KR102191923B1 - 글루크론산 전이 효소, 이를 암호화하는 유전자 및 이의 이용 방법 - Google Patents
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Abstract
안정적, 지속적이고 그리고 대량으로 글리시리진(glycyrrhizin)를 제공하기 위해, 글리시리진 합성 과정에 관여하는 효소, 상기 효소 유전자 및 이의 이용 방법을 제공하는 것이다.
오레아난 형(oleanane-type) 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에서 글루크론산의 2 위치의 히드록시기에 글루크론산을 추가로 전이하는 활성을 갖는 글루크론산 전이 효소를 식별하고 상기 효소, 이의 유전자 및 그 이용 방법을 제공한다.
오레아난 형(oleanane-type) 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에서 글루크론산의 2 위치의 히드록시기에 글루크론산을 추가로 전이하는 활성을 갖는 글루크론산 전이 효소를 식별하고 상기 효소, 이의 유전자 및 그 이용 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 오레아난(oleanane) 형 트리테르페노이드 모노글루쿠로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에 글루크론산(glucuronic acid)을 전이하는 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자 및 상기 효소 또는 유전자의 이용 방법에 관한 것이다.
콩과의 다년생 초본 식물인 감초 속(Glychyrrhiza 속) 식물은 한방에서 중요한 생약으로 알려져 있으며, 세계적으로 널리 이용되고 있다. 이 식물 생약으로 이용되는 부분은 주로 뿌리 부분과 줄기(stolon: 지하경)이다. 이러한 부분에 포함된 주요 활성 성분은 글리시리진(glycyrrhizin)임을 G. uralensis, G. glabra 및 G. inflata을 이용한 성분 분석에서 밝혀지고 있다(비특허문헌 1). 글리시리진(glycyrrhizin)은 오레아난 형 트리테르페노이드 사포닌에 속하는 단맛 물질이며, 그 생약학적 및 약리학적 유용성에서 다양한 연구가 이루어지고 있다.
의약품으로 고품질 글리시리진(glycyrrhizin)을 생물 생산 체계에 의해 안정적이고 지속적으로 제공하기 위해서는, 글리시리진(glycyrrhizin) 합성 과정에 관여하는 유전자와 그 유전자의 발현량을 마커로 이용하여 최적 생산 조건의 확립, 글리시리진 고생산 주식의 선발 또는 합성 효소 유전자의 도입에 의한 글리시리진 고생산 식물 육종 등을 할 필요가 있다. 그러기 위해서는 글리시리진 합성 과정에 관여하는 유전자 군의 분류가 필수적이다.
글리시리진(glycyrrhizin)은 식물에 공통으로 포함되는 β-아미린을 출발 물질로 두 단계의 산화 반응 및 2 단계 높은 당화 반응에 의해 생합성된다고 생각할 수 있다. β-아미린은 오레아난 형 트리테르페노이드에 속하는 트리테르페노이드 사포닌 합성 과정에서 글리시리진(glycyrrhizin)와 소야사포닌(soyasaponin)의 생합성 분기점이 되는 전구체 물질이다(도 1). 본 발명자들은 지금까지 β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)에 이르는 경로의 합성 효소로 글리시리진(glycyrrhizin)의 어글리콘(비당부)인 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid)을 β-아미린에서 생합성하는 상기 2 단계의 산화 반응을 촉매하는 2 종의 산화 효소 CYP88D6 (특허 문헌 1) 및 CYP72A154 (특허 문헌 2)를 분리하였다(도 2). 하지만 글리시레틴산에서 두 단계 높은 당화 반응을 촉매하고 글리시리진을 생합성하는 합성 효소 유전자는 지금까지 전혀 밝혀지지 않았다.
비특허문헌 1 Gibson, M.R., 1978, Lloydia-the journal of Natural Products, 41(4): 348-354
본 발명의 과제는 글리시리진(glycyrrhizin)를 비롯한 오레아난 형 트리테르페노이드 디글루쿠로나이드(triterpenoid diglucuronide)를 생물 생산 체계에 의해 안정적이고 지속적으로 제공하기 위해 오레아난 형 트리테르페노이드 디글루쿠로나이드 합성 과정에서 오레아난 형 트리테르페노이드에 탕에 전이 활성을 갖는 당 전이 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 동정하고 상기 효소, 이의 유전자 및 이의 이용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭 한 결과, 아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)에 이르기 합성 과정에서 두 번째 단계의 배당화 반응을 촉매하는 효소, 즉 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드를 전이하는 새로운 당 전이 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 분리하는 데 성공했다. 구체적으로는 콩과 식물에서 mRNA를 조제한 후 cDNA library를 제작하고 EST 분석을 실시했다. 상기 생합성 경로에서 당 전이 효소가 관계하고 있다고 예상하고 공지의 당 전이 효소 유전자의 염기 서열을 이용하여 상기 cDNA 라이브러리를 검색하고 후보 유전자를 좁힌. 각 후보 유전자에 대한 유전자 발현 분석한 후 원하는 활성을 가지며 줄기과 뿌리 부분에서 고발현하는 유전자를 동정함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본원은 다음의 발명을 제공한다.
(1) 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide) 에서 글루크론산(glucuronic acid)의 2 위치의 히드록시기에 글루크론산을 전이하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(2) 상기 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)는 β-아미린 모노글루크로나이드, 11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 30-히드록시-11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 30-히드록시-β-아미린 모노글루크로나이드, 11-옥소 글리시레틴산 모노글루크로나이드 및 글리시레틴산 모노글루크로나이드로 이루어진 군에서 선택되는 (1)에 기재된 폴리펩티드.
(3) 감초 속 (Glychyrrhiza 속) 식물 또는 우마고야시 속 (Medicago 속) 식물에서 유래하는, (1) 또는 (2)에 기재된 폴리펩티드.
(4) 감초 속 식물이 G. uralensis인, (3)에 기재된 폴리펩티드.
(5) 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, (1) ~ (4)의 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
(6) 다음의 (a) ~ (c)에 나타내는 것 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, (1) ~ (4)의 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 배열,
(b) 서열 번호 4의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는
(c) 서열 번호 4의 아미노산 서열과 80 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열.
(7) (1) ~ (6) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(8) 다음의 (d) ~ (g)에 나타내는 하나의 염기 서열을 포함, (7)에 기재된 폴리 뉴클레오티드.
(d) 서열 번호 5의 염기 서열,
(e) 서열 번호 5의 염기 서열에서 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가 된 염기 서열,
(f) 서열 번호 5의 염기 서열과 80 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열 또는
(g) 서열 번호 5의 염기 서열에 상보적인 염기 서열과 엄격한(stringent) 조건에서 혼성화하는 염기 서열.
(9) (7) 또는 (8)에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
(10) 과잉 발현형 벡터 또는 구성적 발현형 벡터인, (9)에 기재된 재조합 벡터.
(11) (9) 또는 (10)에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체 또는 그 후대.
(12) 콩과 (Fabaceae) 식물인, (11)에 기재된 형질 전환체 또는 그 후대.
(13) (11) 또는 (12)에 기재된 형질 전환체 또는 그 후배를 배양하는 단계 및 배양액에서 (1) ~ (6)의 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드를 추출하는 단계를 포함하는, 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에서 글루크론산(glucuronic acid)의 2 위치의 히드록시기에 글루크론산을 전이하는 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조 방법.
(14) β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)을 생합성 할 수 있는 개체 또는 세포에서, (1) ~ (6)의 어느 하나에 기재된 폴리펩티드의 활성을 억제하는 공정을 포함하는 글리시레틴산 모노글루크로나이드(glycyrrhetinic acid monoglucuronide)의 제조 방법.
(15) 상기 억제가 (1) ~ (6) 중 어느 한 항 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 발현의 억제, 또는 상기 폴리펩타이드의 활성 저해 물질 처리에 의한 억제인, (14)에 기재된 제조 방법.
(16) (7) 또는 (8)에 기재된 폴리뉴클레오티드의 유무 또는 그 발현을 검출하여 상기 폴리뉴클레오티드를 갖는 식물을 선발하는 방법이며, 대상 식물에서 제조된 핵산 함유 샘플에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편을 이용하여 핵산 증폭법 또는 핵산 혼성화를 수행하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 것을 포함하는, 상기 식물 선발법.
또한, 본 명세서에서 말하는 글리시리진, β-아미린에서 글리시리진에 이르기 생합성 경로 및 해당 경로의 중간 산물은 원칙적으로 글리시리진의 20 위치 이성체인 20-에피-글리시리진(20-epi-glycyrrhizin), β-아미린에서 20-에피-글리시리진에 이르는 생합성 경로 및 해당 경로의 중간 산물을 포함한다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2013-078847 호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함하고 있다.
본 발명에 의하면, 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에서 글루크론산(glucuronic acid)의 2 위치의 히드록시기에 글루크론산을 전이(transfer)하는 활성을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들을 이용한 방법을 제공할 수 있다.
[도 1] 트리테르페노이드 사포닌 생합성 계에 있어서 글리시리진(glycyrrhizin) 및 소야사포닌(soyasaponin) I의 생합성 경로를 나타낸다.
[도 2] β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)에 이르는 생합성 경로의 오레아난 형 트리테르페노이드 및 각 변환 반응에 관여하는 것으로 알려진 효소 (CYP88D6, CYP72A154, GuUGT73.8)의 촉매 위치를 나타낸다. GuUGT73.8이 본 발명의 글루크론산 제 2 전이 효소에 해당한다.
[도 3] RT-PCR 법에 의한 유전자 발현의 분석 결과를 나타낸다.
[도 4-1] A. 샘플 A를 이용한 경우의 개념도이다. B. 본 발명의 폴리펩티드 (GuUGT73.8)에 의해 글리시레틴산 모노글루크로나이드에서 글리시리진(glycyrrhizin)으로 변환되기 전의 글리시레틴산 모노글루크로나이드의 검출 결과를 나타낸다. 흰색 화살표의 피크는 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 나타낸다. C. GuUGT73.8를 발현하는 형질 전환 효모에서 얻은 단백질 추출물인 샘플 A를 당 수용체 기질인 글리시레틴산 모노글루크로나이드와 당 공여체 기질 UDP- 글루크론산을 함유한 용액에 첨가하여 in vitro 효소 분석을 실시한 반응 용액을 LC-MS로 분석한 결과를 나타낸다. 검은색 화살표 피크는 글리시리진(glycyrrhizin)을 나타낸다.
[그림 4-2] A. 그림 4-1의 대조군인 샘플 B를 이용한 경우의 개념도이다. B.GuUGT73.8를 발현하지 않는 빈 벡터만을 형질 전환 효모에서 얻은 단백질 추출물 인 샘플 B를 당 수용체 기질인 글리시레틴산 모노글루크로나이드와 당 공여체 기질 UDP- 글루크론산을 함유한 용액에 첨가하기 전에 글리시레틴산 모노글루크로나이드의 검출 결과를 나타낸다. 흰색 화살표의 피크는 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 나타낸다. C. 샘플 B를 첨가하여 in vitro 효소 분석을 실시한 반응 용액을 LC-MS로 분석한 결과를 나타낸다.
