KR102170609B1 - 박테리아 인공 염색체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 백신의 제조를 위한 박테리아 인공 염색체 (BAC)의 용도이며, 여기서 BAC는
- 박테리아 세포당 10카피 초과로 BAC를 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
- 약독화 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 포유동물 세포에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
를 포함하는 것인, 상기 용도에 관한 것이다.

Description

박테리아 인공 염색체 {BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES}
본 발명은 RNA 바이러스 게놈의 감염성 cDNA를 조작, 유지 및 증식시키기에 적합한 플라스미드 벡터 시스템 뿐만 아니라 이러한 벡터 시스템의 용도에 관한 것이다.
이전에는, 여러 플라비바이러스 및 다른 RNA 바이러스의 카피 DNA (cDNA)를 상이한 저카피 박테리아 벡터에 클로닝시켜 (바이러스 서열의 큰 크기와 잠재 발현에 기인한) 그들의 고유 독성을 극복하여 왔다 (Bredenbeek et al., (2003) J. Gen. Virol. 84, 1261-1268; Durbin, et al., (2006) Hum Vaccin. 2, 255-260; Fan and Bird (2008) J. Virol. Methods. 149, 309-315; Li et al., (2011) PLoS One 6, e18197; Pu et al., (2011) J. Virol. 85, 2927-2941; Rice et al., (1989) New Biol. 1, 285-296) Almazan et al. (2008) Methods Mol Biol. 454, 275-91). 클로닝된 cDNA는 RNA 게놈의 시험관내 합성과 형질감염에 의해 (Bredenbeek et al., 2003, 상기 인용), 또는 형질감염된 플라스미드 DNA로부터 바이러스 RNA의 전사를 가능케 해주는 CMV-IE (시토메갈로바이러스 극초기) 프로모터와 같은 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 바이러스 cDNA를 혼입시킴으로써 (Enjuanes et al., (2001) J. Biotechnol. 88, 183-204; Hall et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 10460-10464), 감염성 재조합 바이러스의 생산을 위한 주형으로서 사용되어 왔다. 약독화 구제역 (Ward et al., (1997) J. Virol. 71, 7442-7447) 및 쿤진(Kunjin) 바이러스 (Hall et al., (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100, 10460-10464)의 발현을 지시하는 이러한 바이러스 발현 카세트가 실험적인 DNA 백신으로서 사용되어 왔다. 비록 바이러스 발현 카세트를 포함하는 저카피수 벡터 시스템을 박테리아 숙주 세포에서 안정한 방식으로 유지시킬 수 있지만, 그들은 그들이 감염성 바이러스 cDNA의 정제를 불과 소규모 실험적 용도에 충분한 양으로 허용할 뿐이라는 중요한 단점을 안고 있다. 그러므로, 예를 들어 생 cDNA 백신의 생산에 있어서 감염성 바이러스 cDNA의 일상적인 공급원으로서 그들의 사용은 불가능하다.
바이러스 DNA 백신의 생산은 충분한 DNA를 수득하기 위해서는 클로닝 벡터의 대폭적인 증폭을 요하지만, 이들 증폭 방법은 심한 제약을 받기 쉽다. 돌연변이를 피하기 위하여, 바이러스 DNA를 포함하는 벡터는 돌연변이유발성 사건 (재조합, 돌연변이, 미스매치 복구 향상 등)을 방지하는 조건 하에서 증식시킨다. 박테리아 인공 염색체 (BAC)는 그들의 안정성에 대해 알려져 있으며 500 kb 이상까지의 삽입체를 함유할 수 있다.
그러나 외래 DNA를 갖는 이러한 벡터의 크기는 박테리아에게 심각한 부담이 되며, 그의 복제는 상당한 대사적 수고를 요한다. 또한, 뉴클레오티드의 고갈은 증가된 돌연변이를 가져올 수 있다. 최종적으로, 외래 DNA의 원치않는 발현 (소위 잠재 발현)이 일어날 수 있으며, 이는 독성 재조합 단백질의 원인이 될 수 있다. 잠재 전사체에 의한 독성 단백질의 생산은 플라비바이러스 DNA에 선천적이며 플라스미드의 카피수를 낮춤으로써 오직 해결될 수 있다. 실제로, 벡터의 카피수가 높을수록, 독성 단백질의 농도는 더 높다. 결과로서, 박테리아 숙주는 이들 단백질이 발현되지 않는 돌연변이체를 역선택할 수 있다.
문헌 [Pu et al., (2011) J. Virol. 85, 2927-2941]에서는 박테리아에서 플라비바이러스 cDNA의 고유 독성을 해결하기 위한 다양한 시도를 상세히 기재하고 있다. 이들은 바이러스 게놈의 일부를 포함하는 플라스미드의 생체내 라이게이션, 특이적 숙주, 잠재 발현을 회피하기 위한 돌연변이체 및 또한 저카피수 플라스미드를 포함한다.
박테리아에서 단일 카피로서 발생하는 BAC의 사용은 따라서 이들 문제에 대한 해결책을 제공한다.
저카피수는 BAC DNA를 후속하여 서브클로닝시키거나 또는 증폭시켜 농도를 증가시키고, 이들 기술에 의한 일부 돌연변이의 도입이 구상된 실험에 중요하지 않은 적용에게는 단점이 아니다. 그러나, 이러한 증폭 방법은 DNA 백신의 제조에 적용될 수 없으며, 이러한 점은 BAC를 DNA 백신용 대규모 플라스미드 제제에 대하여 비-바람직한 비히클이 되게 한다. 상당량의 BAC를 수득하기 위해서는 매우 대규모 배양물이 요구된다.
유도성 BAC 벡터의 사용이 문헌 [Wild et al., (2002) Genome Res. 12, 1434-1444]으로부터 알려져 있으며, 그에 의하면 BAC의 카피수는 세포당 1카피에서 세포당 100카피까지 또는 심지어는 그 초과로 증가한다. 비록 당해 시스템이 BAC DNA의 수율을 증가시키는 방법을 제공하지만, 유도시 복제 시스템의 강력하게 증가된 활성이 돌연변이 빈도를 증가시킬 것이라는 당연한 우려가 존재한다. 따라서 DNA 백신의 제조는, 벡터의 고카피수가 달성되지만 벡터의 복제가 돌연변이의 용인할 수 없는 도입 없이 일어나는 시스템을 요구한다.
본 발명은 숙주 세포에서 저카피수로 안정하게 유지될 수 있지만, 원치않는 돌연변이유발 사건 없이 자신의 숙주의 배양 조건을 변형시킴으로써 현저히 증폭될 수 있는 벡터를 제공함으로써 종래 기술의 벡터 시스템에서 백신의 제조를 위한 바이러스 cDNA의 증폭의 문제를 해결한다. 본 발명의 추가 목적은 효모 및 박테리아 숙주 양쪽 모두로부터 및 그들에게로 셔틀링될 수 있고, 따라서 효모 및 박테리아 유전계 양쪽 모두에서 벡터의 조작에 흔쾌히 순응하는 매우 다재다능한 시스템을 제공하는 이러한 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명은, 예상하였던 것과는 대치되게, BAC 벡터의 카피수의 유도성 증가가 놀랄 정도로 낮은 돌연변이율을 보유하는 DNA를 제공함을 입증한다. 한층 더 놀랍게도, 발생하는 소수의 돌연변이는 대부분 프레임시프트 돌연변이 또는 정지 코돈이며, 발현시 말단절단 버전으로 인도한다. 영향이 없거나 또는 변형된 아미노산으로 인도하는 점 돌연변이는 과소표시된다.
이러한 예상외의 효과는 다량의 벡터가 수득된다는 이점과 발생하는 오류의 제한된 양이 최초 클로닝된 구축물과 비교하여 독성이 증가될 수 있는 돌연변이된 바이러스 게놈으로 인도하기보다는 비-기능적 바이러스 게놈으로 인도한다는 이점을 가져온다.
본 발명은 예를 들어 박테리아 숙주의 배양 조건을 변형함으로써 박테리아 인공 염색체의 증폭을 고카피수로 유도하도록 허용하는 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 박테리아 인공 염색체를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 박테리아 인공 염색체는 포유동물 세포에 상기 박테리아 인공 염색체의 도입시 상기 바이러스 cDNA의 전사를 촉진하고 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 가능케 해주는 시스-조절 요소에 의해 플랭킹된 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 추가로 포함한다. 바이러스 발현 카세트에 함유된 바이러스 cDNA는 야생형 RNA 바이러스 게놈의 것에 상응할 수 있거나 또는 이종 DNA 서열이 삽입되고/되거나 천연 바이러스 서열이 결실, 말단절단 또는 돌연변이된 키메라 바이러스 cDNA 구축물일 수 있다. 전형적으로 이종 DNA 서열은 포유동물 세포에 이러한 키메라 바이러스 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 도입 뒤에 재조합 바이러스에 의해 이종 발현되는 1종 이상의 펩티드/단백질을 코딩한다. 박테리아 인공 염색체는 상기 박테리아 인공 염색체를 효모로 셔틀링시키고 효모에서 유지시키기 위한 효모 자율 복제 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체를 효모 세포로 셔틀링시키고 효모 세포에서 유지시킬 가능성은 그것이 효모 및 박테리아 유전계 양쪽 모두에서 유전자 조작에 흔쾌히 순응하는 이점을 제공한다.
그에 따라 본 발명은 RNA 바이러스 게놈의 감염성 cDNA를 조작, 유지 및 증식시키는 데 적합한 단일 벡터 시스템을 제공한다. 유도성 ori의 자극의 부재 하에서 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 박테리아 숙주에서 감염성 바이러스 cDNA의 보존과 안정한 클로닝에 사용될 수 있으며, 반면에 이러한 자극의 존재 하에서 상기 cDNA는 쉽사리 증폭 및 후속하여 단리시켜 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 RNA 바이러스 병원체에 대한 생백신으로서 사용될 바이러스 cDNA의 개발, 안정적인 유지와 생산에 특히 유용하다. 이와 달리, 상기 박테리아 인공 염색체는 cDNA로부터 천연 또는 재조합 바이러스의 유지 및 증식을 위해, 예를 들어 연구목적으로 사용된다.
본 발명에서, 유도성 박테리아 ori를 갖는 BAC는 RNA 바이러스의 cDNA 및 포유동물 세포에서 바이러스 cDNA의 전사와 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 위한 시스 조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트의 백신의 제조에 사용된다.
놀랍게도, 바이러스 DNA를 포함하는 BAC의 다중 카피의 생성은 고카피수 시스템으로 발생하는 것으로 알려져 있는 단점을 가져오지 않았다.
일반적으로, 박테리아 시스템에서는 바이러스 서열의 잠재 발현에 기인하여 독성 단백질이 생산된다. 실제로, 플라비바이러스 감염성 클론의 생성은 박테리아에서 그들의 전장 cDNA의 독성에 의해 전통적으로 방해받아 왔다. 당해 문제를 극복하기 위하여 매우 낮은 카피수 플라스미드 및 박테리아 인공 염색체의 사용을 포함하여 다양한 접근법이 채용되어 왔다 (문헌 [Edmonds (2013) J. Virol. 87, 2367-2372]에 논의되어 있음). 이는 BAC중으로 클로닝되고 박테리아 성장과 대사를 방해하는 삽입체에 관계되는 현상이다. 잠재 발현이 일어나지 않는 돌연변이체를 갖는 박테리아는 성장 이점을 가지며 최초 집단을 과성장시킬 것이다. 종래 기술에서 이러한 점은 박테리아 콜로니의 크기에 의해 반영된다. 비-돌연변이 구축물은 독성 단백질을 생산하며 전형적으로는 소형 콜로니가 수득된다. 돌연변이 구축물은 독성 단백질을 보다 적게 생산하거나 또는 전혀 생산하지 않으며, 이는 보다 큰 콜로니의 발생을 가져온다.
이러한 종래 기술 지식에 기반하여, 플라스미드 복제의 유도는 따라서 독성 전사체의 증가 및 잠재 발현이 일어나지 않는 돌연변이체의 동시 증가로 이어지리라고 예상되었었다.
놀랍게도 유도성 복제 시스템은 잠재 단백질의 독성에 무감각한 것으로 보인다. 실제로, 종래 기술 고카피수 시스템과 비교하여, 박테리아 콜로니는 다소 좀더 크며, 이는 박테리아 숙주가 결과로서 일어나는 독성 단백질에 보다 덜 민감하다는 것을 시사한다. 보다 중요하게는, 돌연변이된 플라스미드를 나타내는 매우 큰 콜로니는 조우되지 않는다.
유도성 시스템이 독성 단백질에 대하여 무감각하다는 발견은 예기치 않은 것이다. 종래 기술에서는 당해 시스템이 독성 단백질에 민감하지 않으리라는 것 (또는 아마도 독성 단백질이 생산되지 않는다는 것)을 표시한 어떠한 시사점도 존재 하지 않았다.
유도성 시스템의 추가 단점은 BAC의 다중 카피의 생성에 내재한다. 실제로 유도성 시스템의 고안자들은 BAC 클론의 가장 중요한 특색은 그들의 매우 낮은 카피수에서 연유하는 그들의 안정성이라고 설명한다. 상기 인용 문헌 [Wild et al., (2002)]에서는 글루코스의 첨가에 의해 카피수를 한층 더 낮출 수 있음을 보여주고 있다. 이러한 단일 카피 상태는 클론간의 세포내 재조합에 대한 기회를 감소시킴으로써 BAC 라이브러리의 유지의 안정성을 향상시킨다. 이는 와일드(Wild) 등에 의해 발표된 바와 같은 유도성 시스템은 BAC의 다중 카피가 숙주 세포에 존재 하자마자 발생하는 원치않는 재조합 사건의 변화를 낮추지 않음을 입증한다. 유도 및 결과로서 일어나는 고카피수는 재조합 사건을 재도입할 것이라고 통상의 기술자에 의해 이해된다. 그 결과로서, 통상의 기술자는 백신접종 목적으로 사용하고자 의도되는 DNA 제제에 대해 이러한 시스템을 사용하는 것을 삼가하게 된다.
본 발명에서 BAC는 유도성 ori 시스템에서 증폭시키며 증폭된 BAC는 재조합 사건에 대하여 시험된다. 예상되는 것과는 상반되게, 재조합 사건은 희박하다.
또한, 재조합 사건에 대하여 시험하는 것과는 별개로, 증폭 BAC는 다른 돌연변이의 존재에 대해서도 또한 시험되었다. 조우하게 되었던 돌연변이 빈도는 매우 낮았고, 더욱이 미스센스의 분율은 놀랍게도 이론상 예상된 것보다 낮다. 돌연변이는 발생할 경우 우세하게는 비-기능적 바이러스 RNA의 원인이 되는 넌센스 또는 프레임시프트 돌연변이이다.
본 발명은 DNA 백신 생산의 현저한 규모확대를 가능케 해준다. 예를 들어, 생-약독화 황열 백신의 주요 제조업자는 현재로서는 기존 수요를 충족시킬 수가 없다. 본 발명의 기술을 가지고서는, DNA 백신을 현행 생-약독화 백신에 비해 현저히 더 낮은 단가와 보다 많은 양으로 생산 가능할 것이며, 그리하여 장기간의 염원을 실현하게 된다.
또한 다른 바이러스 질환, 예컨대 JEV, WNV, 홍역, 풍진 및 HIV 백신에 대해서도, 충분량의 DNA를 제공할 수 있는 백신 제조 플랫폼에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 제1 측면은, 백신의 제조를 위한 박테리아 인공 염색체 (BAC)의 용도이며, 여기서 BAC는
- 박테리아 세포당 10카피 초과로 상기 BAC를 증폭시키기 위한 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
- 약독화 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 포유동물 세포에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
를 포함하는 것인, 상기 용도에 관한 것이다.
약독화 RNA 바이러스 게놈의 cDNA의 실시양태는 RNA 바이러스 게놈의 키메라 바이러스 cDNA 구축물이며, 여기서 이종 DNA 서열이 삽입되어 있거나 또는 천연 바이러스 서열이 결실, 말단절단 또는 돌연변이되어 있다.
바이러스 발현 카세트의 실시양태는
- 양성-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA,
- 상기 cDNA의 전사를 개시하기 위한, 상기 cDNA의 5' 말단에 선행하는 RNA 폴리머라제 구동 프로모터, 및
- 세트 위치에서 상기 바이러스 cDNA의 RNA 전사체를 절단하기 위한, 상기 cDNA의 3' 말단 뒤에 오는 RNA 자기-절단을 위한 요소를 포함한다.
양성-가닥 RNA 바이러스의 실시양태는 플라비바이러스, 헤파시바이러스, 페스티바이러스, 토가바이러스, 피코르나바이러스, 코로나바이러스, 헤페바이러스 및 칼리시바이러스이다.
전형적인 실시양태에서, 바이러스 발현 카세트는 황열 바이러스의 cDNA, 예를 들어 생-약독화 YFV-17D 황열 바이러스 백신의 cDNA를 포함한다.
