JP2006526393A - フラビウイルスレプリコンパッケージング系 - Google Patents

Abstract

動物細胞内でのフラビウイルスＲＮＡレプリコンパッケージングおよびウイルス様粒子の産生のために必要なフラビウイルス構造タンパク質の発現を促進するテトラサイクリン調節可能なフラビウイルスパッケージング系が提供される。この調節可能なパッケージング系は、クンジン、デング熱および西ナイル熱ウイルスならびにその他のフラビウイルスレプリコンに基づく発現系と適合性であり、予想外に高力価のウイルス様粒子を産生する。本パッケージング系の特定の適用は、フラビウイルスレプリコンを含み、動物細胞内での発現のために異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡをパッケージングするウイルス様粒子の産生である。いっそうより特別には、本パッケージング系は防御的ＣＤ８ Ｔ細胞媒介性防御免疫応答を誘導する免疫原を送達することができる。

Description

本発明は、フラビウイルス起源のウイルス様粒子の産生に関する。より詳細には、本発明は、動物細胞内でのフラビウイルスＲＮＡパッケージングのために必要なフラビウイルス構造タンパク質の誘導性発現を促進する誘導性フラビウイルスパッケージング系に関する。特定の形状では、本発明はクンジン(Kunjin)と適合性であるテトラサイクリン誘導性パッケージング系および予想外に高力価のウイルス様粒子を産生する他のフラビウイルス発現系を提供する。本パッケージング系の特定の適用は、フラビウイルスレプリコンを含み、動物細胞内での発現のために異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡをパッケージングするウイルス様粒子の産生である。

抗ウイルスワクチンおよび抗癌ワクチンのために、プラス鎖ＲＮＡウイルスのレプリコンに基づくベクターが開発されてきた(Khromykh,2000.Curr Opin Mol Ther.2:555-569において概観されている）。幾つかの特徴のために、これらのベクターは高度に有効かつ安全なワクチンを開発するための望ましい選択対象となっている。これらの特徴には、（ｉ）レプリコンＲＮＡの自己増幅能力に起因するコードされた異種遺伝子（ＨＧ）の高レベルの発現、（ｉｉ）核スプライシングおよび／または染色体統合と関連するあらゆる可能性のある合併症を排除する専ら細胞質での複製、（ｉｉｉ）レプリコンＲＮＡがトランスフェクト（または感染）された細胞から漏れ出ることはあり得ないこと、したがって免疫された被験者におけるワクチンベクターの拡散を制限してこれらのベクターを生物学的に安全にすること、および（ｉｖ）それらのｃＤＮＡの容易な操作および組換え体の産生を可能にする比較的小さなゲノムサイズ（７〜９ｋｂ）、が含まれる。

アルファウイルス、ピコルナウイルス、およびフラビウイルスを含む大多数のプラス鎖ＲＮＡウイルスファミリーの代表的ウイルスに対して、レプリコンに基づく発現ベクターが開発されてきた（上記のKhromykh,2000において概観されている）。

一般に、ＶＬＰ送達は、哺乳動物における防御免疫応答を誘導するという点において最も有効であることが証明されている。

詳細にはクンジン（ＫＵＮ）フラビウイルスＶＬＰを利用する発現系は、国際特許出願第PCT/AU02/01598号に記載されたように、ウイルスタンパク質に対する防御免疫応答を誘導することが証明されている。

しかしＶＬＰ内へのＫＵＮレプリコンＲＮＡのパッケージングは比較的労力を要して時間を消費し、最初はＫＵＮレプリコンＲＮＡを用いる、そして２４〜３６時間遅延後にはＫＵＮ構造遺伝子を発現するＲＮＡであるＳＦＶレプリコンを用いる２回の連続的トランスフェクションを必要とする(Khromykh,et al.,1998.J Virol.72 5967-5977)。さらに、この系を用いて産生するＶＬＰの最高力価は、感染性ＶＬＰが１ｍＬ当たり約２〜５×１０⁶個に過ぎず(Khromykh et al.,1998、上記参照;Varnavski & Khromykh,1999,Virology.255 366-375)、これは大規模ＶＬＰ製造を困難および非効率にさせる。

フラビウイルス構造タンパク質は、ウイルスによる細胞変性(viral cytopathicity)およびウイルス誘導性アポトーシスの主因の一つであると思われる(Nunes Duarte dos Santos et al.,2000.Virology 274,292-308)。全長ＲＮＡ（１、２、４、９〜１１、１３、１４）と比較したフラビウイルスレプリコンの低い細胞変性は、さらにまた構造タンパク質がウイルスによる細胞変性に対して大きく寄与することも示している。ＤＥＮ２およびＪＥウイルス由来のｐｒＭおよびＥカセットを発現する安定な細胞系は生成されているが、天然ｐｒＭ−Ｅ遺伝子を使用した場合の発現レベルは低かった(Hunt et al.,2001,J.Virol.Methods.97 133-149)。比較的多量のｐｒＭ−Ｅ粒子を発現する安定な細胞系を樹立するためには、低い膜融合活性を有する未熟ｐｒＭ−Ｅ粒子を産生するためにｐｒＭタンパク質内のフリン切断部位の不活化(Konishi et al.,J Virol.75 2204-2212)、または抗アポトーシス性ｂｃｌ−２遺伝子の共発現(Konishi & Fujii,2002,Vaccine.20 1058-1067)が必要とされた。これらの安定な細胞系はいずれも、全３種のフラビウイルス構造タンパク質を同時には発現しなかった。

本発明者らが個別プロモーター（ＣおよびｐｒＭ−Ｅを個別に発現する）の制御下で全３種のＫＵＮ構造遺伝子を継続的に発現する安定な細胞系を産生するために実施した以前の試みは、極めて不安定な発現を生じさせ、少数の細胞継代後に陽性に発現する細胞を１０〜２０％しか産生しなかった。ＫＵＮレプリコンＶＬＰを産生するためにこれらの細胞系を使用する試みは、極めて低いＶＬＰ力価しか生じさせなかった。

このため、本発明の目的は、従来のパッケージング系より有効および／または高収率のＶＬＰ産生を達成するフラビウイルスパッケージング系を提供することである。

このため本発明は、調節可能なフラビウイルスパッケージング系、パッケージング構築物および／またはそれを含むパッケージング細胞に広く向けられる。

国際特許公開第WO99/28487号はフラビウイルス構造タンパク質を安定に、および誘導性で発現する細胞系の樹立がＶＬＰを産生するための有用なアプローチであろうと手短に述べているが、本発明者らは、驚くべきことに高収率および高効率のＶＬＰパッケージングを可能にするためにはＣおよびｐｒＭ−Ｅの誘導性発現だけでは不十分であることを見いだした。

調節可能なフラビウイルスパッケージング系の樹立および実際の実施に着手するにあたって、本発明者らは予想外にも、先行技術から予想される量よりはるかに多量のＶＬＰを産生するためには、構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥが、個別のＣおよびｐｒＭ−Ｅタンパク質としてよりむしろ単独の前駆体翻訳産物として発現させられなければならないことを証明した。

本発明の特別な長所は、ＶＬＰ力価が、先行技術パッケージング系を使用して典型的に入手される力価の少なくとも５００倍を超えることである。

本発明のまた別の特別な長所は、調節可能なフラビウイルスパッケージング系が様々なフラビウイルスサブグループのいずれかに由来するパッケージングレプリコンに有用な可能性があることである。

第１態様では、本発明は、動物細胞内でのフラビウイルス構造タンパク質の調節可能な発現のためのパッケージング構築物であって、前記ベクターはＣタンパク質、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を含むフラビウイルス構造タンパク質翻訳産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節可能なプロモーターを含んでいるパッケージング構築物を提供する。

第２態様では、本発明は、第１態様のパッケージング構築物を含むパッケージング細胞を提供する。

第３態様では、本発明は、
（ｉ）動物細胞内でフラビウイルス構造タンパク質を調節可能に発現するためのパッケージング構築物であって、前記ベクターがフラビウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節可能なプロモーターを含むパッケージング構築物と；
（ｉｉ）フラビウイルス発現構築物であって、
（ａ）フラビウイルスレプリコンと；
（ｂ）異種核酸と；
（ｃ）前記レプリコンに作動可能に連結したプロモーターと
を含むフラビウイルス発現構築物と
を含むフラビウイルス発現系を提供する。

好ましくは、上記の態様によると、調節可能なプロモーターはテトラサイクリン誘導性である。

第４態様では、本発明は、本発明のフラビウイルス発現系を含むパッケージング細胞を提供する。

第５態様では、本発明は、フラビウイルスＶＬＰを産生する方法であって、
（ｉ）第１態様のパッケージング構築物を宿主細胞内へ導入し、パッケージング細胞を産生するステップと；
（ｉｉ）前記パッケージング細胞内へ
（ａ）フラビウイルスレプリコンと；
（ｂ）異種核酸と；
（ｃ）前記レプリコンに作動可能に連結したプロモーターと
を含むフラビウイルス発現構築物を導入するステップと；
（ｉｉｉ）前記パッケージング細胞によって１つ以上のＶＬＰの産生を誘導するステップと
を含む方法を提供する。

第６態様では、本発明は、第５態様の方法によって産生したフラビウイルスＶＬＰを提供する。

第７態様では、本発明は第６態様のＶＬＰおよび医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

第８態様では、本発明は、第６態様のＶＬＰに宿主細胞を感染させ、前記タンパク質をコードする前記異種核酸を前記宿主細胞内で発現させるステップを含む組み換えタンパク質を産生する方法を提供する。

適切には、発現したタンパク質は引き続いて精製される。

第９態様では、本発明は、動物を免疫する方法であって、第７態様の医薬組成物を前記動物へ投与し、前記動物において免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。

好ましくは、前記動物は哺乳動物である。

より好ましくは、前記哺乳動物はヒトである。

好ましくは、上記の態様によると、Ｃ、ｐｒＭ、およびＥ構造タンパク質はクンジンウイルス（ＫＵＮ）起源である。

好ましくは、上記の態様によると、フラビウイルスレプリコンは、クンジンウイルス、西ナイル熱ウイルスまたはデング熱ウイルス起源である。

特定の実施形態では、フラビウイルスレプリコンは１つ以上の突然変異非構造タンパク質をコードする。

本明細書を通して、他に特別に明記しない限り、「含む(comprise、comprises)」、および「含んでいる(comprising)」は排他的ではなく包括的に使用しているので、明記した整数または整数群は、１つ以上の他の規定していない整数または整数群を含むことがある。

本発明者らは、安定なパッケージング構築物ならびにＫＵＮレプリコンＶＬＰの単純化された（すなわち、１回のＲＮＡトランスフェクション）誘導性製造を可能にするパッケージング細胞系ｔｅｔＫＵＮ−ＣｐｒＭＥを開発した。本発明の安定なパッケージング細胞系中においては、ＫＵＮ構造遺伝子Ｃ、ｐｒＭおよびＥはテトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーターから発現する（図１）。このパッケージング細胞系の増殖および維持中、毒性ＫＵＮ構造遺伝子産物の産生は培地へのテトラサイクリン（またはドキシサイクリン）の添加によって阻害される。ｔｅｔＫＵＮ−ＣＭＥ細胞内へのＫＵＮレプリコンＲＮＡのトランスフェクション後の培地からのドキシサイクリンの除去は、ＫＵＮ構造遺伝子発現の誘導を生じさせ、その産物は次に複製中のＫＵＮレプリコンＲＮＡを分泌ＶＬＰ内へパッケージングする（図１）。

驚くべきことに、本発明のパッケージング構築物から産生したＫＵＮ構造タンパク質は、１ｍＬ当たり約１０⁹ＶＬＰまでの力価でトランスフェクトされて自己増幅したクンジンレプリコンＲＮＡを分離ＶＬＰ内へパッケージングすることができた。これは、クンジン構造遺伝子の一過性発現のために細胞変性セムリキ森林熱ウイルスレプリコンＲＮＡを使用した以前のパッケージングプロトコルに比べて約１５００倍の改良を表す。分泌ＫＵＮレプリコンＶＬＰは、３×１０⁶個のトランスフェクト細胞から総計約５．４×１０¹⁰ＶＬＰまでを産生するＲＮＡトランスフェクションの８日後までに３〜４回、連続して採取することができよう（表３）。Ｖｅｒｏ細胞上のＶＬＰの継代および２〜４日齢の哺乳期マウスへのＶＬＰの脳内注射は、ＶＬＰ調製物中の感染性クンジンウイルスの存在についての証拠を全く示さなかった。ヒトＲＳ（呼吸器合胞体）ウイルスＭ２遺伝子をコードするＫＵＮレプリコンＶＬＰを用いたマウスの免疫は、格別に強力なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導した。パッケージング細胞はさらにまた、遠縁のフラビウイルスである２型デング熱ウイルスならびに西ナイル熱ウイルスレプリコンからレプリコンＲＮＡをパッケージングすることもできたが、これはこれらの細胞があらゆるフラビウイルスレプリコンＲＮＡをパッケージングできる能力を示唆していた。

Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ前駆体翻訳産物由来のフラビウイルス構造タンパク質からウイルス粒子（またはレプリコンＶＬＰ）を産生するために必要とされる個々のＣ、ｐｒＭ（Ｍ）およびＥタンパク質へのプロセシングは複雑な工程であり、細胞シグナラーゼ、細胞フリンプロテアーゼおよびウイルスにコードされたプロテアーゼＮＳ２Ｂ−ＮＳ３による５回の切断事象を必要とする（図２）。したがって本発明によって使用された連続Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ前駆体翻訳産物は、レプリコンＲＮＡから発現したウイルスプロテアーゼを供給しなければ正確にプロセシングすることができない。これは、レプリコンＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクトしなければＣ−ｐｒＭ−Ｅ発現の誘導後にｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞から分泌Ｅタンパク質（分泌ＶＬＰのインジケーター）が産生されないことを示している図１から明らかである。天然フラビウイルスＣ−ｐｒＭ接合部の切断はウイルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼの両方による切断を必要とし、そしてウイルスプロテアーゼによる切断が発生しなければ、細胞シグナラーゼ切断が進行することはできない(Stocks & Lobigs,1998,J Virol.72 2141-2149)。これは、細胞にとって有害なＥＲストレス反応を引き起こすことがあるＥＲ内での未切断Ｃ−ｐｒＭ産物の蓄積をもたらす。さらに、ｐｒＭがＣから切断されない場合は、ｐｒＭは分泌ウイルス粒子の産生にとって不可欠であるｐｒＭ−Ｅヘテロダイマーの形成に参加することはできない。ウイルスプロテアーゼを用いずに細胞シグナラーゼによるＣからのｐｒＭの効率的切断を可能にするＣおよびｐｒＭ間の疎水性配列における突然変異は設計できるが、それらはウイルス粒子の産生を無効にすると思われ(Lee et al.,2000,J Virol.74 24-32)、これは分泌ウイルス粒子の産生のために細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼによるＣ−ｐｒＭ接合部の協調したプロセシングが重要な役割を果たすことを示唆している。そこで本発明において使用したウイルスプロテアーゼをコードするレプリコンＲＮＡのトランスフェクションと結び付けたＣ−ｐｒＭ−Ｅ前記翻訳産物をコードするヌクレオチド配列の発現はＫＵＮ構造タンパク質の適正なプロセシングおよび高力価の分泌レプリコンＶＬＰの産生にとって好都合な条件を提供したと思われる。

より詳細には、本発明の誘導性発現系は、細胞培養培地へのテトラサイクリンの添加によって潜在的に毒性のＣ−ｐｒＭ−Ｅ前駆体翻訳産物の発現の「スイッチを切る」能力を提供する。これはＣ−ｐｒＭ−Ｅ発現を低下させずにｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ安定性パッケージング細胞系の選択および維持を可能にし、したがって高力価のレプリコンＶＬＰの高レベルかつ誘導性の産生を可能にする。

このため本発明はフラビウイルスレプリコンパッケージングへの以下の広範な適用を有する可能性があることは理解されるであろう：
（ｉ）あらゆるフラビウイルスレプリコンをパッケージングする能力；および／または
（ｉｉ）フラビウイルスレプリコンパッケージングのために必要かつ十分であるいずれかのフラビウイルス構造タンパク質を発現する能力。

本明細書で使用する「フラビウイルス(flavivirus)」および「フラビウイルスの(flaviviral)」は、６５種以上の関連ウイルス種を含有するフラビウイルス科内のフラビウイルス属のメンバーに関連する。典型的には、フラビウイルスは、単一糖タンパク質Ｅを含むペプロマーを備える小さなエンベロープＲＮＡウイルス（直径：約４５ｎｍ）である。他の構造タンパク質はＣ（コア）およびＭ（膜様）と呼ばれている。一本鎖ＲＮＡは感染性であり、典型的には約４×１０⁶の分子量を有しており、５’末端ではｍ７Ｇ‘ｃａｐ’を備えるが３’末端ではポリ（Ａ）区域を有していない；したがって単独メッセンジャーとして機能する。フラビウイルスは広範囲の脊椎動物に感染し、そして多数はダニや蚊などの節足動物によって伝播するが、別のフラビウイルス群はＮＫＶ（no-known-vector（公知の媒介動物を持たない））と呼ばれている。

フラビウイルスの特定の非限定的例は、西ナイル熱ウイルス、クンジンウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、マリーバレー(Murray Valley)脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、モンタナコウモリ(Montana Myotis)白質脳炎ウイルス、ウスツ(Usutu)ウイルス、およびアルクフルマ(Alkhurma)ウイルスである。

本明細書で使用する用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドならびにｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡを表している。

好ましい形態では、本発明のパッケージング構築物は二本鎖プラスミドＤＮＡパッケージング構築物である。

「タンパク質」はアミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当分野において周知のように、天然（すなわち、遺伝的にコードされた）、非天然、Ｄ−およびＬ−アミノ酸を含んでいてよい。

「ペプチド」は、５０個未満のアミノ酸を有するタンパク質である。

「ポリペプチド」は、５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。

本発明によると、「パッケージング構築物」は１つ以上のフラビウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節可能なプロモーターを含んでいる。

適切には、パッケージング構築物は構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。

本発明者らは、「前駆体」または「プレタンパク質」としてのＣ、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質をコードする連続アミノ酸配列の誘導性発現がＶＬＰを産生するために群を抜いて有効な系であることを見いだした。これは、ＣおよびｐｒＭ−Ｅタンパク質が個別ヌクレオチド配列によって各々コードされる典型的な従来のアプローチとは対照的である。

これに関連して、本発明によると、構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥは、ＶＬＰ産生のために必要とされる個々のＣ、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質を産生するために引き続いてタンパク質分解プロセシングを受けることのできる単一の前駆体翻訳産物として動物細胞内で発現することができる。

前駆体翻訳産物のプロセシングについて記載している提案されたモデルは図２に要約した。

プロセシングは通常は細胞プロテアーゼおよびレプリコンにコードされたプロテアーゼの両方の存在に依存するが、構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥの１つ以上の中にまた別のプロテアーゼ切断部位を組み込み、動物宿主動物細胞において適切なプロテアーゼと共に発現することで、通常起こるプロセシング系とは別のプロセシング系を提供できることも企図されている。

そのような系は、Ｃ、ｐｒＭおよびＥ翻訳産物のプロセシングにおいて、フラビウイルスレプリコンにコードされたプロテアーゼの必要を撤回することができよう。

好ましい実施形態では、構造タンパク質はＫＵＮ構造タンパク質Ｃ，ｐｒＭおよびＥである。

しかし、いずれか他のフラビウイルス由来の構造タンパク質を使用することもできる。１種のフラビウイルス中の構造タンパク質と、他のフラビウイルスの構造タンパク質との置換がキメラフラビウイルスの回収を許容することは、明確に確証されており(Monath et al.,2000,J.Virol.74 1742;Guirakhoo et al.,2000,J.Virol.74 5477;Pletnev et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 10532)、１種のフラビウイルス由来の構造タンパク質が他のフラビウイルス由来のＲＮＡをパッケージングすることができることを示している。近年、（ｉ）黄熱病レプリコンは黄熱病ｐｒＭＥおよび西ナイル熱またはデング熱ウイルスコアタンパク質を供することによってパッケージングできること、（ｉｉ）西ナイル熱レプリコンはウイルスを供することによってパッケージングできることが証明されている。

構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥは、Ｃ、ｐｒＭおよびＥ翻訳産物のプロセシングおよび／またはウイルスパッケージングを妨害しない、または感知できるほど減少させないこれらのタンパク質の１つ以上においていずれかの突然変異または他の配列変化を含み、包含していることもまた理解されるであろう。

これに関連して、また別のプロテアーゼ切断部位を構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥの１つ以上の中に組み込むことができるという上記の可能性を参照されたい。さらに、ウイルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼによって認識される切断部位のすぐ上流または下流の配列は切断効率を増強するために修飾することができ(Stocks & Lobigs et al.,1998,J Virol,72 2141-2149)、これによりＶＬＰの改良された切断および／または分泌をもたらすことができる。

典型的には、突然変異および／または変異体構造タンパク質は、Ｃ、ｐｒＭまたはＥタンパク質アミノ酸配列各々と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、または有益には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有してよいことが企図されている。

したがって、突然変異および／または変異体構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｃ、ｐｒＭまたはＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、または有益には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有してよいことは理解されるであろう。

本明細書で使用する「配列同一性率」は、参照配列とのアミノ酸またはヌクレオチドとの正確なマッチ数をオーバーラップ領域内の残基数で割ることによって決定したパーセンテージである。オーバーラップの最小領域は、典型的には少なくとも６、１２または２０連続残基である。アミノ酸配列同一性は、non-gapped BLASTおよびGapped Blast 2.0を含めてwww.ncbi.nlm.nih.govから入手できるNCBI BLAST検索方法を含む標準方法によって決定できる。しかし、米国特許第5,691,179号およびAltschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25 3389-3402に記載された配列解析方法もまた企図されている。

本発明のパッケージング構築物の１つの特徴は、フラビウイルス構造タンパク質翻訳産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節可能なプロモーターの存在である。

「調節可能なプロモーター」は動物細胞内で操作可能なあらゆるプロモーターであって、プロモーター活性は１つ以上の調節因子に反応して制御することができるものを意味する。調節因子は、物理的（例、温度）であっても、あるいは化学的（例、ステロイドホルモン、重金属、抗生物質）であってもよい。

そのようなプロモーターの例には、熱ショック誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性／抑制性プロモーター、メタロチオニン誘導性プロモーターおよび細菌ｌａｃオペロンを通して誘導性である哺乳動物機能的オペレーター（例、ｌａｃ−調節型ＣＭＶまたはＲＳＶプロモーター）が含まれる。

好ましい調節可能なプロモーターは、ドキシサイクリンの存在下では抑制され、ドキシサイクリンの除去によって誘導される「tet off」プロモーターである。

この実施形態の特に好ましい形態によると、調節可能なプロモーターは、別個の構築物によってコードされる、テトラサイクリン転写活性化因子（ｔＴＡ）に対する応答性を促進するテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）に連結されたＣＭＶプロモーターを含んでいる。

本発明のパッケージング構築物は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、３’ポリアデニル化および転写ターミネーター配列（例、β−グロビンまたはＳＶ４０由来）などの他の調節配列ならびに安定な形質転換体の選択を促進するための選択可能なマーカー遺伝子（例、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子）を含んでいる。

特に好ましい形態では、本発明のパッケージング構築物は安定な形質転換体の選択を促進するためにＩＲＥＳ−ネオマイシンヌクレオチド配列を含んでいる。

この実施形態の好ましい形態では、パッケージング構築物はβ−グロビンポリアデニル化シグナルをさらに含んでいる。

本発明によると、安定なパッケージング細胞系は典型的には、
（ｉ）テトラサイクリン（ドキシサイクリン）転写活性化因子を発現する安定な細胞系を樹立するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において産生した安定な細胞系を使用し、ドキシサイクリンの除去後にＫＵＮ構造遺伝子を誘導性発現することのできるパッケージング細胞を産生するステップと
の２段階で作製する。

特定の実施形態では、ステップ（ｉ）での安定な細胞系は、ヒト鎖延長因子αプロモーターに作動可能に連結したテトラサイクリン転写活性化因子ヌクレオチド配列を含んでいるテトラサイクリン転写活性化因子構築物を前記細胞内へトランスフェクトするステップによって産生される。

しかしこれに関連して、ＲＳＶ、ＳＶ４０、アルファクリスタリン、アデノウイルスおよびＣＭＶプロモーターなどを含むがそれに限定されない他のプロモーターが有用であることは理解されるであろう。

「作動可能に連結した」または「作動可能に結合した」は、前記調節可能なプロモーターが、前記フラビウイルス構造タンパク質をコードするＲＮＡの細胞内転写を開始および調節可能に制御するように配置されていることを意味している。

好ましくは、テトラサイクリン転写活性化因子構築物は、安定な形質転換体の選択を促進するＩＲＥＳ−ピューロマイシン選択マーカー配列をさらに含んでいる。

ステップ（ｉｉ）では、上述した本発明のパッケージング構築物は、その後テトラサイクリン転写活性化因子を発現する安定な細胞系内にトランスフェクトされる。

ＶＬＰパッケージングのための適切な宿主細胞は、タンパク質発現のために必要とされる転写、翻訳およびいずれかの転写後および／または翻訳後のプロセシングまたは修飾を実行するためにコンピテントであるいずれかの真核、動物または哺乳動物細胞系であってよい。核酸トランスフェクションおよびタンパク質発現のために典型的に使用される哺乳動物の例には、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＣＶ−１、ＢＨＫ２１、２９３、ＨＥＫ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、ＷＥＨＩ ２３１、ＨｅＬａ ＭＲＣ−５、およびＢ１６黒色腫細胞が含まれるが、それらに限定されない。

好ましくは、宿主細胞はＢＨＫ２１である。

本発明によって産生されたパッケージング細胞は、１つ以上のタンパク質をコードするフラビウイルスレプリコンＲＮＡのその後のパッケージングのために使用できることは理解されるであろう。

本発明によって企図されるフラビウイルスレプリコンには、例えば国際特許公開第WO99/28487号および国際特許公開第WO02/01598号に記載されたようなフラビウイルスＲＮＡ由来のいずれか１つ以上の自己複製成分が含まれる。限定されるものではないが、これらには、ＤＮＡに基づくレプリコン構築体（レプリコンｃＤＮＡがＣＭＶなどの哺乳動物発現プロモーターの制御下に置かれ、プラスミドＤＮＡの形態で送達される）、およびＲＮＡに基づくレプリコン構築体（レプリコンｃＤＮＡがＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３などのバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター（対応するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用してレプリコンＲＮＡのインビトロ産生を可能にする）の制御下に置かれ、裸のＲＮＡまたはＶＬＰ内へパッケージングされたＲＮＡとして前記レプリコンＲＮＡが送達される）が含まれる。