[도 2] β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)에 이르는 생합성 경로의 오레아난 형 트리테르페노이드 및 각 변환 반응에 관여하는 것으로 알려진 효소 (CYP88D6, CYP72A154, GuUGT73.8)의 촉매 위치를 나타낸다. GuUGT73.8이 본 발명의 글루크론산 제 2 전이 효소에 해당한다.
[도 3] RT-PCR 법에 의한 유전자 발현의 분석 결과를 나타낸다.
[도 4-1] A. 샘플 A를 이용한 경우의 개념도이다. B. 본 발명의 폴리펩티드 (GuUGT73.8)에 의해 글리시레틴산 모노글루크로나이드에서 글리시리진(glycyrrhizin)으로 변환되기 전의 글리시레틴산 모노글루크로나이드의 검출 결과를 나타낸다. 흰색 화살표의 피크는 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 나타낸다. C. GuUGT73.8를 발현하는 형질 전환 효모에서 얻은 단백질 추출물인 샘플 A를 당 수용체 기질인 글리시레틴산 모노글루크로나이드와 당 공여체 기질 UDP- 글루크론산을 함유한 용액에 첨가하여 in vitro 효소 분석을 실시한 반응 용액을 LC-MS로 분석한 결과를 나타낸다. 검은색 화살표 피크는 글리시리진(glycyrrhizin)을 나타낸다.
[그림 4-2] A. 그림 4-1의 대조군인 샘플 B를 이용한 경우의 개념도이다. B.GuUGT73.8를 발현하지 않는 빈 벡터만을 형질 전환 효모에서 얻은 단백질 추출물 인 샘플 B를 당 수용체 기질인 글리시레틴산 모노글루크로나이드와 당 공여체 기질 UDP- 글루크론산을 함유한 용액에 첨가하기 전에 글리시레틴산 모노글루크로나이드의 검출 결과를 나타낸다. 흰색 화살표의 피크는 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 나타낸다. C. 샘플 B를 첨가하여 in vitro 효소 분석을 실시한 반응 용액을 LC-MS로 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
1.
글루크론산
제 2 전이 효소 및 그 활성 단편
본 발명의 제 1 측면은 글루크론산 제 2 전이 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 명세서에서 「글루크론산 제 2 전이 활성」는 한 단계의 글루크론산 전이 반응 (글루크론산 제 1 전이 반응)을 받은 오레아난 형 트리테르페노이드, 즉 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에 대해 두 번째의 글루크론산 전이 반응 (글루크론산 제 2 전이 반응)을 촉매하는 활성을 말한다.
본 명세서에서 「글루크론산 제 2 전이 활성을 갖는 폴리펩티드」는 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에 글루크론산을 전이 활성을 갖는 글루크론산 제 2 전이 효소 및 그 활성 단편이다.
「오레아난 형 트리테르페노이드」는 5 환성 오레아난 골격이 있고 6 개의 이소프렌 단위로 이루어진 C30의 이소프레노이드(isoprenoid)을 말한다. 예를 들어, 오레아놀산(oleanolic acid), 헤데라게닌(hederagenin), β-아미린(β-amyrin), 카멜리아게닌(camelliagenin), 소야사포게놀(soyasapogenol), 사이코게닌(saikogenin), 11-옥소-β-아미린(11-oxo-β-amyrin), 30-히드록시-β-아미린(30-hydroxy-β-amyrin), 30-히드록시-11-옥소-β-아미린(30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin), 11-데옥소 글리시레틴산(11-deoxoglycyrrhetinic acid) 및 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid)이 해당된다.
「오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)」는 오레아난 형 트리테르페노이드 3 위치의 히드록시기 (OH 기)에 글루크론산이 1 개 전이된 화합물을 말한다. 예를 들어, 오레아놀산 모노글루크로나이드, 헤데라게닌 모노글루크로나이드, β-아미린 모노글루크로나이드, 카멜리아게닌 모노글루크로나이드, 소야사포게놀 모노글루크로나이드, 사이코게닌 모노글루크로나이드, 11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 30-히드록시-β-아미 린 모노글루크로나이드, 30-히드록시-11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 11-옥소글리시레틴산 모노글루크로나이드 및 글리시레틴산 모노글루크로나이드가 해당된다.
본 명세서에서 「글루크론산 제 2 전이 효소」는 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에서 글루크론산의 2 위치의 히드록시기에 추가로 글루크론산을 전이하는 글루크론산 제 2 전이 활성을 갖는 효소이다. 해당 활동을 통해 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드에서 오레아난 형 트리테르페노이드 디글루쿠로나이드가 생성된다. 따라서 예를 들어, 글리시레틴산 모노글루크로나이드에서 글리시리진(glycyrrhizin)을 얻을 수 있다. 글루크론산 제 2 전이 효소는 예를 들어, 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 배열 (Ser-His-Xaa-Ile-Arg-Val-Val : Xaa는 하나의 아미노산을 나타낸다. 바람직하게는 Leu 또는 Thr이다.)을 기질 결합 부위로 포함하는 폴리펩타이드를 들 수 있다. 또는 (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열 (b) 서열 번호 4의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열, 또는 (c) 서열 번호 4 나타내는 아미노산 서열과 80 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 들 수 있다.
상기 「서열 번호 4의 아미노산 서열」은 G. uralensis 유래의 글루크론산 제 2 전이 효소 (GuUGT73.8)이다. GuUGT73.8 시작 메티오닌을 1 위치로 하였을 때, 28 위 ~ 34 위의 위치에 상기 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 서열로 구성된 기질 결합 부위를 포함한다. 또한 GuUGT73.8의 다른 종 orthologue도 본 명세서에서 글루크론산 제 2 전이 효소로서 바람직하다. 예를 들어, 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 GuUGT73.8의 Lotus japonicus orthologue를 들 수 있다. 서열 번호 9의 아미노산 서열은 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대해 66.9 %의 동일성을 가진다. 또한 서열 번호 4의 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 본 발명에서 사용하여도 좋다. 예를 들어, 서열 번호 4의 아미노산 서열에서 1 ~ 10 개, 바람직하게는 1 ~ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ~ 3 개 또는 1 ~ 2 개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열 1 ~ 10 개, 바람직하게는 1 ~ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ~ 3 개 또는 1 ~ 2 개의 아미노산이 부가된 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 1 ~ 10 개, 바람직하게는 1 ~ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ~ 3 개 또는 1 ~ 2 개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 글루크론산 제 2 전이 활성을 유지한 서열 번호 4에 나타내는 글루크론산 제 2 전이 효소의 돌연변이 등이 해당한다.
상기 「(c) 서열 번호 4의 아미노산 서열과 80 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열」은 서열 번호 4의 아미노산 서열과 80 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상, 90 %, 95 % 또는 97 % 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 말한다.
본 발명에서 「그 활성 단편」은 글루크론산 제 2 전이 효소의 일부 영역을 포함하고 글루크론산 제 2 전이 활성을 유지하는 폴리펩티드 단편을 말한다. 이 활성 단편을 구성하는 폴리펩티드의 아미노산의 길이는 특별히 제한하지 않는다. 예를 들어, 상기 (a) ~ (c)의 폴리펩티드에서 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 또는 150 아미노산의 연속 공간이면 된다.
본 발명의 글루크론산 제 2 전이 활성을 갖는 폴리펩타이드 기질은 위의 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)를 들 수 있다. 바람직하게는 β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)에 이르는 생합성 경로에 관여하는 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide) 이다. 구체적으로는 β-아미린 모노글루크로나이드, 11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 30-히드록시-11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 30-히드록시-β-아미린 모노글루크로나이드, 11-옥소 글리시레틴산 모노글루크로나이드 또는 글리시레틴산 모노글루크로나이드다.
본 발명의 폴리펩티드가 유래 생물종은 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 콩과 (Fabaceae) 식물이다. 예를 들어, Arachis 속 식물, Cicer 속 식물, Aspalathus 속 식물, Dalbergia 속 식물, Pterocarpus 속 식물, Desmodium 속 식물, Lespedeza 속 식물, Uraria 속 식물, Galegeae 속 식물, Astragalus 속 식물, Glycyrrhiza 속 식물, Oxytropis 속 식물, Augyrocytisus 속 식물, Cytisus 속 식물, Genista 속 식물, Spartium 속 식물, Hedysarum 속 식물, Cyamopsis 속 식물, Indigofera 속 식물, Lotus 속 식물, Lupinus 속 식물, Wisteria 속 식물, Cajanus 속 식물, Canavalia 속 식물, Erythrina 속 식물, Glycine 속 식물, Hardenbergia 속 식물, Lablab 속 식물, Mucuna 속 식물, Phaseolus 속 식물, Psophocarpus 속 식물, Pueraria 속 식물, Vigna 속 식물, Robinia 속 식물, Castanospermum 속 식물, Maackia 속 식물, Ormosia 속 식물, Sophora 속 식물, Styphnolobium 속 식물, Medicago 속 식물, Trigonella 속 식물, Trifolium 속 식물, Lathyrus 속 식물, Lens 속 식물, Pisum 속 식물 및 Vicia 속 식물을 들 수 있다. 바람직하게는 Glycyrrhiza 속 식물 또는 Medicago 속 식물이다. 구체적으로는 G. uralensis , G. glabra, G. inflata , G. aspera , G. eurycarpa , G. pallidiflora , G. yunnanensis , G. lepidota , G. echinata , G. acanthocarpa 또는 M. truncatula 등을 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 공지의 방법을 이용하여 추출할 수 있다. 예를 들어, 식물 배양 세포에서 추출하는 경우라면, 예를 들어, 감초 배양 세포에서 글루크론산 전이 효소를 추출하는 Hayashi 등의 방법 (Hayashi et al., 1996, Phytochemistry, 42 : 665-666)을 참조하면 좋다. 또한 식물의 기관 또는 조직 (뿌리 또는 줄기 등)에서 추출하는 경우라면, 예를 들어 콩에서 이소 플라본 배당화 효소를 추출, 정제하는 Noguchi 등의 방법 (Noguchi et al., 2007, J. Biol . Chem., 282 : 23581-23590)를 참조하면 된다. 또한 서열 번호 4 또는 9에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 공지의 화학 합성법에 의해 합성될 수 있다. 또는 아래의 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 취득하여 공지의 유전자 재조합 기술 및 단백질 발현 시스템에 의해 생합성 할 수 있다. 구체적인 방법은 Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재된 방법을 참조하면 된다.
서열 번호 4의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대해 80 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열 예를 들어, 후술하는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 상기 기술 분야에서 공지의 방법으로 변경하여 얻을 수 있다. 유전자에 변이를 도입하는 방법은 Kunkel 법 또는 Gapped duplex 법 등의 공지 방법 또는 이에 준하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 상용 변이 도입 키트 (예 : Mutant-K (TaKaRa 사)와 Mutant-G (TaKaRa 사)) 또는 LA PCR in vitro Mutagenesis 시리즈 키트 (TaKaRa 사) 등을 이용하여 변이 도입할 수도 있다. 또한 돌연변이 유발제 (예를 들면, 메탄 술폰산 에틸 (EMS), N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG) 등의 알킬화제)에 접촉 작용시키는 방법, 자외선을 조사하는 방법을 사용해도 좋다.
