KR102173430B1

KR102173430B1 - 도라지 복합발효추출물과 식물추출물을 포함하는 항염 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102173430B1
Application number: KR1020180121624A
Authority: KR
Inventors: 한은혜; 임미경; 이상호; 이소연
Original assignee: 고려은단주식회사; 고려은단헬스케어 주식회사
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2020-11-03
Also published as: KR20200041511A

Abstract

본 발명은 도라지 복합발효추출물(A)과; 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물 중에서 선택된 1종 이상의 식물추출물(B)을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 도라지, 감초 및 대추를 혼합하여 발효시킴으로써 항염효과를 높이고, 여기에 대두추출물, 달단메밀추출물 또는 당귀등복합추출물을 혼합함으로써 독성이 없는 함량 수준에서 항염효과가 더욱 높아진 항염 조성물을 얻을 수 있다.

Description

도라지 복합발효추출물과 식물추출물을 포함하는 항염 조성물 및 그 제조방법{Anti-inflammatory composition comprising complex fremented extract of Platycodon grandiflorum and herbal extract, and preparing method thereof}

본 발명은 도라지 복합발효추출물에 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물 중에서 선택된 1종 이상의 식물추출물을 혼합한 항염효과가 우수한 조성물 및 이러한 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

도라지(Platycodon grandiflorum)는 초롱꽃과의 여러해살이풀로서 길경·도랏·길경채·백약·질경·산도라지라고도 한다. 산과 들에서 자라며 봄이나 가을에 뿌리를 채취하여 생으로 먹거나 나물로 먹는다. 도라지는 사포닌을 많이 함유하며, 도라지 뿌리의 껍질을 벗기거나 그대로 말린 길경(桔梗)은 한방에서는 치열(治熱), 폐열, 편도선 및 설사의 치료에 사용한다.

감초(Glycyrrhiza uralensis)는 약용식물로 감초뿌리는 단맛이 나서 감미료나 한약재로 사용된다.

대추(Zizyphus jujuba Mill. Jujube)는 대추나무의 열매로, 과육에는 주로 당분이 들어 있으며 점액질·능금산·주석산 등도 들어 있고, 씨에는 베툴린·베투릭산·지방 등이 들어 있어 한방에서는 이뇨강장·건위진정·건위자양의 약재로 널리 쓰이고 식용으로도 널리 쓰인다.

대두(soybean)는 콩과의 일년생 초본인 콩(Glycine max Merrill) 및 그 열매를 가리킨다. 열매는 팥이나 완두와는 달리 단백질과 지방을 많이 함유하여 단백질의 함량이 약 40%, 지방의 함량이 약 18%이다. 된장, 간장, 식용유의 원료로 사용되고, 두부, 냉두부, 메주, 유부, 콩나물로 다량으로 소비되며, 단백 자원, 유지 자원 및 조미 자원으로 매우 중요한 역할을 하고 있다.

메밀은 마디풀목 마디풀과 메밀속에 속하는 일년생 또는 영년생 초본으로 총15개의 종 중에서 주로 재배되는 것은 보통메밀(Fagopyrum esculentum)과 달단메밀(Fagopyrum tataricum, 쓴메밀, 타타르메밀)이다. 달단메밀은 보통 메밀에 비해 쓴맛이 강하여 쓴메밀로 불리며 중세유럽에 달단인(타타르인)에 의해 유럽에 도입됐기 때문에 달단메밀 또는 타타르메밀이라고도 불린다. 메밀의 루틴성분은 모세혈관의 삼투압을 조절하여 고혈압이나 고지혈증을 예방하는 효과가 있다. 특히, 달단메밀은 보통메밀에 비해 루틴의 함량이 훨씬 높다는 연구결과들이 나오면서 달단메밀과 달단메밀 가공품에 대한 관심이 증가하고 있으나, 국내에서는 아직 그 이용이 미미한 실정이다.

당귀(Angelica gigas)는 한약재의 하나로 생리 활성 성분으로 데커시놀이 함유되어 있다. 변비 및 탈모에 효능이 있고 혈관을 확장시켜 혈류량을 증강시켜서 혈액 순환에 좋은 것으로 알려져 있다.

삼백초 (Saururus chinensis (Lour.) Baill.)는 꽃과 잎, 뿌리가 하얗기 때문에 삼백초라고 불린다. 삼백초는 뿌리를 비롯해 줄기, 잎, 꽃 전체를 약재로 이용하며 요리에도 첨가하고 차로 달여 마시기도 한다. 삼백초는 혈액순환, 항암, 항산화, 변비개선, 장건강, 천식개선, 이뇨작용, 부종완화, 혈관건강, 여성질환개선, 피부미용 등에 효과가 있다.

오미자(Schisandra chinensis)는 오미자나무의 열매로 단맛, 신맛, 쓴맛, 짠맛 및 매운맛의 5가지 맛이 나서 오미자라고 불린다. 시잔드린, 고미신, 시트럴, 사과산, 시트르산 등의 성분이 들어 있어 심장을 강하게 하고 혈압을 내리며 면역력을 높여 주어 강장제로 쓴다. 또한 폐 기능을 강하게 하고 진해·거담 작용이 있어서 기침이나 갈증 등을 치료하는 데 도움이 된다.

대한민국 등록특허 제10-0295366호 대한민국 등록특허 제10-0375560호 대한민국 등록특허 제10-0998225호 대한민국 공개특허 제10-2013-0120597호 대한민국 등록특허 제10-1211937호

본 발명은 도라지, 감초 및 대추를 혼합한 후 발효시킨 도라지 복합발효추출물(A)과 여기에 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물 중에서 선택된 1종 이상의 식물추출물(B)을 혼합하여 얻은 항염 효과가 우수한 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

항염 효과가 알려져 있는 식물은 많이 있으나 인체에 안전한 식물의 경우 대부분 미미한 수준의 항염효과를 나타내는데 불과하여, 이러한 식물성분들의 조합으로 독성이 없는 함량 범위에서 유의미한 수준의 항염 효과를 지닌 조성물을 얻기는 어렵다.

본 발명은 항염효과가 우수한 도라지 복합발효추출물을 중심으로 독성이 없는 함량 수준에서 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물 중 선택된 식물 추출물을 조합하여 항염 효과를 크게 상승시킨 식물성 항염 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,

(a) 도라지, 감초 및 대추를 혼합한 후 발효시켜 얻은 도라지 복합발효추출물(A)과; (b) 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물 중에서 선택된 1종 이상의 식물추출물(B)을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.