本発明の好ましいフラビウイルスレプリコンはクンジンウイルスに由来するが、当業者であれば本発明のパッケージング系があらゆるフラビウイルスレプリコンをパッケージングするために使用できることを理解するであろう。

比較的明確に特徴付けられたフラビウイルスレプリコンの例には、系統１(Shi et al.,Virology,2002,296 219-233)および系統ＩＩ(Yamshchikov et al.,2001,Virology,281 294-304)の西ナイル熱ウイルス株、２型デング熱ウイルス(Pang et al.,2001,BMC Microbiology,1 18)、および黄熱病ウイルス(Molenkamp et al.,2003,J.Virol.,77 1644-1648)由来のレプリコンが含まれる。

１つの特定の実施形態では、前記フラビウイルスレプリコンはＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂおよび／またはＮＳ５を含む１つ以上の突然変異構造タンパク質をコードすることができる。

１つの特定の実施形態では、ＮＳ１タンパク質内のロイシン残基２５０がプロリンによって置換されている。

また別の特定の実施形態では、アラニン３０が非構造タンパク質ＮＳ２Ａ内のプロリンによって置換されている。

さらにまた別の特定の実施形態では、アスパラギン１０１が非構造タンパク質ＮＳ２Ａ内のアスパラギン酸塩によって置換されている。

さらにまた別の特定の実施形態では、プロリン２７０が非構造タンパク質ＮＳ５内のセリンによって置換されている。

それによって細胞適応的突然変異をレプリコン内に導入するために上述したものとは別のアミノ酸を使用できることは理解されるであろう。

本発明によると、「フラビウイルス発現ベクター」は、１つ以上の他の調節ヌクレオチド配列とともにフラビウイルスレプリコンを含んでいる。そのような調節配列には、プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、１つ以上の異種核酸を挿入するための１つ以上の制限酵素部位、ポリアデニル化配列ならびに転写の停止および３’末端の正確な切断を保証する肝炎デルタウイルスリボザイム（ＨＤＶｒ）のアンチゲノム配列などの他の配列が含まれるが、それらに限定されない。

特に好ましい形態では、フラビウイルス発現ベクターは、パッケージング細胞内でＣ、ｐｒＭおよびＥをコードする作動可能に連結したヌクレオチド配列の発現を促進するＣＭＶプロモーターを含んでいる。しかしこれに関連して、ＲＳＶ、ＳＶ４０、アルファクリスタリン、アデノウイルスおよびヒト鎖延長因子プロモーターなどを含むがそれらに限定されない他のプロモーターが有用であることは理解されるであろう。

したがって、「フラビウイルス発現構築物」は、ＲＮＡの形態で、および／またはコードされたタンパク質として発現可能であるようにその中に異種核酸が挿入されている発現ベクターである。

前記異種核酸は、１つ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる、または標的配列と実質的に同一または実質的に相補的であるヌクレオチド配列をコードすることができる。

異種核酸は、動物細胞内で発現できるあらゆるタンパク質をコードすることができる。

これを念頭に置くと、フラビウイルスレプリコンは、例えば国際特許公開第WO99/28487号に記載されているように、典型的には１つ以上のクローニング部位を導入することによって、前記異種核酸を含むことができるように修飾、適合またはさもなければ組み換えることができる。

テトラサイクリン転写活性化因子構築物、パッケージング構築物またはフラビウイルス発現構築物の動物宿主細胞内への導入は、動物細胞へ適用できるいずれかの方法によって行なわれてよい。そのような方法には、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、リポフェクタミン、リポフェクチンおよび他の親油性物質による送達、リン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、微粒子衝突(microparticle bombardment)法、マイクロインジェクション法およびプロトプラスト融合法が含まれる。

上記から、本発明のパッケージング系が動物細胞中、好ましくは哺乳動物細胞中のタンパク質の発現のために使用できることは理解されるであろう。

これは、動物細胞によって提供される翻訳後プロセシングおよび／または修飾を必要とするあらゆる真核細胞タンパク質の発現を促進することができる。そのようなタンパク質の非限定的例には、ホルモン、成長因子、転写因子、酵素、組み換え免疫グロブリンまたはそのフラグメント、抗原、免疫原などが含まれる。

特定の実施形態では、本発明によって産生したＶＬＰは適切な動物細胞に感染させ、それによって細胞中におけるコードされたタンパク質の発現を促進するために使用できる。その後に適切なタンパク質精製技術を使用すると発現したタンパク質を単離および精製することができる。

そのような系は、ＣＨＯ細胞などの、レプリコンでコードされた異種タンパク質を高レベルで発現することができる動物細胞を利用することができるが、それらに限定されない。

特定の実施形態では、異種核酸は、ウイルス、真菌、細菌、原生動物などの病原微生物、寄生虫などの無脊椎動物および節足動物に由来する、もしくはそれらから入手できる免疫原性タンパク質もしくはペプチドをコードできる、または、動物およびヒトを含む動物に由来する、もしくはそれらから入手できる腫瘍抗原などの突然変異した発癌性もしくは腫瘍タンパク質をコードすることができる。異種核酸は、例えば免疫を誘導するために構築された免疫原性エピトープなどの合成または人工タンパク質もコードすることができる。

本発明の免疫治療用組成物は、ヒトなどの動物を予防的または治療的に免疫するために使用できる。

本発明のＶＬＰによってコードされた免疫原性タンパク質またはペプチドエピトープを適切に発現させることによって、ウイルス、腫瘍、細菌、原生動物および他の無脊椎動物寄生虫に対して免疫応答を誘発または誘導することができる。

好ましくは、免疫応答はＣＴＬの誘導を含んでいる。

本発明によると、本発明によって産生したＶＬＰは、許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含む免疫治療用組成物またはワクチン組成物の調製において使用できる。

「医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤」は、全身性投与において安全に使用できる固形または液状の充填剤、希釈剤もしくはカプセル化剤を意味する。特定の投与経路に依存して、当分野において周知の様々な担体を使用できる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩液、ならびに塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む鉱物酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸および発熱物質無含有水を含む群から選択できる。

医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤について記載している有用な参考文献は、参照して本明細書に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.、米国ニュージャージー州、1991)である。

本発明の組成物を患者に提供するためにはあらゆる安全な投与経路を使用できる。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、経口腔、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを使用できる。

当分野において理解されるように、「アジュバント」はワクチン組成物の免疫原性および／または有効性を増強する１つ以上の物質を意味する。適切なアジュバントの非限定的例には、スクアランおよびスクアレン（または他の動物起源の油）；ブロックコポリマー；Tween(登録商標)80などの界面活性剤；Quil(登録商標)A、DrakeolもしくはMarcolなどの鉱油、ピーナッツ油などの植物油；コリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)などのコリネバクテリウム由来アジュバント；プロピオンバクテリウム・アクネ(Propionibacterium acne)などのプロピオンバクテリウム由来アジュバント；マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)(Bacille Calmette and GuerinまたはBCG)；インターロイキン２およびインターロイキン１２などのインターロイキン類；インターロイキン１などのモノカイン類；腫瘍壊死因子；γインターフェロンなどのインターフェロン類；サポニン−水酸化アルミニウムまたはＱｕｉｌ−Ａ−水酸化アルミニウムなどの組み合わせ；リポソーム；ＩＳＣＯＭ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ムラミルジペプチドなどの合成グリコペプチドもしくは他の誘導体；Avridine；リピド(Lipid)Ａ誘導体；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥ−デキストランもしくはリン酸アルミニウム含有；Carbopol' EMAなどのカルボキシポリメチレン；Neocryl A640などのアクリルコポリマーエマルジョン（例、米国特許第5,047,238号）；ワクシニアもしくは動物ポックスウイルスタンパク質；コレラ毒素などのサブウイルス粒子アジュバント、またはそれらの混合物が含まれる。

本発明による免疫治療用組成物を含む医薬組成物および免疫方法は、動物およびヒトを含むがそれらに限定されないあらゆる動物に投与できる。

したがって、獣医学的および医学的治療が企図されており、それらの治療は治療される疾患または病気に依存して治療的および／または予防的に投与できる。

本発明を容易に理解して実際的に実行できるように、以下の非限定的例を参照として挙げる。

［材料および方法］
〔プラスミド〕
ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐの誘導体(Hobbs et al.,1998 Biochem Biophys Res Commun 252,368-72)であり、テトラサイクリン転写活性化因子をコードする配列（図１Ａ）を含有するプラスミドｐＥＦ−ｔＴＡ−ＩＲＥＳｐｕｒｏは、Queensland大学のRick Sturm氏から贈呈された。テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＫＵＮ ＣｐｒＭＥ遺伝子カセットをコードするプラスミドｐＴＲＥ２ＣｐｒＭＥ−ＩＲＥＳＮｅｏ（図１Ａ）を下記のとおりに構築した。ＥＭＣＶ内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）についての配列およびネオマイシン遺伝子は、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩを用いてｐＣＩＮ１の誘導体であるｐＢＳ−ＣＩＮ４ＩＮ(Rees et al.,1996,BioTechniques 20 102-110)から切り取った。次にＩＲＥＳＮｅｏカセットをｐＴＲＥ２ベクター(Clontech社)の対応するＭｌｕＩ／ＸｂａＩ部位内へ挿入して中間体ｐＴＲＥ２ＩＲＥＳＮｅｏプラスミドを産生した。クンジン（ＫＵＮ）ＣｐｒＭＥ遺伝子カセットをコードする配列は、５’および３’末端でＢｇｌＩＩ制限酵素部位を備えるフラグメントを産生するために、プライマーＣｐｒＭＥＦｏｒ 5'ATTTAGGTGACACTATAGAGTAGTTCGCCTGTGTGA3'およびＣｐｒＭＥＲｅｖ 5'GAGGAGATCTAAGCATGCACGTTCACGGAGAGA3'を用いて、ＦＬＳＤＸプラスミドＤＮＡテンプレート(Khromykh et al.,1998,J.Virol.72 5967)から高忠実度Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ(Promega社)によってＰＣＲ増幅させた。このフラグメントの５’末端でのＢｇｌＩＩ部位がフォーワードプライマーの１００ヌクレオチド下流および天然ＫＵＮ翻訳開始コドンのすぐ上流に位置することに留意されたい。ＫＵＮ ＣｐｒＭＥ配列を含有するＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントをＩＲＥＳＮｅｏ配列の上流に位置するｐＴＲＥ２ＩＲＥＳＮｅｏベクターのＢａｍＨＩ部位内に挿入して、ｐＴＲＥ２ＣｐｒＭＥ−ＩＲＥＳＮｅｏプラスミドを産生した（図１Ａ）。

様々なレプリコンＲＮＡのインビトロ転写のために使用された様々な異種遺伝子をコードするＲＮＡに基づくＫＵＮレプリコンベクターおよび他のＫＵＮレプリコン構築物については以前に報告されている(Khromykh & Westaway,1997,J.Virol.71 1497;Anraku et al.,2002,J.Virol.76 3791;Liu,2002 #1264;Varnavski & Khromykh,1999,Virology 255 366;Varnavski et al.,2000,J.Virol.74 4394)。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＭ２遺伝子をコードするＫＵＮレプリコンは、適切なプライマーを使用してＲＳＶ感染細胞由来のＲＮＡの逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲ増幅によって調製したＲＳＶ Ｍ２ ｃＤＮＡ配列を含有するＤＮＡフラグメントをＲＮＡｌｅｕベクター(Anraku et al.,2002、上記参照)内へクローニングすることによって構築した。

２型デング熱ウイルス（ＤＥＮ２）レプリコン構築物ｐＤＥＮΔＣｐｒＭＥおよびｐＤＥＮΔｐｒＭＥは、構造遺伝子内で大きなインフレーム欠失を作製することによってＤＥＮ−２の ニューギニア(New Guinea)Ｃ系統のゲノムに対応する全長ｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドｐＤＶＷＳ６０１に由来する。ｐＤＥＮΔＣｐｒＭＥはＣ遺伝子の最初の８１ヌクレオチドおよびＥ遺伝子の最後の７２ヌクレオチドを保持していたが、他方ｐＤＥＮΔｐｒＭＥはｐｒＭ遺伝子の最初の２１ヌクレオチドおよびＥ遺伝子の最後の７２ヌクレオチドを保持していた。

〔細胞系、ウイルスおよび抗体〕
ＢＨＫ２１およびＶｅｒｏ細胞系は、５％のＣＯ₂を含む３７℃の大気中で１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補給したダルベッコ改質イーグル培地(Life Technologies社)中で培養した。野生型（ｗｔ）ＫＵＮウイルス、ＭＲＭ６１Ｃ系統は、以前に記載されたように(Westaway et al.,1997,J.Virol.71 6650)Ｖｅｒｏ細胞内で増殖させた。ウサギにおいて立てた抗ＫＵＮ ＮＳ３ポリクローナル抗体は以前に記載されたとおりであった(Westaway et al.,1997、上記参照)。抗ＫＵＮエンベロープ３．９１Ｄモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はマウスにおいて立てた(Adams et al.,1995,Virology 206 49)。

〔ＤＮＡトランスフェクション〕
ＢＨＫ２１細胞は、製造業者によって記載されたように、リポフェクタミンプラス試薬(Life Technologies社)を用いて２μｇのプラスミドＤＮＡとのトランスフェクションの前に６０ｍｍ径培養皿内で２４時間培養した。