본 발명의 폴리펩티드에 따르면 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)를 당 수용체 기질로 하여 글루크론산 제 2 전이 활성에 의해 오레아난 형 트리테르페노이드 디글루쿠로나이드를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드로 글루크론산 전이 방법을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 및 글루크론산 전이 방법을 이용하면 글리시리진(glycyrrhizin) 생합성 경로의 추가 해명이나 글리시리진 합성에 적용할 수 있게 된다.
2.
글루크론산
제 2 전이 효소 및 그 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 제 2 실시예는 제 1 실시예에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 즉 글루크론산 제 2 전이 효소 및 그 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 글루크론산 제 2 전이 활성을 갖는 제 1 양태에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이면 그 염기 서열은 특히 한정하지 않는다. 바람직하게는 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리펩티드 제 1 양태의 (a) ~ (c)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 폴리뉴클레오티드의 구체적인 예로는 (d) 서열 번호 5의 염기 서열 (e) 서열 번호 5의 염기 서열에서 1 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열 (f) 서열 번호 5의 염기 서열과 80 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열 또는 (g) 서열 번호 5의 염기 서열에 상보적인 염기 서열과 엄격한 조건에서 잡종 염기 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드다. 서열 번호 5의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 G. uralensis 유래의 글루크론산 제 2 전이 효소인 GuUGT73.8를 암호화한다. 또한 GuUGT73.8의 다른 종 orthologue를 코드하는 유전자도 본 형태의 폴리뉴클레오티드로 바람직하다. 예를 들어, GuUGT73.8의 L. japonicus orthologue인 서열 번호 9에 나타낸 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩하는 서열 번호 8의 염기 산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한 서열 번호 5의 염기 서열에서 1 또는 복수 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 본 발명에서 사용하여도 좋다. 예를 들어, 서열 번호 5의 염기 서열의 1 ~ 15 개, 바람직하게는 1 ~ 9 개, 보다 바람직하게는 1~6 개, 1 ~ 3 개 또는 1 ~ 2 개의 염기가 결실 염기 서열 서열 번호 5의 염기 서열에 1 ~ 15 개, 바람직하게는 1 ~ 9 개, 보다 바람직하게는 1~6 개, 1 ~ 3 개 또는 1 ~ 2 개의 염기의 염기가 부가된 염기 서열 또는 서열 번호 5 에 나타내는 염기 서열의 1 ~ 10 개, 바람직하게는 1 ~ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ~ 3 개, 또는 1 ~ 2 개의 염기가 다른 염기로 치환된 염기 서열을 들 수 있다.
상기 「(f) 서열 번호 5의 염기 서열과 80 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열」는 서열 번호 5의 85 % 이상 90 % 이상 95 % 이상 또는 97 % 이상의 염기 동일 성을 갖는 염기 서열이 바람직하다.
상기 「(g) 엄격한 조건」은 핵산 분자 사이에서 염기쌍 경우 의한 특이적인 혼성화가 형성되는데, 비특이적인 하이브리드는 실질적으로 형성되지 않는 조건을 말한다. 구체적으로는 염기 서열의 동일성이 높은 (예를 들면 80 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상 또는 97 % 이상) 핵산 분자 사이에서 염기쌍 경우에 따라 하이브리드를 형성할 수 있지만, 그렇지 핵산 분자 사이에서는 하이브리드가 실질적으로 형성되지 않는 조건이다. 예를 들어, 하이브리드화 반응 온도가 25 ~ 70℃, 바람직하게는 50 ~ 70℃, 보다 바람직하게는 55 ~ 68℃의 범위 내인 조건 및/또는 하이브리드 화 용액 중의 포름아미드 농도가 0 ~ 50 % 바람직하게는 20 ~ 50 %, 보다 바람직하게는 35 ~ 45 %의 범위 내에 있는 조건을 말한다. 또한 하이브리드화 후 필터 세척의 나트륨 소금 농도가 15 ~ 750 mM, 바람직하게는 15 ~ 500 mM, 보다 바람직하게는 15 ~ 300 mM 15 ~ 200 mM 또는 15 ~ 100 mM의 조건이다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하는 mRNA 전구체에 대응하는 염기 서열을 가지고 있어도 좋다. mRNA 전구체에 대응하는 염기 배열은 pre-mRNA 접합 반응에 의해 실질적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 같은 배열이고, 또 거기에 코드되는 폴리펩티드는 제 1 양태에 기재된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능을 가지고 있기 때문이다. 예를 들어, G. uralensis 게놈에 존재하는 염기 서열을 가지며, 접합 후 성숙 mRNA의 염기 서열이 서열 번호 5로 나타내는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 해당한다. 또는 L. japonicus 게놈에 존재하는 염기 서열을 가지며, 접합 후 성숙 mRNA의 염기 서열이 서열 번호 8로 나타내는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 해당한다.
「글루크론산 제 2 전이 효소의 활성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드」는 제 1 형태의 (a) ~ (c)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (d) ~ (g)의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에서 연속 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 혹은 150 염기 영역을 포함하고, 그 염기 서열을 코드하는 펩타이드가 글루크론산 제 2 전이 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 적당한 식물, 예를 들어, 콩류, 바람직하게는 Glycyrrhiza 속 식물 또는 Medicago 속 식물에서 공지된 방법을 이용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 5의 염기 서열에 따라 설계 한 적당한 염기 서열 길이를 갖는 프라이머 쌍 (예를 들어, 서열 번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍)을 이용하여 G. uralensis 등의 감초 속 식물의 DNA 라이브러리 또는 게놈 DNA library 유래의 핵산을 주형으로 PCR 등의 핵산 증폭 반응을 함으로써 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 라이브러리 등을 주형으로 서열 번호 5의 염기 서열의 일부를 갖는 핵산 단편을 프로브로 하이브리드 화에 의해 얻을 수있다. 이러한 방법은 Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재된 방법을 참조하면 된다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5의 염기 서열과 같은 알려진 염기 서열에 따라 화학 합성법 등의 공지의 핵산 서열 합성법에 의해 합성할 수도 있다.
서열 번호 5의 염기 서열에서 1 또는 수 개의 또는 복수 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열 또는 서열 번호 5의 염기 서열과 80 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상 또는 97 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 제 1 양태에서 설명한 방법으로 변이를 도입하는 등 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하면, 그것을 직접 또는 다음의 제 3 형태의 재조합 벡터에 통합하여 다양한 생물종 또는 세포에 도입하여 고 발현시킴으로써, 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide) 에 글루크론산 를 전이시킬 수 있다.
3. 재조합 벡터
본 발명의 제 3 측면은 상기 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 벡터는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 적당한 벡터에 도입하여 구축할 수 있다. 벡터의 종류는 특별히 한정하지 않는다. 복제용 또는 유전자 발현용 등의 목적에 따라 또는 도입하는 숙주 (예를 들어, 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포, 식물 세포 또는 식물체 특히 콩과의 식물 세포 또는 식물체)에 따라 적절하게 선택하면 된다. 과잉 발현형 벡터 또는 구성적 발현형 벡터는 특히 바람직하다. 한정하지는 않지만 사용 가능한 벡터의 구체적 예로는 pBI 계, pPZP 계, pSMA 계, pUC 계, pBR 계, pBluescript 계 (stratagene 사) pTriEXTM 계 (TaKaRa 사) 등의 플라스미드 벡터와 콜리 플라워 모자이크 바이러스 (CaMV), 콩 모자이크 바이러스 (BGMV), 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 등의 바이러스 벡터 또는 pBI 계 등의 바이너리 벡터들 수 있다.
상기 벡터에 목적의 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 방법은 상기 분야에 공지 된 방법을 사용할 수 있다. 일반적으로 정제된 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 적당한 제한 효소로 절단하고, 상기 적당한 벡터의 해당 제한 효소 부위 또는 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여 연결하는 방법 등이 채용된다. 구체적인 방법은 예를 들어, Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조하면 된다.
본 발명의 재조합 벡터는 제 2 실시예에 기재된 목적의 폴리뉴클레오티드 외에, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 또는 터미네이터 등의 조절 영역 또는 선발 마커 유전자 및/또는 다른 유전자를 포함할 수 있다.
프로모터, 인핸서, 터미네이터 또는 선발 마커의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 상기 벡터와 마찬가지로 목적 또는 도입하는 숙주에 따라 적절히 선택하면 된다.
식물 세포에서 작동 가능한 프로모터로는, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus; CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 합성 효소 유전자(nopaline synthase gene; Pnos)의 프로모터, 옥수수 유래 유비퀴틴 프로모터, 벼 유래의 액틴 프로모터, 담배 유래 PR 단백질 프로모터 등이 꼽힌다. 또한 세균 세포에서 작동 가능한 프로모터로는 Bacillus stearothermophilus (바실러스 스테아로텔모필스)의 말토제닉·아밀라아제 유전자, Bacillus licheniformis의 α-amylase 유전자, Bacillus amyloliquefaciens의 BAN 아밀라아제 유전자, Bacillus subtillis의 알칼리 프로테아제 유전자 또는 Bacillus pumilus의 자일로시다아제 유전자의 프로모터 또는 파지 람다의 PR 또는 PL 프로모터인 대장균의 lac, trp 또는 tac 프로모터 등이 들 수 있다. 효모 숙주 세포에서 작동 가능한 프로모터로는 효모 해당 계 유전자 유래의 프로모터, 알코올 탈수소 효소 유전자 프로모터, TPI1 프로모터 ADH2-4c 프로모터 등이 꼽힌다. 곰팡이에서 작동 가능한 프로모터로는 ADH3 프로모터 tpiA 인 등이 꼽힌다. 동물 세포에서 작동 가능한 프로모터로는 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, CMV 프로모터 등 곤충 세포에서 작동 가능한 프로모터로는 폴리 헤드린 프로모터 P10 프로모터 바큘로 바이러스인 Autographa californica polyhedrosis의 염기성 단백질 프로모터, 바큘로 바이러스 즉시 형 초기 유전자 1 프로모터 바큘로 바이러스 39K 지연형 초기 유전자 프로모터 등을 들 수 있다.
인핸서로는 CaMV 35S 프로모터의 상류 측의 배열을 포함하는 인핸서 영역, SV40 인핸서, CMV 강화 등을 들 수 있다.
터미네이터로는 노팔린 합성 효소 (NOS) 유전자의 터미네이터, 옥토파인 합성 효소 (OCS) 유전자의 터미네이터, CaMV 35S 터미네이터 대장균 리포폴리 단백질 lpp 3' 터미네이터, trp 오페론 터미네이터 amyB 터미네이터 ADH1 유전자의 터미네이터 등이 꼽힌다.
선발 표지 유전자로는 약제 내성 유전자 (예를 들어, 테트라 사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 하이그로 마이신 내성 유전자, 스페치노 마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 또는 네오마이신 내성 유전자) 형광 또는 발광 리포터 유전자 (예, 루시페라제, β-갈락토시다 아제, β-구루쿠로니타제 (GUS) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NPT II), 디히드로 엽산 환원 효소(dihydrofolate reductase gene) 등의 효소 유전자를 들 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에 따르면, 상기 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드의 조작 및/또는 발현 등의 제어가 용이해진다.
4. 형질
전환체
또는 그 후대
본 발명의 제 4 측면은 형질 전환체 또는 그 후대에 관한 것이다.
본 명세서에서 「형질 전환체」는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터의 도입에 의해 형질 전환된 숙주를 말한다.