상기 항염 조성물은, 상기 도라지 복합발효추출물(A) 100~1,600 중량에 대해 상기 식물추출물(B) 50~1,200 중량의 비율로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 항염 조성물에서, 상기 식물추출물(B)은 대두추출물이며, 상기 도라지 복합발효추출물(A) 100~1,600 중량에 대해 100~1,000 중량의 비율로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 항염 조성물에서, 상기 식물추출물(B)은 달단메밀추출물이며, 상기 도라지 복합발효추출물(A) 100~1,600 중량에 대해 500~1,200 중량의 비율로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 항염 조성물에서, 상기 식물추출물(B)은 당귀, 삼백초 및 오미자의 복합추출물이며, 상기 도라지 복합발효추출물(A) 100~1,600 중량에 대해 50~150 중량의 비율로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 항염 조성물에서, 상기 도라지, 상기 도라지 복합발효추출물(A)은,

도라지와 감초를 건조하여 분쇄하고, 대추는 씨앗을 제거한 후 건조하여 채써는 단계; 상기 분쇄된 도라지와 감초 및 대추채를 1:1~3:1~3의 중량비로 혼합하고 혼합물 총 중량을 기준으로 5~10배의 물을 넣고 90~100℃에서 30~90분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계; 상기 추출액을 50~60℃로 냉각한 후 도라지, 감초 및 대추의 혼합물 100중량부에 대하여 셀룰라아제 0.5~2중량부와 아밀라아제 0.5~2중량부를 투입하여 2~4시간 동안 효소반응시켜 효소반응액을 얻는 단계; 상기 효소반응액을 110~130℃에서 40~80분 동안 멸균한 다음 25~35℃로 냉각시키는 단계; 상기 냉각된 멸균액 100중량부에 대하여 사카로마이세스 세레비지애 1~3중량부를 접종하고 14~18시간 동안 배양하여 배양액을 얻는 단계; 상기 배양액 10kg을 기준으로 95% 주정 8~12ℓ를 투입하여 60~80℃에서 40~80분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계; 상기 추출액 100중량부에 대하여 퍼라이트를 1~3중량부 및 규조토 1~3중량부를 첨가하여 여과하여 여과액을 얻는 단계; 상기 여과액을 농축하여 농축액을 얻는 단계; 상기 농축액의 고형분 100중량부를 기준으로 25~35중량부의 α-시클로덱스트린을 혼합하고 고압멸균기를 사용하여 90~100℃에서 100~120분 동안 살균하는 단계; 및 상기 살균된 농축액을 분무건조하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임이 바람직하다.

또한 본 발명은,

(a) 하기 단계를 포함하는 방법에 의하여 도라지, 감초 및 대추의 복합발효추출물(A)을 제조하는 단계:

(i) 도라지와 감초를 건조하여 분쇄하고, 대추는 씨앗을 제거한 후 건조하여 채써는 단계;

(ⅱ) 상기 분쇄된 도라지와 감초 및 대추채를 1:1~3:1~3의 중량비로 혼합하고 혼합물 총 중량을 기준으로 5~10배의 물을 넣고 90~100℃에서 30~90분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계;

(ⅲ) 상기 추출액을 50~60℃로 냉각한 후 도라지, 감초 및 대추의 혼합물 100중량부에 대하여 셀룰라아제 0.5~2중량부와 아밀라아제 0.5~2중량부를 투입하여 2~4시간 동안 효소반응시켜 효소반응액을 얻는 단계;

(ⅳ) 상기 효소반응액을 110~130℃에서 40~80분 동안 멸균한 다음 25~35℃로 냉각시키는 단계;

(ⅴ) 상기 냉각된 멸균액 100중량부에 대하여 사카로마이세스 세레비지애 1~3중량부를 접종하고 14~18시간 동안 배양하여 배양액을 얻는 단계;

(ⅵ) 상기 배양액 10kg을 기준으로 95% 주정 8~12ℓ를 투입하여 60~80℃에서 40~80분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계;

(ⅶ) 상기 추출액 100중량부에 대하여 퍼라이트를 1~3중량부 및 규조토 1~3중량부를 첨가하여 여과하여 여과액을 얻는 단계;

(ⅷ) 상기 여과액을 농축하여 농축액을 얻는 단계;

(ⅸ) 상기 농축액의 고형분 100중량부를 기준으로 25~35중량부의 α-시클로덱스트린을 혼합하고 고압멸균기를 사용하여 90~100℃에서 100~120분 동안 살균하는 단계; 및

(ⅹ) 상기 살균된 농축액을 분무건조하는 단계;

(b) 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물 중에서 선택된 1종 이상의 식물추출물(B)을 제조하는 단계; 및

(c) 상기 도라지 복합발효추출물(A)과 식물추출물(B)을 혼합하는 단계를 포함하는, 항염 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법에서, 상기 식물추출물(B)을 제조하는 단계는, 대두배아 1kg을 기준으로 정제수 8~12ℓ를 혼합하여 70~90℃에서 100분~140분 동안 추출하고, 추출액을 여과, 농축 및 분무건조하여 대두추출물을 제조하는 것임이 바람직하다.

상기 제조방법에서, 상기 식물추출물(B)을 제조하는 단계는, 달단메밀을 분쇄하고, 분쇄된 달단메밀 1kg을 기준으로 70% 주정 에탄올 8~12ℓ를 혼합하여 60~80℃에서 160~200분 동안 추출하고, 추출액을 여과, 농축 및 분무건조하여 달단메밀추출물을 제조하는 것임이 바람직하다.

상기 제조방법에서, 상기 식물추출물(B)을 제조하는 단계는, 참당귀, 삼백초 및 오미자를 분쇄하고, 분쇄된 참당귀, 삼백초 및 오미자를 2:1~3:1~3의 중량비로 혼합하고, 혼합물 1kg을 기준으로 70% 주정 에탄올 8~12ℓ를 혼합하여 60~80℃에서 160~200분 동안 추출하고, 추출액을 여과, 농축 및 분무건조하여 당귀, 삼백초 및 오미자의 복합추출물을 제조하는 것임이 바람직하다.

상기 제조방법에서, 상기 도라지 복합발효추출물(A)과 식물추출물(B)을 혼합하는 단계는, 상기 도라지 복합발효추출물(A) 100~1,600 중량에 대해 상기 식물추출물(B) 50~1,200 중량의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 도라지에 감초 및 대추를 혼합하여 발효시킴으로써 항염효과가 우수한 도라지 복합발효추출물을 얻고, 여기에 대두추출물, 달단메밀추출물, 당귀등복합추출물 중 선택된 식물추출물을 혼합함으로써 독성이 없는 함량 수준에서 항염효과가 더욱 높아진 항염 조성물을 얻을 수 있다. 본 발명의 조성물은 식물성분만으로도 항염효과 뛰어나고 안전성이 높다.

도 1은 도라지 복합발효추출물의 항산화효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 발효도라지추출물의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 도라지 복합발효추출물의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 발효도라지추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도라지 복합발효추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 도라지, 감초 및 대추의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 도라지, 감초 및 대추의 NO 소거능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 도라지 복합발효추출물의 IL-1β 억제효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 도라지 복합발효추출물의 IL-6 억제효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 도라지 복합발효추출물의 TNF-α 억제효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 발효도라지추출물의 항염증효과의 기전을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 도라지 복합발효추출물의 항염증효과의 기전을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 다양한 추출물의 항산화활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 복합발효추출물과 다른 추출물을 혼합하였을 때 항산화 상승효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 대두추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 달단메밀추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 당귀등복합추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 복합발효추출물과 대두추출물을 혼합하였을 때 NO 소거능 상승효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 복합발효추출물과 달단메밀추출물을 혼합하였을 때 NO 소거능 상승효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 복합발효추출물과 당귀등복합추출물을 혼합하였을 때 NO 소거능 상승효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 복합발효추출물, 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물의 세포독성을 확인한 결과이다.