〔ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生およびそれらの力価の決定〕
ＫＵＮレプリコンＲＮＡは、本質的には以前に記載されたようにＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写させ、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内へエレクトロポレーションした(Khromykh & Westaway,1997、上記参照)。慣例的に、約３０μｇのＲＮＡを３×１０⁶ｃｅｌｌｓ内へエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を次に１００ｍｍ径の培養皿の中に播種し、３７℃で８日間まで様々な量の培地中でインキュベートした。培養液（ＣＦ）は、通常はこの期間中の３〜５回の時点に採取し、ＶＬＰの複数回の採取を可能にするために、同一量の新鮮培地と交換した。感染性ＶＬＰの力価は、採取したＣＦの１０倍連続希釈液を用いてＶｅｒｏ細胞を感染させ、そして感染３０〜４０時間後に実施した抗ＮＳ３抗体を用いたＩＦ（間接免疫蛍光）分析においてＮＳ３発現に対して陽性の細胞数を計数することによって決定した。

〔免疫蛍光〕
培養細胞のカバーガラスはレプリコンＲＮＡを用いたトランスフェクションまたはＶＬＰを用いた感染の２４〜４８時間後に４％パラホルムアルデヒド中で固定し、各々抗ＮＳ３または抗Ｅ抗体を用いる間接免疫蛍光（ＩＦ）法によってＫＵＮ ＮＳ３またはＥタンパク質の発現についてアッセイした。

〔ノーザンブロット分析〕
全ＲＮＡは、ドキシサイクリンを含めて、および含めずに培養したｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞から、そしてＴｒｉｚｏｌ試薬(Life Technologies社)を用いて正常ＢＨＫ２１細胞から抽出した。２０μｇのＲＮＡは１％ホルムアミド−ＴＡＥアガロースゲル上で分離し、次に２０×ＳＳＣを用いるキャピラリーブロッティングによってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ(Amersham-Pharmacia Biotech社)へ移した。標識プローブを調製するためのテンプレートとして、ｐＴＲＥ２ＩＮｅｏＣｐｒＭＥから単離したＡｆｌＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントを使用した。この³²Ｐ標識プローブは、製造業者によって記載されたとおりにRediprime IIキット(Amersham-Pharmacia Biotech社)を用いて調製した。ＲＮＡは、本質的には製造業者によって記載されたとおりに、６８℃でＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液(Clontech社)を使用して³²Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズさせた。バンドはＸ線フィルムへの曝露、または燐光イメージングによって可視化し、ImageQuantソフトウエア(Molecular Dynamics社)を用いて定量した。

〔ウエスタンブロット分析〕
ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞は、製造業者によって記載されたとおりに、ドキシサイクリンを含めて、または含めずに６０ｍｍ径培養皿内で２日間にわたり培養し、そしてＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて細胞タンパク質を抽出した。ＢＨＫ２１細胞タンパク質も陰性コントロールとして使用するために回収した。各サンプルについてのタンパク質濃度は、製造業者によって記載されたとおりにＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ(BioRad社)を用いて決定した。５μｇの全タンパク質を１２．５％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次にＨｙｂｏｎｄ Ｐ膜(Amersham-Pharmacia Biotech社、英国)上に移した。この膜を４℃のブロッキングバッファー（リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中の５％脱脂粉乳／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で一晩インキュベートした。ＫＵＮ抗Ｅ ＭＡｂをブロッキングバッファー中で１：１０に希釈し、室温で２時間にわたり膜と一緒にインキュベートした。５分間にわたり０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳを用いてこの膜を３回洗浄し、次に二次抗体を添加した。ヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼである二次抗体はブロッキングバッファー中で１：２０００に希釈し、室温で２時間にわたり膜と一緒にインキュベートした。この膜を再び０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳを用いて洗浄し、ＥＣＬ ＋Ｐｌｕｓキット(Amersham-Pharmacia Biotech社)を用いて展開させた。この膜を次に様々な時間間隔にわたりＸ線フィルムに曝露させた。

〔ＲＴ−ＰＣＲおよびシーケンシング〕
全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌを用いてｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞の６０ｍｍ径培養皿から抽出した。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット(Invitrogen社)を用いて、０．１μｇのＲＮＡを逆転写させ、そして増幅させた。ＫＵＮ ｃｐｒＭＥ領域に対して使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、フォーワードプライマー、ＣｏｒｅＸｂａＩ 5'GGCTCTAGACCATGTCTAAGAAACCAGGA3'およびリバースプライマー、ｃｐｒＭＥＲｅｖ 5'GAGGAGATCTAAGCATGCCGTTCACGGAGAGA3’であった。次にｃＤＮＡ産物は、この領域の全配列をカバーするために６種のプライマーを使用して、ＢｉｇＤｙｅターミネーターミックス(Applied Biosystem社)を用いてシーケンシングするためのテンプレートとして使用した。

〔ＫＵＮ ＶＬＰおよびＩＬ−２併用腫瘍療法〕
４群の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６−８週齢、１群当たりｎ＝３）の背部上でマウス１匹当たり４つの腫瘍（１群当たりｎ＝１２の腫瘍）を接種するために、５×１０⁴ＬＬＯｖａ腫瘍細胞を皮下注射した(Nelson et al.,J Immunol.2001,166 5557-66)。腫瘍が触知可能（＞１×１ｍｍ²）になったら、２群のマウスに１０⁸ｐｆｕ（２００□Ｌで）ＫＵＮ ＶＬＰＭｐｔを注射し、別の２つのコントロール群にはＰＢＳを注射したが、どちらも腹腔内経路によって１０日間をあけて２回実施した。ＶＬＰＭｐｔからの１群およびコントロール群は、最初のＶＬＰＭｐｔまたはＰＢＳ注射の４日後に、２日間をあけて腹腔内経路によって２０００ＩＵのマウスＩＬ−２の２回の投与を受けた。残りの２群はＩＬ−２の投与を受けなかった。腫瘍のサイズは毎日記録し、腫瘍のサイズが１５×１５ｍｍ²に達したときにマウスを安楽死させた(Anraku et al.,2002、上記参照)。

〔ＫＵＮ ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥレプリコンパッケージング細胞系（Ａ８細胞系）におけるＫＵＮレプリコンウイルス様粒子（ＶＬＰ）の増幅および拡散能力についての評価〕
（細胞）
参照して本明細書に組み込まれる正常ＢＨＫ２１細胞およびＫＵＮ ｔｅｔＫＵＮｃＰｒＭＥ ＫＵＮレプリコンパッケージング細胞（Ａ８細胞系）(Harvey et al.,J Virol.200478 531-8)は、３７℃のＣＯ₂インキュベーター内で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen社、カリフォルニア州サンディエゴ）内で増殖させた。

（ＫＵＮレプリコンＶＬＰ）
ＫＵＮｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌレプリコンＶＬＰの調製法は、(Harvey et al.,J Virol.2004、上記参照)に記載されている。手短には、遺伝子発現を容易に比較するためのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子および選択のためのピューロマイシン遺伝子をコードするインビトロ転写ＫＵＮｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌ ＲＮＡを用いて、Ａ８細胞をエレクトロポレーションした。ＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点で細胞培養液を採取し、採取液中にエンカプシデーションされたレプリコンＫＵＮｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌ ＲＮＡを含むＶＬＰの力価は、Ｖｅｒｏ細胞を感染させ、それらを感染４８時間後にＸ−Ｇａｌを用いて染色することによるβ−ｇａｌ陽性細胞数によって計算した。

（ＫＵＮｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌレプリコンＶＬＰ感染、Ｘ−Ｇａｌ染色およびβ−ｇａｌアッセイ）
９０％コンフルエントな状態にある２４ウエルプレート内のＢＨＫ２１およびＫＵＮ ＫＵＮレプリコンパッケージングＡ８細胞は、感染多重度（ＭＯＩ）１でｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌ ＶＬＰを用いて感染させ、ドキシサイクリンを含まない培地中でインキュベートした。感染の４８、９６および１４４時間後に、４％ホルムアルデヒド−リン酸緩衝生理食塩液を用いて細胞を固定し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトプロピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を用いてインサイチュー染色し、または細胞をトリプシン化し、計数し、製造業者（Promega社、ウィスコンシン州マディソン）の取扱説明書にしたがって市販のβ−ｇａｌ検出キットを使用することによってβ−Ｇａｌアッセイのために溶解させた。

［結果］
〔ＫＵＮレプリコンＲＮＡをＶＬＰ内へパッケージングすることのできるテトラサイクリン誘導性ＢＨＫ細胞系であるｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥの樹立〕
我々の知る限り、全３種のフラビウイルス構造タンパク質を同時に発現する安定な細胞系はこれまでに報告されていなかった。我々は、以前にＫＵＮ Ｃタンパク質を安定に発現するＶｅｒｏ細胞系を生成したが、その発現レベルは低かった(Westaway et al.,1997.Virology.234 31-41)。我々が個別プロモーター（ＣおよびｐｒＭ−Ｅを個別に発現する）の制御下で全３種のＫＵＮ構造遺伝子を継続的に発現する安定な細胞系を生成するために実施した、標準（非誘導性）ＤＮＡ発現ベクターを用いる以前の試みは、極めて不安定な発現を生じさせ、２、３回の細胞継代後に陽性に発現する細胞を１０〜２０％しか産生しなかった（データは示していない）。ＫＵＮレプリコンＶＬＰを産生するためにこれらの細胞系を使用する試みは、極めて低いＶＬＰ力価を生じさせた（データは示していない）。

最初に、テトラサイクリン転写活性化因子を安定に発現するＢＨＫ細胞系であるＢＨＫ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆを樹立するために、テトラサイクリン転写活性化因子をコードする配列（図１Ａ）を含有するｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐの誘導体(Hobbs et al.,1998 Biochem Biophys Res Commun 252368-372)であるｐＥＦ−ｔＴＡ−ＩＲＥＳｐｕｒｏプラスミドＤＮＡを用いてＢＨＫ２１細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞クローンを選択するために濃度１０μｇ／ｍＬの抗生物質ピューロマイシンを添加した。このトランスフェクションから、５つの細胞クローンを単離して培養するのに成功した。これらのクローンを次に、ドキシサイクリン（テトラサイクリンと同一領域の抗生物質であるがより高い比活性およびより長い半減期を有する）の存在下（０．５μｇ／ｍＬ）および非存在下でのプラスミドｐＴＲＥ２ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ(Clontech社)を用いたトランスフェクションによる発現の誘導について分析した。すべてのＢＨＫ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞クローンは、程度の相違する誘導およびバックグラウンドレベルを示した（結果は示していない）。未誘導細胞に比較して最高誘導倍率のルシフェラーゼ発現を示している２つのＢＨＫ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞クローンを使用してＫＵＮ構造タンパク質であるコア（Ｃ）、膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）を発現する安定なＢＨＫ細胞系を樹立した。ＫＵＮ ＣｐｒＭＥ遺伝子カセットおよび脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入部位−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子カセット（ＩＲＥＳＮｅｏ）をｐＴＲＥ２ベクター（Clontech社、オーストラリア国ノースライド）内にサブクローニングすることによって構築したｐＴＲＥ２ＣｐｒＭＥ−ＩＲＥＳＮｅｏプラスミドＤＮＡ（図１Ａ）を用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞に、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンおよび０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンも含有していた培地中で０．５ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８）を用いる選択を受けさせて安定なパッケージング細胞系を樹立した。最高効率のパッケージング細胞系を選択するために、Ｇ４１８およびピューロマイシンへの耐性を付与する多数の細胞クローンはＫＵＮレプリコンＲＮＡ（ＲＮＡｌｅｕ）を用いてエレクトロポレーションし、そしてそれらが感染性ＫＵＮレプリコンＶＬＰを産生できるかどうかを判定するためにドキシサイクリンを含めずに培養した。採取した培養液（ＣＦ）中に存在する感染性ＶＬＰの力価（１ｍＬ当たりの感染単位（ＩＵ）で）は、以前に記載されたようにＶｅｒｏ細胞の感染後に抗ＮＳ３抗体を用いた免疫蛍光分析を実施することによって決定した(Khromykh et al.,1998,J Virol.72 7270-7279;Westaway et al.,1997,J Virol.71 6650-6661)。

４つの細胞クローン、すなわち＃Ａ３、＃Ａ８、＃Ｅ１および＃Ｅ５は、ＲＮＡエレクトロポレーション５３時間後に１ｍＬ当たり５×１０⁴から２×１０⁸ＩＵで相違する効率でＶＬＰを産生することができた（表１）。２×１０⁸ＩＵ／ｍＬのＶＬＰを産生する最高効率細胞クローン＃Ａ８をｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥと指名し、その後の全試験において使用した。ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内で産生されたｍＲＮＡ内でコードされたＫＵＮ ＣｐｒＭＥ配列の野生型ＫＵＮ ＣｐｒＭＥ配列に対する同一性は、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞から単離された全ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅後の全ＣｐｒＭＥ領域をシーケンシングすることによって確証した。プラスミドＤＮＡ ｐＴＲＥ２ＣｐｒＭＥ−ＩＲＥＳＮｅｏ内に存在する配列からのヌクレオチド変化は見いだされなかった。

