 및 SNX-2112 (-OH, 도면에 나타내지 않음)는 Lys 58의 측쇄 아미노와 수소 결합을 형성하기 때문에, 18과 20 및 SNX-2112 둘 다 사이의 활성에 있어서의 차이는 본 발명자들의 결합 모델에 의해서 잘 설명된다. 18은 강염기성 아미노 그룹을 함유하며, Lys 58 측쇄 (NH2, 도면에 나타내지 않음)와 수소 결합을 형성할 수 없다. 이것은 이 위치에서의 염기성 아민이 바람직하지 않다는 후앙 (Huang) 등의 관찰과 잘 일치한다. 20의 아미드 결합은 18의 염기성 아미노를, SNX-2112의 하이드록실과 마찬가지로 Lys 58에 대한 H-결합 수용기로서 작용할 수 있는 비-염기성 아미드 그룹으로 전환시킨다.
PU-H71 비드 (6)의 합성은 도 30에 나타내었으며, 35% 수율로 2를 수득하는 1,3-디브로모프로판에 의한 8-아릴설파닐퓨린 (1) (He et al., 2006)의 9-알킬화로 시작한다. 2의 형성에서 수득된 낮은 수율은 주로, 피할 수 없는 경쟁적 3-알킬화에 기인할 수 있다. 1,3-디브로모프로판의 5 개의 등가물을 사용하여 1의 완전한 반응을 보장하고, 또한 낮은 수율에 기여할 수 있는 다이머화와 같은 다른 바람직하지 않는 부반응을 제한하였다. 2를 tert-부틸 6-아미노헥실카바메이트 (3)와 반응시켜 90% 수율로 Boc-보호된 아미노 퓨린 4를 제공하였다. TFA에 의한 탈보호에 이어서 아피겔 (Affi-Gel®) 10과의 반응으로 6을 제공하였다. 비오티닐화된 PU-H71 (7)은 또한 2를 EZ-Link® 아민-PEO3-비오틴과 반응시킴으로써 합성되었다 (도 31).
알데히드 8 (Brough et al., 2008)로부터의 NVP-AUY922 비드 (11)의 합성은 도 32에 나타내었다. 9는 3에 의한 8의 환원적 아미노화로부터 Boc 그룹의 검출가능한 손실이 없이 75% 수율로 수득되었다. 단일 단계에서, Boc 및 벤질 보호 그룹 둘 다를 BCl3에 의해서 제거하여 이속사졸 10을 78% 수율로 제공하였으며, 이것은 그 후에 아피겔 (Affi-Gel®) 10과 반응하여 11을 제공하였다.
SNX-2112 비드 (21)의 합성은 도 33에 나타내었으며, 화합물 17과 18은 특허 문헌 (Serenex et al., 2008, WO-2008130879A2; Serenex et al., 2008, US-20080269193A1)에 언급되어 있지만, 어떤 것도 적절하게 특정화되지 않았거나, 그들의 합성이 충분히 기술되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 합성을 상세하게 기술하는 것이 가치있는 것으로 느낀다. 토실하이드라존 14는 토실 하이드라지드 (12)와 디메돈 (13)의 축합으로부터 89% 수율로 수득되었다. 14의 테트라하이드로인다졸론 15로의 단일-포트 (one-pot) 전환반응은 트리플루오로아세트산 안하이드라이드로 처리함으로써 생성된 중간체 트리플루오로아실 유도체의 염기 촉진된 폐환축합에 따라 55% 수율로 일어난다. 15를 DMF 중에서 2-브로모-4-플루오로벤조니트릴과 반응시켜 91% 수율로 16을 제공하였다. 아릴화가 N1에서 선택적으로 일어나기 때문에 이 반응의 위치선택성을 주목하는 것은 흥미롭다. 15와 유사한 인다졸-4-온의 컴퓨터 연구에서, 1H 및 2H-호변이성체는 둘 다 평형으로 존재하는 것으로 알려졌으며, 그러나 그의 더 큰 쌍극자 모멘트 (dipole moment)로 인하여 1H 호변이성체가 극성 용매에서 바람직하다 (Claramunt et al., 2006). 트랜스-1,4-디아미노사이클로헥산에 의한 16의 아미노화는 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐 [Pd2(dba)3] 및 2-디사이클로헥실포스피노-2'-(N,N-디메틸아미노)비페닐 (DavePhos)을 사용하여 버크월드 (Buchwald) 조건 (Old et al., 1998) 하에서 성취되어 41%의 조합 수율로 아미드 18 (17%)과 함께 니트릴 17 (24%)을 제공하였다. 17의 완전한 가수분해 후에, 18을 EDCI/DMAP에 의해서 6-(Boc-아미노)카프로산에 커플링시켜 91% 수율로 19를 제공하였다. 탈보호 후에, 20을 수득하고, 그 후에 이것을 아피겔 (Affi-Gel®) 10과 반응시켜 21을 제공하였다.
몇 가지 방법을 사용하여 최종 프로브의 합성을 위한 반응의 진행을 측정하였다. 액체의 UV 모니터링은 각각의 화합물에 대한 λmax에서의 감소를 측정함으로써 사용되었다. 일반적으로, 1.5 시간 후에 λmax에서 추가의 감소는 없는 것으로 관찰되었으며, 이것은 반응의 완결을 시사한다. TLC는 반응의 진행의 조척도 (crude measure)로 사용된 반면에 액체의 LC-MS 모니터링은 완전한 반응을 확인하기 위해서 사용되었다. 과량의 화합물 (1.2 eq.)이 사용되었기 때문에 TLC 상에서 스포트는 사라질 수 없는 반면에, 강도에서의 뚜렷한 감소는 반응의 진행을 나타내었다.
Hsp90 억제제 PU-H71 (He et al., 2006) 및 NVP-AUY922 (Brough et al., 2008)의 합성 및 완전한 특정화는 다른 곳에서 보고되었다. SNX-2112는 특허 문헌 (Serenex et al., 2008, WO-2008130879A2; Serenex et al., 2008, US-20080269193A1)에서 이전에 언급되었으며, 단지 최근에 이것은 완전히 특정화되었고, 그의 합성이 적절하게 기술되었다 (Huang et al., 2009). 이 연구 과제를 시작할 때에, 그의 합성에 대한 구체적인 상세한 내용은 없었다. 추가로, 본 발명자들은 유사한 화합물에 대해서 보고된 조건 [Pd(OAc)2, DPPF, NaOtBu, 톨루엔, 120℃, 마이크로웨이브] 하에서 트랜스-4-아미노사이클로헥산올에 의한 16의 아미노화를 재현하는데 어려움이 있었다. 본 발명자들에게서는 기껏해야 단지 흔적량의 생성물이 검출되었다. 촉매를 PdCl2, Pd(PPh3)4 또는 Pd2(dba)3로, 또는 용매를 DMF 또는 1,2-디메톡시에탄 (DME)으로, 또는 염기를 K3PO4로 변화시키는 것은 어떤 개선도 제공하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 이 단계를 변형시켰으며, 16을 DME 중에서 Pd2(dba)3 및 DavePhos를 사용하여 버크월드 조건 (Old et al., 1998) 하에서 트랜스-4-아미노사이클로헥산올 테트라하이드로피라닐 에테르 (24)에 커플링시켜 45%의 조합 수율로 아미드 26 (17%)과 함께 니트릴 25 (28%)를 제공할 수 있었다 (도 34). 이들은 16을 트랜스-1,4-디아미노사이클로헥산에 커플링시키기 위해서 사용된 조건이었으며, 유사하게 25 중의 일부는 반응의 과정 중에 26으로 가수분해되었다. 본 발명자들의 목적에 따라 이것은 불필요하였기 때문에, 본 발명자들은 25에 대한 이 반응을 최적화시키지 못하였다. 본 발명자들은 반응에 대한 주된 장애가 톨루엔 중에서의 트랜스-4-아미노사이클로헥산올의 낮은 용해도였으며, THP 보호된 알콜 24을 사용하여 적어도 용해도를 증가시킨 것으로 추정하였다. SNX-2112는 26으로부터 THP 그룹을 제거한 후에 수득되고 완전히 특정화되었다 (1H, 13C-NMR, MS).
다음으로, 본 발명자들은 합성된 비드가 암 세포에서 Hsp90과의 상호작용을 유지하였는지 여부를 조사하였다. PU-H71, NVP-AUY922, SNX-2112 또는 2-메톡시에틸아민 중의 어느 하나에 공유적으로 부착된 아가로즈 비드 (각각 PU-, NVP-, SNX-, 대조-비드)를 K562 만성 골수성 백혈병 (CML) 또는 MDA-MB-468 유방암 세포 추출물과 배양하였다. 도 28A에 나타낸 바와 같이, 대조-비드가 아닌 Hsp90 억제제는 암 세포 용해물에서 Hsp90을 효율적으로 분리시켰다. 대조 비드는 아피겔 (Affi-Gel®) 10에 복합체화된 Hsp90 불활성 화학물질 (2-메톡시에틸아민)을 함유하여 (실험부 참조) 세포 추출물에서 단백질에 대한 고체 지지체의 잠재적인 비특이적 결합에 대한 실험적 대조군을 제공하였다.
또한, 종양 세포에서 진정한 Hsp90 클라이언트 단백질을 분리시키는 이들 화학적 도구의 능력을 프로브화하기 위해서, 본 발명자들은 고체 지지체 (6)에 부착된 PU-H71을 암 세포 추출물과 배양하였다. 본 발명자들은 MDA-MB-468 세포 내의 Hsp90/c-Kit 및 Hsp90/IGF-IR 복합체 (도 28B) 및 K562 세포 내의 Hsp90/Bcr-Abl 및 Hsp90/Raf-1 복합체 (도 28C)의 용량-의존적 분리를 증명할 수 있었다. 이들은 삼중-음성 유방암 및 CML 각각에서 변형된 표현형을 구동시키는데 중요한 역할을 갖는 Hsp90-의존적 종양단백질이다 (Whitesell & Lindquist, 2005; Hurvitz & Finn, 2009; Law et al., 2008). c-Kit 및 IGF-IR의 Hsp90 매개된 조절과 일치하여, PU-H71에 의한 MDA-MB-468 세포의 처리는 이들 단백질의 정상-상태 수준의 감소를 초래한다 (도 28B, 용해물, - 및 + PU-H71을 비교). PU-비드 (6)를 사용하여, 본 발명자들은 최근에 미만성 거대 B-세포 림프종에서 전사 억제자 BCL-6 (Cerchietti et al., 2009) 및 돌연변이 JAK2 구동된 골수증식성 장애에서 JAK2 (Marubayashi et al., 2010)와 같은 신규의 Hsp90 클라이언트를 분리 및 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 또한, 삼중-음성 유방암에 대해 특이적인 Hsp90 종양-클라이언트를 확인할 수 있었다 (Caldas-Lopes et al., 2009). 이들 종양에서 Hsp90의 작용 기전에 대해 밝히는 것 이외에도, 확인된 단백질은 중요한 종양-특이적 종양-클라이언트이며, 임상시험 중에 이들 암에서 PU-H71 및 Hsp90 억제제의 임상 효능을 모니터링하는데 바이오마커로서 도입될 것이다.
유사한 실험은 PU-H71-비오틴 (7) (도 29A)에 의해서 가능하였지만, PU-H71-비드는 클라이언트 단백질과의 복합체에서 Hsp90을 분리시키는데 PU-H71-비오틴 비드에 비해 탁월하였다.
고체 지지체 고정화된 GM을 사용하여 Hsp90/클라이언트 단백질 복합체를 분리시키기 위한 이전의 시도는 거의 성공하지 못하였음을 아는 것이 중요하다 (Tsaytler et al., 2009). 그 경우에, Hsp90에 결합된 단백질은 정제 단계 중에 세척 제거되었다. Hsp90-상호작용 단백질의 손실을 방지하기 위해서, 저자들은 암 세포 추출물을 호모이작용성 (homobifunctional) 아미노-반응성 DTT-가역성 크로스-링커인 DSP와의 교차-결합에 적용하였으며, 이것은 PU-H71과는 달리 GM은 Hsp90/클라이언트 단백질 상호작용을 안정화시킬 수 없었음을 시사한다. 본 발명자들은 아피겔 (Affi-Gel®) 10 수지에 직접 공유적으로 부착된 GM과 비드를 사용하는 경우에 유사한 프로필을 관찰하였다. 결정학적 및 생화학적 조사는 GM이 특정의 클라이언트 단백질 결합에 바람직하지 않은 아포 개방-입체형태 (apo, open-conformation)에서 Hsp90과 우선적으로 상호작용하여 (Roe et al., 1999; Stebbins et al., 1997; Nishiya et al., 2009), Hsp90/클라이언트 단백질 복합체를 포획하는 GM-비드의 제한된 능력에 대한 잠재적 설명을 제공하는 것을 시사한다. 어떤 Hsp90 배좌를 다른 Hsp90 화학형이 선호하는 지에 대해서는 현재 알려지지 않았지만, 여기에서 보고된 바와 같이 또한 이용가능한 NVP- 및 SNX-비드에 의해서 유사한 평가가 현재 가능하여 이들 작용제와 Hsp90의 상호작용 및 이들 상호작용의 생물학적 중요성에 대한 더 나은 이해를 제공한다.
여기에서 디자인된 화학적 도구의 또 다른 적용 시에, 본 발명자들은 PU-H71-비오틴 (7)을 또한 사용하여 세포 표면 상에서 발현된 경우의 Hsp90을 특이적으로 검출할 수 있음을 보여준다 (도 29H). 주로 사이토졸성 단백질인 Hsp90은 특정의 경우에 세포 표면으로 전좌하는 것으로 보고되었다. 유방암에서는, 예를 들어, 막 Hsp90이 암 세포 침입을 도와주는데 포함된다 (Sidera & Patsavoudi, 2008). 살아있는 세포에서 막 Hsp90의 특이적 검출은 PU-H71-비오틴 (7)의 사용에 의해서 가능한데, 이는 비오틴 컨주게이트된 Hsp90 억제제는 잠재적으로 세포에 들어갈 수 있는 반면에, 비오틴을 검출하기 위해서 사용된 스트렙타비딘 컨주게이트는 세포 불투과성이기 때문이다. 도 29B는 D-비오틴이 아닌 PU-H71-비오틴이 백혈병 세포의 표면 상에서 Hsp90 발현을 검출할 수 있음을 보여준다.
요약하면, 본 발명자들은 각각 상이한 화학형의 3 개의 상이한 Hsp90 억제제를 기초로 한 유용한 화학적 도구를 제조하였다. 이들은 PU-H71 (퓨린), NVP-AUY922 (이속사졸) 및 SNX-2112 (인다졸-4-온)-비드와 같은 고체 지지체 상에 부착시킴으로써, 또는 비오티닐화 (PU-H71-비오틴)에 의해서 제조되었다. 이들 프로브의 유용성은 Hsp90을 효율적으로 분리시키고, PU-H71 비드 (6)의 경우에는 암 세포 추출물로부터 Hsp90 종양단백질 함유 복합체를 분리시키는 그들의 능력에 의해서 입증되었다. 이용가능한 공-결정 구조 및 SAR은 그들의 디자인, 및 링커의 부착 부위를 입증하기 위해서 사용된 Hsp90α의 적절한 X-선 결정 구조에 대한 도킹에 이용되었다. 이들은 Hsp90 생물학을 더 잘 이해하는 쪽으로, 및 가장 바람직한 임상 프로필을 갖는 Hsp90 억제제를 디자인하는 쪽으로의 노력에서 중요한 화학적 도구이다.
종양단백질 및 Hsp90 프로브를 사용하는 경로의 확인
본 발명은 상술한 Hsp90 프로브를 사용하는 암-연루된 경로의 성분 (예를 들어, 종양단백질)을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 암-연루된 경로는 대사, 유전자 정보 처리, 환경 정보 처리, 세포 과정, 또는 유기체 시스템에 포함되는 경로이다. 예를 들어,, 암-연루된 경로는 표 1에 열거된 경로일 수 있다.
더욱 특히, 암-연루된 경로 또는 암-연루된 경로의 성분은 결장직장암, 췌장암, 갑상선암, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 포함한 백혈병, 기저 세포 암종, 흑색종, 신세포암, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함한 폐암, 유방암, 신경아세포종, 골수증식성 장애, 위장 기질성 종양을 포함한 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문함, 신경교종을 포함한 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종을 포함한 림프종, 및 난소암, 경부암 및 내막암을 포함한 부인과 암으로 구성된 그룹으로부터 선택된 암과 같은 암에 포함된다.
이하의 하부 항목에는 암 세포에서 Hsp90의 특성을 결정하기 위한, 및 종양단백질 및 암-연루된 경로를 확인하기 위한 본 발명의 Hsp90 프로브의 사용을 기술한다.
암 세포에서 이종 Hsp90 제시
소분자 Hsp90 억제제와 종양 Hsp90 복합체의 상호작용을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 젤다나마이신 (GM) 또는 PU-H71에 공유적으로 부착된 아가로즈 비드 (각각 GM- 및 PU-비드)를 사용하였다 (도 4, 5). 화학적으로 상이한 작용제인 GM 및 PU-H71은 그의 N-말단 영역 조절 포켓에 결합함으로써 Hsp90과 상호작용하고, Hsp90을 억제한다 (Janin, 2010). 비교를 위해서, 본 발명자들은 또한 항-Hsp90 항체 (H9010)에 커플링된 G 단백질 아가로즈-비드를 생성시켰다.
우선, 본 발명자들은 유방암 및 만성 골수성 백혈병 (CML) 세포 용해물에서 Hsp90에 대한 이들 작용제의 결합을 평가하였다. H9010에 의한 4 개의 연속적인 면역침강 (IP) 단계는 이들 추출물로부터 Hsp90을 효율적으로 고갈시켰으나, 비-특이적 IgG에 의해서는 그렇지 않았다 (도 4a, 4xH9010 및 나타내지 않음). 그에 반해서, PU- 또는 GM-비드에 의한 순차적 풀-다운은 단지 전체 세포 Hsp90의 분획만을 제거하였다 (도 4b, 10a, 10b). 특히, MDA-MB-468 유방암 세포에서, 조합된 PU-비드 분획은 전체 세포 Hsp90 풀의 대략 20-30%를 나타냈으며, 신선한 PU-비드 분취액을 추가로 첨가하는 것은 용해물 내의 잔류하는 Hsp90을 침강시키지는 못하였다 (도 4b, PU-비드). 소분자에 접근할 수 없는 이 PU-고갈된 잔류하는 Hsp90 분획은 H9010에 대한 친화성을 유지하였다 (도 4b, H9010). 이것으로부터, 본 발명자들은 MDA-MB-468 세포 추출물 내의 Hsp90의 상당한 분획이 여전히 자연적 입체형태로 존재하였지만, PU-H71과는 반응성이 없는 것으로 결론을 내렸다.
세포 용해물 내에서 Hsp90 배열에서의 변화가 이것을 항체에 대한 것이 아닌 고정화된 PU-H71에 대한 결합에 이용할 수 없게 만들 가능성을 배제하기 위해서, 본 발명자들은 온전한 암 세포에서 Hsp90에 대한 방사성표지된 131I-PU-H71의 결합을 분석하였다 (도 4c, 하부). 131I-PU-H71 및 PU-H71의 화학적 구조는 동일하다: PU-H71은 안정한 요오드 원자 (127I)를 함유하며, 131I-PU-H71은 방사성 요오드를 함유하며; 따라서, 동위원소 표지된 131I-PU-H71은 비표지된 PU-H71과 동일한 화학적 및 생물학적 특성을 갖는다. 몇 가지 암 세포주에서 Hsp90에 대한 131I-PU-H71의 결합은 세포당 명확하지만 상이한 수의 부위에서 포화되었다 (도 4c, 하부). 본 발명자들은 MDA-MB-468 세포에서 PU-H71에 의해서 결합된 세포 Hsp90의 분획을 정량하였다. 우선, 본 발명자들은 Hsp90이 이들 세포에서 다른 종양 세포에서 보고된 Hsp90의 풍부함과 밀접하게 일치하는 값인 총 세포 단백질의 2.66-3.33%를 나타낸 것으로 결정하였다 (Workman et al., 2007). 대략 41.65x106 MDA-MB-468 세포를 용해시켜 3875 ㎍의 단백질을 수득하였으며, 이중의 103.07-129.04 ㎍는 Hsp90이었다. 따라서, 하나의 세포는 (2.47-3.09)x10-6 ㎍, (2.74-3.43)x10-11 μmols 또는 (1.64-2.06)x107 분자의 Hsp90을 함유하였다. MDA-MB-468 세포에서, 131I-PU-H71은 기껏해야 이용가능한 세포 결합 부위의 5.5x106 에 결합하였으며 (도 4c, 하부), 이것은 총 세포 Hsp90의 26.6-33.5%에 해당한다 (5.5x106/(1.64-2.06)x107*100으로 계산됨). 이 값은 세포 추출물에서 PU-비드 풀-다운에 의해서 수득된 것과 매우 유사하여 (도 4b), 총 Hsp90 풀의 약 30%을 나타내는 PU-H71이 MDA-MB-468 세포 내의 Hsp90의 분획에 결합하는 것을 확인하며, 이 풀을 효율적으로 분리시키기 위한 PU-비드의 용도를 입증한다. K562 및 그 밖의 다른 정립된 t(9;22)+ CML 세포주에서, PU-H71은 전체 세포 Hsp90의 10.3-23%를 결합시켰다 (도 4c, 10b, 10c).
종합적으로, 이들 데이터는 PU-H71과 같은 특정의 Hsp90 억제제가 정상 세포에서보다 암 세포에서 더 풍부한 Hsp90 종의 서브세트에 우선적으로 결합함을 시사한다 (도 11a).
종양- 및 WT-단백질 결합된 Hsp90 종은 암 세포 내에 공-존재하지만, PU-H71은 종양단백질 / Hsp90 종에 대해서 선택적이다
이들 Hsp90 종과 연관된 생화학적 기능을 탐색하기 위해서, 본 발명자들은 각각 항체- 및 Hsp90-억제제 비드에 의한 면역침강 (IPs) 및 화학적 침강 (CPs)을 수행하였으며, 본 발명자들은 공지된 클라이언트의 선택된 서브세트에 의해 공동-침강시키는 이들과 관련하여 결합된 Hsp90의 능력을 분석하였다. K562 CML 세포를 우선 조사하였는데, 이는 이 세포주가 이상 Bcr-Abl 단백질, 구성적으로 활성인 키나제, 및 그의 정상 대응물 c-Abl을 공동-발현하기 때문이다. 이들 두 개의 Abl 종은 분자 중량에 의해서 명백하게 분리할 수 있으며, 따라서 웨스턴 블럿에 의해서 쉽게 구별이 가능하여 (도 5a, 용해물), 동일한 세포 환경에서 Hsp90 종양- 및 야생형 (WT)-클라이언트의 분석을 용이하게 한다. 본 발명자들은 비-특이적 IgG가 아닌 H9010이 Bcr-Abl 및 Abl 둘 다와의 복합체로 Hsp90을 분리시키는 것을 관찰하였다 (도 5a 및 11, H9010). 면역침강된 Bcr-Abl 및 Abl (도 5a 및 5b, 좌측, H9010)과 상등액 내에 잔류하는 각 단백질의 분획 (도 5b, 좌측, 잔류하는 상등액)의 비교는 항체가 K562 세포에서 Abl의 돌연변이체 또는 WT 형태에 결합된 Hsp90에 대해서 우선적으로 풍부하게 되지 않았음을 나타내었다.
그에 반해서, PU-결합된 Hsp90은 Bcr-Abl 단백질을 우선적으로 분리시켰다 (도 5a 및 5b, 우측, PU-비드). Hsp90/Bcr-Abl 종의 PU-비드 고갈 (도 5b, 우측, PU-비드) 후에, H9010은 나머지 Hsp90/Abl 종을 침강시켰다 (도 5b, 우측, H9010). PU-비드는 실질적으로 포화성 조건에서 Hsp90/Bcr-Abl 종에 대한 선택성을 유지하였다 (즉, 과량의 용해물, 도 12a, 좌측, 및 비드, 도 12a, 우측). Bcr-Abl/Hsp90 종에 대한 PU-H71의 생화학적 선택성의 추가의 확인으로서, Bcr-Abl은 Abl보다 PU-H71에 의한 분해에 대해서 훨씬 더 민감하였다 (도 5d). 이상 Abl에 대한 PU-H71의 선택성은 일차 CML 샘플 (도 13b)에 대해서 뿐만 아니라 다른 정립된 t(9;22)+ CML 세포주 (도 13a)에 대해서도 연장되었다.
WT-단백질이 아닌 종양-단백질 결합된 Hsp90 종은 대부분 Hsp90에 의한 클라이언트 단백질 조절을 위한 공동- 샤페론 동원에 의존적이다
PU-H71- 및 항체-연관된 Hsp90 분획 사이를 더 구분하기 위해서, 본 발명자들은 순차적 고갈 실험을 수행하였으며, 두 가지 종의 공동-샤페론 구성을 평가하였다 (Zuehlke & Johnson, 2010). Hsp90/Bcr-Abl 복합체를 함유하는 Hsp90의 분획은 Hsp70, Hsp40, HOP 및 HIP를 포함한 몇 개으 공동-샤페론을 결합시켰다 (도 5c, PU-비드). PU-비드 풀-다운은 또한 몇 개의 추가 Hsp90 공동-샤페론 종에 대해서 풍부하게 되었다 (표 5a-d). 이들 발견은 PU-H71이 공동-샤페론-결합된 Hsp90을 인식함을 강력하게 시사한다. Hsp90/Abl 종을 포함하는 것으로 나타난 PU-비드-고갈된 나머지 Hsp90 풀은 공동-샤페론과 연관되지 않았지만 (도 5c, H9010), 이들의 풍부한 발현은 용해물에서 검출되지 않았다 (도 5c, 잔류 상등액). 그러나, 공동-샤페론은 전체 세포 추출물에서 H9010에 의해서 분리된다 (도 11b, 11c).
이들 발견은 CML 세포에서 Bcr-Abl 또는 Abl에 우선적으로 결합된 Hsp90의 뚜렷한 풀의 존재를 시사한다 (도 5g). H9010은 Bcr-Abl 및 Abl 함유 Hsp90 종에 둘 다에 결합하는 반면에, PU-H71은 Bcr-Abl/Hsp90 종에 대해서 선택적이다. 본 발명자들의 데이터는 또한, Hsp90이 정상 (즉, Abl)이 아닌 이상 (즉, Bcr-Abl) 단백질의 활성을 변조시키는 경우에, 이것은 고전적인 공동-샤페론 Hsp70, Hsp40 및 HOP를 이용하고, 절실하게 필요로 할 수 있음을 시사한다 (도 11a). 이러한 가설과 일치하여, 본 발명자들은 Bcr-Abl이 K562 세포에서 Hsp90 공동-샤페론인 Hsp70의 녹다운에 대해 Abl보다 더 민감하다는 것을 발견하였다 (도 5e).
PU-H71의 종양-단백질/ Hsp90 종 선택성 및 복합체 트랩핑 능력은 모든 Hsp90 억제제에 의해서 공유되지 않는다
다음으로, 본 발명자들은 PU-H71과 유사한 방식으로 Hsp90의 N-말단 조절 포켓과 상호작용하는 합성 억제제 SNX-2112 및 NVP-AUY922, 및 천연 생성물 GM (Janin, 2010)을 포함한 다른 억제제가 유사한 Hsp90 종을 선택적을 분리시킬 수 있었는지 여부를 평가하였다 (도 5f). SNX-비드는 Bcr-Abl/Hsp90에 대한 선택성을 입증한 반면에, NVP-비드는 H9010과 유사하게 행동하였으며, Bcr-Abl/Hsp90과 Abl/Hsp90 종 사이를 구분하지 않았다 (각각 SNX- 대 NVP-비드 참조; 도 5f). GM-비드는 또한 세포 용해물에서 Hsp90의 서브집단을 인식한 반면에 (도 10a), 이들은 Bcr-Abl을 공동-침강시키는데 있어서의 PU-비드보다 훨씬 덜 효율적이었다 (도 5f, GM-비드). Hsp90/클라이언트 단백질 복합체를 트랩핑하는데 있어서 GM에 대한 유사한 무효성은 이전에 보고되었다 (Tsaytler et al., 2009).
PU-H71의 종양-단백질/ Hsp90 종 선택성 및 복합체 트랩핑 능력은 Bcr -Abl/Hsp90 종으로 제한되지 않는다
종양-단백질을 향한 선택성이 Bcr-Abl로 제한되지 않았는지 여부를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 다른 종양 세포주에서 몇 개의 추가의 잘 정의된 Hsp90 클라이언트 단백질을 시험하였다 (도 12b-d) (da Rocha Dias et al., 2005; Grbovic et al., 2006). K562 세포에서의 다른 결과와 일치하여, H9010은 SKMel28 흑색종 세포에서 발현된 돌연변이 B-Raf 및 CCD18Co 정상 결정 섬유아세포에서 발현된 WT B-Raf 둘 다와 복합체를 형성한 Hsp90을 침강시켰다 (도 12b, H9010). 그러나, PU- 및 GM-비드는 Hsp90/돌연변이체 B-Raf를 선택적으로 인식하였으며, Hsp90/WT B-Raf는 거의 인식하지 않음을 나타내었다 (도 12b, PU-비드 및 GM-비드). 그러나, K562 세포의 경우와 같이 GM-비드는 돌연변이체 클라이언트 단백질을 공동-침강시키는데 있어서 PU-비드보다 상당히 덜 효율적이었다. 유사한 결과는 다른 Hsp90 클라이언트에 대해 수득되었다 (도 12c, 12d; Tsaytler et al., 2009).
PU-H71- 비드는 CML에서 이상 시그날로좀을 확인한다
상기 제시된 데이터는 Hsp90과 특이적으로 상호작용하는 (도 14; Taldone & Chiosis, 2009) PU-H71이 종양-단백질/Hsp90 종에 대해 우선적으로 선택적이며, 클라이언트 결합 입체형태에 Hsp90을 트랩핑함을 시사한다 (도 5). 따라서, 본 발명자들은 PU-H71 비드가 종양원성 Hsp90 클라이언트 단백질의 세포 보체를 조사하는 도구로서 사용될 수 있었는지 여부를 검사하였다. 이상 Hsp90 클라이언트들은 종양 표현형의 유지에 가장 결정적인 다양한 단백질을 포함하는 것으로 가정되었기 때문에 (Zuehlke & Johnson, 2010; Workman et al., 2007; Dezwaan & Freeman, 2008), 이러한 방법은 종양-특이적 방식으로 중요한 시그날링 경로를 잠재적으로 확인할 수 있었다. 이 가설을 시험하기 위해서, 본 발명자들은 중요한 기능적 병변의 적어도 일부분이 공지된 K562 세포에서 PU-H71 비드에 의해서 분리된 단백질 카고의 편향되지 않은 분석을 수행하였다 (Ren, 2005; Burke & Carroll, 2010).
PU-비드 또는 대조-비드에 의해서 세포 용해물로부터 분리된 단백질 카고를 탄뎀 질량 분광분석법에 커플링된 나노 액체 크로마토그래피 (나노 LC-MS/MS)에 의한 프로테오믹 분석에 적용하였다. 초기 단백질 확인은 마스코트 탐색 엔진을 사용하여 수행되었으며, 스캐폴드 프로테옴 소프트웨어를 사용하여 더 평가되었다 (표 5a-d). PU-비드-상호작용 단백질 중에서, Bcr-Abl이 확인되었으며 (참조: Bcr 및 Abl1, 표 5a 및 도 6), 이것은 이전의 데이터를 확인한다 (도 5).
그 후, IPA (Ingenuity Pathway Analysis)를 사용하여 확인된 단백질로부터 생물학적 네트워크를 구성하였다 (도 6a, 6b, 15; 표 5e, 5f). IPA는 PU-H71-분리된 단백질을 세포사, 세포 주기, 세포 성장 및 증식과 연관된 13 개의 네트워크에 배정하였다. 이들 네트워크는 공지된 기본적인표준 CML 시그날링 경로와 꽤 중복된다 (도 6a).
시그날링 단백질 이외에도, 본 발명자들은 탄수화물 및 지질 대사, 단백질 합성, 유전자 발현, 및 세포 조립 및 구성을 조절하는 단백질을 확인하였다. 이들 발견은 세포 항상성을 유지하고, 세포 변형의 중요한 매개체인 Hsp90의 가상적인 광범한 역할과 일치한다 (Zuehlke & Johnson, 2010; Workman et al., 2007; Dezwaan & Freeman, 2008; McClellan et al., 2007).
MS에 의한 확인 후에, 다수의 주요 단백질은 K562 세포, 및 일차 CML 아세포 둘 다에서 화학적 침강 및 웨스턴 블럿에 의해서 더 증명되었다 (도 6c, 좌측, 도 6d, 13a, 13b). 이들 단백질의 정상-상태 수준에 대한 PU-H71의 효과가 또한, 이들의 Hsp90-조절된 발현/안정성을 더 지지하기 위해서 질문되었다 (도 6c, 우측) (Zuehlke & Johnson, 2010).
PU-비드 상에 풍부한 높은 점수의 네트워크는 CML에서 이상 시그날링을 전파하기 위하여 Bcr-Abl에 의해서 사용된 것이었다: PI3K/mTOR-, MAPK- 및 NFκB-매개된 시그날링 경로 (네트워크 1, 22 초점 분자 (focus molecules), 점수 = 38 및 네트워크 2, 22 초점 분자, 점수 = 36, 표 5f). 성분 단배질들 사이의 관계를 조사하기 위해서 이들 네트워크에 대한 연결 지도를 창출시켰다 (도 15a, 15b). 이들 지도는 명확성을 위해서 단지 주요 경로 성분 및 관계만을 남겨서 단순화시켰다 (도 6b).