본 발명은 도라지 복합발효추출물과; 대두, 달단메밀 및 당귀등복합추출물 중에서 선택된 1종 이상의 식물추출물을 유효성분으로 포함하는 항염효과가 우수한 항염 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 도라지 복합발효추출물

도라지 복합발효추출물은 도라지에 감초 및 대추를 혼합한 후 발효시켜 얻는다. 이하, 본 발명의 도라지 복합발효추출물을 얻는 바람직한 실시예를 설명한다.

먼저, 도라지와 감초는 뿌리부분을 사용하며, 건조하여 분쇄한다. 대추는 씨앗을 제거한 후 건조하여 채를 썬다.

상기 분쇄된 도라지, 분쇄된 감초 및 채썬 대추를 1:1~3:1~3의 중량비로 혼합하여 추출한다. 혼합물 총 중량을 기준으로 5~10배의 물을 넣고 90~100℃에서 30~90분 동안 추출한다.

추출액을 50~60℃로 냉각한 후 각각 도라지, 감초 및 대추의 혼합물 100중량부에 대하여 셀룰라아제 0.5~2중량부와 아밀라아제 0.5~2중량부를 투입하여 2~4시간 동안 효소반응시켜 효소반응액을 얻는다.

상기 효소반응액을 110~130℃에서 40~80분 동안 멸균한 다음 25~35℃로 냉각시킨다. 냉각 후 멸균액 100중량부에 대하여 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae) 1~3중량부를 접종한다. 접종 후 14~18시간 동안 배양하여 배양액을 얻는다.

도라지, 감초 및 대추는 발효 후 혼합하였을 때는 항염효과에서 상승효과가 없었고, 도라지, 감초 및 대추를 먼저 혼합한 후 발효시켰을 때 항염효과가 상승되었다.

상기 배양액 10kg을 기준으로 95% 주정 8~12ℓ를 투입하여 60~80℃에서 40~80분 동안 추출하여 추출액을 얻는다.

상기 추출액 100중량부에 대하여 퍼라이트를 1~3중량부 및 규조토 1~3중량부를 첨가하여 여과하여 여과액을 얻는다. 이때 압착여과장치를 사용하는 것이 바람직하며, 세공크기(세공크기)는 15~25㎛인 것이 바람직하다.

상기 여과액을 농축한다. 14~16Brix로 농축하는 것이 바람직하다. 농축액의 고형분 100중량부를 기준으로 25~35중량부의 α-시클로덱스트린을 혼합하고 고압멸균기를 사용하여 90~100℃에서 100~120분 동안 살균한다.

살균이 끝난 후 살균된 농축액을 분무건조한다.

건조된 분말은 50~70메쉬의 체로 체별하여 사용하는 것이 바람직하며, 60메쉬로 체별하여 사용하는 것이 보다 바람직하다.

2. 대두추출물

대두는 배아부분을 사용한다. 바람직하게는 대두배아 1kg을 기준으로 정제수 8~12ℓ를 혼합하여 70~90℃에서 100분~140분 동안 추출한다. 추출 후 추출액을 여과하고 농축 및 건조한다. 여과, 농축, 건조는 각각 공지의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

한정되지 않는 바람직한 실시예에 따르면, 추출 후 추출액 대비 약 1%(w/w)의 퍼라이트를 첨가하여 여과한다. 여과 후 45~55℃에서 20 brix가 될 때까지 농축한다. 농축액을 고압멸균기로 95℃에서 1시간 멸균한다. 멸균이 끝난 후 분무건조기로 건조시킨다. 건조물은 체별기(60 mesh)로 체별 한 후 포장한다.

3. 달단메밀추출물

바람직하게는 달단메밀을 분쇄하고, 분쇄된 달단메밀 1kg을 기준으로 70% 주정 에탄올 8~12ℓ를 혼합하여 60~80℃에서 160~200분 동안 추출한다. 추출 후 추출액을 여과하고 농축 및 건조한다. 여과, 농축, 건조는 각각 공지의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

한정되지 않는 바람직한 실시예에 따르면, 추출 후 추출액 대비 약 1%(w/w)의 퍼라이트를 첨가하여 여과한다. 여과 후 45~55℃에서 20 brix가 될 때까지 농축한다. 농축액을 고압멸균기로 95℃에서 1시간 멸균한다. 멸균이 끝난 후 분무건조기로 건조 시킨다. 건조물은 체별기(60 mesh)로 체별 한 후 포장한다.

4. 당귀, 삼백초 및 오미자의 복합추출물(당귀등복합추출물)

바람직하게는 당귀, 삼백초 및 오미자를 분쇄하고, 참당귀, 삼백초 및 오미자를 2:1~3:1~3의 중량비로 혼합한다. 1:1:1:의 중량비로 혼합하는 것이 보다 바람직하다. 혼합물 1kg을 기준으로 70% 주정 에탄올 8~12ℓ를 혼합하여 60~80℃에서 160~200분 동안 추출한다. 추출 후 추출액을 여과하고 농축 및 건조한다. 여과, 농축, 건조는 각각 공지의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

5. 항염 조성물

상기 도라지 복합발효추출물에, 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물 중에서 선택된 1종 이상의 식물추출물(B)을 혼합한다.

도라지 복합발효추출물의 다양한 농도에서, 다양한 농도의 식물추출물(B), 즉 대두추출물, 달단메밀추출물 또는 당귀등복합추출물을 혼합하였을 때 항염효과가 상승한다.

도라지 복합발효추출물은 100~1,600㎍/㎖의 농도로 사용하는 것이 바람직하고, 400~1,600㎍/㎖의 농도로 사용하는 것이 보다 바람직하다.

상기 농도의 도라지 복합발효추출물에 대두추출물과 달단메밀추출물은 100~1,000㎍/㎖의 농도로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하고, 300~700㎍/㎖의 농도로 혼합하여 사용하는 것이 보다 바람직하다.

상기 농도의 도라지 복합발효추출물에 달단메밀추출물은 500~1,200㎍/㎖의 농도로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하고, 800~1,200㎍/㎖의 농도로 혼합하여 사용하는 것이 보다 바람직하다.

또한 상기 농도의 도라지 복합발효추출물에 당귀, 삼백초 및 오미자의 복합추출물은 50~150㎍/㎖의 농도로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하고, 80~120㎍/㎖의 농도로 혼합하여 사용하는 것이 보다 바람직하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

(1) 도라지 복합발효추출물의 제조

제천에서 재배한 감초 뿌리를 세척하여 건조하였다. 봉화에서 재배한 도라지 뿌리를 세척하여 건조하였다. 논산에서 재배한 대추를 세척하고 씨앗을 제거한 후 건조하였다. 건조된 감초와 도라지는 분쇄하고 대추를 채를 썰었다. 분쇄된 도라지 400g, 분쇄된 감초 600g 및 대추채 500g을 발효조(KFC-30L, (주)한국발효기, 한국)에 넣고 상수 9ℓ를 혼합하여 100rpm으로 교반하면서 95℃에서 1시간 동안 추출하였다.