다른 실시양태에서, 바이러스 발현 카세트는 음성-가닥 RNA 바이러스, 이중-가닥 RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스의 군에 속하는 바이러스의 cDNA를 포함한다.
구체적 실시양태에서, 박테리아 인공 염색체는 상기 박테리아 인공 염색체를 효모로 셔틀링시키고 효모에서 유지시키기 위한 효모 자율 복제 서열을 추가로 포함한다.
효모 ori 서열의 일례는 2μ 플라스미드 기점 또는 ARS1 (자율 복제 서열 1) 또는 그의 기능적 상동 유도체이다.
특정 실시양태에서, RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 RNA 폴리머라제 II 프로모터, 예컨대 시토메갈로바이러스 극초기 (CMV-IE) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 프로모터 또는 그의 기능적 상동 유도체이다.
다른 실시양태에서, RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 RNA 폴리머라제 I 또는 III 프로모터이다.
RNA 자기-절단을 위한 요소의 예는 델타 간염 바이러스의 게놈 리보자임의의 cDNA 또는 기능적 상동 RNA 요소이다.
특정 실시양태에서, 바이러스 발현 카세트는 생-약독화 YFV-17D 백신의 cDNA를 포함하며, 여기서 비리온 표면 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 중 1종 이상이 YFV-17D의 상기 기능적 비리온 표면 단백질이 발현되지 않도록 결실, 말단절단 또는 돌연변이되어 있고, 이종 단백질을 코딩하는 cDNA 서열이 YFV-17D cDNA에 삽입되어 있다. 이러한 이종 단백질의 일례는 플라비바이러스의 비리온 표면 단백질이다.
바이러스 발현 카세트의 실시양태는 생-약독화 YFV-17D 백신의 cDNA를 포함하며, 여기서 1종 이상의 비관련 cDNA 서열이 바이러스 폴리단백질 내에 1종 이상의 이종 단백질로서 발현되도록 삽입되어 있다.
다른 실시양태에서, 바이러스 발현 카세트는 바이러스 cDNA를 포함하며, 여기서 외래 cDNA 서열이 상기 재조합 바이러스에 의해 이종 발현되도록 삽입되어 있다.
추가 측면은
a) 제1 측면 및 그의 다양한 실시양태에 기재된 바와 같은 BAC로 형질감염된 박테리아 숙주를 제공하는 단계;
b) 상기 유도성 ori를 활성화시키는 화합물을 첨가함으로써 BAC를 증폭시키는 단계;
c) 증폭된 BAC를 단리하는 단계;
d) BAC를 백신으로 제제화하는 단계
를 포함하는, RNA 바이러스에 대한 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
추가 측면은 백신으로서 사용하기 위한, 제1 측면 및 그의 다양한 실시양태에 기재된 바와 같은 BAC에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 RNA 바이러스 감염의 예방에 사용하기 위한, 제1 측면 및 그의 다양한 실시양태에 기재된 바와 같은 BAC에 관한 것이다.
추가 측면은 생 DNA 백신으로서의, 제1 측면 및 그의 다양한 실시양태에 기재된 바와 같은 BAC의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면은 상기 cDNA로부터 천연 또는 재조합 바이러스의 증식을 위한, 제1 측면 및 그의 다양한 실시양태에 기재된 바와 같은 BAC의 용도에 관한 것이다.
추가 측면은 백신의 제조를 위한, 제1 측면 및 그의 다양한 실시양태에 기재된 바와 같은 박테리아 인공 염색체 (BAC)로서의 BAC에 관한 것이다.
도 1. RNA 바이러스 발현 플라스미드의 pShuttleBAC 시리즈의 생성. (A) 출발 벡터 구축물로서 pShuttleBAC/Pme의 구축을 보여주는 스케치. (B) SV40 프로모터 (SV40p)와 HDV 리보자임 (HDrz) 간의 상동 재조합에 의한 바이러스 cDNA의 삽입에 의해 pShuttleBAC/Pme-유래 플라비바이러스 발현 벡터의 구축을 보여주는 스케치.
도 2. 이. 콜라이에서 pShuttleBAC 구축물의 증진된 플라스미드 안정성. 종래 기술 플라비바이러스 cDNA 플라스미드 (A) 및 벡터의 새로운 pShuttleBAC 시리즈 (B, DNA-YFVax)의 원리 레이아웃를 보여주는 일반적 플라스미드 지도. 이. 콜라이에 형질전환시 각 (A) 및 (B)의 단일 콜로니를 밤새 37℃에서 성장시키고 선택 배지에 플레이팅하였다. 일반적으로 유형 A의 구축물은 유형 B의 것들과 비교하여 훨씬 더 작은 콜로니 크기로 성장한다 (각각 도 2C 및 2D). 더욱이, 유형 A 구축물은 광범위한 콜로니 크기의 후손을 생성하며 (정규화 콜로니 직경에 대한 막대그래프, 도 2C의 우측 패널), 이는 종종 cDNA를 이. 콜라이에게 덜 독성이게 해주는 돌연변이체 플라스미드 클론의 선택 및 분리를 나타내는 것이다. 클론 분석은 바이러스 E/NS1 영역에서의 트랜스포손 삽입을 포함하여 다수의 가능성이 있는 근본적인 돌연변이를 확인해내었다. 대조적으로, pShuttleBAC 시리즈의 유형 B 구축물을 포함하는 플라스미드 클론은 분리하지 않으며 심지어는 이. 콜라이에서의 반복 계대 후에 조차도 보다 균일한 콜로니 크기를 나타내고 이는 높은 유전적 안정성을 표시한다.
도 3A. 노던 블롯에 의한 pShuttle/YF17D (야생형, WT) 및 그의 복제-결핍 유도체 pShuttle/YF17DΔGDD (ΔGDD)로 베로(Vero)-B 세포의 형질감염 후 YFV-17D RNA 복제의 복제성 중간체의 검출. 안티센스-배향 안티게놈, (-)-RNA (A 상부 패널, 11 kb) 및 센스-배향 바이러스 게놈, (+)-RNA (A 하부 패널, 11kb)는 오직 WT 형질감염된 세포에서만 형질감염 5일 후에 검출될 수 있었다. DNA 지시 RNA 합성의 억제제인 악티노마이신 D (ACD)의 존재 하에서의 진행중인 복제는 pShuttle/YF17D로부터 YFV-17D 게놈 전사의 초기 론칭 후에 바이러스 복제가 플라스미드 독립적 방식으로 자율적으로 속행됨을 확인시켜 준다.
도 3B. 5'- 및 3'-RACE (cDNA 말단의 고속 증폭)에 의한 적당한 YFV-17D RNA 전사체 프로세싱의 검출. pShuttle/YF17D는 cDNA 말단의 고속 증폭 (RACE)에 의해 확인되는 바와 같이 적당한 5' 및 3' 말단 (각각 상부 및 하부 패널)으로 시작하고 끝나는 초기 YFV-17D RNA (도 3B에서 볼드체)의 전사를 론칭한다.
도 4A-C. 상이한 기점의 YFV-17D에 의해 유도된 유사 CPE. 주형으로서 pACNR-FLYF17DII를 사용하여 시험관내 전사 및 캡핑된 RNA로부터 유래한 YFV-17D 바이러스 (A) 또는 pShuttle/YF17D의 플라스미드 DNA 형질감염 후에 수거한 YFV-17D 바이러스 (B)는 감염후 일수(d p.i.) 5일에서 BHK-21 세포상에 동일한 바이러스-유발 세포독성 효과 (CPE)를 생성한다; C, 비교를 위한 비-감염 세포.
도 4D-E. 상이한 기점의 YFV-17D의 유사한 플라크 표현형. 주형으로서 pACNR-FLYF17DII를 사용하여 시험관내 전사 및 캡핑된 RNA로부터 유래한 YFV-17D 바이러스 (D) 또는 pShuttle/YF17D의 플라스미드 DNA 형질감염 후에 수거한 YFV-17D 바이러스 (E)는 BHK-21 세포상에 필적하는 수 (5일 p.i. 3 x 105 플라크 형성 단위 (pfu) mL-1 vs 2 x 105 pfu mL-1) 및 동일한 모폴로지의 플라크 (직경 6.4±0.7mm vs 6.1±1.1mm; n = 8, p-값 = 0.6, t-검정에 의함)를 생성한다.
도 5. 면역형광 검정 (IFA)에 의한 감염성 재조합 DENV2의 검출. pShuttle/DV2로 형질감염된 BHK-21 세포에 의해 생산된 재조합 DENV2 NGC는 베로-B 세포의 용량 의존적 감염을 보여주며, 바이러스 E 단백질 5일 p.i.에 대한 면역형광 염색에 의해 바이러스 병소로서 가시화한다 (A, 비-희석 상청액, B, 100배 희석 상청액, C, 비-감염 세포 대조군).
도 6. 스타마릴(Stamaril) (흰색 정사각형)로 감염된 또는 pShuttle / YF17D (×표)로 형질감염된 AG129 마우스의 생존 . i.p. 챌린지 약 10 내지 12일 후, 인터페론 유형 I 및 II 수용체-결핍 (AG129) 마우스는 체중 감소가 시작되고 증상의 균일한 세트, 즉 털의 곤두세움, 신체의 떨림 및 이완성 후지마비가 일어난다. 복제 결핍 NS5ΔGDD 플라스미드 변이체 (ΔGDD, 흰색 원)로 형질감염된 대조군 동물은 발병을 보이지 않는다. 그러나, 그들은 초기 형질감염 20일 후 2차 스타마릴® 챌린지 (검은색 삼각형)에 감수성인 채로 있으며, 이어서 필적하는 타임프레임 내에 및 유사한 증상을 보이면서 사망한다. 플라스미드 DNA를 담체로서 33% 프로필렌 글리콜중 탄산칼슘 마이크로플라워를 사용하여 i.p. 형질감염시켰다.
도 7. 감염 AG129 마우스로부터의 이환율 (A) 및 YFV-17D RNA의 검출 (B). (A) 스타마릴®로 감염되거나 또는 pShuttle/YF17D (pYF17D)로 형질감염된 경우, AG129 마우스는 평균 12 내지 13일 (MDD, 사망에 이르기까지의 평균 일수) 후에 그들을 안락사시켜야 하기 전에 체중의 약 20%가 감소한다. 대조적으로, pShuttle/YF17DΔGDD (ΔGDD)-형질감염 마우스는 그들을 스타마릴®로 챌린지시키기 (ΔGDD + 2°스타마릴®) 전에는 체중이 늘고 약 2주 안에 YFV-17D 감염으로 사망한다. (B) 사망시에 수집한 (A)로부터의 AG129 마우스의 뇌 샘플에서 qRT-PCR에 의해 필적하는 양의 YFV-17D RNA가 검출될 수 있다.
도 8. pShuttle/YF17D (합성 구축물 #1)의 지도. 용어설명: SV40p: 원숭이 바이러스 40 프로모터/기점, YFV-17D: 황열 바이러스 백신 주 17D cDNA, HDVrz: 델타 간염 바이러스 리보자임 cDNA; 2μ: 에스. 세레비지아에 2-마이크론 기점; TRP1: 트립토판에 대한 원영양 성장을 부여하는 TRP1 유전자; parABC: F-플라스미드의 구획화 유전자; repE: F-플라스미드의 repE 유전자; oriS: F-플라스미드의 기점; oriV: 플라스미드 RK2의 기점; CmR: 클로람페니콜 내성 유전자.
도 9. 상이한 YFV-17D cDNA 벡터로의 형질전환 후 이. 콜라이 콜로니 성장. (A) pACNR-FLYF17DII로의 형질전환 후 이. 콜라이 EPI-300T 콜로니 및 16 h 동안 37℃에서의 성장. 주요 크기 차이를 보이는 두 하위집단, 즉 마이크로콜로니 (0.2 mm보다 작은 직경) 및 마크로콜로니 (대략 0.4 mm 직경)를 갖는 콜로니 크기 분포가 관찰될 수 있다. 마이크로콜로니가 대다수를 나타낸다. (B+C) pShuttle/YFV17D로의 형질전환 후 이. 콜라이 EPI-300T 콜로니. 유도제의 부재 하에 (B), 또는 유도성 고카피 기점에 의해 매개된 고카피 복제의 유도를 위해 0.01% L-아라비노스의 존재 하에 (C) 플레이트상에 플레이팅. 큰 검은색 원은 교정기로서 역할을 하도록 한천중으로 포매된 2.5 mm 직경의 지르코니아 비드이다. 삽화는 각각의 세팅에서 관찰된 콜로니 윤곽을 나타내는 개략적인 선도이다.
도 10. 상이한 YFV-17D cDNA 벡터로의 형질전환 후 이. 콜라이 콜로니의 크기 분포. (A) pACNR-FLYF17DII로의 형질전환 후 이. 콜라이 EPI-300T 콜로니. (B+C) pShuttle/YFV17D로의 형질전환 후 이. 콜라이 EPI-300T 콜로니. 유도제의 부재 하에 (B), 또는 유도성 고카피 기점에 의해 매개된 고카피 복제의 유도를 위해 0.01% L-아라비노스의 존재 하에 (C) 플레이트상에 플레이팅.
도 11A. pShuttle/ChimeriVax-JE의 지도. pShuttle/ChimeriVax-JE는 SV40 프로모터/기점 뒤에, 신경약독화 JEV 백신 주 JE SA14-14-2의 nt 477-2477이 삽입되어 있는 YFV-17D의 nt 1-481 및 2452-10862를 함유한다. JEV E-ORF의 마지막에서 두 번째 두 개의 마지막 아미노산은 히스티딘에서 글리신 코돈으로 돌연변이되어 KasI 부위를 생성하고, NS2A 및 NS4B-ORF는 각각 YFV-17D NS2A에서 메티오닌으로부터 발린으로 및 NS4B-ORF에서 리신으로부터 글루타민으로 변경하는 이모젭(Imojev)®에서 발견된 두 적응성 G4055a 및 G7349a 돌연변이를 함유한다. 추가적인 침묵 돌연변이는 위치 406 (XhoI), 4009 (BstEII) 및 7315 (NheI)에서 제한 마커를 생성한다.
도 11B. pShuttle/ChimeriVax-WN의 지도. pShuttle/ChimeriVax-WN은 SV40 프로모터/기점 뒤에, WNV 주 NY-99의 신경약독화 유도체의 nt 477-2477이 삽입되어 있는 YFV-17D의 nt 1-481 및 2452-10862를 함유한다. WN E-ORF의 마지막에서 두 번째 두 개의 마지막 아미노산은 히스티딘으로부터 글리신 코돈으로 돌연변이되어 KasI 부위를 생성하고, NS2A 및 NS4B-ORF는 각각 YFV-17D NS2A에서 메티오닌으로부터 발린으로 및 NS4B ORF에서 리신으로부터 글루타민으로 변경하는 이모젭®에서 발견된 두 적응성 G4055a 및 G7349a 돌연변이를 함유한다. 추가적인 침묵 돌연변이는 위치 406 (XhoI), 4009 (BstEII) 및 7315 (NheI)에서 제한 마커를 생성한다.
도 12. pShuttle/EV71의 지도. pShuttle/EV71은 그의 5'말단에서의 SV40 프로모터/기점과 그의 3' 말단에서의 30 nt 길이 폴리A 반복체+델타 간염 바이러스 리보자임 사이에 삽입된 EV71 주 BrCr-TR (진뱅크 AB204852.1)의 cDNA를 함유한다.
도 13은 서열 1 내지 7을 갖는 서열을 도시한다.
정의
용어 "박테리아 인공 염색체 (BAC)"는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이에 DNA 서열을 클로닝시키는 데에 사용된 플라스미드 DNA 구축물을 언급한다. 전형적으로는 30,000 내지 약 300,000 염기쌍 범위의 DNA 서열이 BAC중으로 삽입될 수 있다. 삽입된 DNA를 갖는 BAC는 박테리아 세포에 의해 흡수될 수 있다. 박테리아 세포가 성장하고 분열함에 따라, BAC DNA는 박테리아 세포 내에 박테리아 세포당 매우 낮은 카피수로, 바람직하게는 세포당 3카피를 초과하지 않는 카피수로, 예컨대 세포당 단일 카피로 안정적으로 유지된다. BAC의 복제는 복제 기점 (ori) 서열, 전형적으로는 oriS 서열에서 개시된다. 당해 복제는 BAC에 의해 코딩된 유전자 생성물, 일반적으로 repE 및/또는 repF에 의해 엄중하게 조절된다. BAC는 분열중에 딸세포로 BAC 카피의 구획화를 지시하는 단백질, 예컨대 parA, B 및 C를 추가로 코딩한다. 전형적으로, BAC 벡터는 선택가능한 마커, 예컨대 항생제 내성 또는 리포터 효소 마커, 예컨대 청백 선택을 가능케 해주는 lacZ를 추가로 포함한다. 일반적으로 사용되는 BAC의 일례는 pBeloBac11이다 (Shizuya et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8794-8797). 당해 벡터의 서열은 진뱅크 수탁번호 U51113으로 보고되었다. pBeloBac11은 oriS, oriS에서 복제를 개시하고 조절하는 단백질을 생산하는 repE 유전자, 및 구획 유전자 par A, B 및 C를 포함하는 환상 플라스미드이다. 선택을 위해 pBeloBac11은 클로람페니콜 내성-코딩 유전자를 포함한다. 그 벡터는 삽입체가 BAC에 클로닝될 때 벡터로부터 붕괴 또는 제거될 수 있는 lacZα 유전자를 또한 포함한다.