PI3K / mTOR -경로
PI3K/mTOR-경로의 활성화는 Bcr-Abl 백혈병유발에서 필수적인 시그날링 기전 중의 하나로서 드러났다 (Ren, 2005). 이 경로에서 특히 흥미로운 것은 조절부전 해독을 초래하고, 백혈병유발에 기여하는, Bcr-Abl-변형된 세포에서 구성적으로 활성화된 라파마이신 (mTOR)의 포유동물 표적이다. 최근의 연구는, mTORC1 및 mTORC2 복합체 둘 다가 Bcr-Abl 세포에서 활성화되며, 세포 성장 및 생존에서 뿐만 아니라 미토겐 반응을 매개하는 유전자 생성물의 mRNA 해독에서 중요한 역할을 한다는 증거를 제공하였다 (Carayol et al., 2010). mTOR, 및 RICTOR, RAPTOR, Sin1 (MAPKAP1), 클래스 3 PI3Ks PIK3C3 (또한, hVps34로 불림), 및 PIK3R4 (VSP15) (Nobukuni et al., 2007)와 같은 mTOR의 주요 활성화제가 PU-Hsp90 풀-다운에서 확인되었다 (표 5a, 5d; 도 6c, 6d, 13b).
NFκB 경로
핵 인자-κB (NF-κB)의 활성화가 일차 골수 세포의 Bcr-Abl 변형, 및 누드 마우스에서 종양을 형성시키는 Bcr-Abl-변형된 조혈 세포에 필요하다 (McCubrey et al., 2008). 이 경로 상에 풍부한 PU-분리된 단백질은 NF-κB뿐만 아니라, 별도의 영역을 통해서 NF-카파-B-유도성 키나제 (NIK) 및 IKKs를 결합시키고, 이들을 활성 키나제 복합체, 및 둘 다 1-카파B 키나제/NF-카파B 캐스케이드의 양성적 조절인자인 TBK-1 (TANK-결합 키나제 1) 및 TAB1 (TAK1-결합 단백질 1) 내에 조립시키는 IKBKAP와 같은 NF-kB의 활성화인자를 포함한다 (Hacker & Karin, 2006) (표 5a, 5d). 최근에, 골수성 백혈병 세포에서 NF-κB 캐스케이드의 Bcr-Abl-유도된 활성화는 주로, 본 발명자들에 의해 여기에서 PU-H71/Hsp90 상호작용인자인 것으로 확인된 티로신-인산화된 PKD2 (또는 PRKD2)에 의해서 매개되는 것으로 입증되었다. (Mihailovic et al., 2004) (표 5a, 5d; 도 6c, 6d, 13b).
Raf / MAPK 경로
Raf-1, A-Raf, ERK, p90RSK, vav 및 몇 개의 MAPKs와 같은 CML에서 활성화된 또 다른 중요한 경로 (Ren, 2005; McCubrey et al., 2008)인 MAPK 경로의 주요 효과기가 또한 PU-Hsp90-결합된 풀에 포함되었다 (표 5a, 5d; 도 6c, 6d, 13b). ERK 시그날 변환 캐스케이드 이외에도, 본 발명자들은 MEKK4 및 TAB1과 같은 P38 MAPK 경로를 활성화시키는데 작용하는 성분을 확인한다. IPA는 MAPK-경로를 PI3K/mTOR-, STAT- 및 병소 유착 경로를 포함한 다수의 상이한 시그날 변환 경로의 주요 요소에 연결시킨다 (도 15a-d, 6b).
STAT-경로
STAT-경로는 또한, CML에서 활성화되며, 세포사멸(apoptosis)에 대한 사이토킨 독립성 및 보호를 부여하고 (McCubrey et al., 2008), PU-H71 화학적 침강에 의해서 풍부화되었다 (네트워크 8, 20 초점 분자, 점수 = 14, 표 5f, 도 15c). STAT5 및 STAT3은 둘 다 PU-H71-Hsp90 복합체와 연관되었다 (표 5a, 5d; 도 6c, 6d, 13b). CML에서, 인산화에 의한 STAT5 활성화는 Bcr-Abl에 의해서 구동된다 (Ren, 2005). 전-B 림프아구성 백혈병 세포 (Hendriks & Kersseboom, 2006)에서 Bcr-Abl에 의해서 구성적으로 인산화되고 활성화된 브루톤 (Bruton) 무감마글로불린혈증 티로신 키나제 (BTK)는 또한, STAT5를 통해서 시그날을 보낼 수 있다 (Mahajan et al., 2001). BTK는 본 발명자들이 CML에서 확인한 또 다른 Hsp90-조절된 단백질이다 (표 5a, 5d; 도 6c, 6d, 13b). 인산화 이외에도, STATs는 칼파인 (CAPN1)-매개된 단백분해적 분해에 의해서 골수양 세포에서 활성화되어 절단된 STAT 종을 유도할 수 있다 (Oda et al., 2002). CAPN1은 또한, 역시 Bcr-Abl에 의해서 활성화된 활성화된 Ca(2+)/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II감마 (CaMKII감마)와 같이 PU-결합된 Hsp90 풀-다운에서 발견된다 (Si & Collins, 2008) (표 5a, 5d). CML에서 CaMKII감마 활성은 MAPK 및 STAT 경로를 포함하는 다수의 결정적인 시그날 변환 네트워크의 활성화와 연관된다. 특히, 골수양 백혈병 세포에서 CaMKII감마는 또한 STAT3을 직접적으로 인산화하며, 그의 전사 활성을 증진시킨다 (Si & Collins, 2008).
병소 유착 경로
골수 미세환경에 대한 전구체 혈액 세포의 체류 및 귀환은 생존 및 증식의 수용체 및 아고니스트 (agonists)에 의해서 조절된다. Bcr-Abl은 유착 독립성 (adhesion independence)을 유도하여 골수로부터 조혈성 줄기 세포의 이상 방출을 야기하고, 리간드 결합의 부재 하에서 유착 수용체 시그날링 경로의 활성화를 초래한다. 병소 유착 경로는 PU-H71 풀-다운에서 잘 표시된다 (네트워크 12, 16 초점 분자, 점수 = 13, 표 5f, 도 15d). 병소 유착-연관된 단백질인 팍실린, FAK, 빈쿨린, 탈린 및 텐신은 Bcr-Abl-형질감염된 세포주에서 구성적으로 인산화되며 (Salgia et al., 1995), 이들은 역시 PU-Hsp90 복합체에서 분리되었다 (표 5a, 5d, 및 도 6c). CML 세포에서, FAK는 STAT5를 활성화시킬 수 있다 (Le et al., 2009).
MYC (Sawyers, 1993) (네트워크 7, 15 초점 분자, 점수 = 22, 도 6a 및 15e, 표 5f) and TGF-β (Naka et al., 2010) (네트워크 10, 13 초점 분자, 점수 = 18, 도 6a 및 15f, 표 5f)에 의해서 구동된 것인 CML 내의 그 밖의 다른 중요한 변형 경로도 역시 여기에서 확인되었다. 확인된 네트워크 중에는 또한 질병 진행 및 CML의 이상 세포 주기 및 증식에 중요한 것이 있다 (네트워크 3, 20 초점 분자, 점수 = 33, 네트워크 4, 20 초점 분자, 점수 = 33, 네트워크 5, 20 초점 분자, 점수 = 32, 네트워크 6, 19 초점 분자, 점수 = 30, 네트워크 9, 14 초점 분자, 점수 = 20, 네트워크 11, 12 초점 분자, 점수 = 17 및 네트워크 13, 10 초점 분자, 점수 = 12, 도 6a 및 표 5f).
요약하면, PU-H71은 CML에서 악성 표현형에 중요한 시그날링 경로에 참여하는 단백질의 광범위한 단면을 풍부하게 한다 (도 6). PU-결합된 Hsp90과 이상 CML 시그날로좀의 상호작용은 일차 CML 샘플에서 유지되었다 (도 6d, 13b).
PU-H71 확인된 단백질 및 네트워크는 악성 표현형에 중요한 것이다
본 발명자들은 PU-비드 풀-다운에서 이들 단백질의 존재가 기능적으로 중요하며, CML 세포에서 악성 시그날로좀을 광범하게 지지하는 Hsp90의 역할을 시사한다는 것을 입증하였다.
PU-비드에 의해서 확인된 네트워크가 K562에서의 변형에 중요하다는 것을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 다음으로 개별적인 네트워크로부터의 주요 노드 단백질 (도 6b, 황색 박스, - Bcr-Abl, NFκB, mTOR, MEK 및 CAMIIK)의 억제제가 K562 세포의 성장 및 증식능을 감소시킨다는 것을 나타내었다 (도 7a).
다음으로, 본 발명자들은 CML에서 아직 배정된 역할을 갖지 않는 PU-비드 확인된 Hsp90 상호작용인자가 또한 변형된 표현형에 기여한다는 것을 입증하였다. 다수의 유전자의 전사 공동-활성화인자인 히스톤-아르기닌 메틸트랜스퍼라제 CARM1 (Bedford & Clarke, 2009)가 CML 세포주 및 일차 CML 세포로부터의 PU-비드 풀-다운에서 입증되었다 (도 6c, 6d, 13). 이것이 최초로 보고된 Hsp90과 CARM1 사이의 관련성이지만, PRMT5와 같은 다른 아르기닌 메틸트랜스퍼라제는 난소암 세포에서 Hsp90 클라이언트인 것으로 나타났다 (Maloney et al., 2007). 상승된 CARM1 수준은 전립선 및 유방암의 발생에 연루되지만, CML 백혈병유발에서 CARM1의 중요성에 대해서는 거의 알려지지 않았다 (Bedford & Clarke, 2009). 본 발명자들은 PU-비드에 의해서 인식된 Hsp90 종에 의해서 본질적으로 완전히 포획되고 (도 7b), 또한 PU-H71에 의한 분해에 민감한 (도 6c, 우측) CARM1을 발견하였다. 따라서, CARM1은 CML에서 신규한 Hsp90 종양-단백질일 수 있다. 실제로, CARM1을 사용한 녹다운 실험은 K562 세포에서의 생존도 및 세포사멸의 유도를 나타내었지만, 대조 shRNAs는 그렇지 않았으며 (도 7c), 이것은 이 가설을 지지한다.
PU-풀다운에서 단백질의 존재가 단순히 그들의 풍부한 발현에 기인하는 것이 아니라 이상 활성화된 시그날링에 대한 그들의 참여에 기인하는 것을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 K562 및 췌장암 세포주 Mia-PaCa-2로부터의 PU-비드 풀다운을 비교하였다 (표 5a). 두 가지 세포는 모두 높은 수준의 STAT5 단백질을 발현하지만 (도 7d), STAT5 인산화 (도 7d) 및 DNA-결합 (Jaganathan et al., 2010)에 의해서 입증되는 바와 같이 STAT5 경로의 활성화는 단지 K562 세포에서만 나타났다. 따라서, 이 단백질은 단지 K562 PU-비드 풀다운에서만 확인되었다 (표 5a 및 도 7e). 그에 반해서, 활성화된 STAT3은 K562 (도 6c, 7e) 및 Mia-PaCa-2 세포 추출물 (도 7e, 7f) 둘 다로부터의 PU-Hsp90 복합체에서 확인되었다.
mTOR 경로는 K562 및 Mia-PaCa-2 세포 둘 다에서 PU-비드에 의해서 확인되었으며 (도 7e, 7f), 실제로 mTOR의 ATP 영역을 표적으로 하는 선택적 억제제 (Apsel et al., 2008)인 PP242에 의한 그의 약물학적 억제는 두 가지 세포 모두에 대해서 독성이다 (도 7a, 7g). 다른 한편으로, Abl 억제제인 글리벡 (Gleevec) (Deininger & Druker, 2003)은 K562 세포에 대해서만 독성이었다 (도 7a, 7g). 두 가지 세포는 모두 Abl을 발현하지만, K562만이 종양원성 Bcr-Abl을 가지며 (도 7d), PU-비드는 K562 세포에서 Bcr-Abl로서 Abl을 확인하지만 Mia-PaCa-2 세포에서는 그렇지 않다 (도 7e).
PU-H71은 종양원성 STAT-활성화의 새로운 기전을 확인한다
PU-비드 풀-다운은 CML 백혈병유발에서 구성적으로 활성화되는 Bcr-Abl (Ren, 2005), CAMKIIγ (Si & Collins, 2008), FAK (Salgia et al., 1995), vav-1 (Katzav, 2007) 및 PRKD2 (Mihailovic et al., 2004)를 포함한 몇 개의 단백질을 함유한다. 이들은 그들의 정상-상태 수준이 Hsp90 억제에 의해서 감소하기 때문에, 그들의 안정성에 관해서 Hsp90에 대해 의존적인 고전적 Hsp90-조절된 클라이언트이다 (도 6c) (Zuehlke & Johnson, 2010; Workman et al., 2007). STAT3 및 STAT5의 구성적 활성화는 또한 CML에서 보고되었다 (Ren, 2005; McCubrey et al., 2008). 그러나, STAT5 및 STAT3 수준은 Hsp90 억제에 의해서 본질적으로 변형되지 않고 유지되기 때문에 (도 6c)이들 단백질은 고전적인 클라이언트 단백질의 범주에 부합하지 않는다. PU-풀-다운은 또한 mTOR, VSP32, VSP15 및 RAPTOR과 같은 활성 시그날링 메가-복합체의 일부분적으로 잠재적으로 분리된 단백질을 함유한다 (Carayol et al., 2010). p-mTOR의 세포 수준에 의해서 측정된 바와 같이, mTOR 활성은 또한, 복합체 성분보다 Hsp90 억제에 대해서 더 민감한 것으로 보인다 (즉, PU-H71 처리된 세포에서 p-mTOR 및 RAPTOR의 상대적 감소와 비교하여, 도 6c). 추가로, PU-Hsp90 복합체는 K562에서 다수의 이상 활성화된 시그날링 경로의 주요 효과기에 Bcr-Abl을 연결시키는 GRB2, DOCK, CRKL 및 EPS15와 같은 어댑터 (adapter) 단백질을 함유한다 (Brehme et al., 2009; Ren, 2005) (도 6b). 이들의 발현은 또한 Hsp90 억제 시에 변화되지 않고 유지된다 (도 6c). 따라서, 본 발명자들은 특정의 종양원성 경로에 대한 Hsp90의 기여가 그의 고전적인 폴딩 작용을 넘어서서 연장되는지 여부에 대해서 생각하였다. 특이적으로, 본 발명자들은 이전에 가정된 바와 같이 (Dezwaan & Freeman, 2008; Pratt et al., 2008) Hsp90이 또한 시그날링 복합체를 그들의 활성 배열로 유지시키는 스캐폴딩 분자로서 작용할 것이라고 가정하였다.
Hsp90은 STAT5의 입체형태에 결합하여 영향을 미친다
이러한 가설을 조사하기 위해서, 추가로 본 발명자들은 CML에서 구성적으로 인산화된 STAT5에 집중하였다 (de Groot et al., 1999). p-STAT5의 전체 수준은 인산화 및 탈인산화 현상의 균형에 의해서 결정된다. 따라서, K562 세포에서 p-STAT5의 높은 수준은 상류 키나제 활성에서의 증가, 또는 단백질 티로신 포스파타제 (PTPase) 활성에서의 감소를 나타낼 수 있다. Hsp90과 p-STAT5 사이의 직접적인 상호작용은 또한 p-STAT5의 세포 수준을 변조시킬 수 있었다.
이들 잠재적 기전의 상대적 기여를 세밀하게 조사하기 위해서, 본 발명자들은 우선 주된 키나제 및 K562 세포에서 STAT5 인산화를 조절하는 PTPases에 대한 PU-H71의 영향을 조사하였다. Bcr-Abl은 JAK 인산화에 대한 필요성이 없이 STAT5를 직접 활성화시킨다 (de Groot et al., 1999). 일치하여, STAT5-인산화는 Bcr-Abl 억제제 글리벡의 존재 하에서 빠르게 감소하였다 (도 8a, 좌측, 글리벡). Hsp90은 Bcr-Abl 안정성을 조절하는 한편, Hsp90 억제 후에 정상-상태 Bcr-Abl 수준의 감소는 3 시간 이상을 필요로 한다 (An et al., 2000). 실제로, CRKL 인산화의 감소가 없는 것에 의해서 입증되는 바와 같이 (도 8a, 좌측, PU-H71, p-CRKL/CRKL), Bcr-Abl 발현 (도 8a, 좌측, PU-H71, Bcr-Abl) 또는 기능에서의 변화는 이것이 p-STAT5 수준을 감소시킨 시간 간격에서 PU-H71에 의해서 관찰되지 않았다 (도 8a, 좌측, PU-H71, p-STAT5). 또한, Bcr-Abl로 형질감염된 32Dcl3 세포에서 STAT5의 키나제 활성화인자 (Klejman et al., 2002)인 HCK의 활성 및 발현에서의 변화는 나타나지 않았다 (도 8a, 우측, HCK/p-HCK).
따라서, 0 내지 90 분 간격에서 PU-H71에 의한 p-STAT5 인산화의 감소 (도 8c, 좌측, PU-H71)는 Bcr-Abl 또는 다른 키나제의 불안정화에 의해서 설명될 것 같지 않다.
따라서, 본 발명자들은 PU-H71의 존재 하에서 p-STAT5 수준의 빠른 감소가 PTPase 활성의 증가에 의해서 설명될 수 있는지 여부를 검사하였다. 주요 사이토졸성 STAT5 포스파타제 (Xu & Qu, 2008)인 SHP2의 발현 및 활성은 또한, 이 시간 간격에서 변화되지 않았다 (도 8a, 우측, SHP2/p-SHP2). 마찬가지로, STAT-시그날링을 끄는 음성 피드백 루프를 형성하는 SOCS1 및 SOCS3 (Deininger & Druker, 2003)의 수준은 PU-H71에 의해서 영향을 받지 않았다 (도 8a, 우측, SOCS1/3).
따라서, 0-90 분의 간격에서 STAT5에 대한 효과가 없는 것은 STAT에 대한 키나제 또는 포스파타제 활성에서의 변화에 기인할 것 같다. 대체 기전으로, 및 STAT5가 아닌 p-STAT5의 대부분은 CML 세포에서 Hsp90 결합되기 때문에 (도 8b), 본 발명자들은 활성화된 STAT5의 세포 수준이 Hsp90에 대한 직접 결합에 의해서 미세-조정되는 것으로 가정하였다.
STATs의 활성화/불활성화 주기는 상이한 다이머 입체형태 사이에서의 이들의 전이를 수반한다. STATs의 인산화는 인산화 시에 평행 다이머 입체형태를 유발하는 역평행 다이머 입체형태에서 일어난다. 다른 한편으로, STATs의 탈인산화는 티로신 인산화된 STAT 다이머가 반드시 평행으로부터 역-평행 배열로 이동하여 포스파타제에 대한 더 나은 표적으로서 포스포-티로신을 노출시키는 광범한 공간적 재배향을 필요로 한다 (Lim & Cao, 2006). 본 발명자들은 STAT5가 Hsp90에 결합한 경우에 티로신 분해에 더 민감한 것을 발견하였으며 (도 8c), 이것은 Hsp90의 결합이 STAT5의 입체형태 상태를 직접적으로 변조시켜 잠재적으로 STAT5를 틸인산화에 바람직하지 않고/않거나 인산화에 바람직한 입체형태로 유지시키는 것을 나타낸다.
이러한 가능성을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 비-특이적 PTPase 억제제인 오르토바나데이트 (Na3VO4)를 세포에 첨가하여 STAT5의 탈인산화를 차단하는 펄스-추적 (pulse-chase) 전략을 사용하였다. 그 후, p-STAT5의 잔류 수준을 몇 개의 후속 시점에서 결정하였다 (도 8d). PU-H71의 부재 하에서, p-STAT5는 빠르게 축적한 반면에, 그의 존재 하에서 세포 p-STAT5 수준은 감소되었다. 이 과정 (도 8d)의 동력학은 p-STAT5 정상-상태 감소의 속도 (도 8a, 좌측, PU-H71)와 유사하였다.
Hsp90은 STAT5를 STAT5 -함유 전사 복합체 내에서 직접 활성 입체형태로 유지시킨다
STAT5 인산화 및 다이머화 이외에도, STAT5의 생물학적 활성은 그의 핵 전좌 및 그의 다양한 표적 유전자에 대한 직접 결합을 필요로 한다 (de Groot et al., 1999; Lim & Cao, 2006). 따라서, 본 발명자들은 Hsp90이 또한 STAT5 유전자의 전사 활성화를 촉진시키며, 따라서 프로모터-연관된 STAT5 전사 복합체에 참여할 수 있는지 여부에 대해서 생각하였다. ELISA-기본 시험을 사용하여, 본 발명자들은 STAT5 (도 8e)가 K562 세포에서 구성적으로 활성이며, STAT5 결합 공통 서열 (consensus sequence) (5'-TTCCCGGAA-3')에 결합하는 것을 발견하였다. STAT5 활성화 및 DNA 결합은 PU-H71에 의한 Hsp90 억제 시에 용량-의존적 방식으로 부분적으로 폐지된다 (도 8e). 더구나, K562 세포에서 정량적 ChIP 시험은 중요한STAT5 표적 MYC 및 CCND2에서 Hsp90 및 STAT5 둘 다의 존재를 나타내었다 (도 8f). 어떤 단백질도 유전자간 조절 지역 (나타내지 않음)에 존재하지 않았다. 따라서, PU-H71 (1 mM)은 STAT5 표적 유전자 CCND2 , MYC , CCND1 , BCL - XL 및 MCL1의 mRNA 풍부성을 감소시켰지만 (Katzav, 2007), 조절 유전자 HPRT 및 GAPDH의 경우는 감소시키지 않았다 (도 8g, 나타내지 않음).
종합적으로, 이들 데이터는 STAT5 활성이 CML 세포에서 Hsp90에 의해 양성적으로 조절되는 것을 나타낸다 (도 8h). 본 발명자들의 발견은 STAT5에 대한 Hsp90 결합이 단백질의 입체형태를 변조시키고, 이 기전에 의해서 이것은 STAT5 인산화/탈인산화 동력학을 변화시켜 p-STAT5의 증가된 수준쪽으로 평형을 이동시킨다는 시나리오와 일치한다. 또한, Hsp90은 STAT5를 STAT5-함유 전사 복합체 내에서 직접 활성 입체형태로 유지시킨다. 그러나, STAT-경로의 복잡성을 고려하여 다른 잠재적 기전이 배제될 수는 없다. 따라서, 단백질 안정성을 촉진시키는데 있어서의 그의 역할 이외에도, Hsp90은 클라이언트 단백질을 활성 배열로 유지시킴으로써 종양 형성을 촉진시킨다.
더욱 광범하게, 데이터는 이것이 종양 세포 내의 종양원성 단백질 분획을 지지하는데 가장 밀접하게 포함된 세포 Hsp90의 PU-H71-Hsp90 분획이며, PU-H71-Hsp90 프로테오믹스가 특정한 종양 세포에서 악성 표현형을 유지시키는데 필요한 단백질 경로의 광범한 단면을 확인하기 위해서 사용될 수 있음을 시사한다 (도 9).
논의
현재, 종양 세포 생존을 유지시키는데 필요한 다수의 단백질은 그들의 코드화 서열 내에 돌연변이를 나타낼 수 없으며, 아직 이들 단백질을 확인하는 것은 어떻게 개별적인 종양이 작동하는지를 이해하는데 매우 중요한 것으로 인정된다. 돌연변이는 다수의 유전자에서 종양 세포 생존을 지지하는데 필요하지 않기 때문에 (예를 들어, 다수의 골수종에서의 IRF4 및 B-세포 림프종에서의 BCL6) (Cerchietti et al., 2009), 게놈 광범위 돌연변이 연구는 이들 종양단백질을 확인할 수 없을 수 있다. RNAi 스크린과 같은 매우 복잡한 고가의 대규모 방법이 다양한 종양에서 종양원성 단백질의 보체를 확인하기 위한 주요 수단이었다 (Horn et al., 2010). 여기에서, 본 발명자들은 종양 종양단백질이 돌연변이되는지 여부와는 무관하게 이들을 조사하기 위한 빠르고 단순한 화학적-프로테오믹스 방법을 제시한다 (도 9). 이 방법은 i) 종양원성 클라이언트 단백질과 연관된 Hsp90의 분획에 우선적으로 결합하며, ii) 종양-클라이언트 결합된 배열로 Hsp90을 고정시키는 PU-H71의 몇 가지 특성을 이용한다. 이들 특징은 함께 질량 분광분석법에 의한 종양-연관된 단백질 클라이언트의 화학적 친화성-정제를 크게 용이하게 한다 (도 9). 본 발명자들은 이 방법이 분명한 암의 종양별 병변 특징을 세밀하게 조사하는데 강력한 도구를 제공한다고 제안한다. PU-비드 결합된 Hsp90 복합체의 일부분으로서 이상 단백질 집단을 정제 및 풍부화시키는 초기 화학적 침강 단계로 인하여, 이 방법은 고가의 SILAC 표지 또는 샘플의 2-D 겔 분리를 필요로 하지 않는다. 대신에, PU-비드 풀-다운으로부터의 단백질 카고는 SDS 완충액 내에서 간단하게 용출되고, 표준 SDS-PAGE에 제시된 다음에, 분리된 단백질은 LC/MS/MS 분석을 위해서 추출되고 트립신 처리된다.
이 방법은 종양 세포의 악성 표현형을 유지시키는 종양단백질을 확인하는 독특한 방법을 나타내는 한편, 다른 화학적 또는 항체-기본 프로테오믹스 기술과 마찬가지로 이것도 또한 잠재적 제한을 갖는다는 것을 알 필요가 있다 (Rix & Superti-Furga, 2009). 예를 들어, "점착성" 또는 풍부한 단백질은 또한 비차별적 방식으로 PU-H71 비드에 의해서 분리된 단백질에 결합할 수 있다. 이러한 단백질은 몇 명의 연구자들에 의해서 목록이 작성되었으며 (Trinkle-Mulcahy et al., 2008), 본 발명자들은 이들 리스트를 사용하여 이들 단백질 중의 일부가 실제로 진정한 Hsp90 클라이언트일 수 있다는 명백한 이해에 의해서 풀-다운으로부터 이들을 제거하였다. 둘째로, 본 발명자들은 PU-H71이 Hsp90에 대해서 특이적이라는 몇 개의 라인의 증거를 제시하였지만 (도 11; Taldone & Chiosis, 2009), 비드 상에 존재하는 고농도의 PU-H71에서 소수의 단백질에 대한 약물의 비특이적이고 직접적인 결합은 피할 수 없음을 또한 고려하여야 한다.
이전 단락에 기술된 잠재적 제한에도 불구하고, 본 발명자들은 이 방법을 사용하여 CML에서 Hsp90-촉진된 이상 시그날링 경로의 일차적인 전반적 평가를 수행하였다. PU-H71 친화성 정제에 의해서 확인된 Hsp90 상호작용체 (interactome)는 잘-특정화된 CML 시그날로좀과 상당히 중복되며 (도 6a), 이것은 이 방법이 이러한 형태의 백혈병의 분자 기준을 정의하는 경로 및 단백질의 복잡한 웹의 대부분을 확인할 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은, 개별적인 종양에서 악성 표현형을 구동시키는 이상 시그날링 네트워크를 확인하기 위하여 PU-H71 화학적-프로테오믹스 시험이 다른 형태의 암에 연장될 수 있음을 시사한다 (도 9). 예를 들어, 본 발명자들은 여기에서 MDA-MB-468 삼중-음성 유방암 세포, MiaPaCa2 췌장암 세포 및 OCI-LY1 미만성 거대 B-세포 림프종 세포에서 이상 단백질 네트워크를 확인하기 위해서 방법을 사용하는지에 대해 나타낸다.
단일 작용제 치료법은 암에 치유적인 것 같지 않기 때문에, 이상적인 병용 치료방법을 디자인하는 것이 필요하다. 종양원성 Hsp90-스캐폴드된 시그날링 네트워크의 프로테오믹 확인은 특이적 소분자 억제제를 사용하여 더 표적화될 수 있는 추가의 종양단백질을 확인할 수 있다. 실제로, K562 CML 세포의 변형에 기여하는 것으로 본 발명자들의 방법에 의해서 확인되고, 개별적인 네트워크 상에서 주요 노드 단백질인 (도 6b, 황색 박스) mTOR 및 CAMKII의 억제제는 단일 작용제로서 활성이며 (도 7a), 이들 백혈병 세포의 성장에 영향을 미치는데 있어서 Hsp90 억제와 상승작용을 한다 (도 21).
덜 잘-특정화된 종양 타입에 적용되는 경우에, PU-H71 화학적 프로테오믹스는 병용 치료법을 위한 덜 명백하며 더 영향력이 강한 후보 표적을 제공할 수 있다. 본 발명자들은 MDA-MB-468 삼중-음성 유방암 세포, MiaPaCa2 췌장암 세포 및 OCI-LY1 미만성 거대 B-세포 림프종에서 이 개념을 예시한다.
삼중-음성 유방암 세포주 MDA-MB-468에서 이 방법에 의해서 확인된 주된 시그날링 네트워크는 PI3K/AKT, IGF-IR, NRF2-매개된 산화적 스트레스 반응, MYC, PKA 및 IL-6 시그날링 경로였다 (도 22). 방법에 의해서 확인된 경로 성분은 표 3에 열거된다.
[표 3]
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PI3K - AKT - mTOR 경로
포스파티딜이노시톨 3 키나제 (PI3K)는 그의 이노시톨 지질 생성물이 사이토킨, 성장 인자 및 다른 세포외 매트릭스 단백질의 시그날 변환 경로에서 중추적인 역할을 하는 지질 키나제의 패밀리이다. PI3Ks는 3 개의 클래스인 클래스 I, II 및 III으로 분류되고, 여기에서 클래스 I이 가장 잘 연구된 것이다. 이것은 촉매적 및 조절성 서브유닛으로 구성된 헤테로다이머이다. 이들은 p110 및 p85인 것으로 가장 통상적으로 확인된다. 클래스 I PI3K에 의한 포스포이노시타이드(4,5)비포스페이트 (PIP2)의 인산화는 PtdIns(3,4,5)P3을 생성시킨다. 다양한 PI3ks가 다양한 시그날링 경로에 포함된다. 이것은 수용체 티로신 키나제 (RTKs), 어댑터 분자 GAB1-GRB2, 및 키나제 JAK와 같은 분자 그들의 상호작용을 통해서 매개된다. 이들은 PDK1를 활성화시키는데 집중한 다음에 AKT를 인산화시킨다. AKT는 2 개의 상이한 경로를 따른다: 1) 억제성 역할 - 예를 들어, AKT는 Bad/Bcl-XL 복합체의 Bad 성분을 인산화시킴으로써 세포사멸을 억제하여 세포 생존을 허용한다. 2) 활성화 역할 - AKT는 IKK를 활성화시켜 NF-κB 활성화 및 세포 생존을 유도한다. 그의 억제성 뿐만 아니라 활성화 역할에 의해서 AKT는 에너지 저장, 세포 주기 진행, 단백질 합성 및 혈관형성과 같은 다수의 세포 과정에 포함된다.
이 경로는 1-포스파티딜-D-미오-이노시톨 4,5-비스포스페이트, 14-3-3, 14-3-3-Cdkn1b, Akt, BAD, BCL2, BCL2L1, CCND1, CDC37, CDKN1A, CDKN1B, 시트룰린, CTNNB1, EIF4E, EIF4EBP1, ERK1/2, FKHR, GAB1/2, GDF15, 글리코겐 신타제, GRB2, Gsk3, Ikb, IkB-NfkB, IKK (복합체), ILK, 인테그린, JAK, L-아르기닌, LIMS1, MAP2K1/2, MAP3K5, MAP3K8, MAPK8IP1, MCL1, MDM2, MTOR, NANOG, NFkB (복합체), 니트릭 옥사이드, NOS3, P110, p70 S6k, PDPK1, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트, PI3K p85, PP2A, PTEN, PTGS2, RAF1, Ras, RHEB, SFN, SHC1 (EG:20416을 포함), SHIP, Sos, THEM4, TP53 (EG:22059를 포함), TSC1, Tsc1-Tsc2, TSC2, YWHAE로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
IGF -IR 시그날링 네트워크
인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1)은 성장 호르몬 조절 하의 펩타이드 호르몬이다. IGF-1은 세포 증식, 성장 및 생존을 촉진시킨다. 6 개의 특이적 결합 단백질인 IGFBP 1-6은 IGF 활성의 더 뉘앙스가 있는 조절을 허용한다. IGF-1 수용체 (IGF-1R)는 경막 티로신 키나제 단백질이다. IGF-1-유도된 수용체 활성화는 자동인산화에 이어서 하류 경로를 활성화시키는 증진된 능력을 야기한다. 활성화된 IGF-1R은 SHC 및 IRS-1을 인산화시킨다. 어댑터 분자 GRB2 및 SOS와 함께 SHC는 Ras/Raf/MEK/ERK 경로를 활성화시키는 시그날링 복합체를 형성한다. 핵으로의 ERK 전좌는 세포 성장 및 분화를 촉진시키는 유전자를 유도하는 전자 조절인자 ELK-1, c-Jun 및 c-Fos의 활성화를 야기한다. IRS-1은 PI3K/PDK1/AKT/BAD 경로를 통해서 세포 생존을 위한 경로를 활성화시킨다. IRS-1은 또한, PI3K/PDK1/p70RSK 경로를 통해서 세포 성장을 위한 경로를 활성화시킨다. IGF-1은 또한 JAK-1, JAK-2 및 STAT-3의 티로신 인산화를 유도함으로써 JAK/STAT 경로를 통해서 시그날을 전달한다. SOCS 단백질은 JAKs를 억제할 수 있으며, 이에 의해서 이 경로를 억제한다. 어댑터 단백질 GRB10은 IGF-IR과 상호작용한다. GRB10은 또한, E3 유비퀴틴 리가제 NEDD4를 결합시키고, 시그날링의 장기간 약화의 수단으로서 IGF-IR의 리간드 자극된 유비퀴틴화, 내재화 및 분해를 촉진시킨다.