추출액을 55℃로 냉각한 후 셀롤라아제와 아밀라아제를 각각 원료대비 1중량%(15g)씩 투입하여 3시간 동안 효소반응시켰다.

효소반응액을 121℃에서 1시간 동안 멸균한 뒤 30℃로 냉각한 후 멸균액량 대비 2%의 사카로마이세스 세레비지애를 접종하였다, 접종 후 100rpm, 0.3vvm, 0.3bar의 조건으로 16시간 동안 배양하였다.

배양액에 95% 주정을 10ℓ 투입한 뒤 70℃에서 1시간 동안 추출하였다. 추출액에 퍼라이트를 추출액 대비 2중량%, 규조토를 추출액 대비 2중량% 첨가하여 압착여과장치(세공크기 20㎛)로 여과하였다. 이 여과액을 농축기(R10028, 두영하이테크, 한국)를 사용하여 15Brix로 농축하였다. 농축액에 농축액의 총고형분대비 30중량%의 α-시클로덱스트린을 넣고, 고압멸균기(AC-03, 제이오텍, 한국)로 95℃에서 2시간 동안 살균하였다.

살균이 끝난 후 분무건조기를 이용하여 건조하였다. 건조된 분말을 60메쉬로 체별한 것으로 시험물질을 제조하였다.

(2) 대두추출물의 제조

대두 배아 1kg과 정제수 10ℓ를 발효조에 넣어 80℃에서 2시간 동안 추출하였다.　이 후 추출액을 여과한 후 농축하여 분무건조하였다.

(3) 단달메밀추출물의 제조

단달메밀을 분쇄하고, 분쇄된 단달메밀 1.5kg과 70% 주정 에탄올 15ℓ를 발효조에 넣어 70℃에서 3시간 동안 추출하였다.　이 후 추출액을 여과한 후 농축하여 분무건조하였다.

(4) 당귀등복합추출물의 제조

참당귀, 삼백초 및 오미자를 분쇄하고, 분쇄된 참당귀 500g, 삼백초 500g 및 오미자 500g의 혼합물과 70% 주정 에탄올 15ℓ를 발효조에 넣어 70℃에서 3시간 추출하였다.　이 후 추출액을 여과한 후 농축하여 분무건조하였다.

<비교예 1>

발효도라지추출물의 제조

충청남도 금산에서 재배한 도라지 뿌리를 세척하여 분쇄하였다. 분쇄물 2kg을 발효조(KFC-30L, ㈜한국발효기, 한국)에 투입한 후 상수 8kg을 넣고 100rpm으로 교반하며 121℃에서 1시간 동안 추출하였다.

추출액을 100rpm, 0.5bar, 0.3vvm의 조건으로 30℃까지 냉각한 후 사카로마이세스 세레비지애 배양액을 추출액의 중량을 기준으로 3중량% 접종하여 15시간 동안 배양하였다.

배양이 종료된 액을 50℃로 조정하고 셀룰라아제(0.4%) 8g, 아밀라아제(0.2%) 4g을 투입하여 16시간 동안 효소반응을 시켰다.

효소반응액에 퍼라이트를 반응액 중량을 기준으로 4중량% 첨가하여 압착여과장치(세공크기 20μm)로 여과하였다. 이 여과액을 농축기(R10028, 두영하이테크, 한국)를 사용하여 10Brix로 농축하였다.

농축액에 농축액의 총고형분대비 30중량%의 α-시클로덱스트린을 넣고, 고압멸균기(AC-03, 제이오텍, 한국)로 95℃에서 2시간 동안 살균하였다.

<실험예 1>

도라지 복합발효추출물의 항산화효능 확인

도라지 복합발효추출물의 항산화효능은 항산화물질이 자유 라디칼(free radical)과 반응하는 원리에 기반을 두어 DPPH 라디칼의 소거능을 측정하는 시험법을 사용하여 확인하였다.

실험시료로는 실시예 1에서 제조된 도라지 복합발효추출물(PG-D002)을 사용하였고, 비교시료로는 비교예 1에서 제조된 발효도라지추출물(PG-D001)을 사용하였다. 양성 대조구로는 비타민 C{L-아스코르브산, Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)}를 사용하였다.

96웰 플레이트의 각 웰에 시험물질과 양성 대조구인 비타민 C 및 시험물질을 농도별로 80㎕씩 넣어주고 300μM DPPH 120㎕를 넣어주었다. 비타민 C는 0, 1㎍/㎖, 4㎍/㎖, 11㎍/㎖, 33㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도를 사용하였고, 실험시료와 비교시료는 0, 313㎍/㎖, 625㎍/㎖, 1250㎍/㎖, 2500㎍/㎖ 및 5000㎍/㎖의 농도를 각각 사용하였다.

96웰 플레이트를 호일로 감싸 빛을 차단하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과에서 확인되는 바와 같이, 양성 대조구인 비타민 C의 DPPH 라디칼 소거능 IC₅₀값은 6.41±0.09㎍/㎖로 나타났다. 실험시료인 비교예 1의 발효도라지추출물(PG-D001)과 도라지 복합발효추출물(PG-D002)의 DPPH 라디칼 소거능 IC₅₀값은 각각 1386.39±30.58㎍/㎖과 748.02±29.18㎍/㎖로 나타나, 도라지 복합발효추출물(PG-D002)이 발효도라지추출물(PG-D001)보다 항산화 효능이 약 2배 정도 높은 것으로 확인되었다.

<실험예 2>

도라지 복합발효추출물의 세포독성 확인

도라지 복합발효추출물의 세포독성을 MTT 분석법(MTT assay)으로 확인하였다.

실험시료로는 실시예 1에서 제조된 도라지 복합발효추출물(PG-D002)을 사용하였고, 비교시료로는 비교예 1에서 제조된 발효도라지추출물(PG-D001)을 사용하였다.

RAW 264.7 세포(mouse macrophage cells)는 세종대학교에서 제공받아 사용하였다. DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium), FBS(fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신(P/S), DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)는 Gibco(Carlsbad, CA, USA) 제품을 사용하였고, MTT(thiazolyl blue tetrazolium bromide), DMSO(dimethyl sulfoxide)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

RAW 264.7 세포를 10% FBS, 1% P/S을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 96웰 플레이트에 1×10⁴/well로 식종(seeding)하여 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 각 웰에 시험물질을 농도별로 24시간 동안 처리한 후 5mg/㎖의 MTT 용액을 10㎕씩 넣고 4시간 동안 반응시킨 다음 배지를 제거하고 100 ㎕ DMSO로 포르마잔(formazan) 결정을 용해시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군 대비 백분율로 나타내어 세포생존율(cell viability)을 확인하였다.

비교예 1의 발효도라지추출물(PG-D001)의 세포독성을 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 발효도라지추출물(PG-D001)은 25~1000㎍/㎖의 처리농도에서 세포독성은 나타나지 않았다.