용어 "유도성 박테리아 ori 서열"은 박테리아 숙주 세포에서 기능하고 증폭-매개 단백질(들)에 반응을 보이는 플라스미드 ori 서열을 언급한다. 바람직하게는, 유도성 ori의 복제 기능은 상기 증폭-매개 단백질(들)의 부재 하에서 격심하게 억제되거나 또는 비-존속성이다. 상기 증폭-매개 단백질(들)의 존재 하에서 유도성 ori는 플라스미드를 고카피수로, 바람직하게는 세포당 20카피 초과로, 보다 바람직하게는 100카피 초과로, 예를 들어 세포당 500 또는 1000카피 초과로 증폭시키는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에서 사용하기 위해서는, 비록 필수적인 것은 아니지만, 유도성 ori는 단일 증폭-매개 단백질에 반응하는 것이 또한 바람직하다.
oriV는 그의 넓은 숙주 범위, 그의 알려져 있는 100 kb 이상의 DNA 단편 복제능, 그의 고카피수 및 단 한 종의 유도 단백질에 대한 그의 요구성 때문에 본 발명에서 유도성 박테리아 ori로서 사용하기에 특히 유용하다. 유도성 oriV를 포함하는 박테리아 인공 염색체의 예는 pBeloBAC/oriV (Wild et al., (2002) Genome Res. 12, 1434-1444) 및 pBAC-LacZ (애드진(Addgene) 플라스미드 13422: pBAC-lacZ, 애드진(Adgene), 미국 매사추세츠주 캠브리지)이다. pBAC-lacZ 플라스미드는 표준 이. 콜라이 균주에서 복제될 수 있는 mini-F'이지만, 그것이 단일 카피 에피솜으로서 유지되기 때문에, 그것은 낮은 DNA 수율을 부여한다. pBAC-lacZ는 trfA 유전자에 의해 코딩된 트랜스-작용 인자의 존재 하에서 오직 활성인 제2의 보다 높은 카피수 복제 기점 (oriV)을 또한 함유한다. 유도성 프로모터로부터 trfA를 발현하는 이. 콜라이 세포에 당해 플라스미드의 형질전환은 trfA 발현을 유도함으로써 pBAC-lacZ 플라스미드의 카피수를 증가시키는 것을 가능케 해준다. 트랜스포맥스(TransforMax)TM EPI300TM 이. 콜라이 세포 (에피센터(Epicentre), 미국 위스콘신주 매디슨)는 자신의 유전자 생성물이 oriV 복제 기점으로부터의 복제 개시에 요구되는 유도성 돌연변이체 trfA 유전자를 함유한다. trfA의 발현은 배양 배지에 L-아라비노스의 첨가에 의해 유도될 수 있으며, 그에 따라 oriV의 활성화가 일어나게 된다.
"효모 복제 기점"은 효모 세포에서 플라스미드의 복제와 유지를 가능케 해주는, 당해 플라스미드 안의 서열, 예컨대 박테리아 인공 염색체를 언급한다. 2 μ 플라스미드에 존재 하는 바와 같은 복제 기점 (Huberman et al., (1987) Cell 51, 473-481; Brewer and Fangman (1987) Cell 51, 463-471; Hartley and Donelson (1980) Nature 286, 860-865)이 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체를 효모로 셔틀링시키기 위한 적합한 ori인 것으로 나타났다. 다른 적합한 효모 ORI가 기재되어 있으며 (Liachko et al., (2013) Genome Res. 23, 698-704), 예를 들어 효모 동원체 플라스미드 (YCp)에 사용되는 바와 같은 ARS1 (자율 복제 서열 1) 및 그의 기능적 상동 유도체 또는 합성 CEN6/ARSH4 기점 (Frazer and O'Keefe (2007) Yeast. 24, 777-789)이 있다.
본 발명에 관련해서 "바이러스 발현 카세트"는 이하에서 좀더 상세히 기재된 바와 같이 포유동물 세포에 상기 박테리아 인공 염색체의 도입시 바이러스 cDNA의 전사를 촉진하고 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 가능케 해주는 시스-조절 요소에 의해 플랭킹된 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 언급한다.
"감염성 바이러스 RNA"는 자신의 포유동물 숙주에 도입시 감염성 바이러스 후손의 바이러스 복제 및 생산에 요구되는 모든 바이러스 기능을 제공하기에 충분한 바이러스 RNA를 언급한다. 이는 (i) 바이러스 RNA 합성 및 게놈 증폭을 위한 전사 주형으로서 역할 담당, 및 (ii) 바이러스 복제에 요구되는 바이러스 단백질의 합성을 위한 번역 주형으로서 역할 담당을 포함한다. 다른 보조 기능, 예컨대 예를 들어 선천적인 항-바이러스 반응에 관여되는 숙주 세포 인자의 디코잉 (Moon et al., (2012) RNA. 18, 2029-40)이 또한 감염성 바이러스 RNA에 의해 제공되어야 할 수도 있다.
본 발명에 관련해서 "약독화"는 질환을 일으키는 유기체의 유해 성질이 약화 (또는 약독화)되는 병원체의 독성 변화를 말하며; 약독화 병원체는 생백신으로서 사용될 수 있다. 약독화 백신은 약화시킨 살아있는 유기체로부터, 그들의 질환 유발능을 감소시키는 효과가 있는, 보통은 준-최적 조건 하에서의 배양 (또한 "약독화"로도 호칭)으로부터 또는 유전자 변형으로부터 몇가지 방식으로 유도될 수 있다.
제1 측면에서 본 발명은 자극의 존재 하에서 박테리아 세포 내에서 박테리아 인공 염색체의 증폭을 고카피수로, 바람직하게는 세포당 10카피 초과로, 보다 바람직하게는 100카피 초과로, 예를 들어 세포당 500 또는 1000카피 초과로 유도하는 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 박테리아 인공 염색체를 제공한다. 일반적으로, 상기 자극의 결과로서 상기 박테리아 인공 염색체의 증폭은 10,000개보다 많게는 초과하지 않으며, 예를 들어 세포당 불과 5000카피이다. 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 포유동물 세포에 박테리아 인공 염색체의 도입시 바이러스 cDNA의 전사를 촉진하고 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 가능케 해주는 시스-조절 요소에 의해 플랭킹된 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 바이러스 발현 카세트의 안에 포함되어 있는 바이러스 cDNA는 양성-가닥 바이러스, 음성-가닥 바이러스, 이중-가닥 RNA 바이러스 또는 복제를 위한 암비센스 RNA 전략을 이용하는 바이러스의 군에 속하는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 바이러스 발현 카세트에 함유된 상기 바이러스 cDNA는 야생형 RNA 바이러스 게놈의 것에 상응할 수 있거나 또는 이종 DNA 서열이 삽입되고/되거나 천연 바이러스 서열이 결실된 키메라 바이러스 cDNA 구축물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이종 DNA 서열은 포유동물 세포에 이러한 키메라 바이러스 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 도입 뒤에 재조합 바이러스에 의해 이종 발현되는 1종 이상의 단백질을 코딩한다. 임의로는, 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 상기 박테리아 인공 염색체를 효모로 셔틀링시키고 효모에서 유지시키기 위한 효모 자율 복제 서열을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체를 효모 세포로 셔틀링시키고 효모 세포에서 유지시킬 가능성은 그것이 효모 및 박테리아 유전계 양쪽 모두에서 유전자 조작에 흔쾌히 순응하는 이점을 제공한다.
유도성 ori의 자극의 부재 하에서 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 박테리아 숙주에 감염성 바이러스 cDNA의 보존과 안정한 클로닝에 사용될 수 있으며, 반면에 이러한 자극의 존재 하에서 상기 cDNA는 증폭 및 후속하여 단리되어 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 RNA 바이러스 병원체에 대한 생백신으로서 사용될 바이러스 cDNA의 개발, 안정한 유지 및 생산에 특히 유용하다. 이와 달리, 상기 박테리아 인공 염색체는 cDNA로부터 천연 또는 재조합 바이러스의 유지 및 증식용으로, 예를 들어 연구목적으로 사용된다. 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체, 특히 효모 복제 기점을 포함하는 것들은 그들이 바이러스 cDNA를 유전자 조작하기 위한 다용도 시스템을 제공한다는 추가 이점이 있다. 이러한 다용도성은 상기 박테리아 인공 염색체의 연구 및 개발 용도에, 예를 들어 RNA 바이러스 병원체에 대한 생 cDNA 백신의 설계에 또는 역 유전학적 접근법을 이용하는 특정 바이러스 유전자 생성물의 역할과 기능 규명을 목표로 하는 연구에 특히 중요하다.
본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체가 양성-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 포함하는 경우에, 상기 바이러스 cDNA는 그의 5' 말단에는 포유동물 세포에 도입시 바이러스 cDNA의 전사를 개시하는 RNA 폴리머라제 구동 프로모터에 의해 선행되는 것이 바람직하고, 반면에 그의 3' 말단에는 바람직하게는 세트 위치에서 상기 바이러스 cDNA의 RNA 전사체를 절단하기 위한 RNA 자기-절단을 위한 요소가 후속된다. 이들 시스-조절 요소는 함께 포유동물 세포에 박테리아 인공 염색체 도입시 상기 바이러스 cDNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 전사 및 프로세싱을 가능케 해준다. 바람직하게는, 상기 RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 RNA 폴리머라제 II-작동 프로모터, 예컨대 예를 들어 시토메갈로바이러스 극초기 (CMV-IE) 프로모터 (Thomsen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 659-663), 원숭이 바이러스 40 프로모터 (Deboist and Chambon (1981) Nature 290, 304-310) 또는 그의 기능적 상동 유도체, 예컨대 CMV-IE 닭 베타-액틴 키메라 (CAG) 프로모터 (Niwa et al., (1991) Gene 108, 193-199) 또는 상기 RNA 폴리머라제 II-작동 프로모터의 유도성 버전, 예컨대 테트라시클린-오퍼레이터 최소 CMV-IE 프로모터 (Gossen et al., (1995) Science. 268, 1766-1769; Baron and Bujard (2000) Methods Enzymol. 327, 401-421)이다. 이와 달리, 상기 RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 RNA 폴리머라제 I (Russel and Zomerdijk (2006) Biochem. Soc. Symp. 73, 203-216) 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예컨대 U6 또는 H1 프로모터이다. RNA 자기-절단을 위한 상기 요소는 델타 간염 바이러스의 게놈 리보자임의의 cDNA (Chadalavada et al., (2007) RNA 13, 2189-2201) 또는 문헌 [Webb and Luptak (2011) RNA Biol. 8, 719-727]에 기재된 바와 같은 기능적 상동 델타 간염 바이러스-유사 자기-절단 리보자임 RNA 요소의 cDNA인 것이 더욱 바람직하다. 바람직하게는, 상기 바이러스 발현 카세트에 함유된 양성-가닥 RNA 바이러스의 바이러스 cDNA는 하기 바이러스 패밀리, 즉 황열 바이러스 및 다른 플라비바이러스를 포함한 플라비비리다에(Flaviviridae), C형 간염 바이러스를 포함한 헤파시바이러스, 소 바이러스 설사 바이러스 및 고전적인 돼지 콜레라 바이러스를 포함한 페스티바이러스, 알파바이러스, 치쿤구냐(Chikungunya) 및 루비바이러스, 풍진 바이러스를 포함한 토가비리다에(Togaviridae), 엔테로바이러스, 예컨대 폴리오바이러스와 리노바이러스, 및 아프토바이러스를 포함한 피코르나비리다에(Picornaviridae), HCoV-229E, SARS-CoV, MERS-CoV (초기에는 신규 코로나바이러스 2012/London1_novel CoV 2012로서 기재되었음) 및 고양이 코로나바이러스를 포함한 코로나비리다에(Coronaviridae), 및 E형 간염 바이러스를 포함한 헤페바이러스, 및 노워크바이러스 및 노로바이러스를 포함한 칼리시비리다에(Caliciviridae) 중 어느 한 쪽에 속하는 바이러스로부터 유래된다. 바이러스 발현 카세트에 함유된 상기 바이러스 cDNA는 야생형 RNA 바이러스 게놈의 것에 상응할 수 있거나 또는 이종 DNA 서열이 삽입되고/되거나 천연 바이러스 서열이 결실, 말단절단 또는 돌연변이된 키메라 바이러스 cDNA 구축물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이종 DNA 서열은 포유동물에 이러한 키메라 바이러스 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 도입시 재조합 바이러스에 의해 이종 발현되는 1종 이상의 펩티드/단백질을 코딩한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 양성-가닥 생-약독화 황열 바이러스 (YFV)-17D 백신의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유한다 (도 6). 당해 특정 실시양태에 따른 박테리아 인공 염색체는 YFV-17D cDNA의 안정한 클로닝 및 증식에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 박테리아 인공 염색체는 현재 사용되고 있는 약독화 YFV-17D 바이러스 생백신 (스타마릴® 및 유사 제제, 예컨대 YF-Vax® 등)에 대한 대안으로서 생 YFV-17D에 대한 DNA 백신으로서 일익을 담당할 수 있다. 기존 YFV-17D 바이러스 백신에 관하여, 본 발명에 따른 YFV-17 DNA 백신은 그것이 진핵생물 세포 배양물 또는 부화계란에 대한 필요없이 보다 낮은 단가로 생산될 수 있다는 이점이 있다. 또한, 그의 유통은 저온유통체계를 요하지 않으며, 무침 투여될 수 있다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체는 이종 DNA 서열이 삽입되고/되거나 천연 바이러스 서열이 결실된 생-약독화 YFV-17D 백신의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유한다. 예를 들어, US 6962708를 참조하면, YFV-17D의 기능적 prM-E 단백질이 발현되지 않도록 YFV-17D의 cDNA중 prM-E 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 결실, 말단절단 또는 돌연변이시킬 수 있으며, 반면에 제2 바이러스의 바이러스 외피 단백질이 YFV-17D 백신의 변경된 게놈으로부터 발현되도록 제2의 상이한 바이러스의 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 바이러스는 또한 플라비바이러스, 예컨대 일본 뇌염 (JE, 예를 들어 JE SA14-14-2), 뎅기열 (DEN, 예를 들어 뎅기열 유형 1 내지 4 중 어느 것; 예를 들어, 뎅기열-2 주 PUO-218) (Gruenberg et al., (1988) J. Gen. Virol. 67, 1391-1398), 머레이 밸리 뇌염 (MVE), 세인트 루이스 뇌염 (SLE), 웨스트 나일 (WN), 진드기-매개 뇌염 (TBE) (즉, 중부 유럽 뇌염 (CEE) 및 러시아 춘하 뇌염 (RSSE) 바이러스), 및 C형 간염 바이러스 (HCV)이다. 제2 플라비바이러스로서 사용하기 위한 추가적인 플라비바이러스는 쿤진 바이러스, 포와산 바이러스, 키아사누르 삼림열 바이러스, 지카 바이러스, 우수투 바이러스 및 옴스크 출혈열 바이러스를 포함한다. 포유동물 세포에 키메라 YFV-17D cDNA를 포함하는 이러한 박테리아 인공 염색체의 도입은 YFV-17D에 속하는 세포내 복제를 담당하는 유전자 및 유전자 생성물과 제2 바이러스의 외피의 유전자 및 유전자 생성물로 구성된 키메라 바이러스의 생산을 가져온다. 바이러스 외피는 중화 항체의 유도를 담당하는 항원 결정기를 함유하므로, 키메라 바이러스로의 감염 결과는 이러한 항체가 제2 바이러스에 대항하여 생성된다는 것이다. 이와 달리, YFV-17D의 cDNA중 prM-E 및/또는 NS1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 결실, 말단절단 또는 돌연변이시킬 수 있으며 그에 따라 YFV-17D의 기능적 prM-E 및/또는 NS1 단백질이 발현되지 않으며, 반면에 특이적 에피토프/항원을 함유하는 펩티드/단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입시킬 수 있으며 그에 따라 상기 단백질이 YFV-17D 백신의 변경된 게놈으로부터 발현된다. 이와 달리, 이종 단백질을 코딩하는 cDNA를 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체내 cDNA YFV-17D에 다른 위치에서 삽입시킬 수 있으며, 예컨대 E 유전자와 NS1 유전자 사이에의 삽입 (Bonaldo et al., (2007) Virol. J. 4, 115), C 유전자내 삽입 (Jones et al., (2005) Virology 331, 247-259; Schoggings et al., (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 14610-14615) 또는 YFV-17D cDNA의 비-번역 영역내 삽입 (Jones et al., (2005), 상기 인용)을 들 수 있다. 바람직하게는, 상기 에피토프/항원-함유 단백질은 종양 항원이거나, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 병원체의 항원이다. 포유동물 세포에 키메라 YFV-17D cDNA를 포함하는 이러한 박테리아 인공 염색체의 도입은 YFV-17D에 속하는 세포내 복제를 담당하는 유전자 및 유전자 생성물과 상기 에피토프/항원-함유 단백질의 유전자 및 유전자 생성물로 구성된 키메라 바이러스의 생산을 가져온다. 바이러스 외피는 중화 항체의 유도를 담당하는 항원 결정기를 함유하므로, 키메라 바이러스로의 감염 결과는 이러한 항체가 상기 에피토프/항원-함유 단백질에 대항하여 생성된다는 것이다.