이 경로는 1-포스파티딜-D-미오-이노시톨 4,5-비스포스페이트, 14-3-3, 14-3-3-Bad, Akt, 비전형적 단백질 키나제 C, BAD, CASP9 (EG:100140945를 포함), Ck2, ELK1, ERK1/2, FKHR, FOS, GRB10, GRB2, IGF1, Igf1-Igfbp, IGF1R, Igfbp, IRS1/2, JAK1/2, JUN, MAP2K1/2, MAPK8, NEDD4, p70 S6k, PDPK1, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트, PI3K (복합체), Pka, PTK2 (EG:14083을 포함), PTPN11, PXN, RAF1, Ras, RASA1, SHC1 (EG:20416을 포함), SOCS, SOCS3, Sos, SRF, STAT3, Stat3-Stat3으로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
NRF2 - 매개된 산화적 스트레스 반응
산화적 스트레스는 반응성 산소의 생산과 반응성 중간체의 해독 사이의 불균형에 의해서 야기된다. 퍼옥사이드 및 유리 래디칼과 같은 반응성 중간체는 단백질, 지질 및 DNA와 같은 세포의 다수의 부분에 대해서 매우 손상을 주는 것일 수 있다. 심한 산화적 스트레스는 세포사멸 및 괴사를 유발할 수 있다. 산화적 스트레스는 아테롬성 동맥경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 다수의 질환에 수반된다. 산화적 스트레스는 또한, 노화와 연관되었다. 산화적 스트레스에 대한 세포 방어 반응은 해독 효소 및 항산화제 효소의 유도를 포함한다. 핵 인자-적혈구 2-관련된 인자 2 (Nrf2)는 이들 효소의 프로모터 내에서 항산화제 반응 요소 (ARE)에 결합하며, 그들의 전사를 활성화시킨다. 불활성 Nrf2는 액틴-결합 단백질 Keap1과 연관됨으로써 세포질 내에 유지된다. 산화적 스트레스에 대한 세포의 노출에 의해서, Nrf2는 단백질 키나제 C, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 및 MAP 키나제 경로에 대한 반응으로 인산화된다. 인산화 후에, Nrf2는 핵으로 전좌하며, AREs를 결합시키고, 글루타치온 S-트랜스퍼라제, 사이토크롬 P450, NAD(P)H 퀴논 옥시도리덕타제, 헴 옥시게나제 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제와 같은 해독 효소 및 항산화제 효소를 트랜스활성화시킨다.
이 경로는 ABCC1, ABCC2, ABCC4 (EG:10257을 포함), 액틴, 액틴-Nrf2, Afar, AKR1A1, AKT1, AOX1, ATF4, BACH1, CAT, Cbp/p300, CBR1, CCT7, CDC34, CLPP, CUL3 (EG:26554를 포함), Cul3-Roc1, Cyp1a/2a/3a/4a/2c, EIF2AK3, ENC1, EPHX1, ERK1/2, ERP29, FKBP5, FMO1 (EG:14261을 포함), FOS, FOSL1, FTH1 (EG:14319를 포함), FTL, GCLC, GCLM, GPX2, GSK3B, GSR, GST, HERPUD1, HMOX1, Hsp22/Hsp40/Hsp90, JINK1/2, Jnkk, JUN/JUNB/JUND, KEAP1, Keap1-Nrf2, MAF, MAP2K1/2, MAP2K5, MAP3K1, MAP3K5, MAP3K7 (EG:172842를 포함), MAPK14, MAPK7, MKK3/6, 근건막 섬유육종 종양유전자, NFE2L2, NQO, PI3K (복합체), Pkc(s), PMF1, PPIB, PRDX1, Psm, PTPLAD1, RAF1, Ras, RBX1, 반응성 산소종, SCARB1, SLC35A2, Sod, SQSTM1, STIP1, TXN (EG:116484를 포함), TXNRD1, UBB, UBE2E3, UBE2K, USP14, VCP로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
단백질 키나제 A 시그날링 경로
단백질 키나제 A (PKA)는 성장, 발달, 기억 및 대사와 같은 다양한 과정을 조절한다. 이것은 두 개의 촉매적 서브유닛 (PKA-C) 및 조절 (PKA-R) 서브유닛 다이머의 테트라머 복합체로서 존재한다. 타입-II PKA는 AKAPs에 의해 세포 내에서 특정한 위치에 고정된다. 신경전달물질, 호르몬, 염증성 자극, 스트레스, 에피네프린 및 노르에피네프린과 같은 세포외 자극은 GPCRs 및 ADR-α/β와 같은 수용체를 통해서 G-단백질을 활성화시킨다. 이들 수용체는 CRHR, GcgR 및 DCC와 같은 다른 것들과 함께 PKA의 활성화를 유도하는 cAMP 축적에 책임이 있다. ATP의 cAMP로의 전환은 9 개의 경막 AC 효소 및 하나의 가용성 AC에 의해서 매개된다. 경막 AC는 헤테로트라이머 G-단백질, Gαs, Gαq 및 Gαi에 의해서 조절된다. Gαs 및 Gαq는 AC를 활성화시키는 반면에 Gαi는 억제한다. Gβ 및 Gγ 서브유닛은 Gαs 및 Gαq와 상승적으로 작용하여 ACII, IV 및 VII을 활성화시킨다. 그러나, Gαi와 함께 β 및 γ 서브유닛은 ACI, V 및 VI의 활성을 억제한다.
G-단백질은 DAG and IP3을 생성시키는 PLC를 활성화시킴으로써 cAMP 시그날링에 간접적으로 영향을 미친다. DAG는 다시 PKC를 활성화시킨다. IP3은 IP3R을 통해서 ER로부터 Ca2+를 방출시키면서 cAMP 시그날링에 대해 상류의 단백질을 변조시킨다. Ca2+는 또한 CaCn 및 CNG에 의해서 방출된다. Ca2+ 방출은 ACI를 활성화시킴으로써 cAMP 변조에 참여하는 칼모듈린, CamKKs 및 CamKs를 활성화시킨다. Gα13은 IκBα의 인산화 및 분해 및 PKA의 활성화를 유도하는 두 개의 독립적인 경로를 통해서 MEKK1 및 RhoA를 활성화시킨다. 저산소증, 허혈증 및 열 충격과 같은 스트레스 조건 하에서의 높은 수준의 cAMP는 또한 직접적으로 PKA를 활성화시킨다. TGF-β는 SMAD 단백질의 인산화를 통해서 cAMP와는 무관하게 PKA를 활성화시킨다. PKA는 심근 수축을 초래하는 SERCA2의 활성을 조절하는 포스포람반 (Phospholamban)을 인산화시키는 반면에, TnnI의 인산화는 이완을 매개한다. PKA는 또한 KDELR를 활성화시켜 단백질 회복을 촉진시킴으로써 세포의 정상 상태를 유지시킨다. Ca2+의 농도에서의 증가에 이은 PKA 활성화는 심혈관 항상성에 필수적인 eNOS 활성을 증진시킨다. 활성화된 PKA는 Raf1의 억제에 의해서 ERK 활성화를 억제한다. PKA는 14-3-3 단백질과 BAD 및 NFAT의 상호작용을 억제하여 세포 생존을 촉진시킨다. PKA는 내피 MLCK를 인산화시켜 기본 MLC 인산화의 감소를 유도한다. 이것은 또한 필라민, 어덕신, 팍실린 및 FAK를 인산화시키고. 스트레스 섬유의 소실 및 막 러플 (membrane ruffle)에서의 F-액틴 축적에 수반된다. PKA는 또한, 특이적 PPtase1 억제제, DARPP32의 인산화에 의해서 포스파타제 활성을 조절한다. PKA의 다른 기질에는 히스톤 H1, 히스톤 H2B 및 CREB가 포함된다.
이 경로는 1-포스파티딜-D-미오-이노시톨 4,5-비스포스페이트, 14-3-3, ADCY, ADCY1/5/6, ADCY2/4/7, ADCY9, Adducin, AKAP, APC, ATF1 (EG:100040260을 포함), ATP, BAD, BRAF, Ca2+, 칼시뉴린 단백질(들), 칼모듈린, CaMKII, CHUK, Cng 채널, Creb, CREBBP, CREM, CTNNB1, 사이클릭 AMP, DCC, 디아실글리세롤, ELK1, ERK1/2, 필라민, 병소 유착 키나제, G 단백질 알파i, G 단백질 베타 감마, G-단백질 베타, G-단백질 감마, GLI3, 글리코겐, 글리코겐 인산라제, 글리코겐 신타제, GNA13, GNAQ, GNAS, GRK1/7, Gsk3, 헤지호그 (Hedgehog), 히스톤 H1, 히스톤 h3, Ikb, IkB-NfkB, 이노시톨 트리포스페이트, ITPR, KDELR, LIPE, MAP2K1/2, MAP3K1, Mlc, 미오신-경쇄 키나제, 미오신2, Nfat (패밀리), NFkB (복합체), NGFR, NOS3, NTN1, 패치드 (Patched), Pde, Phk, Pka, Pka 촉매적 서브유닛, PKAr, Pkc(s), PLC, PLN, PP1 단백질 복합체 그룹, PPP1R1B, PTPase, PXN, RAF1, Rap1, RHO, RHOA, Rock, Ryr, SMAD3, Smad3-Smad4, SMAD4, SMO, TCF/LEF, Tgf 베타, Tgf 베타 수용체, TGFBR1, TGFBR2, TH, Tni, VASP로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
IL-6 시그날링 경로
염증에서 IL-6의 중추적 역할은 이것을 암과 연관된 염증의 관리를 위한 중요한 표적으로 만드는 것이다. IL-6 반응은 모든 IL-6-관련된 사이토킨에 대한 만능 시그날-변환 수용체 서브유닛으로서 작용하는 당단백질 130 (GP130)을 통해서 전파된다. IL-6-타입 사이토킨은 야누스 키나제 (Janus Kinase; JAK) 패밀리의 티로신 키나제 및 시그날 변환의 주요 매개체로서 신호 변환인자 및 전사 (STAT) 패밀리의 활성화인자를 이용한다. IL-6에 의한 수용체 자극 시에, GP130과 연관된 키나제의 JAK 패밀리는 활성화되어 GP130의 인산화를 야기한다. GP130의 몇 개의 포스포티로신 잔기는 STAT 인자, 주로 STAT3 및 STAT1에 대한 도킹 부위로 작용한다. 이어서, STATs는 인산화되고, 다이머를 형성하고, 핵으로 전좌하여 여기에서 이들은 표적 유전자의 전사를 조절한다. 시그날 변환의 JAK/STAT 경로 이외에도, IL-6는 또한 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 경로의 세포외 시그날-조절된 키나제 (ERK1/2)를 활성화시킨다. ERK1/2의 상류 활성화인자에는 RAS, 및 src 상동성-2 함유 단백질 GRB2 및 SHC가 포함된다. SHC 단백질은 JAK2에 의해서 활성화되며, 따라서 IL-6 활성화된 JAK/STAT와 RAS-MAPK 경로 사이의 연계로 작용한다. IL-6 활성화된 RAS에 대한 반응으로 MAPKs의 인산화는 핵 인자 IL-6 (NF-IL6)의 활성화를 야기하며, 이것은 다시 IL-6 유전자의 전사를 자극한다. IL-6 유전자의 전사는 또한, 핵 인자 카파 B (NFκB)의 활성화를 통해 종양 괴사 인자 (TNF) 및 인터류킨-1 (IL-1)에 의해서 자극된다.
MDA-MB-468 세포에서의 본 발명에 기술된 방법에 의한 발견을 기초로 하여, AKT, mTOR, PI3K, IGF1R, IKK, Bcl2, PKA 복합체, 포스포디에스테라제를 표적으로 하는 것 (단, 이들로 제한되지는 않는다)과 같은 이들 확인된 경로의 성분의 억제제의 조합이 Hsp90 억제제와의 조합으로 사용되는 경우에 효과적인 것으로 제안된다.
AKT 억제제의 예는 PF -04691502, 트리시리빈 포스페이트 (NSC-280594), A-674563, CCT128930 , AT7867, PHT -427, GSK690693 , MK-2206이다.
PI3K 억제제의 예는 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄설포닐피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일티에노(3,2-d)피리미딘, BKM120, NVP-BEZ235, PX-866, SF 1126, XL147이다.
mTOR 억제제의 예는 데포롤리무스 (deforolimus), 에버롤리무스 (everolimus), NVP-BEZ235, OSI-027, 타크롤리무스 (tacrolimus), 템시롤리무스 (temsirolimus), Ku-0063794, WYE-354, PP242, OSI-027, GSK2126458, WAY-600, WYE-125132이다.
Bcl2 억제제의 예는 ABT-737, 오바토클락스 (Obatoclax) (GX15-070), ABT-263, TW-37이다.
IGF1R 억제제의 예는 NVP-ADW742, BMS-754807, AVE1642, BIIB022, 식수투무맙 (cixutumumab), 가니투맙 (ganitumab), IGF1, OSI-906이다.
JAK 억제제의 예는 토파시티닙 (Tofacitinib) 시트레이트 (CP-690550), AT9283, AG-490, INCB018424 (룩솔리티닙 (Ruxolitinib)), AZD1480, LY2784544, NVP-BSK805, TG101209, TG-101348이다.
IkK 억제제의 예는 SC-514, PF 184이다.
포스포디에스테라제의 억제제의 예는 아미노필린, 아나그렐리드, 아로필린, 카페인, 실로미라스트, 디피리다몰, 디필린, L 869298, L-826,141, 밀리논, 니트로글리세린, 펜톡시필린, 로플루미라스트, 롤리프람, 테토미라스트, 테오필린, 톨부타마이드, 암리논, 아나그렐리드, 아로필린, 카페인, 실로미라스트, L 869298, L-826,141, 밀리논, 펜톡시필린, 로플루미라스트, 롤리프람, 테토미라스트이다.
미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 세포주 OCI-LY1에서, 상기 방법에 의해서 확인된 주요 시그날링 네트워크는 B 세포 수용체, PKC테타, PI3K/AKT, CD40, CD28 및 ERK/MAPK 시그날링 경로였다 (도 23). 상기 방법에 의해서 확인된 경로 성분은 표 4에 열거하였다.
[표 4]
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B 세포 수용체 시그날링
B 세포 항원 수용체 (BCR)를 통해서 전파된 시그날은 B 림프구의 발생, 생존 및 활성화에 아주 중요하다. 이들 시그날은 또한, 잠재적으로 자체-반응성인 B 림프구의 제거에서 중추적 역할을 한다. BCR은 막 항체를 인식하는 표면-결합된 항원, 및 면역수용체 티로신 기본 활성화 모티프 (ITAM)로 불리는 사이토졸성 모티프를 통해서 시그날 변환을 할 수 있는 결합된 Ig-α 및 Ig-β 헤테로다이머로 구성된다. B 세포 항원 수용체 (BCR)에 의한 다가 항원의 인식은 세포 반응에 이르는 일련의 연결된 시그날링 현상을 개시시킨다. BCR의 연계 (engagement)는 ITAM에서 티로신 잔기의 인산화를 유도한다. ITAM의 인산화는 SYK 키나제, 및 LYN, FYN 및 BLK 키나제를 포함하는 키나제의 SRC 패밀리에 의해서 매개된다. 인산화된 ITAMs에 의해서 상호간에 활성화된 이들 키나제는 연결된 시그날링 경로의 캐스케이트를 차례로 유발한다. BCR의 활성화는 핵 인자 카파 B (NFκB)의 자극을 초래한다. NF-kB를 통한 BCR 시그날링에 중심이 되는 것은 브루톤 티로신 키나제 (BTK), 어댑터 B-세포 링커 (BLNK) 및 포스포리파제 C 감마 2 (PLCγ2)에 의해서 형성된 복합체가다. 티로신 인산화된 어댑터 단백질은 BCR 결합된 티로신 키나제 및 하류 효과기 분자 사이의 브릿지로서 작용한다. BLNK는 BCR 활성화 시에 인산화되며, 티로신 키나제 SYK를 PLCγ2의 활성화에 커플링시키는 작용을 한다. PLCγ2의 완전한 자극은 BTK에 의해서 촉진된다. 자극된 PLCγ2는 단백질 키나제 (PKC)의 DAG 및 Ca2+ 매개된 활성화를 유발하며, 이것은 다시 IkB 키나제 (IKK) 및 그 후에는 NFκB를 활성화시킨다. NFκB의 활성화 이외에도, BLNK는 또한 VAV 및 GRB2와 같은 다른 단백질과 상호작용하여 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 경로의 활성화를 야기한다. 이것은 c-JUN, 전사 인자의 활성화 (ATF) 및 ELK6과 같은 몇 개의 인자의 트랜스활성화를 야기한다. 또 다른 어댑터 단백질인 일단 SYK에 의해서 활성화된 BCAP로 불리는 포스포이노시타이드 3-키나제 (PI3K)에 대한 B 세포 어댑터는 PI3K/AKT 시그날링 경로를 유발하는 쪽으로 나아간다. 이 경로는 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3)을 억제하여 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT)와 같은 전사 인자의 핵 축적 및 단백질 합성의 증진을 야기한다. PI3K/AKT 경로의 활성화는 또한 B 세포에서 세포사멸의 억제를 초래한다. 이 경로는 B 세포 수용체 항원 시그날링의 중요한 성분을 강조한다.
이 경로는 1-포스파티딜-D-미오-이노시톨 4,5-비스포스페이트, ABL1, Akt, ATF2, BAD, BCL10, Bcl10-Card10-Malt1, BCL2A1, BCL2L1, BCL6, BLNK, BTK, 칼모듈린, CaMKII, CARD10, CD19, CD22, CD79A, CD79B, Creb, CSK, DAPP1, EGR1, ELK1, ERK1/2, ETS1, Fcgr2, GAB1/2, GRB2, Gsk3, Ikb, IkB-NfkB, IKK (복합체), JINK1/2, Jnkk, JUN, LYN, MALT1, MAP2K1/2, MAP3K, MKK3/4/6, MTOR, NFAT (복합체), NFkB (복합체), P38 MAPK, p70 S6k, PAG1, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트, PI3K (복합체), PIK3AP1, PKC(β,θ), PLCG2, POU2F2, Pp2b, PTEN, PTPN11, PTPN6, PTPRC, Rac/Cdc42, RAF1, Ras, SHC1 (EG:20416을 포함), SHIP, Sos, SYK, VAV로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
PKC테타 경로
효과적인 면역반응은 외래 분자를 확인하고, 성숙 효과기 세포로의 분화에 의해 반응하는 전문화된 백혈구의 능력에 따라 좌우된다. 세포 표면 항원 인식기구 및 복잡한 세포내 수용체-커플링된 시그날 변환 기전은 고충실도로 작동하여 비-자체 항원으로부터 자체 항원을 구분하는 이 단단히 조절된 과정을 매개한다. T 세포의 활성화는 TCR과 MHC-제시된 펩타이드 항원의 지속적인 물리적 상호작용을 필요로 하며, 이것은 면역학적 시냅스 또는 초분자 활성화 클러스터로 불리는 전문화된 지역인 T-세포-APC 접촉 지역에서 다수의 세포 요소의 일시적이고 공간적인 재구성을 야기한다. 최근의 연구는 IL-2 유전자 유도를 통해서 세포 활성화, 분화 및 생존을 유도하는 TCR 시그날링에서의 몇 가지 중요한 기능을 매개하는 T-세포 초분자 활성화 클러스터의 필수적인 성분으로서 Ca-독립적 PKC 패밀리의 구성원인 PKCθ를 확인하였다. 높은 수준의 PKCθ는 골격근 및 림프양 조직에서, 주로 흉선 및 림프절에서 발현되며, 비장에서는 더 낮은 수준으로 발현된다. T 세포는 PKCθ 발현을 위한 일차 위치를 구성한다. T 세포 중에서 CD4+/CD8+ 단일 양성 말초혈액 T 세포 및 CD4+/CD8+ 이중 양성적 흉선세포가 높은 레벨의 PKCθ를 발현하는 것으로 발견되었다. T 세포의 표면 상에서 TCR/CD3 참여는 Src, Syk, ZAP70 및 Tec-패밀리 PTKs의 활성화를 유도하여 PLCγ1, PI3K 및 Vav의 자극 및 막 동원을 초래한다. Rac 및 액틴 세포골격 재구성뿐만 아니라 PI3K에 따라 좌우되는 Vav 매개된 경로가 초분자 활성화 클러스터로의 PKCθ의 선택적 동원에 책임이 있다. PLCγ1-생성된 DAG는 또한 PKCθ의 초기 동원에 역할을 한다. 전사 인자 NF-κB 및 AP-1은 PKCθ의 일차 생리학적 표적이다. PKCθ에 의한 이들 전사 인자의 효율적인 활성화는 TCR 및 CD28 공동-자극성 시그날의 통합을 필요로 한다. APCs 상에 그의 CD80/CD86 (B7-1/B7-2) 리간드를 갖는 CD28이 초분자 활성화 클러스터에 대해 특이적으로 PKCθ의 동원하는데 필요하다. TCR/CD28 공동-자극을 위한 표적으로 작용하는 전사 요소는 IL-2 프로모터 내의 CD28RE이다. CD28RE는 NF-κB 및 AP-1에 대한 조합 결합 부위이다. 최근의 연구는 PKCθ에 의한 NF-κB에 대한 TCR 커플링의 조절이 다양한 별개의 기전을 통해서 영향을 받음을 시사한다. PKCθ는 IKK 복합체와 직접 결합하여 IKK를 조절할 수 있으며; PKCθ는 CaMKII를 통해서 간접적으로 IKK 복합체를 조절할 수 있고; 이것은 함께 IKK 복합체를 통해서 NF-κB 및 IκB를 조절하는 BCL10 및 MALT1을 포함하는 새롭게 기술된 경로의 상류에서 작용할 수 있다. PKCθ는 활성화된 항원-특이적 T 세포의 팽창을 제한하고, 일단 특이적 병원체가 제거되면 면역반응의 종결을 보장하는 중요한 과정인 활성화-유도된 T 세포 사망 (AICD)을 촉진시키는 것으로 확인되었다. 효소적으로 활성인 PKCθ는 칼시뉴린과 선택적으로 상승작용하여 카스파제 8-매개된 Fas/FasL-의존적 AICD를 활성화시킨다. CD28 공동-자극은 TCR-매개된 IL-2 생산에 필수적인 역할을 하며, 그의 부재 하에서 T 세포는 아네르기 (anergy)로 불리는 무반응성 (unresponsiveness)의 안정한 상태로 들어간다. PKCθ-매개된 CREB 인산화, 및 IL-2 프로모터 내의 cAMP-반응 요소에 대한 그의 후속 결합은 IL-2 전사를 음성적으로 조절함으로써 반응성 T 세포를 아네르기 상태로 구동시킨다. T-세포 내에서 PKCθ의 선택적 발현 및 성숙 T 세포 활성화에 있어서의 그의 필수적인 역할은 이것을 이식 및 자가면역 질환에서의 면역억제를 위한 매력적인 약물 표적으로 정립시킨다.
이 경로는 Ap1, BCL10, Bcl10-Card11-Malt1, 칼시뉴린 단백질(들), CaMKII, CARD11, CD28, CD3, CD3-TCR, CD4, CD80 (EG:12519를 포함), CD86, 디아실글리세롤, ERK1/2, FOS, FYN, GRAP2, GRB2, Ikb, IkB-NfkB, Ikk (패밀리), IL2, 이노시톨 트리포스페이프, JUN, LAT, LCK, LCP2, MALT1, MAP2K4, MAP3K, MAPK8, MHC 클래스 II (복합체), Nfat (패밀리), NFkB (복합체), 포르볼 미리스테이트 아세테이트, PI3K (복합체), PLC 감마, POU2F1, PRKCQ, Rac, Ras, Sos, TCR, VAV, 전압-개폐 칼슘 채널, ZAP70으로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
CD40 시그날링
CD40은 생존 시그날을 B 세포에 전달하는 세포 표면 수용체의 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리의 구성원이다. 리간드 결합시키면, 세포-표면 CD40에 의해서 유발된 기본적인 시그날링은 세포질성 어댑터 (지질 뗏목 (lipid rafts)에서 CD40에 의해서 동원된 TNF-수용체-결합된 인자 [TRAFs]) 및 IKK 복합체를 필요로 하는 다수 단계의 캐스케이드를 수행한다. NF-κB 활성화를 통해서, CD40 시그날로좀은 B-세포 성장 및 생존에 포함된 다수의 유전자의 전사를 활성화시킨다. CD40 시그날로좀은 공격적 림프종에서 활성이고, 종양 성장에 기여하기 때문에, CD40에 대해 지시된 면역치료학적 전략이 디자인되고 임상실험에서 현재 시험 중에 있다 (Bayes 2007 and Fanale 2007).
CD40-매개된 시그날 변환은 병원체에 대한 숙주 방어에 연루된 대다수의 유전자의 전사를 유도한다. 이것은 c-Jun, ATF2 및 Rel 전사 인자의 활성화를 통해서 유전자 발현을 조절하는 NF-κB, MAPK 및 STAT3을 포함하는 다수의 경로의 활성화에 의해서 성취된다. CD40L의 수용체 클러스터링은 리간드의 p53과의 연관, ASM의 원형질 막으로의 전좌, ASM의 활성화, 및 세라미드 (ceramide)의 형성에 의해서 매개된다. 세라미드는 CD40L 및 몇 개의 TRAF 단백질 (TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5, 및 TRAF6를 포함)을 CD40과 클러스터링시키는 작용을 한다. TRAF2, TRAF3 및 TRAF6는 CD40에 직접 결합한다. TRAF1은 CD40에 직접 결합하지 않지만, TRAF2와의 헤테로다이머화를 통해서 막 마이크로 영역에 동원된다. TRAF1의 동원과 유사하게, TRAF5도 또한 TRAF3-의존적 방식으로 CD40에 간접적으로 동원된다. Act1은 TRAF 단백질을 TAK1/IKK에 결합시켜 NF-κB/I-κB, 및 MKK 복합체를 활성화시켜 JNK, p38 MAPK 및 ERK1/2를 활성화시킨다. NIK는 또한, IKK를 활성화시키는데 선도적 역할을 한다. Act1-의존적 CD40-매개된 NF-κB 활성화는 CD40L-유도된 세포사멸로부터 세포를 보호한다. CD40L 또는 다른 염성 매개인자에 의해서 자극하면, I-κB 단백질은 IKK에 의해서 인산화되고, NF-κB는 Act1-TAK1 경로를 통해서 활성화된다. 그 후, 인산화된 I-κB는 빠르게 유비퀴틴화되고 분해된다. 유리된 NF-κB는 핵으로 전좌하고, 전사를 활성화시킨다. TNF에 의해서 유도된 A20은 NF-κB 활성화뿐만 아니라 TNF-매개된 세포사멸을 억제한다. TRAF3은 p38 및 JNK의 활성화를 초래하지만 Act1-의존적 CD40-매개된 NF-κB 활성화를 억제하며, CD40L-유도된 세포사멸을 개시시키는 시그날링 경로를 개시시킨다. TRAF2는 SAPK 경로의 활성화에 필요하며, 또한 CD40-매개된 표면 상향조절, B-세포에서의 IgM 분비 및 ICAM1의 상향-조절에서 역할을 한다. CD40L에 의한 CD40 리게이션 (ligation)은 인간 근위 세뇨관 세포의 일차 배양물에서 MCP1 및 IL-8 생산을 자극하며, 이것은 주로 TRAF6의 동원 및 ERK1/2, SAPK/JNK 및 p38 MAPK 경로의 활성화를 통해서 일어난다. SAPK/JNK 및 p38 MAPK 경로의 활성화는 TRAF6를 통해서 매개되는 반면에 ERK1/2 활성은 다른 TRAF 구성원을 통해서 잠재적으로 매개된다. 그러나, 3 개의 MAPK 경로 모두의 자극이 MCP1 및 IL-8 생산에 필요하다. CD40 자극에 의해서 활성화된 다른 경로에는 B-세포에 CD40L에 의해서 부여된 항-세포사멸 특성에 기여하는 JAK3-STAT3 및 PI3K-Akt 경로가 포함된다. CD40은 JAK3에 직접 결합하고, STAT3 활성화를 매개하며, 이어서 ICAM1, CD23, 및 LT-α를 상향-조절한다.
이 경로는 Act1, Ap1, ATF1 (EG:100040260을 포함), CD40, CD40LG, ERK1/2, FCER2, I 카파 b 키나제, ICAM1, Ikb, IkB-NfkB, JAK3, Jnk, LTA, MAP3K14, MAP3K7 (EG:172842를 포함), MAPKAPK2, Mek, NFkB (복합체), P38 MAPK, PI3K (복합체), STAT3, Stat3-Stat3, TANK, TNFAIP3, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TRAF6으로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
CD28 시그날링 경로
CD28은 TCR/CD3에 대한 공동-수용체이며, 주요 양성 공동-자극성 분자이다. CD80 및 CD86에 의해서 리게이션시키면, CTLA4는 활성화의 종결을 위한 음성적 공동-자극성 시그날을 제공한다. 클래스-I 조절성 PI3K에 대한 CD28의 추가의 결합은 PI3K를 막에 동원하여 PIP3의 생성 및 PIK3C3과 같은 플렉스트린-상동성 (pleckstrin-homology) 영역을 함유하는 단백질의 원형질 막으로의 동원을 야기한다. PI3K는 Akt의 활성화에 필요하며, 이것은 다시 세포 생존을 촉진시키는 다수의 하류 표적을 조절한다. NFAT 이외에도, NF-κB는 IL-2 프로모터 및 항-세포사멸 인자의 전사의 조절에 중요한 역할을 갖는다. 이를 위해서, PLC-γ는 IP3 및 DAG를 생성시키는 기질로서 PIP2를 이용한다. IP3은 IP3R을 통해서 Ca2+의 방출을 유도하고, DAG는 PKC-θ를 활성화시킨다. RLK, PLC-γ 및 Ca2+의 영향 하에서; PKC-θ는 직접뿐만 아니라 간접적인 상호작용을 통해서 IKK 복합체의 인산화 상태를 조절한다. 더욱이, CARMA1의 활성화는 BCL10을 인산화시키고, MALT1을 다이머화시키며, 이것은 IKKs의 활성화에 충분한 현상이다. IL-2 프로모터 내의 두 개의 CD28-반응성 요소는 NF-κB 결합 부위를 갖는다. NF-κB 다이머는 통상적으로 억제성 I-κBs에 결합함으로써 세포질 내에 유지된다. I-κBs의 인산화는 그의 유비퀴틴화 및 분해를 개시시킴으로써 NF-κB를 유리시켜 핵으로 전좌시킨다. 마찬가지로, 칼모듈린-칼시뉴린 상호작용의 결과로서 NFAT의 핵으로의 전좌는 IL-2 발현을 효과적으로 촉진시킨다. TCR-CD28-PI3K 시그날링에 의한 Vav1의 활성화는 CD28을 Rac 및 CDC42의 활성화와 연결시키며, 이것은 TCR-CD3-CD28 매개된 세포골격 재구성을 증진시킨다. Rac는 액틴 폴리머화를 조절하여 라멜리포디알 돌출 (lamellipodial protrusion) 및 막 러플링 (membrane ruffling)을 구동시키는 반면에, CDC42는 극성을 생성시키고, 사상위족 (filopodia) 및 마이크로스파이크 (microspike)의 형성을 유도한다. CDC42 및 Rac GTPases는 순차적으로 WASP 및 PAK1과 같은 하류 효과기를 활성화시키는 작용을 하여 ARPs의 활성화를 유도함으로써 세포골격 재배열을 야기한다. CD28은 MEKK1, MKKs 및 JNKs의 후속 활성화를 통해서 Rac/PAK1-매개된 IL-2 전사를 침해한다. JNKs는 IL-2의 전사에 필수적인 c-Jun 및 c-Fos를 인산화시키고 활성화시킨다. CD28을 통한 시그날링은 사이토킨 IL-2 mRNA 생산 및 세포 주기, T-세포 생존, T-H헬퍼 세포 분화 및 면역글로불린 이소타입 스위칭 내로의 도입을 촉진시킨다.