실시예 1의 도라지 복합발효추출물(PG-D002)의 세포독성을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 복합발효추출물(PG-D002)은 100~1,600㎍/㎖의 처리농도에서 세포독성은 나타나지 않았고, 1,600㎍/㎖의 농도에서는 세포생존률이 70%로 약간의 세포독성이 있는 것으로 확인되었다.

<실험예 3>

도라지 복합발효추출물의 NO 감소효과 확인

도라지 복합발효추출물의 NO(Nitrite Oxide) 감소효과를 다음과 같이 확인하였다.

실험시료로는 실시예 1에서 제조된 도라지 복합발효추출물(PG-D002)을 사용하였고, 비교시료로는 비교예 1에서 제조된 발효도라지추출물(PG-D001)을 사용하였다. 시료의 농도는 상기 MTT 분석의 결과에서 독성이 나타나지 않은 농도범위를 사용하였다.

RAW 264.7 세포, DMEM, FBS, P/S, DPBS 및 DMSO는 상기 실험예 2에서와 동일한 제품을 사용하였다. LPS(Lipopolysaccharides), 아질산이온 표준용액(nitrite ion standard solution), 그리스시약(griess reagent)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

RAW264.7 세포를 10% FBS, 1% P/S을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 24웰 플레이트에 10×10⁴/well로 식종하여 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 각 웰에 시험물질을 농도별로 2시간 동안 전처리한 후 1㎍/㎖ LPS를 24시간 동안 처리하여 염증을 유도하였다.

24웰 플레이트의 250㎕ 상등액을 모아 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 아질산이온 표준용액(0, 5μM, 10μM, 15μM, 20μM, 30μM, 50μM)과 상등액 100㎕를 동량의 그리스시약 100㎕와 각각 상온, 암소에서 15분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 아질산이온 표준용액을 이용하여 표준곡선을 그리고 이를 기준으로 확인하였다.

비교예 1의 발효도라지추출물(PG-D001)의 NO 소거능을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 과면역이 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 발현 정도를 측정한 결과, LPS 처리한 대조군의 경우 NO가 20.28±0.25μM로 증가하였다(세포단독 대비 p<0.01 ##). 이러한 조건하에서 발효도라지추출물(PG-D001)을 농도별로 처리하였을 때, 발효도라지추출물(PG-D001) 100~800㎍/㎖의 농도에서 NO 생성이 감소하지만 감소정도는 미미하여, 발효도라지추출물은 NO 소거능이 없는 것으로 확인되었다.

실시예 1의 도라지 복합발효추출물(PG-D002)의 NO 소거능을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다. LPS를 처리한 대조군에서는 NO 생성이 19.97±0.30μM로 과발현이 유도된 것이 확인되었다(세포단독 대비 p<0.01 ##). 복합발효추출물(PG-D002)을 농도별로 처리한 결과, 100㎍/㎖(17.39±0.06μM), 200㎍/㎖(16.57±0.00μM), 400㎍/㎖(15.67±0.06μM), 800㎍/㎖(10.63±0.00μM), 1,600㎍/㎖(5.33±0.06μM)으로 농도의존적으로 NO 생성이 감소하였으며, 통계적으로 유의한 것으로 확인되었다(LPS 유도군 대비 p<0.05 *, p<0.01 **). 복합발효추출물의 NO 억제능 IC₅₀는 833.68㎍/㎖로 나타났다.

<실험예 4>

복합발효추출물의 원료인 도라지, 감초 및 대추의 기능성 평가

복합발효추출물을 구성하는 도라지, 감초 및 대추의 효능을 확인하기 위하여 세포독성과 NO 소거능을 확인하였다.

(1) 세포독성

상기 실험예 2의 방법과 동일하게, 도라지추출물, 감초추출물, 대추추출물, 발효도라지추출물, 도라지추출물과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖), 도라지추출물과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖), 발효도라지추출물과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖) 및 발효도라지추출물(PG-D001)과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖)을 RAW 264.7 세포에 각각 농도별로 처리하여 MTT 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 도라지추출물, 발효도라지추출물(PG-D001), 도라지추출물과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖), 도라지추출물과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖), 발효도라지추출물(PG-D001)과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖) 및 발효도라지추출물(PG-D001)과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖)은 세포독성이 없었으나, 감초추출물은 1,000㎍/㎖에서 세포독성이 있었고, 대추추출물은 100㎍/㎖에서부터 세포독성이 나타났다.

(2) NO 소거능

상기 실험예 3의 방법과 동일하게, 도라지추출물, 감초추출물, 대추추출물, 발효도라지추출물(PG-D001), 도라지추출물과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖), 도라지추출물과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖), 발효도라지추출물(PG-D001)과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖), 발효도라지추출물(PG-D001)과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖) 및 도라지추출물과 감초추출물과 대추추출물의 혼합물의 NO 소거능을 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 확인되는 바와 같이, 도라지추출물, 감초추출물, 대추추출물, 발효도라지추출물(PG-D001), 도라지추출물과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖), 발효도라지추출물과 대추추출물의 혼합물(대추 100㎍/㎖) 및 도라지추출물과 감초추출물과 대추추출물의 혼합물은 NO 생성을 억제하지 않았다. 그러나, 감초추출물은 100㎍/㎖에서 NO 생성을 29% 억제하였다. 도라지추출물과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖)은 도라지추출물 25㎍/㎖ + 감초추출물 100㎍/㎖에서 NO 생성을 19% 억제하였으며, 감초추출물을 단독으로 사용한 경우 NO 생성을 11% 억제하므로 복합물 처리시 NO 생성을 약 8% 더 억제하였다. 발효도라지추출물(PG-D001)과 감초추출물의 혼합물(감초 100㎍/㎖)은 발효도라지추출물(PG-D001) 25㎍/㎖ + 감초추출물 100㎍/㎖에서 NO 생성을 22% 억제하였으며, 감초추출물을 단독으로 사용한 경우 NO 생성을 17% 억제하므로 복합물 처리시 NO 생성을 약 5% 더 억제하였다.

상기 결과에 비추어볼 때, 도라지추출물, 발효도라지추출물, 감초추출물, 대추추출물 및 이들추출물의 혼합물에 비하여 본 발명의 복합발효추출물의 효능이 더 우수한 것으로 확인되었다.

<실험예 5>

복합발효추출물의 사이토카인 발현억제효과 확인

도라지 복합발효추출물의 사이토카인 발현억제효과를 다음과 같이 확인하였다.

실험시료로는 실시예 1에서 제조된 도라지 복합발효추출물(PG-D002)을 사용하였다.

RAW 264.7 세포, DMEM, FBS, P/S, DPBS, DMSO 및 LPS는 상기 실험예 3에서와 동일한 제품을 사용하였다. 마우스 IL-1β(Mouse Interleukin 1β) Quantikine ELISA 키트, 마우스 IL-6(Mouse Interleukin 6) Quantikine ELISA 키트 및 마우스 TNF-α Quantikine ELISA 키트는 R&D systems(Minneapolis, MN, USA) 제품을 사용하였다.