〔ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内のＣｐｒＭＥ発現および分泌ＫＵＮレプリコンＶＬＰの産生の最適化〕
ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞の培養液中での分泌ＫＵＮタンパク質およびＫＵＮ ＶＬＰのレベルを試験するために、我々は以前に記載されたように抗原捕捉ＥＬＩＳＡを使用した(Hunt et al.,2002、上記参照)。分析前４８時間にわたり培養した誘導および未誘導ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞から採取したＣＦは、両方のＣＦサンプル中で検出可能なレベルのＫＵＮ Ｅタンパク質を示さなかった（図１Ｂ）。しかし、ＲＮＡｌｅｕレプリコンＲＮＡを用いて細胞をエレクトロポレーションした場合は、誘導された細胞からのＣＦサンプル中でのＲＮＡエレクトロポレーション４５時間までにＥＬＩＳＡ示度における劇的な増加が認められたが、他方未誘導細胞からのＣＦサンプル中ではＥＬＩＳＡ示度におけるほんのわずかな増加しか検出されなかった（図１Ｂ）。これらのＣＦサンプル中のＶＬＰをＶｅｒｏ細胞上で滴定すると、ＶＬＰの力価はＥＬＩＳＡ結果と明確に相関していた。未誘導細胞から採取したＣＦサンプル中で検出された１ｍＬ当たり５００ＩＵのＶＬＰは約０．１１のＯＤ₄₅₀のＥＬＩＳＡ示度を生じさせたが、誘導細胞からのＣＦサンプル中の１ｍＬ当たり２．１×１０⁸ＩＵのＶＬＰは約０．６３のＥＬＩＳＡ示度を生じさせた（図１Ｂ）。

ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞系におけるＣｐｒＭＥ ｍＲＮＡ転写およびＣｐｒＭＥ遺伝子の細胞内発現を試験するために、培地中にドキシサイクリンを含めて、および含めずに細胞を４８時間培養した。陰性コントロールとして正常ＢＨＫ２１細胞を含めた。ＣｐｒＭＥ ｍＲＮＡ転写は³²Ｐ−標識ＣｐｒＭＥ特異的ｃＤＮＡプローブを用いる全細胞ＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析し（図３Ａ）、そしてＫＵＮタンパク質の発現はＫＵＮ抗Ｅ抗体を用いるウェスタンブロット分析によって分析した（図３Ｂ）。これらの結果は、ドキシサイクリンの存在下で産生するＣｐｒＭＥ ｍＲＮＡおよびＫＵＮ Ｅタンパク質が極めて少ないことを証明した（未誘導細胞）。これとは対照的に、ドキシサイクリンの除去は、対応する標識バンドにおける相対ホスホイメージャー計数によって判定されるように、ＣｐｒＭＥ ｍＲＮＡのレベルにおける約３０倍の増加を生じさせた（図３Ａ）。ＫＵＮ Ｅタンパク質産生のレベルにおけるほぼ類似の増加もまた検出された（図３Ｂ）。

ＶＬＰ産生を最高化するために、培養液の採取および相違する時点での培地からのドキシサイクリンの除去を含む試験を実施した。ＫＵＮレプリコンＲＮＡ（ＲＮＡｌｅｕ）のエレクトロポレーション後、ドキシサイクリン（０．５μｇ／ｍＬ）を含有する培地をさらに１６時間または３０時間にわたり細胞へ添加し、次にドキシサイクリンを含まない新鮮培地と交換した。比較するためにドキシサイクリンを含めずに、エレクトロポレーションした細胞の６０ｍｍ²培養皿を連続的にセットした。培養液をエレクトロポレーション５３時間後および６８時間後に各培養皿から採取し、Ｖｅｒｏ細胞上で感染性アッセイによって試験した。結果は、ＶＬＰ産生のためのＣｐｒＭＥ発現を誘導するためにドキシサイクリンの除去にとって最適な時点はＲＮＡエレクトロポレーションの直後であることを証明した（表２）。培地からのドキシサイクリンの除去における遅延は、産生されたＶＬＰの量における実質的な減少を生じさせた。

最適なＶＬＰ採取プロトコルおよびｔｅｔＫＵＮｃｐｒＭＥ細胞が様々な異種遺伝子をコードする高レベルのＶＬＰを産生する能力を決定するために、ＫＵＮレプリコンＲＮＡ ＲＮＡｌｅｕならびに例えばマウスポリトープ（ＲＮＡｌｅｕＭｐｔ）、ＨＩＶ−１ ｇａｇ（ＫＵＮｇａｇ）、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ｒｅｐＰＡＣ）、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ（ｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ）、および緑色蛍光タンパク質（ｒｅｐＧＦＰ）などの様々な異種遺伝子をコードするレプリコンＲＮＡ(Anraku et al.,2002、上記参照;Liu et al.,2002,J Virol.76 10766-10775;Varnavski & Khromykh,1999,Virology 255 366-375;Varnavski et al.,2000,J Virol.74 4394-4403)をｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内へエレクトロポレーションした。ＶＬＰはＲＮＡエレクトロポレーション後の様々な時点に採取し、ＶＬＰの多数回採取を可能にするためにＶＬＰを採取する度に培地を新鮮培地と交換した（表３）。エレクトロポレーション後第３日からのほぼ全部のＶＬＰ力価は１ｍＬ当たり１０⁷〜１０⁹ＩＵの範囲内にあり、トランスフェクション後１０日間までの第３回または第４回連続採取においてさえ、レプリコンＲＮＡおよびＶＬＰ採取プロトコルの性質に依存して、高いままであった（表３）。最適なＶＬＰ採取プロトコルを用いて最初にトランスフェクトした３×１０⁶ｃｅｌｌｓのｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞からのＶＬＰの全産生量は５．４×１０¹⁰個の感染性粒子（表３中の実験２のｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ ＲＮＡ）に達したが、他の採取プロトコルおよび相違するＫＵＮレプリコンＲＮＡを使用した場合はエレクトロポレーションした細胞３×１０⁶ｃｅｌｌｓ当たりの感染性粒子数は１．６×１０⁹〜１．３×１０¹⁰個の範囲内であった（表３）。

ＫＵＮレプリコンＶＬＰがｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内では拡散するが正常ＢＨＫ細胞内では拡散しないことによって増幅できるかどうかを試験するために、細胞を低ＭＯＩ（０．１）でＲＮＡｌｅｕＭｐｔ ＶＬＰを用いて感染させ、ドキシサイクリンを含まない培地中でインキュベートした。ＫＵＮ抗ＮＳ３抗体を用いて感染させた細胞のＩＦ分析は、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内でのＶＬＰの増幅および拡散を証明している、感染後第２〜３日に陽性細胞巣のサイズにおける有意な増加を示した（図４、パネル１および２）。これとは対照的に、ＶＬＰ感染後の第２日および第３日のどちらにおいても感染した正常ＢＨＫ２１細胞内では個別陽性細胞しか検出されなかった（図４、パネル３および４）。個別実験では、０．１ ＭＯＩのＲＮＡｌｅｕＭｐｔ ＶＬＰを用いたｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞の感染後のインキュベーションの第３日〜第５日におけるＶＬＰ力価の約１０倍の増加が検出されたので（結果は示されていない）、そこでパッケージング細胞における拡散によるＶＬＰの増幅がさらに確証された。

これらの結果は、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞系は、ＫＵＮ構造遺伝子の発現のために細胞変性ＳＦＶレプリコンを用いる我々が以前公表したプロトコルと比較して実質的に（約１５００倍）多量のＫＵＮレプリコンＶＬＰを産生できることを納得できるように証明している(Varnavski & Khromykh,1999、上記参照)。

これはダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ｐｒＭＥ遺伝子を安定的に発現するＣＨＯ細胞系の生成および欠失したｐｒＭＥ遺伝子を有するＴＢＥレプリコンＲＮＡのパッケージングのための使用に関する報告書と比較されたい(Gehrke et al.,2003,J.Virol.77 8924-8933)。ｐｒＭＥ−発現性ＣＨＯ細胞内で入手された分泌ＴＢＥレプリコンＶＬＰの最高力価は５×１０⁷ＩＵ／ｍＬであった。それはｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内で入手されたＫＵＮレプリコンＶＬＰの最高力価の３２分の１である（１．６×１０⁹ＩＵ／ｍＬ、表３）。さらに、トランスフェクト細胞１０⁶ｃｅｌｌｓ当たり産生したＴＢＥレプリコンＶＬＰの全最高量は約１０⁸ＩＵとなったが、これはＫＵＮレプリコンＶＬＰについて入手された量の約５４０分の１である（５．４×１０¹⁰ＩＵ、表３を参照）。しかし、使用した細胞系（ＴＢＥのためのＣＨＯおよびＫＵＮのためのＢＨＫ）、レプリコンＲＮＡ（ＴＢＥのためにはコア遺伝子を含めて、そしてＫＵＮのためにはコア遺伝子を含めずに）、エレクトロポレーション条件（すなわち、トランスフェクト細胞の数、ＴＢＥ ＲＮＡについて報告されていないＲＮＡ量およびエレクトロポレーターの設定）、およびＶＬＰを採取するためのプロトコルにおける相違に関してこれら２つの系間のパッケージング効率をさらに詳細に比較することは困難である。

しかし本発明のｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞が誘導性発現の柔軟性、明らかにより高い力価、連続的採取、および産生するレプリコンＶＬＰのより多い総量を提供する。さらに、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞は様々なフラビウイルス由来のレプリコンＲＮＡをパッケージングすることができた（下記を参照）。

〔ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内でのＫＵＮ構造タンパク質の安定な発現〕
ＫＵＮ ＣｐｒＭＥ遺伝子の発現の安定性を決定するために、ピューロマイシンおよびＧ４１８を含めずにｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞を１２継代にわたり培養し、次にＶＬＰ産生効率を決定するためにＫＵＮレプリコンＲＮＡ（ＲＮＡｌｅｕ）を用いてエレクトロポレーションした。ＣｐｒＭＥ発現の抑制を保証するために、継代中には培地中にドキシサイクリンを存在させた。全３種の抗生物質、すなわちピューロマイシン、Ｇ４１８およびドキシサイクリンの存在下で１２継代にわたって培養したｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞は、ＶＬＰ産生効率を比較するために平行してエレクトロポレーションした。ＣｐｒＭＥの発現を誘導してＶＬＰ産生を可能にするために、レプリコンＲＮＡのエレクトロポレーションの直後にドキシサイクリンを培地から除去した。継代中にはピューロマイシンおよびＧ４１８選択下で維持された細胞からのレプリコンＲＮＡトランスフェクション４８時間後に収集したＶＬＰの力価は、ピューロマイシンおよびＧ４１８選択の非存在下で維持した細胞から同時に収集したＶＬＰの力価と類似であった（各々、２．２×１０⁶ＩＵ／ｍＬおよび１．７×１０⁶ＩＵ／ｍＬ）。この特定の実験におけるＶＬＰ力価は他のパッケージング実験の大多数におけるより低かったが、これらの結果は、抗生物質選択の非存在下での少なくとも１２継代後のｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞中のＫＵＮ構造タンパク質の発現の安定性を明白に証明しており、したがってＫＵＮ構造遺伝子カセットの細胞ゲノム内への安定な組み込みを指示している。

〔レプリコンＶＬＰ調製物中の感染性ＫＵＮウイルスの非存在〕
ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内で産生されたＫＵＮレプリコンＲＮＡおよびＣｐｒＭＥ ｍＲＮＡのＣ遺伝子のＣ末端領域およびＥ遺伝子のＮ末端領域におけるオーバーラッピング配列の存在は、ＶＬＰ調製物中の感染性ＫＵＮウイルスの産生をもたらす可能性がある同種組み換えを潜在的に促進することができる。以前に開発したパッケージング系において、我々はＳＦＶレプリコンベクターから産生した２種のｍＲＮＡからＣ遺伝子およびｐｒＭ−Ｅ遺伝子の発現を分離することによって潜在的組み換えのあらゆる可能性を排除した。しかし、欠陥のあるＲＮＡとヘルパーＲＮＡとの間に長い相補性領域が存在していた、我々が実施したＫＵＮ ＲＮＡを用いた極めて多数の相補性実験（概観については、上記のKhromykh,2000を参照）ならびにＹＦ ＲＮＡを用いた相補性実験(Lindenbach & Rice,1997,J Virol.71 9608-17;Lindenbach & Rice,1999,J Virol.73 4611-21)は、同種組み換えによって産生された可能性のある組み換え感染性ウイルスを全く検出することができなかった。いずれかの組み換え複製コンピテントＫＵＮウイルスがｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内でのＫＵＮレプリコンＶＬＰの産生中に産生したかどうかを試験するために、ＲＮＡｌｅｕ ＲＮＡを用いたトランスフェクション２日後に採取したＣＦを使用してカバーガラス上で増殖したＶｅｒｏ細胞を感染させた。感染した細胞を５日間にわたりインキュベートし、免疫蛍光によってＥタンパク質の発現について試験した。感染したカバーガラスからの組織培養液をさらに５日間にわたりＶｅｒｏ細胞の新鮮培養上で再び継代させ、抗Ｅ抗体を含むＩＦによって試験した。どちらの継代においてもＥ陽性細胞は検出されなかった（結果は示していない）。抗ＮＳ３抗体を用いた平行標識は第１継代における極めて多数の陽性細胞を示したが、第２継代では陽性細胞は検出されず（結果は示していない）、これはＶＬＰが第１巡の感染でしかレプリコンＲＮＡを送達しないことを証明している。同様に、ｐｒＭ−Ｅ遺伝子を安定に発現するＣＨＯ細胞内でのＴＢＥレプリコンＲＮＡのパッケージングは、ｐｒＭ−ＥおよびレプリコンＲＮＡ間でのウイルスゲノム配列におけるオーバーラップにもかかわらず、パッケージング細胞系における数回の継代後にさえ感染性ＴＢＥウイルスの産生を生じさせなかった。