이 경로는 1,4,5-IP3, 1-포스파티딜-D-미오-이노시톨 4,5-비스포스페이트, Akt, Ap1, Arp2/3, BCL10, Ca2+, 칼시뉴린 단백질(들), 칼모듈린, CARD11, CD28, CD3, CD3-TCR, CD4, CD80 (EG:12519를 포함), CD86, CDC42, CSK, CTLA4, 디아실글리세롤, FOS, FYN, GRAP2, GRB2, Ikb, IkB-NfkB, IKK (복합체), IL2, ITK, ITPR, Jnk, JUN, LAT, LCK, LCP2, MALT1, MAP2K1/2, MAP3K1, MHC 클래스 II (복합체), Nfat (패밀리), NFkB (복합체), PAK1, PDPK1, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트, PI3K (복합체), PLCG1, PRKCQ, PTPRC, RAC1, SHP, SYK, TCR, VAV1, WAS, ZAP70으로 구성되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
ERK - MAPK 경로
ERK (세포외-조절된 키나제)/MAPK (미토겐 활성화된 단백질 키나제) 경로는 세포 내에서 감수분열/유사분열, 성장, 분화 및 발암성에 대한 세포 정보를 변환시키는 주요 경로이다. 종종 성장 인자 수용체인 막 결합된 수용체 티로신 키나제 (RTK)는 이 경로를 위한 출발점이다. RTK에 대한 리간드의 결합은 RTK의 고유한 티로신 키나제 활성을 활성화시킨다. 성장 인자 수용체 결합된 단백질 2 (GRB2), SOS (son of sevenless) 및 Shc와 같은 어댑터 분자는 티로신 인산화된 RTK 상에서 시그날링 복합체를 형성하며, Ras를 활성화시킨다. 활성화된 Ras는 MEK (MAPK 키나제)를 활성화 및 인산화시키는 Raf (MAPK 키나제 키나제)로 시작하는 키나제 캐스케이드를 개시시키며; MEK는 ERK (MAPK)를 활성화 및 인산화시킨다. 세포질 내의 ERK는 세포골격 단백질, 이온 채널/수용체 및 해독 조절인자를 포함하는 다양한 표적을 인산화시킬 수 있다. ERK는 또한, 핵 내로 가로질러서 전좌하며, 여기에서 이것은 ELK-1, STAT-1 및 -3, ETS 및 MYC와 같은 전사 조절인자와 상호작용함으로써 유전자 전사를 유도한다. 세포질 내에서 p90RSK의 ERK 활성화는 그의 핵 전좌를 초래하고, 여기에서 이것은 전사 조절인자 CREB, c-Fos 및 SRF와의 상호작용을 통해서 유전자 전사를 간접적으로 유도한다. Ras 및 Raf의 RTK 활성화는 때때로 대체 경로를 취한다. 예를 들어, 인테그린은 FAK 매개된 경로를 통해서 ERK를 활성화시킨다. ERK는 또한, B-Raf의 CAS-CRK-Rap1 매개된 활성화 및 ERK의 PLCγ-PKC-Ras-Raf 활성화에 의해서 활성화될 수도 있다.
이 경로는 1,4,5-IP3, 1-포스파티딜-D-미오-이노시톨 4,5-비스포스페이트, 14-3-3(β,γ,θ,η,ζ), 14-3-3(η,θ,ζ), ARAF, ATF1 (EG:100040260를 포함), BAD, BCAR1, BRAF, c-Myc/N-Myc, cAMP-Gef, CAS-Crk-DOCK 180, Cpla2, Creb, CRK/CRKL, 사이클릭 AMP, 디아실글리세롤, DOCK1, DUSP2, EIF4E, EIF4EBP1, ELK1, ERK1/2, Erk1/2 다이머, ESR1, ETS, FOS, FYN, GRB2, 히스톤 h3, Hsp27, 인테그린, KSR1, LAMTOR3, MAP2K1/2, MAPKAPK5, MKP1/2/3/4, MNK1/2, MOS, MSK1/2, NFATC1, Pak, PI3K (복합체), Pka, PKC (α,β,γ,δ,ε,ι), PLC 감마, PP1/PP2A, PPARG, PTK2 (EG:14083을 포함), PTK2B (EG:19229를 포함), PXN, Rac, RAF1, Rap1, RAPGEF1, Ras, RPS6KA1 (EG:20111을 포함), SHC1 (EG:20416을 포함), Sos, SRC, SRF, Stat1/3, 탈린, VRK2로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
DLBCL OCI-LY1에서 본 발명에 기술된 방법에 의한 발견을 기초로 하여 SYK, BTK, mTOR, PI3K, Ikk, CD40, MEK, Raf, JAK, MHC 복합체 성분, CD80, CD3을 표적으로 하는 것 (단, 이들로 제한되지는 않는다)과 같은 이들 경로의 성분의 억제제의 조합은 Hsp90 억제제와 함께 사용되는 경우에 효과적인 것으로 제안된다.
BTK 억제제의 예는 PCI-32765이다.
SYK 억제제의 예는 R-406, R406, R935788 (포스타마티닙 (Fostamatinib) 디나트륨)이다.
CD40 억제제의 예는 SGN-40 (항-huCD40 mAb)이다.
CD28 경로의 억제제의 예는 아바타셉트, 벨라타셉트, 블리나투모맙 (blinatumomab), 무로모납 (muromonab)-CD3, 비실리주맙 (visilizumab)이다.
주요 조직적합성 복합체, 클래스 II의 억제제의 예는 아폴리주맙 (apolizumab)이다.
PI3K 억제제의 예는 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄설포닐피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일티에노(3,2-d)피리미딘, BKM120, NVP-BEZ235, PX-866, SF 1126, XL147이다.
mTOR 억제제의 예는 데포롤리무스, 에버롤리무스, NVP-BEZ235, OSI-027, 타크롤리무스, 템시롤리무스, Ku-0063794, WYE-354, PP242, OSI-027, GSK2126458, WAY-600, WYE-125132이다.
JAK 억제제의 예는 토파시티닙 (Tofacitinib) 시트레이트 (CP-690550), AT9283, AG-490, INCB018424 (룩솔리티닙 (Ruxolitinib)), AZD1480, LY2784544, NVP-BSK805, TG101209, TG-101348이다.
IkK 억제제의 예는 SC-514, PF 184이다.
Raf의 억제제의 예는 소라페닙 (sorafenib), 베무라페닙 (vemurafenib), GDC-0879, PLX-4720, PLX4032 (베무라페닙), NVP-BHG712, SB590885, AZ628, ZM 336372이다.
SRC의 억제제의 예는 AZM-475271, 다사티닙 (dasatinib), 사라카티닙 (saracatinib)이다.
MiaPaCa2 췌장암 세포주에서 상기 방법에 의해서 확인된 주요 시그날링 네트워크는 PI3K/AKT, IGF1, 세포 주기-G2/M DNA 손상 체크포인트 조절, ERK/MAPK 및 PKA 시그날링 경로였다 (도 24).
몇 개의 네트워크 성분 단백질 사이의 상호작용은 도 16에 예시된다.
췌장 선암은 가장 치명적인 암 중의 하나인 것으로 계속되고 있으며, 미국에서는 암 사망의 네번째 선도 원인을 나타낸다. 80% 이상의 환자가 진단 시에 진행된 암을 나타내며, 따라서 잠재적으로 치유적인 외과적 절제에 대한 후보가 아니다. 젬시타빈-기본 화학요법은 1997년에 중추적인 III 상 실험이래로 국소적으로 진행되거나 전이성인 췌장 선암의 주된 치료법으로 남아있다. 비록 젬시타빈에 의한 치료는 진행된 췌장암을 갖는 환자에게서 상당한 증상 조절을 달성하지만, 그의 반응율은 여전히 낮게 유지되고, 대략 6 개월의 중앙 생존기간과 연관된다. 이들 결과는 이 종양 타입에 대한 기존의 치료 전력의 부적절성을 나타내며, 췌장암을 갖는 환자에 대해서 새롭고 더욱 효과적인 치료법을 개발하는데 합심된 노력이 요구된다.
Pub Med. 문헌, 임상실험 데이터베이스 (clinicaltrials.gov), 미국 임상종양 학회 (American Society of Clinical Oncology; ASCO) 및 미국 암 연구 협회 (American Association of Cancer Research; AACR) 웹사이트의 현재의 검토로 췌장암의 분자 병인론은 다수의 경로 및 규정된 돌연변이를 포함하는 것으로 결론지어졌으며, 이 질병에서 표적화된 치료법의 실패에 대한 주된 원인으로 이 복잡성을 시사한다. 세포 증식, 생존 및 전이를 조절하는 종양원성 경로를 활성화시키는 복잡한 기전과 직면하여, 따라서 단일 활성화 분자를 표적으로 하는 치료법은 다수의 이상 세포 과정을 제압할 수 없으며, 진행된 질병에서 제한된 치료학적 이득을 가질 수 있다.
MiaPaCa2 세포에서 여기에 기술된 방법에 의한 발견을 기초로 하여 AKT, mTOR, PI3K, JAK, STAT3, IKK, Bcl2, PKA 복합체, 포스포디에스테라제, ERK, Raf, JNK을 표적으로 하는 것 (단, 이들로 제한되지는 않는다)과 같은 이들 확인된 경로의 성분의 억제제의 조합은 Hsp90 억제제와 함께 사용되는 경우에 효과적인 것으로 제안된다.
AKT 억제제의 예는 PF-04691502, 트리시리빈 포스페이트 (NSC-280594), A-674563, CCT128930, AT7867, PHT-427, GSK690693, MK-2206 디하이드로클로라이드이다.
PI3K 억제제의 예는 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄설포닐피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일티에노(3,2-d)피리미딘, BKM120, NVP-BEZ235, PX-866, SF 1126, XL147이다.
mTOR 억제제의 예는 데포롤리무스, 에버롤리무스, NVP-BEZ235, OSI-027, 타크롤리무스, 템시롤리무스, Ku-0063794, WYE-354, PP242, OSI-027, GSK2126458, WAY-600, WYE-125132이다.
Bcl2 억제제의 예는 ABT-737, 오바토클락스 (GX15-070), ABT-263, TW-37이다.
JAK 억제제의 예는 토파시티닙 시트레이트 (CP-690550), AT9283, AG-490, INCB018424 (룩솔리티닙), AZD1480, LY2784544, NVP-BSK805, TG101209, TG-101348이다.
IkK 억제제의 예는 SC-514, PF 184이다.
포스포디에스테라제의 억제제의 예는 아미노필린, 아나그렐리드, 아로필린, 카페인, 실로미라스트, 디피리다몰, 디필린, L 869298, L-826,141, 밀리논, 니트로글리세린, 펜톡시필린, 로플루미라스트, 롤리프람, 테토미라스트, 테오필린, 톨부타마이드, 암리논, 아나그렐리드, 아로필린, 카페인, 실로미라스트, L 869298, L-826,141, 밀리논, 펜톡시필린, 로플루미라스트, 롤리프람, 테토미라스트이다.
실제로, 본 발명자들의 방법에 의해서 MiaPaCa2 세포의 변형에 잠재적으로 기여하는 것으로 확인된 (도 7e) mTOR의 억제제는 단일 작용제로서 활성이 있으며 (도 7f), 이들 췌장암 세포의 성장에 영향을 미치는데 Hsp90 억제와 상승적으로 작용한다 (도 17).
mTOR 및 Hsp90 억제제 사이의 상승작용의 정량적 분석:
pp242 (mTOR 억제제) 및 PU-H71 (Hsp90 억제제) 사이의 약물 상호작용을 결정하기 위해서, 차우-탈라레이의 병용지수 (CI) 아이소볼로그램 방법을 전술한 바와 같이 사용하였다. 질량 작용의 법칙의 중앙-효과 원리를 기초로 하는 이 방법은 컴퓨터화된 시뮬레이션에 의해서 각각의 약물의 기전과는 무관하게 두 개 또는 그 이상의 약물 조합에 대한 상승작용 또는 길항작용을 정량한다. 알고리즘을 기초로 하여, 컴퓨터 소프트웨어는 중앙-효과 플롯, 병용지수 플롯 및 표준화된 아이소볼로그램을 표시한다 (여기에서는 2 개의 약물의 비 정수비 조합이 사용된다).　 PU-H71 (0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.0125 μM) 및 pp242 (0.5, 0.125, 0.03125, 0.0008, 0.002, 0.001 μM)를 언급된 농도의 단일 작용제로 사용하거나, 비-정수비 (PU-H71:pp242; 1:1, 1:2, 1:4, 1:7.8, 1:15.6, 1:12.5)로 조합하였다. Fa (사멸 세포 분율)는 수학식 Fa=1-Fu를 사용하여 계산하였으며; Fu는 영향을 받지 않은 세포의 분율이고, 컴퓨터 소프트웨어 (CompuSyn, Paramus,New Jersey, USA)를 사용한 용량 효과 분석을 위해서 사용하였다.
유사한 방식으로, 본 발명의 방법에 의해서 MDA-MB-468 세포의 변형에 기여하는 것으로 확인된 PI3K-AKT-mTOR 경로의 억제제는 Hsp90 억제제와 조합하는 경우에 MDA-MB-468 유방암 세포에서 더욱 효과적이다.
세포 주기: G2/M DNA 손상 체크포인트 조절
G2/M 체크포인트는 세포 주기 내의 두 번째 체크포인트이다. 이 체크포인트는 손상된 DNA를 갖는 세포가 M 상으로 들어가는 것을 방지하는 한편, 또한 DNA 복구가 일어날 수 있도록 정지시킨다. 이러한 조절은 게놈 안정성을 유지시키고, 세포가 악성 변형을 일으키는 것을 방지하는데 중요하다. 모세혈관 확장성 운동실조 돌연변이 (ATM) 및 모세혈관 확장성 운동실조 돌연변이 및 rad3 관련 (ATR)이 DNA 손상에 대해 반응하는 주요 키나제이다. ATR은 UV 손상에 대해서 반응하는 반면에 ATM은 DNA 이중-스트랜드 절단 (DSB)에 반응한다. ATM 및 ATR은 키나제 Chk1 및 Chk2를 활성화시키고, 결과적으로 통상적으로 Cdc2를 활성화시키는 포스파타제인 Cdc25를 억제시킨다. 사이클린-의존적 키나제인 Cdc2는 M 상으로 들어가는데 필요한 주요 분자이다. 인 포스파타제인 Cdc25를 억제한다. 이것은 그의 활성을 위해서 사이클린 B1에 대한 결합을 필요로 한다. 종양 억제인자 유전자 p53은 G2/M 체크포인트 조절에 중요한 분자이다. ATM, ATR 및 Chk2는 p53의 활성화에 기여한다. 또한, p19Arf는 p53의 MDM2 중화를 방지하도록 기계론적으로 작용한다. Mdm4는 p53의 전사 억제제이다. Mdm4의 DNA 손상-유도된 인산화는 Mdm4를 분해에 대해서 표적화함으로써 p53을 활성화시킨다. Gadd45 및 p21과 같은 잘 알려진 p53 표적 유전자가 Cdc2를 억제하는데 포함된다. 또 다른 p53 표적 유전자인 14-3-3σ는 Cdc2-사이클린 B 복합체에 결합하여 이것이 불활성이 되게 한다. p53에 의한 사이클린 B1 유전자의 억제는 또한, 유사분열에 들어가는 것을 차단하는데 기여한다. 이러한 방법으로, 세포가 M 상으로 들어가기 전에 다수의 점검이 시행된다.
이 경로는 14-3-3, 14-3-3 (β,ε,ζ), 14-3-3-Cdc25, ATM, ATM/ATR, BRCA1, Cdc2-사이클린B, Cdc2-사이클린B-Sfn, Cdc25B/C, CDK1, CDK7, CDKN1A, CDKN2A, Cdkn2a-Mdm2, CHEK1, CHEK2, CKS1B, CKS2, 사이클린 B, EP300, Ep300/Pcaf, GADD45A, KAT2B, MDM2, Mdm2-Tp53-Mdm4, MDM4, PKMYT1, PLK1, PRKDC, RPRM, RPS6KA1 (EG:20111을 포함), Scf, SFN, Top2, TP53 (EG:22059를 포함), WEE1로 구성되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에 기술된 방법에 의한 발견을 기초로 하여 CDK1, CDK7, CHEK1, PLK1 및 TOP2A(B)를 표적으로 하는 것과 같은 이 경로의 성분의 억제제의 조합은 Hsp90 억제제와 함께 사용되는 경우에 효과적인 것으로 제안된다.
억제제의 예는 AQ4N, 베카테카린 (becatecarin), BN 80927, CPI-0004Na, 다우노루비신, 덱스라족산, 독소루비신, 엘사미트루신 (elsamitrucin), 에피루비신, 에토포사이드, 가티플록사신 (gatifloxacin), 제미플록사신 (gemifloxacin), 미톡산트론, 날리딕산, 네모루비신, 노르플록사신, 노보비오신, 픽산트론, 타플루포사이드 (tafluposide), TAS-103, 티라파자민, 발루비신 (valrubicin), XK469, BI2536이다.
PU-비드는 또한, 선택된 CML, 췌장암 및 유방암 세포에서 Hsp90-조절된 경로로서 DNA 손상, 복제 및 수복, 상동성 재조합, 및 이온화 방사선에 대한 세포 반응의 단백질을 확인한다. PU-H71은 이들 경로 상에 작용하는 작용제와 상승적으로 작용하였다.
특이적으로, K562 CML 세포, MDA-MB-468 유방암 세포 및 Mia-PaCa-2 췌장암 세포에서 확인된 Hsp90-조절된 경로 중에서 몇 가지는 DNA 손상, 복제 및 수복 반응 및/또는 상동성 재조합에 포함된다 (표 3, 5a-5f). Hsp90 억제는 DNA 손상 및/또는 상동성 재조합에 작용하는 작용제와 상승적이거나 상가적일 수 있다 (즉, 무-오류 상동성 재조합 수복 경로에 의한 이중-스트랜드 DNA 파손의 수복에 중요한 단백질에 작용하는 PARP 억제제와 같은 다른 작용제 또는 IR/화학요법으로 처리한 후에 지속된 DNA 손상을 강화시킨다). 실제로, 본 발명자들은 PU-H71이 Mia-PaCa-2 인간 췌장암 세포를 방사선감작시키는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, PU-H71이 MDA-MB-468 및 HCC1937 유방암 세포에서 PARP 억제제 올라파립 (olaparib)과 상승작용한다는 것을 발견하였다 (도 25).
종양 세포 생존에 필요한 Hsp90 클라이언트의 확인은 또한, Hsp90 치료로부터 이득을 얻을 것 같은 환자의 선택을 위한, 및 임상실험 중에 Hsp90 억제제 효능의 약동학적 모니터링을 위한 종양-특이적 바이오마커로서 적용할 수 있다 (즉, 그의 발현 또는 인산화가 Hsp90 억제에 의해서 변화하는 도 6, 20에서의 클라이언트). 종양 특이적 Hsp90 클라이언트 프로파일링은 궁극적으로 종양의 개인 맞춤형 치료학적 표적화를 위한 방법을 수득할 수 있었다 (도 9).
이 작업은 카말 (Kamal) 등의 작업을 실체화시키고, 상당히 연장시켜 종양에서의 Hsp90이 다중-샤페론 복합체에 완전하게 존재하는 것으로 기술된 반면에 정상 조직으로부터의 Hsp90은 잠복성의 비복합체화된 상태로 존재한다는 원래의 모델의 더욱 세련된 이해를 제공한다 (Kamal et al., 2003). 본 발명자들은 Hsp90이 암 세포에서 생화학적으로 뚜렷한 복합체를 형성한다고 제안한다 (도 11a). 이러한 견해에서, 암 세포 Hsp90의 주된 분획은 정상 세포와 유사한 "하우스키핑" 샤페론 기능을 유지하는 반면에, 암 세포에서 풍부하거나 팽창된 기능적으로 별개의 Hsp90 풀은 종양 세포 생존을 유지시키는데 필요한 종양원성 단백질과 특이적으로 상호작용한다. 아마도 이 Hsp90 분획은 종양 세포 환경에서 팽창되고, 구성적으로 유지된 샤페론 복합체의 세포 스트래스 특이적 형태를 나타낸다. 본 발명자들의 데이터는 이것이 악성 표현형을 유지시키는데 필요한 기능을 수행할 수 있음을 시사한다. 이러한 역할의 하나는 돌연변이 (즉, mB-Raf) 또는 키메릭 단백질 (즉, Bcr-Abl)의 폴딩을 조절하는 것이다 (Zuehlke & Johnson, 2010; Workman et al, 2007). 본 발명자들은 이제 추가의 역할, 즉 이상 활성화된 시그날링 복합체에 포함되는 분자의 스캐폴딩 및 복합체 형성을 촉진시키는 역할에 대한 실험적 증거를 제시한다. 여기에서, 본 발명자들은 CML에서 구성적 STAT5 시그날링을 유지시키는데 있어서의 Hsp90의 이러한 역할을 기술한다 (도 8h). 이들 데이터는 본 발명자들이 Hsp90이 B 세포 림프종 세포에서 BCL6 종양원성 전사 억제인자에 의한 기능적 전사 억제를 유지시키는데 필요하였음을 나타낸 이전의 작업과 일치한다 (Cerchietti et al., 2009).
요약하면, 본 발명자들의 작업은 종양 연관된 Hsp90의 불균질성에 새로운 견해를 제공하고, 종양-특이적 생물학적 경로 및 단백질을 확인하기 위하여 특정의 Hsp90 억제제의 생화학적 특징을 이용하는 화학적 도구를 사용한다 (도 9). 본 발명자들은 여기에 기술된 기능적 프로테오믹스 방법이 별개의 종양에서 조절부전으로 되는 중요한 프로테옴 서브세트의 확인을 허용할 것으로 믿는다. 이것은 본 명세서에 기술된 STAT 기전에 의해서 예시되는 것으로서 새로운 암 기전의 확인, 본 명세서에 기술된 CARM1에 의해서 예시되는 것으로서 새로운 종양단백질의 확인, 및 Hsp90에 대해 상보적인 이상적으로 조합된 표적화된 치료법의 개발을 위한 치료학적 표적의 확인을 허용할 것이다.
재료 및 방법
세포주 및 일차 세포
CML 세포주 K562, 카수미 (Kasumi)-4, MEG-01 및 KU182, 삼중-음성 유방암 세포주 MDA-MB-468, HER2+ 유방암 세포주 SKBr3, 흑색종 세포주 SK-Mel-28, 전립선암 세포주 LNCaP 및 DU145, 췌장암 세포주 Mia-PaCa-2, 결장 섬유아세포, CCCD18Co 세포주를 American Type Culture Collection으로부터 수득하였다. CML 세포주 KCL-22는 Japanese Collection of Research Bioresources로부터 수득하였다. NIH-3T3 섬유아세포 세포는 이전에 기술된 바와 같이 형질감염시켰다 (An et al., 2000). 세포를 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 (MDA-MB-468, SKBr3 및 Mia-PaCa-2), RPMI (K562, SK-Mel-28, LNCaP, DU145 및 NIH-3T3) 또는 MEM (CCD18Co) 내에서 배양하였다. 카수미-4 세포는 20% FBS, 10 ng/㎖ 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 및 1×Pen/Strep으로 보충된 IMDM 내에서 유지시켰다. PBL (인간 말초혈액 백혈구) 및 제대혈은 New York Blood Center로부터 구입한 환자 혈액으로부터 수득하였다. 35 ㎖의 세포 현탁액을 15 ㎖의 피콜-플라크 플러스 (Ficoll-Paque plus; GE Healthcare) 상에 적층시켰다. 샘플을 4℃에서 40 분 동안 2,000 rpm으로 원심분리시키고, 백혈구 계면을 수집하였다. 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 내에 플레이팅하고, 지시된 바와 같이 사용하였다. 일차 인간 아세포발증 CML 및 AML 세포를 고지에 입각한 동의와 함께 수득하였다. 검체의 조작 및 분석은 University of Rochester, Weill Cornell Medical College 및 University of Pennsylvania Institutional Review Boards에 의해서 승인되었다. 단핵 세포는 피콜-플라크 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NY) 밀도 구배 분리를 사용하여 분리시켰다. 세포를 이스코브 (Iscove) 변형된 둘베코 배지 (IMDM), 40% 소 태아 혈청 (FBS), 및 10% 디메틸설폭사이드 (DMSO)로 구성된 동결 배지 내에서, 또는 크리오스토 (CryoStor™) CS-10 (Biolife) 내에서 저온보존하였다. 배양하는 경우에, 세포는 37℃에서 5% CO2의 가습 대기 중에서 유지시켰다.
화학적 및 면역-침강을 위한 세포 용해
세포는 이들을 1 ㎍/㎕의 프로테아제 억제제 (류펩틴 및 아프로티닌)를 첨가한 펠츠 완충액 (HEPES 20 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, NP40 0.01%, 신선하게 제조된 Na2MoO4 20mM, pH 7.2-7.3) 내에서 이들을 수집하고, 이어서 3 회의 연속적인 동결 (드라이 아이스 내에서) 및 해동 단계를 수행함으로써 용해시켰다. 총 단백질 농도는 제조자의 설명에 따라 BCA 키트 (Pierce)를 사용하여 결정하였다.
면역침강
Hsp90 항체 (H9010) 또는 정상 IgG (Santa Cruz Biotechnology)를 지시된 양의 세포 용해물에 40 ㎕의 단백질 G 아가로즈 비드 (Upstate)와 함께 10 ㎕의 용적으로 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 밤새 배양하였다. 비드를 펠츠 용해 완충액으로 5 회 세척하고, SDS-PAGE에 의해서 분리시키고, 이어서 표준 웨스턴 블럿팅 절차를 수행하였다.
화학적 침강
Hsp90 억제제 비드, 또는 아가로즈 비드에 컨주게이트된 Hsp90 불활성 화학물질 (에탄올아민)을 함유하는 대조 비드를 용해 완충액 중에서 3 회 세척하였다. 그 후, 다른 식으로 지시되지 않는 한, 비드 컨주게이트 (80 ㎕)를 4℃에서 지시된 양의 세포 용해물 (120-500 ㎍)과 함께 배양하고, 용적을 용해 완충액에 의해서 200 ㎕로 조정하였다. 배양한 후에, 비드 컨주게이트를 용해 완충액으로 5 회 세척하고, 풀-다운 내의 단백질을 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. 고갈시험을 위해서, 2-4 회 연속적인 화학적 침강을 수행하고, 이어서 지시된 경우에 면역침강을 수행하였다.
추가의 방법은 또한 본 명세서 173-183페이지에서 이하에 기술된다.
추가의 재료
표 5 범례
표 5. (a-d) PU-비드 풀-다운에서 분리되고, 추가의 재료 및 방법에 지시된 바와 같이 확인된 단백질의 리스트. (e) IP (Ingenuity Pathway)에서의 분석을 위해 사용된 지도작성된 단백질의 데이터세트. (f)IPA (Ingenuity Pathways Analysis) 소프트웨어의 사용에 의한 생물정보 경로 분석에 의해서 생성된 단백질 조절 네트워크. 표 5e에 열거된 단백질을 IPA에 의해서 분석하였다.
[표 5a] QSTAR-엘리트 하이브리드 4극자 비행시간 질량 분광계를 사용하여 정의된 추정의 Hsp90 상호작용 단백질 (QTof MS) (AB/MDS Sciex)
#GChiosis_K562 및 MiPaca2_모든 샘플 보고서는 08/05/2010에 작성됨
GChiosis_K562 및 MiPaca2_All
디스플레이: 지정된 스펙트럼의 숫자
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[표 5b] QSTAR-엘리트 하이브리드 4극자 비행시간 질량 분광계를 사용하여 정의된 추정의 Hsp90 상호작용 공-샤페론 (QT인 MS) (AB/MDS Sciex)
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*Grp94 및 Trap-1은 PU-H71이 직접적으로 결합하는 Hsp90 아형(isoform)이다.
[표 5c] QSTAR-엘리트 하이브리드 4극자 비행시간 질량 분광계를 사용하여 정의된 프로테아좀 경로에서 작용하는 추정의 Hsp90 상호작용 단백질 (GT인 MS) (AB/MDS Sciex)
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[표 5d] Waters Xevo QT인 MS를 사용하여 정의된 추정의 Hsp90 상호작용 단백질
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*회색으로 된 부분은 절단된 겔 사이즈가 보고된 MW와 부합하지 않는 단백질이다.
[표 5e] 투입 리스트로부터 Ingenuity Pathway에 의해 프로세싱하기 위해 선택된 기능, 경로 및 네트워크 분석 가능한 단백질
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[표 5f] K562 세포주에서 PU-U71에 의해 분리된 단백질에 Ingenuity Pathways 코어 분석에 의해 부여된 유의미한 네트워크 및 관련 생체기능
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*IPA는 입력된 단백질에 대한 네트워크의 피트(fit)에 따라 각각의 가능한 네트워크에 대한 점수를 컴퓨터에서 계산한다. 상기 점수는 p-값의 밑이 10인 음의 로그값(negative base-10 logarithm)으로서 계산되며, 이는 무작위의 경우로 인한, 주어진 네트워크에서 입력된 단백질이 함께 발견될 가능성을 나타낸다. 따라서, 2 또는 그 이상의 점수는 무작위의 경우만으로는 발생되지 않을 적어도 99%의 신뢰도를 갖는다.
추가의 재료 및 방법
시약
Hsp90 억제제, 고체-지지체 고정화 및 플루오레세인-표지된 유도체를 이전에 보고된 바와 같이 합성하였다 (Taldone et al., 2011, Synthesis and Evaluation of Small ...; Taldone et al., 2011, Synthesis and Evaluation of Fluorescent ...; He et al., 2006). 본 발명자들은 LC Laboratories로부터 글리벡 (Gleevec)을, Selleck으로부터 AS703026을, Tocris로부터 KN-93을, Sigma로부터 PP242, BMS-345541 및 나트륨 바나데이트를 구입하였다. 모든 화합물은 DMSO 저장물로 사용되었다.
웨스턴 블럿팅
세포를 PU-H71 또는 DMSO (비히클)로 24 시간 동안 처리하고, 류펩틴 (Sigma Aldrich) 및 아프로티닌 (Sigma Aldrich)이 보충된 50 mM 트리스, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 1% NP40 용해 완충액 중에서 용해시켰다. 단백질 농도는 제조자의 설명에 따라 BCA 키트 (Pierce)를 사용하여 결정하였다. 단백질 용해물 (15-200 ㎍)을 SDS/PAGE에 의해서 전기영동적으로 분해시키고, 니트로셀룰로즈 막으로 옮기고, 다음에 대한 일차 항체로 프로브화하였다: Hsp90 (1:2000, SMC-107A/B; StressMarq), Bcr-Abl (1:75, 554148; BD Pharmingen), PI3K (1:1000, 06-195; Upstate), mTOR (1:200, Sc-1549; Santa Cruz), p-mTOR (1:1000, 2971; Cell Signaling), STAT3 (1:1000, 9132; Cell Signaling), p-STAT3 (1:2000, 9145; Cell Signaling), STAT5 (1:500, Sc-835; Santa Cruz), p-STAT5 (1:1000, 9351; Cell Signaling), RICTOR (1:2000, NB100-611; Novus Biologicals), RAPTOR (1:1000, 2280; Cell Signaling), P90RSK (1:1000, 9347; Cell Signaling), Raf-1 (1:300, Sc-133; Santa Cruz), CARM1 (1:1000, 09-818; Millipore), CRKL (1:200, Sc-319; Santa Cruz), GRB2 (1:1000, 3972; Cell Signaling), FAK (1:1000, Sc-1688; Santa Cruz), BTK (1:1000, 3533; Cell Signaling), A-Raf (1:1000, 4432; Cell Signaling), PRKD2 (1:200, sc-100415, Santa Cruz), HCK (1:500, 06-833; Milipore), p-HCK (1:500, ab52203; Abcam) 및 β-액틴 (1:2000, A1978; Sigma). 그 후, 막을 상응하는 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨주게이트된 이차 항체의 1:3000 희석액과 함께 배양하였다. 검출은 제조자의 설명에 따라 ECL-증진된 화학발광 검출 시스템 (Amersham Biosciences)을 사용하여 수행되었다.
밀도측정법
겔을 아도브 포토샵 (Adobe Photoshop) 7.0.1에서 스캔닝하고. 정량적 밀도측정 분석은 Un-Scan-It 5.1 소프트웨어 (Silk Scientific)를 사용하여 수행되었다.