RAW264.7 세포를 10% FBS, 1% P/S을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 6웰 플레이트에 40×10⁴/well로 식종하여 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 각 웰에 시험물질을 농도별로 2시간 동안 전처리한 후 1㎍/㎖ LPS를 24시간 동안 처리하여 염증을 유도하였다. 배양액을 모아 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. ELISA 키트를 이용하여 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 정도를 확인하였다.

(1) 복합발효추출물의 IL-1β 억제효과

LPS로 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포에서 복합발효추출물(PG-D002)에 의한 L-1β억제효과를 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.

RAW 264.7 세포에 LPS로 염증을 유도하였을 때 IL-1β 발현이 158.42±3.35pg/㎖로 증가하였다(세포단독 대비 p<0.05 #). 복합발효추출물(PG-D002)을 100~1,600㎍/㎖로 처리하였을 때 400㎍/㎖(112.90±7.44pg/㎖), 800㎍/㎖(45.53±1.49pg/㎖), 1,600㎍/㎖(14.74±0.37pg/㎖)로 IL-1β 발현이 농도의존적으로 감소하였고, 800㎍/㎖와 1,600㎍/㎖의 농도에서는 통계적으로 유의함을 확인하였다(LPS 유도군 대비 p<0.01 **). IL-1β 억제능에 대한 IC₅₀는 568.38㎍/㎖로 나타났다.

(2) 복합발효추출물의 IL-6 억제효과

LPS로 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포에서 복합발효추출물(PG-D002)에 의한 IL-6 억제효과를 확인한 결과를 도 9에 나타내었다.

RAW 264.7 세포에 LPS로 염증을 유도하였을 때 IL-6 발현이 78.9±0.80ng/㎖로 증가하였다(세포단독 대비 p<0.01 ##). 복합발효추출물(PG-D002)을 100~1,600㎍/㎖로 처리하였을 때 400㎍/㎖(61.40±0.80ng/㎖), 800㎍/㎖(48.71±2.30 ng /㎖), 1,600㎍/㎖(27.27±0.97 ng /㎖)으로 IL-6 발현이 농도의존적으로 감소하였고, 통계적으로 유의함을 확인하였다(LPS 유도군 대비 p<0.01 **). IL-6 억제능에 대한 IC₅₀는 1306㎍/㎖로 나타났다.

(3) 복합발효추출물의 TNF-α 억제효과

LPS로 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포에서 복합발효추출물(PG-D002)에 의한 TNF-α 억제효과를 확인한 결과를 도 10에 나타내었다.

RAW 264.7 세포에 LPS로 염증을 유도하였을 때 TNF-α 발현이 46.42 ± 1.27 ng/㎖로 발현량이 증가하였다(세포단독 대비 p<0.01 ##). 복합발효추출물(PG-D002)을 100~1,600㎍/㎖로 처리하였을 때 저농도인 100~800㎍/㎖에서 TNF-α 발현은 억제되지 않으나, 고농도인 1,600㎍/㎖에서는 40.42±1.27ng/㎖로 미미하게 억제함을 확인하였다. TNF-α 억제능에 대한 IC₅₀는 19.1㎎/㎖로 나타났다.

<실험예 6>

복합발효추출물의 항염증효과 기전확인

도라지 복합발효추출물의 항염증효과에 대한 기전을 다음과 같이 확인하였다.

RAW 264.7 세포, DMEM, FBS, P/S, DPBS, DMSO 및 LPS는 상기 실험예 3에서와 동일한 제품을 사용하였다. ß-액틴(ß-actin)은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA), iNOS(Inducible nitric oxide synthase)는 Novus Biologicals(Littleton, CO, USA), COX-2(Cyclooxygenase-2)는 Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA, USA)의 제품을 사용하였다.

항염증효과의 기전을 확인하기 위하여 염증인자인 iNOS 및 COX-2 단백질 발현정도를 웨스턴 블랏 분석법(Western blot assay)로 분석하였다.

RAW 264.7 세포를 10% FBS, 1% P/S을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 6웰 플레이트에 40×10⁴/well로 식종하여 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 각 웰에 시험물질을 농도별로 2시간 동안 전처리한 후 1㎍/㎖ LPS를 24시간 동안 처리하여 염증을 유도하였다. 세포용해버퍼(Cell lysis buffer)로 세포를 용해시켜 세포용해물(cell lysate)을 얻은 후 SDS-PAGE 겔을 사용하여 통하여 iNOS 및 COX-2 발현 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 11과 12에 나타내었다.

도 11의 결과에서 확인되는 바와 같이, RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하였을 때 과면역 반응에 의해 iNOS 및 COX-2 단백질 발현이 증가하였고, 비교시료인 발효도라지추출물(PG-D001)을 25~1000㎍/㎖로 전처리하고 LPS를 처리하였을 때 발효도라지추출물(PG-D001)의 처리에 의해 iNOS 및 COX-2 단백질 발현이 감소하지 않았다. 따라서, 발효도라지추출물(PG-D001)은 LPS에 의해 증가된 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 억제시키지 않는 것으로 확인되었다.

도 12의 결과에서 확인되는 바와 같이, RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하였을 때 과면역 반응에 의해 iNOS 및 COX-2 단백질 발현이 증가하였고, 실험시료인 복합발효추출물(PG-D002)을 50~1,600㎍/㎖로 전처리하고 LPS를 처리하였을 때 LPS에 의해 증가된 iNOS 단백질 발현은 복합발효추출물(PG-D002)의 농도 800㎍/㎖와 1,600㎍/㎖에서 농도의존적으로 감소하였다. 그러나 COX-2 단백질 발현은 감소하지 않고 오히려 농도가 증가할수록 COX-2의 발현도 더 증가하는 경향을 나타내어, iNOS와 COX-2 단백질 발현 조절에 다른 기전이 있을 것으로 보인다.

<실험예 7>

추출물의 DPPH 라디칼 소거능 확인

귤피추출물, 미강추출물, 깻잎추출물, 녹차추출물, 당귀등복합추출물, 달단메밀추출물, 대두추출물, 동충하초추출물, 미배아복합발효추출물, 샐러리추출물, 석류추출물, 양파추출물, 유산균다시마추출물, 홍경천추출물, 화인피토추출물 및 콜라겐트리펩-20S의 항산화효과를 DPPH 라디칼 소거능으로 확인하였다.

각 추출물은 원료를 분쇄하고 분쇄된 원료에 10배 부피의 70% 주정 에탄올을 넣고 70℃에서 3시간 추출하여 추출액을 얻고, 추출액을 여과한 후 농축하여 분무건조하여 시료로 사용하였다.

실험예 1과 동일한 방법으로 DPPH 라디칼 소거능을 확인하여 각 추출물의 농도에 따른 항산화능을 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 확인되는 각 추출물의 항산화능에 대한 IC₅₀을 하기 표 1에 나타내었다.