형질 전환된 숙주는 도입되는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터를 발현할 수 있으면 특별히 한정하지 않는다. 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli) 또는 고초균 (Bacillus subtilis)와 같은 세균, 예를 들어, 신진 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 분열 효모 (Schizosaccharomyces pombe) 또는 메탄올 사슴 성 효모 (Pichia pastoris)와 같은 효모, 아스페르질루스 (Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora), Fusarium의 (Fuzarium) 또는 트리코덜마(Trichoderma) 같은 곰팡이 예를 들어, 벼과 같은 외떡잎 식물 또는 예를 들어 콩과 또는 십자화과 같은 쌍떡잎 식물 또는 식물 세포, 동물 세포 또는 곤충 세포 (예를 들어, sf9 또는 sf21)을 들 수 있다. 숙주 식물의 경우, 바람직하게는 콩과 식물, 보다 바람직하게는 Glycyrrhiza 속 식물, Medicago 속 식물 또는 Glycine 속 식물이다. G. uralensis, M. truncatula 또는 대두 (Glycine max)는 특히 바람직하다.
본 발명의 형질 전환체는 동일한 유전 정보를 갖는 클론체를 포함한다. 예를 들어, 숙주가 대장균이나 효모 등의 무성 생식을 하는 단세포 미생물이면 형질 전환체 1 세대에서 분열 또는 신진 등에 의해 새롭게 생긴 클론체도 본 발명의 형질 전환체에 포함된다. 또한 숙주 식물이면 형질 전환체 1 세대에서 채취 한 식물체의 일부, 예를 들면, 표피, 체관부, 연조직, 통 또는 유관속 같은 식물 조직, 잎, 꽃잎, 줄기 뿌리 또는 종자와 같은 식물 기관 또는 식물 세포로부터 식물 조직 배양법이나 꺾꽂이, 접목 혹은 가지고 나무에 의해 얻은 클론 체 또는 뿌리 줄기, 결절, 구경, 주자 등과 같은 형질 전환체 1 세대에서 무성 생식으로 얻을 수 있는 영양 번식 기관보다 새롭게 생긴 새로운 클론 체도 본 발명의 형질 전환체에 포함된다.
본 발명의 형질 전환체는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터 이외에도 하나 이상의 다른 폴리뉴클레오티드 또는 다른 재조합 벡터를 가지고 있어도 좋다. 여기서 말하는 다른 폴리뉴클레오티드는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드 이외의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들어, β-아미린 합성 효소 유전자, CYP88D6 또는 CYP72A154 또는 하나의 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide) 합성 효소 유전자가 해당한다. 또한 다른 재조합 벡터는 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터 이외의 재조합 벡터를 말한다.
본 발명의 형질 전환체는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 적당한 숙주에 도입함으로써 제조할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터의 도입 방법은 상기 분야에 공지 된 방법, 예를 들면, 아그로박테리움 법(agrobacterium method), PEG- 인산 칼슘 법, 일렉트로 포 레이션 법, 리포좀 법, 파티클 건 법(particle-gun method), 마이크로 인젝션 법을 사용할 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주의 게놈 DNA 중에 포함해도 되고, 도입된 폴리뉴클레오티드의 상태 (예를 들어, 외래 벡터에 함유된 상태)로 존재하고 있다. 또한 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주의 게놈 DNA 중에 포함된 경우와 같이 숙주 세포 내에서 유지되고 계속해서 좋고, 일시적으로 유지되고 있다.
위의 방법으로 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터를 숙주에 도입한 후 원하는 폴리뉴클레오티드의 도입 유무를 PCR 법, 서던 혼성화 법, 노던 혼성화 방법, in situ 혼성화 등에 의해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 「그 후대」는 상기 형질 전환체 제 1 세대의 유성 생식을 통해 자손이며, 본 발명의 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터를 발현 가능한 상태로 유지하고 있는 숙주를 의미한다. 예를 들어, 형질 전환체를 식물의 경우에는 그 형질 전환체의 모종이 해당된다. 대의 세대는 묻지 않는다.
본 형태의 형질 전환체에 의하면 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증강함으로써 숙주 세포 내에 존재하는 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide) 를 오레아난 형 트리테르페노이드 디글루쿠로나이드 효율적으로 변환할 수 있다. 이에 따라 β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)의 생합성 경로의 중간 산물 또는 최종 산물의 생산량이 증가한 형질 전환체를 제공할 수 있다.
또한 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터를 발현 가능하도록 도입하여 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 증강한 형질 전환체를 제공할 수 있다.
5.
글루크론산
제 2 전이 효소 및 그 활성 단편의 제조 방법
본 발명의 제 5 실시예는 제 4 양태의 형질 전환체 또는 그 후대을 배양하여 그 배양물로부터 제 1 양태에 기재된 글루크론산 제 2 전이 활성을 갖는 폴리펩티드를 추출하는 것을 포함하여, 글루크론산 제 2 전이 효소 및 그 활성 단편의 제조 방법에 관한 것이다.
본 실시예에서는 형질 전환체 또는 그 후대를 배양함으로써 제 1 양태에 기재된 폴리펩타이드를 생산하는 경우 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 과잉 발현할 수 있는 형질 전환체 또는 구성으로 표현 가능한 형질 전환체 또는 그 후대를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제 3 양태에 기재된 재조합 벡터를 갖는 형질 전환체 또는 그 후대라면 그 재조합 벡터로 사용되는 벡터가 포함된 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 구성으로 과도하게, 또는 발현 유도에 의해 대량으로 발현 할 수 있는 발현 벡터를 사용하면 된다.
형질 전환체 또는 그 후대을 배양하는 배지는 숙주의 배양에 적합한 배지를 이용하면 된다. 배지는 상기 분야에서 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 대장균 등의 세균을 숙주로 배양하는 경우라면 LB 배지 또는 M9 배지 등 효모를 숙주로 배양하는 경우라면 YPD 배지, YPG 배지, YPM 배지, YPDM 배지, SMM 배지 등 식물을 숙주로 배양하는 경우라면 적절한 배양토와 수경 재배 배지를 들 수 있다.
배지는 탄소원 (예를 들어, 포도당, 글리세린, 만니톨, 과당, 유당 등), 질소원 (예를 들면, 황산 암모늄, 염화 암모늄 등의 무기 질소, 카제인 분해물, 효모 추출물, 폴리펩톤, BACTO 트립톤, beef extract 등의 유기 질소원) 무기 염 (예를 들면, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 염화 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화칼슘 등), 비타민 (비타민 B1 등), 약제 (암피실린, 테트라 사이클린, 카나마이신 등의 항생제) 등을 적절히 함유한다. 또한, 제 1 양태에 기재된 폴리펩티드의 설탕 수용체 기질이 되는 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide), 바람직하게는 β-아미린 모노글루크로나이드, 11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 30-히드록시-11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드, 30- 히드록시-β-아미린 모노글루크로나이드, 11-옥소 글리시레틴산 모노글루크로나이드 또는 글리시레틴산 모노글루크로나이드 및/또는 당 공여체 기질인 글루크론산을 포함하고 있다.
배양 조건은 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합하다면 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 10 ~ 45℃, 15 ~ 40℃, 18 ~ 37℃의 온도에서 필요에 따라 통기 조사 및/또는 교반을 하면서 몇 시간 ~ 수백 시간 배양한다. 구체적인 방법은 예를 들어, Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조하면 된다.
배양 (배양 상청 또는 배양된 형질 전환체를 포함한다)에서 제 1 양태에 기재된 폴리펩티드를 회수하려면 문화에 축적된 폴리펩티드를 공지의 방법으로 추출하여 필요에 따라 정제하면 된다. 예를 들어, 용매 추출법, 염전법, 용매 침전 법, 투석 법, 한외여과법, 겔 전기 영동, 겔 여과 크로마토 그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친 화성 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 원하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 구체적으로는 위의 Hayashi 등의 방법 (Hayashi et al., 1996, Phytochemistry, 42 : 665-666)과 Noguchi 등의 방법 (Noguchi et al., 2007, J. Biol. Chem., 282 : 23581 -23590)를 참조하면 된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 의하면, 숙주 생물 생산 시스템으로 이용하여 글루크론산 제 2 전이 효소 및 그 활성 단편을 안정적으로 대량으로 얻을 수 있게 된다.
6.
글리시레틴산
모노글루크로나이드의
제조 방법
본 발명의 제 6 측면은 글리시레틴산 모노글루크로나이드의 제조 방법에 관한 것이다.
글리시레틴산 모노글루크로나이드는 글리시리진(glycyrrhizin)와 같은 단맛 물질이며, 산업상 유용성이 높지만, 자연계에서는 매우 소량 밖에 존재하지 않기 때문에 대량으로 입수하는 것이 곤란하다. 그러나 β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)을 생합성 할 수 있는 개체 또는 세포에서 제 1 양태에 기재된 글루크론산 제 2 전이 효소에 의해 글리시레틴산 모노글루크로나이드에서 글리시리진(glycyrrhizin)가 생성될 수 본원에서 밝혀졌다. 상기 합성 과정을 갖는 개체 또는 세포 내에서 글리시리진(glycyrrhizin)가 화학적으로 안정된 최종 산물로서 세포 내에 축적된다. 그런데 그 합성 과정에서 글루크론산 제 2 전이 효소의 활성이 억제된 경우 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide)에서 오레아난 형 트리테르페노이드 디글루쿠로나이드로 변환이 억제된다. 그 결과, 글리시리진(glycyrrhizin) (오레아난 형 트리테르페노이드 디글루쿠로나이드)의 전구체인 글리시레틴산 모노글루크로나이드 (오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide))가 최종 산물로서 세포 내에 축적되게 된다. 본 발명은 상기 원리를 이용하여 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 제조하는 방법이다.
본 발명의 제조 방법은 억제 공정을 포함한다. 본 형태의 「억제 공정」은 β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)을 생합성 할 수 있는 개체 또는 세포에서 제 1 양태에 기재된 폴리펩티드의 활성을 억제하는 공정이다.
본 실시예에서 제 1 양태에 기재된 폴리펩티드는 주로 글루크론산 제 2 전이 효소가 해당한다. 구체적으로는 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 글루크론산 제 2 전이 효소 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 (GuUGT73.8), 서열 번호 4의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 80 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 글루크론산 제 2 전이 효소다.
본 공정에서 「개체」는 β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)을 생합성 할 수 있는 개체이면 식물 개체 동물 개체 세균, 효모, 곰팡이를 불문 않지만, 바람직하게는 식물 개체, 보다 바람직하게는 콩과 식물 개체, 더욱 바람직하게는 Medicago 속 식물 또는 Glycine 속 식물 개체 또는 대두 속 식물 개체이다. 예를 들어, G. uralensis 개체, M. truncatula 개체 또는 대두 개체들 수 있다. 본 공정에서 개체에서 β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)까지 합성 과정에 기여 효소를 코딩하는 유전자는 그 개체의 내생 유전자 않아도 된다. 예를 들어, 개체가 형질 전환체에서 그 합성 과정에서 효소를 코딩하는 유전자의 일부가 외인성 유전자도 있다. 예를 들어, 오레아난 형 트리테르페노이드 11 위의 탄소를 산화 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가 존재하지 않는 개체에서 외래성 유전자인 CYP88D6 유전자를 도입 한 형질 전환체를 사용할 수 있다. 또한, 본 공정에서 「세포」는 상기 개체 유래 세포 (조직, 기관 등의 개체의 일부를 포함)을 들 수 있다.