나노-LC-MS/MS
상기 언급된 바와 같이 제조된 용해물을 우선 4℃에서 밤새 대조 비드와 함께 배양함으로써 전-세정하였다. 200 ㎕ 펠츠 용해 완충액 중의 전-세정된 K562 세포 추출물 (1,000 ㎍)을 PU-H71 또는 대조-비드 (80 ㎕)와 함께 4℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 비드를 용해 완충액으로 세척하고, 단백질을 2% SDS 중에서 비등시킴으로써 용출시키고, 변성 겔 상에서 분리시키고,제조자의 절차 (Biorad)에 따라 쿠마시 염색하였다. 풀-다운으로부터 겔-분해된 단백질을 기술된 바와 같이 (Winkler et al., 2002) 트립신으로 소화시켰다. 겔 내의 트립신 소화물을 2 ㎕ 베드-용적의 포로스 (Poros) 50 R2 (Applied Biosystems - 'AB') 역상 비드 상에서 마이크로-클린업 (micro-clean-up) 절차 (Erdjument-Bromage et al., 1998)에 적용하고, 에펜도르프 (Eppendorf) 겔-부하 팁 내에 충진시키고, 용출액을 0.1% 포름산 (FA)으로 희석하였다. 배치 정제된 풀의 분석은 나노 스프레이 이온 공급원이 장치된 QSTAR-엘리트 하이브리드 4극자 비행시간 질량 분광계 (QSTAR-Elite hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometer; QT of MS) (AB/MDS Sciex)를 사용하여 수행되었다. 펩타이드 혼합물 (20 ㎕ 중의)을 20 ㎕/분의 유속으로 엑시젠트 (Eksigent) 나노 MDCL 시스템 (Eksigent Technologies, Inc)을 사용하여 트랩핑 가드 칼럼 (trapping guard column) (0.3x5-㎜ PepMap C18 100 카트리지; LC Packings) 상에 부하시켰다. 세척한 후에, 유동을 가드 칼럼을 통해서 반전시키고, 펩타이드를 75-미크론 x 15-㎝ 융합된 실리카 모세관 PepMap C18 칼럼 (LC Packings) 상에서 200 nL/분의 유속으로 85 분에 걸쳐서 5-45% MeCN 구배 (0.1% FA 중의)로 용출시키고; 용출액을 75-미크론 (10-미크론 오리피스를 가짐) 융합된 실리카 나노-전기스프레이 니들 (nano-electrospray needle) (New Objective)로 유도한다. 전기스프레이 이온화 (ESI) 니들 전압은 약 1800 V로 설정하였다. 질량 분광계는 역치를 단편화 스캔을 위해서 선택된 이중 또는 삼중으로 하전된 전구체 이온의 초당 10 카운트로 설정하여 자동, 데이터-의존적 MS/MS 획득 모드로 작동시킨다. 0.25 초의 조사 스캔 (survey scans)을 400 amu로부터 1800 amu까지 기록하고; 그 후, 3 개까지의 MS/MS 스캔을 100 내지 1800 amu를 기록한 선택된 전구체 이온에 대해 순차적으로 수집하였다. 충돌 에너지를 MS/MS를 위해서 선택된 전구체 이온의 m/z 값에 따라 자동으로 조정한다. 선택된 전구체 이온은 상응하는 단편화 작동주기 (fragmentation duty cycle)의 종료 후에 60 초 동안의 반복된 선택으로부터 배재된다. LC-MS/MS 데이터로부터 초기 단백질 확인은 매스코트 탐색 엔진 (Matrix Science, version 2.2.04; www.matrixscience.com) 및 NCBI (National Library of Medicine, NIH - human taxonomy, 223,695 단백질 서열을 함유) 및 IPI (International Protein Index, EBI, Hinxton, UK - human taxonomy, 83,947 단백질 서열을 함유) 데이터베이스를 사용하여 수행하였다. 한 개의 누락된 트립신 분해 부위가 허용되었으며, 전구체 이온 질량 허용한도는 0.4 Da 단편 이온 질량 허용 = 0.4 Da이고, 단백질 변형은 Met-옥사이드, Cys-아크릴아미드 및 N-말단 아세틸화에 대해서 허용되었다. MudPit 점수 측정은 전형적으로, 유의성 역치 점수 p<0.05를 사용하여 활성화된 'require bold red'에 의해서 적용되었다. 모든 확인된 단백질에 대한 독특한 펩타이드 카운트 (또는 '스펙트럼 카운트') 및 서열 커버리지 (sequence coverages) 퍼센트는 추가의 생물정보 분석을 위해서 스캐폴드 프로테옴 소프트웨어 (Scaffold Proteome Software; version 2_06_01, www.proteomesoftware.com)에 익스포트하였다 (표 5a). 매스코트로부터의 출력을 사용하여, 스캐폴드는 질량 분광분석 데이터를 입증하고, 체계화하며, 해석하여 대량의 데이터를 관리하고, 샘플을 비교하며 단백질 변형을 탐색하는 것을 더 쉽게 하도록 한다. 결과는 제2의 MS 시스템, Waters Xevo QT인 MS 장치에서 입증되었다 (표 5d). 잠재적인 비특이적 상호작용 인자가 확인되었으며, 지시된 바와 같이 추가의 분석으로부터 제거되었다 (Trinkle-Mulcahy et al., 2008).
생물정보 경로 분석
단백질을 생물정보 경로 분석 (Ingenuity Pathway Analysis 8.7 [IPA]; Ingenuity Systems, Mountain View, CA, www.ingenuity.com) (Munday et al., 2010; Andersen et al., 2010)에 의해서 더 분석하였다. IPA는 규칙적으로 업데이트된 "Ingenuity Pathways Knowledge Base"를 기초로 하여 가상적인 단백질 상호작용 클러스터를 구성한다. Ingenuity Pathways Knowledge Base는 생물학적 문헌으로부터 골라서 모은 단백질들 사이의 개별적인 수백만의 관계들로 구성된 매우 큰 큐레이트된 데이터베이스이다. 이들 관계는 물리적 결합 상호작용, 효소 기질 관계, 및 해독 조절에서의 시스-트랜스 관계를 포함하는 직접적인 단백질 상호작용을 포함한다. 네트워크는 노드 (개별적인 단백질) 및 가장자리 (노드 사이의 생물학적 관계)로서 그래프적으로 표시된다. 두 개의 분자를 연결하는 선은 관계를 나타낸다. 따라서, 결합하거나, 서로에 대해 작용하거나, 어떤 다른 방식으로 서로와 연관되는 어떤 두 개의 분자는 이들 사이에 관계를 갖는 것으로 생각될 수 있다. 분자들 사이의 각각의 관계는 Ingenuity Knowledge Base에 함유된 과학적 정보를 사용하여 창출된다. 관계는 분자들 사이에서 선 또는 화살표로 나타낸다. 분자 A로부터 B로의 화살표는 분자 A가 B에 작용함을 나타낼 수 있도록 화살표는 관계의 방향성을 나타낸다. 직접적인 상호작용은 네트워크 다이아그램에서 직선으로 나타내는 반면에, 간접적인 상호작용은 점선으로 나타낸다. 일부의 경우에, 관계는 하나의 분자로부터 나와서 동일한 그 분자를 다시 지적하는 원형 화살표 또는 선으로 존재할 수도 있다. 이러한 관계는 "자기-지시적"이라 칭하며, 그 자체에 작용하는 분자의 능력으로부터 유래한다. 실제로, 차등적으로 발현된 단백질의 UniProtKB 식별자를 함유하는 데이터세트를 IPA에 업로드한다. 그 후, IPA는 이들 단백질, 및 단백질 클러스터를 채우는데 필요한 데이터베이스로부터의 다른 단백질로부터 가상적인 네트워크를 구성한다. 네트워크 생성은 입력된 발현 프로필로부터 가능한 한 다수의 단백질을 포함시키도록 최적화되며, 고도로 연결된 네트워크를 목표로 한다. 단백질은 본체가 복합체의 일부분인 경우에는 두 개의 원으로 네트워크에 도시되며; 단지 하나의 유니트가 존재하는 경우에는 단일 원으로 도시되고; 위 또는 아래를 향하는 삼각형은 각각 포스파타제 또는 키나제를 기술하기 위한 것이고; 수평 타원체는 전사 인자를 기술하며; 원은 "다른" 기능을 도시하는 것이다. IPA는 그 네트워크가 입력된 단백질에 적합한지에 따라 각각의 가능한 네트워크의 점수를 계산한다. 점수는 소정의 네트워크에서 입력된 단백질이 무작위 기회로 인하여 함께 발견될 가능성을 나타내는 p-값의 음성 염기-10 로그로 계산된다. 따라서, 2 또는 그 이상의 점수는 무작위 기회 단독에 의해서 생성되는 것이 아닌 적어도 99% 신뢰도를 갖는다. 여기에 제시된 모든 네트워크는 10 또는 그 이상의 점수로 배정되었다 (표 5f).
방사성동위원소 결합 시험 및 Hsp90 정량화 시험
포화 시험은 131I-PU-H71 및 세포 (K562, MDA-MB-468, SKBr3, LNCaP, DU-145, MRC-5 및 PBL)을 사용하여 수행되었다. 간단하게, 세포의 삼중 샘플을 1 μM의 비표지된 PU-H71이 있거나 없이 증가량의 131I-PU-H71과 혼합시켰다. 용액을 궤도 진탕기 (orbital shaker)에서 진탕하고, 1 시간 후에 세포를 분리하고, 브랜들 세포 수확기 (Brandel cell harvester)를 사용하여 빙냉 트리스-완충 식염수로 세척하였다. 분리된 세포 샘플 모두를 계수하고, 131I-PU-H71의 특이적 흡수를 측정하였다. 이들 데이터를 131I-PU-H71의 농도에 대해서 플롯팅하여 포화 결합 곡선을 제공하였다. PU-결합된 Hsp90을 정량하기 위해서, 9.2x107 K562 세포, 6.55x107 KCL-22 세포, 2.55x107 KU182 세포 및 7.8x107 MEG-01 세포를 용해시켜 각각 6382, 3225, 1349 및 3414 ㎍의 총 단백질을 제공하였다. Hsp90의 백분율을 계산하기 위해서, 세포 Hsp90 발현을 HeLa 세포 (Stressgen#ADI-SPP-770)로부터 정제된 재조합체 Hsp90의 창출된 표준 곡선을 사용하여 정량화하였다 .
펄스-추적
K562 세포를 지시된 바와 같이 PU-H71 (5 μM)이 있거나 없이 Na3VO4 (1 mM)로 처리하였다. 세포를 지시된 시간에 수집하고, 50 mM 트리스 pH 7.4, 150 mM NaCl 및 1% NP-40 용해 완충액 중에서 용해시킨 다음에, 웨스턴 블럿팅 절차에 적용하였다.
트립신 소화
K562 세포를 30 분 동안 비히클 또는 PU-H71 (50 μM)로 처리하였다. 세포를 수집하고, 50 mM 트리스 pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40 용해 완충액에 용해시켰다. STAT5 단백질을 항-STAT5 항체 (Santa Cruz, sc-835)를 사용하여 500 ㎍의 총 단백질 용해물로부터 면역침강시켰다. 단백질 G 아가로즈 비드에 결합된 단백질 침강물을 트립신 완충액 (50 mM 트리스 pH 8.0, 20 mM CaCl2)으로 세척하고, 33 ng의 트립신을 각각의 샘플에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 배양하고, 분취액을 지시된 시점에 수집하였다. 단백질 분취액을 SDS-PAGE에 적용하고, STAT5에 대해서 블럿팅하였다.
활성화된 STAT5 DNA 결합 시험
STAT5a 및 STAT5b의 DNA-결합능은 제조자의 설명에 따라 ELISA-기본 시험 (TransAM, Active Motif, Carlsbad, CA)에 의해서 시험하였다. 간단하게, 5x106 K562 세포를 1 및 10 mM의 PU-H71 또는 대조군으로 24 시간 동안 처리하였다. 10 ㎍의 세포 용해물을 전-흡착된 STAT 공통 올리고뉴클레오타이드 (5'-TTCCCGGAA-3')를 함유하는 웰에 첨가하였다. 대조군 처리된 세포의 경우에, 시험은 야생형 또는 돌연변이된 STAT 공통 결합 부위를 함유하는 20 pmol의 경쟁자 올리고뉴클레오타이드의 부재 또는 존재 하에서 수행하였다. 인터페론-처리된 HeLa 세포 (5 ㎍/웰)가 시험을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. 배양 및 세척한 후에, 토끼 폴리클로날 항-STAT5a 또는 항-STAT5b 항체 (1:1000, Active Motif)를 각각의 웰에 첨가하고, 이어서 HPR-항-토끼 이차 항체 (1:1000, Active Motif)를 첨가하였다. HRP 기질 첨가 후에, 흡광도를 665 ㎚의 기준 파장으로 450 ㎚에서 판독하였다 (Synergy4, Biotek, Winooski, VT). 본 시험에서, 흡광도는 샘플 내에 존재하는 DNA-결합된 전사 인자의 양에 정비례한다. 실험은 4 회 반복하여 수행하였다. 결과는 평균 흡광도 값과 SEM으로부터 AU (arbitrary units)로서 표현되었다.
정량적 크로마틴 면역침강 (Q- ChIP )
Q-ChIP은 변형시켜 전술한 바와 같이 만들었다 (Cerchietti et al., 2009). 간단하게, 108 K562 세포를 1% 포름알데히드로 고정시키고, 용해시키고, 초음파처리하였다 (Branson sonicator, Branson). STAT5 N20 (Santa Cruz) 및 Hsp90 (Zymed) 항체를 전-세정된 샘플에 첨가하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 단백질-A 또는 G 비드를 첨가하고, 샘플을 비드로부터 용출시키고, 이어서 탈-교차결합시켰다. DNA는 PCR 정제 칼럼 (Qiagen)을 사용하여 정제하였다. ChIP 생성물의 정량화는 패스트 SYBR 그린 (Fast SYBR Green; Applied Biosystems)을 사용한 정량적 PCR (Applied Biosy, 7900HT)에 의해서 수행되었다. STAT 결합 부위를 함유하는 표적 유전자는 다음의 프라이머로 검출하였다: CCND2 (5-GTTGTTCTGGTCCCTTTAATCG 및 5-ACCTCGCATACCCAGAGA), MYC (5-ATGCGTTGCTGGGTTATTTT 및 5-CAGAGCGTGGGATGTTAGTG), 및 유전저간 조절 지역의 경우에는 (5-CCACCTGAGTCTGCAATGAG 및 5-CAGTCTCCAGCCTTTGTTCC).
실시간 QPCR
RNA는 제조자의 설명에 따라 RN이지 플러스 키트 (RNeasy Plus kit; Qiagen)를 사용하여 PU-H71-처리 및 대조 K562 세포로부터 추출하였다. cDNA는 고성능 (High Capacity) RNA-to-cDNA 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 합성하였다. 본 발명자들은 다음의 프라이머를 사용하여 특정 유전자를 증폭시켰다: MYC (5-AGAAGAGCATCTTCCGCATC 및 5-CCTTTAAACAGTGCCCAAGC), CCND2 (5-TGAGCTGCTGGCTAAGATCA 및 5-ACGGTACTGCTGCAGGCTAT), BCL-XL (5- CTTTTGTGGAACTCTATGGGAACA 및 5-CAGCGGTTGAAGCGTTCCT), MCL1 (5-AGACCTTACGACGGGTTGG 및 5-ACATTCCTGATGCCACCTTC), CCND1 (5-CCTGTCCTACTACCGCCTCA 및 5-GGCTTCGATCTGCTCCTG), HPRT (5-CGTCTTGCTCGAGATGTGATG 및 5-GCACACAGAGGGCTACAATGTG), GAPDH (5-CGACCACTTTGTCAAGCTCA 및 5-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT), RPL13A (5-TGAGTGAAAGGGAGCCAGAAG 및 5-CAGATGCCCCACTCACAAGA). 전사물 풍부성은 패스트 SYBR 그린 조건 (95℃에서 20 초의 초기 조건에 이어서 95℃에서 1 초 및 60℃에서 20 초의 40 주기). 하우스키핑 유전자 (RPL13A)의 CT 값을 관심이 있는 상응하는 유전자로부터 뺐다 (ΔCT). 차이의 표준 편차는 CT 값의 표준 편차로부터 계산하였다 (반복 실험). 그 후, PU-H71-처리된 세포의 ΔCT 값을 ΔΔCT 방법을 사용하여 그들 각각의 대조-처리된 세포에 대비하여 표현하였다. 대조 처리된 세포에 대비하여 약물로 처리된 세포에서 각각의 유전자에 대한 폴드 표현은 표현 2- ΔΔCT에 의해서 결정된다. 결과는 반복 실험에 대한 평균의 표준 오차를 갖는 폴드 표현으로 나타내었다.
Hsp70 녹-다운
형질감염은 제조자의 설명에 따라 전기천공 (Amaxa) 및 Nucleofector Solution V (Amaxa)에 의해서 수행되었다. Hsp70 녹다운 시험은 Hsp70의 개방 판독 프레임 (HSPA1A; accession number NM_005345)에 대하여 이전에 보고된 바와 같이 (Powers et al., 2008) 디자인된 siRNAs를 사용하여 수행되었다. 음성 대조 세포는 반전된 대조 siRNA 서열 (Hsp70C; Dharmacon RNA technologies)로 형질감염시켰다. 시험을 위해서 사용된 Hsp70에 대한 활성 서열은 Hsp70A (5'-GGACGAGUUUGAGCACAAG-3') 및 Hsp70B (5'-CCAAGCAGACGCAGAUCUU-3')이다. 대조군을 위한 서열은 Hsp70C (5'-GGACGAGUUGUAGCACAAG-3')이다. 2 ㎖ 배지 (1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI) 내의 300만 개의 세포를 제조자의 설명에 따라 0.5 μM siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 6-웰 플레이트에서 유지시키고, 48 시간째에 용해시키고, 이어서 표준 웨스턴 블럿 절차를 수행하였다.
키나제 스크린 (Fabian et al., 2005)
대부분의 시험을 위해서, 키나제-태깅된 T7 파지 스트레인을 BL21 스트레인으로부터 유도된 이. 콜라이 숙주 내의 24-웰 블럭에서 병행하여 성장시켰다. 이. 콜라이를 로그-상으로 성장시키고, 동결된 저장물 (감염의 다중도 = 0.4)로부터의 T7 파지에 의해서 감염시키고, 용해 시까지 (90-150 분) 32℃에서 진탕하면서 배양하였다. 용해물을 원심분리 (6,000 x g)하고, 여과 (0.2 ㎛)하여 세포 파괴물을 제거하였다. 나머지 키나제는 HEK-293 세포에서 생산하고, 이어서 qPCR 검출을 위해 DNA로 태깅하였다. 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 실온에서 30 분 동안 비오티닐화된 소분자 리간드로 처리하여 키나제 시험을 위한 친화성 수지를 생성시켰다. 리간드 비드를 과량의 비오틴으로 차단하고, 차단 완충액 (시블럭 (SeaBlock; Pierce), 1% BSA, 0.05% 트윈 20, 1 mM DTT)으로 세척하여 비결합된 리간드를 제거하고, 비-특이적 파지 결합을 감소시켰다. 결합 반응은 1x 결합 완충액 (20% 시블럭, 0.17x PBS, 0.05% 트윈 20, 6 mM DTT) 중에서 키나제, 리간드화된 친화성 비드, 및 시험 화합물을 조합함으로써 조립하였다. 시험 화합물은 100% DMSO 중의 40x 저장액으로 제조하고, 시험에서 직접 희석하였다. 모든 반응은 0.04 ㎖의 최종 용적으로 폴리프로필렌 384-웰 플레이트에서 수행되었다. 시험 플레이트를 실온에서 진탕하면서 1 시간 동안 배양하고, 친화성 비드를 세척 완충액 (1x PBS, 0.05% 트윈 20)으로 세척하였다. 그 후, 비드를 용출 완충액 (1x PBS, 0.05% 트윈 20, 0.5 ㎛ 비-비오티닐화된 친화성 리간드)에 재-현탁시키고, 실온에서 진탕하면서 30 분 동안 배양하였다. 용출액 내의 키나제 농도는 qPCR에 의해서 측정되었다. KINOMEscan의 선택성 점수 (S)는 화합물 선택성의 정량적 척도이다. 이것은 화합물에 결합한 키나제의 수를 돌연변이 변이체를 제외한 시험한 별개의 키나제의 총수로 나누어 줌으로써 계산된다. TREEspot™는 KINOMEscan (Fabian et al., 2005)에 의해서 개발된 자산 데이터 (proprietary data) 가시화 소프트웨어 도구이다. 결합하는 것으로 확인된 키나제는 적색 원으로 표시되며, 여기에서 더 큰 원은 더 고-친화성의 결합을 나타낸다. 키나제 댄드로그램 (dendrogram)은 Science and Cell Signaling Technology, Inc.로부터의 허락을 받아서 조정하여 재현시켰다.
렌티바이러스 벡터, 렌티바이러스 생산 및 K562 세포 변환
CARM1의 shRNA 녹다운의 렌티바이러스 구조물은 Openbiosystem의 TRC 렌티바이러스 shRNA 라이브러리로부터 구입하였다: pLKO.1-shCARM1-KD1 (카탈로그 No: RHS3979-9576107) 및 pLKO.1-shCARM1-KD2 (카탈로그 No: RHS3979-9576108). 대조 shRNA (shRNA 스크램블)는 애드젠 (Addgene) 플라스미드 1864였다. GFP를 클로닝하여 선택 마커로서 퓨로마이신을 대체시켰다. 렌티바이러스는 이전에 기술된 프로토콜 (Moffat et al., 2006)에서와 같이 293T의 일시적 형질감염에 의해서 생산되었다. 바이러스 상등액을 수집하고, 0.45-㎛ 필터를 통해서 여과하고, 농축시켰다. K562 세포를 8 ㎍/㎖ 폴리브렌 (Aldrich)의 존재 하에서 고-역가 렌티바이러스 농축된 현탁액으로 감염시켰다. 변환된 K562 세포를 72 시간 형질감염 후에 녹색 형광 단백질(GFP)에 대해서 분류되었다.
RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR ( qRT - PCR )
qRT-PCR을 위해서, 총 RNA를 RN이지 미니 키트 (QIAGEN, Germany)를 사용하여 106 세포로부터 분리시킨 다음에, 무작위 헥사머 (SuperScript III 키트, Invitrogen)를 사용하는 역-전사에 적용하였다. 실시간 PCR 반응은 ABI 7500 서열 검출 시스템을 사용하여 수행되었다. PCR 생성물은 Sybr 그린 I 화학 또는 태크맨 (TaqMan) 방법 (PE Applied Biosystems, Norwalk, CT)을 사용하여 검출하였다. 실시간 PCR 시험에 대한 상세한 내용은 다른 곳에 기술되었다 (Zhao et al., 2009). CARM1 qPCR을 위한 프라이머 서열은 TGATGGCCAAGTCTGTCAAG (정방향) 및 TGAAAGCAACGTCAAACCAG (역방향)이다.
세포 생존도, 세포사멸, 및 증식 시험
CARM1 shRNA 또는 스크램블로 형질감염되거나 비형질감염된 K562 세포에서의 생존도 평가는 트립판 블루 (Trypan Blue)를 사용하여 수행되었다. 이 발색단은 음으로 하전되고, 막이 손상되지 않는 한은 세포와 상호작용하지 않는다. 따라서, 염료를 배제하는 모든 세포는 생존가능하다. 세포사멸 분석은 2 ㎕의 아크리딘 오렌지 (100 ㎍/㎖), 2 ㎕의 에티듐 브로마이드 (100 ㎍/㎖), 및 20 ㎕의 세포 현탁액을 혼합시킴으로써 형광 현미경 검사를 사용하여 평가하였다. 최소 200 개의 세포를 적어도 5 개의 무작위 영역에서 계수하였다. 살아 있는 세포사멸성 세포를 구분되는 핵 및 세포질 형광을 기초로 하여 세포 형태학에서의 변화를 검사함으로써 죽은 세포사멸성, 괴사성 및 정상 세포로부터 구별하였다. 생존가능한 세포는 온전한 원형질 막 (녹색 색상)을 표시하는 반면에, 죽은 세포는 손상된 원형질 막 (오렌지 색상)을 표시한다. 수축, 헤테로크로마틴 축합, 및 핵 탈과립화를 포함한 초미세구조 변화의 출현은 세포사멸, 및 괴사가 있는 붕괴된 세포질 막과 더 일치한다. 세포사멸성 세포의 백분율 (세포사멸 지수)은 다음과 같이 계산하였다: 세포사멸성 세포 % = (세포사멸성 핵을 갖는 세포의 총수/계수된 세포의 총수) x 100. 증식 시험을 위해서는, 5 x 103 K562 세포를 96-웰 고형 블랙 플레이트 (Corning) 상에 플레이팅하였다. 시험은 제조자의 설명에 따라 수행되었다 (셀타이터-글로 (CellTiter-Glo) 발광 세포 생존도 시험, Promega). 모든 실험은 3 회 반복하였다. 지시된 경우에, 성장 억제시험은 알라마르 블루 (Alamar blue) 시험을 사용하여 수행되었다. 이 시약은 세포 배양물에서 세포 생존도의 빠른 객관적 척도를 제공하며, 이것은 세포 생존도의 지표인 세포의 대사능을 측정하기 위해서 지표 염료 레사주린 (resazurin)을 사용한다. 간단하게, 기하급수적으로 성장하는 세포를 미량역가 플레이트 (microtiter plates) (Corning # 3603)에 플레이팅하고, 지시된 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 약물을 지시된 농도로 삼중으로 첨가하고, 플레이트를 72 시간 동안 배양하였다. 레사주린 (55 μM)을 첨가하고, 플레이트를 6 시간 후에 아날리스트 (Analyst) GT (형광 강도 모드, 여기 530 ㎚, 방출 580 ㎚, 560 ㎚ 이색성 거울 (dichroic mirror)). 결과는 소프트맥스 프로 (Softmax Pro) 및 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 세포 성장 억제 백분율은 처리된 세포 대비 대조 세포로부터 수득된 형광 판독치를 비교함으로써 계산하였다. IC50은 세포 성장을 50%만큼 억제하는 약물 농도로 계산하였다.
mTOR과 Hsp90 억제제 사이의 상승작용의 정량적 분석
pp242 (mTOR 억제제) 및 PU-H71 (Hsp90 억제제) 사이의 약물 상호작용을 결정하기 위해서, 차우-탈라레이의 병용지수 (CI) 아이소볼로그램 방법을 이전에 기술된 바와 같이 사용하였다 (Chou, 2006; Chou & Talalay, 1984). 질량 작용의 법칙의 중앙-효과 원리를 기초로 하는 이 방법은 컴퓨터화된 시뮬레이션에 의해서 각각의 약물의 기전과는 무관하게 두 개 또는 그 이상의 약물 조합에 대한 상승작용 또는 길항작용을 정량한다. 알고리즘을 기초로 하여, 컴퓨터 소프트웨어는 중앙-효과 플롯, 병용지수 플롯 및 표준화된 아이소볼로그램을 표시한다 (여기에서는 2 개의 약물의 비 정수비 조합이 사용된다).　 PU-H71 (0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.0125 μM) 및 pp242 (0.5, 0.125, 0.03125, 0.0008, 0.002, 0.001 μM)를 언급된 농도의 단일 작용제로 사용하거나, 비-정수비 (PU-H71:pp242; 1:1, 1:2, 1:4, 1:7.8, 1:15.6, 1:12.5)로 조합하였다. Fa (사멸 세포 분율)는 수학식 Fa=1-Fu를 사용하여 계산하였으며; Fu는 영향을 받지 않은 세포의 분율이고, 컴퓨터 소프트웨어 (CompuSyn, Paramus,New Jersey, USA)를 사용한 용량 효과 분석을 위해서 사용하였다.
유동 세포분석
CD34 분리 - CD34+ 세포 분리는 제조자의 설명에 따라 CD34 마이크로비드 키트 (MicroBead Kit) 및 자동화된 자기 세포 분류기 오토MACS (autoMACS)를 사용하여 수행되었다 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). 생존도 시험 - CML 세포주를 48-웰 플레이트에 5×105 세포/㎖의 밀도로 플레이팅하고, 지시된 용량의 PU-H71로 처리하였다. 세포를 매 24 시간마다 수집하고, 아넥신 (Annexin) V 완충액 (10 mM HEPES/NaOH, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl2) 중의 아넥신 V-V450 (BD Biosciences) 및 7-AAD (Invitrogen)로 염색하였다. 세포 생존도는 유동 세포분석 (BD Biosciences)에 의해서 분석하였다. 환자 샘플의 경우에는, 일차 CML 세포를 48-웰 플레이트에 2×106 세포/㎖로 플레이팅하고, 지시된 용량의 PU-H71로 96 시간까지 동안 처리하였다. 세포를 아넥신 V/7-AAD 염색 전에 FACS 완충액 (PBS, 0.05% FBS) 중의 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체 (BD Biosciences)로 4℃에서 30 분 동안 염색하였다. PU-H71 결합 시험 - CML 세포주를 48-웰 플레이트에 5×105 세포/㎖의 밀도로 플레이팅하고, 1 μM PU-H71-FITC로 처리하였다. 처리-후 4 시간째에, 세포를 FACS 완충액으로 2 회 세척하였다. 살아 있는 세포에서 PU-H71-FITC 결합을 측정하기 위해서, 세포를 FACS 완충액 중의 7-AAD로 실온에서 10 분 동안 염색하고, 유동 세포분석 (BD Biosciences)에 의해서 분석하였다. 대신으로, 세포를 고정화 완충액 (BD Biosciences)으로 4℃에서 30 분 동안 고정시키고, 얼음 상에서 30 분 동안 펌 완충액 (Perm Buffer) III (BD Biosciences) 중에서 투과화시킨 다음에, 유동 세포분석에 의해서 분석하였다. PU-H71-FITC 처리 후 96 시간째에, 세포를 아넥신 V 완충액 중의 아넥신 V-V450 (BD Biosciences) 및 7-AAD로 염색하고, 유동 세포분석에 적용하여 생존도를 측정하였다. 백혈병 환자 샘플에 대한 PU-H71-FITC의 결합을 평가하기 위해서, 일차 CML 세포를 48-웰 플레이트에 2×106 세포/㎖로 플레이팅하고, 1 μM PU-H71-FITC로 처리하였다. 처리 후 24 시간째에, 세포를 2 회 세척하고, 7-AAD 염색 전에 FACS 완충액 중의 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체로 4℃에서 30 분 동안 염색하였다. 처리 후 96 시간째에, 세포를 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체로 염색하고, 이어서 아넥신 V-V450 및 7-AAD 염색하여 세포 생존도를 측정하였다. 경쟁 시험을 위해서, 5×105 세포/㎖ 밀도의 CML 세포주 또는 2×106 세포/㎖ 밀도의 일차 CML 샘플을 4 시간 동안 1 μM 비컨주게이트된 PU-H71로 처리하고, 이어서 1 μM PU-H71-FITC로 1 시간 동안 처리하였다. 세포를 수집하고, 2 회 세척하고, FACS 완충액 중에서 7-AAD에 대해서 염색하고, 유동 세포분석에 의해서 분석하였다. Hsp90 염색 - 세포를 고정화 완충액 (BD Biosciences)으로 4℃에서 30 분 동안 고정시키고, 얼음 상의 펌 완충액 III (BD Biosciences) 중에서 30 분 동안 투과화시켰다. 세포를 항-Hsp90 피코에리트린 컨주게이트 (PE) (F-8 클론, Santa Cruz Biotechnologies; CA)로 60 분 동안 염색하였다. 세포를 세척한 다음에, 유동 세포분석에 의해서 분석하였다. 정상 마우스 IgG2a-PE가 이소타입 대조군으로 사용되었다.
통계학적 분석
다른 식으로 지시되지 않는 한, 데이터는 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) (version 4; GraphPad Software)에서 수행된 것으로서 언페어드 2-테일드 t 시험 (unpaired 2-tailed t tests)에 의해서 분석하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의적인 것으로 생각되었다. 다른 식으로 나타내지 않는 한, 데이터는 이중 또는 삼중 반복 실험의 평균±SD 또는 평균±SEM으로 표시된다. 오차 바 (error bars)는 평균의 SD 또는 SEM을 나타낸다. 단일 패널이 제시된다면, 데이터는 2 또는 3 회의 개별적인 실험의 대표적인 것이다.
Hsp90에 의한 B 세포 수용체 경로 및 COP9 시그날로좀의 유지는 미만성(diffuse) 거대 B 세포 림프종에서 새로운 치료학적 표적을 나타낸다
실험적 개요
열 충격 단백질 90 (Hsp90)은 풍부한 분자 샤페론이며, 그의 기질 단백질은 세포 생존, 증식 및 혈관형성에 포함된다. Hsp90은 구성적으로 발현되며, 또한 열 충격과 같은 세포 스트레스에 의해서 유도될 수 있다. 이것은 악성 표현형을 유지시키는데 필요한 샤페론 기질 단백질일 수 있기 때문에, Hsp90은 암에서 매력적인 치료학적 표적이다. 실제로, Hsp90의 억제는 다수의 그의 기질 단백질의 분해를 야기한다. Hsp90의 억제제인 PUH71은 종양단백질을 샤페론화하는데 포함된 종양원성 Hsp90 복합체를 억제하며, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCLs)에 대한 강력한 항-종양 활성을 갖는다. PUH71을 고체 지지체 상에 고정화시킴으로써, Hsp90 복합체는 침강되고, Hsp90의 기질 종양단백질을 확인하기 위하여 분석되어 공지 및 신규의 치료학적 표적을 나타낼 수 있다. 이 방법을 사용한 예비 데이터는 DLBCL 내의 Hsp90의 기질 단백질로서 B 세포 수용체 (BCR) 경로의 다수의 성분을 확인하였다. BCR 경로 활성화는 림프종형성 및 DLBCLs의 생존에 연루되었다. 이외에도, COP9 시그날로좀 (CSN)의 다수의 성분이 DLBCL 내의 Hsp90의 기질로서 확인되었다. CSN은 종양형성, 및 DLBCL의 생존 기전인 NF-κB의 활성화에 연루되었다. 이들 발견을 기초로 하여, 본 발명자들은 Hsp90 및 BCR 경로 성분 및/또는 CSN의 조합된 억제는 DLBCL을 사멸시키는데 있어서 상승적으로 작용할 것으로 가설을 세웠다. 따라서, 본 발명자들의 특정한 목적은 다음과 같다:
특정의 목적 1: Hsp90 및 BCR 경로의 동시 변조가 시험관내 및 생체내에서 DLBCL을 사멸시키는데 협조하는지 여부를 측정하기 위함
고정화된 PU-H71을 DLBCL 세포주 내의 Hsp90 복합체를 풀-다운하기 위해서 사용하여 Hsp90과 BCR 경로 성분 사이의 상호작용을 검출할 수 있다. 증가하는 용량의 PU-H71로 처리된 DLBCL 세포주는 BCR 경로 성분의 분해에 대해서 분석할 것이다. DLBCL 세포주는 BCR 경로 성분의 억제제 단독으로, 및 PU-H71과 조합하여 처리하고, 생존도에 대해서 평가할 것이다. 효과적인 병용 처리는 DLBCL 이종이식 마우스 모델에서 조사될 것이다.