ＶＬＰ調製物中には感染性ＫＵＮウイルスが非存在であるとの追加の証拠をウイルス検出のために最も感受性の方法である哺乳期マウスへの脳内注射によって追求した。１０匹の２〜３日齢Ｂａｌｂ／Ｃ哺乳期マウスを含む群に、４×１０⁶ＩＵのＫＵＮ−ＭＰｔ ＶＬＰまたは陽性コントロールとしての１ｐｆｕのｗｔ ＫＵＮウイルス（ＭＲＭ６１Ｃ系統）を脳内に接種した。１ｐｆｕのｗｔ ＫＵＮウイルスを注射した全１０匹のマウスは、接種４日後に後肢の麻痺を発生し、これらを安楽死させた。これとは対照的に、ＶＬＰを注射した全マウスは健常のままで、実験期間（２１日間）にわたり正常な発達を示した。これらのＫＵＮレプリコンＶＬＰを用いたインビトロおよびインビボ試験結果ならびにＴＢＥレプリコンＶＬＰを用いたインビトロ試験結果(Gehrke et al.,2003、上記参照)は、連続的構造遺伝子カセットを発現するパッケージング細胞内でのフラビウイルスレプリコンＶＬＰの産生が組み換え感染性ウイルスの生成をもたらさないことを明白に証明している。比較すると、連続的シンドビスウイルス構造遺伝子カセットを発現するＢＨＫパッケージング細胞系内で産生した１０⁸ＩＵのシンドビスウイルスレプリコンＶＬＰは、組み換えによって生成した約１０⁵ｐｆｕの感染性ウイルスを含有していた(Polo et al.,1999,Proc Natl Acad Sci USA.96 4598-4603)。構造遺伝子をパッケージング細胞系内の２つの個別発現カセットへ分割するステップは、検出不能なレベルまで感染性ウイルスによる汚染を除去すると思われたが、しかし同時にレプリコンＶＬＰの力価を１ｍＬ当たり５×１０⁶〜１×１０⁷ＶＬＰへ減少させた(Polo et al.,1999、上記参照)。

〔ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内の分泌感染性ＶＬＰ内への西ナイル熱ウイルスおよびデング熱ウイルスレプリコンのパッケージング〕
他のフラビウイルス由来のレプリコンＲＮＡをパッケージングするためにｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞を使用できるかどうかを試験するために、我々は近縁西ナイル熱（ＷＮ）ウイルスおよび遠縁２型デング熱ウイルス（ＤＥＮ２）由来のレプリコンＲＮＡを使用した。構造領域における大きな欠失を伴い、Ｃ遺伝子の最初の２０コドンおよびＥ遺伝子の最後のコドンしか維持していないＷＮレプリコン構築物「レプリコン」については以前に記載されている(Shi et al.,2002,Virology.296 219-233;Lo et al.,2003,J Virol.77 10004-10014)。

２型デング熱ウイルス（ＤＥＮ２）レプリコン構築物であるｐＤＥＮΔＣｐｒＭＥおよびｐＤＥＮΔｐｒＭＥは、構造遺伝子内で大きなインフレーム欠失を作製することによってＤＥＮ−２のニューギニア(New Guinea)Ｃ系統のゲノムに対応する全長ｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドｐＤＶＷＳ６０１(Pryor et al.,2001,Am J Trop Med Hyg.65 427-434)に由来する。ｐＤＥＮΔＣｐｒＭＥはＣ遺伝子の最初の２７コドンおよびＥ遺伝子の最後の２４コドンを保持していたが、他方ｐＤＥＮΔｐｒＭＥはＣ遺伝子全体、ｐｒＭ遺伝子の最初の７コドンおよびＥ遺伝子の最後の２４コドンを保持していた。

パッケージング実験のために、ＤＥＮΔＣＭＥまたはＤＥＮΔＭＥレプリコンＲＮＡはｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内へエレクトロポレーションし、ドキシサイクリンを含まない培地中でインキュベートした。ＶＬＰ産生を比較するために、ＫＵＮレプリコンＲＮＡ（ＲＮＡｌｅｕ）を含めた。トランスフェクション後第２日に交差反応するＫＵＮ抗ＮＳ３抗体を用いたＩＦ分析は、各々ＤＥＮΔＭＥおよびＤＥＮΔＣＭＥ ＲＮＡを用いたトランスフェクション後に約８０％および９５％の陽性細胞を示した。ＫＵＮレプリコンＲＮＡであるＲＮＡｌｅｕのトランスフェクションは約９５％のＮＳ３−陽性細胞を生じさせた。培養液をエレクトロポレーション後第２日に収集し、Ｖｅｒｏ細胞上での感染性アッセイによって滴定した。ＤＥＮΔＭＥおよびＤＥＮΔＣｐｒＭＥレプリコンＲＮＡから産生した感染性ＶＬＰの力価は、各々８×１０⁴ＩＵ／ｍＬおよび１．８×１０⁵ＩＵ／ｍＬであった。同一実験におけるＫＵＮレプリコンＲＮＡは２．２×１０⁷ＩＵ／ｍＬの力価を備えるＶＬＰを産生した。

個別実験では、ＷＮレプリコンＲＮＡのｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内へのエレクトロポレーションは、エレクトロポレーション後第４日までに約７０〜８０％のＮＳ３−陽性細胞の検出および７×１０⁷ＩＵ／ｍＬの分泌ＶＬＰの産生を生じさせた。同一実験で実施されたＫＵＮレプリコンＲＮＡであるＲＮＡｌｅｕのエレクトロポレーションは、エレクトロポレーション後第４日までに約８０〜９０％のＮＳ３−陽性細胞の検出および１０⁸ＩＵ／ｍＬのＶＬＰの産生を生じさせた。

１種のウイルス由来の構造遺伝子を他のフラビウイルス由来の構造遺伝子と置換することによるキメラフラビウイルスの産生の成功は、１種のフラビウイルス由来の構造タンパク質が、それらが同一ＲＮＡ分子からｃｉｓ形で発現した場合に他のフラビウイルス由来のＲＮＡをパッケージングできることを証明している。我々の試験結果は、ｔｒａｎｓ形で提供されたＫＵＮ構造タンパク質による様々なフラビウイルスレプリコンＲＮＡのパッケージングについての最初の証明を表している。ＷＮウイルスのＫＵＮおよびＮＹ９９系統間の極めて高度の相同性(Lanciotti et al.,1999,Science.286 2333-2337;Liu et al.,2003、上記参照)およびそれらの比較的類似の複製効率を前提とすると、観察されたＫＵＮおよびＷＮレプリコンＲＮＡの類似のパッケージング効率は驚くことではない。ＫＵＮレプリコンＲＮＡと比較してＤＥＮ２レプリコンＲＮＡのパッケージング効率が１００分の１以下である原因は、これら２種のウイルス間の重大な配列相違、および一般にデング熱ウイルスにおける低い複製効率を含む多数の因子に帰することができよう。全長感染性ＤＥＮ２ ｃＤＮＡを用いた以前の実験は、ＢＨＫ細胞内へのＲＮＡトランスフェクション直後の分泌ＤＥＮ２ウイルスの比較的非効率的な産生を証明した(Gualano et al.,1998,J Gen Virol.79 437-446)。我々はｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内でのＤＥＮ２およびＫＵＮレプリコンＲＮＡの複製効率を比較しなかったが、ＤＥＮ２レプリコンＲＮＡの複製は、パッケージングのためにＲＮＡを利用可能にすることがより少ないＫＵＮレプリコンＲＮＡより非効率であると思われる。最適なパッケージングには、同一ウイルスのＲＮＡとコアタンパク質間の特異的相互作用をさらに必要とする可能性があるが、しかしパッケージングの特異性を決定するフラビウイルスＲＮＡまたはコアタンパク質におけるシグナル／モチーフはまだ明確にされていない。このパッケージング系はパッケージングシグナルについてのより詳細な研究に寄与し、フラビウイルスビリオンがどのように組立てられ、分泌されるかについての理解を高めると思われる。

〔ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内で調製されたＫＵＮレプリコンＶＬＰを高用量で用いた免疫は、コードされた免疫原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を改善する。〕
パッケージング細胞系は約１００倍高い力価を備えるＫＵＮレプリコンＶＬＰの産生を可能にしたので、したがって免疫実験においてＶＬＰの用量を増量する試験が可能になった。マウスポリトープをコードするＫＵＮレプリコンＶＬＰ（ＫＵＮ−Ｍｐｔ ＶＬＰ）の用量の１０⁶から１０⁷ＩＵのＶＬＰへの１０倍の増量は、エックスビボＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定すると３〜４倍高いＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を誘導した（図５Ａ）。１０⁷から１０⁸ＩＵのＶＬＰへのさらに１０倍の増量は、誘導されたＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞数のほんのわずかな増加しか生じさせなかった（図５Ａ）。個別実験では、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｍ２遺伝子をコードする２．５×１０⁷ＩＵのＫＵＮ ＶＬＰを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを１回免疫した。ＲＳＶ Ｍ２遺伝子をコードするＫＵＮレプリコンは、ＲＳＶ Ａ２単離体を用いて感染させた細胞から単離したＲＮＡの逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲ増幅によって調製したＲＳＶ Ｍ２ ｃＤＮＡ配列を含有するＤＮＡフラグメントをＲＮＡｌｅｕベクター内にクローニングすることによって構築した。ＲＳＶ Ｍ２エピトープであるＳＹＩＧＳＩＮＮＩにとって特異的な高度に強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、１０⁶ｃｅｌｌｓの脾細胞当たり平均１４００スポットを示しているＥＬＩＳＰＯＴ分析（図５Ｂ、ＫＵＮ−Ｍ２ ＶＬＰ）、および複数のエフェクターを２：１のエフェクター：標的比へ希釈した後に４５％を超える比溶解率を示す標準的クロム放出（図５Ｃ、ＫＵＮ−Ｍ２ ＶＬＰ）を用いて産生した。これらの応答はＲＳＶ Ｍ２をコードする複製コンピテント組み換えワクシニアウイルスを用いたワクチン接種後に報告された応答を超えていた(Aung et al.,1999,J Virol.73 8944-8949;Kulkarni et al.,1993,J Virol.67 4086-4092;Simmons et al.,2001,J Immunol.166 1106-1113)。

コントロールＫＵＮ ＶＬＰは有意な特異的応答を誘導することができず（図５Ｂおよび５Ｃ、ＫＵＮ ＶＬＰコントロール）、そしてＳＹＩＧＳＩＮＮＩ−ペプチドを用いて調製したペプチド−ワクチンは数分の１の応答を誘導した（図５ＢおよびＣ、ＳＹＩＧＳＩＮＮＩ／ＴＴ／Ｍ７２０）。

〔癌における治療的ワクチン療法のための高力価ＫＵＮ ＶＬＰ〕
ＣＤ８ Ｔ細胞に基づく治療により樹立された腫瘍の治癒は極めて多数の抗癌ＣＤ８ Ｔ細胞を必要とする(Overwijk et al.,2003,J Exp Med.198 569-80)。我々は、ここでＶＬＰの用量を増量することによってより多数のＣＤ８ Ｔ細胞が誘導されることを証明した。そこで我々は、有意な抗癌活性を媒介するために高用量ＶＬＰワクチン接種を治療的に使用できるかどうかを判定しようと考えた。このモデルでは、モデル腫瘍抗原オバルブミンを発現するＬｅｗｉｓ肺癌細胞に対する治療薬として、オバルブミンＣＤ８ Ｔ細胞エピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬを含有するマウスポリトープ（Ｍｐｔ）をコードするＶＬＰを使用した(LLOva;Nelson et al.,2001、上記参照)。

樹立されたＬＬＯｖａ腫瘍を有するマウスの群に指示した時点にＩＬ−２を含めて、および含めずに１０⁸ＫＵＮ ＶＬＰＭｐｔ（図６、ＶＬＰＭｐｔ）またはＰＢＳ（図６、コントロール）を腹腔内投与により２回ワクチン接種した。（図６、矢印）。ＶＬＰＭｐｔワクチン接種は、腫瘍の増殖を有意に緩徐化した。ＩＬ−２単独またはＶＬＰワクチン接種との併用は、腫瘍増殖に有意な影響を及ぼさなかった。

このため、高レベルのＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を誘導することのできる高力価ＶＬＰＭｐｔワクチンの治療的投与は先在するＬＬＯｖａ腫瘍の増殖を有意に緩徐化できると結論付けられる。ＩＬ−２は、単独でも、またはＶＬＰ療法と併用しても、有意な影響を及ぼさなかった。

〔ＮＳ２ＡおよびＮＳ５における適応的突然変異を備えるＫＵＮレプリコンＲＮＡのウイルス様粒子内へのパッケージング〕
以前の報告書は、ｎｓＰ２内での一部の適応的（非細胞変性）突然変異を備えるシンドビスウイルスおよびＳＦＶレプリコンＲＮＡはＶＬＰ内に効率的にパッケージングすることはできないが、ｎｓＰ２内での他の適応的突然変異を備えるＲＮＡはパッケージングできることを証明した(Perri et al.,2000,J Virol.74 9802-9807)。

我々は、それらを我々が近年報告したテトラサイクリン誘導性パッケージングＢＨＫ細胞系ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ内へトランスフェクトすることによって適応的突然変異を備えるＫＵＮレプリコンＲＮＡのパッケージング能力について試験した。材料および方法の項に記載したとおりに、分泌ＶＬＰを６〜８日間にわたり２日毎に採取し、ＶＬＰ力価を決定した。ＮＳ２Ａ／Ａ３０Ｐ突然変異を備えるレプリコンＲＮＡはｗｔ ＲＮＡに類似する効率でパッケージングされた；他の変異型ＲＮＡは第２日にパッケージング効率の５０〜５００分の１への減少を示したが、ＮＳ２Ａにおける結合突然変異を備えるものを除く全部が第６日までに野生型に近いパッケージング効率を回復した。（表４）。ＮＳ２Ａ内での結合突然変異を備えるＲＮＡは、第８日までに野生型ＲＮＡの４０分の１未満の効率でまだパッケージングされた。これらを要約すると、ＮＳ２Ａ／Ａ３０Ｐ突然変異だけはレプリコンＲＮＡのパッケージング効率に影響を及ぼさなかったが、他の適応的突然変異はパッケージング効率を低下させた。