본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체가 음성-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 포함하는 경우에, 양성-가닥 RNA 바이러스에 대하여 전술한 바와 같은 구축물은 바이러스 게놈 cDNA가 그의 발현을 구동하는 시스 요소에 관하여 그의 센스 (안티게놈) 배향으로 존재 하는 방식으로 (Radecke et al., (1995) EMBO J. 14, 5773-5784), 및 그것이 바이러스 RNA와 함께 바이러스 RNA 복제의 구제에 필요한 바이러스 레플리카제 복합체의 일부가 되게 해주는 센스 배향으로 바이러스 유전자 생성물을 코딩하는 cDNA를 센스 배향으로 추가로 포함하는 방식으로 변형시켜야 한다. 이들 cDNA는 플라스미드로부터 바이러스 레플리카제 복합체를 건설하는 이들 바이러스 유전자 생성물을 발현하는 데 요구되는 조절성 시스 요소에 의해 플랭킹된다. 비-절편 음성-가닥 RNA 바이러스 (Conzelmann (1998) Annu. Rev. Genet. 32, 123-162)의 경우에, 이들 바이러스 유전자 생성물은 N (NP), P 및 L 단백질이다. 음성-가닥 RNA 게놈의 안티게놈 cDNA의 발현은 RNA 폴리머라제 I 또는 II 프로모터 (Martin et al., (2006) J Virol. 80, 5708-5715)에 의해 구동될 수 있으며; 반면에 바이러스 레플리카제 복합체를 건설하는 바이러스 단백질에 대한 발현 카세트는 선천적으로 바이러스 그들 자신에서 조우되는 바와 같이 폴리시스트론성일 수 있거나 또는 각 레플리카제 성분의 균형잡힌 발현을 위해 상이한 RNA 폴리머라제 프로모터의 세트 (Morita et al., (2012) Biotechniques 0, 1-5)를 채용하는 모노시스트론성일 수 있다. 본 발명에 따른 인공 박테리아 염색체로부터의 절편 RNA 게놈을 갖는 음성-가닥 RNA 바이러스의 구제는 비-절편 RNA 게놈을 갖는 음성-가닥 RNA 바이러스에 대하여 기술한 바와 같은 시스템에 관한 변형을 요구하며; 보다 구체적으로는 적당한 RNA 폴리머라제 I 및 II 프로모터 (Fodor et al., (1999) J. Virol. 73, 9679-9682)에 의해 구동된 각각의 게놈 절편에 대한 발현 카세트 (Neumann and Kawaoka (2004) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 43-60)가 혼입될 필요가 있다. 종래 기술에 따른 이러한 목적을 위해 사용된 플라스미드 벡터 시스템의 제한된 벡터능에 기인하여, 이러한 바이러스의 구제에 요구되는 모든 기능은 종래 기술에서는 여러 플라스미드의 공-형질감염에 의해 제공되어야 하며, 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 구제를 위해 8 또는 12종류까지의 플라스미드를 사용하는 것이 각각 문헌 [Hoffmann et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11411-11416] 및 [Fodor et al., 1999, 상기 인용]에 이전에 기재된 바 있다. 대형 삽입체를 함유하려는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 높은 벡터능은 양성-가닥 RNA 바이러스 게놈에 대해서와 유사한 방식으로 단일 박테리아 인공 염색체로부터 음성-가닥 RNA 바이러스 게놈 또는 게놈 절편+추가적인 바이러스 단백질 코딩 서열을 발현하는 것을 가능케 해준다.
바람직하게는, 상기 바이러스 발현 카세트 및 바이러스 복제의 구제에 필요한 추가적인 발현 카세트에 함유된 음성-가닥 RNA 바이러스의 상기 바이러스 cDNA는 하기 바이러스 패밀리, 즉 인플루엔자 A, B 및 C 바이러스를 포함한 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 및 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스 및 호흡기 합포체 바이러스를 포함한 파라목시바이러스 중 어느 한 쪽에 속하는 바이러스로부터 유래된다. 바이러스 발현 카세트에 함유된 상기 바이러스 cDNA는 야생형 RNA 바이러스 게놈의 것에 상응할 수 있거나 또는 이종 DNA 서열이 삽입되고/되거나 천연 바이러스 서열이 결실, 말단절단 또는 돌연변이된 키메라 바이러스 cDNA 구축물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이종 DNA 서열은 포유동물에 이러한 키메라 바이러스 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 도입시 재조합 바이러스에 의해 이종 발현되는 1종 이상의 펩티드/단백질을 코딩한다.
본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체가 이중-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 포함하는 경우에, 구축물은 문헌 [Boyce et al., (2008) J. Virol. 82, 8339-8348]에 기재된 바와 같은 바이러스 RNA 복제의 구제에 필요한 모든 바이러스 RNA 게놈 절편, 즉 블루텅 바이러스의 경우에 10 RNA가 초기 전사체의 적절한 프로세싱, 주로 캡핑을 가능케 해주는 RNA 폴리머라제 II 프로모터로부터 발현될 수 있도록 변형시켜야 한다. 이와 달리, RNA 폴리머라제 I 및 III 프로모터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 바이러스 발현 카세트에 함유된 이중-가닥 RNA 바이러스의 상기 바이러스 cDNA는 하기 바이러스 패밀리, 즉 레오바이러스, 로타바이러스 및 블루텅 바이러스를 포함한 레오비리다에(Reoviridae) 중 어느 한 쪽에 속하는 바이러스로부터 유래된다. 바이러스 발현 카세트에 함유된 상기 바이러스 cDNA는 야생형 RNA 바이러스 게놈의 것에 상응할 수 있거나 또는 이종 DNA 서열이 삽입되고/되거나 천연 바이러스 서열이 결실, 말단절단 또는 돌연변이된 키메라 바이러스 cDNA 구축물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이종 DNA 서열은 포유동물에 이러한 키메라 바이러스 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 도입시 재조합 바이러스에 의해 이종 발현되는 1종 이상의 펩티드/단백질을 코딩한다.
본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체가 복제를 위한 암비센스 RNA 전략을 이용하는 바이러스의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 포함하는 경우에, 구축물은 문헌 [Lowen et al., (2004) Virology 330, 493-500]에 기재된 바와 같은 바이러스 RNA 복제의 구제에 필요한 모든 바이러스 RNA 게놈 절편이 RNA 폴리머라제 I 또는 II 프로모터로부터 발현되는 방식으로 변형시켜야 한다. 바람직하게는, 상기 바이러스 발현 카세트에 함유된 복제를 위한 암비센스 RNA 전략을 이용하는 바이러스의 상기 바이러스 cDNA는 하기 바이러스 패밀리, 즉 리프트 밸리열 바이러스, 한탄 바이러스 및 슈말렌베르크 바이러스를 포함한 부냐비리다에(Bunyaviridae), 및 라싸 바이러스를 포함한 아레나비리다에(Arenavirdae) 중 어느 한 쪽에 속하는 바이러스로부터 유래된다. 바이러스 발현 카세트에 함유된 상기 바이러스 cDNA는 야생형 RNA 바이러스 게놈의 것에 상응할 수 있거나 또는 이종 DNA 서열이 삽입되고/되거나 천연 바이러스 서열이 결실, 말단절단 또는 돌연변이된 키메라 바이러스 cDNA 구축물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이종 DNA 서열은 포유동물에 이러한 키메라 바이러스 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 함유하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 도입시 재조합 바이러스에 의해 이종 발현되는 1종 이상의 펩티드/단백질을 코딩한다.
전술하고 예들에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명은 DNA 백신에 사용될 충분히 고품질의 다량의 바이러스 cDNA를 생성하게 해준다.
DNA에서 백신 제제로의 제제화는 관련 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [chapter 6 to 10 of "DNA Vaccines" Methods in Molecular Medicine Vol 127, (2006) Springer Saltzman, Shen and Brandsma (Eds.) Humana Press. Totoma, N.J.]에서 및 문헌 [chapter 61 Alternative vaccine delivery methods, Pages 1200-1231, of Vaccines (6th Edition) (2013) (Plotkin et al., Eds.)]에서 상세히 기재하고 있다. DNA 백신의 제조에 적합한 허용되는 담체, 희석제, 부형제 및 아주반트에 관한 세부사항은 후술하는 바와 같이 WO 2005042014에서 또한 찾아볼 수 있다.
"허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 의학 및/또는 수의학에서의 사용에, 특히 면역요법에 관하여 허용되는 추가적인 물질을 언급한다.
예로서, 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제는 전신 또는 국소 투여에 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충진제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 특정 투여 경로에 따라, 관련 기술분야 주지의 다종다양한 담체가 사용될 수 있다. 이들 담체는 당, 전분, 셀룰로스와 그의 유도체, 맥아, 젤라틴, 탈크, 황산칼슘, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 포스페이트-완충 용액, 유화제, 등장성 염수 및 염, 예컨대 염산염, 브롬화물과 황산염을 포함한 무기산 염, 유기산 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트와 말로네이트, 및 발열물질 비-함유수를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
제약상 허용되는 담체, 희석제 및 부형제를 기재하고 있는 유용한 참고문헌은 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991]이다.
환자에 DNA 백신을 제공하기 위해서는 임의의 안전한 투여 경로가 채용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 혀밑, 구강, 정맥내, 관절내, 근육내, 피내, 피하, 흡입, 안내, 복막내, 뇌실내, 경피 등이 채용될 수 있다. 예를 들어 면역요법 조성물, 단백질성 백신 및 핵산 백신의 투여에는 근육내 및 피하 주사가 적당할 수 있다. 미세입자 충격 또는 전기천공이 핵산 백신의 전달에 특히 유용할 수 있음이 또한 고려된다.
투여 형태는 정제, 분산액, 현탁액, 주사액, 용액, 시럽, 트로키, 캡슐, 좌제, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 이들 투여 형태는 이러한 목적을 위해 구체적으로 설계된 주사 또는 이식하는 제어 방출 장치 또는 추가적으로 이러한 방식으로 작용하도록 변형된 임플란트의 다른 형태를 또한 포함할 수 있다. 치료제의 제어 방출은 그 치료제를 예를 들어 아크릴수지, 왁스, 고급 지방족 알콜, 폴리락트산과 폴리글리콜산 및 특정 셀룰로스 유도체, 예컨대 히드록시프로필메틸셀룰로스를 포함한 소수성 폴리머로 코팅함으로써 달성될 수 있다. 또한, 제어 방출은 다른 폴리머 매트릭스, 리포솜 및/또는 미세구체를 사용함으로써 달성될 수도 있다.
경구 또는 비경구 투여에 적합한 DNA 백신은 각각이 미리 결정된 양의 플라스미드 DNA를 함유하는 캡슐, 새세이 또는 정제와 같은 불연속 단위로서, 분말 또는 과립으로서, 또는 수성 액체, 비-수성 액체, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼중 용액 또는 현탁액으로서 제시될 수 있다. 이러한 조성물은 조제학의 방법 중 어느 것에 의해 제조될 수 있지만 모든 방법은 전술한 바와 같은 1종 이상의 작용제와 1종 이상의 필요 성분을 구성하는 담체를 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 DNA 플라스미드를 액체 담체 또는 미분 고체 담체 또는 양쪽 모두와 균일하게 그리고 친밀하게 혼합시키고, 이어서 필요에 따라 생성물을 목적하는 제공형태로 성형함으로써 제조된다.
상기 조성물은 투여량 제제와 상용성인 방식으로 및 유효한 양으로 투여될 수 있다. 환자에 투여되는 용량은 적당한 기간에 걸쳐서 환자에서 유익한 반응을 달성하기에 충분하여야 한다. 투여될 작용제(들)의 양은 의사의 판단에 따라 좌우될 인자들인 연령, 성별, 체중과 일반 건강상태를 비롯하여 치료 대상체에 좌우될 수 있다.
전형적으로 DNA 백신은 인간의 예방적 또는 치료적 면역화를 위해 사용되지만, 특정 바이러스에 대해서는 축산동물 및 반려동물과 같은 가축을 포함하여 척추 동물 (전형적으로는 포유동물, 조류 및 어류)에 또한 적용될 수 있다. 원숭이, 마우스, 래트, 조류 및 박쥐와 같은 바이러스의 살아있는 저장소 (동물원성감염증)인 동물에 백신접종이 구상된다.
특정 실시양태에서, 백신은 아주반트, 즉 백신 조성물의 면역원성 및/또는 효능을 증진시키는 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다. 그러나, 생백신은 결국에는 바이러스 복제에 관계없이 선천적 면역 반응을 자극할 수 있는 아주반트에 의해 손상될 수 있다. 적합한 아주반트의 비-제한 예는 스쿠알란 및 스쿠알렌 (또는 동물 기점의 다른 오일); 블록 코폴리머; 세제, 예컨대 트윈-80; 퀼 에이(Quill A), 광물성 오일, 예컨대 드레이크올(Drakeol) 또는 마콜(Marcol), 식물성 오일, 예컨대 낙화생유; 코리네박테리움-유래 아주반트, 예컨대 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum); 프로피오니박테리움(Propionibacterium)-유래 아주반트, 예컨대 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne); 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) (Bacille Calmette and Guerin, 즉 바꿔 말하면 BCG); 인터류킨, 예컨대 인터류킨 2 및 인터류킨 12; 모노카인, 예컨대 인터류킨 1; 종양괴사인자; 인터페론, 예컨대 감마 인터페론; 조합물, 예컨대 사포닌-수산화알루미늄 또는 퀼 에이-수산화알루미늄; 리포솜; ISCOMt) 및 ISCOMATRIX (B) 아주반트; 미코박테리아 세포벽 추출물; 합성 글리코펩티드, 예컨대 무라밀 디펩티드 또는 다른 유도체; 아브리딘(Avridine); 지질 A 유도체; 덱스트란 술페이트; DEAE-덱스트란 또는 DEAE-덱스트란+인산알루미늄; 카복시폴리메틸렌, 예컨대 카보폴에마(Carbopol'EMA); 아크릴릭 코폴리머 에멀젼, 예컨대 네오크릴(Neocryl) A640; 백시니아 또는 동물 폭스바이러스 단백질; 서브-바이러스 입자 아주반트, 예컨대 콜레라 독소, 또는 그들의 혼합물을 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다.
실시예
실시예 1: 실시예 2 및 3에 제시된 실험 작업에 사용된 동물, 바이러스, 세포, 박테리아 및 효모
동물
인터페론 유형 I 및 II 수용체 양쪽 모두의 녹아웃을 갖는 129/Sv 마우스 (AG129 마우스; 비앤케이 유니버셜 리미티드(B&K Universal Ltd.)/영국)를 하우스 사육하였다.
바이러스 및 세포
베로-B (아프리카 녹색 원숭이 신장; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) CCL-81) 및 BHK-21 (베이비 햄스터 신장 세포; ATCC CCL-10) 세포를 ATCC로부터 입수하였다. 모든 세포는 본질적으로 문헌 [De Burghgraeve et al., (2012) PLoS ONE 7, e37244]에 기재된 바와 같이 배양하였다. 황열 바이러스 백신 주 17D (스타마릴®)는 사노피 파스퇴르 엠에스디(Sanofi Pasteur MSD) (벨기에 브뤼셀)로부터 구입하였다.
박테리아 및 효모
pShuttle-BAC의 일상적인 클로닝 및 증식에 사용된 박테리아 균주는 각각 이. 콜라이 Top 10 (인비트로젠(Invitrogen)) 및 Epi300-T (에피센터)이었다. 전장 플라비바이러스 cDNA 플라스미드 pACNR-FL17DII, pACNR-DENV2 및 p4 (이하 참조)로 형질전환된 박테리아를 28℃에서 일상적으로 성장시켰으며, 플라스미드 DNA 수율은 클로람페니콜 증폭에 의해 증가하였다. 셔틀 플라스미드 함유 Epi-300T 세포를 37℃에서 성장시키고 이하에 기재된 바와 같이 증폭시켰다. 효모 균주 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) YPH500 (유전자형: MATα ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1)을 디프코-비디 바이오사이언시스(Difco-BD Biosciences) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터의 선택 배지에서 성장시켰다. 리튬 아세테이트 방법을 이용하여 적격 효모 세포의 형질전환을 수행하였고, 효모를 28℃에서 성장시켰다.