특정의 목적 2: DLBCL에서 CSN의 역할을 평가하기 위함
하부 목적 ( subaim ) 1: CSN이 DLBCL에서 치료학적 표적일 수 있는지 여부를 결정하기 위함
CPs 및 PU-H71에 의한 처리는 CNS를 DLBCL 세포주 내의 Hsp90의 기질로서 입증할 것이다. CSN는 DLBCL 내에서 단독으로 및 PU-H71와 함께 유전적으로 제거되어 생존을 위해 CSN에 대한 DLBCL 의존성을 증명할 것이다. 마우스 이종이식 모델은 단독으로 및 PU-H71와 함께 CSN 억제에 의해서 처리되어 종양 성장 및 동물 생존에 대한 효과를 나타낼 것이다.
하부 목적 2: DLBCL의 생존에서 CSN의 기전을 결정하기 위함
CSN의 면역침강 (IPs)을 사용하여 CSN-CBM 상호작용을 입증할 것이다. CSN의 유전적 제거를 사용하여 DLBCL 세포주에서 Bcl10의 분해 및 NF-κB 활성의 제거를 입증할 것이다.
배경 및 유의성
1. DLBCL 분류
DLBCL은 비-호지킨 림프종의 가장 통상적인 형태이다. DLBCL의 진단 및 치료를 개선시키기 위해서, 이 분자적으로 불균질한 질환을 분류하기 위한 다수의 연구가 시도되었다. 한가지 유전자 발현 프로파일링 연구는 DLBCL을 두 가지 주된 서브타입으로 구분하였다 (Alizadeh et al., 2000). 배중심 (GC) B 세포-ㄹ양 (GCB) DLBCL은 BCL6 및 CD10을 포함하는 배중심 분화에 중요한 유전자의 발현을 특징으로 할 수 있는 반면에, 활성화된 B 세포-유사 (ABC) DLBCL은 활성화된 말초혈액 B 세포의 경우와 유사한 유전자 발현 프로필에 의해서 구분될 수 있다. NF-κB 경로는 ABC DLBCL에서 더 활성이며, 종종 돌연변이된다. 유전자 발현 프로파일링을 사용한 또 다른 분류 노력은 3 가지의 주된 클래스의 DLBCL을 확인하였다. OxPhos DLBCL은 산화적 인산화, 미토콘드리아 기능 및 전자 수송 체인에 포함된 유전자의 상당한 풍부함을 나타낸다. BCR/증식 DLBCL은 세포-주기 조절에 포함된 유전자의 증가된 발현을 특징으로 할 수 있다. 숙주 반응 (HR) DLBCL은 T-세포 수용체 (TCR) 및 T 세포 활성화에 포함된 다른 유전자의 다수의 성분의 증가된 발현을 기초로 하여 확인되었다 (Monti et al., 2005).
이들 예비 분류는 환자 샘플을 사용하여 이루어졌으며, 환자의 진단 또는 치료에 대한 최종 답은 아니었다. 환자 샘플은 세포의 불균질한 집단으로 이루어지며, 종양 미세환경이 질병에서 역할을 하기 때문에 (de Jong and Enblad, 2008), 환자 샘플에 더해서 DLBCL 세포주는 분류하지 않았다. 그러나, 잘-특정화된 세포주를 질병의 배후에 있는 분자 기전을 조사하기 위한 DLBCL의 상이한 서브타입의 모델로서 사용할 수 있다.
2. DLBCL : 신규 치료법에 대한 필요성
사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손의 조합 (CHOP)과 같은 표준 화학요법 레지멘은 약 40%의 DLBCL 환자를 치유하며, GCB 및 ABC 환자에 대한 5-년 전체 생존율은 각각 60% 및 30%이다 (Wright et al., 2003). 이 치료 스케줄에 대한 리툭시맙 면역요법의 첨가 (R-CHOP)는 DLBCL 환자의 생존을 10 내지 15%만큼 증가시킨다 (Coiffier et al., 2002). 그러나, 40%의 DLBCL 환자는 R-CHOP에 반응하지 않으며, 이 병용 화학면역요법의 부작용은 잘 허용되지 않아서 이 질병에 대한 새로운 표적 및 치료법을 확인할 필요성이 강조된다.
환자 종양의 분류는 DLBCL에 근본적인 분자 기전의 이해를 어느 정도 진전시켰다. 이들 상세한 내용이 더 잘 이해될 때까지, 치료는 개별적으로 맞추어질 수 없다. 새로운 약물을 단독으로, 및 병용 치료로 사용하는 치료의 전임상적 연구 및 DLBCL에서 새로운 표적의 조사는 질병의 배후에 있는 분자 기전에 대한 새로운 견해를 제공할 것이다.
3. Hsp90 : 유망한 표적
Hsp90은 암에 대해서 최근에 생겨난 치료학적 표적이다. 샤페론 단백질은 구성적으로 발현되지만, 열 충격과 같은 세포 스트레스에 의해서 유도될 수도 있다. Hsp90은 생존, 증식 및 혈관형성과 같은 세포 과정에 포함된 다양한 기질 단백질의 안정성을 유지시킨다 (Neckers, 2007). Hsp90의 기질 단백질에는 역성형 거대 세포 림프종에서의 NPM-ALK, 및 만성 골수성 백혈병에서의 BCR-ACL과 같은 종양단백질이 포함된다 (Bonvini et al., 2002; Gorre et al., 2002). Hsp90은 질병 유지에 필요한 종양원성 기질 단백질의 안정성을 유지시키기 때문에, 이것은 매력적인 치료학적 표적이다. 실제로, Hsp90의 억제는 다수의 기질 단백질의 분해를 야기한다 (Bonvini et al., 2002; Caldas-Lopes et al., 2009; Chiosis et al., 2001; Neckers, 2007; Nimmanapalli et al., 2001). 그 결과, Hsp90의 다수의 억제제가 임상을 위해서 개발되었다.
4. PU-H71: 신규의 Hsp90 억제제
신규의 퓨린 스캐폴드 Hsp90 억제제인 PU-H71은 개선된 약동학적 프로필 및 다른 Hsp90 억제제들보다 작은 독성과 함께 강력한 항-종양 효과를 갖는 것으로 나타났다 (Caldas-Lopes et al., 2009; Cerchietti et al., 2010a; Chiosis and Neckers, 2006). 본 발명자들의 실험실에서의 연구는 PU-H71이 부분적으로, DLCBL 증식 및 생존에 포함된 전사 억제인자인 BCL-6의 분해를 통해서, DLBCL 세포주, 이종이식편 및 생체외 환자 샘플을 강력하게 사멸시킨다는 것을 나타내었다 (Cerchietti et al., 2010a).
PU-H71의 독특한 특성은 종양 관련된-Hsp90에 대한 그의 큰 친화성이며, 이것은 이 약물이 왜 종양에 우선적으로 축적하는 것으로 나타났는지를 설명하는 것이다 (Caldas-Lopes et al., 2009; Cerchietti et al., 2010a). PU-H71의 이러한 특성은 이것을 암 치료법을 위한 신규의 표적을 확인하는데 유용한 도구가 되도록 한다. 고체 지지체 상에 PU-H71을 고정화시킴으로써, 종양-특이적 Hsp90 복합체의 화학적 침강 (CP)이 수득될 수 있고, Hsp90의 기질 단백질은 프로테오믹스 방법을 사용하여 확인될 수 있다. DLBCL 세포주에서 이 방법을 사용한 예비 실험은 DLBCL 세포에서 Hsp90에 의해 안정화된 적어도 두 개의 잠재적 표적, 즉 BCR 경로 및 COP9 시그날로좀 (CSN)을 밝혔다.
5. 암에서 병용요법
암에 대한 합리적인 병용 치료를 확인하는 것은 필수적인데, 이는 단일 작용제 치료법은 치유력이 없기 때문이다 (표 6). 종양 세포 불균질성으로 인하여 단일요법은 효과가 없다. 비록 종양이 단일 세포로부터 성장하지만, 이들의 유전적 불안정성은 세포사멸에 대한 저항성, 정상 성장 인자에 대한 감소된 의존성, 및 더 큰 증식능의 형태의 증진된 생존능을 위해서 선택되는 딸 세포의 불균질한 집단을 생산한다 (Hanahan and Weinberg, 2000). 종양은 세포의 불균질한 집단으로 이루어지기 때문에, 단일 약물은 소정의 종양에서 모든 세포를 사멸시키지 않을 것이고, 생존한 세포는 종양 재발을 야기한다. 종양 불균질성은 증가된 수의 잠재적 약물 표적을 제공하며, 따라서 병용 치료에 대한 필요성을 제공한다.
[표 6] 종양 치유에는 다수의 치료제가 필요하다 (Kufe DW, 2003)
Figure 112019098147283-pat00080
a. 하나의 제제는 치유력이 있지만, 더 높은 치유률은 둘 이상에 의해 나타난다.
b. 하나의 제제는 1기 아프리칸 버킷을 치유했지만, 둘 이상이 더 나았다.
화학요법제에 대한 노출은 약물의 존재 하에서 생존할 수 있는 종양 세포의 저항성 집단을 발생시킬 수 있다. 이러한 치료학적 저항성을 회피하는 것이 병용 치료에 대한 또 다른 중요한 이유이다.
중복되지 않는 부작용을 갖는 약물들의 조합은 각각의 약물의 더 적은 용량에서 상가적 또는 상승적 항-종양 효과를 제공할 수 있으며, 따라서 부작용을 저하시킬 수 있다. 따라서, 상승작용 또는 강화에 가능한 바람직한 결과에는 i) 치료학적 효과의 효능을 증가시키고, ii) 투약량은 감소시키면서 동일한 효능을 증가 또는 유지시켜 독성을 피하고, iii) 약물 저항성의 발생을 최소화하고, iv) 표적 (효능 상승작용) 대 숙주에 대해서 선택적인 상승작용을 제공하는 것이다. 약물 조합은 이들 치료학적 이득을 위해서 암 및 감염성 질환과 같은 복잡한 질환을 치료하기 위해서 광범하게 사용되어 왔다.
Hsp90의 억제는 악성 세포를 사멸시키고, 대다수의 그의 기질 단백질의 분해를 야기하기 때문에, 종양-Hsp90 기질 단백질의 확인은 추가의 치료학적 표적을 밝힐 수 있다. 이러한 연구에서, 본 발명자들은 Hsp90 억제와의 병용요법을 위한 잠재적 표적으로 DLBCL 생존에서 BCR 경로, 및 Hsp90의 기질인 CSN를 조사하는 것을 목적으로 하였다. 본 발명자들은 Hsp90 및 그의 기질 단백질의 조합된 억제가 DLBCL을 사멸시키는데 상승적으로 작용하여 감소된 독성과 함께 증가된 환자 반응을 제공할 것으로 예견한다.
6. Hsp90 및 그의 기질 BCL6의 억제 사이의 상승작용: 원리의 증명
GCB DLBCL 유전자 발현의 징표인 전사 억제인자 BCL6은 DLBCL에서 가장 공통적으로 포함된 종양단백질이다. BCL6은 전사 억제 복합체를 형성하여 GC B 세포의 형질 세포 분화 및 DNA 손상 반응에 포함된 유전자의 발현을 음성적으로 조절한다. BCL6는 B 세포가 면역글로불린 친화성 성숙 (Ye et al., 1997), 및 배중심에서의 체세포 초돌연변이를 겪는데 필요하다. BCL6의 이상 구성적 발현 (Ye et al., 1993)은 동물 모델에서 나타난 바와 같이 DLBCL을 초래할 수 있다. BCL6의 펩타이드유사 억제제인 RIBPI는 BCL-6-의존적 DLBCL 세포를 선택적으로 사멸시키며 (Cerchietti et al., 2010a; Cerchietti et al., 2009b), 임상을 위해서 개발 중에 있다.
PU-H71 비드를 사용한 CPs는 BCL6이 DLBCL 세포주에서 Hsp90의 기질 단백질이고, PU-H71에 의한 처리가 BCL6의 분해를 유도하는 것을 나타낸다 (Cerchietti et al., 2009a) (도 18). RI-BPI는 PU-H71 처리와 상승작용하여 DLBCL 세포주 및 이종이식체를 사멸시킨다 (Cerchietti et al., 2010b) (도 18). 이러한 발견은 DLBCL에서의 표적이 종양-Hsp90의 CPs를 통해서 확인될 수 있고, Hsp90과 그의 기질 단백질의 조합된 억제가 DLBCL을 사멸시키는데 상승적으로 작용한다는 원리의 증명으로서 작용한다.
7. BCR 시그날링
BCR은 그의 리간드-매개된 활성화가 B 세포에서 광범한 하류 시그날링 캐스케이드를 유발하는 거대 경막 수용체이다 (도 19에 개략적으로 나타냄). BCR의 세포외 리간드-결합 영역은 막 면역글로불린 (mIg), 가장 흔하게는 mIgM 또는 mIgD이며, 이것은 모든 항체와 같이 두 개의 중쇄 Ig (IgH) 및 두 개의 경쇄 Ig (IgL)를 함유한다. Igα/Igβ(CD79a/CD79b) 헤테로다이머는 mIg와 연합하여 수용체의 시그날 변환 부위로서 작용한다. BCR의 리간드 결합은 src 패밀리 키나제 (Lyn, Blk, Fyn)에 의한 CD79a/CD79b의 세포질 테일 (cytoplasmic tails) 상에서 발견되는 면역수용체 티로신-비드 활성화 모티프 (ITAMs)의 인산화를 포함한 수용체의 응집을 야기한다. 세포질 티로신 키나제인 Syk는 CD79a/CD79b 상의 이중으로 인산화된 ITAMs에 동원되며, 여기에서 이것은 활성화되어 브루톤 티로신 키나제 (BTK), 포스포리파제 Cγ (PLCγ), 및 단백질 키나제 Cβ (PKC-β)를 포함한 시그날링 캐스케이드를 야기한다. BLNK는 PLCγ, 포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3-K) 및 Vav를 동원할 수 있는 중요한 어댑터 분자이다. BCR 응집에 의한 이들 키나제의 활성화는 BCR, CD79a/CD79b 헤테로다이머, src 패밀리 키나제, Syk, BTK, BLNK 및 그의 연관된 시그날링 효소로 이루어진 막에서의 BCR 시그날로좀의 형성을 야기한다. BCR 시그날로좀은 막에서의 수용체로부터 하류 시그날링 효과기로의 시그날 변환을 매개환다.
BCR 시그날로좀으로부터의 시그날은 Ras를 통해서 세포외 시그날-관련된 키나제 (ERK) 패밀리 단백질로, 및 Rac/cdc43을 통해서 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 패밀리로 변환된다. PLCγ의 활성화는 세포 칼슘 (Ca2 +)의 증가를 야기하여 Ca2 +-칼모듈린 키나제 (CamK) 및 NFAT의 활성화를 제공한다. 유의적으로, 증가된 세포 Ca2 +는 PKC-β를 활성화시키고, 이것은 BCL10 및 MALT1과의 복합체를 형성하는 어댑터 단백질인 Carma1 (CARD11)을 인산화시킨다. 이 CBM 복합체는 IκB 키나제 (IKK)를 활성화시켜 IκB의 인산화를 야기하고, 이것은 사이토졸 내의 NF-κB 서브유닛을 고립시킨다. 인산화된 IκB는 유비퀴틴화되어 그의 분해 및 NF-κB 서브유닛의 핵으로의 국재화를 야기한다. 이 복잡한 경로 내의 다수의 다른 하류 효과기 (p38 MAPK, ERK1/2, CaMK)는 핵으로 전좌하여 세포 생존, 증식, 성장 및 분화에 포함된 유전자 (NF-κB, NFAT)의 전사에 있어서의 변화에 영향을 미친다. Syk는 또한 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)를 활성화시켜 증가된 세포 PIP3를 제공한다. 이 두 번재 메센저는 세포 성장 및 생존을 촉진시키는 라파마이신 (mTOR) 경로의 급성으로 변형시킨 레트로바이러스 (Akt)/포유동물 표적을 활성화시킨다 (Dal Porto et al., 2004).
8. DLBCL에서 이상 BCR 시그날링
BCR 시그날링은 B 세포의 생존 및 성숙 (Lam et al., 1997), 특히 NF-κB를 통한 생존 시그날링에 필요하다. 실제로, 구성적 NF-κB 시그날링은 ABC DLBCL의 홀마크 (hallmark)이다 (Davis et al., 2001). 더욱이, BCR 및 그의 효과기에서의 돌연변이는 DLBCL, 특히 ABC DLBCL에서 NF-κB의 증진된 활성에 기여한다.
CD79a/CD79b 헤테로다이머의 ITAMs에서의 돌연변이는 과반응성 BCR 활성화와 연관되고, DLBCL에서 수용체 내재화를 감소시키는 것으로 나타났다 (Davis et al., 2010). CD79 ITAM 돌연변이는 또한 Lyn 키나제에 의한 음성적 조절을 차단한다. Lyn은 CD22 상의 면역수용체 티로신-기본 불활성화 모티프 (ITIMs) 및 BCR과 소통하는 막 수용체인 Fc γ-수용체를 인산화시킨다. 이들 인산화된 ITIMs 상에 도킹한 후에, SHP1은 BCR 시그날링의 하향변조를 야기하는 CD79 ITAMs를 탈인산화시킨다. Lyn은 또한, 음성적 조절 부위에서 Syk를 인산화시켜 그의 활성을 감소시킨다 (Chan et al., 1997). 종합적으로, ABC 및 GCB DLBCL 둘 다에서 발견되는 CD79 ITAMs에서의 돌연변이는 BCR을 통한 감소된 Lyn 키나제 활성 및 증가된 시그날링을 야기한다.
BCR 경로 성분에서의 특정한 돌연변이는 직접적으로 NF-κB 활성을 증진시킨다. CARD11 어댑터 단백질에서의 체세포 돌연변이는 IKK의 구성적 활성화를 제공하여 BCR 연계의 부재 하에서 조차도 증진된 NF-κB를 야기한다 (Lenz et al., 2008). 유비퀴틴-편집 효소인 A20은 유비퀴틴 쇄를 IKK로부터 제거함으로써 NF-κB 시그날링을 종결시킨다. A20에서의 불활성화 돌연변이는 ABC DLBCL에서 NF-κB 시그날링으로부터 이 브레이크 (brake)를 제거한다 (Compagno et al., 2009).
ABC DLBCL에서 이 구성적 BCR 활성은 이것을 "긴장성 (tonic) BCR 시그날링"으로 구분하기 위해서 "만성 활성 BCR 시그날링"으로 칭한다. CBM 성분이 부족한 마우스는 정상적인 수의 B 세포를 갖기 때문에, 긴장성 BCR 시그날링은 성숙 B 세포를 유지시키며, CARD11을 필요로 하지 않는다 (Thome, 2004). 그러나, 만성 활성 BCR 시그날링은 CBM 복합체를 필요로 하며, 항원-자극된 B 세포의 특징이지만 휴지 B 세포는 그렇지 않은 현저한 BCR 클러스터링에 의해서 구분된다. 실제로, CARD11, MALT1, 및 BCL10의 녹다운은 GCB DLBCL 세포주에 비해 ABC에 대해서 우선적으로 독성이다 (Ngo et al., 2006). 만성 활성 BCR 시그날링은 대부분 ABC DLBCL과 연관되나, CARD11 및 CD79 ITAM 돌연변이는 GCB DLBCL에서 일어나지 않으며 (Davis et al., 2010; Lenz et al., 2008), 이것은 BCR 시그날링이 DLBCL의 서브타입에 걸쳐서 잠재적인 표적임을 시사한다.
9. DLBCL에서 BCR 경로의 표적화
이것은 세포 성장, 증식 및 생존을 촉진시키기 때문에, BCR 시그날링은 암에서의 명백한 표적이다. DLBCL 내의 BCR 경로에서의 돌연변이 (상술함)는 질병에서의 표적으로서의 그의 적절성을 강조한다. 실제로, BCR의 다수의 성분은 DLBCL에서 표적화되었으며, 이들 치료 중의 일부는 이미 환자에게 제공되었다.
Syk의 음성적 조절인자인 단백질 티로신 포스파타제 (PTP) 수용체-타입 O 절단형 (PTPROt)의 과발현은 증식을 억제하고, DLBCL에서 세포사멸을 유도하여 Syk를 DLBCL에서의 표적으로서 확인한다 (Chen et al., 2006). 소분자 포스타마티닙 (fostamatinib) 디나트륨 (R406)에 의한 Syk의 억제는 증식을 차단하고, DLBCL 세포주에서 세포사멸을 유도한다 (Chen et al., 2008). 이 경구적으로 이용할 수 있는 화합물은 또한 DLBCL 환자에게서 우수한 허용성과 함께 상당한 임상적 활성을 나타내었다 (Friedberg et al., 2010).
RNA 간섭 스크린은 Btk를 DLBCL에서의 잠재적 표적으로 나타내었다. Btk를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNAs (shRNAs)는 DLBCL 세포주, 특히 ABC DLBCL에 대해서 매우 독성이다. Btk의 소분자 비가역적 억제제인 PCI-32765 (Honigberg et al., 2010)는 DLBCL 세포주, 특히 ABC DLBCL을 강력하게 사멸시킨다 (Davis et al., 2010). 이 화합물은 임상실험 중에 있으며, 우수한 허용성을 가지고 B 세포 악성종양에서 효능을 나타내었다 (Fowler et al., 2010).
NF-κB의 구성적 활성은 이것을 DLBCL 내의 합리적인 표적으로 만든다. NF-κB는 다양한 방법을 통해서 표적화될 수 있다. IKK의 억제는 IκB의 인산화를 차단하여 NF-κB 서브유닛의 방출 및 핵 전좌를 방지한다. 선택적 IKK 억제제인 MLX105는 ABC DLBCL 세포주를 강력하게 사멸시킨다 (Lam et al., 2005). NEDD8-활성화 효소 (NAE)는 인산화된 IκB의 CRL1βRCP 유비퀴틴화를 조절하여 그의 분해 및 NF-κB의 방출을 야기한다. MLN4924와 같은 소분자에 의한 NAE의 억제는 ABC DLBCL에서 세포사멸을 유도하고, DLBCL 및 환자 이종이식 모델에서 강력한 종양 크기 퇴행 (tumor burden regression)을 나타낸다. MLN4924는 ABC DLBCL에서 더 큰 효능을 나타내며, 이것은 이 서브타입에서의 생존을 위한 구성적 NF-κB 활성에 대한 더 큰 의존성으로 인한 것으로 예상된다 (Milhollen et al., 2010). 이것은 IKK를 활성화시키기 때문에, PKC-β를 억제하는 것은 NF-κB 활성을 차단하는 또 다른 방법이다. Ly379196과 같은 특이적 PKC-β 억제제는 비록 고용량이기는 하지만 ABC 및 GCB DLBCL 세포주 둘 다를 사멸시킨다 (Su et al., 2002).
NF-κB 활성을 표적화하기 위한 이들 방법은 DLBCL에 대해서 유망한 치료법이다. IKK 및 NAE의 억제는 ABC DLBCL에서 가장 강력하지만, GCB DLBCL에서도 덜 강력한 효과가 또한 나타났다. 이들 연구는 NF-κB 활성을 다른 표적화된 치료법과 조합하는 것이 DLBCL 서브타입에 걸쳐서 더욱 확고한 효과를 제공할 수 있음을 시사한다.
PI3K/Akt/mTOR 경로는 다수의 인간 질환에서 탈조절되며, DLBCL에서 구성적으로 활성화된다 (Gupta et al., 2009). 악성 세포는 이 경로를 이용하여 세포 성장 및 생존을 촉진시키기 때문에, 경로의 소분자 억제제가 세밀하게 조사되었다. mTOR을 표적으로 하는 마크로라이드 항생제인 라파마이신 (시롤리무스)는 FDA 승인된 경구용 면역억제제이다 (Yap et al., 2008). 경구적으로 이용할 수 있는 라파마이신 유사체인 에버롤리무스도 또한 이식 면역억제제로 승인되었다 (Hudes et al., 2007). 이들 화합물은 DLBCL 세포주 및 환자 샘플에서 항종양 활성을 갖지만 (Gupta 2009), 이들의 효과는 대부분 항증식성이고, 단지 편협하게 세포독성이다. 세포독성을 달성하기 위해서, 라파마이신 및 에버롤리무스는 다수의 치료제와의 조합을 평가하였다 (Ackler et al., 2008; Yap et al., 2008). DLBCL에서 에버롤리무스의 II 상 임상 연구는 35%의 ORR로 적당히 성공적이었다 (Reeder C, 2007). 에버롤리무스는 또한, DLBCL 세포주를 다른 세포독성제에 대해 민감하게 만드는 것으로 나타났다 (Wanner et al., 2006). 이들 발견은 DLBCL에서 mTOR 억제가, 특히 병용 요법에서 치료학적 잠재력이 있음을 명백하게 입증한다.
Akt의 억제도 또한 유망한 암 치료법이며, 다수의 방식으로 표적화될 수 있다. 지질 기본 억제제는 Akt의 PIP3-결합 PH 영역을 차단하여 그의 막으로의 전좌를 방지한다. 이러한 약물의 한가지인 페리포신 (perifosine)은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 항종양 활성을 나타내었다.
전체적으로, 화합물은 단지 부분적인 반응만을 나타내어 다른 표적화된 치료법과의 병용을 촉진시켰다 (Yap et al., 2008). GSK690693과 같은 Akt의 소분자 억제제는 림프종 및 백혈병, 특히 ALL에서 성장 억제 및 세포사멸을 야기하며 (Levy et al., 2009), 단일요법으로, 또는 다른 표적화된 치료법과 병용하여 DLBCL을 사멸시키는데 효과적일 수 있다.
MAPK 경로는 암 치료에 있어서 또 다른 치료학적 표적이다. 종양유전자 MCT-1은 DLBCL 환자 샘플에서 고도로 발현되며, ERK에 의해서 조절된다. ERK의 억제는 DLBCL 이종이식 모델에서 세포사멸을 야기한다 (Dai et al., 2009). ERK 및 MEK의 소분자 억제제가 개발되었으며, 임상에서 탁월한 안전성 프로필 및 종양 억제 활성을 나타낸다. 그러나, 이들 약물에 대한 반응은 관찰된 4 가지 부분적인 환자 반응 및 환자의 22%에서 보고된 안정한 질병에 의해서 확고하지 않았다 (Friday and Adjei, 2008). MAPK 경로의 상류 조절인자, 즉 Ras 및 Raf가 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되고, MEK 억제에도 불구하고 세포 생존을 유지시키는 다른 키나제를 조절할 수 있기 때문에, MEK 만을 억제하는 것은 세포독성을 야기시키는데 불충분할 수 있다. 이들 위험에 직면하여, AZD6244와 같은 MEK 억제제가 임상에 도입되었다. MEK 억제에 대한 부분적 반응은 이들 억제제와 다른 표적화된 치료법의 조합이 더욱 확고한 환자 반응을 나타낼 수 있음을 시사한다 (Friday and Adjei, 2008).
10. CSN : 구조 및 기능
CSN은 1996 년에 광형태형성 (photomorphogenesis)의 음성적 조절인자로서 아라돕시스 (Aradopsis)에서 최초로 발견되었다 (Chamovitz et al., 1996). 복합체는 효모로부터 인간까지에서 고도로 보존되며, 8 개의 서브유닛, 즉 크기에 따라 최대로부터 최소로 번호를 붙인 CSN1-CSN8로 이루어진다 (Deng et al., 2000). 대부분의 CSN 서브유닛은 8 개의 서브유닛 홀로복합체 (holocomplex)의 일부분으로서 더 안정하지만, CSN4-7을 함유하는 미니-CSN과 같은 더 작은 일부의 복합체가 보고되었다 (Oron et al., 2002; Tomoda et al., 2002). 준활성화 (Junactivation)-영역-결합 단백질 (Jab1)로서 최초로 확인된 CSN5는 홀로-CSN과는 무관하게 작용하며, 다수의 세포 시그날링 매개인자와 상호작용하는 것으로 나타났다 (Kato and Yoneda-Kato, 2009). 이들 복합체의 분자 구성 및 기능성은 아직 명백하게 이해되지 않고 있다.
CSN5 및 CSN6은 각각 MPR1-PAD1-N-말단 (MPN) 영역을 함유하지만, 단지 CSN5만이 JAB1 MPN 영역 금속효소 모티프 (JAMM/MPN+ 모티프)를 함유한다. 다른 6 개의 서브유닛은 프로테아좀-COP9 시그날로좀-개시 인자 3 영역 (PCI (또는 PINT))을 함유한다 (Hofmann and Bucher, 1998). 이들 영역의 정확한 기전은 아직 완전히 이해되지 않았지만, 이들은 프로테아좀의 리드 복합체 (lid complex) 및 eIF3 복합체와 매우 유사한 상동성을 보유하여 (Hofmann and Bucher, 1998), CSN의 기능이 단백질 합성 및 분해에 관한 것임을 시사한다.
CSN의 가장 잘 특정화된 기능은 단백질 안정성의 조절이다. CSN은 쿨린 (cullins)의 탈네딜화 (deneddylation)에 의해서 단백질 분해를 조절한다. 쿨린은 유비퀴틴 E3 리가제의 중심에서 단백질 스캐폴드이다. 이들은 또한 유비퀴틴 E2 컨주게이트화 효소 및 분해를 위해서 표적화된 단백질 기질에 대한 도킹 부위로 작용한다. 쿨린-RING-E3 리가제 (CRLs)는 유비퀴틴 리가제의 가장 큰 패밀리이다. Nedd8의 컨주게이션에 의한 CRL의 쿨린 서브유닛의 해독-후 변형이 CRL 활성에 필요하다 (Chiba and Tanaka, 2004; Ohh et al., 2002). CSN5 JAMM 모티프는 CRLs로부터 Nedd8의 제거를 촉진시키며; 이 탈네딜화 반응은 온전한 CSN 홀로복합체를 필요로 한다 (Cope et al., 2002; Sharon et al., 2009). 비록 쿨린 탈네딜화가 CRLs를 불활성화시키지만, CSN은 CRL 활성화에 필요하며 (Schwechheimer and Deng, 2001), 자동유비퀴틴화에 의해서 CRL 성분이 자체-파괴하는 것을 방지할 수 있다 (Peth et al., 2007).
CSN은 세포사멸 및 세포 증식을 포함한 다수의 다른 생물학적 기능을 갖는다. 마우스에서 CSN 성분 2, 3, 5, 및 8의 녹아웃은 대규모 세포사멸에 기인한 초기 배아 사망을 야기하며, 여기에서 CSN5 녹아웃이 가장 심한 표현형을 나타낸다 (Lykke-Andersen et al., 2003; Menon et al., 2007; Tomoda et al., 2004; Yan et al., 2003). 이들 녹아웃 동물에게서 표현형은 NAE 녹아웃 마우스 (Tateishi et al., 2001) 및 다양한 쿨린의 녹아웃 마우스 (Dealy et al., 1999; Li et al., 2002; Wang et al., 1999)의 표현형과 유사하기 때문에, 이들 기능은 단백질 안정성 및 분해에서의 복합체의 역할과 관련될 수 있다.
흉선세포에서 CSN5의 제거는 전세포사멸성 BCL2-연관된 X 단백질 (Bax)의 증가된 발현 및 항-세포사멸성 Bcl-xL 단백질의 감소된 발현의 결과로 세포사멸을 야기한다 (Panattoni et al., 2008). CSN5와 사이클린-의존적 키나제 (CDK) 억제제 p27의 상호작용은 세포 증식에 있어서의 그의 역할을 시사한다 (Tomoda et al., 1999). CSN5 녹아웃 흉선세포는 디스플레이 G2 정지를 나타내는 반면에 (Panattoni et al., 2008), CSN8은 휴지기로부터 세포 주기로의 T 세포 도입에 역할을 한다 (Menon et al., 2007).
11. CSN 및 암
세포사멸, 증식 및 세포 주기 조절과 같은 세포 기능에 CSN이 포함되는 것은 이것이 암에서 역할을 할 수 있음을 시사한다. 실제로, CSN5의 과발현은 다양한 종양에서 관찰되며 (표 7), CSN5의 녹다운은 종양 세포의 증식을 억제한다 (Fukumoto et al., 2006). CSN5는 또한 세포 증식, 침습 및 혈관형성에 포함된 유전자의 myc-매개된 전사 활성화에 포함된다 (Adler et al., 2006). CSN2 및 CSN3은 각각 노화를 극복하고 (Leal et al., 2008), 마우스 섬유아세포의 증식을 억제하는 (Yoneda-Kato et al., 2005) 그들의 능력으로 인하여 추정상의 종양 억제인자로 확인된다.
[표 7] 종양 진행 또는 임상적 결과를 연관시키는 CSN5 과발현 (Richardson and Zundel, 2005)
Figure 112019098147283-pat00081
이종이식 모델에서 CSN5의 녹다운은 종양 성장을 상당히 감소시킨다 (Supriatno et al., 2005). 천연 생성물 쿠르쿠민 (curcumin)의 유도체는 CSN5를 억제함으로써 췌장암 세포의 성장을 억제한다 (Li et al., 2009). 종합적으로, 이들 발견은 CSN이 암에서 우수한 치료학적 표적임을 나타낸다.