〔安定に発現する細胞系を生成するためのｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内で入手したＶＬＰの使用〕
我々は次にハムスター細胞系ＢＨＫ２１における持続性複製を樹立する際に長所を提供することが証明されたＮＳ２Ａにおける適応的突然変異も、他の細胞系、特にヒト細胞系において類似の長所を提供するかどうかについて試験した。各々１および１０のＭＯＩ（Ｖｅｒｏ細胞上で滴定した）でパッケージングされた野生型および変異型レプリコンＲＮＡを含有するＶＬＰを用いて２種のヒト細胞系ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２の単層を感染させ、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む培地中で７日間にわたり増殖させた。ピューロマイシン耐性コロニーのＸ−ｇａｌ染色は、ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２細胞の両方においてコロニー数の野生型レプリコンに比較してＮＳ２Ａ／Ａ３０Ｐ変異体に対しては約５０倍の増加およびＮＳ２Ａ／Ｎ１０１Ｄ変異体に対しては約２０倍の増加を示した（図７）。０．０１ ＭＯＩのレプリコンＶＬＰを用いた感染後にも、野生型およびＮＳ２Ａ突然変異型レプリコンＲＮＡ間のピューロマイシン耐性コロニー数における類似の相違が観察された（図７）。興味深いことに、ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２細胞の感染は、ＢＨＫ２１細胞内で産生されたものに類似する数のピューロマイシン耐性コロニーを産生するために、各々１０倍および１００倍以上のＶＬＰを必要とした（図５）。野生型ＫＵＮウイルスの複製効率においてもこれらの細胞系間の類似の相違が観察された（結果は示していない）。個別実験では、Ｖｅｒｏ細胞内ではＢＨＫ細胞中と比較して野生型ＫＵＮウイルスの約２０倍を超える効率的な複製が観察された（結果は示していない）。これらの結果は、様々な細胞系における持続性複製を樹立するそれらの能力においてＮＳ２Ａにおける適応的突然変異を備える親レプリコンＲＮＡに比した長所を確証した。ピューロマイシンを備える選択的培地中でのレプリコンＶＬＰ感染ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２細胞の増殖は、シーケンシングによって確認された突然変異の保持を備える野生型およびＮＳ２Ａ突然変異型レプリコンＲＮＡを安定に発現する細胞集団の樹立を生じさせた（結果は示していない）。ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ２９３、およびＨＥｐ−２細胞を用いた全実験において、ＮＳ２Ａ／Ａ３０Ｐ突然変異は安定に発現する細胞系のより効率的およびより迅速な樹立を許容した（結果は示していない）。ＢＨＫ細胞を用いた試験結果と一致して、様々なレプリコンＲＮＡを安定に発現するＨＥｐ−２および２９３細胞内で樹立されたピューロマイシン耐性細胞系におけるＲＮＡ複製およびβ−ｇａｌ発現の効率もまた類似であった（結果は示していない）。

〔クンジンレプリコンベクター由来の異種遺伝子の発現を増強させるためのｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥパッケージング細胞の使用〕
ＫＵＮレプリコンＶＬＰをＫＵＮパッケージングＡ８細胞内では拡散するが正常ＢＨＫ細胞内では拡散しないことによって増幅できるかどうかを試験するために、細胞を感染多重度（ＭＯＩ）１でｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌ ＶＬＰを用いて感染させ、ドキシサイクリンを含まない培地中でインキュベートした。感染したＡ８パッケージング細胞のＸ−ｇａｌ染色分析は感染後第２日（４８時間後）から第６日（１４４時間後）においてβ−ｇａｌ陽性細胞数の有意な増加を示したが（図８Ａ）、これはＡ８細胞内でのβ−ｇａｌ ＶＬＰの増幅および拡散を証明した。これとは対照的に感染した正常ＢＨＫ２１細胞内では個別の陽性細胞しか検出されず、ＫＵＮ−レプリコンＶＬＰ感染後第２日と第６日の細胞間でβ−ｇａｌ陽性細胞数はほとんど変化しなかった（図８Ａ）。さらに、ＫＵＮ ｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌ ＶＬＰ感染Ａ８ ＫＵＮパッケージング細胞中のβ−ｇａｌ陽性細胞数は感染後第２日からの正常ＢＨＫ２１細胞中よりはるかに多く（図８Ａ）、これは第２日の早期時点におけるレプリコンＶＬＰの増幅および拡散を示していた。

溶解ＫＵＮレプリコンＶＬＰ感染細胞のβ−ｇａｌ分析は、正常ＢＨＫ２１細胞の感染後のインキュベーション第２日から第６日へのβ−ｇａｌ発現のたった１．３倍の増加とは対照的に、Ａ８細胞の感染後のインキュベーション第２日から第６日へのβ−ｇａｌ発現のほぼ３倍の増加を示した（図８Ｂ）。第２日から第６日へのｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌレプリコンＶＬＰ感染Ａ８パッケージング細胞：正常ＢＨＫ２１細胞のβ−ｇａｌ発現の比率は２．３倍から５．２倍へ増加したので、したがってＫＵＮレプリコンパッケージング細胞内での拡散によるＶＬＰの増幅が確認された。感染第２日から第６日に観察されたβ−ｇａｌ発現のこの比較的控えめな増加（３倍から５倍）の原因は、必ずしもＶＬＰの非効率的な拡散を表していない、新しく感染した老化（２から６日齢の過剰コンフルエント）Ａ８パッケージング細胞が効率的なＫＵＮ ＲＮＡ複製を支持する能力の損傷に帰すことができよう。研究者らは以前に、多数の実験において能動的に分割するＢＨＫ細胞中の複製と比較して低い老化ＢＨＫ細胞内でのＫＵＮ ＲＮＡ複製効率を観察している。結論として、これらのデータはＫＵＮ ＲＮＡレプリコンＶＬＰがレプリコンパッケージング細胞（Ａ８細胞系）中で増幅および拡散させられることを証明している。

［考察］
我々は、ここでＫＵＮウイルス構造遺伝子を発現するテトラサイクリン誘導性の安定なパッケージング細胞系であるｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥを用いてフラビウイルスレプリコンＲＮＡをウイルス様粒子内へエンカプシデーションするための新規パッケージング系について説明した。１ｍＬ当たり約４×１０⁸個のＶＬＰまでに達する高力価ＶＬＰおよび１０日間までの複数回のＶＬＰ採取は、３×１０⁶個の単回初期エレクトロポレーションから約６．５×１０⁹ＶＬＰまでの総収率を可能にした。これはＫＵＮ構造遺伝子の一過性発現のための細胞変性ＳＦＶレプリコンＲＮＡを使用した以前に開発されたＫＵＮレプリコンパッケージング系に比した実質的（約３００倍）改良を表しており(Khromykh et al.,1998,J Virol.72 5967-5977;Varnavski & Khromykh.1999、上記参照)、将来のワクチンおよび遺伝子療法の適用にとってＫＵＮレプリコンＶＬＰの大規模工業生産を実現可能にする。ワクチン用途のためのパッケージング細胞内で産生した高力価ＫＵＮレプリコンＶＬＰの有用性は、免疫されたマウスにおけるＲＳウイルス由来のコードされた免疫原に対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞の生成によって証明された。さらに、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞はデング熱ウイルスレプリコンを分泌感染性ＶＬＰ内にパッケージングすることができたが、これは遠縁フラビウイルス由来のレプリコンをエンカプシデーションするＶＬＰの産生のためのｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞の可能性のある適用を示した。

本発明の誘導性パッケージング構築物は、構造タンパク質の明白な細胞毒性の問題を克服する。さらに、ワクチンおよび／またはタンパク質産生の用途を含むＫＵＮレプリコンＶＬＰの意図された使用を考慮に入れて、本発明の誘導性パッケージング系はＶＬＰ調製物中の抗生物質の存在を回避する。

ドキシサイクリンの除去後に樹立されたｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞系内ではＫＵＮ ＣｐｒＭＥｍＲＮＡ転写およびＣｐｒＭＥ発現のおよそ３０倍の誘導が観察され、発現の誘導後にｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内で産生したＫＵＮ構造タンパク質の量は、ＫＵＮレプリコンＲＮＡのトランスフェクション後に高力価の分泌感染性ＶＬＰを入手するために十分であった。ＢＨＫ細胞内での野生型ＫＵＮウイルス感染のピーク時に入手されたウイルス力価と同等またはそれより高い収率である、１ｍＬ当たり約４×１０⁸ＶＬＰまでの力価が入手された(Khromykh & Westaway,1994,J Virol.68 4580-4588)。

重要にも、哺乳期マウスへの脳内注射によるＫＵＮウイルスを検出するために最も感受性の方法は明白に、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞由来のＶＬＰ調製物中に存在する感染性ＫＵＮウイルスがないことを証明した。比較すると、シンドビスウイルス構造タンパク質カセットを発現するＢＨＫパッケージング細胞系は、１ｍＬ当たりｌ〜５×１０⁸個のシンドビスまたはＳＦＶレプリコンＶＬＰを産生した(Polo et al.,1999、上記参照)。しかし、これらのアルファウイルスレプリコンＶＬＰ調製物は、組み換えによって生成された１ｍＬ当たり約１０⁵ｐｆｕの感染性ウイルスを含有していた。構造タンパク質をパッケージング細胞系内の２つの発現カセットへ分割するステップは、感染性ウイルスによるこれらのアルファウイルスレプリコンＶＬＰ調製物の汚染を検出不能なレベルまで除去すると思われたが、しかし同時にレプリコンＶＬＰの力価を１ｍＬ当たり５×１０⁶〜１×１０⁷ＶＬＰへ低下させた(Polo et al.,1999、上記参照)。

分泌ＶＬＰ内へのＤＥＮ２レプリコンＲＮＡのパッケージングは、ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内でも達成された。

ワクチン接種にとっての高力価ＫＵＮレプリコンＶＬＰの有用性を例示するために、相違するマウス系統において２種のＶＬＰを試験した。以前の試験は、マウス１匹に付き１０⁶ＩＵまでの用量で注射したＫＵＮレプリコンＶＬＰが実験的ウイルスおよび腫瘍惹起から動物を防御できる免疫応答の誘導において有効であったことを示した(Anraku et al.,2002、上記参照)。新規パッケージング細胞系中で産生したＶＬＰを用いて、ＫＵＮ−Ｍｐｔ ＶＬＰについての用量反応は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞についてＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて証明され、ＶＬＰの用量の増加は誘導されたＣＤ８ Ｔ細胞数の増加を生じさせた。さらに、ＲＳＶ Ｍ２遺伝子をコードする２．５×１０⁷ＩＵのｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ由来ＫＵＮレプリコンＶＬＰの単回接種によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫は、エックスビボＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したときに脾臓細胞１０⁶個に付き１４００ ＳＹＩＧＳＩＮＮＩ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導およびクロム放出アッセイにおいて２：１のエフェクター対標的細胞の比率で４５％を超える溶解率を生じさせた。

これらを要約すると、本発明は、感染性ウイルスを含まない大量の高力価分泌ＫＵＮレプリコンウイルス様粒子の産生を可能にするパッケージング系を提供し、これらの粒子を用いた免疫がコードされた免疫原に対する強力な免疫応答を誘導することを証明した。したがってこのパッケージング細胞系は、ＫＵＮレプリコンに基づくワクチンを製造するために有用であることを証明するはずである。さらに、このパッケージング細胞系は他のフラビウイルスレプリコンをパッケージングすることができ、フラビウイルスＲＮＡパッケージングおよびウイルス組立体に関する基本的試験および様々なフラビウイルスレプリコンに基づく遺伝子発現系の開発において有用であることが証明されるはずである。

本明細書を通して、いずれか１つの実施形態または特定の特徴の集団に本発明を限定せずに本発明の好ましい実施形態を説明することが目標であった。このため、当業者には、本開示に照らせば、本発明の範囲から逸脱せずに本明細書に例示した特定の実施形態において様々な修飾および変更を加えることができることが理解されるであろう。