본 공정에서 글루크론산 제 2 전이 효소의 활성을 억제하는 방법으로 예를 들어, 글루크론산 제 2 전이 효소를 코딩하는 유전자 발현을 억제하는 방법 또는 글루크론산 제 2 전이 효소의 활성 저해 물질을 사용하여 해당 효소의 활성을 직접적으로 억제하는 방법이 있다. 이러한 억제는 자연 돌연변이에 근거한 것으로서도 좋고, 인위적 처리 또는 인위적 돌연변이에 근거한 것이다. 다음 유전자 발현을 억제하는 방법 및 활성 저해 물질을 이용하는 방법에 대해 구체적으로 설명한다.
(1) 유전자 발현을 억제하는 방법
유전자 발현을 억제하는 방법은 표적 효소인 글루크론산 제 2 전이 효소의 발현 자체를 억제하여 세포 내에서 상기 표적 효소의 절대량을 감소시킴으로써 그 기질의 비율 활성을 저하시키는 방법이다. 유전자 발현의 억제가 완전히 억제뿐만 아니라 부분적으로 억제에도 좋다. 이러한 유전자 발현 억제 방법은 전사 억제 방법 및 전사 후 번역 전에 억제 방법으로 대별할 수 있다.
(i) 전사 억제 방법
전사 억제 방법은 상기 개체 또는 세포에서 글루크론산 제 2 전이 효소를 코딩하는 유전자(이하, 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자라 한다)를 발현 단계에서 억제하는 방법이다. 유전자의 전사 억제 방법은 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어, 유전자 발현을 인위적으로 제어하는 분자 유전학적 방법, 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자의 전사기구를 제어하는 방법 또는 해당 유전자의 돌연변이 주식을 이용하는 방법이 있다.
인위적 제어에 의한 분자 유전학적 방법으로는 예를 들어, 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자의 프로모터 영역을 변경하거나 1 이상의 염기가 부가, 결실 (유전자 파괴를 포함) 및/또는 치환된 변이형 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자를 개체 또는 세포에 도입하여 원하는 기능을 부여하는 방법이 알려져 있다. 개체 또는 세포에서 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자 및 그 프로모터 영역 등에 상기 변이를 도입하는 방법은 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발 법을 이용한 시판의 유전자 변이 도입 키트 (예: Mutant-K (TaKaRa 사) Mutant-G (TaKaRa 사)) 또는 LA PCR in vitro Mutagenesis 시리즈 키트 (TaKaRa 사) 등을 이용하여 복제한 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자에 변이를 도입한 후 상동 재조합에 의해 내생의 야생형 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자와 치환하는 방법을 들 수 있다. 구체적인 방법은 예를 들어, Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재된 방법을 참조하면 된다.
글루크론산 제 2 전이 효소 유전자의 전사기구를 제어하는 방법으로는 예를 들어, 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자의 발현을 특이적으로 제어하는 전사 인자를 억제하는 방법이 있다. 구체적으로는 전사 인자의 기능 또는 활성을 저해하는 저분자 화합물, 앱타머, 항체 등을 이용하면 된다.
돌연변이 주를 이용하는 방법은 개체 또는 세포를 EMS와 MNNG 등의 돌연변이 유발제 또는 자외선 조사 처리한 후 글루크론산 제 2 전이 효소의 활성에 결함이 있는 변이주를 선별하여 분리하는 방법을 들 수 있다. 구체적인 방법은 예를 들어, Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재된 방법을 참조하면 된다.
글루크론산 제 2 전이 효소 유전자에 변이를 생긴 변이체를 글리시리진(glycyrrhizin) 합성 과정의 해명에 이용할 수도 있다.
(ii) 전사 후 번역 전에 억제 방법
전사 후 번역 전에 억제 방법은 상기 개체 또는 세포에서 글루크론산 제 2 전이 효소 유전자의 전사 산물인 mRNA 단계에서 억제하는 방법이다.
전사 후 번역 전에 억제 방법의 구체적인 예로서 예를 들어, RNA 간섭제, 앱타머, 안티센스 DNA, 리보자임 (데옥시 리보자임 포함), U1 어댑터를 이용하는 방법이있다. RNA 간섭제는 생체 내에서 RNA 간섭 (RNA inteference : RNAi)을 유도하여 표적 유전자의 전사 산물의 분해를 통해 그 유전자의 발현을 억제 (침묵) 할 수 있는 물질을 말한다. 예를 들어, siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA) 또는 miRNA (micro RNA) (pri-miRNA 및 pre-miRNA 포함)가 해당된다. 이러한 방법은 표적 유전자의 전사 산물에 대한 특이성이 비교적 높고, 처리 방법도 쉽다는 것에서 편리하다.
상기 RNA 간섭제, 앱타머, 안티센스 DNA, 리보자임 및 U1 어댑터는 모두 공지된 기술이며, RNA 간섭제에 관해서는, 예를 들면, Bass BL, 2000, Cell, 101, 235-238; Sharp PA 2001 , Genes Dev., 15, 485-490; Zamore PD 2002, Science, 296, 1265-1269; Dernburg, AF, GH, 2002, Cell, 111,159-162에 기재된 방법을, 핵산 앱타머 관해서는, 예를 들어, Sumedha D. Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45 : 1628-1650에 기재된 방법, 안티센스 DNA 및 리보자임에 관해서는, 예를 들면, Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재 방법을 그리고 U1 어댑터에 대해서는 Goraczniak R., et al., 2009, Nat Biotechnol., Vol 27, p257-263에 기재된 방법을 참조하면 된다.
(2) 활성 저해 물질을 이용하는 방법
활성 저해 물질을 이용하는 방법은 표적 효소인 글루크론산 제 2 전이 효소를 억제하는 물질로 개체 또는 세포를 처리하여 해당 효소의 활성을 직접 또는 간접적으로 억제 방법이다. 글루크론산 제 2 전이 효소의 억제가 완전히 억제뿐만 아니라 부분적으로 억제에도 좋다.
활성 저해 물질은 표적인 글루크론산 제 2 전이 효소에 결합하여 그 활성을 직접적으로 억제하는 물질, 글루크론산 제 2 전이 효소를 분해하는 물질, 기질인 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(triterpenoid monoglucuronide) 를 둘러싸고 밖으로 글루크론산 제 2 전이 효소와 충돌하여 그 활성을 간접적으로 억제하는 물질 등을 들 수 있다.
글루크론산 제 2 전이 효소에 결합하여 그 활성을 억제하는 물질로는 예를 들어, 글루크론산 제 2 전이 효소 또는 그 단편을 항원으로 하는 항체, 앱타머 또는 저분자 화합물을 들 수 있다. 항체 또는 앱타머는 상기 분야의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.
상기 억제 공정 후에 개체 또는 세포에서 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 추출하여 회수하는 방법은 상기 분야에 공지된 일반적인 글리시리진(glycyrrhizin)을 추출, 회수하는 방법을 사용하면 된다. 예를 들어, Hayashi 등의 방법 (Hayashi et al., 2003, Biol. Pharm. Bull., 26 : 867-871)을 참조하면 된다. 본 발명의 제조 방법에 의하면, 최종 산물로 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 안정적으로 저렴하게 비교적 다량으로 얻을 수 있다.
7. 식물 선발법
본 발명의 제 7 실시예는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 이용한 식물 선발 방법에 관한 것이다. 그 방법은 대상 식물의 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드의 유무 또는 그 발현을 검출하여 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 갖는 식물을 선발하는 방법이다. 이 방법은 대상 식물에서 제조된 핵산 함유 샘플, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편을 이용하여 핵산 증폭 법 또는 핵산 하이브리드 화하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 것을 포함한다.
본 발명에서 「대상 식물」은 선발 법에 제공되는 식물이다. 사용하는 식물체의 부위는 특별히 한정하지는 않지만, 바람직하게는 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현 가능성이 높은 부위, 예를 들면, 뿌리 부분과 줄기이다.
상기 핵산 함유 샘플은 상기 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 페놀 추출법, 페놀 클로로포름 추출법, CTAB 법 등을 이용하여 대상 식물에서 준비할 수 있다.
상기 「핵산 증폭 법」이라 함은 특정 핵산 영역을 핵산 중합 효소에 의해 증폭시키는 방법을 말한다. 예를 들어, PCR (중합 효소 연쇄 반응) 법, RT-PCR (역전사 중합 효소 연쇄 반응) 법, ICAN (등온 유전자 증폭) 법 또는 그 응용 방법 (예를 들어, 실시간 PCR 법)을 들 수 있다. 바람직하게는 PCR 법이다. 이것은 그 방법이 해당 분야에서 현재 세계에서 가장 널리 사용되는 방법이며, 시약, 키트 및 반응 장치 등이 충실하고 다른 다양한 응용 기술이 알려져 있기 때문이다.
상기 「핵산 혼성화 법」이라 함은 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산 단편을 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편과 핵산 단편 사이의 염기 대합(base pairing)을 이용하여 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편을 검출 또는 정량하는 방법이다. 핵산 혼성화 법은 예를 들어, DNA-DNA 하이브리드화 법, DNA-RNA 하이브리드화 법 또는 RNA-RNA 하이브리드 화 방법을 들 수 있다. 이러한 구체적인 방법은 예를 들어, 노잔 하이 화 (분자 생물학 실험 프로토콜 I (1997 년), 니시노 사노 모두 역, 마루 젠 주식회사 참조), DNA 마이크로 어레이 법 (DNA microarray and modern PCR method (2000), supervised by Muramatsu and Nawa, Shujunsha Co., Ltd.) 등을 참조하기 바란다.
상기 핵산 증폭법 또는 핵산 하이브리드화에 사용 프라이머 또는 프로브는 제 2 실시예에 기재된 중 하나의 염기 서열, 바람직하게는 서열 번호 5로 나타내는 염기 서열 또는 그 돌연변이 또는 오루소로구 유전자의 염기 서열에 따라 설계하면 된다. 본 발명의 프라이머 및/또는 프로브를 구성하는 핵산은 보통 DNA, RNA이지만, 필요에 따라 PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid; 등록 상표), 메틸포스포네이트 형 DNA, 포스포로티오에이트 형 DNA, 2'-O- 메틸 형 RNA 등의 화학 수식 핵산(chemically modified nucleic acid )과 핵산(pseudo nucleic acid)을 포함하고 있다. 또는 이들의 조합으로 구성할 수도 있다. 또한 프라이머 및 프로브는 형광 염료 (예 후루오레사민 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, FITC, cy3, cy5, FAM, HEX, VIC) 끄는 물질 (TAMRA, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3), 비오틴 또는 (스트렙토) 아비딘 또는 자석 구슬 등의 자격 물질 또는 방사성 동위 원소 (예를 들어, 32P, 33P, 35S) 등을 이용하여 수식 또는 표지할 수도 있다. 프라이머 및 프로브에서 이러한 자격 물질 등의 수식/표지판 위치는 그 자격 물질의 특성과 사용 목적에 따라 적절하게 결정하면 된다. 일반적으로는 5 '또는 3'말단 부분에 한정되는 경우가 많다. 또한 하나의 프라이머 및 프로브 분자가 하나 이상의 수식 물질로 규정되어 있어도 상관 없다.