12. CSN 및 NF - κB 활성화: DLBCL에서의 역할은?
CSN은 상이한 세포 환경에서 상이하게 NF-κB 활성화를 조절한다. 류마티스 관절염 환자의 TNFα-자극된 활막세포에서, CSN5의 녹다운은 TNFR1-리게이션 의존적 IκBα 분해 및 NF-κB 활성화를 폐지시킨다 (Wang et al., 2006). 그러나, TNFα-자극된 내피 세포에서 CSN 서브유닛의 제거는 IκBα의 안정화 및 NF-κB의 지속적인 핵 전좌를 야기한다 (Schweitzer and Naumann, 2010).
T 세포에서 CSN의 연구는 T 세포 발육 및 생존에서의 그의 결정적인 역할을 입증한다. CSN5 눌 마우스 (null mice)로부터의 흉선세포는 세포 주기 정지 및 증가된 세포사멸을 나타낸다. 중요하게도, 이들 세포는 IκBα의 축적, 감소된 핵 NF-κB 축적, 및 항-세포사멸성 NF-κB 표적 유전자의 저하된 발현을 나타내어 (Panattoni et al., 2008), CSN5가 T-세포 활성화를 조절하는 것을 시사한다. 실제로, CSN은 활성화된 T 세포에서 CBM 복합체와 상호작용한다. T-세포 활성화는 CSN과 MALT1 및 CARD11과의, 및 MALT1을 통해서 BCL10과의 상호작용을 자극한다. CSN2 및 CSN5는 BCL10을 탈유비퀴틴화시킴으로써 CBM을 안정화시킨다. 어느 하나의 서브유닛의 녹다운은 Bcl10의 빠른 분해를 야기하고, 또한 TCR-자극된 T 세포에서 IKK 활성화를 차다하여 CSN이 이 기전을 통해서 NF-κB 활성을 조절할 수 있음을 시사한다 (Welteke et al., 2009).
NF-κB 조절에서 CSN의 정확한 기능은 잘 정의되지 않았으며, 세포 타입에 따라 달라질 수 있다. 특히 T 세포에서 CBM의 안정화를 통해 NF-κB 조절에 CSN이 포함되는 것은 이것이 DLBCL 병리학에서 역할을 할 수 있음을 시사한다.
예비 결과
CPs는 OCI-Ly1 및 OCI-Ly7 DLBCL 세포주에서 수행되었다. 세포를 용해시키고, 사이토졸 및 핵 용해물을 추출하였다. 용해물을 대조 비드 또는 PU-H71로 코팅된 아가로즈 비드와 함께 밤새 배양한 다음에 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거하였다. 단단하게 결합한 단백질을 SDS/PAGE 부하 완충액 중에서 비등시킴으로써 용출시키고, SDS/PAGE에 의해서 분리시키고, 콜로이드성 블루 염색에 의해서 가시화시켰다. 겔 레인을 분절로 절단하고, 본 발명자들의 공동연구자에 의해 질량 분광분석법으로 분석하였다. PU-H71 풀다운에서는 크게 나타났지만 (펩타이드의 수에 의해서 결정됨) 대조군 풀다운에서는 그렇지 않은 단백질이 후보 DLBCL-관련된 Hsp90 기질 단백질이다. 공통적인 단백질 오염물 및 아가로즈 프로테옴을 제외시킨 후에, 본 발명자들은 두 가지 세포주에서 모두 다수의 펩타이드로 표시되는 80% 중복되는 추정상의 클라이언트 단백질 (N=~200)을 수득하였다. 이들 실험에서 PU-H71 Hsp90 클라이언트 중에서 크게 나타난 경로 중의 하나는 BCR 경로이다 (200 개 중의 23 개의 단백질, 도 19 및 도 23에서 회색으로 나타냄). 본 발명자들은 이 발견을 입증하기 시작하였다. 예비 데이터는 Syk 및 Btk가 둘 다 PU-H71이 증가함에 따라서 분해되고, 둘 다 DLBCLs의 CPs에서 PU-H71에 의해서 풀다운되는 것을 나타낸다. PU-H71은 Syk 억제제인 R406과 상승작용하여 DLBCL 세포주를 사멸시킨다 (도 20).
실험적 접근
목적 1: Hsp90 및 BCR 경로의 동시 변조가 시험관내 및 생체내에서 DLBCL 세포를 사멸시키는데 협력하는지 여부를 측정하기 위함
본 발명자들의 예비 데이터는 DLBCL에서 Hsp90의 기질 단백질로서 BCR 경로의 다수의 성분을 확인하였다. BCR 경로는 종양 형성 및 DLBCL 생존에 연루되었다. 본 발명자들은 Hsp90 및 BCR 경로의 성분의 조합된 억제가 DLBCL을 사멸시키는데 있어서 상승작용할 것으로 가정하였다.
실험 디자인 및 예상된 결과
DLBCL 세포주는 배양물 중에서 유지시킬 것이다. GCB DLBCL 세포주는 OCI-Ly1, OCI-Ly7, 및 톨레도 (Toledo)를 포함할 것이다. ABC DLBCL 세포주는 OCI-Ly3, OCI-Ly10, HBL-1, TMD8을 포함할 것이다. 세포주 OCI-Ly1, OCI-Ly7, 및 OCI-Ly10은 10% FBS를 함유하고, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 90% 이스코브 (Iscove) 변형된 배지에서 유지될 것이다. 세포주 톨레도, OCI-Ly3, 및 HBL-1은 페니실린 및 스트렙토마이신, L-글루타민 및 HEPES가 보충된 90% RPMI 및 10% FBS에서 성장될 것이다. TMD8 세포주는 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 90% mem-알파 및 10% FBS 중에서 성장될 것이다.
BCR 경로의 성분은 두 가지 DLBCL 세포주에서의 PU-H71 CPs의 프로테오믹스 분석의 예비 실험에서 Hsp90의 기질 단백질로 확인되었다. BCR 경로의 성분이 Hsp90에 의해서 안정화된다는 것을 증명하기 위해서, CPs를 DLBCL 세포주를 사용하여 수행하고, CD79a, CD79b, Syk, Btk, PLCγ2, AKT, mTOR, CAMKII, p38 MAPK, p40 ERK1/2, p65, Bcl-XL, Bcl6을 포함한 BCR 경로 성분에 대한 상업적으로 이용할 수 있는 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 분석할 것이다. CPs는 이들 기질 단백질에 대한 Hsp90의 친화성을 나타내기 위해서 염 농도를 증가시키면서 수행될 것이다. 일부의 단백질은 낮은 수준으로 발현되기 때문에, 세포 용해물의 핵/사이토졸 분리를 수행하여 전체 세포 용해물을 사용하여 쉽게 검출되지 않는 Hsp90 기질 단백질에 대해서 풍부화시킬 것이다.
BCR 경로 성분의 Hsp90 안정화는 또한, DLBCL 세포주를 증가 용량의 PU-H71로 처리함으로써 입증될 것이다. 상기 열거된 기질 단백질의 수준은 웨스턴 블럿에 의해서 결정될 것이다. 기질 단백질은 PU-H71에 노출시킴으로써 용량-의존적 및 시간-의존적 방식으로 분해될 것으로 예상된다.
DLBCL 세포주의 생존도는 PU-H71 또는 BCR 경로 성분 (Syk, Btk, PLCγ2, AKT, mTOR, p38 MAPK, p40 ERK1/2, NF-κB)의 억제제로 처리한 후에 평가될 것이다. BCR 경로 성분의 억제제는 DLBCL에서 보고된 데이터 및 임상 실험에서의 사용을 기초로 하여 선택되고, 우선 순위가 결정될 것이다. 예를 들어, 멜니크 (Melnick) 실험실은 PCI-32765 및 MLN4924 (상술함)을 사용하기 위해서 MTAs를 갖는다. 세포를 약물 처리의 기간 동안에 지수 성장으로 비처리된 세포를 유지시키는데 충분한 농도로 96-웰 플레이트에 플레이팅할 것이다. 약물은 48 시간 동안 삼중 웰에서 6 가지 상이한 농도로 투여될 것이다. 세포 생존도는 형광 레사주린 감소 방법 (CellTiter-Blue, Promega)에 의해서 측정될 것이다.
형광 (560여기/590방출)은 멜니크 실험실 (BioTek)에서 시너지4 (Synergy4) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정될 것이다. 처리된 세포의 생존도는 적절한 비히클 대조군, 예를 들어, PU-H71의 경우에는 물에 대해서 표준화될 것이다. 용량-효과 곡선 및 세포주의 성장을 대조군에 비해서 50%만큼 억제하는 약물 농도 (GI50)의 계산은 CompuSyn 소프트웨어 (Biosoft)를 사용하여 수행될 것이다. 이들 발견 중의 대부분은 공개된 데이터를 확실하게 하는 것일 수 있지만, 이들 억제제에 의한 효과적인 방법을 설정하고, 본 발명자들의 세포주에서 그들의 용량-반응을 측정하는 것이 Hsp90 및 BCR 경로의 조합 억제의 효과를 입증하는 추후의 병용 치료 실험을 위해서 필요할 것이다.
일단 BCR 경로 억제제에 대한 개별적인 용량-반응 곡선 및 GI50s가 확립되면, DLBCL 세포를 PU-H71 및 BCR 경로의 단일 억제제 둘 다로 처리하여 세포 사멸에 대한 병용의 효과를 입증할 것이다. 실험은 상술한 조건을 사용하여 96-웰 플레이트에서 수행될 것이다. 세포는 삼중으로 일정한 비의 약물의 조합의 6 가지 상이한 농도로 처리될 것이며, 최고 농도는 개별적인 용량=반응 실험에서 측정된 각 약물의 GI50의 두 배이다. 약물은 가장 효과적인 치료 스케줄을 결정하기 위해서 상이한 순서로, 즉 PU-H71에 이어서 24 시간 후에 약물 X, 약물 X에 이어서 24 시간 후에 PU-H71, 및 PU-H71과 함께 약물 X로 투여될 것이다. 생존도는 상기 언급된 시험을 사용하여 48 시간 후에 측정될 것이다. 세포 생존도의 아이소볼로그램 분석은 Compusyn 소프트웨어를 사용하여 수행될 것이다.
상기 제안된 DLBCL 세포주에서의 병용 치료는 용량 및 스케줄의 관점에서 이종이식 모델에서의 실험의 지표가 될 것이다. 최고의 세포 사멸효과를 나타낸 약물 스케줄이 이종이식 모델에 적용될 것이다. DLBCL 세포주는 약물에 반응하는 것으로 예상되는 두 개의 세포주 및 음성 대조군으로서 반응하지 않는 것으로 예상되는 하나의 세포주를 사용하여 SCID 마우스에게 피하로 주사될 것이다. 종양 성장은 감지할 수 있을 때까지 (약 75-100 ㎣) 격일로 모니터링할 것이다. 동물 (n=20)은 그룹당 5 마리의 동물로 무작위로 다음 그룹으로 분류될 것이다: 대조군, PU-H71, BCR 경로 억제제 (약물 X), 및 PU-H71 + 약물 X. 종양 성장에 대한 약물 효과를 측정하기 위해서, 종양 용적은 약물 투여 후에 격일로 제노겐 (Xenogen) IVIS 시스템에 의해 측정될 것이다. 10일 후에, 모든 동물을 희생시키고, 종양은 TUNEL에 의해서 세포사멸에 대해 시험할 것이다. 생존에 대한 약물 효과를 평가하기 위해서, 상기 명시된 바와 같은 동물의 제2 코호트 (cohort)를 처리하고, 종양이 1000 ㎣의 크기에 도달하면 희생시킬 것이다. 종양은 약물이 그들의 표적을 맞추었는지를 입증하기 위해서, 예를 들어, NF-κB 활성 또는 하류 표적의 인산화에 대해 ELISA에 의해 생화학적으로 분석될 것이다. 본 발명자들은 처리된 마우스에서 신체검사, 육안 및 현미경 조직 검사, 혈청 화학 및 CBCs를 포함한 멜니크 실험실(Cerchietti et al., 2009a)에서 확립된 독성 시험을 수행할 것이다.
대체방법 및 위험
세포 생존도를 검출하기 위해서 사용된 형광시험이 일부의 세포주에서 허용되지 않는다면 (예를 들어, 배지의 산도에 기인하여), ATP-기본 발광 방법 (CellTiter-Glo, Promega)이 사용될 것이다. 또한, 일부의 약물은 48 시간 이내에 세포를 사멸시킬 수 없기 때문에, 최적 약물 치료를 결정하기 위해서 필요한 경우에 더 큰 약물 용량 및 더 긴 약물 배양이 수행될 것이다. 일부의 BCR 경로 성분의 억제는 Hsp90의 억제와 조합한 경우에 DLBCL을 사멸시키는데 있어서의 개선된 효과를 나타내지 않을 수 있지만, 상기 나타낸 예비 데이터를 근거로 하여 본 발명자들은 일부의 조합이 어느 하나의 약물 단독인 경우보다 더 효과적일 것으로 믿는다.
목적 2: DLBCL에서 CSN의 역할을 평가하기 위함
하부 목적 1: CSN이 DLBCL에서 치료적 표적이 될 수 있는지 여부를 결정하기 위함
본 발명자들의 예비 데이터는 CSN의 서브유닛을 DLBCL에서의 Hsp90의 기질 단백질로 확인하였다. CSN은 암에 연루되었으며, DLBCL 생존에 역할을 할 수 있다. 본 발명자들은 DLBCL이 생존에 CSN을 필요로 하며, Hsp90 및 CSN의 조합된 억제가 DLBCL을 사멸시키는데 상승적으로 작용할 것이라고 가정하였다.
실험 디자인 및 예상된 결과
DLBCL 세포주 (상술함)에서 CSN 서브유닛의 발현이 증명될 것이다. DLBCL 세포주는 단백질 수확을 위해서 용해시키고, CSN 서브유닛에 대한 상업적으로 이용할 수 있는 항체 및 부하 대조군으로서 액틴을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석될 것이다.
CSN은 두 가지 DLBCL 세포주에서의 PU-H71 CPs의 예비 프로테오믹스 분석에서 Hsp90의 기질 단백질로 확인되었다. Hsp90이 CSN을 안정화시키는 것을 증명하기 위해서, CPs는 DLBCL 세포주를 사용하여 상술한 바와 같이 수행되고, 웨스턴 블럿에 의해 분석될 것이다. CSN의 Hsp90 안정화는 또한, DLBCL 세포주를 증가하는 PU-H71 농도로 처리함으로써 입증될 것이다. CSN 서브유닛의 단백질 수준은 웨스턴 블럿에 의해서 결정될 것이다. CSN 서브유닛은 PU-H71에 대한 노출시에 용량-의존적 및 시간-의존적 방식으로 분해될 것으로 예상된다.
DLBCL 세포주는 CSN2 또는 CSN5를 표적화한 짧은 헤어핀 (sh)RNAs를 함유하며 퓨로마이신 저항성에 의해서 선택된 렌티바이러스 pLKO.1 벡터에 의해서 감염될 것이다. 이들 벡터는 RNAi 컨소시엄을 통해서 상업적으로 이용할 수 있다. 하나의 CSN 서브유닛의 녹다운은 다른 CSN 서브유닛의 발현에 영향을 미칠 수 있고 (Menon et al., 2007; Schweitzer et al., 2007; Schweitzer and Naumann, 2010), CSN2의 녹다운은 CSN 홀로복합체의 형성을 제거하기 때문에, 이들 서브유닛이 사용될 것이다. CSN5 녹다운이 사용될 것인데, 이는 이 서브유닛이 CSN의 효소 영역을 함유하기 때문이다. 3 내지 5 개의 shRNAs의 풀을 각각의 표적에 대해 시험하여 표적 단백질의 최적 녹다운이 있는 서열을 수득할 것이다. 비어 있는 벡터 및 스크램블 shRNAs가 대조군으로 사용될 것이다. 본 발명자들은 CSN 서브유닛의 녹다운이 DLBCL 세포를 사멸시킬 것으로 예견하였고, 본 발명자들은 세포 생존도를 측정하는 것을 목적으로 하였기 때문에, 테트라사이클린 (tet) 유도성 구조물이 사용될 것이다. 이 방법은 또한, 본 발명자들이 shRNA 유도의 적정을 사용하여 CSN 서브유닛의 용량-의존적 녹다운을 위한 조건을 확립하도록 할 수 있다. 녹다운 효율은 감염 및 tet 유도 후에 웨스턴 블럿에 의해서 평가될 것이다. 세포는 감염 후에 목적 1에 기술된 방법을 사용하여 생존도에 대해서 평가될 것이다. 본 발명자들은 CSN의 녹다운이 DLBCLs을 사멸시킬 것이며, CBM 복합체를 안정화시키는데 있어서의 CSN의 역할로 인하여 ABC DLBCLs는 GCB DLBCLs보다 더 생존에 관하여 CSN에 의존적인 것으로 예상된다고 예견한다.
DLBCL에서의 CSN 단일요법 실험 후에, CSN 녹다운의 유도를 DLBCL 세포주에서 PU-H71 처리와 조합할 것이다. 48 시간 이내에 효과적인 용량 의존적 CSN 녹다운을 나타내는 (초기 실험에서 평가된 것으로서) shRNA 구조물이 48 시간 세포 생존도 실험을 수행하기 위해서 사용될 것이다. 상술한 바와 같은 대조 shRNAs가 사용될 것이다. 대조 세포 및 CSN 서브유닛을 표적으로 하는 tet-유도성 shRNA로 감염된 세포를 삼중으로 일정한 비의 tet 및 PU-H71의 상이한 용량으로 처리할 것이다. 약물은 가장 효과적인 치료 스케줄을 결정하기 위해서 상이한 순서로, 즉 PU-H71에 이어서 tet, tet에 이어서 PU-H71, 및 PU-H71과 함께 tet로 투여될 것이다. 세포 생존도는 목적 1에 기술된 바와 같이 측정될 것이다. CSN 및 Hsp90의 조합된 억제는 특히 ABC DLBCL에서 DLBCL을 사멸시키는데 상승적으로 작용하는 것으로 예상된다.
상기 제안된 DLBCL 세포주에서의 CSN 밑 Hsp90의 조합된 억제는 이종이식 모델에서의 실험의 지표가 될 것이다. 시험관내 실험으로부터 PU-H71 및 CSN 녹다운의 가장 효과적인 조합이 이종이식 실험에서 사용될 것이다. 대조군 및 유도성-녹아웃-CSN DLBCL 세포는 처리에 반응하는 것으로 예상된 두 개의 세포주 및 음성 대조군으로서 처리에 반응하지 않는 것으로 예상된 하나의 세포주를 사용하여 이종이식에 대해 사용될 것이다. 동물은 시험관내 실험에 의해서 결정된 것으로서 PU-H71 및 tet의 가장 효과적인 조합의 용량 및 스케줄을 사용하여 비히클, PU-H71 또는 tet로 처리될 것이다. 종양 성장, 동물 생존 및 독성은 목적 1에 기술된 바와 같이 시험될 것이다.
대체방법 및 위험
테트라사이클린 유도의 적정에 의해 CSN의 용량-의존적 녹다운을 성취하는 것은 어려운 것으로 입증될 수 있다. 이것이 일어난다면, 원리의 증명을 나타내기 위해서 상이한 녹다운 효율을 갖는 shRNAs를 사용하여 단일요법으로서, 및 다양한 용량의 PU-H71과 함께 CSN의 증가하는 억제를 모방할 수 있을 것이다.
하부 목적 2: CSN에 대한 DLBCL 의존성의 기전을 결정하기 위함
CSN은 CBM 복합체와 상호작용하고, 자극된 T-세포에서 IKK를 활성화시키는 것으로 나타났기 때문에, 본 발명자들은 CSN이 CBM과 상호작용하고, Bcl10을 안정화시키고, DLBCL에서 NF-κB를 활성화시키는 것으로 가정하였다.
실험 디자인 및 예상된 결과
DLBCL 세포 용해물을 전체 CSN 복합체를 효과적으로 침강시키는 CSN1에 대한 항체와 함께 배양할 것이다 (da Silva Correia et al., 2007; Wei and Deng, 1998). 침강된 CSN1 복합체는 SDS-PAGE에 의해서 분리시키고, CBM의 다양한 성분인 CARD11, BCL10, 및 MALT1에 대한 상업적으로 이용할 수 있는 항체를 사용하여 웨스턴 블럿에 의해 CBM 성분과의 상호작용에 대해 분석될 것이다. T 세포에서 보고된 실험을 기초로 하여, 본 발명자들은 ABC DLBCL에서의 만성 활성 BCR 시그날링으로 인하여, GCB DLBCL 세포주와는 대조적으로, CSN이 CARD11 및 MALT1과 우선적으로 상호작용하는 것으로 예상한다.
CSN, 특히 CSN5는 활성화된 T-세포에서 Bcl10 안정성 및 분해를 조절하는 것으로 나타났기 때문에, 본 발명자들은 CSN이 DLBCL에서 Bcl10을 안정화시키는 것으로 가정하였다. DLBCL 세포주는 상술한 바와 같이 CSN 서브유닛을 표적으로 하는 짧은 헤어핀 (sh)RNAs로 감염될 것이다. 세포는 CSN 서브유닛 녹다운을 유도하기 위해서 tet로 처리될 것이며, 감염 및 유도된 세포 내의 Bcl10 단백질 수준은 웨스턴 블럿에 의해서 정량화될 것이다. 본 발명자들은 Bcl10 수준이 용량-의존적 및 시간-의존적 방식으로 CSN 서브유닛 녹다운에 의해 분해될 것으로 예상한다. Bcl10 단백질의 감소가 세포 사망의 결과가 아님을 입증하기 위해서, 세포 생존도는 세포 용해 전에 트립판 블루로 생존 세포를 계수함으로써 측정될 것이다. Bcl10 분해가 CSN 제거의 특정한 효과임을 입증하기 위해서 CSN 서브유닛 녹다운은 프로테아좀 억제와 조합될 것이다.
CSN2 또는 CSN5의 녹다운은 DLBCL 세포주에서 NF-κB 활성을 폐지시키는 것으로 예상된다. 대조 shRNAs 또는 CSN2 또는 CSN5에 대한 shRNAs로 감염된 DLBCL 세포주를 사용하여, 대조 및 감염된 세포를 몇 가지 방법으로 NF-κB 활성에 대해서 시험할 것이다. 첫째로, 용해물을 웨스턴 블럿에 의해서 분석하여 IκBα 단백질의 수준을 결정할 것이다. 둘째로, NF-κB 서브유닛 p65 및 c-Rel의 핵 전좌는 용해된 세포의 핵 및 사이토졸 분획의 웨스턴 블럿에 의해서, 또는 대조 및 감염된 세포로부터의 핵의 플레이트-기본 EMSA에 의해서 측정될 것이다. 마지막으로, 이들 세포의 NF-κB 표적 유전자 발현은 각각 역전사효소 PCR (RT-PCR) 및 웨스턴 블럿에 의해 제조된 cDNA의 정량적 PCR에 의해서 전사물 및 단백질 수준에서 평가될 것이다.
대체 방법 및 위험
CSN은 TCR-자극된 T 세포에서 CBM과 상호작용하는 것으로 나타났기 때문에, 본 발명자들은 CSN이 DLBCL, 특히 ABC DLBCL에서 (이 서브타입이 만성 활성 BCR 시그날링을 나타내기 때문에) CBM과 상호작용할 것으로 예견한다. CSN-CBM 상호작용이 DLBCL에서 명백하지 않다면, 세포는 BCR 경로를 활성화시키고, CBM의 형성을 자극하기 위해서 IgM으로 자극될 것이다. CBM과의 CSN 상호작용의 동력학을 측정하기 위해서, 상술한 바와 같은 세포 IPs가 IgM 자극의 시점으로부터 시간 경과에 따라 수행될 것이다. CSN-CBM 상호작용과 CBM 형성의 동력학을 연관시키기 위해서, BCL10 IP를 수행하여 동일한 시간 경과에 따른 BCL10-CARD11 상호작용을 입증할 것이다.
결론 및 미래의 방향
DLBCL에 대한 새로운 치료법으로서 PU-H71의 개발은 유망하지만, 병용 치료가 더 강력하고, 덜 독성일 것 같다. PU-H71은 또한, Hsp90의 기질 단백질을 확인하기 위한 도구로서 사용될 수도 있다. 이 방법을 사용한 실험에서, BCR 경로 및 CSN가 DLBCL에서의 Hsp90의 기질로 확인되었다.
BCR은 DLBCL 종양 형성 및 생존에서 역할을 하며, 이 경로의 성분을 표적화하기 위한 노력은 성공적이었다. 본 발명자들은 PU-H71과 BCR 경로 성분의 억제를 조합하는 것은 더 강력하고, 덜 독성인 치료 방법일 것으로 예상한다. 세포 및 이종이식 모델에서 확인된 상승적 조합은 임상 실험에 대한 적용을 위해서 평가될 것이며, 궁극적으로는 환자 치료를 화학요법을 피하고 합리적으로 디자인된 표적화된 치료법 쪽으로 나아가게 할 것이다.
CSN은 암 및 NF-κB 활성화에 연루되어, 이것이 DLBCL에서의 우수한 표적일 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 CSN이 CBM 복합체, 촉진성 NF-κB 활성화 및 DLBCL 생존을 안정화시키는 것으로 가정하였다. 따라서, 본 발명자들은 Hsp90과 CSN의 조합된 억제가 DLBCL을 사멸시키는데 있어서 상승적으로 작용할 것으로 예견한다. 이들 연구는 새로운 치료학적 표적이 이 제안에 기술된 프로테오믹스 방법을 사용하여 확인될 수 있다는 원리의 증거로 작용할 것이다.
미래의 연구는 CSN을 표적으로 하는 화합물을 확인하고, 궁국적으로 CSN 억제제를 DLBCL에 대한 혁신적인 치료법으로 임상에 도입시키는 것일 것이다. CBM 안정화 및 NF-κB 활성화와 같은 CSN 억제의 하류 효과를 측정하는 것은 3 가지 약물의 추가적인 병용 약물 레지멘에 대한 새로운 기회를 드러낼 수 있다. 미래의 연구는 Hsp90, CSN 및 그의 하류 표적을 함께 억제하는 3 가지 약물의 병용 레지멘을 평가할 것이다.
본 연구에서 발견된 PU-H71과의 가장 효과적인 약물 조합은 확인된 효과적인 약물 조합의 광범한 임상 적용성을 입증하기 위해서 17-DMAG와 같이 임상 개발 중에 있는 다른 Hsp90 억제제를 사용하여 수행될 것이다.
비-호지킨 림프종의 가장 통상적인 형태인 DLBCL은 치유되지 않고 남아 있는 공격적인 질환이다. 본 발명에서 제안된 연구는 DLBCL 배후의 분자 기전에 대한 이해를 전진시키고, 환차 치료를 개선시킬 것이다.
여기에서, 본 발명자들은 아피겔 (Affi-Gel®) 10 비드에 부착된 퓨린, 퓨린-양 이속사졸 및 인다졸-4-온 화학적 클래스의 디자인 및 합성 (도 30, 32, 33, 35, 38)에 대해서, 및 비오티닐화된 퓨린, 퓨린-유사, 인다졸-4-온 및 이속사졸 화합물의 합성 (도 31, 36, 37, 39, 40)에 대해서 보고한다. 이들은 Hsp90 억제제의 뚜렷한 행동에 대한 분자 기준을 조사 및 이해하기 위한 화학적 도구이다. 이들은 또한, 결합된 클라이언트 단백질 및 공동-샤페론을 검사함으로써 Hsp90 종양 생물학을 더 잘 이해하기 위해서 사용될 수도 있다. 각각의 Hsp90 억제제에 의해서 가장 변조될 것 같은 Hsp90의 종양 특이적 클라이언트를 이해하는 것은 약동학적 마커의 더 나은 선택, 및 따라서 더 우수한 임상적 디자인을 유도할 것이다. 마지막은 아니지만, 이들 Hsp90 억제제들 간의 분자적 차이에 대한 이해는 가장 바람직한 임상 프로필을 갖는 Hsp90 억제제의 디자인을 유도할 수 있는 특징들을 확인하도록 한다.
Hsp90 프로브의 합성 방법
6.1. 일반적 사항
1H 및 13C NMR 스펙트럼은 브루커 (Bruker) 500 MHz 장치 상에서 기록되었다. 화학적 이동은 내부 표준물인 TMS로부터의 다운필드 (downfield) ppm 값으로 보고되었다. 1H 데이터는 다음과 같이 보고되었다: 화학적 이동, 다중성 (s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, br = 브로드, m = 다중선), 커플링 상수 (Hz), 통합. 13C 화학적 이동은 내부 표준물인 TMS로부터의 다운필드 ppm 값으로 보고되었다. 저해상 질량 스펙트럼은 전자스프레이 이온화 및 SQ 검출기를 갖는 Waters Acquity Ultra Performance LC 상에서 수득하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 PDA, MicroMass ZQ 및 ELSD 검출기 및 역상 칼럼 (Waters X-Bridge C18, 4.6 x 150 ㎜, 5 ㎛)을 갖는 워터스 자동정제 시스템 (Waters Autopurification system) 상에서 1.2 ㎖/분으로 10 분에 걸쳐 (a) H2O + 0.1% TFA 및 (b) CH3CN + 0.1% TFA, 5 내지 95% b의 구배를 사용하여 수행하였다. 칼럼 크로마토그래피는 230-400 메쉬 실리카겔 (EMD)을 사용하여 수행되었다. 모든 반응은 아르곤 보호 하에서 수행되었다. 아피겔 (Affi-Gel®) 10 비드는 Bio-Rad (Hercules, CA)로부터 구입하였다. EZ-Link® 아민-PEO3-비오틴은 Pierce (Rockford, Il)로부터 구입하였다. PU-H71 (He et al., 2006) 및 NVP-AUY922 (Brough et al., 2008)는 이전에 공개된 방법에 따라 합성하였다. GM은 Aldrich로부터 구입하였다.
6.2. 합성
6.2.1. 9-(3- 브로모프로필 )-8-(6- 요오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-6-아민 (2)
1 (He et al., 2006) (0.500 g, 1.21 mmol)을 DMF (15 ㎖)에 용해시켰다. Cs2CO3 (0.434 g, 1.33 mmol) 및 1,3-디브로모프로판 (1.22 g, 0.617 ㎖, 6.05 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 그 후, 추가의 Cs2CO3 (0.079 g, 0.242 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 45분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 잔류물을 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH:AcOH, 120:1:0.5 내지 80:1:0.5)하여 흰색 고체로서 0.226 g (35%)의 2를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 8.24 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.05 (s, 2H), 4.37 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.45 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.41 (m, 2H); MS (ESI): m/z 534.0/536.0 [M+H]+.
6.2.2. tert -부틸 6- 아미노헥실카바메이트 (3) (Hansen et al., 1982)
1,6-디아미노헥산 (10 g, 0.086 mol) 및 Et3N (13.05 g, 18.13 ㎖, 0.129 mol)을 CH2Cl2 (300 ㎖)에 현탁시켰다. CH2Cl2 (100 ㎖) 중의 디-tert-부틸 디카보네이트 (9.39 g, 0.043 mol)의 용액을 실온에서 90분에 걸쳐서 적가하고, 교반을 18 시간 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 분리 깔때기에 첨가하고, 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 크로마토그래피 [CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 70:1 내지 20:1]하여 7.1 g (76%)의 3을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 4.50 (br s, 1H), 3.11 (br s, 2H), 2.68 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.44 (s, 13H), 1.33 (s, 4H); MS (ESI): m/z 217.2 [M+H]+.
6.2.3. tert -부틸 6-(3-(6-아미노-8-(6- 요오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-9-일)프로필아미노)헥실카바메이트 (4)
DMF (7 ㎖) 중의 2 (0.226 g, 0.423 mmol) 및 3 (0.915 g, 4.23 mmol)을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 [CHCl3:MeOH:MeOH-NH3 (7N), 100:7:3]하여 0.255 g (90%)의 4를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.32 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 5.99 (s, 2H), 5.55 (br s, 2H), 4.57 (br s, 1H), 4.30 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.10 (m, 2H), 2.58 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.52 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.44 (s, 13H), 1.30 (s, 4H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 156.0, 154.7, 153.0, 151.6, 149.2, 149.0, 146.3, 127.9, 120.1, 119.2, 112.4, 102.3, 91.3, 79.0, 49.8, 46.5, 41.8, 40.5, 31.4, 29.98, 29.95, 28.4, 27.0, 26.7; HRMS (ESI) m/z [M+H]+, C26H37IN7O4S에 대한 계산치 670.1673; 실측치 670.1670; HPLC: t R = 7.02 분.
6.2.4. N 1 -(3-(6-아미노-8-(6- 요오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-9-일)프로필)헥산-1,6-디아민 (5)
4 (0.310 g, 0.463 mmol)를 15 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 크로마토그래피 [CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 20:1 내지 10:1]하여 0.37 g의 흰색 고체를 제공하였다. 이것을 물 (45 ㎖)에 용해시키고, 고체 Na2CO3를 pH ~12가 될 때까지 첨가하였다. 이것을 CH2Cl2 (4 x 50 ㎖)로 추출하고, 유기층을 합하여 물 (50 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켜 0.200 g (76%) of 5를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.33 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 5.99 (s, 2H), 5.52 (br s, 2H), 4.30 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.68 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.53 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.44 (s, 4H), 1.28 (s, 4H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 154.5, 152.6, 151.5, 150.0, 149.6, 147.7, 125.9, 119.7, 119.6, 113.9, 102.8, 94.2, 49.7, 46.2, 41.61, 41.59, 32.9, 29.7, 29.5, 27.3, 26.9; HRMS (ESI) m/z [M+H]+, C21H29IN7O2S에 대한 계산치, 570.1148; 실측치 570.1124; HPLC: t R = 5.68분.