실험 섹션에 사용되는 프라이머를 이하에 나타내었다.
<표 1>
프라이머 목록
Figure 112015113785869-pct00001
Figure 112015113785869-pct00002
실시예 2: 각각 YFV-17D, 뎅기열 유형 2 (DENV2) 및 뎅기열 유형 4 (Denv4)의 바이러스 cDNA를 함유하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 생산
각각 YFV-17D, 뎅기열 유형 2 (DENV2) 및 뎅기열 유형 4 (Denv4)의 바이러스 cDNA를 함유하는 박테리아 인공 염색체를 이하에 기재된 바와 같이 제조하였다.
재료 및 방법
플라스미드 구축물 (박테리아 인공 염색체)
모든 플라스미드 구축물은 표준 기술에 의해 생성시킨 다음 생거(Sanger) 시퀀싱으로 확인하였다. 유도성 셔틀 벡터 pShuttleBAC/Pme를 다음과 같이 수개의 단계로 생성하였다 (도 1). 먼저, 아라비노스-유도성 pBeloBAC/oriV (Wild et al., (2002) Genome Res. 12, 1434-1444)의 유도체인 pBAC/LacZ (애드진 플라스미드 # 13422)에 존재 하는 lacZ 유전자를 (i) 히그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자를 구동하는 원숭이 바이러스 40 (SV40) 프로모터/기점 (서열 1), (ii) 델타 간염 바이러스의 게놈 리보자임 (HDrz)의 합성 cDNA (Chadalavada et al., (2007) RNA 13, 2189-2201) (서열 2), (iii) 사카로미세스 세레비지아에 에피솜 2μ 플라스미드 기점, 및 (iv) 트립토판에 대한 원영양 성장을 부여하는 TRP1 유전자를 함유하는 합성 DNA 카세트로 치환시켰다. 빌딩 블록 (i)은 프라이머 #334 및 #425를 사용하여 pBABE-hygro (Morgenstern et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18, 3587-3996; 애드진 플라스미드 # 1765)로부터 PCR 증폭시켰다. 빌딩 블록 (ii-iv)는 프라이머 #426 및 #231을 사용하여 pJet(-)/Trp1_2micron-YF3'_HDrz_BstE로부터 PCR 증폭시켰다. 플라스미드 pJet(-)/Trp1_2micron-YF3'_HDrz_BstE는 YFV-17D cDNA (바이러스 nt 9466 내지 10862를 포함)의 3'-말단과 (ii) HDrz (DNA 뉴클레오티드 #109, 110 및 111로부터 조립), 및 (iii+iv) PCR 프라이머 #194 및 #195를 사용하여 pRE637 (Esteban & Fujimura, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2568-2573)로부터 최초로 유도된 2μ-TRP1 서열의 융합체를 함유하는 pJet1.2/blunt (클론제트(CloneJET) PCR 클로닝 키트, 퍼멘타스(Fermentas))의 유도체이다. 빌딩 블록 (i)를 pBAC/LacZ의 SalI 부위중으로 클로닝하기에 앞서 중복 연장 PCR에 의해 (ii-iv)에 융합시켜 pShuttleBAC/SV40_Hygro_HDrz 중간체 구축물을 생성하였다. 후속하여, 이. 콜라이에서의 형질전환 및 클로닝에 앞서 프라이머 #474 및 #475를 사용하여 완전 플라스미드를 스패닝하는 역 PCR 및 T4 DNA 리가제에 의한 재-환상화에 의해 최종 pShuttleBAC/Pme 셔틀 벡터 (도 1A)에서 hph 유전자 스터퍼(stuffer) 요소를 pShuttleBAC/SV40_Hygro_HDrz로부터 다중 클로닝 부위 (SfiI-PmeI-BstEII)로 치환시켰다.
사카로미세스 세레비지아에에서의 상동 재조합에 의해 각각 YFV-17D (서열 3), DENV2 주 뉴기니-C (NGC) 및 DENV4 주 도미니카의 cDNA를 pShuttleBAC/Pme중으로 페이스팅함으로써 바이러스 발현 구축물 pShuttle/YF17D, pShuttle/DV2 및 pShuttle/DV4를 생성시켰다 (도 1B). 그러기 위해서, 바이러스 cDNA를 SV40 프로모터/기점 (Ghosh et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 100-104)의 -76 bp를 함유하는 말단 연장부를 그들의 5'에 도입하고, 86 nt HDrz 서열 (Chadalavada et al., (2007) RNA 13, 2189-2201)을 그들의 3' 말단에 도입하는 3라운드의 PCR에 의해 증폭시켰다. 제1 PCR (10 사이클)은 각각 바이러스 특이적 프라이머 조합 #454+#457, #455+#458 및 #856+#857을 사용하였고, 뒤이어 각각이 SV40- 및 HDrz-특이적 #453+#456, 및 최종적으로 #453+#111 프라이머를 사용하는 10 사이클을 행하였다. 각각의 바이러스 cDNA 주형은 pACNR-FLYF1DII (Bredenbeek et al., (2003), 상기 인용), pACNR-DENV2 및 p4 (Durbin et al., (2001) Am J Trop Med Hyg. 65, 405-413)이었다. 플라스미드 pACNR-DENV2는 YFV-17D 서열을 DENV2 NGC cDNA 유래 pDVWS601 (Gualano et al., (1998) Gen. Virol. 79, 437-446)로 치환시켰으며, 또한 각각 바이러스 게놈의 nt 위치 7537 및 10232에 부가적이고 번역적으로 침묵한 AgeI 및 BstEII 부위를 함유하고 있는 pACNR-FLYF17D의 유도체이다. 재조합에 필요한 선형화 벡터 부분은 프라이머 #552+#553을 사용하여 PmeI로 미리 선형화시킨 pShuttleBAC/Pme상에 역 PCR에 의해 제조하였다. 벡터 앰플리콘을 겔 정제 및 효모 YPH500중으로의 형질전환에 앞서 DpnI로 처리하여 절단되지 않았을지도 모르는 플라스미드 주형의 백그라운드 형태 이월을 감소시켰다. 효모 클론을 트립토판의 부재 하에서 성장시켜 재조합 셔틀 플라스미드를 선택하였다. 효모 미니프렙으로부터 회수된 플라스미드 DNA를 (20mM 염화마그네슘으로 보충한) 미사용 LB 배지중으로 6배 희석한 밤샘 배양물에 0.1% (w/v) L-아라비노스의 첨가 및 격렬한 진탕하에 37℃에서 6 hr 동안의 성장에 의해 문헌 [Wild et al., (2000), 상기 인용]에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 Epi300-T 세포 (에피센터)중으로 전달시키고 증폭시켰다.
nt 9294의 하류에 적당하게 돌연변이된 YFV-17D cDNA를 포함하는 효모 에피솜 플라스미드 (YEp) p404Gal1/HA-NS5ΔGDD_ura3으로부터 유래한 3.6 kb 길이 BglII-PstI 제한 단편을 ClaI (YFV-17D nt 9656의 하류) 및 KasI (HDrz nt 위치 +27의 상류)에 의해 선형화된 pShuttle/YF17D중으로 상동 재조합시켜 pShuttle/YF17DΔGDD를 수득함으로써 자신의 NS5 ORF에 비-전환 치사 돌연변이 (RdRpΔGDD)를 함유하는 YFV-17D 변이체를 생성시켰다.
결과
합성 DNA 구축물의 시리즈 (pShuttleBAC 시리즈)를 몇가지 DNA 빌딩 블록으로부터 조립하여 RNA 바이러스 발현 플라스미드로서 역할을 하도록 하였다 (도 1). 공통 벡터 구축물 pShuttleBAC/Pme는 이. 콜라이에서의 조건부 증폭을 위한 제2 기점 (oriV), 및 사카로미세스 세레비지아에에서의 에피솜 복제를 위한 효모 2 μ 기점과 TRP1 영양요구성 마커를 함유하는 박테리아 인공 염색체이다 (도 1A). YFV-17D 백신의 cDNA를 삽입시켜 pShuttleBAC/Pme에 존재 하는 SV40 프로모터와 HDV 리보자임간의 상동 재조합에 의해 pShuttle/YF17D를 수득하였다 (도 1B). pShuttle/YF17D의 지도를 도 8에 도시하였다 (서열 4). 다른 플라비바이러스의 cDNA를 또한 삽입시켰다. 종래 기술 플라비바이러스 cDNA 클론, 예컨대 pACNR-FLYF17DII와는 대조적으로, pShuttle/YF17D는 이. 콜라이에서 보다 우수한 유전적 안정성을 보이며 (도 2), 더욱이 높은 플라스미드 DNA 수율을 산출하도록 유도시킬 수 있다.
실시예 3: YFV-17D 백신의 cDNA를 포함하는 본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체의 시험관내 및 생체내 특성화
본 발명에 따른 박테리아 인공 염색체로부터 발현된 YFV-17D의 특징은 최초 백신 바이러스의 것 (예컨대 복제 효율, 바이러스 수율 및 플라크 표현형)과 동일한 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 당해 네이키드 YFV-71D 플라스미드 DNA를 AG129 마우스에 i.p. 주사하였을 때, 그것은 양친 바이러스와 동일한 병리, 이환율 및 사망률을 가져왔다. 이러한 편리하고, 강건하며 재현가능한 시스템은 진핵생물 세포 배양물 또는 부화계란에 대한 필요없이 저렴한 단가로 YFV에 대한 DNA 백신을 제공한다. 그것은 더 이상 저온유통체계를 필요로 하지 않을 것이며 무침 주사될 수 있다.
재료 및 방법
시험관내 전사, 시험관내 캡핑 및 전기천공
전장 YFV-17D cDNA를 함유하는 플라스미드 pACNR-FLYF17DII (Bredenbeek et al., (2003) J. Gen. Virol. 84, 1261-1268)를 AflII로 선형화시킨 다음, 프로테이나제 K 소화, 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하였다. 이와 달리, 시험관내 전사 (IVT)를 위한 전장 cDNA 주형을 프라이머 #173과 #55 및 카라 하이 피델리티(KAPA High Fidelity) DNA 폴리머라제를 사용하여 pACNR-FLYF17DII의 PCR에 의해 제조하여 제한된 플라스미드 수율을 극복하였다. Sp6 RNA 폴리머라제 (리보맥스(Ribomax) 대규모 RNA 생산 키트, 프로메가(Promega))를 사용함으로써 시험관내에서 런-오프 RNA 전사체를 생산하였다. 전사체를 정제한 백시니아 바이러스 7-메틸 구아노신 트랜스퍼라제 (스크립트캡(Scriptcap) 7mG 캡핑 시스템, 에피센터)를 사용하여 캡핑하고, 담체 RNA로서 BHK-21 세포로부터 추출된 과량의 총 RNA를 사용하여 BHK-21 세포의 전기천공용으로 사용하였다. 형질감염된 세포가 거의 완전한 세포병원성을 보였을 때 세포 배양 배지를 수거하였다. 배지를 원심분리에 의해 세포 파편으로부터 청정화한 다음 후속 사용하여 BHK-21 세포상에 바이러스 스톡을 제조하였다.
플라스미드 형질감염
베로-B 세포를 6-웰 플레이트중으로 10% 우태 혈청을 함유하는 배지에 70% 전면생잘률로 시딩한 다음, 그 다음날 트랜싯(Transit)-LT1 시약 (마이루스(Mirus))을 사용하여 2.5 ㎍의 플라스미드 DNA로 1:3의 DNA:비히클 비로 형질감염시켰다. 플라스미드 pmRFP1을 가시적 대조군으로서 역할을 하도록 1:10의 비로 공-형질감염시켜 동등한 형질감염 효능을 보장하였다. 바이러스 스톡의 장기 유지 및 생산을 위해, 배지는 오직 2% 혈청을 함유하도록 밤새 인큐베이션 후 교체하였다.
바이러스 RNA 말단의 지도작성
pShuttleBAC 벡터-유래 바이러스 RNA의 적당한 프로세싱은 cDNA 말단의 고속 증폭 (RACE)에 의해 분석하였다. 신규 역 라이게이션/증폭 프로토콜에 따른 5' RACE는 매우 상세하게 공개되어 있다 (Dallmeier & Neyts (2013) Anal. Biochem. 434, 1-3). 비-폴리아데닐화 YFV-17D 게놈 RNA의 3' RACE는 본질적으로 전술한 바와 같이 수행하였다. 간략히 말하자면, pShuttle/YF17D-형질감염 베로 세포의 DNase I-처리 총 RNA 5 ㎕ (대략적으로 1 ㎍의 RNA)를 15% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-8000의 존재 하에 10 ㎕의 총 반응부피로 밤새 16℃에서 T4 RNA 리가제 2 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))의 K227Q 돌연변이체의 활성에 의해 5'-아데닐화 및 3'-디데옥시시토신 (ddC)-변형 링커 #393 (miRNA 클로닝 링커 1, 아이디티 디엔에이 테크놀로지스(IDT DNA Technologies))에 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 YFV-17D 및 각각 링커-특이적 프라이머 #391과 #394를 사용하여 원-스텝 RT-PCR (퀴아젠(Qiagen))에 의해 증폭시켰다. 265 bp의 앰플리콘을 겔 정제한 다음, Taq DNA 폴리머라제에 의해 생성되고 생거 시퀀싱에 의해 분석된 3' 아데닌 오버행을 폴리싱한 후 pJet1.2/blunt (클론제트 PCR 클로닝 키트, 퍼멘타스)중으로 클로닝시켰다.
세포내 바이러스 복제성 RNA 형태의 검출
변성 아가로스 겔 전기영동 후 바이러스 복제성 중간체의 노던 블롯팅 및 검출은 채용되는 겔 시스템 및 프로브 설계에 관하여 약간의 변형을 가하여 본질적으로 문헌 [Dallmeier et al., (2008) PLoS Pathog. 4, e1000230]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말하자면, 3 ㎍의 총 RNA를 열 변성시키고 20mM 3-(N-모폴리노)프로판 술폰산 (MOPS), pH 7.0, 5mM 소듐 아세테이트 및 1% 포름아미드와 0.01 ㎍ 에티듐 브로마이드 mL-1를 함유하는 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)중 1% 아가로스 겔, 이어서 20x SSC (3M 염화나트륨, 300mM 소듐 시트레이트, pH 7.0)중 양으로 하전된 나일론 막 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))상에서의 모세관 이동을 통해 분리하였다. YFV-17D의 NS5 영역 (nt 7637-8136)의 5' 말단에 상보적인 가닥-특이적 DIG-표지 단일가닥 DNA 프로브를 프라이머 #947 및 #948을 사용하여 문헌 [Knuchel et al., (2000) J. Histochem. Cytochem. 48, 285-294]에 따라 생성하였다. 하이브리드화 및 면역검출은 필터 하이브리드화를 위한 DIG 응용 매뉴얼 (로슈 다이아그노스틱스)에 따랐다.
플라크 검정 및 RT-qPCR에 의한 바이러스 정량
형질감염된 세포로부터 방출된 감염성 바이러스를 문헌 [Kaptein et al., (2010) Antimicrob Agents Chemother. 54, 5269-8520]에 이전에 기술된 바와 같이 0.5x 유지 배지에서 1% 미세결정질 셀룰로스 (아비셀(Avicell)) 오버레이를 사용하여 BHK-21 세포의 융합성 단층의 바이러스 플라크 검정 7일 p.i.에 의해 정량하였다. 감염된 마우스 조직에서의 바이러스 RNA 부하의 정량을 위해, 순간 동결 검시물을 프레셀리스(Precellys) 비드 밀에서 RLT 완충제 (RNeasy, 퀴아젠)중에 붕괴시키고, 후속하여 총 RNA를 제조업자의 사용설명서에 따라 추출하였다. YFV-17D RNA에 대한 정량적 리버스 트랜스크립타제 PCR (RT-qPCR)을 NS3 유전자의 약 150 nt 신장물을 표적화하는 프라이머와 프로브 및 표준으로서 동일한 클로닝 YFV-17D cDNA 단편의 연속 희석액을 사용하여 정확히 문헌 [Kaptein et al., (2010), 상기 인용]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
면역형광 검정
pShuttle/DV2-형질감염 BHK-21 세포 7d p.t.의 청정화 상청액을 사용하여 준전면생장 베로-B 배양물을 접종하고, 이를 5일 후에 4% 파라포름알데히드에 고정한 다음 본질적으로 문헌 [De Burghgraeve et al., (2012) PLoS ONE 7, e37244]에 이전에 기재된 바와 같이 면역염색하였다. 세포내 E 단백질 발현을 DENV2 혈청형-특이적 모노클로날 항체 (mAb) 3H5.1 (밀리포어(Millipore)) 및 이차 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-488-표지 Ab (밀리포어)에 의해 검출하였다. DAPI 염색 뒤에, 세포를 플로이드(FLoid) 세포 영상화 스테이션 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 사용하여 가시화하였다.