본 발명에서 사용하는 프라이머 및 프로브의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 프라이머의 경우 일반적으로 15 ~ 50 염기 길이, 바람직하게는 17 ~ 30 염기 길이이다. 프로브의 경우 남부 또는 노잔 하이브리드 화에 사용하는 경우, 최소 10 염기 길이 이상에서 길이, 바람직하게는 15 염기 길이 이상에서 전장, 보다 바람직하게는 30 염기 길이 이상에서 길이, 더욱 바람직하게는 50 염기 길이 이상에서 길이이며, DNA 마이크로 어레이에 사용하는 경우, 10 ~ 50 염기 길이, 바람직하게는 15 ~ 30 염기 길이보다 바람직하게는 20 ~ 25 염기 길이이다. 그러나 이것에만 국한되지 않는다. 일반적으로 프로브가 길수록 하이브리드화 효율이 상승하고 감도가 높아진다. 한편, 프로브가 짧을수록 감도가 낮아 지지만, 반대로 특이성이 상승한다. 고상 위의 프로브는 일반적 0.1 ㎍ ~ 0.5 ㎍의 용액을 사용하여 점적한다. 프라이머, 프로브의 구체적인 예로서 예를 들어, G. uralensis 용 프라이머 세트라면 서열 번호 1 및 2를 L. japonicus 용 프라이머 세트라면 서열 번호 6 및 7을 사용할 수 있다.
핵산 증폭 조건은 증폭 핵산 단편의 염기 길이와 양, 그리고 사용하는 프라이머의 염기 길이 및 Tm 값 등에 의해 변동하기 때문에 이러한 조건에 따라 적절히 정한다. 일례로 PCR 법이면 일반적으로 94 ~ 95℃에서 5 초 ~ 5 분 동안 어닐링 반응을 50 ~ 70℃에서 10 초 ~ 1 분간 신장 반응을 68 ~ 72℃에서 30 초 ~ 3 분 실시 이것을 1 사이클로 15 ~ 40 사이클 정도하고 마지막으로 68 ~ 72℃에서 30 초 ~ 10 분의 신장 반응을 할 수 있다.
핵산 증폭 산물 예를 들어, 아가 로스 전기 영동, 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동점 이종 교잡 등을 이용하여 검출할 수 있다. 또한 이러한 핵산 증폭 산물의 정량은 케미루미 촬영 해석 장치(chemiluminescence-imaging analyzer) (예 : ATTO 사 : 라이트 캡쳐 시리즈) 또는 이미징 분석기 (예 : FUJIFILM 사 : BAS 시리즈)를 이용하여 할 수 있다.
제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현 량을 PCR 법으로 정량하는 방법의 일례로서 내부 표준 물질을 이용한 RT-PCR 법을 들 수 있다 (forefront of PCR Method (1996), edited by Sekiya and Fujinaga, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd). 사용하는 내부 표준으로는 일반적으로 housekeeping 유전자 (예 : GAPDH, β-액틴 등)이 사용된다. 이 방법으로 표적 mRNA 양의 내부 표준 물질에 대한 상대적인 결과를 얻을 수 있다. 하나의 샘플에 대한 PCR 중에 몇 사이클마다 반응액을 샘플링하여 PCR 산물의 양을 정량하고 그래프에 플롯한다. 그렇게 해서 얻어진 그래프의 지수 증가 시절의 포인트에 대해 회귀 분석을 실시해, y 절편을 구함으로써 초기 주 형량을 산출할 수 있다 (Biological Experiment Illustrated 3, "actually amplified by PCR)" (1998), written by Hiroki Nakayama, Shujunsha Co., Ltd).
또한 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현 량을 실시간 정량 PCR 법으로 정량할 수 있다. PCR 산물이 특이적으로 형광 표지된 반응계에서 형광 강도를 검출하는 장치를 갖춘 온도 자전거 타는 사람 장치를 이용하여 PCR을 수행하여 반응 중에 산물의 양을 샘플링할 필요없이 실시간으로 모니터링할 수 그 결과를 컴퓨터로 회귀할 수 있다. PCR 산물을 표지하는 방법으로는 형광 표지 된 probe를 이용하는 방법 (TaqMan (등록 상표) PCR 법)과 두 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하는 방법이 있다. TaqMan (등록 상표) PCR 법은 5' 말단 부분이 퀘차 물질(quencher substance)로, 또한 3'말단 부분이 형광 염료로 수정된 프로브를 사용한다. 일반적으로 5' 말단부 퀘차 물질이 3' 말단 부분의 형광 색소를 억제하고 있지만, PCR이 이루어지면 Taq 중합 효소가 가지는 5'-> 3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 해당 프로브가 분해되어 그로 인해 끄는 물질의 억제가 해제되기 때문에 형광을 발하게 된다. 그 형광 금액은 PCR 생성물의 양을 반영한다. PCR 산물이 검출 한계에 도달할 때의 사이클 수 (CT)과 초기 주형 양과는 역 상관 관계에 있기 때문에 실시간 측정법으로는 CT를 측정함으로써 초기 주 형량을 정량하고 있다. 몇 단계의 기지 량의 주형을 이용하여 CT를 측정하고 검량선을 제작하면 미지 시료의 초기 주 형량의 절대 값을 산출할 수 있다. RT-PCR에 사용하는 역전사 효소는 예를 들어, M-MLV RTase, ExScript RTase (TaKaRa 샤샤), Super Script II RT (GIBCO BRL 사) 등을 사용할 수 있다.
핵산 하이브리드화를 할 경우 위 프로브 뿐만 아니라 샘플의 핵산을 수정/분류할 수 있다. 수식/표지에는 동위 원소 (예를 들어, 32P, 33P, 35S) 또는 형광 (후루오레사민 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, FITC, Cy3, Cy5)를 사용할 수있다. 목적에 따라 적절한 수식/표지판을 하면 좋고, 특히 제한되지 않는다.
하이브리드화는 상기 엄격 조건으로 하는 것이 바람직하다. 비특이적으로 잡종 목적 외 핵산을 제거하는 것이다.
노잔 하이브리드 화 방법은 일반적으로 RNA 서열의 검출 정량을 위해 사용된다. 식물에서 공지의 방법으로 얻은 RNA 시료를 agarose gel 전기 영동으로 분리 한 후, 나일론 또는 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 RNA를 전사하여 제 2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 표지 된 cDNA 또는 그 단편을 프로브로 하이브리드 화를 실시 원하는 폴리뉴클레오티드를 검출하거나 정량할 수 있다.
DNA 마이크로 어레이 법은 유리 및 필터 등의 어레이에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 cDNA 또는 그 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 그 단편을 프로브로 고정한다. 공지의 방법으로 얻은 RNA에 대한 역전사 반응을 하고 Cy3-dUTP, Cy5-dUTP 등을 캡처해 레이블화 cDNA를 얻는다. 어레이의 고정화 프로브 및 표지된 cDNA의 하이브리드 화를 실시해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출 정량한다. 그러면 글리시리진(glycyrrhizin) 높은 함량의 식물을 선발 스크리닝이 가능하다.
또한, 상기 분자 생물학적 기법에 관한 구체적인 방법 등은 Green?, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조하면 된다.
실시예
다음의 실시예에서, 본 발명의 일례를 들어 구체적으로 설명한다.
<실시예 1 : 감초 속 식물의 mRNA 준비와 cDNA library 제작 (1)>
독립 행정법인 의약 기반 연구소 약용 식물 자원 연구 센터 홋카이도 연구부 (홋카이도나요로시)에서 포장 재배된 총 G. uralensis의 줄기를 6 월에 채취했다. RNA 추출 시약 RNAwizTM (Ambion 사)을 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 총 RNA를 조제하였다. 얻은 총 RNA로부터 mRNA를 조제하여 벡터 밀봉법 (Kato, S. et al., DNA Res., 12, 53-62, 2005)에 의해 cDNA 합성을 실시했다. cDNA 단편을 플라스미드 벡터 pGCAPzf3 (Tsugane, T. et al., Plant Biotechnology., 22, 161-165, 2005)에 내장 cDNA 라이브러리를 구축했다.
<실시예 2 : 감초 속 식물의 mRNA 준비와 cDNA library 제작 (2)>
독립 행정법인 의약 기반 연구소 약용 식물 자원 연구 센터 쓰쿠바 연구부 (이바라키현 츠쿠바시)에서 포장 재배되고 있던 정식 후 4 년 이상 경과한 것으로 간주된 G. uralensis의 줄기를 10 월에 채취했다. RNA 추출 시약 TRIzol (등록 상표) (life technologies 사) 및 정제 컬럼 RNeasy (등록 상표) (Quiagen 사)을 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 총 RNA를 조제하였다. 얻은 총 RNA로부터 mRNA를 조제하여 oligo-capping 방법(Murayama, K. et al., Gene, 138, 171-174, 1994, 및, Suzuki, Y. et al., Gene, 200, 149-156 )에 의해 cDNA 합성을 실시했다. cDNA 단편을 플라스미드 벡터 pCMVFL3에 내장 cDNA 라이브러리를 구축했다.
<실시예 3 : 시퀀스 분석 (1)>
실시예 1에서 얻어진 cDNA 라이브러리에서 대장균 DH12S (life technologies 사) 또는 DH10B T1 파지레지스탄트(phage-resistant) (life technologies 사)를 형질 전환하여 얻어진 약 30,000 개의 single colony를 선택하고 384 매 접시에 접종했다. 콜로니 PCR에서 시퀀스 반응의 주형으로하는 DNA를 증폭하고 에탄올 침전에 의한 정제를 실시했다. 그것을 주형으로 하여 Applied Biosystems 사 BigDye ver3.1을 사용하여 각 cDNA 단편의 5' 말단에서 시퀀스 반응을 수행하였다. 에탄올 침전에 의한 정제 후 Applied Biosystems 사 3730 xl DNA Analyzer를 이용하여 염기 서열 분석을 실시했다.
<실시예 4 : 시퀀스 분석 (2)>
실시예 2에서 얻어진 cDNA 라이브러리에서 대장균 DH5α형질 전환하여 얻어진 약 26,000 개의 single colony를 선택하고 384 개의 플레이트에 접종했다. 콜로니 PCR에서 시퀀스 반응의 주형으로 하는 DNA를 증폭하고 에탄올 침전에 의한 정제를 실시했다. 그것을 주형으로 하여 Applied Biosystems 사 BigDye ver 3.1을 사용하여 각 cDNA 단편의 5' 말단에서 시퀀스 반응을 수행하였다. 에탄올 침전에 의한 정제 후 Applied Biosystems 사 3730 xl DNA Analyzer를 이용하여 염기 서열 분석을 실시했다.
<실시예 5 : EST (Expression Sequence Tag) 클러스터링>
실시예 3에서 얻은 약 30,000 개의 EST 데이터 및 실시예 4에서 얻은 약 26,000 개의 EST 데이터를 하나의 데이터 세트에 통합하고 PHRAP 프로그램 (http://www.phrap.org)를 이용하여 클러스터링을 실시했다. 그 결과, 10,372 개의 독특한 콘티구(contigs)을 얻었다.