추출물	항산화능에 대한 IC₅₀(㎍/㎖)
귤피추출물	704.55
미강추출물	534.96
깻잎추출물	119.78
녹차추출물	4.71
당귀등복합추출물	689.95
달단메밀추출물	123.90
대두추출물	1732.98
동충하초추출물	365.45
미배아복합발효추출물	6396.54
샐러리추출물	21065.87
석류추출물	532.47
양파추출물	56.45
유산균다시마추출물	540.75
홍경천추출물	36.82
화인피토추출물	87.23
콜라겐트리펩-20S	0~5000㎍/㎖에서 측정불가

<실험예 8>

복합발효추출물과 다른 추출물의 혼합시 항산화 상승효과 확인

상기 실험예 7에서 10~20%의 항산화효과가 나타나는 농도의 추출물을 실시예 1의 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때의 항산화 상승효과를 확인하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

미강추출물은 미강추출물 100㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 21.22%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 629.01㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

녹차추출물은 녹차추출물 2㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 21.33%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 490.53㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

달단메밀추출물은 달단메밀추출물 30㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 21.22%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 770.08㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

당귀등복합추출물은 당귀등복합추출물 100㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 12.68%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 850.70㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

동충하초추출물은 동충하초추출물 100㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 21.52%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 770.08㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

복합발효추출물(PG-D002) 37㎍/㎖와 동충하초추출물 100㎍/㎖를 혼합하였을 때 복합발효추출물(PG-D002)을 단독으로 사용한 경우에 비해 항산화능이 5% 있으나, 이는 동충하초 자체의 항산화능으로 판단되었다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리했을 때의 IC₅₀은 468.82㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리했을 때보다 낮으며 그 차이가 미미하므로 상승효과는 없었다.

석류추출물은 석류추출물 100㎍/㎖을 단독 처리하였을 때 항산화능이 14.71%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 817.17㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

양파추출물은 양파추출물 20㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 19.73%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 597.71㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

콜라겐트리펩-20S는 콜라겐트리펩-20S 300㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 11.22%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 662.95㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

홍경천추출물은 홍경천추출물 10㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 19.89%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 664.45㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

화인피토추출물은 화인피토추출물 10㎍/㎖를 단독 처리하였을 때 항산화능이 12.40%로 나타났다. 복합발효추출물(PG-D002)과 함께 처리하였을 때 IC₅₀은 700.32㎍/㎖로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독 처리하였을 때보다 높으므로 상승효과가 없었다.

<실험예 9>

추출물의 NO 소거능 확인

샐러리추출물, 대두추출물, 달단메밀추출물, 귤피추출물, 홍삼추출물, 당귀등복합추출물, 미배아복합발효추출물, 홍경천추출물, 화인피토추출물, 유산균다시마추출물, 콜라겐트리펩-20S, 석류추출물, 유산균마늘추출물 및 녹차추출물의 NO 소거능을 확인하였다.

실험예 3과 동일한 방법으로 각 추출물의 농도에 따른 NO 소거능을 확인하였다. 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물에서만 NO 소거능이 확인되었으며, 다른추출물은 NO 소거능이 없었다. 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물의 NO 소거능에 대하여 다음에 설명한다.

(1) 대두추출물

대두추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 확인되는 바와 같이, LPS로 유도된 NO 생성(36.80±0.52μM)이 대두추출물 100㎍/㎖(29.92±0.06 μM), 1,000㎍/㎖(29.01±0.19μM)에 의해 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였다(세포단독 대비 p<0.01 ##, LPS 유도군 대비 p<0.05 *). 이는 각각 17%와 19%의 NO 소거능이다.

(2) 달단메밀추출물

달단메밀추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 확인되는 바와 같이, LPS로 유도된 NO 생성(36.80±0.00μM)이 달단메밀추출물 1,000㎍/㎖(30.52±0.00μM)에서 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였다(세포단독 대비 p<0.001 ###, LPS 유도군 대비 p<0.001 ***). 이는 17%의 NO 소거능이다.

(3) 당귀등복합추출물

당귀등복합추출물의 NO 소거능을 확인한 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 확인되는 바와 같이, LPS로 유도된 NO 생성(13.40±0.25μM)이 당귀등복합추출물 1㎍/㎖(8.07±0.19μM), 10㎍/㎖(4.76±0.06μM), 100㎍/㎖(1.73±0.00μM)에서 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였다(세포단독 대비 p<0.01 ##, LPS 유도군 대비 p<0.01 **). 이는 각각 39%, 64%, 87%의 NO 소거능이다.

<실험예 10>

복합발효추출물과 다른 추출물의 혼합시 NO 소거능 상승효과 확인

복합발효추출물(PG-D002)과 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물을 혼합하였을 때 NO 소거능을 상승효과를 확인하였다.

(1) 대두추출물

복합발효추출물(PG-D002)과 대두추출물 500㎍/㎖을 처리하여 NO 소거능에 대한 상승효과가 있는지를 확인하고 그 결과를 도 18에 나타내었다.

LPS 유발군 기준으로 NO 소거능을 확인한 결과, 복합발효추출물(PG-D002)의 농도별 NO 소거능은 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1,600㎍/㎖에서 9%, 16%, 38%, 57%를 나타내었고, 대두추출물을 단독처리했을 때에는 12%의 NO 소거능을 보였다. 복합발효추출물(PG-D002)(200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1,600㎍/㎖) + 대두추출물 500㎍/㎖은 약 43%, 59%, 71%, 84%로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독처리했을 때보다 NO 소거능에 대한 상승효과가 있는 것으로 확인되었다. 이를 각각의 IC₅₀ 값으로 비교하면, 복합발효추출물(PG-D002)을 단독처리했을 때 1299.21㎍/㎖이고 복합발효추출물(PG-D002) + 대두추출물을 처리했을 때 265.03㎍/㎖이어서 약 80% 효율이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

(2) 달단메밀추출물

복합발효추출물(PG-D002)과 달단메밀추출물 1,000㎍/㎖을 처리하여 NO 소거능에 대한 상승효과가 있는지 확인하고 그 결과를 도 19에 나타내었다.

LPS 유발군 기준으로 NO 소거능을 확인한 결과, 복합발효추출물(PG-D002)의 농도별 NO 소거능은 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1,600㎍/㎖에서 4%, 16%, 28%, 46%를 나타내었고, 달단메밀추출물을 단독처리했을 때에는 62%의 NO 소거능을 보였다. 복합발효추출물(PG-D002)(200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1,600㎍/㎖) + 달단메밀추출물 1,000㎍/㎖은 약 36%, 44%, 55%, 63%로 달단메밀추출물을 단독처리했을 때와 NO 소거능 차이가 없고, NO 소거능에 대한 상승효과는 달단메밀추출물의 효능으로 판단되었다. 이를 각각의 IC₅₀ 값으로 비교하면, 복합발효추출물(PG-D002)을 단독처리했을 때 1640.14㎍/㎖이고 복합발효추출물(PG-D002) + 달단메밀추출물을 처리했을 때 590.80㎍/㎖이어서 약 64% 효율이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

(3) 당귀등복합추출물

복합발효추출물(PG-D002)과 당귀등복합추출물 100㎍/㎖을 처리하여 NO 소거능에 대한 상승효과가 있는지 확인하고 그 결과를 도 20에 나타내었다.