마우스의 생체내 형질감염
10 내지 20 ㎍ 플라스미드 DNA를 33% 프로필렌 글리콜중 담체로서 20 ㎍ 탄산칼슘 마이크로플라워 (Fumoto et al., (2012) Mol. Pharm. 9, 1962-1970)와 혼합하고, 성체 (약 20 g) AG129 마우스에 복막내 주사하였다. 이와 달리, 절반 용량의 생-약독화 YFV-17D 백신 (스타마릴®, 사노피 파스퇴르 엠에스디, 벨기에 브뤼셀)을 복막내 주사하였다. 체중과 행동을 매일 모니터링하였다.
결과
포유동물 세포중으로 형질감염시켰을 경우, 적당하게 프로세싱된 YFV-17D RNA의 전사는 세포내 자립적 바이러스 복제 (도 3A)를 개시하는 pShuttle/YF17D (도 3B)로부터 론칭된다. pShuttle/YF17D로 형질감염된 세포는 최종적으로는 조직 배양시에 그들의 세포독성 효과 유발능 (도 4A-C), 바이러스 수율 및 플라크 표현형 (도 4D+E)에 관하여 양친 YFV-17D 바이러스와 표현형상으로는 구별될 수 없는 감염성 비리온을 분비한다. 그렇게 생성된 재조합 바이러스는 그러므로 생물학적으로 동일한 (정량적으로 및 정성적으로) 것으로 간주될 수 있다. 마찬가지로, pShuttle/DV2로 형질감염된 세포는 재조합 감염성 DENV2 뉴기니 주 C를 생산한다 (도 5).
YFV-17D 감염의 확립된 치사적 생체내 마우스 모델 (Meier et al., (2009) PLoS Pathog. 5, e1000614; Thibodeaux et al., (2012) Vaccine 30, 3180-3187)인 AG129 마우스중 pShuttle/YF17D의 복막내 형질감염은 순정 YFV 백신 스타마릴®과 유사한 바이러스 유발 사망률 (도 6) 및 이환율 (도 7)을 초래한다. 결론적으로, 이러한 편리하고, 강건하며 재현가능한 시스템은 진핵생물 세포 배양물 또는 부화계란에 대한 필요없이 저렴한 단가로 YFV에 대한 DNA 백신의 개발을 가능케 해줄 수 있다. 그것은 더 이상 저온유통체계를 필요로 하지 않을 것이며, 무침 투여될 수 있다.
실시예 4: 네이키드 플라스미드 DNA의 피하 경로에 의해 및 무침 제트 주사에 의해 감염된 AG129 마우스에서 pShuttle/YF17D (DNA-YFVax)에 의해 유발된 이환율 및 사망률
복막내 경로와는 다른 pShuttle/YF17D (DNA-YFVax)의 적용을 위한 다른 경로의 가능성을 평가하기 위하여, 9주령 수컷 AG129 마우스 (수컷, 체중 22 내지 25 g)의 군 (n = 3)에 100 ㎕ 포스페이트-완충 염수 (PBS)중 25 ㎍의 DNA-YFVax로 (i) 주사기와 G27 바늘을 사용하여 피하 (s.c.) 주사하거나, 또는 (ii) 예를 들어 인슐린 또는 마취제의 경피 (t.d.) 적용을 위한 인간 임상 용도로 승인받은 무침 제트 주사장치 (인젝스(Injex)-30, 인젝스 파르마 게엠베하(Injex Pharma GmbH), 독일 베를린)로 t.d. 주사하였다. 이전과 같이 200 ㎕의 33% 프로필렌 글리콜중에 탄산칼슘 미세결정으로 제제화한 25 ㎍ DNA-YFVax로 i.p. 주사한 AG129가 대조군으로서 역할을 하였다. 이환율 및 사망률을 이전과 같이 채점하고, 실험을 30일 후에 종료하였다 (표 2 참조).
<표 2>
상이한 경로를 통해 DNA-YFVax를 주사한 수컷 AG129 마우스에서의 사망률
Figure 112015113785869-pct00003
MDD - 사망까지에 걸린 평균 일수; n.a. - 해당 없음
s.c. 및 t.d. 경로로 DNA-YFVax를 주사한 AG129 마우스의 적어도 일부에서 YFV-17D 유발 질환의 징후 (체중 감소, 털의 곤두세움, 등 웅크림, 후지마비)가 발생하였고 안락사시켜야 했다. 가장 중요하게는, 무침 제트 주사로 주사한 모든 마우스는 17±2일 안에 시종일관하게 YFV-17D 유발 뇌염으로 사망하였고, 반면에 모든 i.p. 주사 대조군 마우스는 실험의 기간 (30일)의 후까지 생존하였다. 검사의 진행과정 동안 대조군에서의 사망률 부족 (실시예 3에 제시된 13±2의 MDD와 비교하여)은 사용된 동물의 보다 높은 체중 및 웅성에 의해 쉽사리 설명될 수 있다.
주목할만한 것으로는, DNA-YFVax에 대한 담체로서 탄산칼슘을 사용하는 것이 백신 전달에 반드시 최적인 것은 아니며; 다시 말하자면 주사 경로 및 탄산칼슘 마이크로플라워의 상이한 배치간 가변성 양쪽 모두에 따라 햄스터에서 관찰되는 심지어는 일부 억제 효과가 종종 있었다 (실시예 5 참조). 결론적으로, DNA-YFVax는 상이한 제제로 및 무침 제트 주사에 의한 것을 포함하여 상이한 주사 경로에 의해 성공적으로 전달될 수 있다.
실시예 5: pShuttle/YF17D (DNA-YFVax)로의 면역화 뒤에 따르는 시리언 골든 햄스터의 혈청전환
DNA-YFVax에 의한 YFV에 대한 보호성 면역의 유도를 평가하기 위하여, 전임상 시리언 골든 햄스터 (메소크리세투스 아우라투스(Mesocricetus auratus)) 모델이 사용되었다 (Tesh et al., (2001) J Infect Dis. 183, 1431-1436). 그러기 위해서, 암컷 햄스터 (8 내지 10주령, 90 내지 100 g)의 군을 1/5 용량의 스타마릴® (100 ㎕), 또는 이전과 같이 200 ㎕의 33% 프로필렌 글리콜중 탄산칼슘 미세결정으로 제제화한 20 ㎍ pShuttle/YF17D (DNA-YFVax)의 복막내 (i.p.) 주사에 의해 면역화시켰다. 반복하여 10 ㎍ DNA-YFVax를 대신 적용하였다. 완전 외과적 마취하에서 심장 천자에 의해 매주 채혈하였으며, 원심분리에 의해 혈청을 수거하여 -80℃에서 동결 저장하였다. 두 비-처리 햄스터는 정상 혈청에 대한 공여자로서 역할을 하였다. 방어의 관련 면역상관을 채점하기 위하여, 혈청을 (i) 간접 면역형광 검정 (IIFA)에 의해, 및 (ii) 플라크-감소 중화 시험 (PRNT)에 의해 분석하였다.
간접 면역형광 검정 (IIFA). 면역화 햄스터 혈청중 YFV-17D (스타마릴® 및 DNA-YFVax)-특이적 IgG 항체는 약간의 변형을 가한 제조업자의 사용설명서에 따라 인간 임상 용도 (Niedrig et al., (2008) Clin Vaccine Immunol. 15, 177-81)에 대해 검증된 시판 YFV IIFA 키트 (유로이뮨 메디지니쉐 라보르디아그노스티카 아게(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG), 독일 뤼벡, 카탈로그 번호 FI-2665-1005G 및 FI-2665-1010G)를 사용하여 측정하였다. 햄스터 혈청을 샘플 완충제에 20배, 66배, 200배, 660배 및 2000배 희석하고, 30 ㎕의 혈청 희석액을 YFV-IIFA 슬라이드상에 적용하였다. 슬라이드를 30 min 동안 실온에서 인큐베이션하고 이어서 0.2% 트윈-20을 함유하는 PBS에서 5 min 동안 세척하였다. 메소크리세투스에서 유도된 항체의 검출을 위해, FITC-표지 항-햄스터 IgG 이차 항체 (잭슨 이뮤노 리서치 래보러토리즈 인코포레이티드(Jackson Immuno Research Laboratories Inc.), 카탈로그 번호 307-095-003)를 2% BSA를 함유하는 PBS에 1:50 희석시킨 다음, 키트에 제공된 항-인간 이차 항체 대신에 사용하였다. 슬라이드를 DAPI로 카운터염색하고, 종점 역가를 형광 현미경검사에 의해 측정하였다.
플라크 감소 중화 시험 (PRNT). 황열 백신-접종 햄스터 혈청에서의 중화 항체 역가를 PRNT를 이용하여 측정하였다. 간략히 말하자면, 0.5 x 106개 BHK 세포/웰을 12-웰 플레이트중 밤새 성장 배지 (10% FCS, 1% 중탄산나트륨 및 1% 글루타민으로 보충한 MEM 배지)에 플레이팅하였다. 모든 혈청을 연속 희석액 1:20, 1:66, 1:200, 1:660, 1:2000 및 1:6600으로 3개1조로 검정하였다. 30 ㎕ 혈청 희석액을 YFV-17D 바이러스 (스타마릴®, 로트 G5400P1, 베로-B 세포상에서 1회 계대)의 40 플라크 형성을 함유하는 30 ㎕ 검정 배지 (오직 2% FCS를 함유하는 것을 제외하고는 성장 배지와 동일)와 혼합하였다. 1 h 동안 37℃에서 당해 사전 흡착 후, 440 ㎕ 검정 배지를 첨가하고, 500 ㎕의 각 혼합물을 BHK 세포에 첨가하였다. 실온에서 1 h 인큐베이션 후, 세포를 LMP 아가로스 (인비트로젠)로 0.5%의 최종 농도로 보충한 검정 배지로 세척하고 오버레이시켰다. 후속하여, 세포를 5일 동안 37℃에서 배양, 8% 포름알데히드로 2 hr 동안 고정 및 김사(Giemsa) 염색제로 염색하였다. 플라크를 계수하고, 50% 중화 역가를 리드(Reed)와 뮌히(Munch) (Reed & Muench (1938) Am. J. Hyg. 27, 493-497)에 따라 계산하였다.
전체적으로, IIFA에 의한 교차반응 항체의 검출 (표 3)과 PRNT에 의한 중화 항체의 검출은 일치하였다 (표 4). 백신 효능에 관하여, DNA-YFVax는 스타마릴®보다 열등함을 보이지 않았으며; 양쪽 시험군 모두에서, 3개체 중 2개체 (1/5 스타마릴® vs. 20 ㎍ DNA-YFVax), 및 5개체 중 4개체 vs. 4개체 중 2개체 (1/5 스타마릴® vs. 10 ㎍ DNA-YFVax)가 YFV 교차반응 항체 및 중화 항체의 고-역가로 혈청전환되었다 (표 3과 4 참조). 이들 값은 완전 보호성 면역 (보호 면역 상관)을 나타내는 것으로 간주될 수 있으며, >40의 PRNT 역가는 치사성 YFV 챌린지 햄스터 모델 (Julander et al., (2011) Vaccine 29, 6008-6016)에서 보호성이다. 가장 중요하게는, WHO에서는 이미 >0.7의 log 중화 지수 (LNI)가 영장류에서 백신접종 뒤에 면역학적 보호와 상관관계가 있다고 진술하고 있으며, 이는 인간에 대해 적용된다 (WHO position paper (2013) Wkly. Epidemiol. Rec. 88, 269-283). PRNT Log10 역가 > 0.7의 당해 기준은 햄스터에서 DNA-YFVax에 의해서는 몇십 배만큼, 즉 150배보다 많게 초과된다 (표 4 참조).
더욱이, 면역 반응은 스타마릴®과 비교하면 DNA-YFVax 백신접종 개체에서 보다 균일하였으며, 고-PRNT 역가로의 혈청전환이 단지 4주 후에 보다는, 즉 스타마릴® 군으로부터의 다른 혈청전환자보다 3주 늦게 보다는, 3주 안에 일관되게 검출된다.
<표 3>
스타마릴® 및 DNA-YFVax 면역화 시리언 골든 햄스터에서의 YFV 교차반응성 항체 반응
Figure 112015113785869-pct00004
ND = 비검출; * (x/x) = 시험된 개체수 중 혈청전환된 개체수
<표 4>
스타마릴® 및 DNA-YFVax 면역화 시리언 골든 햄스터에서의 중화 항체 반응
Figure 112015113785869-pct00005
ND = 비검출
실시예 6: 클로닝된 YFV-17D cDNA의 유전적 불안정성 평가
(a) 출발 물질: pACNR-FLYF17DII (Bredenbeek et al., (2003), 상기 인용) 및 pShuttle/YFV-17D의 대규모 플라스미드 제제를 표준 기술을 이용하여 제조하였다. 그러기 위해서, pACNR-FLYF17DII를 표준 이. 콜라이 K12 유도체 균주에 형질전환시키고, 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 LB-한천에 플레이팅한 다음, 밤새 (37℃ 대신) 28℃에서 성장시켜 플라스미드 안정성을 지지하였다. 소형 콜로니를 일정비율로 규모확대하고, 100 ㎍/mL를 함유하는 LB중 28℃에서 격렬한 진탕하에 2연속 밤샘 배양으로 성장시켜 최종적으로 1 L 배치 배양물에 이르게 하였다. 당해 배치를 밤새 28℃에서 성장시킨 다음, 28℃에서 또 다른 8 h 동안 20 ㎍/mL의 최종 농도가 되도록 클로람페니콜의 첨가에 의해 최종적으로 증폭시켰다. 마찬가지로, pShuttle/YFV-17D를 이. 콜라이 균주 EPI300-T 세포 (에피센터)에 형질전환시키고, 20 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 LB-한천에 플레이팅한 다음, 또한 밤새 37℃에서 성장시켰다. 후자의 플라스미드를 그에 맞게 일정비율로 규모확대하고, 또한 모든 성장은 20 ㎍/mL 클로람페니콜의 존재 하에서 및 37℃에서 행하였다. 최종 밤샘 배치 배양물을 20 ㎍/mL 클로람페니콜 및 0.01% L-아라비노스를 함유하는 미사용 LB 배지에 1:6 희석한 다음, 6 h을 넘지 않게 성장시켰다. 플라스미드를 표준 칼럼 친화도 정제 (퀴아젠)를 이용하여 정제하고, TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)에 1 ㎍/mL의 최종 농도가 되도록 용해시킨 다음, -20℃에서 동결 저장하였다.
(b) 콜로니 성장 및 크기. 양쪽 플라스미드 모두를 이. 콜라이 EPI300-T에 형질전환시키고, 선택 배지로서 적당한 항생제를 함유하는 맥콩키(MacConkey) 한천 (2% 펩톤, 0.5% NaCl, 1% 락토스, 0.15% 담즙 염, 0.003% 뉴트랄 레드, 0.0001% 크리스탈 바이올렛, 1.35% 한천)상에 스트리킹하였다. 멸균 지르코니아 비드 (직경 2.5 mm)를 한천에 포매시켜 절대 크기 측정을 위한 교정기로서 역할을 하도록 하였다. pShuttle/YFV-17D로 형질전환시킨 박테리아의 1분취량에 대해, 한천은 추가적인 0.01% L-아라비노스를 함유하였다. 16 h 동안 37℃에서 인큐베이션 후, 일상적인 디지털 카메라 (캐논 파워샷(Canon Powershot) SX10IS)를 이용하여 사진촬영한 다음 JPEG 파일로 저장하였다 (도 9 참조). 영상을 콜로니 총수 및 크기에 관한 영상 분석을 위해 OpenCFU 버전 3.8.11에 투입하였다 (Geissman (2013) PLoS One. 8, e54072).
pShuttle/YFV-17D를 담지하는 이. 콜라이 클론은 pACNR-FLYF17DII 함유 클론 (도 9A)에 비하여 훨씬 더 큰 크기로 및 훨씬 더 균일한 집단 (도 9B)으로 성장하였다. 예상외로, pShuttle/YFV-17D의 이러한 외관상 더 낮은 독성은 심지어는 아라비노스-유도 상태에서도 잔존한다 (도 9C). pACNR-FLYF17DII 형질전환체 집단 (도 9A)에 존재 하는 보다 큰 콜로니는 십중팔구 독성 바이러스 단백질의 잠재 발현을 제거하는 돌연변이를 갖는 플라스미드를 함유한다 (실시예 6 참조).