<실시예 6 : 상동 검색에 의한 패밀리 1 당 전이 효소(family 1 glycosyltransferase) 유전자 추출>
실시예 5에서 얻어진 10,372 개의 콘티구 배열을 쿼리로 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에 등록되어 알려진 단백질에 대한 BLASTX 검색 (Altschul, SF et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389 -3402, 1997)를 실시했다. 패밀리 1 당 전이 효소가 글리시레틴산 이후 글리시리진(glycyrrhizin) 생합성 경로(도 2)에 관여할 것으로 예측하고 해당 데이터베이스에 등록되어 알려진 패밀리 1 당 전이 효소에 높은 상 동성을 나타내는 콘티구을 선발했다. 선발한 콘티구을 구성하는 여러 EST 클론에서 가장 긴 5' 말단 영역을 유지하는 것으로 판단되는 것에 대해서는 플라스미드 DNA를 추출하고 복제된 각 cDNA 단편 (31 개)의 길이 염기 서열을 결정했다.
<실시예 7 : 유전자 발현 분석 (후보 유전자 검사)>
실시예 6에서 얻은 31 개의 패밀리 1 당 전이 효소 유전자 군에서 글리시리진(glycyrrhizin) 생합성에 관여 가능성이 분자 종을 선발하기 위해 각 패밀리 1 당 전이 효소 분자 종이 식물체의 모든 조직 발현하고 있는지를 RT-PCR 법으로 조사하였다. 글리시리진(glycyrrhizin)을 높이 축적 지하부 조직 (비대 뿌리 및 줄기)와 글리시리진(glycyrrhizin)가 검출되지 않는 지상부 조직 (잎과 줄기)의 총 4 가지 종류의 조직에서 총 RNA를 조제하였다. 얻은 총 RNA 1㎍을 이용하여 SMART RACE cDNA amplification kit (clontech 사)을 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 패스트 가닥 cDNA 합성을 실시했다.
이어 각 패밀리 1 당 전이 효소에 특이적으로 단련하는 센스 및 안티센스 프라이머를 설계하고, 상기 4 종의 퍼스트 가닥 cDNA 각 2 ㎕를 주형으로 Ex TaqTM DNA 중합 효소 (TaKaRa 사)를 이용하여 25 ~ 30 사이클의 PCR을 실시했다. 얻어진 PCR 단편을 아가로오스 겔 전기 영동으로 분석하고 뿌리 및 줄기에서의 발현이 특히 높은 패밀리 1 당 전이 효소 분자 종을 선발했다.
결과의 일부를 그림 3에 나타낸다. 글리시리진(glycyrrhizin) 합성 과정에 관여하는 β-미린 합성 효소(bAS : β-amyrin synthetase) 유전자 (도 1 참조) CYP88D6 유전자 및 CYP72A154 유전자 (도 2 참조)은 줄기 및 뿌리 부분에서 강한 발현을 확인할 수 있다. 비슷한 발현 패턴이 실시예 6에서 얻은 31 개의 후보 유전자 중도 3에 도시 GuUGT73.8 유전자도 확인되었다. 그래서 이 GuUGT73.8 유전자에 대해 다음의 실시예에서 나타낸 바와 같이 실험을 실시했다.
<실시예 8 : GuUGT73.8 유전자 클로닝>
실시예 7의 심사에서 얻은 글루크론산 전이 효소 후보 GuUGT73.8의 전장 유전자를 클로닝했다.
GuUGT73.8 유전자의 길이 코드 영역을 분리하였다. 구체적으로는, 실시예 7에서 제작한 비 뿌리 유래의 총 RNA를 이용하여 조제한 퍼스트 가닥 cDNA를 주형으로 GuUGT73.8 폴리펩티드의 N 말단과 C 말단에 상당하는 부분의 올리고 DNA를 각각 전달 프라이머 (서열 번호 1) 및 역방향 프라이머 (서열 번호 2)으로 KOD-plus-DNA Polymerase (TOYOBO 사)를 이용하여 어닐링 온도 56℃, 반응 온도 68℃에서 30 사이클의 PCR을 실시했다. 또한 서열 번호 1로 표시 포워드 프라이머는 5'말단에 4 염기 (cacc)가 부가되어 있지만, 이것은 pENTRTM/D-TOPO (등록 상표) 항목 벡터 (life technologies 사)에 클로닝용이다. PCR로 증폭된 DNA 단편을 pENTRTM/D-TOPO (등록 상표) 항목 벡터에 클로닝하여 얻은 3 개의 독립적인 클론 (pENTRTM/D-TOPO-GuUGT73.8)에 대한 염기 서열을 결정했다. 그 결과 얻어진 GuUGT73.8 유전자의 염기 서열이 서열 번호 5이며, 또한 그때 추정된 GuUGT73.8의 아미노산 서열이 서열 번호 4이다.
BLAST를 이용한 상 동성 검색하여 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 GuUGT73.8는 새로운 단백질인 것이 밝혀졌다.
<실시예 9 : L. japonicus 유래 GuUGT73.8 오루소로구(orthologue) 유전자 탐색>
G. uralensis와 같은 콩과 식물인 L. japonicus에서 GuUGT73.8 유전자와 유사한 기능을 갖는 것으로 예상되는 오루소로구 유전자를 탐색했다.
L. japonicus의 게놈 정보 데이터베이스인 miyakogusa.jp (http://www.kazusa.or.jp/lotus/release1/index.html)의 BLAST 상 동성 검색 기능을 사용하여 GuUGT73.8 높은 아미노산 동일성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 2 종의 부분 염기 서열, LjSGA_046111 및 LjSGA_014618 나타났다. 이러한 배열의 일부는 중복하고 동일한 폴리펩티드 각각 N 말단과 C 말단을 암호화하는 것으로 추정되었다. LjSGA_046111 및 LjSGA_014618로부터 추정되는 폴리펩티드는 GuUGT73.8에 대해 66 %의 아미노산 동일성을 보여 주었다.
<실시예 10 : L. japonicus 유래 GuUGT73.8 상동 유전자의 분리>
L. japonicus (MG20)를 인공 기상 장치 내 (23℃, 16 시간)으로 육성하고 발아 후 4 주째 식물의 잎, 뿌리 각각 총 RNA를 조제하였다. 얻은 총 RNA를 1 ㎍ 이용하여 SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech 사)을 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 패스트 가닥 cDNA 합성을 실시했다. 패스트 가닥 cDNA 각 2 ㎕를 주형으로 LjSGA_046111 및 LjSGA_014618로부터 추정되는 폴리펩티드의 N 말단과 C 말단에 상당하는 부분의 올리고 DNA를 각각 포워드 프라이머 (서열 번호 6) 및 역방향 프라이머 (서열 번호 7)에 사용, KOD plus ver.2 polymerase (TOYOBO 사)를 이용하여 어닐링 온도 56℃, 반응 온도 68℃에서 35 사이클의 PCR을 실시했다. 또한 pENTRTM / D-TOPO (등록 상표) 항목 벡터 (life technologies 사)에 클로닝시 필요하기 때문에 서열 번호 A 프라이머는 5' 말단에 4 염기 (cacc)이 인공에 부가되어있다. 뿌리 유래 패스트 가닥 cDNA에서 증폭된 DNA 단편을 pENTRTM / D-TOPO 항목 벡터에 클로닝하여 얻은 3 개의 독립적인 복제에 대한 폴리뉴클레오티드 서열을 결정했다. 이로 인해 얻은 배열이 배열 번호 8이고, 그때 추정되는 폴리펩티드 서열이 서열 번호 9이다. 서열 번호 9의 아미노산 서열은 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대해 66.9 %의 동일성을 가지고 있었다.
<실시예 11 : 효모 발현용 벡터의 구축>
실시예 8에서 제작한 서열 번호 5의 폴리뉴클레오티드를 갖는 플라스미드 (항목 복제)와 목적지 벡터 pYES-DEST52 (life technologies 사)를 혼합하여 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (life technologies 사)를 이용 밖으로 염기 서열 특이적 재조합 반응 (GATEWAY attL >attR 반응)에 의해, 서열 번호 5로 나타내는 DNA 단편을 pYES-DEST52에 옮겨 서열 번호 5의 유전자 효모 발현 벡터 pDEST52-GuUGT73.8를 얻었다.
<실시예 12 : 형질 전환 효모의 제작>
효모 INVSc1 주 (life technologies 사) (MATa his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52 MATAlpha his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52)에 실시예 11에서 얻은 pDEST52-GuUGT73.8을 도입했다. 대조군으로 INVSc1 주 빈 벡터에 상당하는 pYES2/CT (life technologies 사)를 도입했다. 효모의 형질 전환은 Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research 社)를 이용하여 첨부된 프로토콜로 수행하였다.
<실시예 13 : 형질 전환 효모의 GuUGT73.8의 발현>
pDEST52-GuUGT73.8 또는 대조군 용 pYES2/CT를 보유하는 형질 전환 효모를 2 % 라피노스를 포함하는 10 mL의 Yeast nitrogen base (YNB) 배지 (-Ura)를 이용하여 30℃, 165 rpm에서 25 시간 진탕 배양하였다. 그 후, 1 mL의 20 % 갈락토스를 첨가하여 30℃에서 25 시간 추가로 진탕 배양하였다. 배양액을 3,000 g, 4℃에서 10 분간 원심 분리하여 효모 세포 펠렛을 얻었다. 얻어진 효모 세포 펠렛을 400 ㎕의 추출 버퍼 (pH7.0, 50 mM Tris, 1 mM DTT, 14.4 mM, β-머캅토에탄올, 20 % Glycerol)에 현탁한 후, 동 체적의 유리 구슬 (SIGMA 사)를 첨가했다. 효모 세포를 분쇄하기 위해 30 초간 볼텍스 믹서에서 격렬하게 교반 한 후, 온도 상승에 의한 효소 활성의 손실을 방지하기 위해 즉시 얼음에 옮기고 1 분간 둔 조작을 15 회 반복했다. 얻어진 액체를 10,000 g, 4℃에서 10 분간 원심 한 후 상층 액을 효모 단백질 추출물로 회수했다. 그 결과, 서열 번호 3에 나타내는 폴리펩티드 (GuUGT73.8)를 발현하는 형질 전환 효모 유래의 단백질 추출물 (샘플 A)와 GuUGT73.8를 발현하지 않는 빈 벡터만 형질 전환한 효모 유래의 단백질 추출물 (샘플 B)를 얻었다. Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad 사)를 이용하여 샘플 A 및 샘플 B의 단백질 농도를 측정했다.
<실시예 14 : 효모 단백질 추출물을 이용한 in vitro 효소 분석>
실시예 13에서 얻은 200 ㎍ 샘플 A 및 샘플 B (80 ㎕의 볼륨 조정) 10 ㎕의 1M 트리스-염산 버퍼 (pH7.0) 5 ㎕의 400 mM MgCl2, 0.2 ㎕의 14.4 mM, β-머캅토에탄올, 4 ㎕의 30 mM 글리시레틴산 모노글루크로나이드 (설탕 수용체 기질) 10 ㎕의 100 mM UDP- 글루크론산 (당 공여체 기질) 91 ㎕의 멸균 물을 혼합한 후 30℃, 1,000 rpm에서 교반시키면서 24 시간 동안 배양 설탕 (글루크론산) 전이 반응을 수행하였다. 부화 후 얻어진 용액을 각각 반응 용액 A 및 반응 용액 B로 했다.