LPS 유발군 기준으로 NO 소거능을 확인한 결과, 복합발효추출물(PG-D002)의 농도별 NO 소거능은 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1,600㎍/㎖에서 9%, 15%, 37%, 56%를 나타내었고, 당귀등복합추출물을 단독처리했을 때 0%의 NO 소거능을 보였다. 복합발효추출물(PG-D002)(200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1,600㎍/㎖) + 당귀등복합추출물 100㎍/㎖은 약 19%, 34%, 46%, 78%로 복합발효추출물(PG-D002)을 단독처리했을 때보다 NO 소거능에 대한 상승효과가 있는 것으로 확인되었다. 이를 각각의 IC₅₀ 값으로 비교하면, 복합발효추출물(PG-D002)을 단독처리했을 때 1321.23㎍/㎖이고 복합발효추출물(PG-D002) + 당귀등복합추출물을 처리했을 때 911.80㎍/㎖이어서 약 31% 효율이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

<실험예 11>

복합발효추출물, 대두추출물, 달단메밀추출물 및 당귀등복합추출물의 세포독성 확인

NO 상승효과가 확인된 복합물의 세포독성을 확인하기 위해, RAW 264.7 세포에 각각 농도별로 처리하여 MTT 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 21에 나타내었다.

세포독성을 확인한 결과, 복합발효추출물(PG-D002) 200~1,600㎍/㎖과 달단메밀추출물 100 또는 1,000㎍/㎖를 함께 처리하였을 때 달단메밀추출물을 단독처리할 때만 세포독성이 있었다. 복합발효추출물(PG-D002) 200~1,600㎍/㎖과 대두추출물 100㎍/㎖ 또는 1,000㎍/㎖를 함께 처리하였을 때 복합발효추출물(PG-D002) 1,600㎍/㎖ + 대두추출물을 처리할 때 세포독성이 있었다. 복합발효추출물(PG-D002) 200~1,600㎍/㎖과 당귀등복합추출물 10㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖를 함께 처리하였을 때 세포독성은 없었다.

Claims

(a) 도라지, 감초 및 대추를 혼합한 후 발효시켜 얻은 도라지 복합발효추출물과; (b) 대두추출물 또는 달단메밀추출물을 유효성분으로 포함하며,
상기 조성물은 상기 도라지 복합발효추출물 100~1,600 중량에 대해 대두추출물 100~1,000 중량 또는 달단메밀추출물 500~1,200 중량의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 도라지 복합발효추출물은,
도라지와 감초를 건조하여 분쇄하고, 대추는 씨앗을 제거한 후 건조하여 채써는 단계;
상기 도라지, 감초 및 대추를 1~3:1~3:1~3의 중량비로 혼합하고 혼합물 총 중량을 기준으로 5~10배의 물을 넣고 90~100℃에서 30~90분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계;
상기 추출액을 50~60℃로 냉각한 후 도라지, 감초 및 대추의 혼합물 100중량부에 대하여 셀룰라아제 0.5~2중량부와 아밀라아제 0.5~2중량부를 투입하여 2~4시간 동안 효소반응시켜 효소반응액을 얻는 단계;
상기 효소반응액을 110~130℃에서 40~80분 동안 멸균한 다음 25~35℃로 냉각시키는 단계;
상기 냉각된 멸균액 100중량부에 대하여 사카로마이세스 세레비지애 1~3중량부를 접종하고 14~18시간 동안 배양하여 배양액을 얻는 단계;
상기 배양액 10kg을 기준으로 95% 주정 8~12ℓ를 투입하여 60~80℃에서 40~80분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계;
상기 추출액 100중량부에 대하여 퍼라이트를 1~3중량부 및 규조토 1~3중량부를 첨가하여 여과하여 여과액을 얻는 단계;
상기 여과액을 농축하여 농축액을 얻는 단계;
상기 농축액의 고형분 100중량부를 기준으로 25~35중량부의 α-시클로덱스트린을 혼합하고 고압멸균기를 사용하여 90~100℃에서 100~120분 동안 살균하는 단계; 및
상기 살균된 농축액을 분무건조하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임을 특징으로 하는 항염 조성물.
(a) 하기 단계를 포함하는 방법에 의하여 도라지 복합발효추출물을 제조하는 단계:
(i) 도라지와 감초를 건조하여 분쇄하고, 대추는 씨앗을 제거한 후 건조하여 채써는 단계;
(ⅱ) 상기 도라지, 감초 및 대추를 1:1~3:1~3의 중량비로 혼합하고 혼합물 총 중량을 기준으로 5~10배의 물을 넣고 90~100℃에서 30~90분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계;
(ⅲ) 상기 추출액을 50~60℃로 냉각한 후 도라지, 감초 및 대추의 혼합물 100중량부에 대하여 셀룰라아제 0.5~2중량부와 아밀라아제 0.5~2중량부를 투입하여 2~4시간 동안 효소반응시켜 효소반응액을 얻는 단계;
(ⅳ) 상기 효소반응액을 110~130℃에서 40~80분 동안 멸균한 다음 25~35℃로 냉각시키는 단계;
(ⅴ) 상기 냉각된 멸균액 100중량부에 대하여 사카로마이세스 세레비지애 1~3중량부를 접종하고 14~18시간 동안 배양하여 배양액을 얻는 단계;
(ⅵ) 상기 배양액 10kg을 기준으로 95% 주정 8~12ℓ를 투입하여 60~80℃에서 40~80분 동안 추출하여 추출액을 얻는 단계;
(ⅶ) 상기 추출액 100중량부에 대하여 퍼라이트를 1~3중량부 및 규조토 1~3중량부를 첨가하여 여과하여 여과액을 얻는 단계;
(ⅷ) 상기 여과액을 농축하여 농축액을 얻는 단계;
(ⅸ) 상기 농축액의 고형분 100중량부를 기준으로 25~35중량부의 α-시클로덱스트린을 혼합하고 고압멸균기를 사용하여 90~100℃에서 100~120분 동안 살균하는 단계; 및
(ⅹ) 상기 살균된 농축액을 분무건조하는 단계;
(b) 대두추출물 또는 달단메밀추출물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 도라지 복합발효추출물 100~1,600 중량에 대해 대두추출물 100~1,000 중량 또는 달단메밀추출물 500~1,200 중량의 비율로 혼합하는 단계를 포함하는, 항염 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 대두추출물은, 대두배아 1kg을 기준으로 정제수 8~12ℓ를 혼합하여 70~90℃에서 100분~140분 동안 추출하고, 추출액을 여과, 농축 및 분무건조하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 항염 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 달단메밀추출물은, 달단메밀을 분쇄하고, 분쇄된 달단메밀 1kg을 기준으로 70% 주정 에탄올 8~12ℓ를 혼합하여 60~80℃에서 160~200분 동안 추출하고, 추출액을 여과, 농축 및 분무건조하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 항염 조성물의 제조방법.
삭제
삭제