6.2.5. PU-H71- 아피겔 10 비드 (6)
4 (0.301 g, 0.45 mmol)를 15 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 고압 하에서 밤새 건조시켰다. 이것을 DMF (12 ㎖)에 용해시키고, 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 25 ㎖의 아피겔 10 비드 (전세척됨, 3 x 50 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 225 ㎕의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 DMAP의 몇 개의 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 그 후, 2-메톡시에틸아민 (0.085 g, 97 ㎕, 1.13 mmol)을 첨가하고, 30 분 동안 진탕을 계속하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2:Et3N (9:1, 4 x 50 ㎖), DMF (3 x 50 ㎖), 펠츠 완충액 (3 x 50 ㎖) 및 i-PrOH (3 x 50 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드 6는 -80℃에서 i-PrOH (비드:i-PrOH (1:2), v/v) 중에 저장하였다.
6.2.6. PU-H71-비오틴 (7)
DMF (0.2 ㎖) 중의 2 (4.2 ㎎, 0.0086 mmol) 및 EZ-Link® 아민-PEO3-비오틴 (5.4 ㎎, 0.0129 mmol)을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 [CHCl3:MeOH-NH3 (7N), 5:1]하여 1.1 ㎎ (16%)의 7을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.30 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.73 (br s, 1H), 6.36 (br s, 1H), 6.16 (br s, 2H), 6.00 (s, 2H), 4.52 (m, 1H), 4.28-4.37 (m, 3H), 3.58-3.77 (m, 10H), 3.55 (m, 2H), 3.43 (m, 2H), 3.16 (m, 1H), 2.92 (m, 1H), 2.80 (m, 2H), 2.72 (m, 1H), 2.66 (m, 2H), 2.17 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.04 (m, 2H), 1.35-1.80 (m, 6H); MS (ESI): m/z 872.2 [M+H]+.
6.2.7. tert -부틸 6-(4-(5-(2,4- 비스 ( 벤질옥시 )-5- 이소프로필페닐 )-3-( 에틸카바모일 )이속사졸-4-일)벤질아미노)헥실카바메이트 (9)
AcOH (0.26 g, 0.25 ㎖, 4.35 mmol)를 8 (Brough et al., 2008) (0.5 g, 0.87 mmol), 3 (0.56 g, 2.61 mmol), NaCNBH3 (0.11 g, 1.74 mmol), CH2Cl2 (21 ㎖) 및 3 Å 분자체 (3 g)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 이것을 감압 하에서 농축시키고, 크로마토그래피 [CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 100:1 내지 60:1]하여 0.50 g (75%)의 9를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.19-7.40 (m, 12H), 7.12-7.15 (m, 2H), 7.08 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.81 (s, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.22 (m, 2H), 3.10 (m, 3H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.41-1.52 (m, 13H), 1.28-1.35 (m, 4H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.04 (d, J = 6.9 Hz, 6H); MS (ESI): m/z 775.3 [M+H]+.
6.2.8. 4-(4-((6- 아미노헥실아미노 ) 메틸 )페닐)-5-(2,4- 디하이드록시 -5- 이소프로필페닐 )-N-에틸이속사졸-3-카복사미드 (10)
CH2Cl2 (20 ㎖) 중의 9 (0.5 g, 0.646 mmol)의 용액에 BCl3의 용액 (1.8 ㎖, 1.87 mmol, CH2Cl2 중의 1.0 M)을 첨가하고, 이것을 실온에서 10 시간 동안 교반하였다. 포화 NaHCO3를 첨가하고, CH2Cl2를 감압 하에서 증발시켰다. 물을 조심해서 따라내고, 남아 있는 황색 침전을 EtOAc 및 CH2Cl2로 몇 회 세척하여 0.248 g (78%)의 10을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.94 (s, 1H), 6.25 (s, 1H), 3.74, (s, 2H), 3.41 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 3.08 (m, 1H), 2.65 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.40-1.56 (m, 4H), 1.28-1.35 (m, 4H), 1.21 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 1.01 (d, J = 6.9 Hz, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 168.4, 161.6, 158.4, 157.6, 155.2, 139.0, 130.5, 129.5, 128.71, 128.69, 127.6, 116.0, 105.9, 103.6, 53.7, 49.2, 41.8, 35.0, 32.7, 29.8, 27.6, 27.2, 26.4, 22.8, 14.5; HRMS (ESI) m/z [M+H]+, C28H39N4O4에 대한 계산치 495.2971; 실측치 495.2986; HPLC: t R = 6.57분.
6.2.9. NVP - AUY922 - 아피겔 10 비드 (11)
10 (46.4 ㎎, 0.094 mmol)을 DMF (2 ㎖)에 용해시키고, 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 5 ㎖의 아피겔 10 비드 (사전세척됨, 3 x 8 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 45 ㎕의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 DMAP의 몇 개의 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 그 후, 2-메톡시에틸아민 (17.7 ㎎, 21 ㎕, 0.235 mmol)을 첨가하고, 30 분 동안 진탕을 계속하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2 (3 x 8 ㎖), DMF (3 x 8 ㎖), 펠츠 완충액 (3 x 8 ㎖) 및 i-PrOH (3 x 8 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드 11는 -80℃에서 i-PrOH (비드:i-PrOH, (1:2), v/v) 중에 저장하였다.
6.2.10. N'-(3,3-디메틸-5- 옥소사이클로헥실리덴 )-4- 메틸벤젠설포노하이드라지드 (14) (Hiegel & Burk, 1973)
10.00 g (71.4 mmol)의 디메돈 (13), 13.8 g (74.2 mmol)의 토실 하이드라지드 (12) 및 p-톨루엔 설폰산 (0.140 g, 0.736 mmol)을 톨루엔 (600 ㎖)에 현탁시키고, 이것을 1.5 시간 동안 교반하면서 환류시켰다. 아직 뜨거울 때에 반응 혼합물을 여과하고, 고체를 톨루엔 (4 x 100 ㎖), 빙냉 에틸 아세테이트 (2 x 200 ㎖) 및 헥산 (2 x 200 ㎖)으로 세척하고, 건조시켜 고체로서 19.58 g (89%)의 14를 제공하였다. TLC (100% EtOAc) Rf = 0.23; 1H NMR (DMSO-d 6 ) δ 9.76 (s, 1H), 8.65 (br s, 1H), 7.69 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 5.05 (s, 1H), 2.39 (s, 3H), 2.07 (s, 2H), 1.92 (s, 2H), 0.90 (s, 6H); MS (ESI): m/z 309.0 [M+H]+.
6.2.11. 6,6-디메틸-3-( 트리플루오로메틸 )-6,7- 디하이드로 -1H- 인다졸 -4(5H)-온 (15)
THF (90 ㎖) 및 Et3N (30 ㎖) 중의 5.0 g (16.2 mmol)의 14에 트리플루오로아세트산 무수물 (3.4 g, 2.25 ㎖, 16.2 mmol)을 한꺼번에 첨가하였다. 생성된 적색 용액을 3시간 동안 55℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 메탄올 (8 ㎖) 및 1 M NaOH (8 ㎖)를 첨가하고, 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 25 ㎖의 포화 NH4Cl로 희석하고, 분리 깔때기에 붓고, EtOAc (3 x 50 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 염수 (3 x 50 ㎖)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 적색 오일상 잔류물을 제공하고, 이것을 크로마토그래피 (헥산:EtOAc, 80:20 내지 60:40)하여 오렌지색 고체로서 2.08 g (55%)의 15를 제공하였다. TLC (헥산:EtOAc, 6:4) Rf = 0.37; 1H NMR (CDCl3) δ 2.80 (s, 2H), 2.46 (s, 2H), 1.16 (s, 6H); MS (ESI): m/z 231.0 [M-H]-.
6.2.12. 2- 브로모 -4-(6,6-디메틸-4-옥소-3-( 트리플루오로메틸 )-4,5,6,7- 테트라하이드로 -1H-인다졸-1-일)벤조니트릴 (16)
DMF (8 ㎖) 중의 15 (0.100 g, 0.43 mmol) 및 NaH (15.5 ㎎, 0.65 mmol)의 혼합물에 2-브로모-4-플루오로벤조니트릴 (86 ㎎, 0.43 mmol)을 첨가하고, 90℃에서 5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 (헥산:EtOAc, 10:1 내지 10:2)하여 흰색 고체로서 0.162 g (91%)의 16을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.97 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 1H), 2.89 (s, 2H), 2.51 (s, 2H), 1.16 (s, 6H); MS (ESI): m/z 410.0/412.0 [M-H]-.
6.2.13. 2-( 트랜스 -4- 아미노사이클로헥실아미노 )-4-(6,6-디메틸-4-옥소-3-(트리플루오로메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인다졸-1-일)벤조니트릴 (17)
1,2-디메톡시에탄 (15 ㎖) 중의 16 (0.200 g, 0.485 mmol), NaOtBu (93.3 ㎎, 0.9704 mmol), Pd2(dba)3 (88.8 ㎎, 0.097 mmol) 및 DavePhos (38 ㎎, 0.097 mmol)의 혼합물을 탈기시키고, 아르곤으로 몇 회 플러시하였다. 트랜스-1,4-디아미노사이클로헥산 (0.166 g, 1.456 mmol)을 첨가하고, 플라스크를 다시 탈기시키고, 아르곤으로 플러시한 후에 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 10:1)에 의해서 정제하여 52.5 ㎎ (24%)의 17을 제공하였다. 추가로, 38.5 ㎎ (17%)의 아미드 18을 분리시켜 총 수율은 41%였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.51 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 8.3, 1.8 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.38 (m, 1H), 2.84 (s, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.49 (s, 2H), 2.15 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 1.99 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 1.25-1.37 (m, 4H), 1.14 (s, 6H); MS (ESI): m/z 446.3 [M+H]+.
6.2.14. 2-( 트랜스 -4- 아미노사이클로헥실아미노 )-4-(6,6-디메틸-4-옥소-3-(트리플루오로메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인다졸-1-일)벤즈아미드 (18)
DMSO (147 ㎕), EtOH (590 ㎕), 5 N NaOH (75 ㎕) 및 H2O2 (88 ㎕) 중의 17 (80 ㎎, 0.18 mmol)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 정제용 TLC [CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 10:1]에 의해서 정제하여 64.3 ㎎ (78%)의 18을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.06 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.60 (br s, 2H), 3.29 (m, 1H), 2.85 (s, 2H), 2.77 (m, 1H), 2.49 (s, 2H), 2.13 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 1.95 (d, J = 11.8 Hz, 2H), l.20-1.42 (m, 4H), 1.14 (s, 6H); MS (ESI): m/z 464.4 [M+H]+; HPLC: t R = 7.05 분.
6.2.15. tert -부틸 6-( 트랜스 -4-(2-카바모일-5-(6,6-디메틸-4-옥소-3-(트리플루오로메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인다졸-1-일)페닐아미노)사이클로헥실아미노)-6-옥소헥실카바메이트 (19)
CH2Cl2 (1 ㎖) 중의 18 (30 ㎎, 0.0647 mmol)의 혼합물에 6-(Boc-아미노)카프로산 (29.9 ㎎, 0.1294 mmol), EDCI (24.8 ㎎, 0.1294 mmol) 및 DMAP (0.8 ㎎, 0.00647 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한 다음에, 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 정제용 TLC [헥산:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3 (7N), 2:2:1:0.5]에 의해서 정제하여 40 ㎎ (91%)의 19를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.31 (m, 1H), 3.06 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.88 (s, 2H), 2.50 (s, 2H), 2.15 (m, 4H), 2.03 (d, J = 11.5 Hz, 2H), 1.62 (m, 2H), l.25-1.50 (m, 17H), 1.14 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 191.5, 174.1, 172.3, 157.2, 151.5, 150.3, 141.5, 140.6 (q, J = 39.4 Hz), 130.8, 120.7 (q, J = 268.0 Hz), 116.2, 114.2, 109.5, 107.3, 79.5, 52.5, 50.7, 48.0, 40.4, 37.3, 36.4, 36.0, 31.6, 31.3, 29.6, 28.5, 28.3, 25.7, 25.4; HRMS (ESI) m/z [M+Na]+ C34H47F3N6O5Na에 대한 계산치 699.3458; 실측치 699.3472; HPLC: t R = 9.10분.
6.2.16. 2-( 트랜스 -4-(6-아미노헥산아미도)사이클로헥실아미노)-4-(6,6-디메틸-4-옥소-3-(트리플루오로메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인다졸-1-일)벤즈아미드 (20)
19 (33 ㎎, 0.049 mmol)를 1 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 정제용 TLC [CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 6:1]에 의해서 정제하여 24 ㎎ (86%)의 20을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 3.74 (m, 1H), 3.36 (m, 1H), 2.92 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.91 (s, 2H), 2.51 (s, 2H), 2.23 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.18 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 2.00 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 1.61-1.75 (m, 4H), l.34-1.50 (m, 6H), 1.15 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, MeOH-d 4 ) δ 191.2, 173.6, 172.2, 151.8, 149.7, 141.2, 139.6 (q, J = 39.5 Hz), 130.3, 120.5 (q, J = 267.5 Hz), 115.5, 114.1, 109.0, 106.8, 51.6, 50.0, 47.8, 39.0, 36.3, 35.2, 35.1, 31.0, 30.5, 26.8, 26.7, 25.4, 24.8; HRMS (ESI) m/z [M+H]+ C29H40F3N6O3에 대한 계산치 577.3114; 실측치 577.3126; HPLC: t R = 7.23 분.
6.2.17. SNX -2112- 아피겔 10 비드 (21)
19 (67 ㎎, 0.0992 mmol)를 3.5 ㎖의 CH2Cl2:TFA (4:1)에 용해시키고, 용액을 실온에서 20 분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 고 진공 하에서 2 시간 동안 건조시켰다. 이것을 DMF (2 ㎖)에 용해시키고, 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 5 ㎖의 아피겔 10 비드 (사전세척됨, 3 x 8 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 45 ㎕의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 DMAP의 몇 개의 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 그 후, 2-메톡시에틸아민 (18.6 ㎎, 22 ㎕, 0.248 mmol)을 첨가하고, 30 분 동안 진탕을 계속하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2 (3 x 8 ㎖), DMF (3 x 8 ㎖) 및 i-PrOH (3 x 8 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드 21은 -80℃에서 i-PrOH (비드:i-PrOH, (1:2), v/v) 중에 저장하였다.
6.2.18. N - Fmoc - 트랜스 -4- 아미노사이클로헥산올 (22) (Crestey et al., 2008)
디옥산:물 (26:6.5 ㎖) 중의 트랜스-4-아미노사이클로헥산올 하이드로클로라이드 (2.0 g, 13.2 mmol)의 용액에 Et3N (1.08 g, 1.49 ㎖, 10.7 mmol)을 첨가하고, 이것을 10 분 동안 교반하였다. 그 후, Fmoc-OSu (3.00 g, 8.91 mmol)를 5 분에 걸쳐서 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 ~5 ㎖로 농축시킨 다음에, 약간의 CH2Cl2를 첨가하였다. 이것을 여과하고, 고체를 H2O (4 x 40 ㎖)로 세척한 다음에 건조시켜 흰색 고체로서 2.85 g (95%)의 22를 제공하였다. 여액을 CH2Cl2 (2 x 100 ㎖)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 제거함으로써 추가로 0.100 g (3%)의 22를 수득하여 조합 수율은 98%였다. TLC (헥산:EtOAc, 20:80) Rf = 0.42; 1H NMR (CDCl3) δ 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 4.54 (br s, 1H), 4.40 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.61 (m, 1H), 3.48 (m, 1H), 1.9-2.1 (m, 4H), 1.32-1.48 (m, 2H), 1.15-1.29 (m, 2H); MS (ESI): m/z 338.0 [M+H]+.
6.2.19. N - Fmoc - 트랜스 -4- 아미노사이클로헥산올 테트라하이드로피라닐 에테르 (23)
1.03 g (3.05 mmol)의 22 및 0.998 g (1.08 ㎖, 11.86 mmol)의 3,4-디하이드로-2H-피란 (DHP)을 디옥산 (10 ㎖)에 현탁시켰다. 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 (0.153 g, 0.61 mmol)를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 교반하였다. 1 시간 후에, 추가의 DHP (1.08 ㎖, 11.86 mmol) 및 디옥산 (10 ㎖)을 첨가하고, 교반을 계속하였다. 9 시간 후에, 추가의 DHP (1.08 ㎖, 11.86 mmol)를 첨가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 생성된 용액을 농축시키고, 잔류물을 크로마토그래피 (헥산:EtOAc, 75:25 내지 65:35)하여 흰색 고체로서 1.28 g (100%)의 23을 제공하였다. TLC (헥산:EtOAc, 70:30) Rf = 0.26; 1H NMR (CDCl3) δ 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.31 (dt, J = 7.5, 1.1 Hz, 2H), 4.70 (m, 1H), 4.56 (m, 1H), 4.40 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.45-3.53 (m, 2H), 1.10-2.09 (m, 14H); MS (ESI): m/z 422.3 [M+H]+.
6.2.20. 트랜스 -4- 아미노사이클로헥산올 테트라하이드로피라닐 에테르 (24)
1.28 g (3.0 mmol)의 23을 CH2Cl2 (20 ㎖)에 용해시키고, 피페리딘 (2 ㎖)을 첨가하고, 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 크로마토그래피 [CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N), 80:1 내지 30:1]에 의해서 정제하여 서서히 결정화하는 오일상 잔류물로서 0.574 g (96%)의 24를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 4.70 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.49 (m, 1H), 2.69 (m, 1H), 1.07-2.05 (m, 14H); MS (ESI): m/z 200.2 [M+H]+.
6.2.21. 4-(6,6-디메틸-4-옥소-3-(트리플루오로메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인다졸-1-일)-2-( 트랜스 -4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)사이클로헥실아미노)벤조니트릴 (25)
1,2-디메톡시에탄 (20 ㎖) 중의 16 (0.270 g, 0.655 mmol), NaOtBu (0.126 g, 1.31 mmol), Pd2(dba)3 (0.120 g, 0.131 mmol) 및 DavePhos (0.051 g, 0.131 mmol)의 혼합물을 탈기시키고, 아르곤으로 수회 플러시하였다. 24 (0.390 g, 1.97 mmol)를 첨가하고, 플라스크를 다시 탈기시키고, 아르곤으로 플러시한 후에 반응 혼합물을 60℃에서 3.5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 정제용 TLC [헥산:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3 (7N), 7:6:3:1.5]에 의해서 정제하여 97.9 ㎎ (28%)의 25를 제공하였다. 추가로, 60.5 ㎎ (17%)의 아미드 26을 분리시켜 총 수율은 45%였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.52 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 8.3, 1.8 Hz, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.40 (m, 1H), 2.84 (s, 2H), 2.49 (s, 2H), 2.06-2.21 (m, 4H), 1.30-1.90 (m, 10H), 1.14 (s, 6H); MS (ESI): m/z 529.4 [M-H]-.
6.2.22. 4-(6,6-디메틸-4-옥소-3-(트리플루오로메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인다졸-1-일)-2-( 트랜스 -4-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)사이클로헥실아미노)벤즈아미드 (26)
DMSO (220 ㎕), EtOH (885 ㎕), 5 N NaOH (112 ㎕) 및 H2O2 (132 ㎕) 중의 25 (120 ㎎, 0.2264 mmol)의 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 그 후, 30 ㎖의 염수를 첨가하고, 이것을 EtOAc (5 x 15 ㎖)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 정제용 TLC [헥산:CH2Cl2: EtOAc:MeOH-NH3 (7N), 7:6:3:1.5]에 의해서 정제하여 102 ㎎ (82%)의 26을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.13 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.68 (br s, 2H), 4.72 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.70 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 2.85 (s, 2H), 2.49 (s, 2H), 2.05-2.19 (m, 4H), 1.33-1.88 (m, 10H), 1.14 (s, 6H); MS (ESI): m/z 547.4 [M-H]-.
6.2.23. 4-(6,6-디메틸-4-옥소-3-( 트리플루오로메틸 )-4,5,6,7- 테트라하이드로 -1H-인다졸-1-일)-2-( 트랜스 -4-하이드록시사이클로헥실아미노)벤즈아미드 ( SNX -2112)
EtOH (4.5 ㎖) 중의 26 (140 ㎎, 0.255 mmol) 및 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 (6.4 ㎎, 0.0255 mmol)를 65℃에서 17시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 정제용 TLC [헥산:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3 (7N), 2:2:1:0.5]에 의해서 정제하여 101 ㎎ (85%)의 SNX -2112를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.10 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H), 5.97 (br s, 2H), 3.73 (m, 1H), 3.35 (m, 1H), 2.85 (s, 2H), 2.48 (s, 2H), 2.14 (d, J = 11.8 Hz, 2H), 2.04 (d, J = 11.1 Hz, 2H), 1.33-1.52 (m, 4H), 1.13 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 191.0, 171.9, 151.0, 150.0, 141.3, 140.3 (q, J = 39.6 Hz), 130.4, 120.3 (q, J = 270.2 Hz), 115.9, 113.7, 109.2, 107.1, 69.1, 52.1, 50.2, 40.1, 37.0, 35.6, 33.1, 30.2, 28.0; MS (ESI): m/z 463.3 [M-H]-, 465.3 [M+H]+; HPLC: t R = 7.97분.
6.2.24. 대조 비드의 제조
DMF (8.5 ㎖)를 고체상 펩타이드 합성 용기 내의 20 ㎖의 아피겔 10 비드 (사전세척됨, 3 x 40 ㎖ DMF)에 첨가하였다. 2-메톡시에틸아민 (113 ㎎, 129 ㎕, 1.5 mmol) 및 DMAP의 몇 개의 결정을 첨가하고, 이것을 실온에서 2.5시간 동안 진탕하였다. 그 후, 용매를 제거하고, 비드를 매회 CH2Cl2 (4 x 35 ㎖), DMF (3 x 35 ㎖), 펠츠 완충액 (2 x 35 ㎖) 및 i-PrOH (4 x 35 ㎖)로 10 분 동안 세척하였다. 비드는 -80℃에서 i-PrOH (비드:i-PrOH (1:2), v/v) 중에 저장하였다.
6.3. 경쟁 시험
경쟁 시험을 위해서, 형광 분극화 (FP) 시험을 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다 (Du et al., 2007). 간단하게, FP 측정은 아날리스트 (Analyst) GT 장치 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 상에서 수행되었다. 측정은 흑색 96-웰 미량역가 플레이트 (Corning # 3650)에서 이루어졌으며, 여기에서 여기 및 방출 둘 다는 웰의 상부로부터 일어났다. 10 μM GM-cy3B의 저장물을 DMSO 중에서 제조하고, 펠츠 완충액 (0.1 ㎎/㎖ BGG를 갖는 20 mM Hepes (K), pH 7.3, 50 mM KCl, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2, 20 mM Na2MoO4, 및 0.01% NP40)으로 희석하였다. 각각의 96-웰에 최종 용적 100 ㎕ HFB 완충액 중의 6 nM 형광성 GM (GM-cy3B), 3 ㎍ SKBr3 용해물 (총 단백질), 및 시험된 억제제 (DMSO 중의 초기 저장물)를 첨가하였다. 약물을 삼중으로 웰에 첨가하였다. 각각의 시험을 위해서, 배경 웰 (완충액 단독), 추적자 (tracer) 대조군 (유리됨, 형광성 GM 단독) 및 결합된 GM 대조군 (SKBr3 용해물 존재 하의 형광성 GM)이 각각의 시험 플레이트 상에 포함되었다. GM이 양성 대조군으로 사용되었다. 시험 플레이트는 4℃에서 24시간 동안 진탕기 상에서 배양하였으며, mP에서의 FP 값이 측정되었다. Hsp90에 결합된 추적자의 분획을 mP 값에 연관시키고, 경쟁자 농도의 값에 대비하여 플롯팅하였다. 결합된 GM의 50%를 대체한 억제제 농도는 데이터를 핏팅 (fitting)함으로써 수득되었다. 모든 실험 데이터는 SOFTmax Pro 4.3.1을 사용하여 분석하였으며, Prism 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하여 플롯팅하였다.
6.4. 화학적 침강, 웨스턴 블럿팅 및 유동 세포분석
백혈병 세포주 K562 및 MV4-11 및 유방암 세포주 MDA-MB-468는 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다. 세포를 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충되고, 37℃에서 5% CO2의 가습 대기 하에서 유지된 RPMI (K562), 이스코브 변형된 둘베코 배지 (MV4-11) 또는 DME/F12 (MDA-MB-468) 중에서 배양하였다. 세포는 이들을 10 ㎍/㎕의 프로테아제 억제제 (류펩틴 및 아프로티닌)가 첨가된 펠츠 완충액 (HEPES 20 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, NP40 0.01%, 신선하게 제조된 Na2MoO4 20 mM, pH 7.2-7.3) 중에서 수거하고, 이어서 3 회의 연속적인 동결 (드라이 아이스 중에서) 및 해동 단계를 수행함으로써 용해시켰다. 총 단백질 농도는 제조자의 설명에 따라 BCA 키트 (Pierce)를 사용하여 측정되었다.
Hsp90 억제제 비드 또는 아가로즈 비드에 컨주게이트된 Hsp90 불활성 화학물질 (2-메톡시에틸아민)을 함유하는 대조 비드를 용해 완충액 중에서 3 회 세척하였다. 그 후, 비드 컨주게이트 (80 ㎕ 또는 지시된 바와 같음)를 세포 용해물 (250 ㎍)과 함께 4℃에서 밤새 배양하고, 용적을 용해 완충액에 의해서 200-300 ㎕로 조정하였다. 배양 후에, 비드 컨주게이트를 용해 완충액으로 5 회 세척하고, 이하에 나타낸 바와 같이 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다.
PU-H71에 의한 처리를 위해서, 세포를 60-70% 합류 (confluence)하도록 성장시키고, 24시간 동안 억제제 (5 μM)로 처리하였다. 단백질 용해물은 50 mM 트리스 pH 7.4, 150 mM NaCl 및 1% NP-40 용해 완충액 중에서 제조되었다.
웨스턴 블럿팅을 의해서, 단백질 용해물 (10-50 ㎍)을 SDS/PAGE에 의해서 전기영동적으로 분해시키고, 니트로셀룰로즈 막에 옮기고, Hsp90(1:2000, SMC-107A/B, StressMarq), 항-IGF-IR (1:1000, 3027, Cell Signaling) 및 항-c-키트 (1:200, 612318, BD Transduction Laboratories)에 대한 일차 항체로 프로브화하였다. 그 후, 막을 상응하는 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨주게이트된 이차 항체의 1:3000 희석액과 함께 배양하였다. 검출은 제조자의 설명에 따라 ECL-증진된 화학발광 검출 시스템 (ECL-Enhanced Chemiluminescence Detection System (Amersham Biosciences)을 사용하여 수행되었다.
세포 표면 Hsp90에 대한 PU-H71의 결합을 검출하기 위해서, 500,000 세포/㎖의 MV4-11 세포를 지시된 농도의 PU-H71-비오틴 또는 대조군으로서 D-비오틴과 함께 37℃에서 2 시간 동안 배양하고, 이어서 FACS 완충액 (PBS + 0.5% FBS) 중의 피코에리트린 (PE) 컨주게이트된 스트렙타비딘 (SA) (BD Biosciences)으로 4℃에서 30 분 동안 염색하였다. 그 후, 세포를 BD-LSRII 유동 세포분석기를 사용하여 분석하였다. 평균 형광 강도 (MFI)를 사용하여 세포에 대한 PU-H71-비오틴의 결합을 계산하고, 값을 SA=PE에 의해서 염색된 비처리 세포의 MFI에 대해서 표준화하였다.
6.5. 도킹
분자 도킹 계산은 글리드 (Glide) 5.0 (Schrodinger)을 사용하여 Ubuntu 8.10 작동 시스템과 함께 HP 워크스테이션 (workstation) xw8200 상에서 수행하였다. 결합된 억제제 PU-H71 (PDB ID: 2FWZ), NVP-AUY922 (PDB ID: 2VCI) 및 27 (PDB ID: 3D0B)과의 Hsp90 복합체의 코디네이트 (coordinates)는 RCSB Protein Data Bank로부터 다운로드하였다. 실험을 위해서, 화합물 PU-H71, NVP-AUY922, 5, 10, 20 및 27을 최급강하 (steepest descent)를 갖는 OPLS-AA (Optimized Potentials for Liquid Simulations-All Atom) 힘의 장 (force field) (Jorgensen et al., 1996)을 사용하여 최적화된 기하학 및 Maestro 8.5의 단편 사전 (fragment dictionary)을 사용하고, 이어서 Macromodel 9.6에서 실행된 절단된 뉴톤 (Newton) 컨주게이트 구배 프로토콜을 사용하여 제작하였으며, Schrodinger LLC에 의해서 제공된 LigPrep 2.2 유틸리티의 디폴트 파라메터 (default parameters )를 사용한 리간드 제조에 더 적용하였다. 각각의 단백질을 Schrodinger LLC에 의해서 제공된 단백질 제조 위자드 (Protein Preparation Wizard)를 사용하여 후속 그리드 생성 및 도킹에 대해서 최적화되었다. 이 도구를 사용하여, 수소 원자를 단백질에 첨가하고, 결합 차수를 지정하고, 리간드 결합에 중요한 것으로 생각되지 않는 결정화의 물 분자를 제거하고, 전체 단백질을 최소화하였다. 단백질에 대한 부분적 원자 전하를 OPLS-2005 힘의 장에 따라 지정하였다. 다음으로, 그리드는 글리드 (Glide)에서 수용체 그리드 생성 도구 (Receptor Grid Generation tool)를 사용하여 제조하였다. 준비되어 있는 각각의 결합된 억제제와 함께 워크스페이스 (workspace) 리간드의 센트로이드 (centroid)를 선택하여 그리드 박스(grid box)를 정의하였다. 크기가 유사한 리간드를 워크스페이스 리간드에 도킹시키는 옵션이 그리드 크기를 결정하기 위해서 선택되었다.
다음으로, 추가 정밀성 (extra precision) (XP) 글리드 도킹 방법을 사용하여 화합물 PU-H71 및 5 (2FWZ에 대해), NVP-AUY922 및 10 (2VCI에 대해), 및 20 및 27 (3D0B에 대해)을 그들의 각각의 결합 부위에 유연하게 도킹시켰다. 비록 글리드에 의해서 사용된 방법에 대한 상세한 내용이 다른 곳에 기술되어 있지만 (Patel et al., 2008; Friesner et al., 2004; Halgren et al., 2004), 사용된 파라메터에 대한 간단한 설명이 이하에 제공된다. 반 데어 발스 (van der Waals) 반경에 대한 스케일 인자 (scale factor)의 디폴트 셋팅을 각각 리간드 및 단백질에 대해 0.15 (스케일 인자 0.8) 또는 그 미만의 절대 부분 전하 및 0.25 (스케일 인자 1.0)의 전자를 갖는 이들 원자에 적용하였다. 도킹 실시에 대한 제약은 정의되지 않았다. 각각의 도킹 계산이 완료되면, 리간드당 최대 100 포즈 (poses)가 생성되도록 허용되었다. 글리드 점수측정 기능 (Eldridge et al., 1997)에 기초한 높은 점수의 도킹 포즈가 본 발명자들의 분석을 위해서 사용되었다. XP 글리드 도킹 절차를 입증하기 위해서, 결정학적 결합된 억제제 (PU-H71 또는 NVP-AUY922 또는 27)를 결합 부위로부터 추출하고, 그의 각각의 결합 부위에 재도킹시켰다. 여기에서는 도킹 시에 억제제의 국재화와 0.098 Å (2FWZ), 0.313 Å (2VCI) 및 0.149 Å (3D0B) 근평균평방편차 (root mean square deviations)로부터 입증되는 바와 같은 결정 구조 사이에 탁월한 일치가 있었다. 따라서, 본 시험은 Hsp90 억제제에 대해 실험적으로 관찰된 결합 모드를 재현하는데 있어서 글리드의 높은 도킹 신뢰성을 시사하며, 글리드 도킹을 위해서 설정된 파라메터는 X-선 구조를 합리적으로 재현한다.
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[표 8] SKBr3 세포 추출물로부터의 Hsp90에 대한 결합 친화성
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Claims (77)

  1. 브루톤 티로신 키나제 (BTK) 억제제와 함께 대상체에 공동-투여되는 PU-H71을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 약제학적 제제.
  2. PU-H71과 대상체에 공동-투여되는 BTK 억제제를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 약제학적 제제.
  3. PU-H71 및 BTK 억제제를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 약제학적 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PU-H71 및 BTK 억제제가 동시에, 수반하여, 순차적으로, 또는 보조적으로 공동-투여되는 것인, 약제학적 제제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PU-H71 및 BTK 억제제가 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제제화되는 것인, 약제학적 제제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 PU-H71을 받았거나 받고 있는 중인, 약제학적 제제.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 BTK 억제제를 받았거나 받고 있는 중인, 약제학적 제제.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, BTK 억제제가 PCI-32765인 것인, 약제학적 제제.

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