영상 분석은 pACNR-FLYF17DII 함유 클론과 대비하여 pShuttle/YFV-17D에서 현저히 더 높은 균일성을 보여주었다 (표 5). 사실상, pACNR-FLYF17D 형질전환체는 상이한 크기 평균의 적어도 두 하위집단으로 명백하게 분류될 수 있으며, 그에 따라 (i) 평균으로부터의 큰 표준 편차 (표 5), 비-가우스 크기 분포 (도 10A), 및 (iii) 큰 차이, 예를 들어 계산된 산술 평균과 중앙값 콜로니 크기간의 큰 차이 (표 5)로 귀결된다. 대조적으로, pShuttle/YFV-17D를 담지하는 형질전환체는 보다 균일한 콜로니 크기 (표 5) 및 종형 가우스 크기 분포 (도 10B)를 보인다. 예상외로, 후자는 pShuttle/YFV-17D의 아라비노스-유도 상태에도 또한 완전히 적용된다 (표 5, 도 10C).
<표 5>
형질전환체 콜로니 크기 (단위: mm)를 채점하는 기술 통계학
Figure 112015113785869-pct00006
실시예 7: 이. 콜라이에서 클로닝된 YFV-17D cDNA의 증식 동안의 돌연변이 패턴 및 빈도
YFV-17D cDNA 함유 플라스미드의 클론 유전적 안정성에 대처하기 위하여, 실시예 6에서 기재한 바와 같은 양쪽 플라스미드 모두를 이전과 같이 (실시예 6b 참조) 이. 콜라이 EPI300-T중으로 형질전환시킨 다음, 선택 배지로서 적당한 항생제를 함유하는 맥콩키 한천에 스트리킹하였다. pACNR-FLYF17DII 클론을 28℃에서 24 h 동안 인큐베이션하였고, 반면에 pShuttle/YF17D 클론은 37℃에서 16 h 동안 인큐베이션하였다.
각각의 플라스미드로부터 각각 24 내지 48 콜로니의 두 시리즈를 플라스미드 성장을 위해 200 ㎕ 액체 배지 (20mM MgCl2로 보충한 적당한 항생제를 함유하는 LB)중으로 선발하였다. 각각 하나의 pACNR-FLYF17DII 시리즈는 소형 콜로니로부터 출발하도록 선택하였고 (pAS 시리즈), 또 하나는 대형 콜로니로부터 출발하도록 선택하였다 (pAL 시리즈). 주요한 크기 차이가 관찰될 수 없었던 pShuttle/Y17D에 대해서는 (실시예 6b 참조), 타당한 크기 차이가 있는 콜로니를 각각 보다 작은 콜로니로부터 (pSS 시리즈) 및 보다 큰 콜로니로부터 (pSL 시리즈) 출발하는 배양물의 두 시리즈로서 선택하였다.
pACNR 플라스미드를 함유하는 박테리아는 24 h 동안 28℃에서 인큐베이션하였고, 반면에 pShuttle 콜로니는 밤새 37℃에서 및 후속하여 6 h 동안 클로람페니콜과 0.01% 아라비노스를 함유하는 600 ㎕ LB에서 인큐베이션하였다. 이들 배양물 [계대 0 (P0)의 플라스미드로서 간주]의 일부를 각각 프라이머 #208과 #94 (상응하는 YFV-17D nt 1 - 940), 및 #953과 #954 (상응하는 YFV-17D nt 2500 - 3600)를 사용하는 증폭을 위한 PCR (고우택 그린 마스터믹스(GoTaq Green Mastermix), 프로메가)에 직접 투입하였다.
앰플리콘을 친화도 정제하고 (퀴아젠), 각각 프라이머 #208 및 #953을 사용하여 직접 서열분석하였다 (빅다이(Bigdye), 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)). 분석된 cDNA 영역은 이전에 알려진 독성의 결정인자, 즉 각각 이. 콜라이에서 바이러스 5' 비-번역 영역에 비정통적 전사 및 번역을 위한 잠재 프로모터 (Li et al., (2011) 상기 인용; Pu et al., (2011), 상기 인용) 및 바이러스 E-NS1 영역내에 특별히 소수성인 단백질 신장물 (Yamshchikov et al., (2001) Virology 281, 272-280)을 갖는 cDNA를 함유할 것으로 예상되었다.
각 배양 클론의 또 다른 부분을 이전과 같이 미사용 배지에 1/100 희석시키고 성장시켜 다음 계대 (P1)를 생성하였다. 후자를 10 계대 (P10)까지 반복하였다. P1, P3 및 P3으로부터의 플라스미드를 이전과 같이 PCR 및 서열분석에 의해 분석하였다. P10에 대해서는, 플라스미드를 5 mL의 보다 큰 부피의 배지에서 성장시키고 플라스미드를 표준 알칼리성 플라스미드 미니프렙 절차에 의해 단리하였다. 이들 플라스미드 미니프렙을 (i) PCR 분석 (nt 1 - 940 및 2500 - 3600 영역 양쪽 모두 표적화), 뒤이어 아가로스 겔 전기영동 검사, (ii) 직접 서열분석 (PCR 앰플리콘이 검출될 수 있었을 경우), 및 (iii) PstI를 사용하는 제한 분석에 투입하였다. P0, P1, P3 및 P10의 서열분석 결과를 표 6과 7에 요약하였다. P10의 PCR 및 제한 분석의 결과를 표 8에 요약하였다.
초기 계대에서 발견된 돌연변이
pAS 및 pAL 시리즈 (표 6)의 초기 계대 (낮은 계대수 P0 내지 P3)로부터의 플라스미드의 직접 서열분석은 최초 클론 플라스미드 제제 (실시예 6a 참조)에서 13%까지의 다소 높은 돌연변이 빈도를 보여주었다. 발견된 거의 모든 돌연변이는 각각 미성숙 정지 코돈 (PMSt) 및 단일 뉴클레오티드 결실/삽입의 도입에 기인한 넌센스 또는 프레임시프트 돌연변이 (FS)이었다. 이들 돌연변이는 명백하게도 전장 YFV-17D 개방 판독 프레임 (ORF)의 발현을 완전히 제거한다. pSL 시리즈에서도 비록 빈도가 덜하기는 하지만 유사한 돌연변이가 P1에서 발견되었다. P0에서의 pSS 시리즈에서, 바이러스 ORF의 발현을 폐지하지 않을 미스센스 돌연변이가 발견되었다.
결론적으로, YFV-17D의 cDNA를 운반하는 최초 클론 플라스미드 (실시예 6a 참조)의 대규모 제제는 쉽사리 검출가능한 양의 돌연변이체 플라스미드 변이체를 함유한다. pACNR-FLYF17DII의 경우에, 돌연변이의 대다수는 전장 바이러스 폴리단백질의 발현을 제거하며 이는 명백하게도 각 돌연변이체 cDNA로부터 생성된 바이러스 RNA를 복제 부적격이 되게 한다. 이것은 모든 플라스미드 클론의 10%보다 많은 클론에 대해 사실이다. pShuttle/YFV-17D의 경우에, 돌연변이 빈도는 보다 낮고 (10% 미만), 가장 중요하게는, 보다 적은 분율의 돌연변이체가 그러므로 선험적 복제 부적격 바이러스를 구성할 것이다.
계대 p10에서 발견된 돌연변이
pAL 및 pAS 시리즈로부터의 플라스미드를 계대 P10에서 분석하였을 때, 플라스미드의 대다수는 각각 48 플라스미드 클론 중 10개 (21%) 및 48 플라스미드 클론 중 44개 (92%)에서 nt 2500-3600 영역의 완전 증폭 실패로 인도한 대형 구조 재배열을 함유하였다 (표 8). 이는 DNA의 수 킬로베이스까지가 플라스미드로부터 실종된 후자 돌연변이체 플라스미드의 이상 제한 패턴을 동반하였다. 주목할만한 것은, 시험된 모든 돌연변이체 클론은 nt 1-940 영역을 여전히 함유하였고 (표 6), 따라서 무관계한 오염물이라기보다는 최초 pACNR-FLYF17DII의 후손이었다 (표 8). 종래 기술에 대해서 이러한 독성 cDNA 단편의 결실이 예상되고 보고되어 있다 (Yamshchikov et al., (2001), 상기 인용).
대조적으로, pShuttle-YFV17D 시리즈에서는 유사한 재배열 및 결실이 결코 발견되지 않았다. 여기서는 48개중 2개 (4%)만이 E-NS1 코딩 영역에서 가능한 인 프레임 ATG 개시 코돈 (nt 2957-2959)을 명백히 변화시키는 미스센스 돌연변이를 나타내었다. 이는 바이러스 ORF의 발현을 폐지하지 않을 것이다.
결론적으로, 최초 클론 pACNR-FLYF17DII (실시예 6a 참조)의 반복 계대는 바이러스 cDNA에 대형 결실 및 그에 따라 모든 플라스미드 클론의 90% 이상까지에서 기능적 cDNA의 손실을 가져오며, 이는 대단히 명백하게도 각 돌연변이체 cDNA로부터 생성된 바이러스 RNA를 완전히 비-기능적이 되게 한다. pShuttle/YFV-17D의 경우에, 돌연변이 빈도는 훨씬 더 낮으며 (5% 미만), 가장 중요하게는, 그들의 사용, 예를 들어 생-약독화 DNA 백신으로서 그들의 사용을 불가하게 할 선험적 복제 부적격 바이러스를 구성하는 어떠한 돌연변이체도 관찰할 수 없다.
<표 6>
이. 콜라이에서의 계대 (초기 계대) 동안에 클로닝된 YFV-17D cDNA에서 발생하는 돌연변이
Figure 112015113785869-pct00007
n.a. - 해당 없음; PMSt - 생성된 미성숙 정지 코돈 (넌센스 돌연변이); FS - 단일 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 기인한 프레임시프트; MS - 코돈을 변경하는 미스센스 돌연변이; S - 침묵적 동의어 코돈 교환
* 출발 코돈의 바로 상류 비-코딩 영역에서 관찰된 하나의 FS
** 동의어 야생형 코돈이 아닌 모든 3가지 교호적 코돈의 혼합 집단
<표 7>
이. 콜라이에서 계대 (후기 계대 P10) 동안에 클로닝된 YFV-17D cDNA에서 발생하는 돌연변이
Figure 112015113785869-pct00008
n.a. - 해당 없음; DEL - 대형 (킬로베이스 범위) 결실, 그 이상의 세부사항에 대해서는 표 8 참조; MSi - 가능한 인 프레임 ATG 개시 코돈을 변경하는 미스센스 돌연변이
* 계대 P0으로부터 유래된 밤샘 배양물을 플레이팅하였을 때, pSS 및 pSL 클론은 동일한 크기의 콜로니로 성장하였고, 그러므로 P10에서 더 이상 별개적인 것으로 간주되지 않았다.
<표 8>
이. 콜라이에서 계대 (계대 P10) 동안에 클로닝된 YFV-17D cDNA를 운반하는 플라스미드에서의 대형 구조적 변화
Figure 112015113785869-pct00009
n.d. - 측정되지 않았음
* 계대 P0으로부터 유래된 밤샘 배양물을 플레이팅하였을 때, pSS 및 pSL 클론은 동일한 크기의 콜로니로 성장하였고, 그러므로 P10에서 더 이상 별개적인 것으로 간주되지 않았다.
실시예 8: 키메라 플라비바이러스 백신에 대한 발현 벡터로서 pShuttle/YFV-JE, pShuttle/YFV-WN 및 pShuttle/YFV-USU의 구축
YFV-17D의 재조합 키메라 유도체가 개발되고, 그 YFV-17D가 이종 항원 (Guy et al., (2010) Vaccine 28, 632-49; US 특허 출원 20100278773)을 위한 벡터로서, 예를 들어 다른 병원성 플라비바이러스 항원의 표면 당단백질, 예컨대 각각 ChimeriVax-JE (이모젭®, 사노피 파스퇴르 엠에스디) 및 ChimeriVax-WN20으로서 개발된 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 및 웨스트 나일 바이러스 (WNV)의 prM 및 E 단백질을 위한 벡터로서 역할을 하는 백신으로서 사용되고 있다. 본 발명에 따른 pShuttle/YFV-17D (DNA-YFVax)는 형질감염된 플라스미드 DNA로부터 직접 이들 전술한 ChimeriVax 백신 바이러스를 론칭할 수 있고 따라서 생 바이러스를 함유하는 상기 생-약독화 ChimeriVax-JE (이모젭®) 및 ChimeriVax-WN20 백신을 완전히 대체할 수 있도록 변형시킬 수 있다.
ChimeriVax-JE를 발현하는 BAC인 pShuttle/ChimeriVax-JE (도 11A)는 pShuttle/YFV17D중 YFV-17D의 nt 482-2451을 신경약독화 JEV 백신 주 JE SA14-14-2 (Chambers (1999) J. Virol. 73(4), 3095-3101; Arroyo et al., (2001) J. Virol. 75, 934-942)의 nt 477-2477 + YFV-17D 백본의 NS2A 및 NS4B 유전자 (Pugachev et al., (2004) J. Virol. 78, 1032-1038)에서의 두 적응성 돌연변이로 치환시킴으로써 생성된다. 이는 3가지 플라스미드 단편; 즉 pShuttle/YFV17D의 두 PCR 앰플리콘 (nt 7228-481 및 nt 3966-7342) 및 주문 DNA 합성 (아이디티 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(IDT Integrated DNA Technologies), 벨기에 하스로드)에서 제조한 키메라 YFV-JEV cDNA 단편의 상동 재조합 및 연결에 의해 달성된다. 후자는 ChimeriVax-JE (도 11A)의 nt 359 - 4105를 포함한다. 최종 구축물은 서열 5에 특정된 바와 같은 서열을 갖는다.
ChimeriVax-WN02를 발현하는 BAC인 pShuttle/ChimeriVax-WN02 (도 11B)는 pShuttle/ChimeriVax-JE의 prM-E 유전자 영역을 문헌 [Monath et al., (2006) (Proc Natl Acad Sci USA. 103, 6694-6699)]에 따른 E 단백질에 3가지 신경약독화 돌연변이, 즉 L107F, A316V 및 K440R을 함유하는 영역 WNV (NY99 주)의 것으로 치환시킴으로써 생성된다. 그러기 위해서, 키메라 YFV-WNV cDNA 단편을 주문 DNA 합성 (아이디티 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스, 벨기에 하스로드)으로 제조한 다음, pShuttle/ChimeriVax-JE의 XhoI (nt 406) 및 KasI (nt 2477) 부위중으로 재조합시킨다. 최종 구축물은 서열 6에 특정된 바와 같은 서열을 갖는다.
실시예 9: 상이한 피코르나바이러스에 대한 발현 벡터로서 pShuttle/EV71의 구축
엔테로바이러스는 센스-배향으로 RNA 게놈을 갖는 소형 비-외피형 바이러스의 피코르나바이러스의 패밀리에 속하는 (+)-RNA 바이러스이다. 전형적으로 피코르나바이러스의 게놈은 캡핑되어 있지 않으며 대신에 5' 말단-공유결합 VPg 단백질을 또한 담지한다. 캡 구조의 결여시에, 내부 리보솜 침입 부위 (IRES)는 바이러스 단백질 발현을 위해 바이러스 RNA에 대한 세포 번역 기구를 동원한다. 원칙적으로, 감염성 바이러스 후손의 피코르나바이러스 복제 및 생산은 바이러스 게놈의 이종 전사 뒤에 세포내에서 론칭될 수 있다. 종래 기술에서, 바이러스 게놈은 파지 프로모터의 제어하에 있고 동족 파지 RNA 폴리머라제가 생산자 세포 (2-플라스미드 시스템)에서 공-형질감염되고 발현되는 경우에만 전사되는 cDNA로부터 발현된다. 마찬가지로, 상기 파지 폴리머라제는 헬퍼바이러스, 예컨대 재조합 바큘로바이러스 (Yap et al., (1997) Virology. 231, 192-200)를 사용하여 각 cDNA의 형질도입시 세포내 발현될 수 있다.
종래 기술의 보다 복잡한 접근법 대신에, 피코르나바이러스 cDNA는 인간 엔테로바이러스 71 (EV71)에 대하여 하기에 예시된 바와 같이 바이러스 복제의 직접 론칭을 위해 pShuttle-BAC (1-플라스미드 시스템)의 유도체로부터 세포내 발현될 수 있다. 그러기 위해서, EV71 게놈을 발현 카세트로서 5' SV40 프로모터 및 3' 말단 폴리A 테일, 뒤이어 델타 간염 바이러스 리보자임을 갖는 pShuttle-BAC중으로 클로닝시킨다. 이는 프라이머 #991 및 #992를 사용하여 PCR에 의해 EV71의 cDNA를 증폭시킨 다음, 프라이머 #453 및 #990으로 재-증폭시켜 각각의 발현 카세트를 생성함으로써 달성된다. 상이한 핵산 공급원이 당해 PCR을 위한 주형으로 사용되어 약 7.4kb 길이 EV71 cDNA; (i) 문헌 [Chua et al., (2008) J. Gen. Virol. 89, 1622-1632] 및 [Zhang et al., (2013) Virus Genes. 47, 235-243]에 의해 기재된 것과 같은 EV71의 이미 클로닝된 cDNA, 또는 (ii) 임의의 조직 배양의 역전사 생성물, 또는 EV71의 인간 또는 동물 조직-유래 전장 게놈 RNA를 적절히 증폭시킬 수 있다. 이와 달리, (iii) EV71 cDNA는 주문 유전자 합성에 의해 제조될 수 있다. cDNA의 공급원에 관계 없이, 그렇게 생성된 발현 카세트는 PmeI를 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 선형화시킨 pShuttle/BAC-Pme중으로, 바람직하게는 효모에서의 재조합에 의해 삽입될 것이다. 이러한 구축물은 EV71 주 BrCr-TR (Arita et al., (2005) J. Gen. Virol. 86, 1391-401)에 대하여 서열 7에 특정된 바와 같은 서열을 갖는다.