本明細書で言及した各特許および科学的文書、コンピュータプログラムおよびアルゴリズムについての開示は、その全体を参照して本明細書に組み込まれる。

安定なパッケージング細胞系ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥの産生および特性付け。（Ａ）安定性なパッケージング細胞系ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥを産生するために使用されたプラスミド構築物の略図である。ｐＥＦ−ｔＴＡ−ＩＲＥＳｐｕｒｏプラスミドを使用して、ヒト鎖延長因子１αプロモーター（ｐＥＦ−ｌα）からテトラサイクリン誘導性転写活性化因子（ｔＴＡ）を継続的に発現する第１の安定性なＢＨＫ細胞系であるＢＨＫ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆを生成した。テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（Ｐ_minCMV）由来のＫＵＮ構造遺伝子Ｃ、ｐｒＭ、およびＥ（ＫＵＮ ＣｐｒＭＥ）を発現するｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥは、ＢＨＫ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞内へのｐＴＲＥ２ＣｐｒＭＥ−ＩＲＥＳＮｅｏプラスミドＤＮＡのトランスフェクションならびにＧ４１８およびピューロマイシンの存在下での選択または細胞増殖によって樹立した（本文参照）。未誘導ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内では、ドキシサイクリン（ＤＯＸ；高比活性を備えるテトラサイクリンの１つの形状）はｔＴＡに結合し、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）への結合および引き続いてのＣＭＶプロモーターからのＣｐｒＭＥ ｍＲＮＡ転写の活性化を防止する。ＫＵＮ ＣｐｒＭＥ遺伝子の発現を誘導するために、ＤＯＸを培地から除去すると、ｔＴＡの放出、ｔＴＡのＴＲＥへの結合、およびＣＭＶプロモーターからのＣｐｒＭＥ ｍＲＮＡ転写の活性化を生じさせた。ｔｅｔＲ−Ｔｅｔ抑制タンパク質；ＶＰ１６−単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン；ＩＲＥＳ−ＥＭＣＶ内部リボソーム進入部位；ｐｕｒｏ−ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ；ＴＲＥ−テトラサイクリン応答エレメント；Ｎｅｏ−ネオマイシン耐性遺伝子；ＳＶ４０ポリＡ−ＳＶ４０転写ターミネーター／ポリ（Ａ）シグナル；β−グロビンポリＡ−β−グロビン転写ターミネーター／ポリ（Ａ）シグナル。（Ｂ）ＫＵＮレプリコンＲＮＡの存在下および非存在下において誘導性および非誘導性ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内での分泌Ｅタンパク質およびＶＬＰの産生。「−ＲＮＡ」グラフ（左側の部分）はレプリコンＲＮＡトランスフェクションを行わない実験の結果を示しており、「＋ＲＮＡ」グラフ（右側の部分）はＫＵＮレプリコンＲＮＡ−ＲＮＡｌｅｕのエレクトロポレーションを用いたまた別の実験の結果を示している。ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞はＫＵＮレプリコンＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし（「＋ＲＮＡ」）、またはエレクトロポレーションせず（「−ＲＮＡ」）、そして０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含めて（非誘導）または含めずに（誘導）培地中で４８時間維持した。抗原捕捉ＥＬＩＳＡによる分泌ＫＵＮ Ｅタンパク質（白色バー）の検出およびＶｅｒｏ細胞上での感染性アッセイによるＶＬＰ力価（黒色バー）（１ｍＬ当たりの感染単位（ＩＵ））の決定は（材料および方法）の項に記載したように実施した。両方の実験における陰性コントロール（Ｃｏｎｔ）は、正常ＢＨＫ細胞からの培養液であった。各実験に使用したＫＵＮウイルス陽性コントロール（ＫＵＮ）は、ＢＨＫ細胞上でのプラークアッセイによって決定した。 クンジンウイルス構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥのプロセシングについての概略図。切断部位は次のように表示した：□ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３（ウイルス）プロテアーゼ；●宿主細胞シグナラーゼ；←宿主細胞フリンプロテアーゼ。 ドキシサイクリンの除去後のｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内でのＫＵＮ構造遺伝子発現の誘導。（Ａ）誘導（−ＤＯＸ）および非誘導（＋ＤＯＸ）ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥおよびＢＨＫ細胞から抽出したＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション分析。２０μｇの各ＲＮＡを１％ホルムアミドアガロースゲル上で分離し、次にキャピラリーブロッティングによってＨｙｂｏｎｄ Ｎ膜上に移した。（Ｂ）誘導性（−ＤＯＸ）および非誘導性（＋ＤＯＸ）ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥおよびＢＨＫ細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロット分析。５μｇの全タンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次にＨｙｂｏｎｄ Ｐ膜上に移した。この膜はＫＵＮ抗Ｅモノクローナル抗体を用いてインキュベートし、結合ＫＵＮ Ｅタンパク質を化学発光によって検出した。 ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞内でのＫＵＮレプリコンＶＬＰの増幅および拡散。ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥおよびＢＨＫ２１細胞のカバーガラスに０．１ ＭＯＩ（感染多重度）のＲＮＡｌｅｕＭｐｔ ＶＬＰを用いて感染させ、感染後第２日および第３日にＫＵＮ抗ＮＳ３抗体を用いるＩＦによって分析した。 高力価ＫＵＮ ＶＬＰレプリコンを用いて免疫したマウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞反応。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群に付きｎ＝４）をＰＢＳ（実験未使用）、組み換え抗原をコードしない１０⁸ＩＵのＫＵＮ ＶＬＰ（ＫＵＮ ＶＬＰコントロール）、またはマウスポリトープＫＵＮ−Ｍｐｔ ＶＬＰをコードする指示用量のＫＵＮ ＶＬＰを用いて腹腔内免疫した(Anraku et al.,.2002,J Virol.76,3791-3799)。２週間後、脾細胞を除去し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによって（Ｈ−２Ｋｂ制限）ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的反応について分析した。（Ｂ、Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群に付きｎ＝３）は、ＲＳウイルスマトリックス２タンパク質をコードする２．５×１０⁷ＩＵのＫＬＴＮ ＶＬＰ（ＫＵＮ−Ｍ２ ＶＬＰ）、組み換え抗原をコードしない２．５×１０⁷ＩＵのＫＵＮ ＶＬＰ（ＫＵＮ ＶＬＰコントロール）を用いて腹腔内免疫、または以前に記載されたように(Elliott et al.,1999,Vaccine.17 2009-2019)モンタニド(Montanide)ＩＳＡ ７２０中の破傷風トキソイドを用いて調製したＨ−２Ｋｄ制限ＲＳＶ Ｍ２エピトープであるＳＹＩＧＳＩＮＮＩ（ＳＹＩＧＳＩＮＮＩ／ＴＴ／Ｍ７２０）を用いて皮下免疫した。２週間後に脾細胞を除去し、以前に記載されたように(Anraku et al.,2002、上記参照)、（Ｂ）ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴおよび（Ｃ）標準クロム放出アッセイ（黒い四角−ＳＹＩＧＳＩＮＮＩペプチドを用いて感作したＰ８１５標的細胞、白い四角−ペプチドを含まないＰ８１５標的細胞）によってＳＹＩＧＳＩＮＮＩ特異的反応について分析した。 ＫＵＮ ＶＬＰおよびＩＬ−２を用いた抗腫瘍療法。４群のマウスの背部に皮下経路により５×１０⁴ＬＬＯｖａを注射した。ＬＬＯｖａ腫瘍を触知できたら（＞１ｍｍ²）、グラフ上に指示した時点にＩＬ−２を含めて、そして含めずに、ＫＵＮ ＶＬＰＭｐｔまたはＰＢＳ（コントロール）を用いて２回ワクチン接種した。（Ａ）腫瘍のサイズを監視し、ＡＮＯＶＡによって群間比較を実施した；ＶＬＰ群対ＶＬＰ＋ＩＬ−２群、ｐ＝０．３４；コントロール群対コントロール＋ＩＬ−２群、ｐ＝０．９６；コントロール群対ＶＬＰ群、ｐ＜０．００１；コントロール群対ＶＬＰ＋ＩＬ−２群、ｐ＜０．００１。（Ｂ）生存率は、同一実験に対するカプランマイヤープロットで表示した（動物は、腫瘍１個のサイズが１５×１５ｍｍ²に達したときに安楽死させた）。対数順位検定によって群間比較を実施した；ＶＬＰ群対ＶＬＰ＋ＩＬ−２群、ｐ＝０．１１；コントロール群対コントロール＋ＩＬ−２群、ｐ＝０．４１；コントロール群対ＶＬＰ群、ｐ＜０．００１５；コントロール群対ＶＬＰ＋ＩＬ−２群、ｐ＜０．００１。 適応的突然変異は、レプリコンＶＬＰを用いた感染後のＢＨＫ２１、ＨＥｐ−２および２９３細胞内でのＫＵＮレプリコンＲＮＡの持続性複製を樹立する際に利点を付与する。ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２細胞は野生型／ＰＡＣ−β−ｇａｌレプリコンＶＬＰまたは各々０．０１、１および１０のＭＯＩでの各ＮＳ２Ａ突然変異体を用いて感染させた。感染４８時間後に、１ｇ／ｍＬ（ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２細胞）ならびに５ｇ／ｍＬ（ＢＨＫ２１細胞）のピューロマイシンを培地に添加し、さらに７日間にわたり細胞を増殖させた。ピューロマイシン耐性細胞コロニーを４％ホルムアルデヒド中で固定し、クリスタルバイオレット（ＢＨＫ２１細胞）またはＸ−ｇａｌ（ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２細胞）のいずれかを用いて染色した。 クンジンレプリコンベクター由来の異種遺伝子の発現を増強させるためのｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ細胞の使用。２４ウェルプレート中で９５％コンフルエントに増殖したＫＵＮパッケージングＡ８細胞系およびＢＨＫ２１細胞をＭＯＩ＝１でＫＵＮｒｅｐＰＡＣ／β−ｇａｌ ＶＬＰを用いて感染させ、感染２、４および６日後にＸ−ｇａｌ染色（Ａ）およびβ−ｇａｌアッセイ（Ｂ）によって分析した。白色バーはＢＨＫ２１細胞を、黒色バーはＡ８細胞のＫＵＮパッケージングを表す。各バーは、２つずつのサンプルからの平均値を表す。エラーバーは標準偏差を表す。

Claims (29)

1. 動物細胞内でフラビウイルス構造タンパク質を調節可能に発現するためのパッケージング構築物であって、前記ベクターが、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を含むフラビウイルス構造タンパク質翻訳産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節可能なプロモーターを含むパッケージング構築物。
2. 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性である、請求項１に記載のパッケージング構築物。
3. 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性ＣＭＶプロモーターである、請求項２に記載のパッケージング構築物。
4. 前記ヌクレオチド配列が、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質またはＥタンパク質に対して各々少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する１つ以上の変異体または突然変異フラビウイルス構造タンパク質をコードする、請求項１に記載のパッケージング構築物。
5. ＩＲＥＳＮｅｏ選択マーカーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のパッケージング構築物。
6. 前記Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質が、クンジンウイルスの構造タンパク質である、請求項１に記載のパッケージング構築物。
7. 請求項１に記載のパッケージング構築物を含むパッケージング細胞。
8. 請求項２に記載のパッケージング構築物およびテトラサイクリン転写活性化因子構築物を含むパッケージング細胞。
9. ＢＨＫ２１細胞である、請求項７または８に記載のパッケージング細胞。
10. （ｉ）請求項１に記載のパッケージング構築物と；
    （ｉｉ）フラビウイルス発現構築物であって、
    （ａ）フラビウイルスレプリコン；
    （ｂ）異種核酸；および
    （ｃ）前記レプリコンに作動可能に連結したプロモーター、
    を含むフラビウイルス発現構築物と、
    を含むフラビウイルスパッケージング系。
11. 前記フラビウイルスレプリコンが、クンジンウイルスレプリコン、デング熱ウイルスレプリコンまたは西ナイル熱ウイルスレプリコンである、請求項１０に記載のフラビウイルスパッケージング系。
12. 前記異種核酸が、動物細胞内で発現可能である１つ以上のタンパク質をコードする、請求項１０に記載のフラビウイルスパッケージング系。
13. 前記１つ以上のタンパク質が免疫原性である、請求項１２に記載のフラビウイルスパッケージング系。
14. 前記レプリコンが、１つ以上の突然変異構造タンパク質をコードする、請求項１０に記載のフラビウイルスパッケージング系。
15. 前記突然変異構造タンパク質が、
    （ｉ）非構造タンパク質ＮＳ１内のプロリンによって置換されたロイシン残基２５０と；
    （ｉｉ）非構造タンパク質ＮＳ２Ａ内のプロリンによって置換されたアラニン３０と；
    （ｉｉｉ）前記非構造タンパク質ＮＳ２Ａ内のアスパラギン酸塩によって置換されたアスパラギン１０１と；
    （ｉｖ）非構造タンパク質ＮＳ５内のセリンによって置換されたプロリン２７０と、
    からなる群から選択された突然変異を含む、請求項１４に記載のフラビウイルスパッケージング系。
16. 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性である、請求項１０に記載のフラビウイルスパッケージング系。
17. 前記調節可能なプロモーターがテトラサイクリン抑制性ＣＭＶプロモーターである、請求項１６に記載のフラビウイルスパッケージング系。
18. 請求項１０に記載のフラビウイルスパッケージング系を含むパッケージング細胞。
19. 請求項１７または１８に記載のフラビウイルスパッケージング系およびテトラサイクリン転写活性化因子構築物を含むパッケージング細胞。
20. ＢＨＫ２１細胞である、請求項１０に記載のパッケージング細胞。
21. フラビウイルスＶＬＰを産生する方法であって、
    （ｉ）請求項１に記載のパッケージング構築物を宿主細胞内へ導入し、パッケージング細胞を産生するステップと；
    （ｉｉ）前記パッケージング細胞内へ、
    （ａ）フラビウイルスレプリコンと；
    （ｂ）異種核酸と；
    （ｃ）前記レプリコンに作動可能に連結したプロモーターと、
    を含むフラビウイルス発現構築物を導入するステップと；
    （ｉｉｉ）前記パッケージング細胞によって１つ以上のＶＬＰの産生を誘導するステップと
    を含む方法。
22. 請求項２１の方法によって産生されるフラビウイルスＶＬＰ。
23. 請求項２２に記載のＶＬＰおよび医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む免疫療法用組成物。
24. ワクチンである、請求項２３に記載の免疫療法用組成物。
25. 組み換えタンパク質を産生する方法であって、請求項２１に記載のＶＬＰに宿主細胞を感染させ、前記タンパク質をコードする前記異種核酸を前記宿主細胞内で発現させるステップを含む方法。
26. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２５に記載の方法。
27. 動物を免疫する方法であって、請求項２３に記載の免疫療法用組成物を前記動物へ投与し、前記動物において免疫応答を誘導するステップを含む方法。
28. 前記動物が哺乳動物である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記動物がヒトである、請求項２８に記載の方法。
    

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