<실시예 15 : 변환 물의 분류>
실시예 14에서 얻은 반응 용액 A와 B를 200 ㎕의 1- 부탄올로 추출했다. 1- 부탄올 추출물 100 ㎕ 메탄올 400 ㎕를 혼합하여 LC-MS 분석 시료로 하였다. LC-MS 분석은 LC 부 (1100 series, Agilent Technologies)와 MS 부 (QSTAR PULSAR, Applied Biosystems)를 연결한 기기에 수행하였다. 컬럼은 센슈 팩 25 cm > 2 mm id를 이용하여 용매는 0.1 % 아세트산 - 아세토 니트릴 : 0.1 % 아세트산 - 물 = 20:80 (0~2 분) 20 : 80-95 : 5 (2 ~ 12 분), 95 : 5 (12 ~ 20 분), 유속은 0.2 mL/min의 조건에서 분석했다. 변환 물의 분류는 실시예 14에서 제조한 글리시레틴산 모노글루크로나이드 및 글리시리진(glycyrrhizin)을 목표 제품으로 LC의 유지 시간 및 MS 스펙트럼을 비교하여 결정했다.
실시예 14에서 샘플 A를 이용하여 효소 분석을 실시한 반응 용액 A에서, 당 수용체 기질인 글리시레틴산 모노글루크로나이드에 해당하는 피크가 검출된(도 4-1: 흰색 화살표) 반면에 글리시레틴산 모노글루크로나이드 1 분자의 글루크론산이 추가된 것으로 생각되는 1 개의 피크 (도 4-1, 검정 화살표)가 검출되었다. 그 피크의 유지 시간 및 질량 스펙트럼이 글리시리진(glycyrrhizin)와 잘 일치했다.
한편, 대조군인 실시예 14에서 샘플 B를 이용하여 효소 분석을 실시한 반응 용액 B에서는 그림 4-1과 마찬가지로, 설탕 수용체 기질인 글리시레틴산 모노글루크로나이드에 상당하는 피크 검출된 (도 4-2: 흰색 화살표). 그러나 그림 4-1의 검은 화살표로 표시되는 글리시리진(glycyrrhizin)에 해당하는 피크는 검출되지 않았다.
이상의 결과로부터 상기 실시예 7에서 얻어진 신규 효소 GuUGT73.8은 글리시레틴산 모노글루크로나이드 2 위치의 히드록시기에 추가로 글루크론산이 전이하여 글리시레틴산 모노글루크로나이드를 글리시리진(glycyrrhizin)로 변환하는 글루크론산 제 두 전이 활성을 갖는 신규의 글루크론산 제 2 전이 효소와 동정되었다.
본 명세서에서 인용 한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 본원에 도입한다.
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> Glucuronyltransferase, gene encoding the same and method for
utilization of the same
<130> PH-5846-PCT
<150> JP 2013-078847
<151> 2013-04-04
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 1
caccatggac tcctttgggg ttgaaggtga 30
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 2
ttaagccact gcctccatta atttgt 26
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> consensus sequence of substrate-binding domain in glucuronyltransferase
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is any of amino acids
<400> 3
Ser His Xaa Ile Arg Val Val
1 5
<210> 4
<211> 506
<212> PRT
<213> Glychyrrhiza uralensis
<400> 4
Met Asp Ser Phe Gly Val Glu Gly Asp His Gln Ala Asp Thr Thr Val
1 5 10 15
Leu Lys Ala Val Phe Leu Pro Phe Ile Ser Lys Ser His Leu Ile Arg
20 25 30
Val Val Asp Lys Ala Arg Ile Phe Ala Met His Gly Val Asp Val Thr
35 40 45
Ile Ile Thr Thr Pro Ala Asn Ala Ala Ala Phe Gln Thr Ser Ile Asp
50 55 60
His Asp Ser Ser Arg Ser Arg Ser Ile Lys Thr His Ile Val Pro Phe
65 70 75 80
Pro Gln Val Pro Gly Leu Pro Gln Gly Phe Glu Arg Leu Asp Ala Asp
85 90 95
Thr Pro Gln His Leu Leu Pro Lys Ile Tyr Gln Gly Leu Ser Ile Leu
100 105 110
Gln Glu Gln Phe Gln Gln Leu Phe Arg Glu Met Arg Pro Asp Phe Ile
115 120 125
Val Thr Asp Met Tyr Tyr Pro Trp Ser Val Asp Ala Ala Ala Glu Leu
130 135 140
Gly Ile Pro Arg Leu Val Cys Asn Gly Gly Ser Tyr Phe Ala Gln Ser
145 150 155 160
Ala Val Asn Ser Ile Glu Leu Phe Ser Pro Gln Ala Lys Val Asp Ser
165 170 175
Asn Thr Glu Thr Phe Leu Leu Pro Gly Leu Pro His Glu Val Glu Met
180 185 190
Thr Arg Leu Gln Leu Pro Asp Trp Leu Arg Gly Ala Pro Asn Glu Tyr
195 200 205
Thr Tyr Leu Met Lys Met Ile Lys Asp Ser Glu Arg Lys Ser Tyr Gly
210 215 220
Ser Leu Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Leu Glu Gly Thr Tyr Glu Glu His
225 230 235 240
Tyr Lys Lys Ala Met Gly Thr Lys Ser Trp Ser Val Gly Pro Val Ser
245 250 255
Leu Trp Val Asn Gln Asp Ala Ser Asp Lys Ala Cys Arg Gly Asp Val
260 265 270
Lys Glu Gly Lys Gly Asp Gly Val Val Leu Thr Trp Leu Asp Ser Lys
275 280 285
Thr Glu Asp Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Met Asn Lys Phe
290 295 300
Pro Lys Thr Gln Leu Val Glu Ile Ala His Ala Leu Glu Asp Ser Gly
305 310 315 320
His Asp Phe Ile Trp Val Val Gly Lys Ile Glu Glu Gly Glu Gly Gly
325 330 335
Ala Asp Phe Leu Arg Glu Phe Glu Lys Lys Val Lys Glu Lys Asn Arg
340 345 350
Gly Tyr Leu Ile Trp Gly Trp Ala Pro Gln Leu Leu Ile Leu Glu His
355 360 365
Pro Ala Val Gly Ala Val Val Thr His Cys Gly Trp Asn Thr Val Met
370 375 380
Glu Ser Val Asn Ala Ser Leu Pro Leu Ala Thr Trp Pro Leu Phe Ala
385 390 395 400
Glu Gln Phe Phe Asn Glu Lys Leu Val Val Asp Val Val Lys Ile Gly
405 410 415
Val Pro Val Gly Val Lys Glu Trp Arg Asn Trp Asn Glu Phe Gly Asp
420 425 430
Glu Val Val Lys Arg Glu Asp Ile Gly Lys Ala Ile Ala Phe Leu Met
435 440 445
Gly Gly Gly Asp Glu Ser Leu Glu Met Arg Lys Arg Val Lys Val Leu
450 455 460
Ser Gly Ala Thr Lys Lys Ala Ile Gln Val Asp Gly Ser Ser Tyr Thr
465 470 475 480
Lys Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Lys Ser Ile Lys Leu Gln Lys
485 490 495
Val Asn Asn Lys Leu Met Glu Ala Val Ala
500 505
<210> 5
<211> 1521
<212> DNA
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Val Thr Asp Met Tyr Tyr Pro Trp Ser Val Asp Ala Ala Ala Glu Leu
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Gly Ile Pro Arg Leu Val Cys Asn Gly Gly Ser Tyr Phe Ala Gln Ser
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Ala Val Asn Ser Ile Glu Leu Phe Ser Pro Gln Ala Lys Val Asp Ser
165 170 175
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Leu Trp Val Asn Gln Asp Ala Ser Asp Lys Ala Cys Arg Gly Asp Val
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Glu Val Val Lys Arg Glu Asp Ile Gly Lys Ala Ile Ala Phe Leu Met
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Gly Gly Gly Asp Glu Ser Leu Glu Met Arg Lys Arg Val Lys Val Leu
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Ile Ala
Claims (16)
- 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드(oleanane-type triterpenoid monoglucuronide)에서 글루크론산(glucuronic acid)의 2 위치(2-position)의 히드록시기에 글루크론산을 전이하는 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 다음의 (a) ~ (c) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
(a) 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열,
(b) 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열에서 서열 번호 3으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3으로 나타낸 아미노산 서열 이외에서 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열, 또는
(c) 서열 번호 3으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.
- 제 1항에 있어서, 상기 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드는 β-아미린 모노글루크로나이드(β-amyrin monoglucuronide), 11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드(11-oxo-β-amyrin monoglucuronide), 30-히드록시-11-옥소-β-아미린 모노글루크로나이드(30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin monoglucuronide), 30-히드록시-β-아미린 모노글루크로나이드(30-hydroxy-β-amyrin monoglucuronide), 11- 옥소 글리시레틴산 모노글루크로나이드(11-oxoglycyrrhetinic acid monoglucuronide) 및 글리시레틴산 모노글루크로나이드(glycyrrhetinic acid monoglucuronide)로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드.
- 제 1항에 있어서, Glychyrrhiza 속 식물 또는 Medicago 속 식물로부터 유래된 폴리펩티드.
- 제 3항에 있어서, 상기 Glychyrrhiza 속 식물은 G. uralensis인 폴리펩티드.
- 삭제
- 제 1항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 6항에 있어서, 다음의 (d) ~ (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
(d) 서열 번호 5로 나타낸 염기 서열,
(e) 서열 번호 3으로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 이외의 폴리뉴클레오티드에서 1 또는 여러 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열; 또는
(f) 서열 번호 3으로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 서열 번호 5로 나타낸 염기 서열과 90 % 이상의 동일성을 갖는 염기 서열.
- 제 6항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 8항에 있어서, 과 발현 벡터 또는 구성적 발현(constitutive expression) 벡터인 재조합 벡터.
- 제 8항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체.
- 제 10항에 있어서, 콩과(Fabaceae) 식물인 형질 전환체.
- 제 10항에 기재된 형질 전환체를 배양하는 공정, 및 그 배양물로부터 제 1항에 기재된 폴리펩타이드를 추출하는 공정을 포함하는, 오레아난 형 트리테르페노이드 모노글루크로나이드에서 글루크론산에서 2 위치의 히드록시기에 글루크론산을 전이하는 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조 방법.
- β-아미린에서 글리시리진(glycyrrhizin)을 생합성 할 수 있는 개체 또는 세포에서, 제 1항에 기재된 폴리펩티드의 활성을 억제하는 공정을 포함하는 글리시레틴산 모노글루크로나이드(glycyrrhetinic acid monoglucuronide)의 제조 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 억제는 제 1항에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 발현의 억제, 또는 상기 폴리펩타이드의 활성 저해 물질 처리에 의한 억제인, 제조 방법.
- 제 6항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 유무 또는 그 발현을 검출하여, 상기 폴리뉴클레오티드를 갖는 식물을 선발하는 방법으로, 대상 식물에서 제조된 핵산 함유 샘플에 대하여, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그 조각을 이용하여 핵산 증폭법 또는 핵산 혼성화(hybridization)를 수행하여, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 정량하는 것을 포함하는, 식물 선발법.
- 삭제
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