다른 엔테로바이러스, 예컨대 예를 들어 인간 리노바이러스 14 (hRV14)의 클로닝을 위해서는 바이러스 cDNA의 초기 증폭을 위한 프라이머의 첫 번째 세트만을 변경하는 유사한 전략이 수행될 수 있다. hRV14에 대한 적합한 프라이머는 #988 및 #989이다.
감염성 EV71 및 hRV14 바이러스는 배양한 포유동물 세포, 예컨대 인간 자궁경부 암종 (HeLa) 세포에서 각각 pShuttle/EV71 및 pShuttle/hRV14 플라스미드의 형질감염에 의해 또는 생체내에서의 형질감염에 의해 생성될 것이다. 그들의 약독화 변이체는 유사한 방식으로 생성될 수 있고 생-약독화 백신으로서 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Katholieke Universiteit Leuven Dallmeier, Kai Neyts, Johan <120> BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES <130> KUL2632KR <140> PCT/EP2014/058459 <141> 2014-04-25 <150> GB1307528.8 <151> 2013-04-26 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 283 <212> DNA <213> viral <400> 1 cctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 60 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc 120 agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct 180 aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 240 actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcc 283 <210> 2 <211> 85 <212> DNA <213> viral <400> 2 tggccggcat ggtcccagcc tcctcgctgg cgccggctgg gcaacattcc gaggggaccg 60 tcccctcggt aatggcgaat gggac 85 <210> 3 <211> 10862 <212> DNA <213> viral <400> 3 agtaaatcct gtgtgctaat tgaggtgcat tggtctgcaa atcgagttgc taggcaataa 60 acacatttgg attaatttta atcgttcgtt gagcgattag cagagaactg accagaacat 120 gtctggtcgt aaagctcagg gaaaaaccct 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acattgaggc tgttccctgg 12840 gggtcgttac cttccacgag caaaacacgt agccccttca gagccagatc ctgagcaaga 12900 tgaacagaaa ctgaggtttt gtaaacgcca cctttatggg cagcaacccc gatcaccggt 12960 ggaaatacgt cttcagcacg tcgcaatcgc gtaccaaaca catcacgcat atgattaatt 13020 tgttcaattg tataaccaac acgttgctca acccgtcctc gaatttccat atccgggtgc 13080 ggtagtcgcc ctgctttctc ggcatctctg atagcctgag aagaaacccc aactaaatcc 13140 gctgcttcac ctattctcca gcgccgggtt attttcctcg cttccgggct gtcatcatta 13200 aactgtgcaa tggcgatagc cttcgtcatt tcatgaccag cgtttatgca ctggttaagt 13260 gtttccatga gtttcattct gaacatcctt taatcattgc tttgcgtttt tttattaaat 13320 cttgcaattt actgcaaagc aacaacaaaa tcgcaaagtc atcaaaaaac cgcaaagttg 13380 tttaaaataa gagcaacact acaaaaggag ataagaagag cacatacctc agtcacttat 13440 tatcactagc gctcgccgca gccgtgtaac cgagcatagc gagcgaactg gcgaggaagc 13500 aaagaagaac tgttctgtca gatagctctt acgctcagcg caagaagaaa tatccaccgt 13560 gggaaaaact ccaggtagag gtacacacgc ggatagccaa ttcagagtaa taaactgtga 13620 taatcaaccc tcatcaatga tgacgaacta acccccgata tcaggtcaca tgacgaaggg 13680 aaagagaagg aaatcaactg tgacaaactg ccctcaaatt tggcttcctt aaaaattaca 13740 gttcaaaaag tatgagaaaa tccatgcagg ctgaaggaaa cagcaaaact gtgacaaatt 13800 accctcagta ggtcagaaca aatgtgacga accaccctca aatctgtgac agataaccct 13860 cagactatcc tgtcgtcatg gaagtgatat cgcggaagga aaatacgata tgagtcgtct 13920 ggcggccttt ctttttctca atgtatgaga ggcgcattgg agttctgctg ttgatctcat 13980 taacacagac ctgcaggaag cggcggcgga agtcaggcat acgctggtaa ctttgaggca 14040 gctggtaacg ctctatgatc cagtcgattt tcagagagac gatgcctgag ccatccggct 14100 tacgatactg acacagggat tcgtataaac gcatggcata cggattggtg atttcttttg 14160 tttcactaag ccgaaactgc gtaaaccggt tctgtaaccc gataaagaag ggaatgagat 14220 atgggttgat atgtacactg taaagccctc tggatggact gtgcgcacgt ttgataaacc 14280 aaggaaaaga ttcatagcct ttttcatcgc cggcatcctc ttcagggcga taaaaaacca 14340 cttccttccc cgcgaaactc ttcaatgcct gccgtatatc cttactggct tccgcagagg 14400 tcaatccgaa tatttcagca tatttagcaa catggatctc gcagataccg tcatgttcct 14460 gtagggtgcc atcagatttt ctgatctggt caacgaacag atacagcata cgtttttgat 14520 cccgggagag actatatgcc gcctcagtga ggtcgtttga ctggacgatt cgcgggctat 14580 ttttacgttt cttgtgattg ataaccgctg tttccgccat gacagatcca tgtgaagtgt 14640 gacaagtttt tagattgtca cactaaataa aaaagagtca ataagcaggg ataactttgt 14700 gaaaaaacag cttcttctga gggcaatttg tcacagggtt aagggcaatt tgtcacagac 14760 aggactgtca tttgagggtg atttgtcaca ctgaaagggc aatttgtcac aacaccttct 14820 ctagaaccag catggataaa ggcctacaag gcgctctaaa aaagaagatc taaaaactat 14880 aaaaaaaata attataaaaa tatccccgtg gataagtgga taaccccaag ggaagttttt 14940 tcaggcatcg tgtgtaagca gaatatataa gtgctgttcc ctggtgcttc ctcgctcact 15000 cgaccgggag ggttcgagaa gggggggcac cccccttcgg cgtgcgcggt cacgcgcaca 15060 gggcgcagcc ctggttaaaa acaaggttta taaatattgg tttaaaagca ggttaaaaga 15120 caggttagcg gtggccgaaa aacgggcgga aacccttgca aatgctggat tttctgcctg 15180 tggacagccc ctcaaatgtc aataggtgcg cccctcatct gtcagcactc tgcccctcaa 15240 gtgtcaagga tcgcgcccct catctgtcag tagtcgcgcc cctcaagtgt caataccgca 15300 gggcacttat ccccaggctt gtccacatca tctgtgggaa actcgcgtaa aatcaggcgt 15360 tttcgccgat ttgcgaggct ggccagctcc acgtcgccgg ccgaaatcga gcctgcccct 15420 catctgtcaa cgccgcgccg ggtgagtcgg cccctcaagt gtcaacgtcc gcccctcatc 15480 tgtcagtgag ggccaagttt tccgcgaggt atccacaacg ccggcggccg gccgcggtgt 15540 ctcgcacacg gcttcgacgg cgtttctggc gcgtttgcag ggccatagac ggccgccagc 15600 ccagcggcga gggcaaccag ccgagggctt cgccctgtcg ctcgactgcg gcgagcacta 15660 ctggctgtaa aaggacagac cacatcatgg ttctgtgttc attaggttgt tctgtccatt 15720 gctgacataa tccgctccac ttcaacgtaa caccgcacga agatttctat tgttcctgaa 15780 ggcatattca aatcgttttc gttaccgctt gcaggcatca tgacagaaca ctacttccta 15840 taaacgctac acaggctcct gagattaata atgcggatct ctacgataat gggagatttt 15900 cccgactgtt tcgttcgctt ctcagtggat aacagccagc ttctctgttt aacagacaaa 15960 aacagcatat ccactcagtt ccacatttcc atataaaggc caaggcattt attctcagga 16020 taattgtttc agcatcgcaa ccgcatcaga ctccggcatc gcaaactgca cccggtgccg 16080 ggcagccaca tccagcgcaa aaaccttcgt gtagacttcc gttgaactga tggacttatg 16140 tcccatcagg ctttgcagaa ctttcagcgg tataccggca tacagcatgt gcatcgcata 16200 ggaatggcgg aacgtatgtg gtgtgaccgg aacagagaac gtcacaccgt cagcagcagc 16260 ggcggcaacc gcctccccaa tccaggtcct gaccgttctg tccgtcactt cccagatccg 16320 cgctttctct gtccttcctg tgcgacggtt acgccgctcc atgagcttat cgcgaataaa 16380 tacctgtgac ggaagatcac ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct gttgataccg 16440 ggaagccctg ggccaacttt tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca 16500 actttcacca taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt 16560 caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat 16620 cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata 16680 accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca 16740 agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaatttc 16800 gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg 16860 ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc 16920 ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt 16980 tccctaaagg gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca 17040 ccagttttga tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg 17100 gcaaatatta tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg 17160 ccgtttgtga tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg 17220 agtggcaggg cggggcgtaa tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa acgcctggtt 17280 gctacgcctg aataagtgat aataagcgga tgaatggcag aaattcgatg ataagctgtc 17340 aaacatgaga attggtcgac cctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca 17400 ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt 17460 ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 17520 gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 17580 cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctc 17639 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 8 atccaccggt ccacaaccat ggcctcctcc gaggac 36 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 9 tgatctagag tcgcggccgc tttaggcgcc ggtggagtg 39 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 10 agtggttttg tgtttgtcat cc 22 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 11 ggatgacaaa cacaaaacca ctggccggca tggtcccagc ctcctcgctg g 51 <210> 12 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 12 ggtcccagcc tcctcgctgg cgccggctgg gcaacattcc gagggg 46 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 13 gtcccattcg ccattaccga ggggacggtc ccctcggaat gttgccc 47 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 14 cccgggcggc cgcgcatacg atttaggtga cactatagag taaatcctgt gtgctaattg 60 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 15 atgcatgcgg ccgcgtcgac ggtcgaaaaa agaaaaggag 40 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 16 atgcatgccg gcgaattctg aaccagtcct aaaacgag 38 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 17 cccgggcggc cgctaatacg actcactata gggagttgtt agtctacgtg g 51 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 18 accccgcctc aatcctc 17 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 19 ggtttctggg acctcccacc ccagagt 27 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 20 ctgtaggcac catcaat 17 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 21 gtcgacgcta gcgattgatg gtgcctacag 30 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 22 ggaggctggg accatgccgg ccaggtcacc ggtagctctt gatccggca 49 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 23 tgccggatca agagctaccg gtgacctggc cggcatggtc ccagcctcc 49 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 24 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 25 gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc agtaaatcct gtgtgctaat 60 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 26 gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc agttgttagt ctacgtggac 60 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 27 ccctcggaat gttgcccagc cggcgccagc gaggaggctg ggaccatgcc ggcca 55 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 28 gaggctggga ccatgccggc cagtggtttt gtgtttgtca tcc 43 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 29 gaggctggga ccatgccggc cagaacctgt tgattcaaca gcacc 45 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 30 cgaggaggct gggaccatgc cggccaggtc accgtttaaa cggccgaggc ggcctcggcc 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 31 tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggccg tttaaacggt gacctggccg gcatggtccc 60 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 32 gaggcggcct cggcctctgc a 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 33 tggccggcat ggtcccagcc t 21 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 34 gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc agttgttagt ctgtgtggac 60 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 35 gaggctggga ccatgccggc cagaacctgt tggatcaaca acacc 45 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 36 ttatgcatag tcaggcacgt catatggata ggatcc 36 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 37 tcgactaata cgactcacta tagggggagc gcgaatggaa aaac 44 <210> 38 <211> 47 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 38 cgcgcatacg atttaggtga cactataggt atcaagaact ctcacgg 47 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 39 agtaaatcct gtgtgctaat t 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 40 ggcaatcacg actcgttgcg 20 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 41 agatggtatc ttcatattta gag 23 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 42 acatttgctt tggtccctgt ct 22 <210> 43 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 43 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 60 <210> 44 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 44 gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ttaaaacagc ggatgggt 58 <210> 45 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 45 gaggctggga ccatgccggc cttttttttt tttttttttt tttttttttt tataaactcc 60 <210> 46 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic primer <400> 46 gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ttaaaacagc 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Claims (23)

  1. 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 포함하며, 여기서 BAC는
    - 박테리아 세포당 10카피 초과로 상기 BAC를 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
    - 약독화 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 포유동물 세포에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
    를 포함하는 것인 백신.
  2. 제1항에 있어서, 약독화 RNA 바이러스 게놈의 상기 cDNA가 RNA 바이러스 게놈의 키메라 바이러스 cDNA 구축물이며, 여기서 이종 DNA 서열이 삽입되어 있거나 또는 천연 바이러스 서열이 결실, 말단절단 또는 돌연변이되어 있는 것인 백신.
  3. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 발현 카세트가
    양성-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA,
    상기 cDNA의 전사를 개시하기 위한, 상기 cDNA의 5' 말단에 선행하는 RNA 폴리머라제 구동 프로모터, 및
    세트 위치에서 상기 바이러스 cDNA의 RNA 전사체를 절단하기 위한, 상기 cDNA의 3' 말단 뒤에 오는 RNA 자기-절단을 위한 요소
    를 포함하는 것인 백신.
  4. 제3항에 있어서, 상기 양성-가닥 RNA 바이러스가 플라비바이러스, 헤파시바이러스, 페스티바이러스, 토가바이러스, 피코르나바이러스, 코로나바이러스, 헤페바이러스 및 칼리시바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 발현 카세트가 황열 바이러스의 cDNA를 포함하는 것인 백신.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 발현 카세트가 생-약독화 YFV-17D 황열 바이러스 백신의 cDNA를 포함하는 것인 백신.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 발현 카세트가 음성-가닥 RNA 바이러스, 이중-가닥 RNA 바이러스 또는 암비센스 RNA 바이러스의 군에 속하는 바이러스의 cDNA를 포함하는 것인 백신.
  8. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 인공 염색체가 상기 박테리아 인공 염색체를 효모로 셔틀링시키고 효모에서 유지시키기 위한 효모 자율 복제 서열을 추가로 포함하는 것인 백신.
  9. 제3항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라제 구동 프로모터가 RNA 폴리머라제 II 프로모터인 백신.
  10. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 발현 카세트가 생-약독화 YFV-17D 백신의 cDNA를 포함하며, 여기서 비리온 표면 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 중 1종 이상이 YFV-17D의 상기 비리온 표면 단백질이 발현되지 않도록 결실, 말단절단 또는 돌연변이되어 있고, 이종 단백질을 코딩하는 cDNA 서열이 YFV-17D cDNA에 삽입되어 있는 것인 백신.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이종 단백질이 플라비바이러스의 비리온 표면 단백질인 백신.
  12. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 발현 카세트가 생-약독화 YFV-17D 백신의 cDNA를 포함하며, 여기서 1종 이상의 외래 cDNA 서열이 1종 이상의 이종 단백질로서 발현되도록 삽입되어 있는 것인 백신.
  13. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 발현 카세트가 이종 DNA 서열이 삽입된 바이러스 cDNA를 포함하며, 여기서 이종 DNA 서열이 이종 발현되도록 삽입되어 있는 것인 백신.
  14. BAC를 포함하며, 여기서 BAC는
    - 박테리아 세포당 10카피 초과로 상기 BAC를 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
    - 약독화 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하는 바이러스 발현 카세트, 또는
    - 약독화 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 포유동물 세포에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
    를 포함하는 것인, RNA 바이러스 감염의 예방을 위한 백신.
  15. 제1항 또는 제14항에 있어서, RNA 바이러스 감염의 예방에 사용하기 위한 DNA 백신인 백신.
  16. - 박테리아 세포당 10카피 초과로 BAC를 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
    - 약독화 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 포유동물 세포에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA에서 감염성 바이러스 RNA로의 프로세싱을 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
    를 포함하는 BAC를 박테리아 숙주에서 증식시키는 단계
    를 포함하는, 천연 또는 재조합 RNA 바이러스 게놈의 cDNA의 유지 및 상기 cDNA로부터 천연 또는 재조합 바이러스의 증식을 위한 방법.
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